II.
METODELOGI PENELITIAN
2.1 Metode Pengumpulan Data 2.1.1 Tempat dan waktu penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana untuk isolasi, identifikasi Streptomyces sp. dan uji in vitro. Pada uji in vivo, penelitian dilakukan di Rumah Kaca Kelompok Tani Pangan Sari Dusun Cengkilung, Desa Peguyangan Kangin, Denpasar Utara. Kultur jamur patogen F.oxysporum f.sp. capsici diambil dari koleksi Laboratorium Biopestisida Fakultas Pertanian Universitas Udayana. Penelitian dilakukan pada bulan Oktober 2012 – April 2013.
2.2 Metodelogi Penelitian 2.2.1 Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu cawan petri, tabung reaksi, pisau, gunting, jarum runcing, pinset, penggaris, kapas, plastik bening, polybag ukuran 20 x 20 cm, kertas saring, mikro pipet, tip, erlenmeyer, jarum ose, inkubator, shaker, autoclave, oven, object glass, cover glass,cork borer, alat penjepit, freezer, aluminium foil, bunsen, mikroskop dan pH meter.
2.2.2 Bahan penelitian Bahan yang digunakan yaitu cabai merah, Streptomyces sp. , kultur jamur patogen F.oxysporum f.sp. capsici, ekstrak yeast, malt estrak, MgSO4.7H2O, congo red 1%, kentang, dextrose, agar, NaCl, aquadest, air steril, K2HPO4,
5
glukosa, kristal violet, garam iodine, alkohol, safranin, minyak emersi, methylene blue, Hidrogen Peroksida.
2.2.3 Pembuatan Media Yeast Malt Agar (YMA/ ISP4) Pembuatan media YMA yaitu dimasukkan malt (ISP4/ International Standar Project 4) sebanyak 10 gram, K2HPO4 0,5 gram, MgSO4.7H2O 0,2 gram, ekstrak yeast 1 gram, agar 20 gram, NaCl 0,1 gram, dan aquades 1 liter ke dalam erlenmeyer, kemudian dicampur lalu ditambahkan larutan congo red 1%, diaduk hingga rata sambil dipanaskan di atas penangas air hingga mendidih. Setelah itu disterilisasi dengan autoclave pada suhu 1210C dengan tekanan 15 lbs untuk menghilangkan kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan.
2.2.4 Media PDA (Potato Dextrose Agar) Pembuatan media PDA yaitu kentang sebanyak 200 gram yang telah dikupas kulitnya lalu dicuci kemudian dipotong kecil-kecil (1 –2 cm). Selanjutnya kentang direbus dengan aquadest sampai empuk, setelah itu rebusan diangkat dan disaring dengan kain saring, air saringan ditakar kembali dijadikan 1 liter. Kemudian dextrose 20 gram dan 15 gram agar-agar dimasukkan dalam larutan tersebut dan dipanaskan sampai mendidih. selanjutnya larutan tersebut dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian disterilkan dalam autoclave.
2.2.5 Media PDB (Potato Dextrose Broth) Pembuatan media PDA yaitu kentang sebanyak 70 gram yang telah dikupas kulitnya lalu dicuci kemudian dipotong kecil-kecil (1 –2 cm) direbus dengan aquadest sampai empuk, setelah itu rebusan diangkat dan disaring dengan
6
kain saring, air saringan ditakar kembali dijadikan 700 ml. Kemudian dextrose 7 gram dimasukkan dalam larutan tersebut dan dipanaskan sampai mendidih. selanjutnya larutan tersebut dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian disterilkan dalam autoclave.
2.2.6 Media Yeast Malt Broth (YMB/ISP5) Pembuatan media YMB sebanyak 11,4 gram dan aquades 600 ml kemudian dicampur diaduk hingga rata sambil dipanaskan di atas penangas air hingga mendidih. Setelah itu disterilisasi dengan autoclave pada suhu 1210C dengan tekanan 15 lbs untuk menghilangkan kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan.
2.2.7 Pengambilan sampel tanah Sampel tanah diambil dari beberapa lokasi berbeda di sekitar Kawasan Bukit Jimbaran. Sampel diambil pada kedalaman ± 15 cm dari permukaan tanah lalu dimasukkan ke dalam kantong plastik steril.
2.2.8 Metode isolasi dan identifikasi Streptomyces sp. Isolasi Streptomyces sp. menggunakan media YMA (ISP4) yang merupakan media selektif untuk mendapatkan bakteri Streptomyces sp. Media YMA (ISP4) juga merupakan media miskin hara yang ditujukkan agar Bakteri Streptomyces sp. dapat mengeluarkan metabolit sekunder untuk mempermudah identifikasi makroskopis selama proses isolasi. Penggunaan antibiotik nystatin juga dilakukan untuk dapat menghambat pertumbuhan jamur yang tidak diinginkan karena sifat dan ciri Streptomyces sp. yang mirip dengan jamur.
7
Menurut Pelczar dan Chan (2010) antibiotik nistatin berasal dari Streptomyces nousei yang aktif terhadap infeksi jamur dengan cara merusak membran sel. Sampel tanah yang diambil, ditimbang sebanyak 10 gr. Setelah ditimbang sampel dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi air steril sebanyak 90 ml sehingga di dapatkan pangkat pengenceran 10-1. Sampel dikocok sampai homogen dan diambil secara aseptik sebanyak 1 ml dengan pipet ukur lalu dituangkan ke dalam tabung reaksi yang berisi air steril 9 ml. Kemudian sampel divortex sampai homogen (tercampur), sampel tersebut memiliki faktor pengenceran sebanyak 100 kali (10-2). Setelah itu, diambil sebanyak 1 ml dari sampel faktor pengenceran 100 kali untuk dilarutkan pada 9 ml air steril dalam tabung reaksi, dikocok hingga homogen dengan vortex, sampel ini memiliki faktor pengenceran sebanyak 1000 kali (10-3). Tahapan diatas diulang sampai mendapatkan faktor pengenceran 10 -4. Pengenceran dan penanaman sampel menggunakan metode pour plate (Pelczar et al., 1993). Terdapat enam buah cawan Petri yang telah disiapkan dan ditambahkan label pada masing – masing cawan Petri berdasarkan faktor pengenceran dari sampel. Masing-masing faktor pengenceran diambil 1 ml secara aseptik untuk dimasukkan ke dalam cawan Petri steril yang kosong, kemudian dituangkan media YMA (ISP4) yang masih cair dengan suhu ±450C. Cawan petri yang sudah berisi sampel, kemudian digoyang ke kanan dan ke kiri sampai homogen. Selanjutnya media ditunggu hingga mengeras dan diinkubasi pada suhu 250 C selama 5 – 7 hari hingga koloni bakteri yang diperkirakan pada cawan Petri terlihat. Setelah itu, bakteri dipisahkan dengan ditanam kembali pada media YMA
8
(ISP4) dalam cawan Petri kemudian diinkubasi pada suhu kamar 25oC selama 5 – 7 hari. Karakterisasi dan identifikasi Streptomyces sp. dilakukan dengan pengamatan secara makroskopis berdasarkan morfologi koloni, hifa dan beberapa stuktur khusus yang dimiliki Streptomyces sp.. Secara mikroskopis Identifikasi Streptomyces sp. dilakukan dengan pewarnaan Gram, pewarnaan tahan asam dan uji katalase. Identifikasi sesuai dengan buku kunci determinasi Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition tahun 1994. 1. Pengamatan morfologi Streptomyces sp. Pengamatan morfologi Streptomyces sp. dilakukan dengan mengambil 1-2 ose koloni bakteri yang diamati dan diletakkan pada kaca objek yang telah berisi 1-2 tetes methylene blue sebagai pewarna langsung untuk mewarnai dinding sel Streptomyces sp. Setelah itu hifa diuraikan sampai memisah dengan jarum runcing lalu ditutup cover glass. Kemudian diamati dibawah mikroskop agar dapat dilihat ciri – ciri yang meliputi adanya hifa aerial, miselia/hifa tidak bersepta dan susunan spora aerial yang dimiliki Streptomyces sp. sesuai dengan buku kunci determinasi yang digunakan, yaitu Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition tahun 1994.
2. Pewarnaan Gram Koloni yang terlihat akan dilakukan pewarnaan Gram. Dibuat apusan kaca objek, dengan cara kaca objek ditetesi dengan air steril dan diambil secara aseptik biakan Streptomyces sp. pada media YMA (ISP4) miring dengan menggunakan ose yang sudah dipanaskan dan difiksasi di atas api bunsen dengan jarak 15-30
9
cm. Kemudian, diwarnai dengan kristal violet selama ± 2 menit dan dicuci dengan air suling. Tahap kedua, ditetesi dengan garam iodine dibiarkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan alkohol 96% sampai warna terhapus ± 30 detik. Setelah itu dicuci dengan air suling kembali. Tahap ketiga, diwarnai dengan safranin selama 5 – 15 menit, dicuci kembali dengan air suling. Difiksasi pada nyala api bunsen, lalu diamati dengan mikroskop pembesaran 1000 kali, untuk melihat struktur morfologi dari Streptomyces sp. tersebut
(Pelczar et al., 1993). Sebelum
pengamatan kaca objek diberi minyak emersi terlebih dahulu. Identifikasi morfologi dilakukan dengan menggunakan buku Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology 9th Edition tahun 1994.
3. Pewarnaan Tahan Asam Apusan bakteri pada kaca objek kemudian difiksasi di atas nyala api bunsen, selanjutnya sepotong kertas hisap diletakkan apusan, lalu dibasahi dengan pewarna karbol fuhsin. Agar apusan menjadi tidak kering maka terus dilakukan pemberian pewarna selama 5 – 10 menit, kemudian dicuci dengan aquadesh. Selanjutnya, dicuci dengan alkohol asam sekitar 10 – 30 detik kemudian diwarnai dengan methylene blue selama 30 detik. Dicuci dengan air dan dikeringkan, kemudian diamati di bawah mikroskop. Bakteri yang tahan asam akan berwarna merah dan yang tidak tahan asam akan berwarna biru (Pelczar et al., 1993).
4. Uji Biokimia Uji katalase menggunakan zat kimia Hidrogen Peroksida 3%. Koloni bakteri diletakkan di atas kaca objek yang telah berisi 1 – 2 tetes H2O2 untuk deteksi enzim katalase. Setelah itu diamati ada tidaknya gelembung, apabila
10
terdapat gelembung maka hasilnya positif (Streptomyces sp. ) dan sebaliknya jika tidak ada gelembung maka hasilnya negatif (Karsinah, 1994). Setelah dilakukan pengamatan koloni bakteri secara makroskopis dan mikroskopis berdasarkan morfologi koloni, hifa, pewarnaan Gram, pewarnaan tahan asam dan uji katalase maka dapat dipastikan koloni tersebut merupakan salah satu spesies Streptomyces sp. , lalu dikultur murni pada media YMA (ISP4) pada cawan petri, selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar 25oC selama 5 – 7 hari dan kemudian siap digunakan untuk pengujian.
2.2.9
Uji
daya
hambat
Streptomyces
sp.
terhadap
pertumbuhan
F.oxysporum f.sp. capsici secara in vitro Pengujian Streptomyces sp. yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi diuji keefektifannya
terhadap
patogen
F.oxysporum f.sp.capsici.
Jamur
F.oxysporum f.sp. capsici ditumbuhkan pada media Potato Dextrosa Agar (PDA) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Isolat Streptomyces sp. yang sudah berhasil diidentifikasi ditumbuhkan pada media Yeast Malt Agar (YMA/ ISP4) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari. Uji daya hambat Streptomyces sp. terhadap pertumbuhan jamur patogen F.oxysporum f.sp. capsici menggunakan metode mengapit jamur patogen dengan empat biakan antagonis yang sama (Streptomyces sp.) masing-masing berjarak 2 cm dari tepi cawan petri kemudian diinkubasi pada suhu ruang hingga terbentuk zona hambatan (Montoc, 2011).
11
2
A
B
C
1
Gambar 2.1 Jamur patogen Fusarium oxsporum f.sp. capsici. A. Pada media PDA usia 4 hari. B. Media PDA usia 8 hari. C. Foto mikroskopis F. oxysporum f.sp. capsici perbesaran 400x 1.Terlihat makrokonidia berbentuk bulan sabit. 2.mikrokonidia. Zona hambat yang terbentuk diukur untuk mendapatkan Streptomyces sp. yang paling berpotensi menghambat pertumbuhan F.oxysporum f.sp. capsici. Zona hambat dihitung dengan menggunakan metoda Whipps (1987), yaitu : Daya hambat : Diameter koloni kontrol-diameter koloni dari perlakuan x 100% Diameter kontrol
2.2.10 Uji efektifitas kultur Streptomyces sp. dalam menghambat penyakit layu Fusarium secara in vivo Uji efektifitas kultur Streptomyces sp. dalam menghambat penyakit layu Fusarium oxysporum fsp. capsici secara in vivo dilakukan dalam beberapa tahap yaitu : A. Penyiapan bibit Bibit tanaman cabai merah dikecambahkan 3 - 4 hari, lalu setelah berkecambah dipindahkan pada tray pembibitan 1 - 2 minggu, kemudian dipindah ke polybag ukuran 20 x 20 cm selama 4 minggu untuk mendapatkan struktur tanaman (tinggi dan jumlah daun).
12
B. Persiapan inokulan F.oxysporum f.sp. capsici Spora F.oxysporum f.sp. capsici ditumbuhkan pada media miring Potato Dextrose Agar (PDA) sebanyak 10 tabung selama 7 hari pada suhu ruang. Setelah itu spora dikeruk menggunakan jarum ose lalu dipindahkan pada media Potato Dextrose Broth (PDB) sebanyak 700 ml dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Kepadatan populasi spora yang digunakan yaitu 2,1 x 106 sel/ml dihitung dengan haemasitometer. Menurut Kawuri (2012) spora dipanen dengan cara disaring menggunakan kertas saring ukuran 0,45 µm untuk memisahkan hifa dengan spora.
C. Persiapan inokulan Streptomyces sp. Kultur Streptomyces sp.1, Streptomyces sp.2, Streptomyces sp.3, dan Streptomyces sp.4 ditumbuhkan pada media Yeast
Malt Agar (YMA) lalu
diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Setelah itu masing – masing kultur Streptomyces sp.1, Streptomyces sp.2, Streptomyces sp.3, dan Streptomyces sp.4 diambil sebanyak 10 koloni pada cawan Petri menggunakan cork borer ukuran 0,5 cm lalu dipindahkan pada media Yeast Malt Broth (YMB) sebanyak 125 ml. Seluruh kultur Streptomyces sp. diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari pada shaker dengan kecepatan 70 rpm. Menurut Kawuri (2012) spora dipanen dengan cara disaring menggunakan kertas saring ukuran 0,45 µm untuk memisahkan hifa.
D. Perlakuan Uji in vivo yang dilakukan pada Streptomyces sp. terhadap tanaman cabai merah yang terinfeksi penyakit layu Fusarium dilakukan 5 perlakuan yaitu:
13
1. Perlakuan kontrol, akar tanaman cabai merah dilukai pada ujung-ujung akar, kemudian akar dicelupkan selama 30 detik dengan F.oxysporum f.sp. capsici lalu spora F.oxysporum f.sp. capsici sebanyak 5 ml disiramkan pada media tanah steril sebanyak 500 gram di polybag. 2. Perlakuan I, akar tanaman cabai merah dilukai pada ujung-ujung akar lalu akar dicelupkan selama 30 detik dengan F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.1, selanjutnya penyiraman spora F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.1 masing – masing sebanyak 5 ml pada media tanah steril sebanyak 500 gram di polybag secara bersamaan. 3. Perlakuan II, akar tanaman cabai merah dilukai pada ujung-ujung akar lalu akar dicelupkan selama 30 detik dengan F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.2, selanjutnya penyiraman spora F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.2 masing – masing sebanyak 5 ml pada media tanah steril sebanyak 500 gram di polybag secara bersamaan. 4. Perlakuan III, akar tanaman cabai merah dilukai pada ujung-ujung akar lalu akar dicelupkan selama 30 detik dengan F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.3, selanjutnya penyiraman spora F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.3 masing – masing sebanyak 5 ml pada media tanah steril sebanyak 500 gram di polybag secara bersamaan. 5. Perlakuan IV, akar tanaman cabai merah dilukai pada ujung-ujung akar lalu akar dicelupkan selama 30 detik dengan F.oxysporum f.sp. capsici dan kultur Streptomyces sp.4, selanjutnya penyiraman spora F.oxysporum f.sp. capsici dan
14
kultur Streptomyces sp.4 masing – masing sebanyak 5 ml pada media tanah steril sebanyak 500 gram di polybag secara bersamaan. Pengamatan dilakukan selama 4 minggu, dimulai saat diberikan perlakuan. Selanjutnya setiap minggu dicatat tinggi tanaman, jumlah daun dan layu tidaknya tanaman. Menurut Vauzia dkk (2012) untuk menghitung persentase tanaman yang terserang penyakit digunakan rumus sebagai berikut: Persentase tanaman terserang penyakit = Jumlah tanaman yang terserang x 100% Jumlah tanaman yang ditanam
2.3 Metode Pengolahan Data Metode penelitian menggunakan RAK (Rancangan Acak Kelompok) dengan 5 perlakuan dengan 5 unit percobaan diulang 5 kali sehingga didapatkan jumlah 125 pot percobaan. Data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis secara kuantitatif dengan menggunakan analyse of varians (ANOVA). Jika terdapat perbedaan yang nyata maka dilakukan uji Duncan P < 0,05.
15
