Lysosomy a lysosomální onemocnění

Lysosomy a lysosomální onemocnění

Eukaryotní buňka

Alberts et al : Molecular biology of the cell 6th edition

Lysosomes

   



Image M.H.

Degradation of macromolecules Calcium store Cholesterol homeostasis Lysosomal exocytosis - plasma membrane repair Cell death

Lysosomy Organely s kyselým obsahem ohraničené jednoduchou membránou Odbourávání makromolekul

Alberts et al : Molecular biology of the cell 6th edition

Lysosomální („střádavá“) onemocnění Deficity lysosomálních enzymů vedou ke střádání materiálu v lysosomech

Lysosomální („střádavá“) onemocnění Poruchy transportu enzymů do lysosomu nebo substrátů (např. v důsledku poruchy vesikulárního transportu) uvnitř buňky vedou také ke střádání materiálu v lysosomech

Lysosomální onemocnění Dědičná onemocnění vedoucí ke střádání v lysosomech 1. Poruchy odbourávání glykanů 2. Poruchy odbourávání lipidů 3. Poruchy odbourávání proteinů 4. Poruchy lysosomálních transportních proteinů 5. Poruchy transportu proteinů do lysosomů

Lysosomy

Lysosomy Vesikuly ohraničené jednoduchou membránou Kyselý obsah (pH 4.5-5.5) Účastní se vesikulárního transportu v buňce interaguje s endosomy, Golgiho aparátem, plasmatickou membránou, endoplasmatickým retikulem „Klasické“ lysosomy jsou hlavním buněčným “degradativním” kompartmentem

Maturation of lysosomes Late endsosome Endolysosome Hydrolase

Endolumenal vesicle

Phagosome (autophagosome)

Lysosome

adapted from Alberts et al. Molecular cell biology

Lysosomy - pokračování Lysosomy obsahují solubilní hydrolasy s kyselým pH optimem V lysosomální membráně se nachází glykosylované membránové proteiny (receptory, vakuolární protonová pumpa, transportní proteiny a další) Lysosomální membrána má odlišné složení lipidů - je bohatá na kyselinu lysobisfosfatidovou Kyselé prostředí uvnitř lysosomu udržuje ATPdependentní protonová pumpa (vakuolární ATPasa)

Lysosomy jsou součástí toku membrán a proteinů v buňce endocytosa fagocytická vacuola

EE M6PR „scavenger pathway“

chaperony zprostředkovaná autofagie

LE NC

EE – časný endosom LE – pozdní endosom M6PR – mannoso-6-fosfátový receptor LY – lysosome NC - jádro

LY

exocytosa

M6PR sekreční vesikula Golgiho aparát

autofagická vakuola

LYSOSOMY, které

ZABÍJÍ !!!

… a jejich příbuzní

Sekreční lysosomy /Lysosomům příbuzné organely V některých buňkách hematopoetického původu jsou organely, které mají vlastnosti jak lysosomů, tak i sekrečních granul - kyselé pH - lysosomální membránové a lumenální proteiny - v odpovědi na stimul jsou schopny exocytosy Lysosomům příbuzné organely (LRO) -lytická granula (NK buňky and cytotoxické Tlymfocyty) -azurofilní granula -melanosomy -“externí“ lysosom osteoklastů - delta-granula krevních destiček

Lysosmům příbuzné organely osteoklast

„zvrásněná“ membrána H+ H

+

„těsnící“ zóna kost

H+

„těsnící“ zóna

Multiple pathways deliver material to lysosomes

endocytosis macropinocytosis phagocytosis

EE M6PR „scavenger pathway“

chaperone mediated autophagy

LE

LY

exocytosis

M6PR

NC

secretory vesicle

Golgi autophagy Image M.H.

EE – early endosome LE – late endosome M6PR – mannosa-6-phosphate receptor LY – lysosome NC - nucleus

Autofagie Makroautofagie Mikroautofagie Chaperony zprostředkovaná autofagie proteiny obsahující specifickou signální sekvenci translokace proteinů přes lysosomální membránu se účastní chaperony internalizace pomocí receptoru LAMP2a v lysosomální membráně

Lysosomální membránový protein LAMP2 je receptorem, který se účastní fůze autofagických vakuol s lysosomy

Autophagie je proces při kterém buňka odbourává části vlastní cytoplasmy nebo organely Autophagosomy s dvojitou membránou obkrouží organely nebo části cytosolu a sfůzují s lysosomy V postmitotických buňkách (neurony, myokard) probíhá autofagie konstitutivně Autofagie je upregulována v odpovědi na:  nedostatek živin  nedostatek růstových faktorů  ER stress  infekce patogeny

Mizushima, Genes and Development, 2007

Morfologie of autofagosomu a autolysosomu







Šipky: autofagosomy Dvojité šipky: autolysosomy/amfisomy Hlavičky šipek: fragmenty endoplasmatického retikula v autofagosomu

Mizushima, Genes and Development, 2007

Import lysosomálních proteinů do lysosomu Luminální lysosomální proteiny: – mannosa-6 fosfátový receptor Lysosomální membránové proteiny: - signály v C-terminnálním konci proteinu - signály jsou rozpoznávány adaptorovými proteiny (AP3..) v trans-Golgiho aparátu Některé lysosomální proteiny jsou transportovány alternativními transportery (sortilin, LIMP2) prosaposin : sortilin, glukocerebrosidáza: LIMP-2(SCARB2) a další ...

Obecné patogenetické mechanismy u lysosomálních onemocnění

Poruchy metabolických, signálních a transportních cest u lysosomálních chorob 

Akumulace sekundárních metabolitů



Poruchy kalciové homeostázy



Volné radikály a oxidativní stress



Neuroinflammace



Aktivace autofagie

Poruchy metabolických, signálních a transportních cest u lysosomálních chorob 







Akumulace sekundárních metabolitů U mnoha lysosomálních onemocnění se hromadí sekundární metabolity, velmi často lipidy Často se akumulují např. gangliosidy GM3, GM2, cholesterol … i když enzymatický aparát pro jejich odbourávání je přítomen Příklad: u mukopolysacharidos (poruch odbourávání komplexních polysacharidů) dochází v mozku ke střádání glykolipidů gangliosidů GM2 a GM3

Poruchy metabolických, signálních a transportních cest u lysosomálních chorob 



 



Poruchy kalciové homeostázy Porucha kalciového signálování je důležitou patobiochemickou poruchou u lysosomálních onemonění Příklad: Glukosylceramid – glykolipid střádaný u Gaucherovy choroby moduluje funkci ryanodinových receptorů v mozku a vede k většímu efluxu Ca++ do cytosolu ER v neuronech U dalších lysosomálních nemocí také jsou poruchy kalciového signálování - jiné mechanismy

Poruchy metabolických, signálních a transportních cest u lysosomálních chorob 







Volné radikály a oxidativní stress u řady lysosomálních onemocnění lze prokázat známky oxidativního stresu a zvýšené produkce kyslíkových radikálů mechanismus není zřejmý - zřejmě se jedná o sekundární zvýšení, např. v důsledku stresu endoplasmatického retikula Předpokládá se, že se oxidativní stress může podílet na patogenesi lysosomálních nemocí, zvláště v mozku

Poruchy metabolických, signálních a transportních cest u lysosomálních chorob 

Neuroinflamace

Známky neuroinflamace jsou přítomny u prakticky všech lysosomálních chorob s postižením CNS  Aktivace imunitního systému - mikroglie  Podobné známky jsou přítomné u “klasických“ neurodegenerativních chorob jako je Parkinsonova nebo Alzheimerova choroba  Aktivace mikroglie u lysosomálních onemocnění přispívá zřejmě k poškození neuronů 

Poruchy metabolických, signálních a transportních cest u lysosomálních chorob Abnormální autofagie  vakuolární mechanismus pro odbourání poškozených organel a dlouhověkých proteinů  zvýšená autofagie je přítomna u řady lysosomálních nemocí, může vést k poškození buňky a buněčné smrti  mechanismus není jasný, ale může přispívat k patogenesi 



u Danonovy choroby - akumulace autofagických vakuol

Transport solubilních lysosomálních proteinů pomocí manosa-6fosfátových receptorů

Třídění proteinů obsahujících M6P

Většina solubilních (luminálních) proteinů, tj. naprostá většina lysosomálních hydrolas, je transportována do lysosomu prostřednictvím mannosa-6-fosfátového receptoru

M6P signál je vytvářen na N-vázaných oligosacharidech glykoproteinů Glc Nac phosphotransferasou in cis-Golgi N-acetylglucosamine phosphotransferasa (GlcNac phosphotransferasa) rozpoznává 3-D strukturu na lysosomálních proteinech Hydrolase carrying M6P moiety

Chránící skupina (GlcNac) group enzymaticky odstraněna v transGolgi, M6P se tím obnaží

GlcNac GlcNac phosphotransferase

GlcNac diphospho uridine

Hydrolase with N-linked oligosaccharide

UMP

Image M.H.

Třídění lysosomálních proteinů obsahujících M6P protein-M6P-M6PR

lysosom

protein-M6P protein protein

trans-Golgi

Sekreční cesta

MP6 receptory vychytávají lysosomální enzymy receptoremzprostřdkovanou endocytosou na plasmatické membráně

endocytosis phagocytic vacuole

EE M6PR „scavenger pathway“

EE – early endosome LE – late endosome M6PR – mannosa-6-phosphate receptor LY – lysosome NC - nucleus

chaperone mediated autophagy

LE

LY

exocytosis

M6PR

NC

secretory vesicle

Golgi autophagic vacuole

Lysosomální hydrolasy a jejich aktivátory

Lysosomální enzymy 30 enzymů, jejichž dědičné deficity způsobují lidská onemocnění Střádáné substráty/nemoci: lipidy – lipidosy, včetně sphingolipidos glykosaminoglycany – mukopolysacharidosy N-glykany, oligosacharidy – glycoproteinosy glykogen – glykogenosa typu II (Pompeho choroba) proteiny – proteinosy

N-acetyltransferase activity n=5

n=22

n=103

R412X/wt

Patients

Heterozygotes

Controls

Aktivátory lysosomálních hydrolas

Glykosidasy, které odbourávají glykosfingolipidy s kratší oligosacharidovou částí (méně než 3 cukerné zbytky), vyžadují aktivátorové proteiny. Aktivátory umožňují katalytickým proteinů přístup ke glykolipidu, který je svou lipidovou částí zanořen v membráně.

Aktivátory lysosomálních hydrolas Saposiny A,B,C,D

Vznikají proteolytickým štěpením prekursorového proteinu prosaposinu. Deficity saposinů vedou k variantním formám deficitů hydrolas, které aktivují

(např. : metachromatická leukodystrofie je způsobena deficitem arylsulfatasy A. Arylsulfatasa A je aktivována saposinem B. Deficit saposinu B způsobuje variantní metachromatickou leukodystrofii

GM2 ativátor aktivuje hexosaminidasu A

Proteolytické procesován prosaposinu

Předpokládaný mechanismus účinku GM2 aktivátoru

Lysosomální membránové proteiny

Lysosomální membrána obsahuje proteiny podílející se na fůzi a rozpojování vakuol, transportní proteiny pro aminokyseliny, sacharidy ... , proteiny podílející se na transportu lysosomálních proteinů, V-ATPasu a řadu proteinů o neznámé funkci LAMP2 je receptor pro autofagii

Přehled lysosomálních onemocnění

LIPIDOSES n=9

2006

lysosome

expanded by storage

NA cbgl uk os NA am c-b -gl in uk id os as am e in i B  -g d ase alak tosi das A eA a-neu ramin idase

e ceramidas e das* i m a se lcer a y n s li cto e a l y a  -g om A g hin se p a t s lfa u yls ar

lysosomal storage disorders Ia

se a MPS t e s lfa a u n=10 id f a t s ase d n i in ro osul m a u s sf. k ron o n a k r u t bgl u Ac-glu N id d D i amin c-a s A o k N u :a-gl A o fatase l C u s t a 6-sulf c A N c Gl GalNAc-6-sulfat sulfa tase GalNA c-4s u l f * atsulfatase * Nh-yaaluron * asp cetyl-aidase (hya luro ar -ga nic a ty lac cid) lg tos lu am ko ini da sa se m in id as e

ase d i s o nn ase b-Ma d i s no n a a-M

ylp

pa lm ito yl GSD IIa th ioe cid a-1 ste ,4-g ra luc o si s e das e acid lip ase  -glukosylceram idase

mutant enzyme protein (n=30)

hep a- aran LN-s id ulf ur ata on se id as e

D in I e ep th as ka tid ep

tid

pr ot ein

sidase o t c la a g 

NCL1,2,kong.

* a-Fukosidase

p pe tri

enzymopathies

GLYKOPROTEINOSES n=7

hydrolases 29 transferase 1

Lipidosy – 9 typů Gaucherova choroba – deficit glukocerebrosidasy Fabryho choroba – deficit alfa-galaktosidasy A Niemann-Pickova choroba typu A/B – deficit kyselé sfingomyelinasy Krabbeho choroba – deficit beta-galactosylceramidasy Metachromatická leukodystrofie – deficit arylsulfatasy A etc.

Oligosacharidová část glykosfingolipidů je postupně odbourávána sadou vysoce specifických lysosomálních exoglykosidas.

Fabryho choroba – deficit alfagalaktosidasy A X-vázané onemocnění Lysosomální střádání glykolipidů s terminální alfa-galaktosou, hlavním střádaným substrátem je globotriaosylceramide Střádání v endotelu cév, hladkém svalu cév, kardiomyocytech, glomerulech a tubulech ledvin a dalších buněčných typech

Fabryho choroba – klinický obraz Hypertrofická kardiomyopatie, arytmie Chronické progredující ledvinnému onemocnění a k ledvinnému selhání TIA, parestesie Angiokeratomy, cornea verticilata X-vázané onemocnění U heterozygoních žen je onemocnění většinou mírnější než u mužů stejného věku, fenotyp zřejmě závisí na X-inaktivaci

Example of arrythmia in Fabry disease :Atrial fibrillation with slow ventricular response and a heart rate of 56 bpm. Criteria for LVH with diffuse abnormal repolarization. http://www.lysosomalstorageresearch.ca/Fabry_eClinic/electrocardiography-ecg.html

Gaucherova choroba Lysosomální střádavé onemocnění Deficit glukocerebrosidasy (kyselé betaglukosidasy) Akumulace glukosylceramidu přednostně v lysosomech buněk makrofágového původu (Gaucherovy buňky) Multisystémové onemocnění Hepatomegalie, splenomegalie, kostní onemocnění, trombocytopenie, anemie, infiltrace plic U 2. a 3. typu onemocnění postižení CNS Značná klinická variabilita, chronicky progredující onemocnění Typ 1: chronický non-neuropatický Typ 2: akutní neuronopatický Typ 3: chronický neuronopatický

genzyme

Niemann-Pickova choroba typu C 

Porucha intracelulárního transportu lipidů, zejména cholesterolu

Neuroviscerální onemocnění : velmi variabilní klinický obraz  prolongovaná neonatální žloutenka nebo cholestáza, isolovaná splenomegalie nebo hepatosplenomegalie  později progredující neurologické příznaky_ ataxie, neobratnost, pády. spasticita, křeče, dysarthie nebo dysfagie,  typické: obrna pohledu vzhůru, gelastická kataplexie  psychiatrické příznaky: presenilní kognitivní porucha, demence, paranoia (halucinace, ...) 

Vanier 2010

Niemann-Pickova choroba typu C Porucha intracelulárního transportu lipidů, zejména cholesterolu  akumulace neesterifikovaného cholesterolu a glykolipidů v pozdních endosomech/lysosomech  Porucha transportu LDL cholesterolu  porucha fůze pozdních endozomů a lysosomu 



mutace v dvou proteinech podílejících se na transportu cholesterolu - NPC1 a NPC2

Intracelulární transport LDL cholesterolu

Funkce NPC1 a NPC2 

Solubilní NPC2 váže cholesterol odvozený od LDL a předává NPC1  NPC1 zřejmě zajistí přesun cholesterolu přes glycocalyx 

V NPC1 je vázán cholesterol na N-terminální doménu hydroxylem dovnitř, v NPC2 je to naopak

Mukopolysacharidy Mukopolysacharidy (glykosaminoglykany) jsou polysacharidy s lineárními řetězci, ve který se opakuje disacharidová jednotka (složená z glukosaminu a uronové kyseliny). Glykosaminoglykany jsou často hojně acetylované a sulfatované.

běžné typy glykosaminoglykanů:

Heparan sulfát Dermatan sulfát Keratan sulfát Chondroitin sulfát Heparin má strukturu podobnou heparan sulfátu

Glykosaminoglykany jsou součástí proteoglykanů

Glykosaminoglykany jsou postupně odbourávány lysosomálními glykosidasami v sériii na sebe navazujících kroků

Mukopolysacharidosy 11 onemocnění Nejběžnější: MPS I – morbus Hurler – deficit alfa-iduronidasy, AR dědičnost MPS II- morbus Hunter - deficit iduronátsulfát sulfatasy. X-vázané onemocnění. Běžné příznaky: Progredující psychomotorická regrese, hepatosplenomegalie, faciální dysmorfie (“obličej chrliče”), kostní onemocnění (dysostosis multiplex), zákaly rohovky, srdeční onemocnění

Mukopolysacharidosy Heparan sulfát, dermatan sulfát MPS I (Hurler, Scheie) 4p16.3 MPS II (Hunter) Xq28

alfa-lduronidasa Iduronát sulfatasa

Heparan sulfát MPS IIIa (SanfilippoA) 17q25.3 MPS IIIb (Sanfilippo B) 17q21 MPS IIIc(SanfilippoC) 8p11.1 MPS IIID (Sanfilippo D) 12q14

Heparan N-sulfatasa N-acetyl glukosaminidasa Acetyl-CoA transferasa N-acetyl glukosamine 6-sulfatasa

Keratan sulfát MPS IVA (Morquio A) 16q24.3 MPS IV B (Morquio B) 3p31.33

Galaktosa 6-sulfatasa beta-galaktosidasa

Deramatan sulfát MPS VI MPS VII (Sly)

5q11-13 N-Acetylgalaktosamine 4-sulfatasa 7q21.11 beta-glukuronidasa

Hyaluronová kyselina MPS IX 3p21.3

Hyaluronidasa

Mukopolysacharidosa III, MPS III Sanfilippova choroba Zprvu normální vývoj V cca 2 – 6 letech se objevuje nápadný psychomotorický neklid, poruchy spánku, vývojové opoždění Hrubé obličejové rysy drsné vlasy, malé zvětšení jater a sleziny, Spasticita, demence, smrt mezi 15 - 25 lety

Glykoproteinosy jsou způsobeny deficit enzymů, které se podílí na odbourávání sacharidové části N-vázaných glykoproteinů. Klinické symptomy jsou podobné mukopolysacharidosám.

I-cell disease (mukolipidosa II) Porucha transportu proteinů obsahujících M6P signál způsobená mutacemi v N-acetylglukosamin 1fosfotransferáze Zvýšené aktivity lysosomálních proteinů v extracelulární tekutině (a v plasmě) Snížené aktivity mnoha lysosomálních enzymů ve tkáních Zvětšené lysosomy díky lysosomálnímu střádání : I-cell = Inclusion cell disease

|Mukolipidosa II (I-cell disease) Hrubé obličejové rysy, Ztluštělé dásně Malá hepatomegalie a splenomegalie Kosní onemocnění – dysostosis multiplex Psychomototická retardsace Zvýšené aktivity lysosomálních hydrolas v plasmě, nízké aktivity ve tkáních Vakuolizace lymfocytů („inkluzní buňky“) = střádající lysosomy Velmi vzácná choroba

Mutace v genu pro N-acetylglukosamin 1-fosfotransferázu cis-Golgi

Lysosomal proteins do not contain M6P signal endoplasmatické retikulum

Mutace v genu pro N-acetylglukosamin-1-fosfotransferázu lysosom

protein-M6P-M6PR protein

Proteiny normálně transportované M6PR nejsou směřovány do lysosomu protein

sekrece

... ale jsou sekretovány mimo buňku. cis-Golgi

Figure 1 A lymphocyte with many vacuole-like inclusions (original magnification, x900).

van der Meer, W et al. J Clin Pathol 2001;54:724-726

Copyright ©2001 BMJ Publishing Group Ltd.

Figure 3 Electron microscopic image of lymphocytic vacuoles containing round osmiophilic structures (original magnification, x15 000).

van der Meer, W et al. J Clin Pathol 2001;54:724-726

Copyright ©2001 BMJ Publishing Group Ltd.

Kostní změny u I-cell disease

Danonova choroba – deficit LAMP2 Lamp 2 se podílí na fůzi lysosomů s autofagosomy Kardiomyopatie – obvykle hypertrofická , ale může být i dilatační. Arrytmie – typicky syndrom preexcitace - Wolf-Parkinson-White U mužů někdy intelektový deficit Další symptomy X-vázané onemocnění U žen obvykle mírnější průběh

Akumulace autofagických vakuol zejména v srdečním a kosterním svalu

X-vázaná dědičnost u Danonovy choroby

Deficity transportních proteinů v lysosomání membráně Cystinosisa – deficit cystinosinu ledvinné onemocnění s Fanconiho syndromem renální selhání – transplantace ledvin krystaly v rohovce, fotofobie Porucha růstu hypothyreosa normální inteligence Isolovaná oční forma Sialurie – deficit sialinu

cystin

cysteamin

Cystinosa

cystin

cysteamin

Cystinosa

Poruchy biogenese a funkce lysosomům příbuzných organel Skupina nemocí obvykle spojená s těmito příznaky: - albinismus (v důsledku dysfunkce melanosomu) - porucha viděnís - zvýšená krvácivost (dysfunkce krevních destiček) - zánětlivé střevní onemocnění - plicní fibrosa - imunodeficit - v tkáních “obrovské” lysosomy Syndromy Heřmanského-Pudláka, Griscelliho, Chediak-Higashiho aj. heatherkirkwood.blogspot.cz

Léčba a diagnostika lysosomálních onemocnění

Transplantace kostní dřeně Transfer hematopoetických kmenových buněk Pro: Na rozdíl od náhrady enzymu může ovlivnit postižení CNS Proti: Vysoká morbidita a mortalita Lysosomální onemocnění Mukopolysacharidosa I Transplantace mění průběh onemocnění Časná léčba může předejít postižení CNS Residuální nemoc Jiné mukopolysacharidosy MPS III – žádná změna v prgresi neurologického onemocnění - od transplantací bylo pro proto u MPS III upuštěno Jiná lysosomální onemocnění Peroxisomální onemocnění X-ALD

http://www.bmtinfonet.org/bmt/bmt. book/chapter.1.html#p13

Třídění proteinů nesoucích M6P protein-M6P-M6PR

lysosom

protein-M6P protein protein

cis-Golgi

Sekreční cesta

Léčba náhradou enzymu u Gaucherovy choroby Receptorem zprostředkovaná endocytosa Glukocerebrosidasa modifikovaná působením exoglykosidas Vychytávána mannosovým receptorem (makrofágy, endotel, hepatocyty)

Původně glukocerebrosidas izolovaná z lidských placent (Ceredase, Genzyme) Nyní rekombinantní enzym Cerezyme (Genzyme) – produkce v Cho cells Nepřekračuje hematoencefalickou bariéru Vysoké náklady (miliony Kč/rok)

Léčba náhradou enzymu Náhrada deficitního enzymu v pravidelných infusích Gaucherova choroba (glucocerebrosidasa) Fabryho choroba (alfa-galactosidasa A) Pompeho choroba (kyselá alfa-glukosidasa) MPS I (alfa-iduronidasa) MPS II (alfa-iduronát sulfatasa) MPS VI, Maroteaux-Lamy (arylsulfatasa B) Niemann-Pick disease B (kyselá sfingomyelinasa) MPS IVA, Morquio A, ...

Produkce rekombinantních enzymů

Genzyme, TKT, Biomarin, Shire, Inotech, Protalix ...

Léčba omezením tvorby substrátu (Substrate reduction therapy) pro Gaucherovu chorobu Inhibice syntézy glykosfingolipidů Miglustat (OGT 918, SC-48334, N-butyldeoxynojirimycin, Zavesca(Actelion)): iminocukr, orální podávání Inhibuje glukosyceramid synthasu Mutantní enzymy mají často zbytkovou aktivitu

J. Clin. Invest. 103(4): 497505 (1999).

Diagnostika Stanovení metabolitů Měření enzymové aktivity Analýza mutací Morfologická diagnostika