Megnövelt stabilitású enzim-polimer nanobiokompozitok Enzyme-polymer nanobiocomposites with enhanced stability
Hegedős Imre, Nagy Endre Pannon Egyetem Mőszaki Informatika Kar, Mőszaki Kémiai Kutatóintézet Egyetem u. 2. P. O. Box 125, H-8200 Veszprém, Hungary Summary Single enzyme nanoparticles (SENs) represent a new approach in industrial enzyme research [1-3].The form of SEN means, that each enzyme molecule is surrounded with a nanometer scale polymer matrix layer, resulting in stabilization of enzyme activity without any serious limitation for the substrate transfer from solution to the active site. Converting free enzyme to SEN can result in significantly more stable catalytic activity while the nanoscale structure of the SEN does not impose a serious mass-transfer limitation on substrates. The synthesis of SEN particles is available via more or less simple laboratorial technique. Previously we have decided to apply this technique for industrial bioethanol synthesis able to comply with the requirements of green chemistry [16]. At first we reproduced the synthesis and investigations of activity and stability of SEN chymotrypsin. The synthesis of SEN-CT consists of three-step processes (Fig. 1). Few parts of the synthesis have changed for available application under our laboratorial conditions. The first step is the enzyme modification on the surface. Terminal primer amino groups on the surface of the enzyme have been modified with microliter amount of acryloyl chloride at zero temperature. Then at the presence of tiny amount of AOT surfactant and bivalent salt CaCl2 the enzyme was extracted to hexane. Vinyl group polymerization reaction at room temperature in hexane phase between MAPS and acryloylated chymotrypsin was initiated by UV light (365 nm) in the presence of the free radical initiator 2,2′-azobis-(2,4-dimethylvaleronitrile). It leads to single enzyme molecules with short polymer spikes on the surface (see Fig. 2). The two-phase system was vortexed and shaken at 22 °C and 300 rpm for 5 min. The buffer phase was removed and filtered by the syringe filter unit (with pore size 0.1 µm), and produced a transparent solution that turned into a turbid solution within 10–30 min. This extraction process was iterated (typically by about four to five times) until no significant amount of CT activity was observed in the final extraction. The extracted buffer solution, containing most of CT activity, was aged in the refrigerator at least for 3 days. The aged and turbid solution was filtered again by the syringe filter unit (with pore size 0.1 µm). The activity of SEN chymotrypsin was detected by the method of Garrel and Cuchillo [5] witch means the measurement the time change of UV-absorbance of modified substrate of chymotrypsin enzyme. The activity of the SEN enzyme is 48-73 percent of the natural chymotrypsin. We found, that the decreasing of the activity is due to the UV-irradiation (Fig. 3.) To assess the CT stability after incubation in aqueous buffer (10 mM phosphate, pH = 7.8) for pre-determined time intervals placed in a temperature-controlled incubator. It was founded that SEN chymotrypsin molecules are really more stable - at least one or two order of magnitude - than natural ones even at more extremely conditions (37 oC, 250 rpm, see Fig. 5). The stabilities of the enzyme samples under investigated conditions were measured by the residual activity as a function of time during incubation at 37 °C shaking (250 rpm) and at 27 °C in a shaking condition (150 rpm) with the tubes on the side (horizontal position). At 27 oC and 150 rpm shake speed the SEN chymotrypsin enzyme has 6.9 times longer half-time period than the natural one (Fig. 5a. and Table 1.) At 37 oC and 250 rpm the SEN-CT has 74 times more stable (Fig. 5b. and Table 1.) Compared these results with the most recent publications [2-9] we can see that SEN-enzymes are more stable than the most of enzyme nanobiocomposites synthesized in different way. Preliminary results show that SENenzymes are more stable than natural ones in a wide pH range (Fig. 6.) The activity of SEN-CT decreases only 50 % at pH 1.5 while the natural CT enzymes have measurable activity only in pH ranging from 4.5 to 9.0. Most recent results show also other SEN-enzymes for example SEN-lipases have also enhanced stability. The activity of SEN-lipase is about 55-60% of the natural free ones. Recently we try to synthesize stable SEN particles witch able to enhanced stability in living biological organisms also (biocompatibility) without significant toxicity. We try to synthesize dendrimer-enzyme nanobiocomposites [17] in two different manner (Fig. 7). It could be applied as enzyme drugs with enhanced activity and without antigenic properties [14].
Bevezetés Az iparban nagy kereslet mutatkozik olyan enzimekre, amelyek nagy stabilitással rendelkeznek és szélsıséges körülmények között is – pl. intenzív rázatás, magasabb hımérséklet, vagy az optiomálistól eltérı pH – csak nagyon keveset vagy semmit sem veszítenek aktivitásukból és mőködıképesek maradnak. Az enzimek valamennyi ipari jellegő felhasználási területén igény mutatkozik a stabilis enzimek elıállítására, így a gyógyszerek, finomvegyszerek elıállítása, ezen kívül mosószer alapanyagok, bioérzékelık, bioszabályozók, biotisztítók, elıállítása esetén, vagy fehérje emésztés és elemzés, bioüzemanyag cellák készítése során is alapvetı igény van megnövelt stabilitású enzimek elállítása [1]. Az enzimek behatárolt életideje ugyanis korlátozza alkalmazhatóságukat, ezért az életidı növelése alapvetı valamennyi felhasználás számára. Hosszabb életidıvel rendelkezı enzimekbıl kevesebb mennyiség elegendı, ugyanakkor növekedik az enzim reaktorok mőködési ideje és kibıvülnek az enzim újrafelhasználás lehetıségei is. Korábban is léteztek technikák, amelyek korlátozott hatékonysággal ugyan, de képesek voltak valamelyest megnövelni az enzimek stabilitását. Ilyen technika az enzim immobilizáció, amely az enzim molekulának nagy szerkezetek üregeibe vagy felületére való rögzítését jelenti egyszerő adszorpcióval, kovalens kötéssel vagy beburkolással. Az enzim molekula és a gazda anyag közötti több ponton történı kötés csökkenti az
enzim degradációjat, illetve az un. „unfolding” mechanizmusait és ilyen módon növeli az enzim mőködésének stabilitását. Az enzim módosítás az enzim molekula olyan kovalens reakciójával definiálható, amely funkciós csoportok vagy polimerek felszínhez kötıdésével megváltoztathatja a felszíni tulajdonságokat és az enzim stabilabb mőködését eredményezheti. A fehérje mérnökség a fehérje aminosav szekvenciájának molekuláris biológiai módszerekkel történı megváltoztatását jelenti (pl. irányított evolúció vagy helyspecifikus mutagenezis) egy stabilabb belsı szerkezet elérése érdekében. A reakció közeg mérnökség ezzel szemben az enzim körüli közeg változtatásával módosítja az enzim szerkezetét. Alkalmazhatnak nem vizes reakció közeget, vagy változtathatják a reakcióközeg ionösszetételét. Az enzim rögzítése a katalizátor újrafelhasználás, a folyamatos mőködés és a termék tisztítás szempontjából is jelentıs. A rögzített enzimeknek azonban gyakran kicsi az aktivitása. Az enzimmőködés hatékonysága javítható a hordozó anyag szerkezetének változtatásával, vagy a hordozó méretének csökkentésével. A kismérető hordozó részecskék nagyobb felületet biztosítanak az enzim rögzítéséhez. Mikrométeres és nanométeres mérető hordozó részecskék alkalmazásával széles körben foglalkoznak. Az utóbbi néhány évben egyre több próbálkozás történik az enzimek stabilitásának nanobiokompozitok elıállításával történı növelésére. Fém nanorészecskék felületéhez – SdS [2] majd arany [3] - kötöttek enzimet. Az enzim nem csak stabilabbá vált, hanem szelektív is lett. Egyedi mágneses nanorészecskéket állítottak elı
a)
b)
Felület módosítás
Enzim
Polimerizáció
Réteg képzés
Polimer réteggel beburkolt enzim
1. ábra a) A polimer védıréteggel beburkolt egyedi enzim részecskék elıállításának sémája b) transzmissziós elektronmikroszkópos felvétel a SEN részecskékrıl
O O
Cl
NH2
NH C
Enzim módosítá s Kimotripszin enzim (CT)
A felületén módosított CT enzim Si
O
(OMe)3 O
O NH
O
C
NH
C n
Iniciátor, UV
O
Si
(OMe)3
O
Polimer szálakkal körbevett CT enzim
O NH
H2O (hidrolízis)
C n
O
Si
(OMe)3
(Szilanol kondenzáció)
O
Polimer hálóval körbevett CT enzim
2.2.ábra ábra AA SEN-kimotripszin SEN-kimotripszin szintézisének szintézisének kémiai kémiai lépései lépései [4], amelyek megırizték aktivitásukat széles pH tartományban ( pH 5,5 és 9,0 között), 4 oC-on történı tárolás után megırizték aktivitásuk 85 %-át, ami a szabad enzimek aktivitásának négyszerese. Poliakrilamid nanogéllel beburkolt Fe3O4 mágneses nanorészecskék és kimotripszin enzim konjugátumokat állítottak elı [5] és az eredeti aktivitás mintegy 80 %-a megmaradt. Torma peroxidázt nanogéllel burkoltak be [6], amelyhez a felszínén akrilezéssel módosított enzimet használtak. Aromás poliamin hiperelágazó (hyperbranched) polimerekkel burkoltak be lipázt [7], a hıstabilitása így 50-80 közé kitolódott és a stabilitása háromszorosára nıtt. Torma peroxidáz enzim felületéhez G 4.0 PAMAM dendrimereket kapcsoltak [8] és az így elıállított kompozitot biosztenzorként alkalmazták. Egy friss publikációban [9] platina nanorészecskéket burkoltak be G4 PAMAM dendrimerekkel és réteges módszerrel glükóz peroxidáz enzimet kerevertek hozzá. Az enzime molekulák a dendrimerek felületén immobilizálódtak. Az így stabilizált enzimeketz szintén bioszenzorként használták, amelyek stabilitása egy hónapon keresztül jónak mutatkozott.
Az egyedei enzim részecskék [1-3] A J. Kim és munkatársai által kifejlesztett un. egyedi enzim nanorészecskék (single enzyme nanoparticles, SENs) elállításának esetében minden egyes enzim részecske néhány nanométer vastagságban szerves vagy szervetlen porózus anyaggal van körbevéve. Ez az újfajta eljárás eltér mind a mezopórus anyagokon, mind a szol-géleken való rögzítéstıl. Az így átalakított enzim molekulák egy-két nagyságrenddel stabilisabb katalitikus aktivitást mutatnak és a szubsztrátum szabad mozgása sem korlátozódik. A módszer elsı publikációja szerint [10] elsı lépésben a felszíni lizin aminosavak szabad amino csoportjait akrilsavkloriddal módosítjuk (1. ábra). Kis mennyiségő felületaktív anyagot használva a módosított fehérjét un. hidrofób ion-pár formában (hydrophobic ionpairing) oldani lehet hexánban. A következı, polimerizációs lépésnél az enzim szabad felszínére van szükség hexán fázisban, amihez elengedhetetlen az ion-pár képzéssel történı oldódás. Vinil csoportot és trimetoxiszilil csoportot egyaránt tartalmazó szilil monomereket adva a hexános reakció elegyhez szabad gyökös vinil
a) 1,0
0,8
0,8
Relatív aktívitás
Relatív aktívitás
1,0
0,6 0,4 0,2
0,6 0,4 0,2 0,0
0,0
0
0
2
4 6 Besugárzási idı [óra]
100
200 Idı [nap]
8
300
1,0
polimerizációt indítottak ultraibolya fénnyel történı gyökképzéssel és lineáris polimereket kaptak, amelyek az enzim felszínéhez kapcsolódtak. (2. ábra). Az enzim molekulákhoz kötött polimer intermediert vizes oldatba juttatva, a leágazó trimetoxi-szilil csoportok egymással kapcsolódnak, minden egyes enzim molekula körül keresztkötött polimer hálózatot eredményezve. Ez jelenti a második, ortogonális polimerizációs lépést (2. ábra). A reakció körülmények finoman szabályozhatók és ezért a keresztkötések zömében az egyes enzim molekulákon belül jöhetnek létre, különálló nano mérető részecskéket eredményezve. Ezt a sajátos szerkezető SEN molekulát polimer hálózathoz is lehet kötni többszörös kovalens kötésekkel [1, 11]. Kísérleti rész A szerzı szabadalomban rögzített leírásának megfelelıen - [12] Example 1 - reprodukáltuk a leírt szintézist. A szintézis egyes lépései valamint az egyes változtatások részletesen megtalálhatók tavalyi közleményünkben [16]. A SEN-kimotripazin aktivitását Garrel és Cuchillo módszerével az UV-elnyelés idıbeli változásának követésével mértük [13]. A termék SEN-kimotripszin enzim aktivitása az eredeti 4873%-ának bizonyult. Az enzim molekulák egyenkénti beborítottságának detektálása transzmissziós elektronmikroszkópiával megoldható. Jelen esetben
Relatív aktívitás
3. ábra CT aktivitása UV-besugárzás hatására
b)
0,8
0,5
0,3
0,0 0
5
10
15 Idı [nap]
20
25
4. ábra CT (X) és SEN-CT (O) enzimek stabilitása a) + 4 oC-on b) 20 oC-on Malvern Zetasizer Nano ZS készülékkel detektáltuk a részecskék méreteloszlását. Az eredmények értékelése A polimerizációs lépéshez hasonló körülmények között vizagáltuk a 365 nm-es UV fény hatását a hexánban oldott módosított CT enzim aktivitására. Azt tapasztaltuk, hogy 8 óra alatt az enzim aktivitása 60-70 %-ára csökken az eredetinek (3. ábra). A megelızı lépések során mérhetı aktivitás csökkenést nem tapasztaltunk. Ez azt jelenti, hogy az enzim-polimer nanobiokompozit aktivitásának 70%-os csökkenését jórészt, vagy teljes egészében az UV-besugárzás okozza. Vizsgáltuk a SEN-CT hőtıben, + 4 oC-on, illetve szobahımérsékleten (20 oC-on) történı tárolás közben történı aktivitás változásást is (4. ábra). Látható, hogy mindkét esetben az enzimpolimer nanobiokompozit stabilisabb.
t1/2 [óra]
Rázatás [rpm]
T [ C] o
4 20 27 37
Natúr CT
150 250
SENCT
864 120 110,0 0,5
12000 648 650 37
1
a)
Rel. t1/2 SENCT/ Natúr CT 13.9 5.4 5,9 74,0
Relatív aktivitás
Körülmények
0,75 0,5 0,25 0 0
Ennél extrémebb körülmények között rázatás közben és magasabb hımérsékleten még nagyobb eltérést tapasztalhatunk a SEN-CT enzim és a kontroll CT enzim stabilitásaiban (5. ábra). 27 oCon 150 rpm-mel (5.a ábra) illetve 37 oC-on 250 rpm-mel (3.b ábra) történı rázatás hatására a natív CT gyorsan elveszíti aktivitását, míg a SEN-CT preparátum stabilis marad. Az enzim aktivitásának felezési idıit az 1. táblázatban foglaltam össze. A felezési idıket úgy számoltuk, hogy logaritmikus skálát alkalmazva az aktivitás-idı grafikonokra egyenest illesztettünk és amikor az egyeneseknek a kiindulási aktivitás felét elérték, azt az idıpontot tekintettúk t1/2-nek. Megvizsgáltuk a SEN-CT enzimek stabilitását különbözı pH-tartományokban és azt találtuk, hogy
Relatív aktivitás
1,0 CT SEN-CT
0,8 0,5 0,3 0,0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
6. ábra A natív (CT) és a beburkolt (SEN_CT) enzimek aktivitásának változása a pH függvényében
b) Relatív aktivitás
1. táblázat Natúr és polimer hálóval borított (SEN) kimotripszin enzim (CT) aktivitásaink felezési idıi (t1/2).
100
200 300 Idı [óra]
400
500
1
0,8
0,6 0,4
0,2
0 0
20
40
60
80
Idı [óra]
5. ábra SEN-kimotripszin (O) és kezeletlen enzim (X) aktivitása a) 27 oC-on, 150 rpm-mel b) 37 oC-on, 250 rpm-mel. a szabad enzimekkel összehasonlítva (CT) extrém savas (1,5) és erısen lúgos (9,0) pH esetében sem csökken a beburkolt enzimek aktivitása 50 % alá, míg ezeken a szabad enzimek már nem képesek mőködni (6. ábra). További vizsgálatokat igényel az ilyen módon beborított egyedi enzim molekulák biológiai lebontásának vizsgálata. Ugyanis valószínősíthetı, hogy a SEN nanorészecskék az élı szervezetek enzimei nem tudják lebontani és így az un. biológiai életidejük is jelentıs mértékben megnı. Ez lehetıvé teheti gyógyászati alkalmazásukat. Lipáz enzimeket is sikeresen bevontunk ugyanezzel a poli-szilil polimer-nanoréteggel és az aktivitásuk mérhetı. Az elızetes kísérleti eredmények szerint a SEN-lipáz aktivitása 55-60%os a frissen készített lipáz oldathoz képest. A stabilitás vizsgálatok folyamatban vannak.
NH2
NH2
NH2
NH2
NH2
CT +
NHCO
NH2
NHCO
CT
CONH
NH2
NH2
CONH
MeOH
NH2
NHCO
NHCO
6
H2O
+6
CT
NH2
NH2
NH2
NH2
NH2
H2O
NH2
CT
NH2
NH2 NH2
a)
b) -
-O
OMe
O
M eO
O
O O
=
O
N H
H N
O OMe
O
H N
O
O
O
OM e
N
OMe
O MeO
O
N H
-O
H N O
O
O
O
N
-
N
O O
-
O
N
H N
O
O N H
N
N
O
N O
O
=
N
N
-O
OM e N H
N
-O O
N
OM e
-
O
O N
-
-O
O
7. ábra Enzim-dendrimer nanobiokompozitok elıállításának módszerei. a) Kovalens savamid kötés kialakításával az enzim szabad felszíni amino csoportjai valamint a dendrimer metil-észter végcsoportjai között b) szupramolekuláris önszevezıdéssel vizes közegben a negatív töltéső karboxil végő dendrimerek (-COO-) az enzim szabad -NH3+-csoportjaival lépnek elektrosztatikus kölcsönhatásba és viszonylag stabil komplexeket alakítanak ki. Dendrimer-enzim nanobiokompozitok Elızetes kísérleteink sikeresnek bizonyultak dendrimer-enzim nanobiokompozitok elıállítását illetıen is. A dendrimerek gömb alakú, teljesen monodiszperz, jól definiált térbeli szerkezető, teljesen szimmetrikus felépítéső polimerek. Egy kızponti magból (core) és a körülötte lévı ismétlıdı AB2 elágazó egységek alkotta rétegekbıl állnak. A rétegek száma szerint generációkat különböztetünk meg. A poliamido-amin (PAMAM) dendrimerek karboxil- vagy amin végő, peptid kötésekbıl felépülı elágazó molekulák. Régóta ismert biokompatibilitásuk és jó áthatolási képességük az endothelium és epithelium rétegein, aminek következtében gyógyszer hatóanyagként történı alkalmazásuk kiemelt jelentıségő [14]. A PAMAM dendrimereket a lebontó izoszomális enzimek (endopeptidázok) bontják, csak egy-két nagyságrenddel lassabban. Tavaly számoltak be az elsı hasonló enzim-dendrimer nanobiokompozit elıállításáról [8]. Itt egész generációs
felszíni dendrimereket használtak (-NH2 csoportokkal), de a feles generációs dendrimerek biokompatibilitás és toxicitás szempontjából kedvezıbbek [14]. Ezért házilag elıállított 1.5 generációs (COOH végő) PAMAM dendrimerekkel próbálkoztunk [17]. A CT enzimeket a fent vázolt módon hidrofób ionpárosodás módszerrel metanolos oldatba vittük. (Az irodalomból ismert, hogy ezzel a módszerrel nem veszítik el az enzimek aktivitásukat metanolban, sıt, stabilabbakká válnak [15]). A PAMAM dendrimerek szintézisénél használatoshoz hasonló lépést alkalmazva nagy feleslegben G 1.5 generációs PAMAM dendrimereket adtunk a CT metanolos oldatához. A CT enzim felületének szabad amino csoportjaival metanolos közegben reakcióba lép a metil-észter végő dendrimer és kovalensen kötött enzimdendrimer nanobiokompozitok jönnek létre (ld. 7a. ábra). A kompozitok szőréssel tisztíthatók és elválaszthatók. Másik, a kovalens kapcsolásnál jóval egyszerőbb elállítási módja a dendrimer-enzim
kompozitoknak az un. szupremolekuláris önszervezıdéssel történı elektrosztatikus kölcsönhatásokon alapuló konjugátumok kialakítása. Ebben az esetben a másfeles generációs (G 1,5) PAMAM dendrimerek karboxil terminális csoportokat tartalmazó változatát reagáltattuk a CT enzimmel vizes közegben (7b. ábra). a negatív töltéső karboxil végő dendrimerek (-COO-) Megfelelı pH-n az enzim szabad -NH3+csoportjaival lépnek elektrosztatikus kölcsönhatásba és viszonylag stabil komplexeket alakítanak ki. Az így kialatott kompozitok rendelkeznek aktivitással, stabilitásuk vizsgálata azonban még folyamatban van. Összefoglalva elmondható, hogy az enzimdendrimer nanobiokompozitok stabilitás és pHtőrés szempontjából elérik, olykor túlhaladják a friss irodalomban leírt egyéb nanobiokompozitokkal kapott eredményeket. Irodalomjegyzék [1] Kim, J., Grate, J.W., Wang, P., Nanostructures for enzyme stabilization, Chemical Engineering Science, 61 (3), 1017-1026 (2006). [2] Hong R., Fischer N.O., Verma A., Goodman C M, Emrick T, Rotello V M, Journal of American Chemical Society, 126, 739-743 (2004) [3] Hong R., Emrick T., Rotello V.M., Journal of American Chemical Society, 126 (42), 1357213572 (2004) [4] Yang Z, Shihui S, Chunjing Z, Biochemical and Biophysical Research Communications, 367, 169-175 (2008)
[5] Hong J., Xu D., Gong P., Ma H., Dong L., Yao S., Journal of Chromatography B, 850 (1-2), 499-506 (2007) [6] Ming Y, Ge Y, Liu Z, Ouyang P.K., Journal of American Chemical Society, 128, 11008-11009 (2006) [7] Ge Y, Minf Y, Lu D, Zhang M, Liu Zh, Biochemical Engineering Journal, 36, 93-99 (2007) [8] Zeng Y-L, Huang H-W, Jiang J-H, Tian MN, Li Ch-X, Shen G-L, Yu R-Q, Analytica Chimica Acta, 604, 170-176 (2007) [9] Yao K. et al., Materials Science and Engineering: C , Article in Press, Corrected Proof (2008) [10] Kim, J., Grate, J.W., Nano Letters, 3, 1219–1222 (2003). [11] Kim, J., Jiab H., Lee C., Chung S., Kwak J. H., Shina Y., Dohnalkova A., Kim B-G., Wang P., Grate W.J., Enzyme and Microbiological Technology, 2006, 39 (3), 474-480. [12] US Patent Application 20040121018 Grate, J. W., et al., June 24, (2004). [13] Garrel, J., Cuchillo, C.M., FEBS Letters, 190 (2), 329-332 (1985). [14] Svenson, S. and Tomalia, D.A., Adanced Drug Delivery Review, 57, 2104–2127 (2005). [15] Meyer J.D., Manning M.C., Pharmaceutical Research, 15 (2) (1998) [16] Hegedős I., Nagy E. Kulcsár E., MőszakiKémiai Napok ‘07 kiadvány, Veszprém, 138. (2007) [17] Hegedős I., Nagy E., Kovács S., MőszakiKémiai Napok ‘07 kiadvány, Veszprém 280. (2007)
