Školitel:
Magnetické částice pro detekci nádorových onemocnění, založené na protilátkách Vojtěch Adam
Datum:
7.11.2013
Název:
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023
Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
Metodika stanovení MT A. Navázání protilátek
G. Získání cílové molekuly
B. Přidání vzorku
C. Izolace cílové molekuly
H. Adsorpce na povrch elektrody
D. Separace pomocí magnetu
I. Promytí
E. Promývání
F. Ohřev
J. Měření Pracovní elektroda Referenční elektroda
Pomocná elektroda
Potenciostat/ Galvanostat
• Polyklonální králičí protilátka, acetátový pufr, inkubace 15 minut při 70°C • Elektrochemické stanovení (tzv. Brdičkova reakce-limit detekce 100 pM) Isolation of metallothionein from cells derived from aggressive form of high-grade prostate carcinoma using paramagnetic antibody-modified microbeads off-line coupled with electrochemical and electrophoretic analysis Masařík, M., Gumulec J., Sztalmachová, M., Hlavna, M., Babula, P., Křížková, S., Ryvolová, M., Jurajda, M., Sochor, J., Adam, V., Kizek, R., Electrophoresis 2011, 32, 1–13
2
1,4
1
1,2
intenzita signálu (%)
1,2
0,8 0,6 0,4 0,2 0
1,2
3,5
intezita signálu (%)
pH
4,3
7,4
1
0,8 0,6
0,4 0,2
0
10,5
0
1,05
1,2
1,00
1
0,95
0,90 0,85 0,80
myší
králičí Protilátka
25
37
50
70
Teplota (°C)
intezita signálu (%)
intenzita signálu (%)
Metodika stanovení MT
0,8 0,6 0,4 0,2 0
15
30
Čas (min)
60
90
3
Brdičkova reakce • •
•
Adsorptivní přenosová technika ve spojení s diferenční pulzní voltametrií – Brdičkova reakce Vylučování vodíku ze základního elektrolytu (Brdičkova soluce – 1 mM Co(NH3)6Cl3 a 1 M amonný pufr (NH3(aq) + NH4Cl, pH = 9.6) v přítomnosti proteinů obsahujících –SH skupinu Sledujeme katalytický signál – Cat2 Co(II) Metallothionein + [Co(NH3)6]Cl3+
[Co(NH3)6]Cl2+
Potenciál Potential 250 nA
+ e-
RS2Co
Co1
Cat1
-0.8 V + 2e[Co(H2O)6] 2+
Cat2
RS2Co
Co1
Metallothionein R(SH)2
-1.2 V +
2eCat 1
RS2Co + 2H+ + 2H+
-1.35 V
+ 2eCo + R(S-)2 + 2H+
Cat 2
-1.5 V
-0.3 1.8
–0.8
Potenciál (V)
Převzato z J. Petrlova, et al. Attomole voltammetric determination of metallothionein, Electrochim. Acta 51 (2006) 5112-5119. V. Adam et al. Metallothionein Electrochemical Fingerprints JACS (2011), in preparation
–1.3
–
Stanovení MT Stanovení proteinu
Exprese MT1A/MT2A 10
60,00
MT2A p < 0.035
1 22Rv1
PC-3
PNT1A MT1A MT2A
0,1
MT1A p < 0.001
Hodnota MT (µg/ng proteinu)
Relativní násobek
p < 0.05 50,00 p < 0.04
40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 PC-3
22Rv1
PNT1A
0,01
Determination of metalothioneins and alpha-methylacyl-CoA recemase in tumor prostate diseases Masařík, M., Gumulec, J., Sztalmachová, M., Hlavna, M., Kuchtíčková, Š., Rovný, A., Hrabec, R., Eckschlager, T., Křížková, S., Adam V., Kizek, R., 7.Symposium a workshop molekulární patologie a histo-cyto-chemie. 2011.ISBN 978-80-87327-59-3.
5
Metodika stanovení Caveolinu-1 • ELISA (imunologická metoda založena na specifické reakci antigenu s protilátkou) • Byl použit set pro stanovení caveolin-1 od firmy USCN Life Science Inc. • Monoklonální protilátka proti caveolinu-1 • Testovaný vzorek (antigen), na který se naváže polyklonální protilátka konjugovaná s biotinem • Avidin konjugovaný s peroxidázou • TMB substrát (3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine) → dochází k barevné změně • Stop reagencie (H2SO4) • Fotometrická detekce při 450 nm
6
Stanovení Caveolinu-1 Stanovení proteinu
Exprese Caveolinu-1 10,00
10
1 22Rv1
0,1
0,01
PC-3
PNT1A
p < 0.05 Intenzita signálu
Relativní násobek
Cav p < 0.001
p < 0.001
1,00 PC-3
PNT1A
22Rv1
0,10
0,01
Apoptický proliferační expresní profil u nádorových prostatických buněk Gumulec, J., Hlavna, M., Sztalmachová, M., Pávková –Goldbergová, M., Křížková, S., Adam, V., Kizek, R., Masaříková, M., Masařík, M., XXXV. Brněnské onkologické dny. 2011, ISBN 978-80-86793-17-7.
7
Metodika stanovení PSA • Pro analýzu PSA byla použita ELISA metoda . Stanovení se provádělo pomoci automatického analyzátoru AIA 600 II • Myší monoklonální protilátka proti PSA→testovaný vzorek (antigen) • Sekundární monoklonální protilátka konjugovaná s hovězí alkalickou fosfatázou • Přidán fluorogenní substrát (4methylumbelliferyl fosfát) • Pomocí fluorescenční intenzity změřena aktivita enzymu 8
Stanovení PSA
682 krát zvýšeno oproti PNT1A
Stanovení proteinu
Exprese PSA 40
10
p < 0.001
Hodnota PSA (ng/ml)
Relativní násobek
35 PSA p < 0.005
30 25 20 15
10 p = 0.1
5 0
1 22Rv1
PC-3
PNT1A
22RV1
PC-3
PNT1A
9
Výsledky
Na úrovni proteinu
Na úrovni RNA
PNT1A
PC-3
22RV1
Caveolin-1
kontrola
1,6x snížená
50x snížená
MT
kontrola
1,2x zvýšená
1,2x snížená
PSA
kontrola
nezměněná
682x zvýšená
Caveolin-1
kontrola
2,9x zvýšená
17,5x snížená
MT1A
kontrola
14,3x snížená
8,3x snížená
MT2A
kontrola
2,5x zvýšená
1,7x snížená
PSA
kontrola
2,7x zvýšená
2x zvýšená
•Výsledky byly vyhodnoceny v softwaru Statistica 9 •K porovnání hladiny mezi kontrolní a nádorovými liniemi bylo použito t-testů 10
Děkuji Vám za pozornost
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023
Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
