2014/11/28
Bioesai Anti Tumor/Kanker KIMIA BIOESAI 2014
CANCER Penyakit degeneratif dengan pertumbuhan seluler yang tidak dapat dikontrol/diatur dan menyebar dalam tubuh
TUMOR Keadaan pertumbuhan seluler yang abnormal shg membentuk kelainan benjolan pada tubuh
Membutuhkan pengobatan jangka Cukup dengan pengangkatan panjang, spt pembedahan, radiasi, tumor. kemoterapi Kondisi yang serious
Biasanya tidak berbahaya.
1
2014/11/28
LYMPHOMA Kanker yang berawal dari kelenjar getah bening
Tipe Kanker
LEUKEMIA kelainan yang dimuai dari sumsum tulang
ADENOMA Kelainan yang terjadi dari tiroid, pituitary.
2
2014/11/28
PenyebabTUMOR Bahan kimia: Benzena Minum alkohol Toksin lingkungan (aflatoxins) Sinar matahari berlebihan Genetik Obesitas Radiasi Virus
:
3
2014/11/28
Gangguan kontrol pertumbuhan Kegagalan dalam melakukan bunuh diri sel. Apoptosis atau bunuh diri sel suatu proses normal untuk menghancurkan sel tua atau sel rusak.
4
2014/11/28
Keseimbangan Pada pembentukan kanker kulit, keseimbangan antara pembelahan sel dan hilangnya sel mengalami perubahan. Sel Basal membelah lebih cepat dibandingkan kematian sel yang lepas pada permukaan
Invasi dan metastasis neoplasma Pertumbuhan sel yang meningkat menghasilkan suatu massa disebut tumor atau neoplasma. Kalau tiada ada proses bunuh diri maka tumor terus tumbuh,
Kanker bisa tumbuh ke seluruh tubuh, melalui: invasi dan metastasis. Invasi dan penetrasi langsung dari migrasi sel kanker ke jaringan sekitar; melalui pembuluh limfe dan darah, ke jaringan lainnya
5
2014/11/28
Hiperplasia dan Displasia
6
2014/11/28
G2 S PHASE SPECIFIC Cytosine Arbinoside Hydroxyurea DNA S PHASE SPECIFIC Synthesis SELF LIMITING 6-Mercaptpurine Methotrexate.
M
M
PHASE PROPHASE METAPHASE SPECIFIC ANAPHASE vincristine TELOPHASE vinblastine
Premitotic Interval
S
paclitaxel
MITOSIS
PHASE NONSPECIFIC
• Tumor Suppressor alkylating agents, cis-platinum Genes -ve (p53) 1 nitrosoureas, • Growth Factors dacarbazine antibiotics+ve R Oncogenes
G
G0 G Differentiation
procarbazine
PENTOSTATIN
Purine synthesis
0
Pyrimidine synthesis
Inhibits adenosine Deaminase
PALA Inhibits Pyrimidine Biosynthesis
Ribonucleotides 6-MERCAPTOPURINE
HYDROXYUREA
6-THIOGAUNINE Inhibit Purine ring biosynthesis Inhibit Neocleotide
Inhibit Ribonucleotide Reductase
Deoxyribonucleotides
interconversions
METHOTREXATE Inhibit dihydrofolate reduction, blocks TMP and Purine synthesis
5-FLOUROURACIL
Inhibit TMP Synthesis
DNA
7
2014/11/28
CYTARABINE FLUDARABINE 2-CHLORODEOXY
BLEOMYCIN ETOPOSIDE TENIPOSIDE
DNA
Damage DNA and Prevent repair
DACTINOMYCINE DAUNORUBICIN DOXORUBICIN MITOXANTRONE Intercalate with DNA Inhibit RNA synthesis
ADENOSINE Inhibit DNA Synthesis ALKYLATING AGENTS MITOMYCETIN CISPLATIN PROCARBAZINE DACARBAZINE
RNA (Transfer, messenger, ribosomal)
PACLITAXEL VINCA ALKALOIDS COLCHICINE
A-ASPARAGINASE
Deaminate asparagine Inhibits protein synthesis
PROTEINS
Enzymes
Form adducts w/ DNA
Microtubules
Inhibit function of Microtubules
Sel hidup dan sel mati • Esai penanda DNA • Esai morfologis • Esai reproduktif
• Esai Integritas membran •Esai Fungsi
8
2014/11/28
Kriteria utama untuk esai viabilitas Category of viability assay Membrane integrity assay
Functional assay
DNA labeling assay
Assays
Principles
-Exclusion dyes -Fluorescent dyes -LDH leakage -Annexin v assay
The determination of membrane integrity via dye exclusion from live cells
-MTT, XTT assay -Crystal violet/ Acid phosphatase(AP) assay -Alamar Blue oxidationreduction assay - Neutral red assay -[3H]-thymidin/ BrdU incorporation
Examining metabolic components that
-Fluorescent conjugates
Morphological mechanism based assay
-Microscopic observation -Caspase 3 detection -PARP cleavage assay
Reproductive assay
-Colony formation assay
are necessary for cell growth
cell selection and viability assay Determination of morphological change
Determination of growth rate
Esai Integritas Membran
9
2014/11/28
Prinsip
Trypan Blue dye Exclusion Methods
Pewarna Ekslusi Memberi gambaran yang membedakan sel hidup dan sel mati termasuk tidak adanya fungsi transpor zat melalui membran plasma karena hilangnya intergritas membran.
Sel harus dihitung dalam rentang waktu 3-5 min karena
berpengaruh pada bertambahnya jumlah warna yang terserap sejalan dengan waktu. - Sel hidup (Viable cells) : kecil, bulat dan refraktif - Sel mati (Non-viable cells) : bengkak, lebih besar dan biru tua
10
2014/11/28
Sel hidup vs sel mati ??
Pewarna Fluorescen Ethidium bromide (EtBr) dan propidium iodide (PI) PI berikatan denan asam nukleat pada kerusakan
membran : teknik flow cytometric tergantung pada fluorescence, PI sangat ideal untuk mengevaluasi sifat permeabilitas dari sel dalam jumlah besar. Hasilnya memberi akurasi statistik yang baik.
PI impermeable terhadap plasma membran yang utuh Interkalasi dengan DNA or RNA merah
11
2014/11/28
Fluorescein diacetate (FDA) suatu nonpolar ester yang dapat melalui membran plasma dan di hidrolisasi oleh esterase intraseluler untuk hasilkan fluorescein bebas, polar fluorescein berada dalam sel yang masih memiliki membran plasma yang utuh. Sel hidup (Undamaged cell) : sangat fluorescen Sel rusak/mati (Damaged cell) : fluorescen lemah
Hijau kekuningan pada 450-480 nm
Ilustrasi dari prinsip esai sel hidup dengan PI/FDA Intact cell – PI and FDA ditambahkan
● FDA (Fluorescein diacetate) ● PI (Propidium iodide)
Membran plasma rusak, fluorescein keluar sel
Fluorescein dlm sel utuh
PI masuk ke dalam sel
12
2014/11/28
Annexin V: Penanda dini suatu Apoptosis Indikasi apoptosis dengan adanya translokasi membran fosfolipid fosfatidilserin (PS) dari bagian dalam membran plasma ke bagian luarnya. Setelah terpapar dg lingkungan luar, tempat berikatan PS makin tersedia utk Annexin V, 35-36 kDa, Ca 2+-dependent, phospholipid binding protein dengan afinitas tinggi terhadapa PS Translokasi PS, dilanjutkan dengan proses apoptosis yaitu hilangnya integritas membran, fragmentasi DNA, dan kondensasi kromatin. Annexin V dapat dikonjugasi dengan biotin atau fluorochrome, cth FITC, PE, APC, Cy5, or Cy5.5. Deteksi dg flow cytometric
13
2014/11/28
- Translokasi PS terjadi juga pada kematian sel, maka bukan penanda absolut utk apoptosis. - Maka ditambahkan dengan pewarna 7-amino-actinomysin (7AAD) atau propidium iodide (PI), yang berikatan dg asam nukleat, hanya bisa melewati membran plasma saat masih utuh pada akhir apoptosis maupun nekrosis. Hasil
/PI+
annexin-/PI-, annexin +/PI-, annexin+/PI+ and annexin –
No Apoptosis = Cell Viability sel negatif terhadap Annexin V dan pewarna vital tidak mengalami apoptosis: translokasi PS belum terjadi dan membran masih utuh. Early Apoptosis Sel positif Annexin V dan pewarna vital masih negatif, berarti tahap awal apoptosis dimana translokasi PS telah terjadi, akan tetapi membran plasma masih utuh. Late Apoptosis or Cell Death Sel positif terhadap Annexin V dan pewarna vital, berarti tahap lanjut apoptosis atau sudah mati, translokasi PS sudah terjadi dan integritas membran sudah hilang.
14
2014/11/28
Prinsip
Esai LDH
Sel tumor memiliki konsentrasi LDH intraseluler yang tinggi dan membelah garam tetrazolium bila LDH ada dalam kultur
LDH katalisasi reduksi dari NAD+ NADH dan H+ denga oksidasi laktat menjadi piruvat. Kedua: diaphorase menggunakan NADH and H+ utk katalisasi reduksi garam tetrazolium (INT) menjadi formazan (absorbsi 490-520 nm).
15
2014/11/28
Kebocoran LDH (lactate dehydrogenase) Nilai kuantitatifviability Aktivitas LDH dapat diukur dg mengukur saat reduksi dari piruvat dan laktat
Reduksi diikat pada oksidasi NADH NAD+, spectrophotometric pada 340nm
Pyruvate + NADH + H+
LDH ⇌ NAD+ + lactate
Esai Fungsi/Proliferasi Sel
16
2014/11/28
Esai MTT Metode ini sensitif, kuantitatif dan uji kolorimetrik
cukup baik, mengevaluasi proliferasi sel, sitotoksisitas, dan apoptosis.
Berdasarkan kemampuan enzim dehidrogenase
mitokondria pada sel hidup utk konversi warna kuning substrat utk mitokhondria dehidrogenasi, yaitu 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) direduksi menjadi produk formazan berwarna biru gelap yg tidak larut dlm air.
Jumlah formazan yang dihasilkan sebanding dengan jumlah sel yang hidup dalam sampel
MTT
Formazan
metabolically active Cell
17
2014/11/28
Uji Kolorimetrik MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide akan direduksi menjadi produk formazan yang tidak larut berwarna ungu biru XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide) akan direduksi menjadi suatu derivat formazan yang larut, warna oranye terang. Keunggulan dg XTT tidak perlu menambahkan zat utk melarutkan formazan.
MTT dan XTT Culture cells in a MTP for a certain period of time (37℃) MTT assay
XTT assay Prepare labeling mixture
Add MTT labeling reagent
Add XTT labeling mixture
Incubate cells (0.5-4 h, 37℃) Insoluble formazan
Soluble formazan
Add solubilizing solution (Isopropanol) and incubate Measure absorbance using an ELISA reader 570nm
18
2014/11/28
Example: MTT and XTT
MTT
XTT
Jenny G., Mark H., Anna J., Inger K., Douglas Mc., Roland M., 2002. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotormeter for quantification of microbial growth in microplates. J. Micro. Methods. 50:63-73
19
