Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
Identifikasi Senyawa Flavonoid dari Daun Ketapang Kencana (Terminalia muelleri Benth.) dan Uji Aktivitas Sebagai Antibakteri Penyebab Bau Badan Dyah Arum Ariyanti, Khairul Anam, Dewi Kusrini Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika,Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedharto, SH, Semarang 50275, Telp. (024)76480824
Abstrak Telah diisolasi dan diidentifikasi senyawa golongan flavonoid dari daun ketapang kencana (Terminalia muelleri Benth.) Isolasi diawali dengan ekstraksi menggunakan metode maserasi, dilanjutkan fraksinasi menggunakan metode kromatografi kolom dan pemurnian menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat flavonoid dari ekstrak etil asetat daun T. muelleri berwarna kuning dengan rendemen 0,14%. Hasil identifikasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan pereaksi geser dan spektrometer FTIR diduga senyawa flavonoid merupakan senyawa herbasitin. Uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada konsentarsi ekstrak etil asetat 1% dan fraksi EC14 5% memiliki kekuatan daya hambat yang sedang. Kata kunci : Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Pereaksi geser, Kromatografi kolom Abstract Flavonoid compound was isolated and identified from Terminalia muelleri Benth. leaves. Isolation was started by maseration, followed by fractionation using column chromatography method, and purification using thin layer chromatography. Flavonoid was isolated from ethyl acetat extract of T. muelleri leaves (yield 0.14%). Structure characterization was conducted using UV spectrophotometer and FTIR. Results showed that the extracted compound was herbasitin. Ethyl acetat extract (1%) and EC14 fraction (5%) of T.muelleri were found to inhibit the growth of Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa. Keyword : Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Shift reagen, Coloumn chromatography
Kandungan kimia pada tanaman T. muelleri belum banyak dilaporkan, namun kandungan kimia dan uji aktivitas dari genus Terminalia telah banyak dilaporkan. Daun Terminalia muelleri Benth dilaporkan 2 memiliki sifat antibakteri . Fraksi fenol pada tanaman Terminalia catappa diketahui 12 berfungsi sebagai antioksidan . Tanaman terminalia dilaporkan juga memiliki aktivitas sebagai anti jamur terhadap Candida albicans, Cryptococcus
PENDAHULUAN Ketapang kencana (Terminalia muelleri Benth.), berasal dari Australia keluarga Combretaceae. Tanaman ini tersebar di berbagai negara yaitu India, Indonesia dan 5,10 Amerika Utara . Ekstrak Terminalia ini dapat berfungsi sebagai antifungi, antikanker, antioksidan dan penghambat 1,7,9 glukosidase .
94
Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
0063) yang diperoleh dari Pusat Studi Pangan Dan Gizi Universitas Gadjah Mada.
neoformans, Aspergillus fumigatus, 7 Microsporum canis dan Sporothrix schenkii . Tanaman terminalia chebula dilaporkan dapat digunakan sebagai uji antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli, Salmonella 8 Sp., Shigella Sp., Saccharomyces cerevisiae . Banyak tanaman terminalia yang sudah diteliti aktivitasnya sebagai antibakteri, namun belum pernah diuji aktivitas terhadap antibakteri penyebab bau badan seperti
Alat Peralatan yang digunakan dalam peralatan ini adalah Blender, botol semprot, pipet tetes, pipa kapiler, peralatan gelas, kertas saring, corong, rotary vacuum evaporator, plat tetes, hot plate, kertas whatman no.1 dan 4, seperangkat alat kromatografi kolom, kertas cakram (Oxoid), petri dish, jarum ose, spektrofotometer UV– Vis (Shimadzu) dan spektrometer IR (Shimadzu).
Staphylococcus epidermidis Coryne bacterium acne, Pseudomonas aeruginosa dan Streptococcus pyogenes. Selain itu, belum pernah dilaporkan jenis senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri dari Terminalia muelleri. Penelitian tentang kandungan jenis senyawa flavanoid dalam tanaman T. muelleri belum pernah dilakukan. Mengingat senyawa flavonoid memiliki banyak manfaat sehingga menarik untuk diidentifikasi jenis senyawanya dan diuji aktivitasnya sebagai antibakteri.
Cara kerja Preparasi sampel Daun T. muelleri yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor dibersihkan dari debu, pasir dan pengotor lainnya, kemudian diangin-anginkan hingga kering dan dijadikan serbuk menggunakan blender. Pembuatan ekstrak Daun ketapang kencana yang telah menjadi serbuk kemudian dimaserasi dengan pelarut n-heksana selama 3 kali 24 jam, filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary vacum evaporator hingga didapatkan ekstrak n-heksana. Selanjutnya bagian ampas dikeringkan lalu dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama 3 kali 24 jam, filtratnya dipekatkan hingga diperoleh ekstrak etil asetat. Kemudian ampas dimaserasi kembali dengan metanol selama 3 kali 24 jam dan filtratnya dipekatkan hingga menjadi ekstrak metanol.
METODE PENELITIAN Bahan Daun ketapang kencana (Terminalia muelleri Benth.), metanol (teknis), etil asetat (teknis), n-heksana (teknis), akuades, plat silika gel GF254 (Merck), sephadex LH-20 (Amersham), silika gel 60-H (Merck), aluminium klorida (Merck), metilen klorida (teknis), kuersetin (Merck), miresetin (Merck), pereaksi Libermann–Burchad, pereaksi Meyer, pereaksi dragendrof, serbuk magnesium, asam sulfat p.a (Merck), natrium hidroksida 2 N, kloroform (t.k), pereaksi Steasny, natrium asetat (Merck), eter (t.k), ferri klorida 1%, aluminium klorida 5%, anhidrida natrium asetat, asam borat, etanol 96%, tetrasiklin, akuabides, bakteri Staphylococcus epidermidis (FNCC 0048) dan Pseudomonas aeruginosa (FNCC
Penapisan fitokimia Penapisan fitokimia dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan tujuan untuk mengetahui kandungan golongan senyawa kimianya meliputi uji alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon, triterpenoid dan steroid menurut metode yang dikembangkan
95
Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
oleh Fransworth 3 Indonesia .
4
dan Materia Medika
spektrometer UV-Vis dan FTIR digunakan untuk mengelusidasi struktur.
Isolasi senyawa flavonoid Sebanyak 7 g ekstrak etil asetat daun T.muelleri difraksinasi dengan kromatografi kolom gravitasi (KG) menggunakan sephadex LH-20 dan pengembang metanolair dengan sistem elusi gradien menurun. Hasil fraksinasi menghasilkan 23 vial dan setiap vial tertampung 120 ml, kemudian dianalisis komponen penyusunnya menggunakan plat silika gel GF254 dan pengembang etil asetat-kloroform (8:2). Fraksi yang diduga mengandung flavonoid difraksinasi kembali dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan Silika Gel 60-H dengan campuran pelarut n-heksanametilen klorida-etil asetat-metanol dengan kepolaran meningkat. Setiap vial dianalisis komponen penyusunnya menggunakan plat silika gel GF254 dan pengembang etil asetatdikrometan (8:2). Vial yang memiliki pola KLT sama digabung menjadi satu fraksi. Pola noda dideteksi dibawah lampu UV 365 nm dan menggunakan penampak bercak AlCl3 5% dalam metanol.
Uji aktivitas antibakteri Uji aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak dan fraksi yang banyak mengandung flavonoid. Metode yang 2 digunakan yaitu metode cakram dengan bakteri uji Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa. Kertas cakram diletakkan di atas media padat dan kemudian ditetesi larutan uji. Larutan uji yaitu ekstrak dan fraksi dengan variasi konsentrasi yaitu 0,5%, 1%, 5% dan 10%. Aktivitas antibakteri ditunjukkan oleh keberadaan zona bening disekeliling kertas cakram, kemudian zona bening diukur diameternya. Pembuatan media nutrien agar Nutrien agar (NA) sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam 100 ml akuades dan dipanaskan hingga larut. Setelah itu dilakukan sterilisasi dalam autoklaf selama o 20 menit dengan suhu 121 C dan tekanan 2 atm. Penyiapan mikroba uji Bakteri uji Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa diinokulasikan dalam media pertumbuhan NA dan o diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Kemudian bakteri ini dibuat suspensi dalam akuabides dan diukur kekeruhannya dengan spektrofotometer pada = 580 nm dan transmitansinya ditepatkan pada T=25% akuabides digunakan sebagai blanko.
Pemurnian dan uji kemurnian senyawa flavonoid Flavonoid yang terdapat dalam fraksi yang paling dominan dimurnikan menggunakan metode kromatografi kertas (whatman no.4). Isolat yang didapatkan kemudian di uji kemurniannya menggunakan KLT silika gel GF254 menggunakan pengembang yang berbeda. Bila terdapat satu noda maka isolat yang diperoleh dipastikan telah murni.
Pengujian aktivitas antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri pada ekstrak daun ketapang kencana dan fraksi dilakukan dengan metode cakram. Suspensi bakteri sebanyak 50 µL dicampur dengan 10 mL NA di petridish. Setelah menjadi padat, kertas cakram diletakkan di atas media dan ditetesi larutan uji sebanyak 10 µL. Kemudian prainkubasi selama 30 menit
Karakterisasi dan elusidasi struktur Isolat murni dikarakterisasi dengan spektrometer UV-Vis dan FTIR. Spektrometer UV-Vis menggunakan metode pereaksi geser sedangkan FTIR menggunakan pelet KBr. Data hasil
96
Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
pada suhu kamar selanjutnya diinkubasi o selama 24 jam pada suhu 37 C. Setelah 24 jam diukur diameter zona bening disekitar kertas cakram dan dinyatakan sebagai diameter hambat. Pembanding yang digunakan adalah pelarut etanol 96% (kontrol negatif) dan antibiotik tetrasiklin (kontrol positif).
Senyawa flavonid dalam fraksi Ec dipisahkan kembali dengan metode kromatografi cair vakum (KCV) dengan silika gel 60-H dan menggunakan pengembang n-heksana – diklorometan - etil asetat -metanol dengan sistem elusi gradien kepolaran meningkat. Hasil fraksi dianalisis dengan KLT silika gel GF254 menggunakan pengembang etil asetat:diklorometan (8:2) dapat dikelompokkan menjadi 16 fraksi (EC1, EC2, EC3,….E C16). Hasil KLT ini juga menunjukkan bahwa fraksi EC14 mengandung flavonoid setelah disemprot dengan AlCl3 5%, dan selanjutnya dilakukan pemisahan dengan metode kromatografi kertas (whatman no.4) dengan pengembang etil asetat:metanol:air (1:2:7). Pada kromatogram diketahui bahwa fraksi EC14 memiliki 5 pita, dan selanjutnya diidentifikasi menggunakan penampak bercak AlCl3 5% dan diketahui pita 3 (Rf 0,6) adalah senyawa golongan flavonoid. Pita 3 selanjutnya dipisahkan dan dilakukan uji kemurnian.
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Fitokimia Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa serbuk daun T. muelleri mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, kuinon, tanin dan steroid/triterpenoid. Isolasi senyawa flavonoid Berdasarkan hasil KLT dengan silika gel GF254 dan pengembang n-heksana : etil asetat (8:2), ekstrak etil asetat positif mengandung flavonoid yang ditandai dengan adanya noda berwarna kuning setelah disemprot dengan H2SO4 10% dibawah UV 365 nm. Ekstrak etil asetat ini kemudian difraksinasi menggunakan metode kromatografi kolom gravitasi. Fase diam yang digunakan adalah Sephadex LH-20 dan pengembang metanol:air dengan sistem elusi gradien kepolaran menurun dihasilkan 6 fraksi (EA,EB,EC…..,E F). Hasil analisis terhadap keenam fraksi menggunakan pengembang etil asetat:kloroform (8:2) dengan penampak bercak AlCl3 5% (dalam etanol) ditunjukkan pada gambar 1.
Uji Kemurnian Pada uji kemurnian pita 3 digunakan metode KLT dengan silika gel GF254 dan pengembang yaitu etil asetat : kloroform : metanol (2:2:6) (Rf 0,8); etil asetat:metanol (3:7) (Rf 0,8); etil asetat : aseton : metanol (1:4:5) (Rf 0,8); dan kloroform : metanol (95:5) (Rf 0,2). Hasil uji kemurnian ini menunjukkan bahwa isolat telah murni dan merupakan senyawa golongan flavonoid. Karakterisasi dan elusidasi struktur Isolat flavonoid murni dikarakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Karakterisasi menggunakan sepktrofotometer UV dengan pereaksi geser bertujuan untuk mengetahui letak gugus hidroksi bebas pada inti senyawa flavonoid dengan cara mengamati pergeseran puncak 6 serapan yang terjadi . Pereaksi geser yang
Gambar 1. Profil KLT fraksi EA,EB,EC,….E F dari ekstrak etil asetat daun T. muelleri dengan pengembang etil asetat:kloroform (8:2) fase diam silika gel GF254, diamatai dibawah UV 365 nm
97
Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
Tabel 3: Absorbansi dan panjang gelombang isolat flavonoid dengan pereaksi geser AlCl3 dan AlCl3/HCl
digunakan adalah natrium hidroksida, alumunium klorida, asam klorida, natrium asetat dan asam borat. Berdasarkan data spektrofotometer UV-Vis terdapat dua pita serapan maksimum yaitu 335 nm (Pita I) dan 274 nm (Pita II) yang diketahui sebagai Flavon atau Flavonol (3-OH tersubstitusi/36 OH bebas) .
Pita I Pita II
isolat+ metanol (nm) 335,0 (0,125 A) 274,0 (0,436 A)
+ AlCl3 (nm)
+ AlCl3/HCl (nm)
380,0 (0,084 A) 280,0 (0,465 A)
351,0 (0,109 A) 276,0 (0,531 A)
Jenis gugus fungsi dalam isolat flavonoid diidentifikasi dengan spektrometer FTIR. Spektra dapat dilihat dalam gambar 5.
Gambar 4. Spektra UV isolat flavonoid dari ekstrak etil asetat daun T.muelleri dengan penambahan pereaksi geser. Tabel 1: Absorbansi dan panjang gelombang isolat flavonoid dengan pereaksi geser natrium hidroksida.
Pita I Pita II
Isolat+ metanol (nm)
+ NaOH (nm)
+ NaOH 5 menit (nm)
335,0 (0,125 A) 274,0 (0,436 A)
332,0 (0,359 A) 276,0 (0,386 A)
332,0 (0,322 A) 278,0 (0,360 A)
Gambar 5. Spektrum IR isolat flavonoid dari ekstrak etil asetat daun T.muelleri
Hasil analisis menunjukkan bahwa isolat memiliki pita serapan pada bilangan -1 gelombang 3209,55 cm yang menunjukkan adanya gugus hidroksil yang dapat membentuk ikatan hidrogen (OH); bilangan -1 gelombang 3174,83 cm menunjukkan adanya gugus C-H aromatic; bilangan -1 gelombang 2920,23 cm menunjukkan adanya gugus C-H asimetri; bilangan -1 gelombang 2856,58 cm menunjukkan adanya gugus C-H simetri; bilangan -1 gelombang 1708,93 cm menunjukkan adanya gugus karbonil (C=O); bilangan -1 -1 gelombang 1514,42 cm dan 1502,55 cm menunjukkan adanya gugus C=C aromatik; -1 bilangan gelombang 1452,40 cm menunjukkan adanya gugus C-H tekuk;
Tabel 2: Absorbansi dan panjang gelombang isolat flavonoid dengan pereaksi geser NaOAc dan NaOAc/H3BO3.
Pita I Pita II
Isolat+ metanol (nm)
+ NaOAc (nm)
+ NaOAc/ H3BO3 (nm)
335,0 (0,125 A) 274,0 (0,436 A)
323,0 (0,306 A) 277,0 (0,284 A)
341,0 (0,160 A) 274,0 (0,315 A)
98
Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
-1
Tabel 4: Rata-Rata Diameter Hambat Pada Konsentrasi Ekstrak dan Fraksi
bilangan gelombang 1390,68 cm dan -1 1357,89 cm menunjukkan adanya gugus OH tekuk; bilangan gelombang 1041,56 cm 1 menunjukkan adanya gugus C-O eter; -1 bilangan gelombang 952,84 cm menunjukkan adanya substitusi cincin benzena pada posisi meta; bilangan -1 menunjukkan gelombang 877,61 cm adanya substitusi cincin benzena pada posisi -1 para dan bilangan gelombang 761,88 cm menunjukkan adanya substitusi cincin benzena pada posisi orto. Berdasarkan hasil analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR dapat diusulkan bahwa senyawa flavonoid yang berhasil diisolasi dari ekstrak etil asetat daun T. muelleri adalah 3,5,7,8,4’ pentahidroksiflavon (Herbasitin) dan strukturnya dapat terlihat dalam Gambar 6.
Rata-Rata Diameter hambat (mm) S. epidermidis P. aeruginosa
Sampel Uji Ekstrak etil asetat 0,5% Ekstrak etil asetat 1% Ekstrak etil asetat 5% Ekstrak etil asetat 10% Fraksi EC14 0,5% Fraksi EC14 1% Fraksi EC14 5% Fraksi EC14 10% Tetrasiklin Etanol 96%
12.7±3,21 19,7±2,51 23±2,0 11 ± 2,1 12,3±2,1 36±6,3 -
14±1,0 16,3±3,5 29,7±4,1 23,7±3,5 10,3±4,9 13,3±3,0 16,3±2,5 35±6,2 -
Keterangan :Tetrasiklin (kontrol positif), etanol 96% (kontrol negatif).15-20 mm: daya hambat kuat; 10-14 mm: daya hambat Sedang; 0-9 mm: daya hambat 11 lemah .
KESIMPULAN 1. Senyawa flavonoid dari ekstrak etil asetat daun Terminalia muelleri Benth. berupa serbuk berwarna kuning dengan rendemen 0,14% dan diidentifikasi sebagai senyawa Herbasitin. 2. Ekstrak etil asetat daun T.muelleri (1%) dan fraksi EC14 (5%) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa dengan kekuatan daya hambat sedang.
Gambar 6. Struktur senyawa 3,5,7,8,4’ Pentahidrok6 siflavon (Herbasitin) .
Uji aktivitas antibakteri Uji antibakteri dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dan fraksi EC14. Uji ini menggunakan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa 3 dengan metode cakram . Berdasarkan hasil uji antibakteri diketahui bahwa ekstrak etil asetat dan fraksi Ec14 bersifat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa. Daya hambat ekstrak dan fraksi memiliki kekuatan yang 11 sedang . Hasil ini dapat terlihat dalam tabel 4.
DAFTAR PUSTAKA 1. Anam, K., A.G. Suganda, E.,Y. Sukandar dan Kardono, L.Broto S., 2009, Antimicrobial Activity of Terminalia muelleri Benth. leaves. Indonesia, J. Nad. Prod., 7: 40-43. 2. Anam, K., A.G. Suganda, E.Y. Sukandar dan Kardono, L.Broto S., 2010, Antibacterial Effect of Component of Terminalia muelleri Benth. against Staphylococcus aureus, International Journal of Pharmacology, 6 (4): 369-374. 3. Departemen Kesehatan, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, Direktorat
99
Chem Info Vol 1, No 1, Hal 94 - 100 , 2013
4.
5.
6.
7.
8.
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta. Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal of Pharmaceutical Sciences, 55, 245-265. Lemmens, R.H.M.J. dan N. WulijarniSoetjipto, 1992. Prosea: Plant Resources of South-East Asia. Pudoc, Wageningen, The Netherlands, pp: 23. Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, Academic Press Inc (LTD). London. Masoko, P., J. Picard dan J.N. Eloff, 2005, The Diversity Antifungal activities of six south African Terminalia species (Combretaceae), J. Ethnopharmacol., 99: 301-308. Mostafa, M.G., Rahman M., dan Karim M.M., 2011, Antimicrobial activity of Terminali Chebula, Int. J. Med. Arom Plants, ISSN 2249-4340, Vol.1 No.2, pp 175-179
9.Muschietti, L., D. Marcos, V. Sülsen, J.D. Muñoz, G. Ferraro, S. Zacchino dan V. Martino, 2005, In vitro antifungal assay of traditional argentine medicinal plants. J. Ethnopharmacol., 102: 233-238. 10.Nanakorn, W., 1985, The genus terminalia (Combretaceae) in Thailand, Thai Forest Bull. Bot., pp: 59-107. 11.Nazri Mohd,N.A.A, Ahmat,N, Adnan,A, Mohamad Syed,S.A, dan Ruzaina Syaripah, S.A., 2011, In Vitro Antibacterial and Radical Scavenging Activities of Malaysian Table Salad, African Journal of Biotechnology Vol.10(30). 12.Saroja,M, R,Santhi, dan S,Annapoorani, 2011, Antioxidant Activity of Phenolic of Terminalia Catappa in Ela Propagated Swiss Albino Mice, Journal of Advanced Scientific Research 2(3): 70-72
Semarang, Desember 2012
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Khairul Anam, M.Si. NIP. 19681104 199403 1 002
Dra. Dewi Kusrini, M.Si. NIP. 19570807 198703 2 001
100
