Kyselina hyaluronová Streptococcus equi subsp. zooepidemicus a jím produkovaná kyselina hyaluronová a glukuronidáza Marcela Tlustá Biotechnologická laboratoĜ
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Kyselina hyaluronová
Meyer a Palmer, 1934 Extracelulární matrix, matrix oþní sklivec, sklivec synoviální tekutina, kĤåH K Kyselina li glukuronová l k á (GlcUA) (Gl UA) N-acetylglucosamin (GlcNAc) acety g ucosa (G c c) E1,3 a E1,4 Od nČNROLND N'D DåSRQČkolik MDa
Kyselina hyaluronová NevČtvená vlákna, v roztocích helikální konfigurace V lik t polymeru: Velikost l kD - MDa kDa MD Interakce s molekulami vody V lký hydrodynamický Velký h d d i ký objem bj Roztoky s vysokou viskozitou a elasticitou Vynikající mazací vlastnosti VýplĖ prostoru Filtraþní vlastnosti Vazba na receptory CD44, RHAMM Proliferace, lokomoce bunČk, interakce s leukocyty, atd.
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Kyselina hyaluronová
Kapsulární polysacharid
Sklivec oka Synoviální tekutina Extracelulární matrix KĤåH PĜirození mikrobiální producenti: Streptococcus P t l Pasteurela
Rekombinantní mikrobiální producenti: E. coli B. subtilis L. lactis
Biotechnologická produkce HA
SEZ
Kohoutí hĜebínky, hĜebínky sklivec oka hovČzího dobytka, kloubní tekutina, pupeþní šĖĤra St t Streptococcus skupina k i AaC Bacillus subtilis Kosmetický prĤmysl Farmaceutický prĤmysl PotravináĜský prĤmysl
Streptococcus equi subsp. subsp zooepidemicus Skupina C Nehemolytický Glukuronidáza pozitivní vysokokapsulární 3-5 g/l HA 1 5 - 2 MDa 1,5 MD
Myšlenka Intracelulární glukuronidáza UDP-GlcUA UDP GlcUA substrát pro glukuronidázu UDP-GlcUA prekurzor prudukce HA Kompetice HA syntázy a glukuronidázy Deaktivace genu pro glukuronidázu Porovnaní míry produkce
Deaktivace Transkripþní úroveĖ Zastavení pĜepisu mRNA Z Č ZmČnami i v promotoru t (delece) (d l )
Translaþní úroveĖ Zastavení syntézy proteinu Delece RBS
Funkþní úroveĖ ZmČna sekvence v ORF inzerce nebo delece sekvencí v ORF
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Deaktivace genu glukuronidázy Na transkripþní úrovni 9\XåLWt homologní rekombinace Delece celé promotorové oblasti Delece zaþátku ORF Zastavení pĜepisu genu Bez glukuronidázové aktivity ŠetĜení energie
Konstrukce mutaþní kazety 2 homologické rekombinaþní úseky PĜed a za deletovanou þástí Velikost úsekĤ – pĜLEOLåQČ stejná Primery – pĜLEOLåQČ stejná teplota topení VnČjší primery modifikované na 5’ 5 konci rozpoznávacím místem pro RE Jeden vnitĜní modifikovaný na 5’ konci reverzní formou druhého vnitĜního
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Mutaþní kazeta
Konstrukce mutaþní kazety HRU1 HRU2 HRU1+2
Separace na elfo
650 bp 750 bp 1400 bp.
Klonování pUC19 EcoRI linearizace Defosforilace HRU1+2 extrakce z gelu ŠtČpení EcoRI Ligace pUC19 a mutaþní kazety Transformace E. coli DH5D Bílomodrá selekce rekombinantních klonĤ Sekvenþní analýza plazmidĤ
Bílo - modrá selekce
Reklonování Replikovatelný v E. coli i ve S. equi subsp. p zooepidemicus PodmínČná replikace (teplota 32°C) D t Determinanta i t antibiotikové tibi tik é rezistence i t E. co coli RR1 Bez selekce rekombinantních klonĤ 1Låãt~þinnost identifikace klonĤ s p rekombinantním plazmidem
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Porovnání
Blokování genu Inzercí cizorodé DNA Jednoduchá homologická g rekombinace
delecí úseku DNA D jitá h Dvojitá homologická l i ká rekombinace k bi
VýmČnou úseku DNA ý Dvojitá homologická rekombinace
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Inzerce vs. delece Inzerce Vyšší y p pravdČpodobnost p Jednodušší selekce Nadbyteþné sekvence
Delece 1LåãtSUDYGČpodobnost 6ORåLWČjší selekce Bez nadbyteþných sekvencí
Mutaþní plazmid 2 rekombinaþní místa PĜed a za deletovanou oblastí
Determinanta antibiotikové rezistence R li jí se i v E. Realizují E colili i v SEZ
Poþátek replikace p Realizují se i v E. coli i v SEZ PodmínČná replikace
Kombinovaná mutace 2 tandemové homologické rekombinace Inzerce: jedna homologická rekombinace Delece: druhá homologická rekombinace PravdČpodobnost jako pĜi inzerci Selekce jako pĜi inzerci Bez nadbyteþných sekvencí jako pĜi deleci
Teplotní zmČny Transformace, 29°C, selekþní tlak Inzerce 37°C 37 C, selekþní tlak Delece 29°C, bez selekþního tlaku Léþba 29°C, bez selekþního tlaku
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
Mutace
Mutace
PCR detekce
Funkþní detekce
Autor prezentace: Mgr. Marcela Tlustá
DČkuji j za pozornost p TČším se na praktickou þást
