BAB
III
M E T O D E PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian 3.1.1 Desain penelitian Penelitian i n i merupakan penelitian eksperimental dengan desain post test only with
3.1.2
control.
Tempat dan waktu penelitian Penelitian i n i akan d i l a k u k a n di L a b o r a t o r i u m B i o k i m i a Fakultas
Kedokteran
Universitas R i a u bulan A p r - N o v 2 0 0 9 , sebagaimana yang tercantum pada j a d w a l kerja.
3.1.3
Variabel Penelitian
3.1.3.1 Variabel terikat V a r i a b e l terikat pada penelitian i n i adalah konsentrasi M D A p l a s m a .
3.1.3.1 Variabel bebas V a r i a b e l bebas pada penelitian i n i adalah konsentrasi kolesterol plasma.
3.1.4
Definisi Operasional Pada penelitian i n i yang d i m a k s u d dengan: -
A i r perasan u m b i b a w a n g merah adalah sari air yang diperoleh sebagai hasil perasan
umbi
bawang
merah
dengan
konsentrasi
80%.
Konsentrasi
ini
diperoleh dari penelitian pendahuluan. -
M D A adalah produk peroksidasi l i p i d dalam plasma y a n g d i u k u r metode
-
dengan
Wills.
M e n c i t adalah mencit {Mus
musculus)
jantan dewasa yang diperoleh
dari
B a g i a n F a r m a k o l o g i Universitas R i a u , berumur ± 4 bulan dengan berat badan rata-rata 30-35 g/ekor. K u n i n g telur adalah k u n i n g telur mentah a y a m negeri.
14
-
Kolesterol adalah kolesterol total p l a s m a yang d i u k u r dengan metode C H O D PAP.
3.1.5
Sampel Penentuan j u m l a h sampel berdasarkan rumus t ( r - l ) > 15, t = j u m l a h perlakuan; r = j u m l a h ulangan. Penelitian
ini menggunakan sampel 20 ekor mencit, terdiri dari
4 kelompok
perlakuan ( K P ) , m a s i n g - m a s i n g k e l o m p o k terdiri dari 5 ekor mencit, yaitu 1.
KP
I yaitu k e l o m p o k mencit yang h a n y a diberi air layak m i n u m m e l a l u i
sonde lambung d i s a m p i n g diet standar. 2.
K P II yaitu k e l o m p o k mencit yang diberi k u n i n g telur m e l a l u i sonde lambung d i s a m p i n g diet standar.
3.
KP
III
bawang
yaitu k e l o m p o k mencit yang d i b e r i k u n i n g telur dan air perasan merah
(konsentrasi
ditentukan
dalam
penelitian
pendahuluan)
d i s a m p i n g diet standar. 4.
KP
IV
yaitu k e l o m p o k
mencit y a n g diberi k u n i n g telur dan
simvastatin
d i s a m p i n g diet standar.
3.2
Bahan dan C a r a
3.2.1 Pemelibaraan hewan percobaan
Bahan dan a l a t : M e n c i t , pakan, kandang mencit, serutan k a y u , timbangan.
C a r a kerja M e n c i t - m e n c i t d i p e l i h a r a d a l a m kandang. A l a s kandang diberi serutan k a y u untuk menyerap
kotoran
mencit.
Alas
kandang
diganti
2 x
seminggu.
Kandang
diletakkan pada ruanan berventilasi c u k u p . M a k a n a n dan m i n u m a n diberikan ad diperiksa dan ditambah setiap hari. Penimbangan
tersebut libitum,
berat badan tikus d i l a k u k a n setiap
minggu. Setiap bulan kandang-kandang d i c u c i dan dibersihkan.
15
3.2.2 Pengolahan bawang merah
Bahan dan alat U m b i bawang merah, aquadest, oven, timbangan, blender, kain flanel.
C a r a kerja
:
A i r perasan bawang merah dibuat dengan cara : •
B a w a n g merah d i k u p a s kuHtnya d a n d i c u c i dengan air bersih.
•
U m b i bawang d i i r i s sampai ketebalan menjadi ± 2 m m , lalu d i k e r i n g k a n dengan oven (lemari pengering) pada suhu 40-50 °C selama 30-36 j a m .
•
Setelah k e r i n g b a w a n g merah d i t i m b a n g 500 gram. B a w a n g d i l u m a t dengan 100 m l akuades m e n g g u n a k a n blender.
•
Setelah d i d i a m k a n 1 j a m , lumatan tersebut diperas dengan k a i n flanel d a n sarinya ditampung.
•
A i r perasan diencerkan dengan akuades h i n g g a v o l u m e n y a menjadi 2 5 0 m l . D e n g a n d e m i k i a n , 2 g r a m bawang merah setara dengan 1 m l air perasan bawang merah atau sama dengan 2 0 0 % b/v.
•
3.23
Pengenceran d i l a k u k a n sesuai dengan konsentrasi yang d i i n g i n k a n .
Pemberian air perasan bawang merah
Bahan dan Alat A i r perasan b a w a n g merah, sonde l a m b u n g
C a r a kerja
:
V o l u m e y a n g d i b e r i k a n adalah 1 m l , konsentrasi disesuaikan dengan konsentrasi optimal yang didapatkan pada penelitian pendahuluan. A i r perasan bawang
merah
diberikan tiap hari pada pagi hari dengan menggunakan sonde l a m b u n g . Pemberian
m
perasan bawang merah d i l a k u k a n selama 2 m i n g g u , saat yang bersamaan j u g a d i b e r i k a n k u n i n g telur. Tetapi pemberian keduanya dijarakkan ± 1 j a m .
16
3.2.4 Pemberian kuning telur
Bahan dan alat K u n i n g telur, sonde lambung.
C a r a kerja
:
Pemberian k u n i n g telur d i l a k u k a n tiap hari selama 5 m i n g g u , yaitu 3 m i n g g u dilakukan sebelum pemberian bawang merah dan 2 m i n g g u d i l a k u k a n bersamaan dengan pemberian air perasan bawang merah. K u n i n g telur d i b e r i k a n sebanyak 1 m l pada pagi hari dengan sonde lambung.
3.2.5 Pemberian simvastatin Simvastatin diberikan tiap hari pada pagi
hari dengan
menggunakan
sonde
lambung. Pemberian simvastatin d i l a k u k a n selama 2 m i n g g u , saat yang bersamaan j u g a diberikan k u n i n g telur. Tetapi pemberian keduanya dijarakkan ± 1 j a m . Perhitungan dosis simvastatin menurut Laurence dan B a c h a r a c h (1964) d a l a m Santoso (2006) yaitu 0,0026 X 20 m g = 0,052 mg/20 g berat badan. Simvastatin i n i k e m u d i a n dilarutkan dalam akuades.
3.2.6 Pengambilan darah
Bahan dan alat Eter, bejana kaca untuk membius mencit, alat-alat bedah berupa pinset, gunting, skapel, tabung E D T A , alat sentrifugasi, pipet.
C a r a kerja
:
Pada waktu yang telah ditentukan, d i l a k u k a n pengambilan
darah dari jantung.
Sebelumnya mencit dibius dengan j a l a n m e m a s u k k a n n y a ke d a l a m bejana yang telah jenuh dengan uap eter. Darah ditampung d a l a m tabung E D T A . T a m b a h k a n 10 |xl 2 M m B H T dan 10 \i\ 2 M m desferal per m l darah. T a b u n g d i b o l a k - b a l i k perlahan agar tidak
17
menggumpal. Darah k e m u d i a n disentrifugasi dengan kecepatan sekitar 3 0 0 0 rpm untuk memperoleh plasma, k e m u d i a n d i s i m p a n d a l a m lemari pendingin - 20 °C sampai w a k t u pengukuran.
3.2.7 Pembuatan larutan standar M D A
Bahan dan alat
:
Tetra etoksipropan ( T E P ) 0,125 j i M , Thiobarbituric
acid ( T B A ) 0,67 % w/v d a l a m air,es
spektrofotometer, kuvet, vortex, penangas air, bejana, alat sentrifus.
C a r a kerja
:
Pembuatan larutan standar M D A dengan menggunakan larutan tetraetoksipropan ( T E P ) sebagai prekursor. T E P akan d i h i d r o l i s i s oleh air menjadi M D A . Pembuatan k u r v a standar dengan menggunakan berbagai konsentrasi dari larutan standar T E P (0,4 sampai 5 nmol/ml). S u m b u x m e n u n j u k k a n kadar standar dan s u m b u y menunjukkan absorban. o
Preparat M D A standar ( T E P )
diencerkan dengan berbagai j u m l a h dan didapat
berbagai konsentrasi M D A . o
K e d a l a m 2 m l larutan standar ditambahkan 2 m l reagen T B A .
o
Larutan dipanaskan selama 10 menit pada suhu 95 °C d a l a m penangas air dengan tabung tertutup.
o
T a b u n g d i d i n g i n k a n dengan es k e m u d i a n disentrifiis pada 2.000 g selama
10
menit. o
Larutan d i p i n d a h k a n ke d a l a m kuvet dan d i b a c a absorbansinya.
o
Kontrol
yang
digunakan
membuat
autozero
alat terdiri dari akuades
yang
diinkubasi dengan reagen T B A . Perhitungan konsentrasi M D A
plasma menggunakan
rumus A 1 / A 2 = C 1 / C 2
dengan
mengambil n i l a i yang terdekat.
18
3.2.8 Pemeriksaan M D A plasma
Bahan dan alat Plasma, T C A
2 0 % , akuades, Thiobarbituric
acid
(TBA)
0,67 %
w/v
dalam
air,es
spektrofotometer, kuvet, vortex, penangas air, bejana, pipet m i k r o , alat sentrifus, tabung reaksi.
C a r a kerja
:
Pengukuran spektrofotometer
MDA
d i l a k u k a n dengan
sinar tampak.
Metode
metode
Wills
dengan
menggunakan
i n i berdasarkan p r i n s i p b a h w a
bila
MDA
direaksikan dengan asam tiobarbiturat akan membentuk senyawa b e r w a m a merah m u d a , yang akan mengabsorbsi sinar tampak pada panjang g e l o m b a n g
515-553 n m . J u m l a h
M D A akan menggambarkan tingkat peroksidasi l i p i d . o
M a s u k k a n 150 |al p l a s m a y a n g
sudah diencerkan dengan
350 ^ l akuades
ditambahkan 250 ^1 T C A 2 0 % . o
Larutan d i c a m p u r k a n dan d i d i a m k a n d a l a m suhu ruangan selama 5 m.enit.
o
T a b u n g disentrifus pada 2.000 g selama 10 menit d a l a m suhu ruangan.
o
Supematan kemudian d i a m b i l 500 \i\
o
K e dalam larutan ditambahkan 500 |j.l reagen T B A dan d i c a m p u r .
o
Larutan dipanaskan dengan tabung y a n g ditutup selama 10 menit d a l a m waterbath dengan suhu kurang lebih 95 °C.
o
T a b u n g diangkat dan d i d i n g i n k a n d a l a m es, k e m u d i a n disentrifiis pada 2.000 g selama 10 menit.
o
D i m a s u k k a n d a l a m kuvet dan dibaca absorbansinya.
19
Pengolahan dan Analisis Data
Pengolahan
data
d i l a k u k a n secara
m a n u a l , dengan
kalkulator
sedangkan analisis data d i l a k u k a n menggunakan program Social
Science
konsentrasi
(SPSS).
MDA
dan
Uji
statistik
konsentrasi
yang
digunakan
kolesterol
antar
dan
Statistical untuk
kelompok
komputer,
Package
for
membandingkan tergantung
uji
normalitas dan homogenitas. J i k a data berdistribusi normal dan homogen m a k a digunakan uji parametrik anava 1 arah, sedangkan j i k a salah satu syarat tidak
terpenuhi
mengetahui
maka
hubungan
digunakan antara
uji
non
parametrik
konsentrasi
digunakan uji statistik k o r e l a s i . U j i Pearson
MDA
dan
Kruskal
tersebut
Wailis.
konsentrasi
digunakan j i k a data
Untuk
kolesterol berdistribusi
normal dan uji Spearman j i k a data tidak berdistribusi normal ( D a h l a n ,
2004).
20
