JKK, Tahun 2015, Volume 4(1), halaman ISSN

JKK, Tahun 2015, Volume 4(1), halaman 12-16

ISSN 2303-1077

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI TIGA ISOLAT BAKTERI TANAH GAMBUT KALIMANTAN BARAT Erlindawati1*, Puji Ardiningsih1, Afghani Jayuska1 1 Program Studi Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura, Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi * email: [email protected] ABSTRAK Senyawa antibakteri diketahui mampu dihasilkan oleh bakteri dari tanah dan dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri patogen. Sifat keasaman pada tanah gambut mengindikasikan bahwa bakteri yang mampu bertahan hidup di dalamnya memiliki keunikan tersendiri. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi 3isolat bakteri dari tanah gambut dan mengetahui kemampuannya dalam menghasilkan senyawa antibakteri. Identifikasi spesies bakteri dilakukan berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology melalui uji morfologi dan biokimia. Uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar (well) menggunakan dua jenis supernatan bebas sel bakteri, yaitu supenatan asam dan supernatan netral terhadap bakteri uji Bacillus cereus dan Escherichia Coli. Hasil identifikasi menunjukkan bakteri yang diisolasi dari tanah gambut tersebut yaitu: Enterobacter cloacae, Enterobacter gergoviae, dan Proteus rettgeri.Identifikasi protein dengan uji biuret secara kualitatif terhadap seluruh supernatan bebas sel netral menunjukkan hasil uji positif.Supernatan bebas sel yang bersifat asam dari isolat B (Enterobacter gergoviae) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Gram positif dan negatif, dengan diameter zona hambat B. cereus: 9,401 mm danE. Coli: 10,301 mm. Supernatan bebas sel netral dari isolat B (Enterobacter gergoviae)memiliki daya hambat dengan diameter zona hambat B. cereus: 18,975 mm danE. Coli: 10,870 mm. Ketiga isolat bakteri mampu menghasilkan senyawa yang bersifat antibakteri. Kata kunci: antibakteri, bakteriosin, tanah gambut PENDAHULUAN Pengembangan berbagai jenis senyawa antibakteri dari ekstrak bahan-bahan alam telah menjadi kajian penting, salah satunya dalam bidang biokimia.Penelitian dalam dekade terakhir juga menunjukkan kemampuan sel bakteri dalam menghasilkan senyawa antibakteri sebagai metabolit sekunder yang berperan dalam pertahanan diri terhadap kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan. Bakteri yang dapat menghasilkan senyawa antibakteri umumnya diisolasi dari bahan makanan. Belakangan ini kajian mengenai senyawa antibakteri dari bakteri tanah mulai menjadi perhatian (Yanagida et al., 2005). Beberapa jenis bakteri dari tanah telah diisolasi dan diketahui kemampuannya dalam menghasilkan senyawa antibakteri. Panagan (2011) telahmelakukanisolasi8 isolat bakteri tanah penghasilantibakteri daritanah hutan kampus Unsri Indralaya, Sumatera Selatan.Empatisolatediantaranyamenunjukkanh asilpositifdalammenghambatpertumbuhanBacillu s cereusdanEscherichia coli.Susilowati dkk(2007) melakukan isolasi dan karakterisasi bakteri Actinomycetes dari sampel tanah yang

diambil dari 39 lokasi di Indonesia. Dua dari 115 isolat memiliki kemampuan terbaik dalam menghasilkan senyawa antibakteri untuk menghambat pertumbuhan E.coli K1.1 dan Pseudomonas pseudomallei.Penelitian Yanagida et al. (2006) menunjukkan bahwa 42 strain bakteri penghasil asam berhasil diisolasi dari 55 sampel tanah di sekitar akar tanaman mulberi dan pohon Angelica di Jepang. Tiga dari 42 isolat, yaitu: Lactobacillus animalis C060203, Enterococcus durans C102901 dan Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides C060204, menunjukkan aktivitas antimikroba terbaik. Kemampuan bakteri dari tanah dalam menghasilkan senyawa antibakteri berkaitan dengan karakteristik tanah yang menjadi lingkungan hidup bakteri. Salah satu jenis tanah yang memiliki karakter unik adalah tanah gambut dengan tingkat keasaman yang tinggi. Gambut merupakan jenis tanah organik yang terbentuk dari sisa-sisa tumbuhan yang telah mati dan terurai menjadi endapan organik dengan bantuan bakteri aerobik dan anaerobik (Subiksa dan Wahyunto, 2011). Data penyebaran lahan

12

JKK, Tahun 2015, Volume 4(1), halaman 12-16

ISSN 2303-1077

gambut yang diambil pada tahun 2002 menunjukkan luas lahan gambut di Kalimantan Barat mencapai 1,729 juta ha. Lahan gambut tersebut dapat ditemukan di daerah Sambas, Ketapang, Pontianak, Singkawang, dan Kapuas Hulu (Balai Penelitian Tanah, 2011). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi 3 bakteri dari tanah gambut. Identifikasi spesies bakteri dilakukan berdasarkan uji morfologi dan uji biokimia, serta uji aktivitas antibakteriterhadap bakteri uji B. cereus dan E. coli menggunakan metode difusi agar untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji.

1% v/v subkultur bakteri diinokulasikan pada media MRSbroth dan diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 48 jam.Selanjutnya kultur bakteri diendapkan melalui proses sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.Supernatan yang diperolehdibagimenjadi 2bagian.Sebagiandarisupernatantersebutdinetra lkan pH-nyamenjadi 7 denganpenambahan2-3 tetes larutanNaOH 1M (Savadogo et al., 2004). Uji Aktivitas Antibakteri Supernatan Bebas Sel Bakteri Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode sumur (well) (Delgadoet al., 2001). Keduabagian supernatan tersebutmasingmasing dipipet sebanyak 20µL dan dimasukkan ke dalam sumur pada media padat NA yang telah diinokulasikan bakteri uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk di sekitar sumur diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong.

METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah autoclave STIK MJ-78A, cawan petri, centrifuge SIGMA 1-14, hot plate, jangka sorong, laminar air flow, mikropipet, mikroskop, neraca analitik, pH meter, shaker incubator STIK PS-B2125, tabung reaksi, vortex HVD Microspin FV-2400, dan seperangkat alat gelas yang umum digunakan di laboratorium. Bahan-bahan yang digunakan adalah akuades, alkohol, de Man Rogosa and Sharpe (MRS), kalsium karbonat (CaCO3), larutan Gram (kristal violet, iodin, etanol 95%, dan safranin), natrium klorida (NaCl), nutrient agar (NA), dan nutrient broth (NB). Mikroba uji yang digunakan yaitu Bacillus cereus dan Eschericia coli. Tiga isolat bakteri yang digunakan adalah bakteri yang telah diisolasi dari tanah gambut yang diambil di daerah Jalan Budi Utomo dan Jalan 28 Oktober Pontianak.

Identifikasi peptida secara kualitatif dengan uji biuret Peptida yang terkandung dalam supernatan bebas sel netral diidentifikasi secara kualitatif dengan uji biuret. Identifikasi dilakukan dengan mengambil 2 ml supernatan bebas sel yang telah dinetralkan pH-nya, ditambahkan 2 ml NaOH 10% dan beberapa tetes CuSO4 0,1% hingga terbentuk warna ungu (Frenk et al., 2007). HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Isolat Bakteri Hasil pengujian morfologi dan biokimia (Tabel 1) menunjukkan bahwa isolat A merupakan bakteri Proteus rettgeri, B adalah bakteri Enterobacter gergoviae, dan C adalah bakteri Enterobacter cloacae.Berdasarkan sifat morfologinya, isolat bakteri A, B, dan C merupakan bakteri Gram negatif dan berbentuk batang (basil). Hasil uji morfologi juga menunjukkan genus Proteus sp. tidak memiliki flagela sebagai alat gerak, sedangkan genus Enterobacter sp. menggunakan flagela sebagai alat gerak. Hasil uji fermentasi karbohidrat menunjukkan bahwa seluruh isolat menggunakan karbohidrat sebagai sumber karbon. Seluruh isolat juga menggunakan sitrat sebagai sumber karbon jika tidak terdapat karbohidrat. Hasil uji katalase menunjukkan semua isolat dapat menghasilkan enzim katalase yang berfungsi untuk melindungi

Identifikasi Bakteri dari Tanah Gambut Tiga isolat bakteri hasil isolasidari tanah gambut dengan kode A, B, dan C diidentifikasi berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1957) dengan melakukan uji morfologi dan biokimia. Uji morfologi meliputi uji pewarnaan Gram dan uji motilitas. Uji biokimia yang dilakukan yaitu: fermentasi karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sakarosa), enzim dekarboksilase (lisin, arginin, dan ornitin), enzim urease, enzim katalase, indol, oksidatiffermentatif (OF), Triple Sugar Iron Agar(TSIA), penggunaan sitrat, dan produksi H2S. Produksi Supernatan Bebas Sel Bakteri Supernatan bebas sel bakteri diperoleh denganmenginokulasikan isolat bakteri yang akan diuji pada media MRSbroth dan diinkubasi pada suhu 37oCselama 14-16 jam. Sebanyak 13

JKK, Tahun 2015, Volume 4(1), halaman 12-16

ISSN 2303-1077

bakteri dari radikal oksigen yang beracun, seperti H2O2. Hasil uji enzim urease menunjukkan bahwa ketiga isolat bakteri menghasilkan enzim urease. Urease merupakan enzim pemecah ikatan nitrogen dan karbon dari senyawa amida, seperti urea. Bakteri yang mengandung urease dapat menghidrolisis urea dan menghasilkan amonia yang bersifat basa. Persamaan reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut. H2N C= O + 2 H2O → 2 NH3 + CO2 + H2O H2N Urea air amonia

Hasil pengukuran pH supernatan bebas sel hasil sentrifugasi menunjukkan bahwa supernatan bersifat asam dengan rentang nilai pH 5,65-5,84. Sifat asam ini disebabkan adanya asam-asam organik yang dihasilkan oleh bakteri, sehingga dapat menurunkan pH media (Januarsyah, 2007). Selain menghasilkan asam-asam organik, sel bakteri juga menghasilkan peptida sebagai metabolit sekunder (Berdy, 2005). Peptida yang memiliki aktivitas antimikroba maksimum terjadi pada suasana netral (Sharma and Gautam, 2008). Adanya peptida dapat dideteksi dengan menetralkan supernatan yang bersifat asam menggunakan larutan NaOH 1 N (Soumya et al., 2012). Supernatan yang telah netral kemudian diuji untuk mengetahui sensitivitasnya terhadap mikroba uji.

Tabel 1. Hasil identifikasi spesies bakteri Pengujian

A

Kode Isolat B

C

b -

b +

b +

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

F A/A + + + -

+ + + F A/A + + + Enterobacter gergoviae

+ + F K/A + + + Enterobacter cloacae

Morfologi

Gram strain Bentuk sel motilitas Biokimia Fermentasi: - Glukosa - Laktosa - Maltosa - Sakarosa - Manitol Dekarboksilase - Lisin - Arginin - Ornitin OF TSIA Produksi H2S Sitrat Urease Katalase Indol Spesies bakteri

Proteus rettgeri

Uji Aktivitas Antibakteri Uji aktivitas antibakteri isolat bakteri dilakukan untuk mengetahui kemampuan supernatan bebas sel bakteri yang mengandung senyawa metabolit sekunder dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Aktivitas penghambatan dilihat dari diameter zona bening yang terbentuk (Gambar 1). Besarnya diameter zona bening yang terbentuk berbanding lurus dengan aktivitas antimikroba isolat bakteri tersebut dalam menghambat pertumbuhan mikroba uji (Sahnouni et al., 2012). Tabel 2. Aktivitas antibakterisupernatan asam dan netral dari tiga isolat bakteri terhadap mikroba uji Isolat bakteri Proteus rettgeri Enterobacter gergoviae Enterobacter cloacae

Keterangan: (+) uji positif; (-) uji negatif; b= basil

Preparasi Supernatan Bebas Sel Metabolit sekunder merupakan salah satu hasil metabolisme sel bakteri yang berfungsi sebagai pertahanan diri. Metabolit sekunder dihasilkan secara ekstraseluler sehingga dilakukan pemisahan sel bakteri dalam supernatan untuk mengekstrak metabolit sekunder (Seo et al., 2012). Supernatan bebas sel diperoleh melalui proses sentrifugasi untuk mengendapkan sel bakteri (Savadogo et al., 2004), sehingga supernatan hanya mengandung hasil metabolisme bakteri.

Supernatan asam netral asam netral asam netral

Diameter Zona Bening (mm) B.cereus E.coli

20,961 9,401 18,975 10,975

11,619 9,451 10,301 10,870 10,351 -

Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa supernatan asam dan supernatan netral dari isolat B (Enterobacter gergoviae) memiliki kekuatan yang lebih besar dalam menghambat pertumbuhan E.coli dibandingkan isolat lainnya. Supernatan asam dari isolat B (Enterobacter gergoviae) dan supernatan netral dari isolat A (Proteus rettgeri) memiliki aktivitas antibakteri yang lebih tinggi dalam menghambat pertumbuhan B. cereus.

14

JKK, Tahun 2015, Volume 4(1), halaman 12-16

ISSN 2303-1077

DAFTAR PUSTAKA Balai Penelitian Tanah, 2011, Pengelolaan Lahan Gambut Berkelanjutan, Kementerian Pertanian Indonesia. Berdy, J., 2005, Bioactive Microbial Metabolites, J. Antibiot., 58 (1): 1-26. Breed, R. S., E.G.D. Murray, and Nathan R.S., 1957, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 7th Edition, The Williams and Wilkins Company, USA. Delgado, A., Brito, D., Fevereiro, P., Peres, C., and Marques, J.F., 2001, Antimicrobial Activity of L.plantarum, Isolated from a Traditional Lactic Acid Fermentation of Table Olives, INRA, EDP Science: 203-215. Januarsyah, T., 2007, Kajian Aktivitas Hambat Bakteriosin dari Bakteri Asam Laktat Galur SCG 1223, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor (Skripsi). Panagan, A.T., 2011, Isolasi Mikroba Penghasil Antibiotika dari Tanah Kampus Unsri Indralaya menggunakan Media Ekstrak Tanah, Jurnal Penelitian Sains, 14: 37-40. Sahnouni, F., Matallah, B.A., Chemlal, D., and Boutiba, Z., 2012, Technological Characterization of Lactic Acid Bacterial isolated from Intestinal microbiota of Marine Fish in the Oran Algeria Coast, African Journal of Microbiology Research, Vol. 6(13): 3125-3133. Savadogo, A., Cheik A. T. O., Imael H. N. B., and Alfred S.T., 2004, Antimicrobial Activities of Lactic Acid Bacteria Strains Isolated from Burkina Faso Fermented Milk, Pakistan Journal of Nutrition,Vol. 3 (3): 174-179. Sharma, N., and Gautam, N., 2008, Antibacterial Activity and Characterization of Bacteriocin of Bacillus mycoides Isolated from Whey, Indian Journal of Biotechnology, Vol. 7: 117-121. Seo, M., Won, H., Kim, J., Tsogbadrakh M., and Lee B., 2012, Antimicrobial Peptides for Therapeutic Applications: A Review, Molecules Vol. 17: 12276-12286. Soumya, T.V., Reshma J., and Surya J, 2012, Characterization of Bacteriocin Produced by Lactobacillus sp and Optimization of Cultural Conditions, International Journal of Scientific and Research Publications, Vol. 2: 1-9. Subiksa, IGM., dan Wahyunto, 2011, Genesis Lahan Gambut di Indonesia, Balai Penelitian Tanah. Susilowati, D. N., Hastuti, R. D., dan Yuniarti, E., 2007, Isolasi dan Karakterisasi Aktinomisetes Penghasil Antibakteri Enteropatogen Escherichia coli K1.1,

Aktivitas antimikroba dari supernatan asam disebabkan isolat bakteri menghasilkan senyawa yang bersifat asam yang dapat merusak dinding sel bakteri patogen (Berdy, 2005). Aktivitas antimikroba dari supernatan bebas sel yang bersifat netral dikarenakan adanya peptida yang bersifat antibakteri yang dihasilkan oleh sel bakteri. Keberadaan peptida dalam supernatan bebas sel yang bersifat netral telah dikonfirmasimelalui hasil uji positif pada uji biuret secara kualitatif.

Gambar 1. Zona bening yang terbentuk dari isolat B (Enterobacter gergoviae) terhadap E.coli

Berdasarkan diameter zona bening yang terbentuk diketahui bahwa aktivitas antimikroba oleh supernatan asam mengalami peningkatan setelah supernatan dinetralkan. Peningkatan aktivitas antibakteri supernatan netral disebabkan adanya peptida sebagai senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan sel bakteri (Berdy, 2005). Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa senyawa peptida dalam supernatan netral memiliki aktivitas antibakteri yang lebih tinggi dibandingkan aktivitas antimikroba oleh asam-asam organik dalam supernatan asam. SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka disimpulkan bahwa ketiga isolat bakteri dalam tanah gambut adalah Enterobacter cloacae, Enterobacter gergoviae, dan Proteus rettgeri. Seluruh isolat bakteri tersebut menghasilkan asamkarboksilat dan peptida yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji B. cereus dan E. coli.

15

JKK, Tahun 2015, Volume 4(1), halaman 12-16

ISSN 2303-1077

Pseudomonas pseudomallei 02 05, dan Listeria monocytogenes 5407, Jurnal AgroBiogen, Vol. 3(1): 15-23. Yanagida, F.; Chen, Y. and Shinohara, T., 2005, Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Soi Using an Enrichment

Procedure, Letters in Applied Microbiology., 40: 195-200. Yanagida, F.; Chen, Y. and Shinohara, T., 2006, Searching for Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria in Soil, J. Gen. Appl. Microbiol., 52: 21-28.

16