KAPANG PEREDUKSI FOSFAT DARI BERBAGAI BIOAKTIVATOR (REDUCING PHOSPHATES MOLD FROM VARIOUS BIOACTIVATORS)

KAPANG PEREDUKSI FOSFAT DARI BERBAGAI BIOAKTIVATOR (REDUCING PHOSPHATES MOLD FROM VARIOUS BIOACTIVATORS) Adyanti K. Sutoro*, N.D. Kuswytasari1, Maya Shovitri1

Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya ABSTRAK Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi kapang dari bioaktivator Orlitani, Tunas Windu, Petro Gladiator dan Bio Extrim. Isolat kemudian diuji kemampuannya mereduksi fosfat dalam medium Pikovskaya dengan 3 (tiga) sumber fosfat yang berbeda, yaitu AlPO4 (Aluminum orthophosphate), Ca3(PO4)2 (Tricalcium diphosphate) atau P2O5 (Phosphorus oksida). Parameter yang diukur adalah rasio antara diameter isolat kapang dan diameter zona bening yang disebut dengan Indeks Reduksi Fosfat (IRF). Pada penelitian ini kapang yang berhasil diidentifikasi dari bioaktivator Orlitani adalah Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Rhizopus sp., Penicillium sp. Trichoderma sp.1 dan Trichoderma sp.2. Pada bioaktivator Tunas Windu, teridentifikasi Rhizopus sp., Nigrospora sp dan Aspergillus awamori. Pada bioaktivator Petro Gladiator, isolate kapang yang diidentifikasi adalah Rhizopus sp., Aspergillus awamori dan Aspergillus niger. Pada bioaktivator Bio Extrim, teridentifikasi Fusarium sp. dan Rhizopus sp. Hasil uji reduksi fosfat menunjukkan bahwa 7 (tujuh) isolat kapang mampu mereduksi Ca 3(PO4)2, yaitu Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Penicillium sp. Trichoderma sp.1, Trichoderma sp.2 dan Fusarium sp.. Terdapat 4 (empat) isolat kapang yang mampu mereduksi P2O5 yaitu Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus awamori dan Fusarium sp..Tidak satupun isolat kapang yang mampu mereduksi AlPO4. Kata kunci : Kapang, Bioaktivator, Reduksi Fosfat ABSTRACT In this research, isolation and identification of molds in four different bioactivators collected from Orlitani, Tunas Windu, Petro Gladiator and Bio Extrim followed by evaluation of its ability to reduce phosphates in the Pikovskaya medium with three different phosphate sources, AlPO4 (Aluminum orthophosphate), Ca3(PO4)2 (Tricalcium diphosphate) and P2O5 (Phosphorus oxide). The measured parameters taken were the ratio between the diameter of clear zone diameter with the diameter of mold isolate which is then called Phosphate Reduction Index (IRF). The molds were identified from Orlitani is Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Rhizopus sp., Penicillium sp. Trichoderma sp.1 and Trichoderma sp.2. From Tunas Windu were identified Rhizopus sp., Nigrospora sp and Aspergillus awamori. At Petro Gladiator were identified Rhizopus sp., Aspergillus awamori and Aspergillus niger. In Bio Extrim were identified Fusarium sp. and Rhizopus sp. The results showed, seven mold isolates that have ability in reducing phosphate Ca3(PO4)2 are Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Penicillium sp. Trichoderma sp.1, Trichoderma sp.2 dan Fusarium sp.. Four mold isolates mold that have ability in reducing phosphate P2O5 are Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus awamori dan Fusarium sp.. At last, no mold isolates that could reduce phosphate AlPO4. Keyword : Molds, Bioactivators, Phospate Reduction *Corresponding Author Phone : +6281216368685 email : [email protected] 1Alamat sekarang : Prodi Biologi, FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya 1

I PENDAHULUAN Fosfor (P) termasuk unsur hara makro yang dibutuhkan oleh tumbuhan. Apabila kekurangan unsur P, pertumbuhan tanaman akan terhambat, daun menjadi tipis, kecil dan tidak mengkilat, daun dan buah rontok sebelum waktunya, batangnya menjadi gopong (lubang di tengah), terkadang terdapat bercak pada tepi atau ujung daun (nekrosis). Fungsi penting P lainnya adalah sebagai penyusun adenosin triphosphate (ATP) yang terkait dalam metabolisme tumbuhan (Dobermann and Fairhurst, 2000). Unsur P di alam berikatan dengan oksigen yang disebut senyawa fosfat. Tanaman menyerap fosfat dalam bentuk ion fosfat anorganik terutama H2PO4-, dan HPO42-. Namun, ketersediaan fosfat dalam tanah di Indonesia umumnya sangat rendah yang disebabkan karena fosfat terikat menjadi AlPO4 pada tanah asam atau Ca3(PO4)2 pada tanah basa. Tumbuhan tidak dapat menyerap fosfat terikat sehingga harus diubah menjadi bentuk yang dapat diserap tumbuhan (Elfiati, 2005). Kapang (molds) adalah jamur berfilamen (Brock et al., 1994). Kapang merupakan mikroorganisme tanah yang mampu mereduksi fosfat terikat menjadi fosfat yang dapat diserap oleh tumbuhan dengan bantuan enzim fosfatase (Cunningham dan Kuiack, 1992). Aspergillus sp., Penicilium sp. Dan Trichoderma sp. Diketahui mampu mereduksi fosfat (Elfiati, 2005) Dalam skala laboratorium, uji reduksi fosfat menggunakan medium Pikovskaya. Fosfat yang telah tereduksi akan membentuk zona bening di sekitar koloni kapang. Fosfat tereduksi dengan bantuan enzim fosfatase yang disekresikan oleh koloni kapang tersebut. Kemampuan kapang dalam mereduksi fosfat ditunjukkan dari rasio diameter koloni kapang dan diameter zona bening yang terbentuk (Saryono dkk, 2002) Saat ini telah banyak beredar pupuk organik berupa kompos yang dapat meningkatkan hasil pertanian, memperbaiki tekstur tanah dan meningkatkan kandungan unsur hara tanah yang tersedia bagi tumbuhan dalam bentuk yang dapat diserap oleh tumbuhan (Goenadi, 1993). Kompos merupakan hasil degradasi bahan organik yang dilakukan oleh mikroorganisme. Pada 2

proses pengomposan bahan organik biasanya ditambahkan bioaktivator yang mengandung mikroorganisme yang dapat mereduksi lignin, selulosa, protein, lipid, amilum, dan mikrorganisme yang dapat memfiksasi nitrogen. Nurmajdi (2004), Mala dkk, (1999) dan Jasmaniar (2006) telah berhasil menunjukkan bahwa mikroorganisme yang terkandung dalam bioaktivator dapat mempercepat laju pengomposan bahan organik sehingga kandungan fosfat dalam tanah dapat dimanfaatkan langsung oleh tumbuhan. Kelebihan Penggunaaan bioaktivator yaitu bioaktivator mengandung strain terpilih berdaya adaptasi tinggi yang dikemas dalam bahan pembawa alami sehingga dapat mempertahankan daya hidup mikroba hingga satu tahun,tidak mencemari lingkungan karena tidak mengandung senyawa kimia, mempercepat proses pengomposan, lebih mudah, lebih murah dan tidak memerlukan bahan tambahan lain serta meningkatkan kandungan bahan organik tanah, memperbaiki struktur tanah, dan ketersediaan hara dalam tanah. Biaktivator yang beredar di pasaran saat ini sangatlah beragam, misalnya saja Petro Gladiator, Orlitani, Bio Extrim dan Bioaktivator Tunas Windu. Permasalahan yang dihadapi dalam penelitian ini adalah kapang apa saja yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari ke-4 (empat) bioaktivator yang digunakan. Selanjutnya, isolat kapang manakah dari ke-4 (empat) bioaktivator tersebut yang memiliki kemampuan dalam mereduksi fosfat terikat. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang jenis kapang yang terdapat pada beberapa bioaktivator yang memiliki kemampuan dalam mereduksi fosfat terikat dari AlPO4 (biasanya terdapat pada tanah asam), Ca3(PO4)2 (biasanya terdapat pada tanah basa) dan P2O5 (biasanya terdapat pada tanah netral). II METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Pelaksanaan tugas akhir rencananya akan dilakukan pada bulan April –Juni 2010 di Laboratorium Mikologi, Jurusan Biologi FMIPA ITS.

Pembuatan Medium PDB (Potato Dextrose Broth) Chloramphenicol 100 ‰ Potato Dextrose Broth (Oxoid®, Inggris) sebanyak 24 gram dan Chloramphenicolsebanyak 100 mg dilarutkan dengan akuades hingga 1000 ml di dalam erlenmeyer. Medium cair kemudian dihomogenkan dengan magnetic stirer sampai larut dan dipanaskan hingga mendidih. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan plastik wrap. Medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C dan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. Pembuatan Medium PDA (Potatoes Dextrose Agar) Chloramphenicol 100 ‰ Potato Dextrose Agar (Oxoid®, Inggris) sebanyak 39 gram dan Chloramphenicolsebanyak 100 mg dilarutkan dengan akuades hingga 1000 ml akuades. Medium cair kemudian dihomogenkan dengan magnetic stirer sampai larut dan dipanaskan hingga mendidih. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan plastik wrap. Medium disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C dan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. Pembuatan Medium Pikovskaya Chloramphenicol 100 ‰ Glukosa sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Lalu ditambahkan masing-masing Sumber Fosfat (Ca3(PO4)2 atau AlPO4 atau P2O5) 2,5 gr, Natrium klorida (NaCl) 0,1 gram, Amonium sulfat ((NH4)2SO4) 0,25 gram, Kalium klorida (KCl) 0,1 gram, Magnesium sulfat anhidrat (MgSO4.7H2O) 0,05 gram, MnSO4 1,25 mg, FeSO4 1,25 mg, yeast extract 0,25 gram, 100 mg chloramphenicol dan agar 5 gram. Akuades dimasukkan ke dalam erlenmeyer hingga volume 500 ml, lalu diletakkan di atas magnetic stirer. Semua bahan dalam erlenmeyer distirer hingga tercampur. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan plastik wrap. Medium disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0C dan tekanan 1,5 atm selama 15 menit (dimodifikasi dari Elzouni,2008). Isolasi Kapang dari Bioaktivator Sumber inokulum adalah Biaktivator Petro Gladiator, Orlitani, Bio Extrim dan 3

Bioaktivator Tunas Windu.Kapang diaktivasi terlebih dahulu dengan cara memasukkan bioaktivator bubuk sebanyak 10 mg atau bioaktivator cair sebanyak 10 ml ke dalam 100 ml medium Potatoes Dextrose Broth. Kemudian di shaker selama 168 jam (Boldu, 2001). Isolasi kapang dilakukan dengan metode pengenceran bertingkat sampai 10-6 dan metode tuang.Kultur bioaktivator diambil sebanyak 1 ml, kemudian diinokulasikan ke dalam akuades steril 9 ml dan di-vortex agar bercampur (disebut suspensi dengan pengenceran 10-1). Suspensi pengenceran 10-1 diambil sebanyak 1 ml dengan mikropipet dan dimasukkan ke dalam akuades steril 9 ml, kemudian di-vortex (disebut suspensi dengan pengenceran 10-2). Hal ini dilakukan terus sampai pengenceran 10-6. Mulai sampel pengenceran 10-4hingga 10-6diambil sebanyak 0,1 ml lalu dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Cawan Petri berisi sampel ditambahkan medium PDA cair secukupnya, kemudian digerak-gerakkan membentuk angka delapan. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 4 hari dengan posisi cawan Petri terbalik (Siswanto, 2006). Pemurnian Isolat Kapang Koloni kapang yang tumbuh dimurnikan dengan propagasi koloni, yaitu memotong dan memindahkan secara aseptik sebagian hifa/miselium kapang ke dalam medium biakan padat baru (Alexopoulos et al., 1996) dan diinkubasi pada suhu ruang sampai tumbuh koloni. Pemindahan koloni dilakukan secara bertingkat sebanyak 3 kali sampai diperoleh isolat murni. Isolat murni kemudian diinokulasi ke dalam tabung reaksi berisi medium padat miring secara duplo. Satu tabung untuk proses identifikasi dan karakterisasi, sedangkan satu tabung lainnya untuk sediaan biakanyang disimpan dalam lemari es pada suhu 40C. Identifikasi Isolat Kapang Identifikasi isolat kapang dilakukan berdasarkan karakteristik makroskopis dan mikroskopis. Untuk mengidentifikasi isolat kapang, maka hasil pengamatan dicocokkan dengan buku Pengenalan Kapang Tropik Umum (Gandjar, 1999), Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi Morphologies of Cultured Fungi and Key to Species

(Watanabe, 2002), The Genus Aspergillus (Raper et al., 1965) dan Fungi and Food Spoilage (Pitt et. al.,2009) Karakteristik Makroskopis Untuk mengamati ciri makroskopisnya maka setiap isolat murni kapang diinokulasi ke dalam suatu media agar datar kemudian di inkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Karakteristik Mikroskopis Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan cara membuat slide culture. Kertas saring steril diletakkan pada bagian dasar cawan petri steril secara aseptik dengan menggunakan penjepit. Batang gelas steril berbentuk “U” diletakkan di atas kertas saring tersebut. Kemudian dengan penjepit, kaca objek steril diletakkan di atas batang gelas tersebut. Akuades sebanyak 4 ml di tuang pada kertas saring. Medium PDA kosong dipotong berbentuk kotak 1 cm x 1 cm menggunakan scalpel steril dan diletakkan di atas kaca objek secara aseptis. Isolat murni diambil dengan jarum inokulasi steril kemudian ditusukkan ke bagian tengah kotak medium padat dan empat sisi yang lain kemudian ditutup dengan kaca penutup steril. Preparat biakan kemudian diinkubasi pada suhu kamar (25oC) selama 48 jam. Setelah kapang bersporulasi maka dilakukan pewarnaan dengan lactophenol cotton blue (LPCB). Pewarnaan dengan LPCB dilakukan dengan cara kaca penutup dibuka dan preparat biakan ditetesi etanol 95% sebanyak 1 tetes dan diikuti dengan LPCB sebanyak 12 tetes, kemudian preparat ditutup dengan kaca penutup steril. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100400x. Uji Pereduksi Fosfat Biakan murni hasil dari pemurnian isolat kapang diinokulasi pada medium Pikovskaya dalam cawan petri untuk mengetahui pembentukan zona bening. Isolat kapang diambil dengan jarum tanam tajam yang telah steril kemudian diinokulasi pada cawan petri berisi medium Pikovskaya. Pengamatan dilakukan pada saat diameter isolat kapang yang diuji mencapai 3 cm. Pengamatan yang

4

dilakukan adalah ada tidaknya zona bening dan selanjutnya apabila isolat kapang tersebut membentuk zona bening, dengan menggunakan rumus dapat diperoleh indeks reduksi fosfatnya. Ulangan dilakukan sebanyak 3 kali. Adapun rumus Indeks Reduksi adalah rumus sebagai berikut:

Analisis Data Kemampuan isolat kapang dalam mereduksi fosfat dideskripsikan apakah mampu membentuk zona bening atau tidak. Selanjutnya dicari kapang manakah yang memiliki kemampuan mereduksi fosfat pada masing – masing sumber fosfat (Ca3(PO4)2 atau AlPO4 atau P2O5). III HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil isolasi dan identifikasi kapang Bioaktivator adalah inokulum campuran berbagai jenis mikroorganisme seperti mikroba lignolitik, selulolitik, proteolitik, lipolitik, amilolitik, dan mikroba fiksasi nitrogen yang biasanya digunakan untuk pengomposan bahan organik. Bioaktivator yang digunakan dalam penelitian ini adalah Orlitani, Petro Gladiator, Tunas Windu dan Bio Extrim. Tabel 4.1 menunjukkan isolat kapang yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari ke-4 bioaktivator. Dari bioaktivator Orlitani adalah Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Rhizopus sp., Penicillium sp. Trichoderma sp.1 dan Trichoderma sp.2. Pada bioaktivator Tunas Windu, teridentifikasi Rhizopus sp., Nigrospora sp dan Aspergillus awamori. Pada bioaktivator Petro Gladiator, teridentifikasi Rhizopus sp., Aspergillus awamori dan Aspergillus niger. Pada bioaktivator Bio Extrim, teridentifikasi Fusarium sp. dan Rhizopus sp..

Tabel 4.1 Hasil isolasi dan identifikasi kapang dari bioaktivator Hasil Bioaktivat Makrosko Mikrosko Identifika or pis pis si Aspergill us flavus (O1) Aspergill us niger(O2) Trichoder ORLITAN ma sp.1 I (O3) (Lebih Trichoder detailnya ma sp.2 pada (O4) Lampiran 7) Rhizopus sp. (O5)

TUNAS WINDU (Lebih detailnya pada Lampiran 8)

PETRO GLADIAT OR (Lebih detailnya pada Lampiran 9)

5

Penicilliu m sp. (O6) Aspergill us awamori (T1) Rhizopus sp. (T2) Nigrospo ra sp. (T3) Aspergill us awamori (P1) Aspergill us niger (P2) Rhizopus sp. (P3)

BIO EXTRIM (Lebih detailnya pada Lampiran 10)

Fusarium sp. (B1) Rhizopus sp. (B2)

Kapang pereduksi fosfat Untuk menguji kemampuan isolat kapang dalam mereduksi fosfat, digunakan medium selektif Pikovskaya (Rao dan Sinha, 1963). Medium Pikovskaya berwarna putih keruh karena mengandung P tidak larut seperti trikalsium difosfat (Ca3(PO4)2), aluminium orthofosfat (AlPO4) dan fosfat alam (P2O5). AlPO4 biasanya terdapat pada tanah asam, Ca3(PO4)2 pada tanah basa dan P2O5 pada tanah netral. Pembuatan medium Pikovskaya ini harus steril dan teliti. Pada saat penuangan medium Pikovskaya ke cawan petri steril, harus dilakukan secara aseptis dan digoyang terus menerus agar kekeruhan dalam medium dapat merata. Hal ini memudahkan pengamatan zona bening yang akan terbentuk apabila isolat kapang yang diinokulasikan berpotensi mereduksi fosfat. Luas zona bening tersebut secara kualitatif menunjukkan besar kecilnya kemampuan isolate kapang dalam mereduksi P dari fosfat terikat. Hal ini diperkuat dengan penelitian Rachmiati (1995) yang menyatakan semakin besar diameter zona bening semakin besar pula kemampuan kapang dalam mereduksi fosfat. Kemampuan reduksi fosfat ditunjukkan oleh nilai indeks reduksi fosfat (IRF) yang merupakan rasio antara diameter zona bening yang terbentuk dengan diameter koloni isolat kapang. Diameter koloni isolat kapang mempengaruhi kemampuan isolat kapang dalam mereduksi fosfat, hal ini disebabkan karena semakin tua usia isolat kapang maka metabolisme kapang tersebut semakin sempurna. Oleh sebab itu, pada penelitian ini pengukuran diameter zona bening dilakukan pada saat diameter koloni isolat kapang mencapai ± 3 cm seperti pendapat Pointing (1999). Pada Tabel 4.5 dan Gambar 4.1 dapat dilihat nilai indeks reduksi fosfat (IRF) yang dihasilkan isolat kapang pada Ca3(PO4)2, P2O5 dan AlPO4.

Tabel 4.4 Nilai Indeks Reduksi Fosfat Yang Dihasilkan Isolat Kapang Nilai Indeks Reduksi Fosat (IRF) Bioaktivator Hasil Identifikasi Ca3(PO4)2 P2O5 AlPO4 Aspergillus flavus (O1) 1,09 1,06 0 Aspergillus niger (O2) 1,12 1,06 0 Trichoderma sp.1 (O3) 1,07 0 0 ORLITANI Trichoderma sp.2 (O4) 1,07 0 0 Rhizopus sp. (O5) 0 0 0 Penicillium sp. (O6) 1,03 0 0 Aspergillus awamori (T1) 1,10 1,07 0 TUNAS WINDU Rhizopus sp. (T2) 0 0 0 Nigrospora sp. (T3) 0 0 0 Aspergillus awamori (P1) 1.13 1,09 0 PETRO GLADIATOR Aspergillus niger (P2) 1.17 1,10 0 Rhizopus sp. (P3) 0 0 0 Fusarium sp. (B1) 1,12 1,03 0 BIO EXTRIM Rhizopus sp. (B2) 0 0 0

Gambar 4.1 Grafik Indeks Reduksi Fosfat (IRF) pada saat diameter isolat ± 3 cm pada Fosfat Ca3(PO4)2, AlPO4 dan P2O5 (O1= Aspergillus flavus, O2= Aspergillus niger,O3= Trichoderma sp.1, O4= Trichoderma sp.2, O5= Rhizopus sp., 06= Penicillium sp., T1= Aspergillus awamori, T2= Rhizopus sp., T3= Nigrospora sp., P1= Aspergillus awamori, P2= Aspergillus niger, P3= Rhizopus sp., B1= Fusarium sp., B2= Rhizopussp.) Dari Tabel 4.5 dan Gambar 4.1 terlihat bahwa isolat kapang yang mampu mereduksi Ca3(PO4)2 ada 9 (sembilan) isolat, yaitu dari bioaktivator Orlitani: Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Trichoderma sp.1, Trichoderma sp.2 dan Penicillium sp., dari bioaktivator Tunas Windu: Aspergillus awamori, dari bioaktivator Petro Gladiator: Aspergillus awamori dan Aspergillus niger, dan dari bioaktivator Bio Extrim: Fusarium 6

sp.. Isolat kapang yang memiliki kemampuan tertinggi dalam mereduksi Ca3(PO4)2 adalah Aspergillus niger dari bioaktivator Petro Gladiator dengan nilai IRF 1,17. Tabel 4.5 dan Gambar 4.1 juga menunjukkan bahwa isolat kapang yang mampu mereduksi P2O5 ada 6 (enam) isolat, yaitu dari bioaktivator Orlitani: Aspergillus flavus dan Aspergillus niger, dari bioaktivator Tunas Windu: Aspergillus