III. METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental menggunakan post test only control group design yang menggunakan evaluasi secara histopatologi. Penelitian ini menggunakan penilaian histopatologi Salked score (Winanto et al., 2013).
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober‒Desember 2015 dengan tempat penelitian di animal house Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Pembuatan dan pengawetan bahan jaringan ALS‒R dilakukan oleh Bank Jaringan Riset Batan (BJRB), Pasar Jumat, Jakarta. Pembuatan dan pengamatan preparat secara mikroskopis dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
3.3 Identifikasi Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.3.1 Variabel Bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah ORIF dan ALS‒R.
30
3.3.2 Variabel Terikat Variabel terikat pada penelitian ini adalah penyatuan (union) fraktur femur tikus Sprague Dawley
3.3.3 Definisi Operasional Definisi operasional pada penelitian ini terdiri dari fraktur femur, ALS‒R, ORIF, penilaian histopatologi seperti yang dijelaskan pada tabel 3. Tabel 3. Definisi operasional No Variabel
Definisi Operasional
Alat Ukur
Hasil Ukur
1.
Fraktur Femur
Tidak ada
Tidak ada
2.
ALS‒R
Tidak ada
Tidak ada
Kategorik
3.
ORIF
Tidak ada
Tidak ada
Kategorik
4.
Penilaian Histopatologi
Tulang femur pada tikus Sprague Dawley yang dibuat fraktur transversal dengan gergaji kecil Selaput amnion yang diperoses secara liofilisasi kemudian disterilkan dengan radiasi sinar γ yang didapat dari Bank Jaringan Riset Batan Metode fiksasi interna dengan pemasangan intramedullary wire pada fraktur femur yang dibuat pada tikus putih oleh Spesialis Orthopedi Penilaian secara histolopatologi proses penyembuhan fraktur
Skala Ukur Kategorik
Menggunakan Nilai 0‒8 Salked score
Ordinal
31
3.4 Populasi dan Sampel Penelitian Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus novergicus) galur Sprague Dawley yang telah dewasa berumur 2‒3 bulan, berat badan 200‒300 gram yang diperoleh dari Laboratorium Hewan Coba Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes.
3.4.1 Kriteria Inklusi a
Tikus jantan
b Sehat c
Berumur 2‒3 bulan
d Berat badan 200‒300 gram
3.4.2 Kriteria Eksklusi a
Mati
b Tampak sakit (gerakan tidak aktif, tidak mau makan, rambut kusam atau rontok)
3.4.3 Besar Sampel Sampel penelitian sebanyak 30 ekor dipilih secara acak dan dibagi ke dalam 3 kelompok perlakuan sesuai dengan rumus Frederer. Rumus Federer yaitu : (t − 1)(n − 1) > 15 Dengan t adalah jumlah kelompok perlakuan dan n adalah besar sampel tiap kelompok, sehingga didapatkan jumlah sampel dengan rumus Frederer sebagai berikut :
32
(3‒1) (n‒1) > 15 2n ‒2 > 15 n > 8,5 sampel yang digunakan tiap kelompok percobaan sebanyak 9 ekor (n>8,5) dan jumlah kelompok yang akan digunakan adalah 3 kelompok. Penambahan sampel untuk mencegah drop out sebesar 10%. Sehingga penelitian ini akan menggunakan 30 ekor tikus Sprague Dawley dari populasi yang ada.
Pada penelitian ini sampel dibagi dalam tiga kelompok, yakni kelompok K, P1, dan P2. Pada kelompok kontrol (K) tikus akan diberikan pakan standar dan dibuat fraktur tanpa perlakuan khusus. Pada kelompok kedua (P1) tikus diberikan pakan standar, dibuat fraktur dan diberikan perlakuan khusus dengan dilakukan ORIF tanpa ALS‒R. Pada kelompok ketiga (P2) tikus diberikan pakan standar, dibuat fraktur dan diberikan perlakuan khusus dengan dilakukan ORIF dengan ALS‒R.
3.5 Alat dan Bahan Penelitian 3.5.1 Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : a. Kandang hewan b. Tempat pakan hewan c. Tempat minum hewan d. Alat tulis
33
e. Handscoen f. Spuit g. Gergaji kecil (small saw) h. Alat bedah minor i. Mikroskop j. Object glass
3.5.2 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah a. Hewan coba berupa tikus Sprague Dawley dengan berat badan 200‒300 g, berumur 2‒3 bulan. Hewan coba diberi pakan standar dan minum secara ad libitum b. Bahan Perlakuan i.
ORIF
ii.
ALS‒R
c. Bahan untuk tindakan anasthesia berupa : i. Ketamine 75 mg/kgBB ii. Xylaxine 5 mg/kgBB d. Bahan pembuatan preparat i. Formalin 10% ii. Paraffin block iii. Hematoxyillin Eosin
34
3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Persiapan Persiapan sebelum penelitian dilakukan pemilihan sampel tikus Sprague Dawley yang didapatkan dari Laboratorium Hewan Coba Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes. Pembuatan ALS‒R dilakukan di Bank Jaringan Riset Batan (BRJB), Pasar Jumat, Jakarta.
3.6.2 Adaptasi Tikus Adaptasi tikus dilakukan bertujuan untuk memgurangi stres dan kematian. Tikus sebanyak 30 ekor dibagi kedalam 3 kandang dan diadaptasi selama 3 hari sebelum perlakuan dimulai di animal house Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Selama masa adaptasi tikus diberi makan berupa pelet dan air secara ad libitum.
3.6.3 Prosedur Frakturisasi Mengacu pada penelitian sebelumnya, proses frakturisasi tikus dengan menggunakan gergaji kecil (small saw). Tikus di anastesi subkutan dengan ketamin 75 mg/kgBB dan xylazine 5 mg/kgBB. Selanjutnya dilakukan fraktur transversal pada mid diafisis os femur hingga menunjukkan garis patahan pada periosteum.
3.6.4 Pembedahan Setelah dilakukan frakturisasi, dilakukan fiksasi interna dengan menggunakan ORIF. Pada kelompok K3 dilakukan pemasangan ALS‒R
35
dengan implantasi pada bagian fraktur femur dengan ukuran 15x5 mm. Pembedahan ini dilakukan dengan alat bedah minor steril.
3.6.5 Perawatan Pasca Pembedahan Tikus
diberikan
gentamicin
salep
setelah
pembedahan
untuk
meminimalisir infeksi. Selama 5 hari pasca operasi tikus diberikan asam mefenamat dan amoksisilin peroral. Luka operasi diobati dengan menggunakan larutan betadine.
3.6.6 Pengambilan Jaringan dan Pembuatan Preparat Proses penyembuhan fraktur terjadi selama 28 hari, selanjutnya dilakukan euthanasia untuk diambil jaringan tulang femur. Pengambilan jaringan dilakukan dengan menggunakan alat bedah minor steril. Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam pot sampel yang berisi formalin 10%. Jaringan dikirimkan ke tempat pembuatan preparat di bagian Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitass Lampung.
3.6.7 Pembuatan Preparat Pembuatan preparat dilakukan dengan menggunakan paraffin block selanjutnya dilakukan pewarnaan Hematoxyillin Eosin. Pembuatan preparat dilakukan di Laboratorium Patologi Kedokteran Universitas Lampung.
Anatomi Fakultas
36
3.6.8 Pengamatan Preparat Pengamatan preparat dilakukan dengan melihat jaringan tulang, fibrosis, kalus, kartilago tulang dan bone union. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x dan 400x di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
3.6.9 Penilaian Histopatologi Berdasarkan Salked score penilaian histopatologi proses penyembuhan tulang yang telah dimodifikasi dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Penilaian Salked score pada fraktur healing yang telah dimodifikasi Kualitas dari penyatuan (union) Skor Tidak ada tanda‒tanda fibrosis atau penyatuan lainnya 0 Penyatuan fibosis 1 Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago <25% 2 Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago 26‒50% 3 Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago 51‒75% 4 Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago >75% 5 Kartilago termineralisasi dan penyatuan tulang 6 Woven bone (tulang anyaman) 7 Tulang matur 8 (Sumber: Winanto et al., 2013)
37
3.7 Alur Penelitian
Pengajuan izin ke komisi etik penelitian hewan coba
Adaptasi tikus selama 3 hari
Pengelompokkan tikus menjadi 3 kelompok, masing‒masing berisi 10 tikus
Kelompok K
Kelompok P1
Kelompok P2
Fraktur Femur dengan gergaji kecil pada mid diafisis os femur
Fraktur Femur dengan gergaji kecil pada mid diafisis os femur
Fraktur Femur dengan gergaji kecil pada mid diafisis os femur
Dilakukan ORIF dengan intramedullary nails
Dilakukan ORIF dengan intramedullary nails dan diberikan ALS‒R
Pada minggu keempat, tikus dieuthanasia menggunakan katemine 75‒100 mg/kgBB xylazine 25‒50 mg/kgBB secara intraperitoneal dan terminasi
Pengambilan jaringan dan pembuatan preparat
Pengamatan dan penilaian secara histopatologi
38
3.8 Analisis Data Data dianalisis dengan menggunakan uji statistik dengan program komputer. Uji normalitas dilakukan dengan uji Shapiro‒Wilk dan uji homogenitas dilakukan dengan uji levene. Selanjutnya dilakukan, uji analisis non‒parametrik Kruskal‒Wallis dan post hoc Mann‒Whitney.
3.9 Etika Penelitian Penelitian ini telah dilakukan kaji etik dan disetujui oleh komite etik penelitian Fakultas
Kedokteran
2476/UN26/8/DT/2015.
Universitas
Lampung
dengan
nomor
