ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Erdei Anna, DSc Klasszikus és molekuláris genetika program Programvezető: Prof. Dr. Orosz László, DSc
HIV-1 SZUBTÍPUSOKRA OPTIMALIZÁLT, SZEMÉLYRE SZABOTT IMMUNTERÁPIA Doktori értekezés
Somogyi Eszter
Témavezető: Dr. Lisziewicz Julianna, PhD Genetic Immunity Kft., Budapest
Budapest 2012 1
Tartalomjegyzék 1.
Rövidítések ................................................................................................................... 4
2.
Bevezetés ...................................................................................................................... 6
3.
Irodalmi áttekintés és a téma háttere ............................................................................ 8
3.1
A HIV felépítése és életciklusa .................................................................................. 10
3.2
A HIV fertőzés immunológiája .................................................................................. 13
3.3
HIV diverzitás és epidemiológia ................................................................................ 17
3.4
A DermaVir kifejlesztése ........................................................................................... 19
3.4.1
A DermaVir pDNS alapú antigénje ........................................................................... 21
3.4.2
Az antigén DC-be juttatása patogén-szerű szintetikus nanorészecskével ................. 21
3.4.3
DermaPrep orvosi eszköz a nanomedicina bőrön át történő bejuttatására .............. 22
3.4.4
Preklinikai és klinikai eredmények ........................................................................... 23
4.
Célkitűzések ............................................................................................................... 26
5.
Anyagok és módszerek .............................................................................................. 27
5.1.
Nanomedicina készítés ............................................................................................... 27
5.2.
Western blot ............................................................................................................... 27
5.3.
Immunprecipitáció ..................................................................................................... 27
5.4.
Intracelluláris festés ................................................................................................... 28
5.5.
VLP+ termelés és tisztítás........................................................................................... 28
5.6.
Transzmissziós elektronmikroszkópia ....................................................................... 28
5.7.
Biológiai aktivitás mérés ............................................................................................ 28
5.8.
Statisztikai analízis ..................................................................................................... 29
5.9.
In silico T sejt epitóp repertoár analízis ..................................................................... 29
5.10.
Filogenetikai analízis ................................................................................................. 29
5.11.
pDNS konstrukciók készítése .................................................................................... 30
5.11.1.
Szekvenciák................................................................................................................. 30
5.11.2.
RNS kivonás ............................................................................................................... 30
5.11.3.
Oligonukleotidok tervezése és szintézise.................................................................... 30
5.11.4.
RT-PCR ...................................................................................................................... 30
5.11.5.
Agaróz gélelektroforézis ............................................................................................ 31
5.11.6.
DNS tisztítás gélből .................................................................................................... 31
5.11.7.
Inzert és pDNS vektor előkészítése irányított ligáláshoz ........................................... 31
5.11.8.
Hőkompetens E. coli kompetens sejt készítés............................................................. 32
5.11.9.
Ligálás és transzformálás .......................................................................................... 32
5.11.10.
pDNS termelés ............................................................................................................ 32
5.11.11.
Az új pDNS-esek azonosságának ellenőrzése ............................................................ 32
6.
Eredmények................................................................................................................ 33
6.1.
A DermaVir in vitro jellemzése ................................................................................. 34
6.1.1.
A pLWXu1 pDNS által expresszált fehérje repertoár ................................................ 34 2
6.1.2.
VLP+ termelés ............................................................................................................ 36
6.1.3.
Biológiai aktivitás ...................................................................................................... 37
6.2.
A nanomedicina immunológiai potenciáljának in silico modellezése....................... 40
6.2.1.
T sejt epitóp repertoár analízis kidolgozása .............................................................. 40
6.2.2.
Abszolút immunológiai potenciál (AIP) ..................................................................... 42
6.2.3.
A DermaVir (pLWXu1) immunológiai potenciálja egy személyben modellezve ....... 43
6.2.4.
Relatív immunológiai potenciál (RIP) ....................................................................... 44
6.2.5.
Nem-B szubtípusú fertőzés esetén a B-szubtípus alapú terápia hatékonyságának in silico modellezése ....................................................................................................... 46
6.3.
Szubtípus-optimalzált pDNS konstrukciók tervezése és klónozása .......................... 49
6.3.1.
A vakcinatervezést segítő új alkalmazás: az “immunológiai fa” .............................. 49
6.3.2.
Szubtípus-optimalizált termékjelöltek immunológiai szempontú tervezése ............... 52
6.3.3.
Az új pDNS-ek elkészítése és a termékjelöltek in silico jellemzése............................ 53
6.3.4.
Az új szubtípus-optimalizált termékjelöltek in vitro tesztelése .................................. 56
6.3.4.1.
VLP+ termelés az új termékjelöltek által.................................................................... 56
6.3.4.2.
Az új termékjelöltek biológiai aktivitása .................................................................... 59
6.3.5.
A nanomedicina termékcsalád in vitro eredményeinek összefoglalása ..................... 59
7.
Eredmények megvitatása ........................................................................................... 61
8.
Összefoglalás.............................................................................................................. 69
9.
Summary .................................................................................................................... 71
10.
Publikációk ................................................................................................................. 72
11.
Köszönetnyilvánítás ................................................................................................... 73
12.
Irodalomjegyzék…………………………………………..…..…………………....74
3
1. Rövidítések AIDS
Szerzett immunhiányos tünetegyüttes (Acquired Immune Deficiency Syndrome)
AIP
Abszolút immunológiai potenciál
ANN
Mesterséges neurális hálózat (Artificial Neural Network)
APC
Antigén prezentáló sejt (Antigen presenting cell)
ARB
Általános relatív kötés (Average Relative Binding)
ART
Antiretrovirális terápia
as
aminosav
bp
bázispár
CA
Kapszid
cART
kombinált antiretrovirális terápia
CTL
Citotoxikus T limfocita (Cytotoxic T lymphocyte)
DC
Dendritikus sejt (Dendritic cell)
EMA
Európai Gyógyszerengedélyezési Hivatal (European Medicines Agency)
Env
Burokfehérje (Envelope)
FDA
Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerengedélyezési Hivatal (Food and Drug Administration)
HIV
Emberi immunhiány vírusa (Human Immunodeficiency Virus)
HLA
Humán leukocita antigén (Human leukocyte antigen)
IEDB
Immunológiai Epitóp Adatbázis (Immune Epitope Database)
IN
Integráz
Kbp
kilobázispár
LC
Langerhans sejt (Langerhans cell)
MA
Mátrix
MHC
Fő hisztokompatibilitási antigén (Major histocompatibility complex)
NC
Nukleokapszid
Nef
Negatív faktor
PCR
Polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction)
pDNS
plazmid DNS
Pol
Polimeráz
PEIm
Polietilénimin-mannóz
Rev
Virion expressziós szabályozó (Regulator of virion expression) 4
RIP
Relatív immunológiai potenciál
RT
Reverz transzkriptáz fehérje
SIV
Majom immunhiány vírusa (Simian Immunodeficiency Virus)
SMM
Stabilizált mátrix módszer (Stabilized Matrix Method)
SU
Felszíni fehérje (surface protein)
Tat
transzaktiváló szabályozó fehérje (Transactivating regulatory protein)
TM
Transzmembrán fehérje
Vif
Virion fertőzési faktor (Virion infectivity factor)
VLP
Vírusszerű részecske (Virus-like particle)
VLP+
Komplex vírusszerű részecske
Vpr
R-vírusfehérje (Viral protein R)
Vpu
U-vírusfehérje (Viral protein U)
5
2. Bevezetés Ez a doktori munka a Genetic Immunity Kft. termékfejlesztési laboratóriumában készült. A HIV (Human Immunodeficiency Virus) fertőzés és a következtében kialakuló AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) világszerte 34 millió fertőzöttet számláló halálos betegség [1]. Egyelőre nem létezik ellene sem megelőző oltás, sem terápiás vakcina, noha a vakcina fejlesztés egyik kiemelkedő fontosságú célterülete ez. Az antiretrovirális gyógyszeres terápia számos mellékhatása, és a gyógyszer rezisztens vírustörzsek kialakulása miatt sürgető feladat egy működő, és a szervezetre kevésbé káros vakcina kifejlesztése. A Genetic Immunity Kft. terápiás nanomedicina kifejlesztését tűzte ki célul a HIV/AIDS kezelésére. (A nanomedicina a nanotechnológia orvosi alkalmazásának összefoglaló megnevezése, és ez a kutatási terület többek között betegségek megelőzésére, kezelésére, és diagnózisára keres megoldásokat [2].) A Genetic Immunity első termékjelöltje, a DermaVir HIV Tapasz már a klinikai fejlesztés második fázisában jár. A nanomedicina terápiás alkalmazásának célja de novo T sejtes immunválasz kiváltása a kezelt beteg szervezetében, mely a HIV-vel fertőzött sejtek pusztításával csökkenti a vírusterheltséget, ugyanakkor javítja az immunrendszer –ezzel a fertőzött személy– általános állapotát. A nanomedicina hatóanyaga egy patogén-szerű nanorészecske, ami HIV fehérjéket kódoló plazmid DNS-ből (pDNS) és kationos szintetikus polimerből (polietiléniminmannóz, PEIm) áll, folyadék formulációban. A nanorészecske oldat célzott, bőrön át történő “beadását”-, ezzel együtt az epidermiszben lévő antigén bemutató sejtekhez (Langerhans sejtek, LC) irányítását a szintén saját fejlesztésű DermaPrep orvosi eszköz teszi lehetővé. Az immunválasz kiváltásában kulcsfontosságú hatóanyag a pDNS, ami számos HIV fehérjét (antigént) expresszál, az első termékjelölt esetében B szubtípusra specifikusakat. A HIV azonban rövid története ellenére az RNS vírusok gyors evolúciója miatt nagy természetes diverzitással rendelkezik. Kilenc térbeli és időbeli elkülönülést mutató szubtípusba (és számos rekombináns alcsoportba) sorolható, melyek között 10-35% genetikai távolság állapítható meg [3].
6
Kérdésként merül fel, hogy az ilyen nagy divergenciát mutató szubtípusokkal fertőzött betegek esetében mennyire lehet hatékony a B szubtípusra specifikus nanomedicina? Ezért a doktori munka egyik célkitűzése a B szubtípusra specifikus termékjelölttel kiváltható immunválasz in silico modellezésének kidolgozása, majd ezzel a nanomedicina kereszt-reaktivitásának modellezése volt nem-B szubtípusú fertőzések esetén. A kapott eredmények alapján döntöttünk egy szubtípus-optimalizált termékcsalád kifejlesztése mellett. A feladat megvalósításához egy immunológiai szempontú tervezést segítő eszközt is kifejlesztettünk. Ezenkívül fontos célunk volt a klinikai tesztelés alatt álló DermaVir termékjelölt in vitro jellemzése, ehhez módszerek fejlesztése, majd végül az új nanomedicina jelöltek klinikai vizsgálatokra alkalmas minőségének in vitro igazolása.
7
3. Irodalmi áttekintés és a téma háttere Létezik-e olyan antigén, ami a HIV fertőzés ellen véd? Ez a kérdés kutatók ezreit és emberek (tíz)millióit foglalkoztatja 25 éve. Eddig senki nem adott egyértelmű választ a kérdésre. Nincs megelőző védőoltás, mert a HIV számos védőmechanizmusa, valamint genetikai változatossága miatt az eddigi összes antigén jelölt hatástalannak bizonyult. A kutatás tovább folyik, de a sikertelenség miatt időközben előtérbe került a terápiás vakcinák fejlesztése, hogy a világméretű járvány fertőzöttjeinek jobb életkilátásokat és jobb életminőséget nyújtsanak. Amíg célt nem ér valaki, addig marad az antiretrovirális terápia (ART), a vírus életciklusának különböző szakaszait gátló közel harmincféle piacon lévő gyógyszerrel [4]. Az ART legnagyobb hátránya, hogy a vírus RNS örökítőanyagának rendkívül gyors mutációs képessége miatt hamar kialakulnak a gyógyszerrezisztens mutánsok. Épp ezért a gyógyszereket hármas kombinációban adják (cART), és amikor az adott betegben hatástalanná válik, lecserélik egy újabb gyógyszerkombinációra. Sajnos sok HIV fertőzött eljut odáig, hogy már nincs mire lecserélni a gyógyszereit. A terápiás HIV vakcina tervezés esetén is az egyik legnagyobb kihívás a megfelelő antigén készlet kiválasztása, amely hatékonyan képes HIV-specifikus T sejteket indukálni, hogy azok sikeresen elpusztíthassák a vírussal fertőzött sejteket a beteg szervezetében, ezzel fékezve a betegség előrehaladását. Minél szélesebb az antigén repertoár, annál többféle antigén-specifikus T sejt termelődése indukálható, és annál hatékonyabb lehet a vakcina [5]. A gyengített vírust tartalmazó vakcinák ezért sikeresek sok kórokozó elleni védelemben (pl. mumpsz, kanyaró, rubeola). Sőt, már a SIV (majom immundeficiencia vírus) esetében is kifejlesztettek hosszú távú védettséget biztosító, gyengített kórokozót tartalmazó oltóanyagot [6]. Ez bíztató eredmény arra nézve, hogy esetleg emberben is indukálható tartós, a vírus replikációt kordában tartó immunválasz a HIV ellen. Azonban a gyengített HIV vírus vakcinaként történő alkalmazása túl sok biztonsági kockázatot rejt [7]. Az elterjedten használt alegység vakcinák ezzel szemben csak egy vagy néhány antigént tartalmaznak. Ezek újabb alternatívája a VLP (vírusszerű részecske) vakcina, ami spontán összeszerelődő kapszidfehérjékből, valamint esetenként burokfehérjékből áll, és nagy előnye, hogy az alkotó fehérjéket természetes konformációban tartalmazza a leghatékonyabb immunválasz kiváltása érdekében. Már kereskedelmi forgalomban is 8
kaphatók ilyen VLP vakcinák, pl. a magas kockázatú humán papillomavírus törzsek elleni megelőző vakcinák (Gardasil® és Cervarix™) [8,9]. Eddig azonban a VLP vakcinák terápiás felhasználása nem volt sikeres (vagy fel sem merült), mivel nem váltanak ki a terápiás vakcinák hatékonyságához szükséges T sejtes immunválaszt [10]. Néhány kivételes esetben megfigyeltek már mind a fertőzéstől megvéd, mind terápiás szempontból hatékony immunválaszt HIV-fertőzött betegekben [11,12,13,14]. Ezen esetek jelzik, hogy a HIV virion jó antigén, ami ellen létezhet hatékony természetes immunválasz.
Épp
struktúrfehérjéinek
ezért
a
együttes
széles
antigén
bevetése
repertoár
immunogénként
és
a
virion
működő
felszíni vakcinát
eredményezhet, amit már többféle vakcinafejlesztési elképzelésben is felhasználtak. Többen is készítettek kémiailag módosított-, vagy replikációs mutáns HIV vírustörzseket, de a klinikai vizsgálatokra vonatkozó kérelmeiket nem fogadták el a gyógyszerengedélyezési hatóságok, mert a vakcina-jelöltek nem bizonyultak eléggé biztonságosnak [15, 16]. Az egyéb vírus-vektor alapú vakcinák fő hátránya, hogy a vektorral szembeni korábbi védettség miatt nem alkalmazhatók mindenkinél, és terápiás célú (többszöri) alkalmazásuk is korlátozott a vektor antigének ellen kialakuló immunválasz miatt, amik közömbösíthetik a vakcina hatását. A Merck STEP klinikai kísérletében például Adenovírus 5 vírus-vektor alapú megelőző vakcinát használtak magas fertőzési kockázatú HIV negatív egyének bevonásával. Sajnos azonban a kezelt csoportban magasabb volt a HIV-fertőzések száma a korábban Adenovírus fertőzésen átesett személyek vírusvektorral szembeni immunitása miatt, mint a kontroll csoportban [17]. A nem vírus-vektor alapú DNS vakcinákat is azzal a céllal fejlesztik, hogy számos antigén ellen váltsanak ki velük immunválaszt. Előnyük, hogy egy DNS konstrukció sok antigént expresszálhat, ezáltal széles repertoárú patogén-specifikus immunválaszt válthat ki, emellett a körültekintő és többszörös biztonsági módosítások könnyen bevihetők a DNS-be. Így megszüntethetők az eredeti kórokozó integrációs-, és onkogén tulajdonságai, valamint megakadályozható, hogy a vakcinaként felhasznált módosított örökítőanyag replikálódjon, ill. rekombinálódjon vad vírustörzsekkel. A Genetic Immunity laboratóriumában olyan terápiás HIV vakcina kifejlesztését tűztük ki célul, ami HIV specifikus T sejtek széles repertoárjának képződését képes kiváltani, ezáltal a HIV fertőzés ill. az AIDS lefolyását lassítani. A DermaVir terápiás vakcina pDNS hatóanyaga a tizenöt HIV fehérje közül tizenhármat teljes hosszúságában-, kettőt 9
pedig részlegesen kódol és expresszál a célzott antigén bemutató sejtekben (APC). A pDNS célba juttatását lehetővé tevő nanorészecske formuláció-, valamint a bőrben lévő APC-k elérését szolgáló “DermaPrep” bőr előkészítő és kezelési eljárás fontos részét képezik az alább kifejtett hatásmechanizmus kiváltásának. Előbb azonban tekintsük át röviden a HIV életciklusát, immunológiáját és epidemiológiáját! 3.1 A HIV felépítése és életciklusa A HIV (Human Immunodeficiency Virus) a Retroviridae család Lentivirus genusába tartozik, többek között a majom immunhiány vírusával (SIV) együtt. A 120 nm átmérőjű burkos RNS vírus lassú lefolyású halálos fertőzést okoz. A HIV genomját két azonos, egyszálú pozitív irányultságú, 9,5 kilobázis méretű RNS alkotja, ami a következő vírusalkotó fehérjéket expresszálja (1. ábra) [18]: Gag poliprotein (mely a vírus érése során tovább hasítódik mátrix-MA, kapszid-CA és nukleokapszid-NC fehérjékké), Pol poliprotein (melyet saját enzimaktivitása hasít proteáz-PR, reverz transzkriptáz-RT és integráz-IN fehérjékre), valamint az Env 160 kDa méretű poliprotein (amit a gazdasejt proteázai gp120 felszíni fehérje alegységre-SU és a pg41 transzmembrán fehérje alegységre-TM hasítanak, és ezek trimerei alkotják a vírus felszíni gligoproteinjét). A szerkezeti fehérjéken kívül szabályozó fehérjéket is kódol a genom: Tat és Rev, valamint a Nef, Vif, Vpr és Vpu járulékos fehérjéket [19]. Felszíni burokfehérje (Env-SU)
Vpr
Transzmembrán burokfehérje (Env-TM) Proteáz (Pol-PR)
kettős lipidréteg Mátrix (Gag-MA) Kapszid (Gag-CA)
Nukleokapszid (Gag-NC)
vírus genom
Integráz (Pol-IN)
Reverz transzkriptáz (Pol-RT)
1. ábra. A HIV virion felépítésének sematikus ábrája.
10
A vírus szexuális úton a nyálkahártya mikrosérülésein át, vagy vérrel, ill. vertikálisan anyáról magzatra, illetve újszülöttre (anyatejjel) terjed [20]. Sikeres fertőzés az után jöhet létre, hogy a szervezetbe került virionok bejutnak a szaporodásuk helyszínéül szolgáló immunsejtekbe: elsősorban a CD4 receptorral rendelkező T limfocitákba, esetleg dendritikus sejtekbe (DC) ill. makrofágokba. Először általában nyugvó CD4+ T sejteket fertőz a vírus, majd ezekben intenzív reprodukciós ciklussal megsokszorozza a vírusmennyiséget (ez a fertőzés akut fázisa, amit enyhe mononukleózis-szerű tünetek kísérhetnek). A T sejt CD4+ receptorán és koreceptorán (CCR5 vagy CXCR4) az EnvSU felszíni glikoproteinjének segítségével rögzül a virion. Majd konformáció változás után az Env-TM fehérje utat nyit a sejtbe: a vírus burka a gazdasejt membránjába olvad, a kapszid pedig bejut a citoplazmába (2.ábra) [21]. Ezután a kapszid is lebomlik, és szabaddá válik a vírusgenom, megkezdődik a replikáció. Az RT fehérje révén az RNSről RNS-DNS hibrid, majd kettős szálú DNS másolat készül, mely gyűrű konformációjú preintegrációs komplexként az IN fehérje segítségével a gazdasejt genomjába integrálódik [22]. A vírus ezen integrálódott formája a provírus, és amennyiben a fertőzött T sejtből memória T sejt alakul ki, ez a látens fertőzés hosszú ideig fennmaradhat, a vírus rezervoárját (ill. annak egy részét) alkotva [23,24]. Ha a gazdasejt aktiválódik ― vagyis mitózis történik, RNS polimeráza kis mennyiségben mRNS-eket szintetizál az integrálódott HIV DNS-ről, és ezekről korai szabályozó fehérjék expresszálódnak [25]. Előbbi (“transzaktivátor fehérje”, a transzkripció fő virális szabályozó fehérjéje) a genom LTR promóterérnek TAR (“Transactivating Responsive Region”) szabályozó régiójának transzkriptumához kötődve transzkripciós iniciátorként és elongációs faktorként fokozza az mRNS-ek képződését (3. ábra) [25,25,26]. A Rev az RRE (“Rev Responsive Element”) szabályozó régióhoz kötődve a képződött teljes hosszúságú és a részlegesen hasított mRNS-ek sejtplazmába történő exportját-, ezzel a HIV fehérjék transzlációját segíti elő [27]. A termelődő vírus fehérjék a teljes hosszúságú mRNS két kópiáját is becsomagolva éretlen HIV részecskékké szerelődnek össze a sejthártyát is integrálva annak belső oldalán, majd a folyamat a sejthártya lefűződésével és ezzel a termelődött HIV vírusok sejtből való kijutásával zárul. Utolsó lépésként transzlációt követő fehérje hasítással a Gag poliproteinből származó fehérjék is előállítódnak, felveszik végleges térszerkezetüket és a Gag-CA fehérjékből kialakul a kapszid, ami az érett virion morfológiájának ismérve [28].
11
HIV virion
Új HIV
6
1 2
CD4+ T sejt
Vírus ssRNS
5 RT RNS/DNS
3
mRNS mRNS
Virális dsDNS
Provírus
4
Sejtmag
2. ábra. A HIV életciklusának áttekintése 2. áttekintése. 1: Vírus köt kötő kötődés ődés dés és sejtbe jutás, 2: kicsomagolódás, 3: transzkripció, 4: a virális DNS integrációja a gazdasejt genomjába, 5: fehérjeszintézis és új vírusok összesz összeszerel erelő erelődése, ődése, dése, 6: új vírusok lef lefűződése. lefűűződése. ődése.
3. ábra. A HIV genom és promóter vázlatos térképe. 3. térképe. A promóter promóterben ben a transzkripciós starthelyt starthelytő starthelytől őll közvetlenül downstream irányban helyezkedik el a TAR szabályozó régió, ami az ábra bal alsó rész részén én látható „stem „stem-loop loop” loop struktúrájú RNS RNS--tt kódolja. A Tat szabályozó fehérje a TAR RNS szürk szürkével ével jelölt régiójához köt kötődik. ődik. 12
3.2 A HIV fertőzés immunológiája A HIV fertőzés immunológiai alapjainak áttekintéséhez a klinikusok számára készített UpToDate online tudásbázist használom vezérfonalként [29]. A HIV leggyakrabban az anogenitális nyálkahártyán át fertőz, és az előző bekezdésben leírt módon jut be a CD4 receptorral rendelkező immunsejtekbe. A célsejtbe jutáshoz a gp120 vírusfehérje és a célsejt CD4 receptorának kapcsolódásán kívül a CCR5 vagy a CXCR4 koreceptor keresztkötése is szükséges. A vírus koreceptor használata meghatározza a célsejtek fajtáját: a CCR5 koreceptor segítségével bejutó HIV törzsek makrofág-, ill. DC tropikusak, a CXCR4 koreceptor pedig a T sejt tropikus HIV bejutásában játszik szerepet, de vannak olyan vírusok is, amik mindkét koreceptorral képesek kapcsolódni [30]. Friss (ún. elsődleges) fertőzést általában makrofág/DC tropikus vírus hoz létre. A leggyakoribb a DC antigénbemutató sejt fertőzése, produktív vagy nem produktív módon. A nem produktív fertőzés eredményeképp a vírus a DC-SIGN receptorhoz kapcsolódva bejut a sejtbe, de nem replikálódik, hanem a DC segítségével a nyirokcsomóba jut és ott CD4+ T sejteket fertőz [31,32]. A vírus két nap múlva már kimutatható a közeli nyirokcsomókban, további három nap múlva pedig a vérben is [33]. Ezután a fertőzés szétterjed az egész szervezetben. A következő, akut fertőzési szakasz néhány hetében többnyire mononukleózis-szerű tünetekkel kísérve (láz, nyirokcsomó-duzzanat), esetleg tünetmentesen a vírus gyorsan replikálódik (4. ábra) [34]. Ezzel egy időben a CD4+ T sejt szám csökken, a CD8+ T sejt szám pedig emelkedik, de mindkettő hamar visszaáll az eredetihez közeli szintre. A CD4+ T sejt szám csökkenés, valamint a Th17 (szabályozó) T sejt szám csökkenés az emésztőrendszer mentén lévő nyirokcsomókban lokális immunhiányt okoz, ennek következtében a bélfal nyálkahártyáján át baktériumok kerülnek a szervezetbe, ami krónikus immun-aktivációt eredményez [35,36]. Az immun-aktivációban természetesen szerepet játszik az intenzív HIV replikáció is.
13
4. ábra. A HIV fertőzés tipikus időbeli lefolyása a CD4+ T sejt szám és a vérplazmában mérhető HIV RNS mennyiségének függvényében.
Az akut HIV fertőzési szakaszban a természetes ölősejtek (NK) közvetlen lízissel, és ellenanyag-függő citotoxikus mechanizmussal (ADCC) pusztítják a fertőzött sejteket. Az NK sejtek átmenetet képeznek a veleszületett- és az adaptív immunválasz között, mivel elősegítik a DC-k érését [37]. A DC professzionális antigénbemutató sejtek (APC) szerepe kulcsfontosságú a HIV specifikus immunválasz kiváltásában. (Ugyanakkor ezek a sejtek fertőződnek meg elsőként, amikor a HIV a nyálkahártyán át bejut a szervezetbe.) Az éretlen DC-k endocitózissal veszik fel a virionokat a szervezetbe jutásuk helyén, és a közeli nyirokcsomóba vándorolnak, miközben érett DC-vé differenciálódnak az antigén feldolgozása során. A DC-k antigén bemutató funkcióját
az
MHCI
(fő
hisztokompatibilitási
komplex
I)
és
MHCII
(fő
hisztokompatibilitási komplex II) molekulákhoz kapcsolt immunogén peptidekkel, azaz epitópokkal hajtja végre. A 9-11 aminosav (as) hosszúságú epitópot kötő MHCI molekula CD8+ T sejtek érését (ún. priming-ot) segíti elő, míg az MHCII molekulához kapcsolt 13-25 as méretű epitópok a CD4+ helper T sejtek érését stimulálják. A HIV virionok endocitózisa után az exogén (sejten kívülről származó) vírusfehérjék proteolitikus lízissel peptidekre esnek, és ezek egy része az endocitotikus úton MHCII molekulákra kötődik, amit a DC-k CD4+ helper T sejteknek mutatnak be (5.ábra) [38]. A sejten belül képződő vírusfehérjék, és kereszt-prezentációval akár a sejten kívülről 14
felvett antigének is képesek az MHCI útvonalon CD8+ citotoxikus T sejtek (CTL) primingjára [39,40]. (A HIV vírus Nef fehérjéje az antigén bemutatás hatékonyságát csökkenti, mert az MHCI és MHCII molekulák downregulációjával akadályozza HIV epitópok megjelenését a sejtfelszínen [41,42].) Az MHCI útvonalon a HIV antigének proteasomákban történő részleges lebontás után peptidek formájában haladnak át a TAP transzportfehérjéken
(Transporter
associated
with
Antigen
Processing)
az
endoplazmatikus retikulumba. A TAP molekulán azonban átlagosan csak minden 7. peptid képes átjutni, és az epitópok száma még ennél is kisebb, mert csak minden 200. peptid illik bele az MHCI molekula kötőzsebébe, hogy aztán megfelelő erősséggel kötődjön [43,44].
5. ábra. Az antigén bemutatás útvonalai DC-kben. A HIV fehérjéket a DC-k mindkét útvonalon képesek feldolgozni: a sejten kívülről származó antigénekből proteolitikus bontással nyert peptideket MHCII molekulákon mutatják be, ezzel CD4+ T sejtek érését elősegítve. A sejtben képződő vírusfehérjék, ill. kereszt-prezentációval az endocitózissal felvett antigénekből származó peptidek pedig MHCI molekulákhoz kapcsolódva CD8+ T sejtek érését segítik elő. Az MHCI-hez a TAP transzportfehérjén átjutott peptidek egy része tud kapcsolódni.
A DC-k tehát elősegítik a differenciálódó CD4+ helper- és CD8+ T sejtek HIV specifikus effektor sejtté- ill. memória sejtté érését. Az antigén bemutatás során a nyirokcsomóban a vírus specifikus MHC-peptid komplexhez kapcsolódni képes T sejt 15
receptorú (TCR) T sejtek aktiválódnak, és gyorsan proliferálódnak, aminek köszönhetően több nagyságrenddel megnő a mennyiségük. A CD8+ T sejtek emellett differenciálódnak is (effektor/memória sejtté). Az effektor sejtek antivirális citokineket termelnek (pl. IFN-γ, β-kemokin, MIP-1α, MIP-1β és RANTES), ill. citolitikus sejtté differenciálódnak granzim és perforin enzimek termelésével (ez a sejtpopuláció képes a nyirokszerveket, ill. nyirokkeringést is elhagyni). A citolitikus sejtek azután közvetlen lízissel képesek elpusztítani a specifitásuknak megfelelő fertőzött sejteket. Az effektor sejtek kis része további differenciálódás után nyugvó memóriasejtekké alakul, amik antigén hiányában is hosszú ideig képesek fennmaradni, és újabb antigén stimulusra azonnali effektor funkciókkal válaszolni. A CD4+ helper T sejtek termelődése az immunválasz során két szempontból meghatározó: a HIV fertőzés miatt pusztuló CD4+ T sejt állományt pótolják, és a CD8+ T sejtek működését segítik. Utóbbi segítő funkció több szinten is megnyilvánul, pl. a CD8+ T sejtek megfelelő primingjában az akut fertőzés során, és a memória CD8+ T sejt populáció kialakulásában. A CD4+ T sejtek közreműködésével kialakult CD8+ memória T sejtek pedig hatékonyabb másodlagos effektor populációt képesek termelni [45,46,47]. Noha a vírusfertőzések során az ellenanyag termelés kulcsfontosságú a fertőzés megakadályozására, HIV esetében ez nem igaz. A neutralizáló ellenanyagok definíció szerint a kórokozó felszíni fehérjéihez specifikusan kapcsolódva megakadályozzák, hogy a fertőzés létrejöjjön. A neutralizáló (és a nem-neutralizáló) HIV specifikus ellenanyagok azonban nem tudnak megfelelő hatást kifejteni a fertőzés megelőzésére, de még a vírus replikáció fékezésére sem a krónikus fertőzési szakaszban. Ennek oka, hogy a vírus gyors mutációs rátájának és az immunszelekciónak köszönhetően hamar megjelennek olyan mutáns vírustörzsek, amik az ellenanyag kötőhelyeken változva kivédik az ellenanyag kötődését. [48,49]. A fent részletezett specifikus (adaptív) immunválasz megfékezi és visszaszorítja a HIV további szaporodását: a HIV-specifikus T limfociták hatékonyan csökkentik a szervezet vírus-terheltségét. A humorális immunválasz eredményeként pedig jelentős ellenanyag termelés mutatható ki, vagyis megtörténik a szerokonverzió is. A fertőzés akut szakaszában a legtöbb HIV virion éppen a frissen fertőzött proliferálódó CD4+ T sejtekben termelődik. Noha az immunrendszer hatékonyan pusztítja ezeket a fertőzött T sejteket, egy kis részük elég hosszú ideig életben marad ahhoz, hogy visszaalakuljon nyugvó memória sejtté, és az integrálódott HIV-et (provírus) hordozva a vírus rezervoárját képezze. 16
A lecsökkent vírusszám, és replikációs aktivitás mellett az immunrendszer hosszú évekig képes kontrollálni a fertőzést (akár 15 évig), ez a klinikailag tünetmentes látens fertőzési szakasz. Ezalatt a CD4+ T sejt szám és a DC-k száma is lassan csökken, sőt egyes nagyon alacsony vírusszámú fertőzöttekben sosem éri el az AIDS tünetegyüttes kialakulásához vezető mennyiséget. A csökkenés oka elsősorban az, hogy a vírus a CD4+ T sejteket fertőzi, továbbá a vírusra ható immunszelekció (escape mutánsok megjelenése), és az aktivált T sejtek apoptózisra való “hajlama” is közrejátszik a folyamatban. Amikor a CD4+ sejtek száma a kritikus mennyiséget közelíti (200/ml), a vírusmennyiség drasztikusan nőni kezd, és járulékos fertőzések tünetei jelennek meg a betegben, pl. TBC, toxoplazma, gombás fertőzések, és tumoros betegségek. Az AIDS, a szerzett immunhiányos tünetegyüttes a HIV fertőzés utolsó fázisa, ami néhány éven belül halállal végződik. Fontos megjegyezni, hogy az immunválasz minőségét, ezáltal a betegség lefolyásának sebességét nagyban befolyásolhatja a fertőzött egyén MHC genotípusa. Egyes MHC allélek (más néven HLA-humán leukocita antigén) nagyon hatékony immunválasszal egészen alacsonyra csökkentik az akut fázisban a vírusszámot, ezzel lassú betegség lefolyást tesznek lehetővé. Ezek a protektív allélek, pl. HLA-B57 [50]. Sajnos azonban léteznek nem-protektív allélek is, pl. HLA-B35, és az ilyen allélekkel rendelkező betegekben az átlagosnál gyorsabb a betegség lefolyása. HLA [51]. 3.3 HIV diverzitás és epidemiológia A HIV-1 vírus őse valószínűleg a SIV majom immundeficiencia vírus volt, amit Kamerunban csimpánz vadászok kaphattak el elsőként [52,53,54]. A majom vírusok filogenetikai vizsgálatai alapján úgy tűnik több független fertőzési esemény is történt, az első valamikor az 1930-as évek környékén [55]. Ezekből jöhetett létre a HIV-1 három járványcsoportja: a mára globális járványokozó M (main) csoport, az O (outlier) csoport és az N (non-outlier) csoport [3]. Egy átfogó filogenetikai tanulmány szerint viszont az O csoport tagjaihoz filogenetikailag legközelebb álló majom vírustörzsek gorillából származnak [56]. Az N és O csoport tagjai csak az eredetük helyén, NyugatAfrikában terjedtek el, míg az M csoport alább részletezett szubtípusai és rekombináns csoportjai tehetők felelőssé a globális járványokért (6. ábra. HIV szubtípusok és rekombináns formák földrajzi elterjedése.) [54]. 17
A HIV-2 kórokozó őse szintén majom SIV, a Cercocebus atys fajt fertőző vírus, de a HIV-2 járványtani jelentősége a HIV-1 N és O csoportjához hasonlóan kis területekre korlátozódik [57]. Ezért a továbbiakban a HIV rövidítés alatt jellemzően a HIV-1 M csoportját értem. Rövid múltja ellenére a HIV nagy természetes diverzitással rendelkezik, és számos, térbeli és időbeli elkülönülést mutató kisebb genetikai csoportba, szubtípusba sorolható. Gyors evolúciójának legfőbb oka, hogy a HIV reverz transzkriptáz enzimének nincs proofreading
hibajavító
aktivitása,
így
a
magas,
kb.
3,4x10-5
mutáció/bázispár/replikációs ciklus mutációs ráta eredményeként milliós nagyságrendű új vírusvariáns képződik naponta(!) minden fertőzött személyben [58]. Ilyen ütemű evolúció mellett mára a szubtípusok genetikai diverzitása 10-35% [3]. Jelenleg 9 szubtípusba sorolhatók az M csoportba tartozó izolátumok, melyeket A-K betűkkel jelölnek, ill. vannak még kisebb genetikailag elkülönülő csoportok: szub-szubtípusok, valamint rekombináns alcsoportok, amik kialakulásához különböző szubtípusokkal való egyidejű fertőzés, rekombináció, és a rekombináns sikeres terjedése szükséges (6. ábra) [54]. A HIV-1 nevezéktani ajánlás definíciója szerint ilyen rekombinánsok (circulating recombinant form, CRF) akkor jegyezhetők be, ha legalább három személyből, járványtani kapcsolatot nem mutató esetekben izolálják a stabilizálódott rekombináns vírust [59].
A B C D
B és CRF01_AE CRF02_AG és más rekombináns formák A, B és AB rekombináns forma B és BF rekombináns forma B, C és BC rekombináns forma F, G, H, J, K, CRF_01 és más rekombináns formák Nincs elegendő adat
6. ábra. HIV szubtípusok és rekombináns formák földrajzi elterjedése. 18
3.4 A DermaVir kifejlesztése A DermaVir nanomedicina kifejlesztésének ötletét egy HIV-fertőzött beteg különleges kórtörténete adta 1999-ben [14,60]. A betegnél korai diagnózist követően kezdték meg az antiretrovirális terápiát, amit a szokásos módon szakítottak meg ún. kezelési szünetekkel (a kezelési szünetekben az immunrendszer ugyanis új erőre kap). Két ilyen kezelési szünet után az ilyenkor szintén szokásos mérsékelt vírusszint emelkedés volt megfigyelhető. Aztán a beteg egy időre abbahagyta a terápiát, és a következő klinikai ellenőrzés során kiderült, hogy vírusszintje nem emelkedett. Vagyis a beteg szervezete olyan hatékony immunválaszt produkált, ami kordában tudta tartani a fertőzést. A vírusszint ezután még évekig alacsony maradt antiretrovirális kezelés nélkül, és csak azután emelkedett újból mérhető szintre! Ez volt az első klinikai megfigyelés, ami azt mutatta, hogy létezhet hatékony immunválasz a HIV ellen. Az eset rámutatott, hogy a fertőzés korai szakaszában a T sejtes immunválasz megfelelően erős ahhoz, hogy a vírusszámot a mérési határ alá szorítsa. A megfigyelést egy majomkísérlettel is sikerült igazolni: primer fertőzést követően beiktatott kezelési szünet után a T sejtes immunválasz sikeresen megfékezte, és visszaszorította a SIV vírus szaporodását [61]. A fertőzés hosszú távú természetes kontrollját azóta sokan leírták az “elit kontroller” HIV fertőzöttek esetében, akiknél a szabad vírusszám tartósan nagyon alacsony (50 kópia/ml alatti) [62]. A termékfejlesztés irányát az ekkor megfogalmazott kérdés határozta meg: hogyan lehetne olyan HIV-specifikus T sejtes immunválaszt generálni, ami hatékonyan pusztítja a HIV-vel fertőzött sejteket, és ezzel a tünetmentes fázisban megfékezi a betegség
előrehaladását?
Mivel
a
T
sejtek
kórokozó-specifikussá
érését
antigénbemutató sejtek irányítják, ezért HIV antigének DC-kbe juttatásával lehetne megoldani a feladatot. A kifejlesztett DermaVir termék lényegében a természetes immunválasz biztonságos utánzása, az alábbi módon. A hatóanyag pDNS, ami a biztonsági módosítások mellett a lehető legtöbb HIV antigént kódolja, hogy minél hatékonyabb (széles specifitású) T sejt választ tudjon kiváltani. A pDNS DC-k általi felvételét és az antigén expressziót egy szintetikus patogén-szerű nanorészecske formuláció segíti [63]. A nanorészecskék DC-khez irányítása pedig egy szintén saját fejlesztésű technológiával történik: a DermaPrep kezelési eljárással a nanorészecske oldat a bőrben lévő DC populációhoz, az LC-khez juttatható. A DermaVir kezelés hatásmechanizmusát a 7. ábrán mutatom be röviden. 19
NYIROKCSOMÓ
7. ábra. A DermaVir kezelés hatásmechanizmusának áttekintése. A bőr előkészítése a során a nanomedicina penetrációját akadályozó felső elhalt sejtrétegeket (stratum corneum) kell eltávolítani dörzsöléssel. Ugyanez a lépés aktiválja, és a kezelt területre vonzza az LC-ket enyhe bőrpír kíséretében. Ezután zsebet formáló, szélein leragasztható 80 cm2-es tapasz(oka)t helyezünk a bőrre, és az így képződő “tartályba” juttatjuk a nanorészecskéket tartalmazó oldatot. Az odasereglő aktivált LC-k felveszik a mannozilált felszínű, patogént imitáló nanorészecskéket és a nyirokcsomóba vándorolnak, ahol az időközben a pDNS-ről termelődő fehérje antigéneket feldolgozzák. A feldolgozott antigénekből származó epitópokat ezután éretlen T sejteknek mutatják be (priming), amit az immár HIV specifikus CD4+ és CD8+ T sejtek proliferációja-, és a szervezetben való szétterjedése és követ. A kezelés hatására termelődött T sejtek (effektorok és nagy proliferációs kapacitású memória sejtek) a HIV-vel fertőzött sejteket pusztítják.
A DermaVir kezelés fő lépései megegyeznek a kórokozók elleni T sejtes immunválasz természetes lefolyásával: a kezelést végző személy a bőr felső elszarusodott rétegét dörzsöléssel távolítja el. Ezzel megszünteti a fizikai akadályt, ami a nanomedicina vizes oldatának felszívódását akadályozná, valamint ez a “veszély-jelzés” odavonzza és aktiválja az epidermisz antigénbemutató sejtjeit. A felületre ezután egy 80 cm2-es, szélein leragasztható tapasz kerül, ami a bőrfelületen tartja az ezután egy tű nélküli fecskendővel a tapasz alá juttatott nanomedicinát. A felszívódás során az LC-k találkoznak a mannozilált felszínű szintetikus nanorészecskékkel, és endocitózissal felveszik azokat, mintha kórokozók volnának. A nanorészecske “belsejében” lévő 20
pDNS-t a szintetikus burok megvédi az enzimatikus bontástól, így a pDNS-ről expresszálódhat a kódolt 15 antigén, majd megtörténhet az antigén bemutatás. (Az antigén bemutatás lehetséges útvonalait a disszertáció új eredményei alapján az “Eredmények megvitatása” c. fejezetben fejtem ki.) Eközben az LC-k a közeli nyirokcsomókba vándorolnak, ahol CD4+ T sejtek-, és CD8+ T sejtek érését stimulálják
a
pDNS-ről
származó
HIV-specifikus
epitópok
bemutatásával.
Végeredményül HIV-specifikus effektor sejtek és memória T sejtek termelődnek, amik képesek a HIV-vel fertőzött sejtek elpusztítására [64]. 3.5 A DermaVir pDNS alapú antigénje A DermaVir hatóanyaga, a pLWXu1 pDNS a széles specifitású T sejtes immunválasz kiváltása érdekében úgy lett tervezve, hogy a tizenöt HIV fehérje közül tizenhármat módosítás nélkül expresszáljon, valamint az IN és Nef fehérjék működésképtelen Nterminális részét is kódolja. Több biztonsági módosítás gátolja meg az integrációt, reverz transzkripciót és replikációt. A tizenhárom fehérje módosítás nélküli kódolása elméletileg azt is lehetővé teszi, hogy belőlük komplex vírusszerű részecskék (VLP+) képződjenek. Az eredeti HIV promóter (5’ LTR) biztosítja a pDNS által kódolt fehérjék expresszióját antigénbemutató sejtekben (lásd 3. ábra) [25]. A Nef fehérje működésének kiiktatása az immunogenitás növelésének előnyével is jár, mert a Nef az MHCI és MHCII molekulák downregulációjával akadályozza HIV epitópok megjelenését a sejtfelszínen a természetes fertőzés során, amivel meggátolja, hogy az immunrendszer megtalálja a fertőzött sejteket [41,42,65]. 3.6 Az antigén DC-be juttatása patogén-szerű szintetikus nanorészecskével Annak érdekében, hogy a pDNS hatékonyan jusson be a DC-kbe, és ott a kódolt antigéneket expresszálja, egy szintetikus nanorészecske formulációt fejlesztettünk ki. A polietilénimin-mannóz (PEIm) a pDNS-sel a vírusok mérettartományába eső 70-300 nm átmérőjű gömbszerű nanorészecskéket alkot, amit a DC-k a kórokozókhoz hasonlóan felvesznek és aktiválódnak [63,66,67]. Ebben belül helyezkedik el a pDNS, amit beburkol a mannozilált, pozitív töltésű polimer (8. ábra). A nanorészecske endocitózisa után a pDNS-t a polimer burok megvédi az enzimatikus bontástól, és lehetővé teszi, hogy a pDNS eljusson a sejtmagba és megtörténjen az antigének expressziója. A pDNS védelmének “finomhangolását” a nanorészecskét stabilizáló kötések száma határozza 21
meg a pDNS foszfátcsoport oxigénje és a PEIm másodlagos amin nitrogénje közt. A nanorészecske stabilitása tehát szorosan összefügg a pDNS antigén-expressziós hatékonyságával (biológiai aktivitásával), mert az endoszómában védenie kell a pDNSt, majd a sejtmag közelébe jutva “szétesnie” [66,68]. A szintetikus nanorészecskék használatának előnye tehát, hogy segíti a pDNS-be kódolt antigének DC-kbe jutását, expresszióját, és azután az endogén antigének bemutatási útvonalán haladhat az antigének feldolgozása. Továbbá a nanorészecskék terápiás alkalmazásával kiküszöbölhetjük az általánosan használt vírusvektorokkal szemben a többszöri alkalmazás miatt kialakuló rezisztenciát. pDNS
PEIm
8. ábra. A DermaVir szintetikus nanorészecske egyszerűsített modellje (keresztmetszet). pDNS: plazmid DNS, PEIm: polietilénimin-mannóz.
3.7 DermaPrep orvosi eszköz a nanomedicina bőrön át történő bejuttatására Az antigéneket pDNS-ben kódoljuk, a nanorészecske formuláció segít a pDNS DC célsejtekbe juttatásában és az antigének expressziójában ill. bemutatásában, végső soron a HIV-specifikus T sejtek termelésében. De hogyan kerül a DC-k közelébe a nanorészecske oldat? Ennek a lépésnek a megoldása a szintén saját fejlesztésű DermaPrep orvosi eszközzel lehetséges. Az eszköz alkalmazása magában foglal egy bőr előkészítő eljárást: egy durva szivaccsal eltávolításra kerül a bőr külső-, fizikai védelmet biztosító stratum corneum rétege, és ez veszély-jelzésként odavonzza és aktiválja az LC (DC) sejteket (7. ábra) [69,70]. A bőrre ragasztott féligáteresztő anyagból készült tapasz alá juttatott nanomedicina immár könnyen felszívódik, és az LC-k
kórokozók
után
kutatva
hatékonyan
fel
is
veszik
a
patogén-szerű
nanorészecskéket. A DermaPrep kezelés lényegében a természetes immunválasz folyamatait segíti elő, ugyanis az aktivált LC-k a veszély-jelzés hatására egy 900-1800 sejt/mm2 hálózatot hoznak létre közvetlenül a bőrfelszín alatt [71]. Vagyis körülbelül 8 22
millió LC-t állít szolgálatba a 80 cm2 felületen végzett kezelés. Miután pedig az LC-k felvették a DermaVir nanorészecskéit, a nyirokcsomóba vándorolnak, hogy a pDNSben kódolt antigénekre specifikus T sejtek termelését irányítsák. A DermaPrep eszköz tehát végső soron a nanomedicinát a bőrön át a nyirokcsomóba juttatja. A DermaPrep orvosi eszköz európai forgalmazási engedélyét (CE jelzés) 2009-ben szereztük meg. 3.8 Preklinikai és klinikai eredmények A DermaVir hatásmechanizmusának kísérletes igazolása a humán klinikai kísérletek előtt ex vivo kísérletekkel, majd előrehaladott állapotú SIV fertőzött rhesusmajmokban történt a fent ismertetett pDNS konstrukció SIV (és HIV) fehérjéket kódoló változatával [64,72]. Sikerült igazolni, hogy az ex vivo úton DC-kbe juttatott DermaVir-rel kezelt sejtek szubkután injektálását követően a pDNS-ben kódolt antigének expresszálódnak a nyirokcsomóban lévő DC-kben, és, hogy ezek a DC-k HIV-specifikus CD4+ Helper T sejtek, valamint CD8+ citotoxikus T sejtek termelődését indukálják [67]. Ezután a mérések in vivo ismétlése következett egér-, és majom modellben, a DermaVir-t DermaPrep-pel bőrön át bejuttatva. Az in vivo eredmények megerősítették az ex vivo mérések eredményét, ezzel alátámasztva a DermaPrep kezelési eljárás hatékonyságát [64]. A következő lépés a humán fázis I kísérletek előtt a tervezett humán kísérlethez hasonló méréssorozatok elvégzése volt krónikus SIV251 fertőzött rhesusmajmokban. Az antiretrovirális kezeléssel kombinált (cART) DermaVir kezelések növelték a SIVspecifikus T sejtek mennyiségét (még a késői stádiumú, AIDS-es majmokban is), lecsökkentették a vírusszámot, és jelentősen megfékezték a vírus replikációt a kezelés utáni időszakban is. Ennek eredményeképpen a kezelt állatok életideje 18 hétről 38 hétre növekedett a nem kezelt kontroll csoportéhoz képest [72]. Az első, embereken végzett klinikai kísérlet a budapesti Szent László Kórházban, 20052006 között zajlott [73,74]. Célja a DermaVir kezelés biztonságosságának, és immunogenitásának vizsgálata volt. Kilenc cART kezelés alatt álló HIV fertőzött beteget kezeltek DermaVirrel, egy alkalommal, három különböző dózissal: háromhárom beteg kapott 0,1 mg DNS-t tartalmazó DermaVir-t két DermaVir tapasszal bejuttatva, 0,4 mg pDNS-t tartalmazó DermaVir-t négy tapasszal, ill. 0,8 mg pDNS-t tartalmazó DermaVir-t nyolc tapasszal. Nemcsak a hatóanyag mennyisége különbözött tehát, hanem a célzott nyirokcsomók (ill. LC-k) száma is. A kezelés után 28 napon át figyelték az esetleges mellékhatások megjelenését, majd hosszú távon is ellenőrizték: 23
12, 24, 36 és 48 héttel a kezelést követően. A vizsgálat során egyetlen esetben sem tapasztaltak súlyosabb mellékhatást, a leggyakoribb (négy betegnél) enyhe bőrreakció volt, dózistól függetlenül. A hatásosság vizsgálata a következő eredményeket hozta: a cART terápiának köszönhető 50 kópia/ml alatti vírusszint változatlanul alacsony maradt a DermaVir adását követő 28 napban. A Gag, Tat és Rev antigénekre specifikus (IFNγát és IL2-t termelő) CD4+ és CD8+ effektor T sejtek száma megemelkedett, az alacsony dózisú csoportban 3-ból 2 kezeltben, és a középső dózisú csoport mindhárom tagjában. Ezenkívül a magas proliferációs kapacitású HIV-specifikus memória T sejtek száma is szignifikánsan emelkedett, és még egy évvel később is esetenként detektálható volt [73,74,75]. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a DermaVir biztonságos, és a középső dózisban már egyetlen DermaVir immunizálás is kiváltja az elvárt széles specifitású T sejtes immunválaszt. De a tartós hatás érdekében szükségesnek tűnik a DermaVir kezelés bizonyos időközönkénti ismétlése. Az USÁ-ban végzett fázis I/II klinikai kísérletben ezért már többszöri DermaVir kezelés hatását vizsgálták 24 cART kezelés alatt álló HIV fertőzött betegben [76]. A betegek egyik csoportja 0,2 mg, ill. 0,4 mg pDNS dózisú DermaVir-t kapott három alkalommal, a másik csoport 0,4 mg pDNS dózisú DermaVir-t hat alkalommal, a harmadik csoport pedig placebo-t. A kezelések nem okoztak súlyos mellékhatásokat, és ismét megemelkedett a HIV-specifikus effektor-, és memória T sejtek száma, a legjobban a 0,4 mg-mos dózissal kezelt csoportban. A következő, fázis II klinikai vizsgálat célja a DermaVir biztonságosságának mérése, valamint az immunogenitásának és antivirális hatásának mérése volt, ezúttal cART kezelést nem kapó betegekben [77]. 36 HIV-fertőzött egyént kezeltek a háromféle DermaVir dózis valamelyikével (0,2 mg, 0,4 mg vagy 0,8 mg pDNS/DermaVir), ill. placebo-val hat-hetenként, összesen négy alkalommal. A kezelt csoportokban előforduló mellékhatások nem különböztek a placebo csoportétól, csak egy betegnél fordult elő közepesen súlyos mellékhatás (a háromfokozatú skálán 2-es), de az ő kezelését sem kellett emiatt felfüggeszteni. A 0,4 mg-mos dózisú csoport megint jobb immunválaszt mutatott a többinél, és szintén ebben a csoportban a szabad vírusmennyiség 70%-kal csökkent a placebóhoz képest. Az eddigi klinikai vizsgálatok eredményei alapján tehát a DermaVir kezelés ismételt alkalmazása megfelelően biztonságos, és HIV specifikus T sejtes immunválaszt generál, valamint fékezi a HIV szaporodását. 24
A pLWXu1 pDNS-t tartalmazó DermaVir termékjelölt klinikai vizsgálatai tovább folytatódnak, és reményeink szerint a termék forgalomba hozatali engedélyével zárul a fejlesztés.
Ezzel
párhuzamosan
a
DermaVir
hatásmechanizmusának
további,
részletekbe menő jellemzésén is dolgozunk. A munka folyamatosan újabb kutatási kérdéseket vet fel, amik megválaszolása új fejlesztési irányt is kijelölhet. Így történt ez doktori munkám esetében is, aminek egy személyre szabható DermaVir terápia, és hozzá egy szubtípus optimalizált termékcsalád első termékjelöltjeinek elkészítése lett az eredménye. Lássuk, hogyan!
25
4. Célkitűzések A DermaVir HIV terápiás nanomedicina in vitro kísérletes jellemzését, és az antigén repertoár in silico jellemzését, valamint ezekhez vizsgálati módszerek fejlesztését tűztem ki célul. A DermaVir immunválasz kiváltó képességének in silico modellezési eredményei alapján ezután indokoltnak láttuk egy HIV szubtípus-optimalizált DermaVir termékcsalád kifejlesztését, és a termékcsaládon alapuló személyre szabott HIV immunterápia prototípusának kidolgozását. Fenti célok eléréséhez az alábbi részfeladatokat állapítottuk meg: I.
A klinikai tesztelés alatt álló DermaVir HIV terápiás nanomedicina kísérletes jellemzése a hatásmechanizmus egyes részleteinek megismerésére, ill. alátámasztására. (Eredmények a 6.1. alfejezetben.)
II.
Az előbbi célkitűzéshez in vitro vizsgálati módszerek fejlesztése, ill. optimalizálása és validálása a DermaVir komplex VLP+ termelésénekvalamint
biológiai
aktivitásának
(antigén
expressziós
potenciáljának)
mérésére. (Eredmények a 6.1.2. és 6.1.3. alfejezetekben.) III.
A DermaVir terápiás nanomedicina pDNS hatóanyaga által expresszált majdnem teljes proteom immunválasz kiváltó képességének (immunológiai potenciáljának) in silico modellezésére T sejt epitóp predikción alapuló módszer kidolgozása. (Eredmények a 6.2.1. alfejezetben.)
IV.
A
szubtípus-B
specifikus
HIV
szekvenciát
tartalmazó
DermaVir
immunológiai potenciáljának in silico modellezése, és a nanomedicina hatásosságának
in
silico
modellezése
nem-B
szubtípusú
HIV-vel
fertőzöttekben. (Eredmények a 6.2.2.-6.2.5. alfejezetekben.) V.
HIV-1 szubtípusokra immunológiailag optimalizált pDNS-ek tervezése, és ehhez a tervezést segítő eszköz elkészítése, ami a személyre szabható immunterápia megvalósítását is támogatja. (Eredmények a 6.3.1. és 6.3.2. alfejezetekben.)
VI.
A megtervezett pDNS-ek elkészítése, valamint az elkészített termékjelöltek in silico jellemzése. (Eredmények a 6.3.3. alfejezetben.)
VII.
Az új termékjelöltek in vitro jellemzése. (Eredmények a 6.3.4. alfejezetben.)
26
5. Anyagok és módszerek 5.1. Nanomedicina készítés 1 mg/ml koncentrációjú pDNS-t 6 térfogat egység 10%-os glükóz oldattal higítottunk, majd 13,6 mM koncentrációjú polietilénimin-mannóz (PEIm) oldatot adtunk az elegyhez. A nanorészecske képződés 20 perces, szobahőn (23 ± 2ºC) történő inkubálás alatt történt. 5.2. Western blot DMEM tápfolyadékban tartott 293T humán sejteket transzfektáltunk 10 µg pDNS-t tartalmazó DermaVirrel, nem transzfektált sejteket használva negatív kontrollként. A sejteket 24 órás, 37 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett történő inkubálás után lizáltuk, és szétosztott adagokban felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A lizált mintákat, vagy tisztított VLP+-t (lásd az 5.5. pontban) előre öntött 4-20% gradiens gélben (Bio-Rad) futtattuk, majd PVDF membránra (Bio-Rad) blottoltuk 1 órán át 300 mA-rel (omniPAGE Electroblotting System, Cleaver Scientific). A membránt 5% BSA-val blokkoltuk, és többszöri PBS mosást követően HIV+ humán szérumban (Boston Biomedica) inkubáltuk 1 órán át. Tween-20-at tartalmazó PBS mosási lépések után a membránt peroxidázzal konjugált anti-humán IgG-vel (Sigma-Aldrich) inkubáltuk, majd mostuk, végül az eredményt kolorimetriás eljárással (Amplified Opti-4CN kit, Bio-Rad) tettük láthatóvá. 5.3. Immunprecipitáció DMEM tápfolyadékban tartott 293T sejteket transzfektáltunk pLWXu1-gyel, és 24 órán át 37 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett inkubáltuk, majd radioaktívan jelöltük 400 microCi 35S-sel (Perkin Elmer NEG009H) és egy éjszakán át inkubáltuk. Pozitív kontrollként a pLW fertőzőképes vírust tartalmazó szülői pDNS-t, negatív kontrollként nem-transzfektált sejteket használtunk. A következő napon a sejteket lizáltuk és szétosztott adagokban felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A lizált minták precipitációját inaktivált
HIV+
humán
szérum
(Advanced
BioScience
Laboratories),
vagy
monoklonális Nef ellenanyag (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) hozzáadásával végeztük. Mosást követően a mintákat 12% SDS-PAGE gélben futtattuk.
27
5.4. Intracelluláris festés 293T sejteket transzfektáltunk 10 µg pLWXu1-gyel vagy a pozitív kontroll pLW pDNS-sel, és 48 órás inkubálás után monoklonális egér ellenanyagokkal (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program ill. Affinity BioReagents) jelöltük, majd EPICS XL-MCL áramlási citofluoriméterrel vizsgáltuk (Coulter). Minden mérést 50000 adatponttal végeztünk. 5.5. VLP+ termelés és tisztítás 293T sejteket transzfektáltunk DermaVirrel, majd 24 órával a transzfekció után leszívtuk a VLP+-t tartalmazó felülúszót. A felülúszót 10 ml 20%-os szukróz oldatra pipettáztuk és a VLP+-ket centrifugálással szűrtük át a szukróz oldaton (50000 g, 3 órás centrifugálás). A pelletet 1/20 térfogatarányú PBS (pH 7,4) oldatban szuszpendáltuk, és a tisztított VLP+-ket felhasználásig -80 °C-on tároltuk. 5.6. Transzmissziós elektronmikroszkópia 293T sejteket transzfektáltunk DermaVirrel, és 24 órával a transzfekció után a leszívtuk a felülúszót, a sejteket PBS-sel mostuk, majd 5% glutaraldehidet tartalmazó, 0.1 M cacodylate pufferben fixáltuk. A fixált sejteket Dr. Kovács Attila Lajos segítségével az ELTE Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszékén beágyaztuk, metszettük, és elektronmikroszkóppal (JEM100CX II) vizsgáltuk, az alábbiak szerint: a rögzített sejteket 0.1 M cacodylate pufferrel mostuk, majd 50 °C-os 1,5%-os agarra rétegeztük. A mintákat cacodylate OsO4 oldattal utó-fixáltuk, “en-block” festettük nem pufferelt 1% uranil-acetát oldattal, végül etanollal és propilén-oxiddal dehidratáltuk. A beágyazáshoz DPM-30-at tartalmazó TAAB kitet használtunk (TAAB Laboratories Equipment). Az ultravékony metszeteket lead-citráttal festettük. 5.7. Biológiai aktivitás mérés DMEM tápfolyadékban tartott 293T humán sejteket transzfektáltunk DermaVirrel. 24 órás, 37 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett történő inkubálás után a felülúszót leszívtuk, és HIV p24 antigén ELISÁ-val (Zeptometrix, Retrotek), a gyártó előírása szerint meghatároztuk a plazmid DNS által expresszált p24 koncentrációt. A biológiai aktivitást mérő módszerünket az európai gyógyszerengedélyezési hatóság (International
28
Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) ICHQ2(R1) ajánlása alapján végeztük [78]. A validálás célja az volt, hogy az ajánlásban javasolt paraméterek meghatározásával igazoljuk, módszerünk alkalmas a DermaVir biológiai aktivitásának (azaz antigén expressziós képességének) mennyiségi meghatározására. A validált biológiai aktivitást mérő módszer használatát az európai és amerikai gyógyszerengedélyezési hatóságok (EMA, FDA) írják elő. Minden esetben öt párhuzamossal végeztük a méréseket adatpontonként, valamint legalább két alkalommal ismételtük a mérést. 5.8. Statisztikai analízis Az eredmények szignifikanciájának meghatározása Student’s t-teszttel történt, és minden esetben megadtuk a P-értéket. 5.9. In silico T sejt epitóp repertoár analízis Az MHCI és MHCII T sejt epitóp predikciókat az “Immune Epitope Database” (IEDB) epitóp adatbázis felhasználásával végeztük [79]. Az MHCI epitóp predikciókhoz mesterséges neurális hálózaton (Artificial Neural Network, ANN) alapuló predikciós módszert-, míg MHCII epitóp predikciókhoz az úgynevezett Konszenzus módszert használtuk [80,81,82]. Csak a nagy affinitású MHCI epitópokat vizsgáltuk, melyek 50 nM-nál kisebb koncentrációjú fél-maximális gátlási koncentrációval jellemezhetők [83]. Az MHCI epitóp predikciós paraméterek az alábbiak voltak: humán MHCI forrás faj; összes, ill. kiválasztott MHCI allélek; peptid hossz: 9 aminosav; eredményhalmaz szűkítése: csak az IC50=50 nM alatti epitópok; ANN predikciós módszer. Az MHCII epitóp predikciókat a következő paraméterekkel végeztük: konszenzus predikciós módszer; összes, ill. kiválasztott MHCII allélek, eredményhalmaz szűkítése: 90 vagy 50 konszenzus százalékos rangsor (Consensus Percentile Rank) ill. magasabb értékkel rendelkező epitópok. 5.10. Filogenetikai analízis A Los Alamos HIV Database-ből származó szekvenciák Clustal-W illesztését követően (BioEdit 7.0.9.0) Neighbor-joining módszerrel Kimura két paraméteres korrekciós modelljét használva filogenetikai fákat generáltunk (MEGA 4.1) [84,85]. A fák topológiájának megbízhatóságát 1000 Bootstrap ismétléssel ellenőriztük [86]. 29
5.11. pDNS konstrukciók készítése 5.11.1. Szekvenciák A következő, szubtípus-optimalizált pDNS konstrukciókat készítettük el: pLWXu-AB, pLWXu-BC, pLWXu-C, pLWXu-BF. A felhasznált szekvenciák kétféle forrásból származtak: vírus RNS izolálást követő RT-PCR-rel HIV+ vérplazma mintákból amplifikáltuk (pLWXu-BC, pLWXu-C, pLWXu-BF pDNS-ek esetében), ill. a “Los Alamos HIV Database”-ben található HIV szekvenciák alapján tervezett gént szintetizáltattunk (CRF AB gag gén, génbanki szám: AF414006). 5.11.2. RNS kivonás Az RNS kivonást “QIAamp viral RNA Mini Kit”-tel (Qiagen) végeztük mintánként 140 µl vérplazmából, a gyártó előírása szerint. 5.11.3. Oligonukleotidok tervezése és szintézise Az oligonukleotidokat génbanki, szubtípus-azonos HIV izolátumok megfelelő génszakaszainak szekvenciái alapján terveztük OLIGO 4.0 szoftver segítségével. Az oligonukleotidokat az Invitrogen (RT-PCR primerek) ill. az Eurofins MWG Operon (szekvenáló primerek) állította elő. 5.11.4. RT-PCR A szubtípus optimalizáláshoz két HIV genomi szakaszt amplifikáltunk, melyek a (1.) gag és részleges pol ill. (2.) env-tat-rev-vpu géneket fedik le. A felhasznált primereket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az egy lépéses RT-PCR reakciókat a SuperScript III One-step RT-PCR System kittel (Invitrogen) végeztük, 50 µl reakcióelegyben, ami 25 µl 2x “reakció mix” puffert, 10 µl tisztított HIV RNS-t, mindkét oligonukleotidból 10 µM-t, 1U SuperScript III/Taq enzimet, 40U RNase-out enzimet, és nukleáz-mentes vizet tartalmazott. A PCR reakció paraméterei az alábbiak voltak: 60 °C 30 min, 30x(94 °C 15 s, 55-58 °C 30 s, 68 °C 3 min), 68 °C 5 min.
30
1. táblázat. A HIV RT-PCR reakciókhoz felhasznált primerek. Primer azonosító
Szekvencia
Termék
cDNA1
AGA GAC CCA GTA CAA GC
cDNS
Gag-F Gag-R Env-F Env-R
CTG GTA ACT AGA GAT CCC TCA GA TTG TTT ATA CTA GGT ATG GTG TGG CTC CAT GGC TTA GGA CAA TAT ATC TAT G CTA CTC CCT CTG CTG CTG GCT CAG CT
1. PCR termék 2. PCR termék
5.11.5. Agaróz gélelektroforézis 0,8%-os, 0,5 µg/ml etídium-bromiot tartalmazó agaróz gélt és 1xTAE puffert (Invitrogen) használtunk. Futtatási paraméterek: 100V, 45 perc ill. PCR termék tisztítása esetén 60V, 2 óra. A gélek értékeléséhez az ImageJ (NIH) szoftvert használtuk. 5.11.6. DNS tisztítás gélből A kívánt 2,3 kbp (gag gén) ill. 3 kbp (env-tat-rev-vpu gének) méretű RT-PCR terméknek megfelelő sávot, ill. az emésztett pDNS vektort (10, ill. 9,3 kbp) 0,8% agaróz gélben való futtatás után kivágtuk, majd “Genelute Gel Extraction Kit”-tel (Omega) tisztítottuk, a gyártó előírása szerint. A termékeket precipitáltuk 2,5x térfogat abszolút etanol és 1/10 térfogat 3M nátrium-acetát hozzáadásával. 1 órás -80 °C-os inkubálás után 70%-os jéghideg etanollal mostuk, majd szárítás után a pelletet 20 µl DNáz-mentes vízben visszaoldottuk. 5.11.7. Inzert és pDNS vektor előkészítése irányított ligáláshoz A tisztított RT-PCR termékeket (inzert) és a pLWXu1 plazmidot (vektor) restrikciós enzimes emésztéssel készítettük elő a ligáláshoz. A Gag poliprotein klónozásához a pLWXu1 pDNS-t és a megfelelő gag gént tartalmazó inzertet NarI és BstZ17I restrikciós enzimekkel (New England BioLabs) emésztettük a gyártó által biztosított 1x NEBuffer4 pufferben, egész éjszakán át 37 °C-on inkubálva. Az env-tat-rev-vpu gének klónozásához a pLWXu1 pDNS-t és a megfelelő inzertet NcoI és BlpI restrikciós enzimekkel (New England BioLabs) emésztettük a gyártó által biztosított NEBuffer4 pufferben egész éjszakán át 37 °C-on inkubálva. Az emésztett pLWXu1 pDNS vektort az előző bekezdésben leírt módon gélből kivágtuk és tisztítottuk. Az emésztett inzertet is precipitáltuk a fentiek szerint, és 20 µl DNáz-mentes vízben visszaoldottuk.
31
5.11.8. Hőkompetens E. coli kompetens sejt készítés E.coli Max efficiency Stbl2 kompetens sejt (Invitrogen) felhasználásával saját kompetenssejt- bankot (WCB) készítettünk az E. coli rázott lombikos fermentálását követő kétszeri CaCl2-os kezeléssel 0 °C-on (víz-jég elegyben). A kompetens sejtet felhasználásig (legfeljebb egy hétig) 0 °C-on tároltuk. 5.11.9. Ligálás és transzformálás A pDNS vektort és az inzertet 1:5 mólarányban adtuk a ligálási reakció elegyhez, 4 U T4 DNS ligáz (Invitrogen) és 5x ligáz puffer mellett 20 µl-es végtérfogatban, majd egész éjszakán át szobahőn inkubáltuk. 50 µl E. coli kompetens sejthez 5 µl-t ligálási elegyet adtunk, majd 30 perces jégen inkubálás, 45mp 42 °C-os vízfürdőben történő hősokkolás, és újabb 1 perces jégen történő inkubálás után 250 µl LB tápfolyadékot (Gibco) mértünk a sejtekhez. 90 percen át inkubáltuk 37 °C-on, 250 fordulat/min keverés mellett, ezután LB-agar-Kanamicin (50 µg/ml) táptalajra szélesztettük, és 30 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A transzformáns baktérium telepeket 4 °C-on tároltuk. 5.11.10.
pDNS termelés
A baktérium telepeket LB-Kanamicin (50 µg/ml) tápfolyadékba oltottuk, és 16 órán át 30 °C-on, 250 fordulat/min keverés mellett szelektíven növesztettük, majd izoláltuk az így felszaporított pDNS-t. A pDNS izolálást E.Z.N.A. Miniprep Kittel (BioBasics) végeztük a gyártó előírása (Plasmid Miniprep Protocol II) szerint, 1.5 ml baktérium szuszpenzió feldolgozásával, átlagosan 50 µg hozammal. A nagyobb mennyiségű pDNS termelést Qiagen Plasmid Maxi Kittel (QIAGEN) végeztük, a gyártó előírása szerint, 500 ml baktérium szuszpenzió feldolgozásával és átlagosan 500 µg hozammal. A pDNS oldat koncentrációját az oldat 260 nm-en mért abszorbanciájának spektrofotometriás meghatározása után a DNS koncentráció= A260× 50×(hígítási faktor) képlettel számoltuk ki, és a pDNS oldat koncentrációját 1 mg/ml-re hígítottuk. 5.11.11.
Az új pDNS-esek azonosságának ellenőrzése
A tisztított pDNS-eket a ligáláshoz használt enzimpárral (NarI-BstZ17I ill. NcoI-BlpI) emésztettük. A reakcióelegy 1 µg pDNS-t, 1x NEBuffer4 puffert, 1-1 U restrikciós enzimet és nukleáz-mentes vizet tartalmazott 20 µl végtérfogatban. 37 ºC-on 2 órás inkubáció után a mintákat 0,8%-os agaróz gélben futtattuk. A megfelelő méretű DNS fragmentumokat tartalmazó mintákat szekvenáltattuk (Eurofins MWG Operon). 32
6. Eredmények A DermaVir hatóanyagát egy fertőzőképes, B szubtípusú HIV izolátumból kiindulva fejlesztette ki korábban munkacsoportunk. [87,88,89]. A laboratóriumi dolgozóból izolált vírus klónozása után (pLW) többszörös mutációkkal módosították a szekvenciát, hogy a replikációt, ezen belül a reverz transzkripciót és az integrációt gátolják (9. ábra). A reverz transzkripció a 3’LTR deléciójával blokkolható, és ezzel megakadályozható a módosított DNS vad vírusból származó DNS-sel vagy retrotranszpozonokkal történő rekombinációja ill. komplementációja is. Továbbá a HIV IN fehérjéje a 3’LTR régióhoz kötődve irányítja a virális DNS integrációját. A deléció tehát egyszerre több folyamatot is akadályoz. Az IN fehérje génjének többszörös mutációja (stop kodonok és 7 bp deléció) további biztosíték az integráció gátlására [90]. Ezek a biztonsági módosítások két fehérjét tesznek működésképtelenné: Pol-RT és Nef. Mindemellett a többi fehérje módosítás nélküli kódolása lehetővé teszi, hogy a tizenöt HIV fehérje közül 13 természetes konformációban termelődjön, valamint ezek a fehérjék komplex vírusszerű részecskékké (VLP+) álljanak össze. A Nef mutációját a fehérje kódoló régiójával átfedésben lévő 3’ LTR deléciója okozza. De a Nef fehérje működésének kiiktatása az immunogenitás növelésének előnyével is járhat, mert a Nef az MHCI és MHCI downregulációjával akadályozza HIV epitópok megjelenését a sejtfelszínen a természetes fertőzés során, amivel meggátolja, hogy az immunrendszer megtalálja a fertőzött sejteket [41,42]. Az eredeti HIV promóter (5’ LTR) biztosítja a pDNS által kódolt fehérjék expresszióját antigénbemutató sejtekben (lásd 3. ábra) [24,25]. A HIV promóter használata új megközelítés a vakcinatervezésben, pedig a Tat jelenlétében erősebb transzkripciós aktivitása van, mint az adenovírus promóternek, vagy a CMV promóternek [25]. Ezenkívül talán az is előnyös lehet az immunválasz kiváltása szempontjából, hogy az eredeti promóterről a természetes vírusfehérje termeléshez hasonló mennyiségben, ill. sorrendben történik az átírás [91].
33
Csonka nef gén Del 12141-12309
Inaktivált integráz gén Q E F G I P stop stop stop stop stop deletion stop stop CAG GAA TTT GGA ATT CCC TAG CGG TAA CCA-------GAGTAGTAGAATCTATGAATAA-AGAATTAA 7541
12141
7600
Nef 12309
11689
Tat Rev 1
Gag 5’ LTR
Pol Prot RT
Env
RNáz IN
Nef 3’ LTR
12252
Inaktivált reverz transzkripció Del 12141-12611 12141
R 11978
U5 12611
NF-κB NF-ATc
SP1
TATA
9. ábra. A DermaVir nanomedicina aktív hatóanyagának, a pLWXu1 pDNS-nek a (linearizált) térképe. Biztonsági módosítások a pDNS HIV-specifikus részében: az integráz géntermék inaktiválására két stop kodon, valamint egy 7 bp hosszúságú deléció, mely további alternatív stop kodonokat eredményez a deléciótól downstream irányban az int génben. Hosszú deléció a nef gén 3’ végén, mely csonka Nef átírását eredményezi. 3’ LTR teljes deléció, ami megakadályozza a reverz transzkripciót. ■: biztonsági módosítások helye a pDNS-ben.
A pLWXu1 pDNS-ben kódolt fehérje repertoár jelenti a nanomedicina antigén készletét. A fehérjetermelés kísérletes jellemzése ezért a nanomedicina hatásának igazolása szempontjából, valamint biztonságossága szempontjából is nagyon fontos. Az alábbiakban az erre irányuló in vitro kísérletek eredményét mutatom be. Azután pedig az antigén-készlet immunválasz-kiváltó képességének (immunológiai potenciáljának) in silico modellezése következik. 6.1. A DermaVir in vitro jellemzése 6.1.1. A pLWXu1 pDNS által expresszált fehérje repertoár A pLWXu1 által expresszált fehérje (antigén) repertoár termelését Western blottal igazolta munkacsoportunk (10. ábra). A legnagyobb mennyiségben a gag gén termékei (p17-MA, p24-CA, p55-Gag poliprotein, amely tartalmazza a p7-NC fehérjét is), EnvSU (gp120) és az Env-TM (gp41) expresszálódtak. A Pol fehérjéket: p66-RT plusz 34
RNáz, ill. RT (p51) kisebb koncentrációban detektáltuk. A teljes hosszúságú IN és Nef fehérjék hiányát egyrészt szekvenálással, másrészt immunprecipitációval igazoltuk, amihez a pLW fertőzőképes HIV-et expresszáló pDNS-t használtuk pozitív kontrollként (ez a pDNS volt a pLWXu1 elkészítésének kiindulási alapja is; 10.B és C ábra) [92].
10. ábra. A pLWXu pDNS által expresszált fehérjék. A: western blot, HIV+ humán szérum használatával elsődleges ellenanyagként. M: fehérje marker, Neg: negatív kontroll, nem transzfektált sejtek; a-gp120 (Env-SU), b-p66 (RT plusz RNase), c-p55 (Gag poliprotein, benne p17, p24 és p7), d-p51 (Pol-RT), e-gp41 (Env-TM), f-p24 (Gag-CA), g-p17 (Gag-MA). B: A teljes hosszúságú Integráz termelődésének hiányát igazoló immunprecipitáció (csillaggal jelölve). Az extra csíkok a HIV+ szérum használata miatt megjelenő többi HIV specifikus fehérjének felelnek meg. C: A teljes hosszúságú Nef termelődésének hiányát igazoló immunprecipitáció
(csillaggal
jelölve).
D:
pLWXu1-gyel
transzfektált
293T
sejtek
intracelluláris festése FITC-cel jelölt p24, p55, gp41, gp120, Rev és Tat ellenanyagok használatával, áramlási citofluorimetriával mérve.
Mivel a többi szabályozó fehérjét sem western blottal, sem immunprecipitációval nem sikerült kimutatni, egy társ-munkacsoport intracelluláris festéssel igazolta azok termelődését. Ezzel sikerült bizonyítani a Rev (0,7% pLWXu1 esetében, ill. 1,3% a kontroll pLW esetében) ill. Tat (0,2% pLWXu1 esetében, ill. 0,5% a kontroll pLW esetében) fehérjék expresszióját (16.D ábra). Továbbá a p24, p55, gp41 és gp120 35
struktúrfehérjék termelődését a pLWXu1-ről ez a módszer is megerősítette. A Vif, Vpr és Vpu fehérjék létét közvetett módon, szekvenálással igazoltuk. Eredményeink a szekvenálási adatokkal együtt alátámasztják a pDNS-ben kódolt tizenhárom intakt fehérje termelődését, valamint a két módosított génről a natív fehérje termelődésének hiányát. 6.1.2. VLP+ termelés Mivel a pLWXu1 tizenhárom teljes hosszúságú HIV fehérjét expresszál, feltételeztük, hogy ezek komplex vírusszerű részecskévé (VLP+) képesek összeállni. A “+” index a komplex VLP megkülönböztetésére szolgál a hagyományos, általában egy ill. kétfajta struktúrfehérjéből spontán összeszerelődő VLP-ktől [93]. A pLWXu1 VLP+ termelésének igazolására humán 293T sejteket transzfektáltunk pLWXu1 pDNS-t tartalmazó nanomedicinával, és egy napos inkubálást követően transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk a mintákat (11.A ábra). A felvételeken jól láthatók a vad típusú HIV-re jellemző fenotípusú VLP+ részecskék, melyek az érett virionhoz hasonló mag (core) és burok (envelop) struktúrákat tartalmaznak. Megfigyeltük továbbá, hogy a VLP+ részecskék a sejten kívüli térbe, vagy intracitoplazmatikus vakuolumokba fűződnek le, és a virion érési fázisaihoz hasonló stádiumok különíthetők el [92]. A VLP+ összetett felépítését tisztított VLP+ felhasználásával végzett western blot is igazolta (11.B ábra).
36
11. ábra 11. ábra. A pLWXu1 pLWXu1-ről ről eexpresszált xpresszált fehérjékb fehérjékbő fehérjékből őll képz képződő ődőő komplex VLP+ részecskék. A: A: 24 órával a transzfekciót követ követő követően ően en fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács Attila Lajos készítette. Ezeken jól megfigyelhet megfigyelhetők ők k a VLP+ “érésének” fázisai: 1: lef lefűző lefűződés ű ődés (budding), 2: éretlen virion virion-szer szerűű,, 3: érett virion szerű, virion-szer szerűű (extracelluláris térben), 4: érett virion virionszerű szerű (intracitoplazmatikus vakuolumban). A méretskála minden esetben 100 nm nm--nek nek felel meg. B: Western blot pLWXu1 B: pLWXu1-gyel gyel transzfektált 293T sejtek felülúszójából, két HIV HIV+ + szérum elsődleges elsődleges első dleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLW vad típusú HIV HIV-et et kódoló pDNS. a-gp120 a gp120 (Env (Env-SU), SU), bb--p66 p66 (reverz transzkriptáz plusz RNase), cc-p55 p55 (Gag polyprotein, benne p17, p24 és p7), dd-p51 p51 (Pol (Pol-RT), RT), ee-gp41 gp41 (Env (Env-TM), TM), f-p31 f p31 (I (IN), N), gg-p27 p27 (Nef), hh-p24 p24 (Gag (GagCA), ii-p17 p17 (Gag (Gag-MA), MA), j-p7 j p7 (Gag-NC). (Gag NC).
6.1.3. Biológiai aktivitás A pLWXu1 pDNS alapú immunogén részletes jellemzését a gyógyszerengedélyezési hatóságok el előírása őírása írása alapján végeztük el. Biológiai termékek esetén az egyik 37
kulcsfontosságú paraméter a biológiai aktivitás, azaz esetünkben az antigén expressziós hatékonyság meghatározása. A biológiai aktivitás in vitro meghatározására egy olyan módszert optimalizáltunk és validáltunk, mely humán sejtvonal transzfekcióját követően a felülúszóba szekretált HIV specifikus fehérje, a p24 (Gag-CA) mennyiségi mérésével történik. A p24 fehérje a pLWXu1-ről a HIV virionhoz hasonló módon, csak a transzkripció késői szakaszában termelődik, és expressziójához a transzkripció korai szakaszában már átíródó szabályozó fehérjék szükségesek. Azt találtuk, hogy a transzfektált 293T sejtek felülúszójában található p24 mennyiségének 92.1%-a VLP+ részecskék alkotóelemeként van jelen (12. ábra). Ezért a p24 mennyiségi kimutatásával mérhető a pDNS konstrukcióban kódolt fehérjekészlet-, valamint a VLP+ expressziója is, azaz a pDNS biológiai aktivitása [92].
Biológiai aktivitás (p24 ng/ml)
90
*
80 70 60 50 40 30 20 10 0 Összes p24
Nem-VLP+ alkotó p24
12. ábra. A pLWXu1 biológiai aktivitása. A nanomedicinával transzfektált 293T sejtek által termelt összes p24 92,1%-a (62,7 ng/ml) VLP+ alkotóelemként van jelen a transzfektált sejtek felülúszójában (*P<0,001).
Az optimalizált (sztenderdizált) módszert az európai ICH Q2(R1) analitikai módszerek validálására vonatkozó irányelvek alapján validáltuk [78]. A validálás lényege, hogy igazoljuk a mérési módszer alkalmasságát a tervezett célra: a DermaVir vizsgálati anyag biológiai aktivitásának in vitro meghatározására a pDNS hatóanyag által expresszált p24 antigén mennyiségi mérésével. Ehhez a módszer következő paramétereit kell meghatározni: pontosság (accuracy), ismételhetőség (precision) (napok közti variabilitás: különböző napokon ugyanaz a személy végzi el a mérést; 38
minták közti variabilitás: két személy ugyanazon vizsgálati anyagból származó mintákkal végzi el a mérést; mintán belüli variabilitás: egy személy a vizsgálati anyag 5 különböző adagjából vett 3-3 mintával végzi el a mérést; mérést végző személyek közti variabilitás: azonos napon többen is elvégzik a mérést), specifikusság (a módszer specifikus a kívánt paraméter meghatározására, ebben az esetben a DermaVir formuláció p24 fehérje expresszióját képes mérni), mérési tartomány, kimutatási határ és a mennyiségi meghatározásra alkalmas alsó méréshatár, linearitás (koncentráció függés, vagyis annak igazolása, hogy a módszer a mérési tartományban kvantitatív). Minden mérés során 5 párhuzamossal dolgoztunk. A kívánt paramétereket meghatároztunk a pontosság kivételével, amelyben egy minősített sztenderd anyaghoz kell hasonlítani a mintánkat, csakhogy a DermaVir esetében nincs ilyen összehasonlító anyag. Eredményeink összefoglaló számadatai a következők: ismételhetőség (precision, n=49): [p24] = 45,19 ng/ml; CV% (variációs együttható, az adatcsoport átlagtól való eltérése osztva az átlaggal, százalékban kifejezve) = 14,12 %. Specifikusság: DermaVir[p24] = 43,80 ng/ml, CV (%) = 4,4 %. A formuláció nélküli csupasz pDNS esetében a kimutatási határ alatti eredményeket kaptunk. Szintén a méréshatár alatti eredményt kaptunk a p24 fehérjét expresszálni nem képes, aspecifikus pDNS-t tartalmazó nanorészecske formuláció esetében is. Ezzel igazoltuk, hogy módszerünk a DermaVir formuláció biológiai aktivitásának mérésére specifikus. Mérési tartomány: 0,5-0,8 µg pDNS-t tartalmazó DermaVir. Linearitás: a mérési tartományon belül 7 adatpontra határoztuk meg, ahol a 0,7 µg pDNS/DermaVir az alapértelmezett vizsgálati mennyiség, és ennek 70-120%-át jelenti a többi vizsgálati pont. A linearitás mérés adataira illesztett egyenes egyenlete: y=0,472x-22,636, korrelációs együtthatója R2=0,83, ez megfelel az R2>0,8 elfogadási kritériumnak. A kimutatási határ a vizsgálati anyag kalibrációs egyeneséből (linearitás adatok) és a negatív kontroll mintákra kapott p24 adatok átlagtól való eltérése alapján (SD%=0,78) 16,60 pg/ml-nek adódott. A validálás során minden előírt paramétert meghatároztunk, valamint igazoltuk a módszer alkalmasságát a DermaVir biológiai aktivitásának pontos, specifikus és reprodukálható mennyiségi meghatározására.
39
6.2. A nanomedicina immunológiai potenciáljának in silico modellezése 6.2.1. T sejt epitóp repertoár analízis kidolgozása Jelen fejezetben az in silico immunológiai potenciál modellezésének kidolgozásáról lesz szó: hogyan választottuk ki a T sejt epitóp predikciós módszereket és a felhasznált HIV szekvencia adatbázist. Ezt követően a kiválasztott módszerek megbízhatóságának tesztelését, és az általunk bevezetett kvantitatív és kvalitatív mérőszámok: az abszolút immunológiai potenciál (AIP) és a relatív immunológiai potenciál (RIP) definícióját és alkalmazását mutatom be a DermaVir nanomedicina pDNS hatóanyagának (pLWXu1) példáján. Ezután pedig a nanomedicina keresztvédő képességének modellezését különböző szubtípusú fertőzésekre. A személyre szabott immunterápia tervezése is ugyanezen T sejt predikciós módszeren alapul, ami alapján kifejlesztettünk egy immunológiai hasonlósági csoportokat megjelenítő új vakcinatervező “eszközt”, az immunológiai fá-t. Utóbbi lényegét és alkalmazását a 6.3. fejezetben részletezem. Mivel lényegében a T sejt epitópok határozzák meg egy T sejtes immunválaszt kiváltó terápiás vakcina immunológiai karakterét, célul tűztük ki a pLWXu1-ről termelődő fehérje antigének elméleti T sejt epitóp repertoárjának mennyiségi és minőségi vizsgálatát bioinformatikai eszközökkel. Az analízishez a legmegbízhatóbb módszerek és adatbázis kiválasztására törekedtünk. A legnagyobb és leghomogénebb adatokat tartalmazó T sejt epitóp adatbázist, az “Immune Epitope Database”-t (IEDB) használtuk. A legmegbízhatóbb in silico epitóp predikciós módszer kiválasztásához összehasonlítottuk a stabilizált mátrix módszer (Stabilized Matrix Method, SMM), az átlagos relatív kötésen alapuló módszer (Average Relative Binding, ARB) és a mesterséges neurális hálózat alapú módszer (Artificial Neural Network, ANN) megbízhatóságát. Ehhez a HXB2 HIV-1 referencia törzs struktúrfehérjéit választottuk (GenBank azonosító: NC_001802), és az IEDB adatbázis segítségével, mindhárom módszerrel prediktáltuk a nagy affinitású MHCI epitópokat, majd összehasonlítottuk azokat a “HIV Molecular Immunology” című kiadványban publikált, kísérletesen igazolt epitópokkal [83]. (A nagy affinitású epitópok definíció szerint 50 nM-nál kisebb fél-maximális gátlási koncentrációval – IC50 értékkel – jellemezhetők.) A megbízhatóságot a kísérletes adatokkal korrekt egyezést mutató (teljesen egyező-, plusz az egy as eltérést tartalmazó) epitópok százalékban kifejezett arányaként adtuk meg. Az ANN predikciós módszer bizonyult a legmegbízhatóbbnak, az Env-TM (gp41)
40
fehérje esetén például a prediktált epitópok 74,5%-a mutatott korrekt egyezést a kísérletesen igazolt, valós epitópokkal, míg az SMM 66,4%-os, az ARB módszer pedig 57,6%-os predikciós megbízhatóságot eredményezett. Ezután meghatároztuk az ANN MHCI predikciós módszer megbízhatóságát a HXB2 összes struktúrfehérjéjének felhasználásával, ugyanarra az allélre. A legalacsonyabb, 70,5%-os megbízhatósági értéket a gp120 eredményezte. Az MHCII epitóp predikciós “Konszenzus módszert” publikált validálási eredmények alapján választottuk [81]. A továbbiakban tehát az ANN predikciós módszerrel, valamint a Konszenzus módszerrel prediktáltuk az MHCI és MHCII epitópokat mind a tizenöt pLWXu1 által kódolt teljes vagy csonka fehérjére [92]. Ezen predikciók, és a szintén ebben a fejezetben részletezett keresztvédettség elemzések elvégzése után az addig általunk prediktált összes epitóp felhasználásával ismét elvégeztük az ANN ill. Konszenzus predikciós módszerek megbízhatóságának vizsgálatát, most már az összes prediktálható allélre (57 MHCI és 63 MHCII allélre). Eredményül 97,7%-os megbízhatóságot kaptunk az MHCI predikciós módszerre, és 95,1%-os megbízhatóságot az MHCII predikciós módszerre (2. Táblázat). Ez azt jelenti, hogy a kísérletesen igazolt 1480 CD8+ T sejt specifikus MHCI epitóp 97,7%-át prediktáltuk pontos-, vagy korrekt egyezéssel. Az MHCII esetében pedig a 615 kísérletesen igazolt CD4+ T sejt specifikus MHCII epitóp 95,1%át sikerült pontos-, ill. korrekt egyezéssel prediktálnunk. 2. táblázat. Az MHCI és MHCII epitóp predikciós módszerek megbízhatóságának vizsgálata kísérletesen igazolt epitópok segítségével.
MHCI
MHCII
1
1
Adathalmaz szűkítése (erős epitópok
<50 nM
<50
Kísérletesen igazolt epitópok száma*
1480
615
Predikcióval „megtalált„ epitópok száma
1436
585
97,7%
95,1%
Megengedett eltérések száma az epitópban
A predikció megbízhatósága *HIV Molecular Immunology 2008
Predikcióink alapján a pLWXu1 által expresszált fehérjék összesen 933 nagy affinitású (CD8+ T sejtek érését indukáló) MHCI epitópot, és 2330 nagy affinitású (CD4+ T sejtes választ eredményező) MHCII epitópot tartalmaznak az IEDB adatbázisban elérhető összes gyakori humán MHCI allélre (n=57) valamint MHCII allélre (n=63). 41
Fontos megjegyezni, hogy ez az epitóp repertoár nem egy adott egyénben kifejeződő epitópokat jelenti, hanem a teljes humán populációban elméletileg képződő HIV epitóp repertoárt. Vagyis ez az összegzett érték a pLWXu1 által expresszált fehérje készlet elméleti epitóp mennyiségét adja meg, amely T sejtes immunválasz kiváltását indukálhatja a humán populációban. 6.2.2. Abszolút immunológiai potenciál (AIP) Az immunológiai potenciál részletesebb jellemzéséhez bevezettük az abszolút immunológiai potenciál (AIP) fogalmát, ami megmutatja, hogyan oszlik meg az egyes fehérjékre specifikus epitópok mennyisége a teljes proteom immunológiai potenciálján belül. Az AIP tehát minden fehérjének megadja az antigén-specifikus T sejtes immunválaszban képviselt elméleti részarányát. Az AIP-t az összes gyakori IEDB adatbázisban található MHCI és MHCII allélre prediktáltuk. Az alább részletezett eredményeink rámutattak a strukturális és szabályozó fehérjék egyidejű kódolásának fontosságára a széles spektrumú immunválasz kiváltására tervezett HIV vakcinánkban. A pLWXu1 által expresszált fehérjék a következő MHCIAIP sorrendet eredményezték: Env-TM (22,9%), Pol-RT (15,0%) és Env-SU (13,7%), valamint Gag-CA (7,6%), Rev (6,6%), Vif (6,5%), Nef (5,6%), Vpu (4,2%), Gag-MA (3,8%), Pol-RNáz (3,8%), Pol-IN (3,4%), Vpr (3,0%), Pol-Proteáz (2,0%), Tat (1,3%) és Gag-NC (0,5%) (13. ábra). Az MHCII specifikus AIP pedig ezt a sorrendet mutatta: Env-SU > Tat > Pol-RT > Gag-NC > Vif > Gag-CA > Gag-MA > Env-TM > Rev > Nef > Vpr > Pol-IN > Pol-RNáz > Vpu > Pol-Proteáz. 17,3%-tól 2,0%-ig terjedő értékekkel. Eredményeink megmutatták, milyen jelentős különbségek vannak az egyes HIV fehérjék CD4+ ill. CD8+ T sejt indukáló képességében: az MHCI-AIP megoszlása a struktúrfehérjék és szabályozófehérjék között 72,8% ill. 27,2%, az MHCII-AIP esetében pedig 63,6% ill. 36,4%. A legmagasabb AIP részarányt a Gag-CA, Pol-RT, Vif, Rev, Env-SU és Env-TM fehérjék képviselik a pLWXu1 expresszált fehérjéi közül. A legnagyobb MHCI-AIP és MHCII-AIP értékek közti különbséget a Tat és Gag-NC fehérhéknél találtuk. Ezek nagyon kis aktivitást mutatnak a CD8+ T sejtek indukálására, viszont nagyon immunogénnek adódnak a CD4+ helper T sejtek indukálására nézve. (Az Env-SU ötször hosszabb fehérje, mégis a Tat szinte ugyanakkora részt tesz ki az MHCII-AIP-ből (15,0 %-ot), mint az Env-SU (17,3%).)
42
Gag
3.8
CA (231)
6.9 0.5
Pol
Prot. (99)
8.8
2.0
RT (440)
1.7
15.0
RNase (120)
MHCI
IN* (142) Vif (192)
11.0 3.8
2.7
3.4
3.0
6.5
Vpr (96)
MHCII 7.0
3.0
Tat (101)
3.0
1.3
Rev (115)
15.0
6.6
Vpu (81)
4.8
4.2
SU (508) TM (345)
6.4
7.6
NC (55)
Env
pLWXu1 által expresszált fehérjék
MA (132)
2.3
13.7
17.3
22.9
5.9
Nef* (150)
5.6
30 -30
20 -20
10 -10
4.4
0
10
20
30
Abszolút immunológiai potenciál (%)
13. ábra. A pLWXu1 pDNS gyógyszerhatóanyag által expresszált antigén készlet abszolút immunológiai potenciálja (AIP) MHCI és MHCII T sejt epitópok predikciója alapján. A pLWXu1 által expresszált proteom AIP értékének az egyes fehérjék közti megoszlása százalékban kifejezve: az MHCI molekulákon bemutatott epitópok által indukálható CD8+ specifikus T sejtek mennyisége (fekete oszlop), ill. az MHCII molekulákon bemutatott epitópokkal indukálható CD4+ T sejtek mennyisége (szürke oszlop). A csillaggal jelölt fehérjék nem teljes hosszúságúak; a fehérjék hossza (as) a fehérjék rövidítése mellett zárójelben szerepel.
6.2.3. A DermaVir (pLWXu1) immunológiai potenciálja egy személyben modellezve A teljes populációra vonatkoztatható eredmények után lássuk, milyen egy hipotetikus genetikai HLA háttérrel rendelkező személy AIP-je. A legáltalánosabb HLA alléleket is hordozó hipotetikus személy genotípusa legyen a következő: HLA A*0250, 3001; HLA B*0702, 0801 MHCI specifikus allélek, valamint DP A1*0103, 0201; DP B1*0201, 0501; DQ A1*0101, 0301; DQ B1*0501, 0302; DR A1*0101, 0101; DR B1*0101, 0102 MHCII specifikus allélek. (HLA C alléleket még nem tartalmazott az IEDB adatbázis a vizsgálat idején, ezért nem szerepelnek a hipotetikus genotípusban sem.) Az MHCI-AIP eredmények hasonló trendet mutattak egy személy esetén, mint a minden fenti, populáció szintű predikció esetében. Csak három fehérje: Pol-RNase, Vpu és a Pol-IN sorrendje módosult minimálisan (± 1 hellyel). Ezzel szemben az MHCIIAIP nagyobb eltéréseket eredményezett a modell személy esetében: az Env-TM > Tat > 43
Pol-RT > Gag-NC > Env-TM > Gag-CA > Vif > Rev > Gag-MA > Vpr > Nef > Pol-IN > Vpu > Pol-Proteáz > Pol-RNáz antigén sorrendet kaptuk [92]. Fontos megjegyezni, hogy az egyes MHC allélek hozzájárulása immunológiai potenciálhoz nagyon eltérő, pl. az MHCI epitópok mennyisége a különböző alléleken a következőképpen alakult: A*0250-re 78 epitóp, A*3001-re 43 epitóp, A*0702-re 9 epitóp míg az A*0801 allélre mindössze 1 nagy affinitású epitóp volt prediktálható. Tehát az immunválasz minősége függ az egyén genetikai MHC hátterétől. Ezek az eredmények jelzik, hogy módszerünk alkalmas lehet a DermaVirre (vagy más antigénre) specifikus T sejtes immunválasz modellezésére minden személyben, amennyiben a HLA genotípusa ismert. Ezért úgy gondoljuk a módszer segítséget nyújthat a klinikai kísérletek immunogenitási eredményeinek értelmezése során is, mivel prediktálhatjuk az immunogén immunválaszban mérhető hatását. 6.2.4. Relatív immunológiai potenciál (RIP) Az egyes fehérjék T sejtes választ kiváltó potenciáljának további jellemzése céljából definiáltuk a relatív immunológiai potenciált (RIP), amely az adott fehérjére specifikus adat. A RIP megmutatja, hogy egy fehérjében mennyi nagy affinitású epitóp található az elméletileg lehetséges epitópmennyiséghez képest, vagyis MHCI esetén a modell szerinti 9 as hosszúságú, MHCII esetén 15 as hosszúságú peptidek maximális számához képest. Mivel az MHCI epitópok hossza 9 as a predikcióinkban, az MHCII epitópok hossza pedig 15 as, ezért az elméleti epitóp szám MHCI esetén a fehérje hossza mínusz 8, MHCII esetén a fehérje hossza mínusz 14. A RIP értékét a prediktált nagy affinitású epitópok számának, valamint az elméleti epitópok számának hányadosa adja, százalékban kifejezve. A RIP tehát a fehérje epitópsűrűségének mérőszáma. Az MHCI-RIP az Env-TM struktúrfehérje (214/337; 63,5%) és a Rev szabályozó fehérje (62/107; 57,9%) esetében volt a legmagasabb, de a Gag-CA (71/124; 57,3%), és a Vpu is magas relatív immunológiai potenciált eredményezett (39/73; 53,4%) (14. ábra). A legalacsonyabb értékek a Tat (12/93; 12,9%) és Gag-NC fehérjékre (5/47; 10,6%) adódtak. A legnagyobb MHCII-RIP értékeket a Gag-NC (204/41; 497,6%) és Tat (349/87; 401,1%) fehérjékre számoltuk, ami összecseng ezen fehérjék magas MHCII-AIP részarányával. 100%-nál magasabb RIP értéket akkor kaphatunk, ha a vizsgált fehérje bizonyos mértékben “MHC-független” erős epitópokat is tartalmaz, vagyis ha egy 44
epitóp több MHCII allélre is prediktálható (ekkor az ismétlések is beleszámítandók az összes prediktált epitóp mennyiségbe). A Gag-CA szintén magas RIP-pel jellemezhető (160/118; 135,6%), ezután pedig a Rev > Vif > Vpr > Env-SU > Vpu > Nef > Gag-MA > Pol-RT > Pol-RNáz > Pol-IN > Pol-Proteáz > Env-TM fehérjék következnek a sorban [92]. Az MHCI-RIP és MHCII-RIP értékek tehát nagyban különböznek, ami szintén jelzi a sokféle fehérje antigént tartalmazó pLWXu1 pDNS alapú vakcina immunológiai
Gag Gag Pol
MA (231) (132) CA (132) (231) NC (55) Prot. (99) RT (440) RNase (120) IN* (142)
MHCI
MHCII
Vif (192) Vpr (96) Tat (101) Rev (115) Vpu (81)
Env
pLWXu1 által derived expresszált proteins fehérjék
potenciálját széles specifitású CD4+ és CD8+ T sejtes immunválasz kiváltására.
SU (508) TM (345) Nef* (150)
-600 600 600 -400 400 400 -200 200 200
0
200
400
600
Number ofElméletitheoretical és prediktált and predicted epitópok epitopes száma
14. ábra. A pLWXu1 pDNS gyógyszerhatóanyag által expresszált antigén készlet relatív immunológiai potenciálja (RIP) MHCI és MHCII T sejt epitópok predikciója alapján. A pLWXu1 expresszált antigén készletének RIP értéke, vagyis az egyes fehérjéken belüli epitóp sűrűség ábrázolása: az MHCI specifikus epitópok (fekete oszlop) aránya az adott fehérjében elméletileg lehetséges 9 as hosszú epitópok mennyiséghez képest (fehér oszlop), ill. az MHCII specifikus epitópok aránya az adott fehérjében elméletileg lehetséges 15 as hosszú epitópok mennyiséghez képest (fehér oszlop). A csillaggal jelölt fehérjék nem teljes hosszúságúak; a fehérjék hossza (as) a fehérjék rövidítése mellett zárójelben szerepel.
45
6.2.5. Nem-B szubtípusú fertőzés esetén a B-szubtípus alapú terápia hatékonyságának in silico modellezése A fent ismertetett in silico T sejt epitóp predikciós módszer segítségével modelleztük, hogy a B szubtípusra specifikus T sejtes immunválasz mennyire lehet hatékony nem Bszubtípusú HIV fertőzés esetén. Mivel az Afrikában (Szaharától délre) domináló C szubtípusú HIV a legjelentősebb járványokozó bolygónkon, részletes összehasonlításukat ezzel a szubtípussal mutatom be. Először egyetlen gyakori MHCI specifikus HLA allélre, részletesen vizsgáljuk meg a keresztvédettséget a közös epitópok számba vételével! A HLA A*0250 allélre vonatkozó eredményeinket a 3. táblázatban foglaltam össze. A nanomedicina által expresszált fehérjekészlet 104 nagy affinitású epitópja közül B szubtípusú (vagyis szubtípus-azonos) fertőzés esetén 93 teljesen megegyezik, vagyis a prediktált pLWXu1 epitópok 89%-a hatékony CD8+ T sejtes válasz indukálására lehet képes, amennyiben a kezelt beteg az elemzett B szubtípusú HIV-vel fertőzött (3.A táblázat). C szubtípusú fertőzés esetén azonban sokkal alacsonyabb a nanomedicinából származó epitópok, és a fertőzést okozó HIV-ből származó epitópok közti egyezés mértéke: mindössze 13 egyező epitópot találtunk, amik a Gag, Pol és Env poliproteinekre korlátozódtak (3.B táblázat). Ez mérsékelt keresztvédettségre utal, más szóval a B szubtípusú fehérjéket expresszáló vakcina alacsony hatékonyságát jelzi C szubtípusú HIV-vel fertőzött betegben. 3. táblázat. A B szubtípus specifikus pLWXu1 nanomedicina hatékonyságának modellezése C szubtípusú HIV-vel fertőzött betegben, T sejt epitóp predikcióval az MHCI specifikus HLA A*0250 allélre. A: Összefoglaló táblázat a nanomedicina hatékonyságára egy szubtípus-azonos (génbanki azonosító: NC_001802), valamint C szubtípusú (AB254141) fertőzés esetén. *A teljesen megegyező epitópok alapján számoltuk ki a keresztvédettség mértékét, melyet a pLWXu1 összes epitópjának százalékában adtuk meg. B: A megegyező epitópok eloszlása a proteomban. (Az epitóp szekvenciákat követő számok az epitóp fehérjén belüli pozícióját jelölik. Az egyező epitópokat +, az eltérőeket – szimbólum jelöli.)
A pLWXu1 epitópok száma A*0250 MHCI allélre 104 Keresztvédettség* (%)
A fertőzés szubtípusa B C egyező/Σ epitóp egyező/Σ epitóp 93/107 13/92 89
13
46
B
Tat
B szubtípus C szubtípus
Fehérje
pLWXu1
B szubtípus
16
15 / 16
5 / 20
9
8/9
GLLETSEGC
+
+
FLYQSTHLP 21-29
-
ILGQLQPSL
+
-
RLVNGSLAL 54-62
+
SLYNTVATL
+
+
LIWDDLRSL 62-70
+
TLYCVHQRI
+
-
RLRDLLLIV 77-85
+
TLNAWVKVV 151-159
+
-
LLLIVTRIV 81-89
+
ALSEGATPQ 174-182
+
+
LIVTRIVEL 83-91
+
DLNTMLNTV 183-191
+
+
LLGRRGWEA 91-99
+
AMQMLKETI 197-205
+
-
ALKYWWNLL 99-107
+
AEWDRVHPV 210-218
+
-
LLQYWSQEL 106-114
+
IILGLNKIV 266-274
+
+
4
3/4
ALVVAIIIA
+
VVAIIIAIV
+ +
Rev
pLWXu1
+
-
+
-
EMMTACQGV 345-353
+
-
IIAIVVWSI
VLAEAMSQV 362-370
+
-
ALAEMGVEM
-
AMSQVTNSA 366-374
+
-
37
32 / 37
Vpu
RMYSPTSIL 275-283 WMTETLLVQ 316-324
-
-
MLLGMLMIC 20-28
+
24
23 / 27
4 / 18
QMHEDIISL 103-111
+
ITLWQRPLV 59-67
+
+
KLTPLCVSL 121-129
+
LLTQIGCTL 145-153
+
-
TLTSCNTSV 192-200
+
ALVEICTEM 188-196
+
-
VITQACPKV 200-208
+
DVGDAYFSV 265-273
+
+
SLAEEEVVI 264-272
+
YQYMDDLYV 336-344
+
+
NLTDNVKTI 276-284
-
YMDDLYVGS 338-346
+
+
IIVQLNQSV 284-292
-
HLLRWGLTT 363-371
+
-
TLKQIASKL 341-349
+
ELHPDKWTV 388-396
+
-
QIINMWQEV 422-430
-
TVNDIQKLV 408-416
+
-
ALFLGFLGA 517-525
+
KLVGKLNWA 414-422
+
-
FLGAAGSTM 522-530
+
KLLRGTKAL 436-444
+
-
TMGAASMTL 529-537
+
LLRGTKALT 437-445
+
-
QLLSGIVQQ 543-551
+
ALTEVIPLT 443-451
+
-
LLSGIVQQQ 544-552
+
ELAENREIL 457-465
+
-
AIEAQQHLL 558-566
+
ILKEPVHGV 464-472
+
-
LLQLTVWGI 565-573
+
QLTEAVQKI 522-530
+
-
QLQARILAV 575-583
+
YQLEKEPIV 582-590
+
-
SLWNWFNIT 668-676
+
IVGAETFYV 589-597
+
-
NITNWLWYI 674-682
+
YLALQDSGL 638-646
+
-
WLWYIKIFI 678-686
-
ALQDSGLEV 640-648
+
-
YIKIFIMIV 681-689
-
IVTDSQYAL 650-658
+
-
FIMIVGGLV 685-693
+
Env (poliprotein)
SLFGNDPSS 491-499
LVNQIIEQL 672-680
+
-
MIVGGLVGL 687-695
+
YLAWVPAHK 687-695
+
-
GLRIVFAVL 694-702
+
HLEGKVILV 782-790
+
-
IVFAVLSIV 697-705
+
6
6/6
0/5
AVLSIVNRV 700-708
+
WQVMIVWQV 5-13
+
-
RLVNGSLAL 747-755
+
RIRTWKSLV 17-25
+
-
LIWDDLRSL 755-763
+
SLVKHHMYV 23-31
+
-
RLRDLLLIV 770-778
+
LVITTYWGL 64-72
+
-
LLLIVTRIV 774-782
+
ELADQLIHL 101-109
+
-
LIVTRIVEL 776-784
+
KIKPPLPSV 158-166
+
-
LLGRRGWEA 784-792
+
5
4/5
0/5
ALKYWWNLL 792-800
+
LLEELKNEA 22-30
+
-
LLQYWSQEL 799-807
+
WLHGLGQHI 38-46
+
-
SLLNATAIA 813-821
+
GLGQHIYET 41-49
+
-
AVAEGTDRV 821-829
+
AIIRILQQL 59-67
+
-
3
2/3
QLLFTHFRI 66-74
-
-
0
0
0
Nef
Vpr
Vif
Pol (poliprotein)
Gag (poliprotein)
Fehérje
LLRPMTYKA 75-83
-
GLEGLIHSQ 96-104
+
ILDLWIYHT 109-117
+
47
A pLWXu1 pDNS alapú nanomedicina hatékonyságának elemzését nem B-szubtípusú fertőzöttben ezután kiterjesztettük az összes prediktálható gyakori MHCI allélre (n=57), valamint MHCII allélre is (n=63). A CD8+ T sejtes immunválasz elméleti hatékonysága 58%-osnak adódott szubtípus-azonos pácienst feltételezve, míg a C szubtípusú fertőzöttben mindössze 26% volt a megegyező epitópok aránya a nanomedicinából származó epitópokkal (4. táblázat). Modellünkbe bevettünk egy harmadik elterjedt szubtípust is, az A szubtípust. Ennél szintén alacsony, 24%-os epitóp-egyezést találtunk a nanomedicinából származó MHCI epitópokkal. A CD4+ T sejtes immunválasz esetében szintén korlátozott mennyiségben találtunk egyező epitópokat: 47%-ot az egyező szubtípusú fertőzés esetén, 15%-ot a C szubtípusú fertőzés esetén, ill. 14%-ot A szubtípusú fertőzés esetén. Noha modellünkben csak egy-egy szubtípus-specifikus szekvenciát elemeztünk, eredményeink megerősítik a fenti, egyetlen allél vizsgálatával tett megállapításunkat, azaz a nanomedicina eltérő szubtípusú fertőzés esetén lényegesen kisebb hatékonyságú lehet. A természetes felülfertőződéshez hasonlít ez a megfigyelés, aminek során a HIV fertőzött beteg egy újabb HIV vírussal is fertőződik. A felülfertőzés vírusszint emelkedést okoz, mert az alacsony kereszt-reaktivitás miatt az addig hatékony immunválasz nem működik az új vírussal szemben [94,95].
4. táblázat. A B-szubtípus specifikus pLWXu1 nanomedicina hatékonyságának modellezése szubtípus-azonos (génbanki azonosító: NC_001802), C szubtípusú (AB254141) és A szubtípusú (AB253428) HIV-vel fertőzés esetén, T sejt epitóp predikcióval az összes prediktálható gyakori MHCI és MHCII allélre. A keresztvédettséget a pLWXu1 összes epitópjának százalékában adtuk meg. A fertőzés szubtípusa pLWXu1 epitópok száma 57 MHCI allélre 991
B
C
A
egyező/Σ epitóp
egyező/Σ epitóp
egyező/Σ epitóp
578/1164
257/1051
242/964
Keresztvédettség (%)
58
26
24
egyező/Σ epitóp
egyező/Σ epitóp
egyező/Σ epitóp
966/1636
297/2102
280/2261
47
15
14
epitópok száma 63 MHCII allélre 2046 Keresztvédettség (%)
Eredményeink azt sugallják, hogy a teljes HIV-fertőzött humán populáció számára akkor tudunk hatékony terápiás vakcinát (nanomedicinát) nyújtani, ha a vírus genetikai változatosságát, pontosabban a genetikai változatosságból származtatható immunválaszt 48
befolyásoló különbségeket is figyelembe véve szubtípus-optimalizált termékeket fejlesztünk. 6.3. Szubtípus-optimalzált pDNS konstrukciók tervezése és klónozása 6.3.1. A vakcinatervezést segítő új alkalmazás: az “immunológiai fa” Mivel a HIV genetikai változatossága (szubtípusok) a megfertőzött személy antigénfeldolgozásért felelős genetikai változatosságával (MHC vagy HLA genotípus) együtt határozza meg a kialakuló immunválasz minőségét, indokolt mindkét paramétert figyelembe venni az immunogén tervezés során. Ezért a hagyományos HIV diverzitás genetikai rokonsági viszonyainak vizsgálata helyett kidolgoztunk egy immunológiai hasonlóságokon alapuló vírus csoportosítást. Módszerünk fehérje aminosav sorrend helyett immunológiailag releváns T sejt epitópok alapján illeszti a szekvenciákat, és a Neighbor joining filogenetikai fa készítő algoritmussal analóg módon kapcsolja össze az epitópok alapján leghasonlóbb szekvenciákat, ill. szekvencia csoportokat [84]. Eredményül a hasonló immunválaszt kiváltani képes HIV szekvenciák csoportjait kapjuk. Lássunk egy példát a genetikai hasonlóság-alapú fa és az immunológiai fa információtartalma közti különbség bemutatására! Az elemzéshez egy jól izolált epidémia, az ausztrál járvány génbankban található összes teljes HIV szekvenciáját használtuk fel. A 15. ábrán a legkonzervatívabb HIV fehérje, a Pol poliprotein aminosav alapú illesztése után készített filogenetikai fa, és a gyakori MHCI allélekre prediktált CD4+ T sejt epitópok illesztése után készített immunológiai fa látható. Külcsoportnak három, főként a Távol-Keleten elterjedt CRF_AG izolátumot választottunk. A filogenetikai fán az elágazási pontokon a bootstrap értékek a megbízhatóságot jelző mérőszámok (1000 ismétléssel generált fa hány százalékában szerepel az adott elágazás). Az immunológiai fa elágazási pontjain a számok két izolátum, ill. izolátum-csoport közötti korrekt egyezést mutató epitópok (megegyező plusz egyetlen aminosavban különböző) számát adják meg. Tehát minél több a korrekt egyezést mutató epitóp, annál nagyobb az immunológiai, pontosabban immunválaszbeli hasonlóság két szekvencia között. Éppen ezért a közös ágon lévő szekvenciák jobb immunológiai
keresztreakciót
adhatnak
egymással,
mint
a
csoporton
kívüli
szekvenciákkal.
49
Filogenetikai fa
Immunológiai fa
15. ábra. Példa a filogenetikai fa és az immunológiai fa információtartalmának különbségére, ausztrál HIV izolátumok Pol poliproteinjének vizsgálatával. Filogenetikai fa: Clustal-W illesztés, Neighbor-Joining algoritmus, 1000 Bootstrap ismétlés. Immunológiai fa: prediktált MHCI epitópok sorozatának (epitom) illesztése; a számok a vonatkozó két taxon közti korrekt egyezést mutató (megegyező plusz egy as-ban eltérő) epitópok mennyiségét jelentik. 50
A CRF_AG külcsoport filogenetikailag jól elkülönül a szubtípus-B csoporttól, és az immunológiai fán is egy klasztert alkot, noha két B szubtípusú szekvencia immunológiailag kilóg a csoportból. Közülük az egyik éppen a pLWXu1 által expresszált Pol poliprotein, de ennek a nagyobb immunológiai távolságát az magyarázhatja, hogy a biztonsági módosítások miatt rövidebb fehérjét hasonlítottunk a többi teljes hosszúságú poliproteinhez. A fák topológiájában azonban több különbség is látható, például a filogenetikai fán bekeretezett három szekvencia filogenetikai távolsága lényegében elhanyagolható, míg az immunológiai fán a DQ676879 azonosítójú szekvencia távolabb helyezkedik el a filogenetikailag közelebbi DQ676877 és DQ676878-as szekvenciáktól, és több közös epitópot tartalmaz a DQ676880-as szekvenciával, mint az előbbiekkel. Ehhez hasonló különbségeket a két fa között több helyen is megfigyelhetünk még. Noha az eltérések viszonylag kismértékűek, mégis rávilágítanak arra, hogy a filogenetikai csoportok nem feltétlenül egyeznek a szekvenciák immunológiai csoportosítással előálló klasztereivel. Ugyanis az immunológiai fa az immunválaszt meghatározó epitópok szempontjából súlyozza a szekvenciák közti távolságokat, minőségileg más eredményt adva. Az immunológiai-, ill. filogenetikai fák összehasonlítását a többi HIV fehérjére is elvégeztük, és minden esetben az előző példához hasonló szintű minőségi különbségeket találtunk köztük. Az immunológiai fákat elkészítettük MHCI és MHCII allélekre is, amelyek minden fehérje esetén kongruensek voltak: a módszer azonos immunológiai hasonlósági viszonyokat eredményezett mind a CD8+ T sejtes immunválasz, mind a CD4+ T sejtes immunválasz szempontjából. Vizsgálataink alapján úgy véljük, hogy az immunológiai fa hatékony eszköz lehet az új vakcinajelöltek (immunogének) fejlesztéséhez. A továbbiakban az immunológiai fa alapján történő pDNS immunogén tervezést mutatom be a szubtípus-optimalizált új nanomedicina hatóanyagok példáján.
51
6.3.2. Szubtípus-optimalizált termékjelöltek immunológiai szempontú tervezése Az új nanomedicina termékjelöltek tervezése előtt kiválasztottuk a célzott járványokat. A leendő termékcsalád első tagjai az alábbi szubtípusokba ill. cirkuláló rekombináns formákhoz tartoznak: a legnagyobb járványokat okozó C szubtípus, a Kínában és a Távol-Keleten gyakori BC rekombináns forma (CRF_07 ill. CRF_08), a DélAmerikában jellemző BF rekombináns típusok (CRF_39 ill. CRF_40), és a KeletEurópában, főként Ukrajnában az utóbbi évtizedben gyorsan terjedő AB rekombináns szubtípus (5. táblázat) [96]. 5. táblázat. HIV-1 szubtípus-optimalizált pDNS konstrukciók, és a célzott járványok helye valamint mérete. Szubtípus / CRF C szubtípus CRF_BC (07 és 08) CRF_BF (12 és 39) CRF_AB (03)
Elterjedési terület Fertőzöttek száma* Afrika (Szaharától délre) 22,5 millió Kína 3,3 millió D-Amerika 1,6 millió K-Európa 10 000
pDNS név pLWXu-C pLWXu-BC pLWXu-BF pLWXu-AB
* A régió összes HIV fertőzöttjének száma, amin belül a megadott szubtípus, ill. CRF-ek dominálnak.
Ezt követően T sejtes immunválasz alapú immunológiai hasonlósági fákat készítettünk teljes HIV proteomokra a kiválasztott járványok izolátumainak felhasználásával. Célunk az volt, hogy az immunológiai fa csoportjaiba sorolható konstrukciókat tervezzünk. Ugyanakkor kulcsfontosságú feladat volt a konstrukciók biztonsági módosítása, a klinikai tesztelésre hatóságilag engedélyezett (pLWXu1) pDNS biztonsági profiljának megőrzésével. Ezért a pLWXu1 pDNS Pol poliprotein génjét (melynek 3’ végéhez közeli IN tartalmaz többszörös biztonsági módosításokat), valamint a Nef gén 3’ végén csonkított kódoló darabját változtatás nélkül megőriztük a szubtípus-optimalizált konstrukciókban. Vagyis az immunológiai optimalizálást a fent említett HIV-specifikus szekvenciákon kívül eső régiókra kellett korlátoznunk. A biztonsági és immunológiai optimalizálási szempontoknak megfelelő új pDNS szekvenciákat a 16. ábrán látható térképek szerint terveztük meg. A CRF-ek esetében természetesen az eredeti szubtípusok rekombinációs mintázatát is figyelembe vettük [97].
52
Tat Rev
Pol Gag
Prot RT RNáz IN
Env
pLWXu-BC
Nef
LTR
LTR
Tat Rev
Pol Gag
Prot RT RNáz IN
Env
pLWXu-C
Nef
LTR
LTR
Tat Rev
Gag
Pol Prot RT RNáz IN
Env
pLWXu-BF
Nef
LTR
LTR
Tat Rev
Pol Gag
Prot RT RNáz IN
Env
pLWXu-AB
Nef
LTR
LTR
Szubtípus- B:
; C:
; F: ; AB: ; biztonsági módosítások:
16. ábra. A négy új pDNS HIV-specifikus részének térképe. A szubtípus-B eredetű szekvenciák és a biztonsági módosítások a pLWXu1 pDNS-ből származnak.
Az immunológiai szekvencia optimalizálást a következőképpen valósítottuk meg: a pLWXu-AB termékjelölt esetében az immunológiai fa CRF_03 AB klaszteréből kiválasztott izolátum alapján terveztük a pDNS szekvenciát (16. ábra). Azon konstrukcióknál, amelyeket frissen izolált HIV törzsek klónozásával készítettünk (pLWXu-BC, pLWXu-BF és pLWXu-C), az immunológiai fát használtuk fel a megfelelő epidemiológiai egységek meghatározásához, majd a pDNS-ek készítéséhez. 6.3.3. Az új pDNS-ek elkészítése és a termékjelöltek in silico jellemzése Ezután elkészítettük az új pDNS termékjelölteket. A HIV-fertőzött betegek vérszérumából RNS izolálás után RT-PCR-rel amplifikáltuk a vírus örökítőanyagát. A pLWXu-AB
konstrukcióhoz
az
AB
rekombinánsra
optimalizált
DNS-t
szintetizáltattunk. A pLWXu1 “szülői” pDNS biztonsági módosításokat is tartalmazó részeit változtatás nélkül megtartottuk, míg a szubtípus-specifikus DNS szakaszokat a pLWXu1 DNS megfelelő szakaszai helyére illesztettük irányított klónozással. A restrikciós enzimes gyors ellenőrzést követően az új pDNS-eket megszekvenáltattuk. Az elkészített pDNS konstrukciók szekvenciáit felhasználva azt is ellenőriztük, hogy tényleg az immunológiai fa megfelelő csoportjába tartoznak-e. A 17. ábrán az 53
immunológiai szekvencia-optimalizálás célfehérjéi közül a két legjelentősebb poliprotein, a Gag és Env immunológiai fáit mutatjuk be, melyek a szubtípusok és CRF-ek csoportspecifikus referencia szekvenciákat is tartalmazó válogatásai. A szubtípus-optimalizált
szekvenciák
minden
esetben
a
megfelelő
(tervezett)
immunológiai klaszterbe sorolódtak.
Env poliprotein
Gag poliprotein
pLWXu-AB
AB A BF
A pLWXu-BF
BF
pLWXu-BF
pLWXu-AB pLWXu1 (B)
pLWXu-BC pLWXu1 (B)
B
B
pLWXu-C pLWXu-BC
pLWXu-C
C
C
17. ábra. Az immunológiai szekvencia-optimalizálás eredménye: az új pDNS immunogén jelöltek a tervezett immunológiai klaszterekbe tartoznak mind a Gag poliprotein-, mind pedig az Env poliprotein immunológiai fáján. (A termékjelölteket aláhúzással emeltük ki a fákon.)
A munkát az új termékjelöltek in silico jellemzésével folytattuk: a pDNS-ek által kódolt fehérjék immunológiai potenciálját modelleztük különböző szubtípusú és CRF-ű fertőzések esetén. Annak érdekében, hogy a modell reprezentatív legyen, minden gyakori HLA allélre elvégeztük a T sejt epitóp predikciót, amit az IEDB adatbázis tartalmaz (57 MHC I allél, 63 MHC II allél, 2010-es allélkészlet alapján). Ezáltal populációs
szintű
immunválaszokat
kaptunk,
amik
sosem
egyetlen
egyénre 54
specifikusak,
viszont
általánosan
jellemezhetik
a
nanomedicina-jelöltek
használhatóságát különböző szubtípusokba tartozó járványokban. Eredményeinket a 6. táblázatban rendszereztük. Vizsgálatunkat a következő szempontok szerint végeztük: Az A, B, C és F szubtípusok esetén a Los Alamos HIV Database teljes genom szekvenciáiból készítettünk egy-egy reprezentatív szekvencia gyűjteményt, 1 szekvencia / év / izolálás országa / szubtípus kiválasztással. Ez átlagosan 50 szekvenciát jelent szubtípusonként. A CRF-ek esetében minden teljes genom szekvenciát felhasználtunk az elemzéshez. A csoportokon belül a Los Alamos Database szerinti referencia szekvenciát választottuk ki összehasonlító szekvenciának (génbanki azonosítók: AB253428, NC_001802, AF286224, AF077336, AF193277, AY008716, EU735534). Ezután a megfelelő referencia szekvencia proteomja alapján prediktált T sejt epitóp készlettel hasonlítottuk össze a csoporton belüli összes proteom epitóp készletét, valamint az összes szubtípus-optimalizált pDNS által termelt fehérje repertoár epitóp-készletét. A referencia szekvencia összes prediktált MHC I ill. MHC II epitópjának számát adtuk meg 100%-nak. (Mivel ez a szám szekvenciánként eltérő lehet, a táblázat utolsó sorában megadtuk, hogy az adott összehasonlító szekvencia esetén 1% mennyi epitópot jelent.) Majd kiszámoltuk a csoportátlagokat (szubtípus ill. CRF csoportátlag), amely az egyező epitópok átlagos mennyisége egy csoporton belül. Ez az érték adja meg a szigorúan vett keresztvédettséget csoporton belül, noha a kizárólag nagy, ill. közepes affinitású epitópok vizsgálata miatt ezek a számok valószínűleg kissé alábecsült értékek. Ezenkívül a csoportátlag egy elvi maximumot, ill. viszonyítási értéket is kijelöl, hiszen a HIV szekvenciákkal a legerősebb keresztreaktivitást mutató új termékjelölteknél sem várunk a csoportátlagnál nagyobb számokat. Az 6. táblázatból kiolvashatjuk tehát, hogy a vizsgált szubtípusú ill. CRF-ű csoportba eső fertőzések esetén mely szubtípus-optimalizált pDNS konstrukciók nyújtanák a legjobb védelmet. Egy kivétellel a konstrukciók az azonos szubtípusú/CRFű fertőzéssel szemben adták a legmagasabb prediktált keresztvédettséget. A csoportspecifikus átlaggal összemérhető eredményeket kaptunk, vagyis a legjobb immunválaszt
adó
termékjelölt
megközelíti
a
csoporton
belüli
átlagos
keresztvédettséget. A CRF_BC fertőzési modellünkben a vizsgált HIV törzs nem az azonos CRF-ű termékjelölttel adta a legjobb immunválaszt, hanem a pLWXu1-gyel. Vagyis immunológiailag a pLWXu1 hatóanyagú nanomedicina közelebb áll a CRF_BC referencia izolátumhoz, mint a pLWXu_BC. Ez az eredmény megerősíti a szubtípus55
optimalizált termékekből álló termékcsalád hasznosságát, kiegészítve azzal a megállapítással, hogy a jövőben a leghatékonyabb nanomedicina kiválasztásához a fertőzést okozó vírustörzs szekvenciáját érdemes analizálni és megnézni, hogy ténylegesen melyik termékjelölttel adja a legjobb keresztvédettséget. Tehát a páciens fertőzést okozó HIV vírusának-, és a T sejt epitópjait meghatározó HLA genotípusának ismeretében személyre szabott in silico analízist végezhetünk, és személyre szabott ajánlást tehetünk a betegben legjobb hatékonyságot mutató immunogénre ill. immunterápiára. 6. táblázat. Az új nanomedicina termékjelöltek immunológiai hatásosságának modellezése különböző HIV fertőzések esetén. Az immunológiailag legközelebbi, vagyis a fertőzést okozó HIV törzzsel legtöbb közös epitópot tartalmazó termékjelölteket szürkével emeltük ki.
DermaVir pLWXu1 (B) pLWXu-AB pLWXu-BC pLWXu-C pLWXu-BF Szubtípus ill. CRF csoportátlag 1% epitóp egyezés mennyi epitópot jelent (MHC I/MHC II)
szubtípus (fertőzésé) CRF (fertőzésé) A B C F AB BC BF Szubtípus/CRF összehasonlító szekvenciával egyező MHC I/MHC II epitópok (%) 25/12 80/59 26/16 23/10 37/20 27/20 22/14 28/14 69/46 27/12 24/12 43/30 23/15 22/11 28/13 37/47 30/17 22/12 29/13 27/15 24/13 26/12 26/18 31/17 24/10 28/12 27/15 25/10 26/11 48/35 28/16 29/16 33/14 29/14 30/18 30/15 37/16 37/18 36/23 70/62 38/38 30/16 10/22 7/16
10/21 10/21 9/21 10/21 10/22
6.3.4. Az új szubtípus-optimalizált termékjelöltek in vitro tesztelése Az új termékjelöltek minőségének ellenőrzése során a klinikai DermaVirt használtuk referencia anyagként. Az új pDNS konstrukciók mindegyike a pLWXu1 pDNS HIVspecifikus részeinek cseréjével készült, az összes biztonsági módosítást változtatás nélkül megőrizve. Ezt szekvenálással ellenőriztük minden esetben. Ezért az új nanomedicina jelöltek esetén elegendő volt az antigén expressziót jellemezni a VLP+ termelés és a biológiai aktivitás in vitro mérésével. 6.3.4.1.
VLP+ termelés az új termékjelöltek által
Az új termékjelöltek VLP+ termelésének igazolására a pLWXu1-nél ismertetett módon a pDNS-ekkel transzfektált 293T sejteket transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltunk (18.A ábra). Minden új termékjelölt esetében jól láthatók a vad típusú HIVre jellemző fenotípusú VLP+ részecskék, melyek az érett virionhoz hasonló mag (core) 56
és burok (envelop) struktúrákat tartalmaznak, és a sejten kívüli térbe, valamint sejten belüli vakuolumokba fűződnek le. A VLP+ összetett felépítését tisztított VLP+ felhasználásával végzett western blottal is megerősítettük (18.B ábra). Ugyanezen módszerrel igazoltuk a pDNS-ekben kódolt fehérje repertoár VLP+-alkotó részének expresszióját. A pLWXu-BF és pLWXu-BC esetén a p17-nek megfelelő sáv nem látható, amit a felhasznált VLP+ minta alacsonyabb koncentrációja okozhat. (A p17 expresszióját egyértelműen igazolja a VLP+ termelődése, hiszen a VLP+ core részét a p17 fehérjék határolják, lásd 18.A ábra.)
57
A
pLWXu-AB
pLWXu-BC
pLWXu-C pLWXu-BF
B
18. ábra. Az új pDNS-ekről expresszált fehérjékből képződő komplex VLP+ részecskék. A: a VLP+ “érésének” különböző fázisai az új pDNS-ek esetében (intracelluláris- és extracelluláris lefűződés, éretlen virion-szerű fázis, érett virion-szerű fázis). A méretskála minden esetben 100 nm-nek felel meg. A fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács Attila Lajos készítette. B: Western blot pLWXu1-gyel transzfektált 293T sejtek felülúszójából, HIV+ szérum-keverék elsődleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLWXu1 “szülői” pDNS. a-gp120 (Env-SU), b-p66 (reverz transzkriptáz plusz RNáz), c-p55 (Gag poliprotein, benne p17, p24 és p7), d-p51 (Pol-RT), e-gp41 (Env-TM), f-p24 (Gag-CA), g-p17 (Gag-MA), h-p7 (Gag-NC). 58
6.3.4.2.
Az új termékjelöltek biológiai aktivitása
Az új termékjelöltek biológiai aktivitásának meghatározását a fentiekben ismertetett validált módszerrel végeztük el. Az új termékjelöltek biológiai aktivitását a pLWXu1 pDNS-t tartalmazó referencia anyag biológiai aktivitásának százalékában adtuk meg (19. ábra). Minden új termékjelölt legalább 80%-os biológiai aktivitást mutatott, ezzel megfelelt annak a minimum 70%-os elfogadási kritériumnak, aminek a klinikai termék stabilitás vizsgálatai során is teljesülni kell.
Relatív biológiai aktivitás (%)
120
*
100
80
60
40 pLWXu1
pLWXu-BF pLWXu-AB pLWXu-BC pLWXu-C
19. ábra. Az új pDNS-ek biológiai aktivitása, a pLWXu1 biológiai aktivitásának %-ában megadva. (pLWXu-BF: 82,0±8,5%; pLWXu-AB: 98,5±9,5%; pLWXu-BC: 103,0±10,0%; pLWXu-C: 93,1±2,2%; P>0,05).
6.3.5. A nanomedicina termékcsalád in vitro eredményeinek összefoglalása A DermaVir termékcsalád eddig elkészült termékjelöltjeinek in vitro kísérletes jellemzési eredményeit a 7. táblázatban foglaltuk össze. A pDNS-ek szekvenciája a tervekkel egyező volt. A szubtípus-optimalizált pDNS-ek esetében távolság-mátrix alapú vizsgálattal ellenőriztük a szubtípus-specifikus szakaszok genetikai távolságát. A vizsgált Gag ill. Env poliproteinek esetében a B szubtípusú pLWXu1 fehérjéitől való szekvencia eltérés megegyezett az szubtípusok közötti divergencia általános mértékével [3]. A pLWXu1 pDNS hatóanyagú DermaVir a kódolt fehérjéket expresszálta, valamint VLP+-t termelt, ahogyan a szubtípus-optimalizált új termékjelöltek is. Az új termékjelöltek biológiai aktivitása pedig összemérhető volt a referencia anyagként használt pLWXu1-ével. A pLWXu1 esetében a biztonsági módosítások miatt a teljes hosszúságú IN és Nef fehérjék termelődésének hiányát is igazolta munkacsoportunk.
59
7. táblázat. A nanomedicina termékcsalád kísérletes (in vitro) jellemzésének összefoglalása. Jellemzett tulajdonság (vizsgálati módszer)
pLWXu1 (B)
pLWXu-AB
pLWXu-BC
pLWXu-C
pLWXu-BF
Azonosság meghatározás és szekvencia alapú fehérje különbségek (Szekvenálás, távolság mtx.)
pDNS tervvel egyező
pDNS tervvel egyező Gag: 15%
pDNS tervvel egyező Env: 31%
pDNS tervvel egyező Gag: 20 % Env: 31%
DNS tervvel egyező Env: 26%
VLP+ termelés (TEM)
VLP+ kimutatható
VLP+ kimutatható
VLP+ kimutatható
VLP+ kimutatható
VLP+ kimutatható
Antigén termelés (Western Blot)
gp120 (Env-SU), p66 (RT+RNáz), p55 (Gag poliprot.), p51 (Pol-RT), gp41 (Env-TM), p24 (GagCA), p17 (Gag-MA) kimutatható
A várt fehérjék kimutathatók
A várt fehérjék kimutathatók, p17 csak Gag poliprotein alkotóként
A várt fehérjék kimutathatók
A várt fehérjék kimutathatók, p17 csak Gag poliprotein alkotóként
Relatív biológiai aktivitás (transzfekció, p24 ELISA)
100%
99%
103%
93%
82%
Antigén termelés (Intracelluláris festés, FACS)
p24, p55, gp41, gp120, Rev, Tat kimutatható
Nem mértük
Nem mértük
Nem mértük
Nem mértük
Biztonsági módosítások (Immunprecipitáció)
IN, Nef módosított fehérjék nem mutathatók ki
Nem mértük
Nem mértük
Nem mértük
Nem mértük
60
7. Eredmények megvitatása Az immunológiai szempontból szubtípus-optimalizált HIV immunterápia egy új lehetőség a HIV fertőzöttek kezelésére úgy, hogy a kezelt beteg vírusának és az immunválasz minőségét befolyásoló HLA típusának figyelembe vételével a neki leginkább megfelelő termék választható ki a szubtípus-optimalizált termékcsaládból. A termékcsalád első tagjait a DermaVir HIV Tapasz fázis II klinikai kísérleti fejlesztési fázisban járó nanomedicina alapján terveztük és készítettük. Ehhez felhasználtuk az eddig kifejlesztett technológiákat, hiszen az új termékjelöltekben csak az antigéneket kódoló pDNS-ek különböznek. A termékcsalád kifejlesztésének szükségességét támogató
in
silico
immunológiai
potenciál
predikciók
és
kereszt-védettségi
modellezések, valamint az immunogén tervezésére kifejlesztett módszereink egészítik ki az eddigi technológiákat. Miért, és hogyan érhetünk el eredményt ezzel a termékcsaláddal? A klinikai DermaVir termékjelölt in vitro jellemzésének új eredményei, a nanomedicina termékcsalád in silico és in vitro tesztelésének eddigi adatai, valamint a HIV/AIDS elleni vakcinafejlesztés tanulságai alapján tekintsük át a lehetséges válaszokat! A kutatók a természetes immunológiai kontrollal rendelkező HIV fertőzöttek (“elit kontrollerek”) tanulmányozásával próbálják megtalálni a legjobb antigént, egyelőre sikertelenül [98,99,100]. A HIV fertőzöttek szervezetében termelődnek ugyan vírus neutralizáló ellenanyagok, de ezeket eddig nem sikerült eredményesen felhasználni vakcina hatóanyagként. A legújabb vizsgálatok mutatnak rá az eredménytelenség okaira. A neutralizáló ellenanyag molekulák a HIV felszínén lévő Env glikoproteinek trimereihez kapcsolódnak. Úgy tűnik, hogy a hatékony neutralizálás feltétele a HIV esetében is a pl. influenza vírusnál sikeres antigén keresztkötés az ellenanyag által. Csakhogy a HIV felszínén kevés keresztköthető fehérje trimer található, egymástól távol. Ezért itt az ún. polireaktív ellenanyagok lehetnek hatékonyak, amik a trimeren belüli keresztkötést teszik lehetővé, ezzel stabilizálva az ellenanyag-antigén kötést [101]. Sajnos azonban még az ilyen polireaktív ellenanyagok is csak korlátosan működnek [102]. A HIV diverzitás, a vírusra ható immunszelekció és a vírus többféle védőmechanizmusa gördít leküzdhetetlennek tűnő akadályokat a megelőző vakcina kifejlesztése elé. A terápiás vakcinafejlesztés esetében is több antigén használata, és ezzel a minél szélesebb skálájú immunválasz kiváltása látszik célravezetőnek az egyedi antigének használata helyett [103]. 61
A HIV vakcinafejlesztés tehát a sok antigénes hatóanyagok fejlesztése irányába halad [104]. Ennek a feladatnak a megoldásában egyre inkább előtérbe kerül a bioinformatikai modellezés, mint a tervezés idő- és költséghatékonyságát növelő eszköz. Az in silico T sejt epitóp predikciót mi is felhasználtuk a doktori munka több lépéséhez: (1) a B-szubtípusú DermaVir pDNS-e (pLWXu1) által expresszált antigének immunológiai potenciáljának modellezéséhez; (2) a DermaVir hatékonyságának modellezéséhez vizsgálatával;
nem-B (3)
szubtípusú
fertőzöttek
szubtípus-optimalizált
esetében
DermaVir
a
keresztvédettség
termékcsalád
pDNS-einek
immunológiai alapú tervezéséhez; (4) az új termékjelöltek immunológiai potenciáljának (kereszt-reaktivitásának) modellezéséhez szubtípus-azonos ill. eltérő szubtípusú fertőzések esetén. A bioinformatikai modellezési munkához először kiválasztottunk egy in silico T sejt epitóp predikciós módszert mind a CD8+ T sejtekre specifikus MHCI-, mind pedig a CD8+ T sejtekre specifikus epitópok prediktálására. A módszerek megbízhatóságát kísérletesen igazolt epitópok adatbázisának segítségével határoztuk meg: a nagy ill. közepes affinitású T sejt epitópok prediktálásának megbízhatósága 97,1%-ot eredményezett MHCI epitópok esetén, míg 97,7%-ot MHCII epitópok predikciója esetén, vagyis a kísérletesen igazolt epitópok 97,1%-át, ill. 97,7%-át teljes- ill. korrekt egyezéssel (1 as eltérést megengedve) tudtuk prediktálni (2.táblázat). Ezzel az eljárással modelleztük azután a pLWXu1 pDNS-ben kódolt antigén készlet, vagyis a nanomedicina várható immunológiai hatását. Több, mint 100 eltérő HLA allélre prediktáltuk a nagy-, és közepes affinitású T sejt epitópokat. Eredményeink alapján a nanomedicina jelölt által expresszált 15 fehérjéből álló antigén repertoárja széles spektrumú CD4+ és CD8+ specifikus immunválasz kiváltására képes. Ez az irodalomban eddig közölt HIV vakcinajelöltek közül a legszélesebb HIV epitóp repertoárt jelenti [105,106]. Az abszolút immunológiai potenciál (AIP) és relatív immunológiai potenciál (RIP) analízisünk megerősítette mind a struktúrfehérjék, mind pedig a szabályozó fehérjék kódolásának fontosságát a T sejtes immunválaszt célzó nanomedicina pDNS-ében. A pLWXu1 pDNS által kódolt fehérje repertoár AIP értéke mennyiségileg prediktálja a hatóanyag által indukálható CD4+ és CD8+ specifikus immunválaszt. Ez alapján minden HIV fehérje szerepet játszik a CD4+ ill. CD8+ T sejtek különböző mértékű 62
aktiválásában, de csak az Env-SU, Pol-RT, Gag-CA Vif és Rev fehérjék aktiválják hatékonyan mindkettőt. A Tat és Gag-NC a CD4+ T sejt válasz kiváltására nagyon magas, míg a CD8+ T sejtes válasz kiváltására szerény potenciált mutatott. Klinikai kutatások eredményei is megerősítették, hogy a széles HIV epitóp repertoár felismerése fordítottan korrelál a vírus terheltséggel, noha a szerepet játszó fehérjék immunválasz szempontú sorrendje természetesen függ az egyén HLA hátterétől és érdekes módon a betegség stádiumától is [107,108]. A széles epitóp repertoárnak köszönhetően a T sejtek képesek felismerni és elpusztítani a HIV-vel fertőzött sejteket (a látensen fertőzöttek kivételével), de lehet, hogy a korai fehérjékre specifikus T sejtek (pl. Vif és Rev) szerepe is meghatározó a HIV replikáció visszaszorításában. A RIP mérőszámmal a fehérjén belüli nagy epitópok relatív sűrűségét adhatjuk meg, a fehérje elméleti (9, ill. 15 as hosszú) epitóp mennyiséghez képest. (Az elméleti epitóp mennyiség a protein hossz mínusz 8 az MHCI RIP predikció esetén, ill. protein hossz mínusz 14 az MHCII RIP esetén.) A RIP hasonlít egy már korábban bevezetett mérőszámhoz: a SIR (“size of immune repertoire”, immunológiai repertoár mérete) a fehérjében prediktált epitóp mennyiséget hasonlítja egy ugyanolyan mennyiségű elméleti nonamert tartalmazó, és hasonló aminosav eloszlású fehérjében várt epitóp mennyiséghez [109]. RIP analízisünk alapján a Gag és Env proteinek méltán szerepelnek sok fejlesztés alatt álló HIV vakcina antigénjeként, hiszen magas MHCI-, és MHCII RIP értékkel rendelkeznek. Szintén magas MHCI-RIP-et kaptunk a Rev és Vpu fehérjék esetében, és a Tat fehérje MHCII-RIP értéke is kiemelkedő volt, jelezvén a korai szabályozó fehérjék magas immunológiai potenciálját, ill. támogatva ezek HIV vakcina antigénként való felhasználását. Immunogén-tervezési koncepciónk némiképp hasonlít a mozaik vakcinatervezési módszerhez, melynek lényege, hogy az antigént mesterségesen dúsítják fel epitópgazdag szakaszokkal, in silico evolúciót modellezve [110]. A felhasznált valódi kórokozó szekvenciák egy csoportját in silico “rekombináltatják”, majd minden ciklus után meghatározott paraméterek figyelembevételével kiválogatják a legtöbb epitópot tartalmazó (átfedő epitópokat is tartalmazó) szekvenciákat, és az eredeti szekvencia csoport epitóp-szegény szekvenciáit ezekre cserélik. Bizonyos számú ciklus után végeredményül egy, a valóságban nem létező mozaik szekvenciát kapnak, amit aztán vakcina antigénként tesztelnek.
63
A DermaVir nanomedicinában az epitóp repertoár kiterjesztésének a sok fehérje kódolásán kívül egy másik módja is van: az egyszerű antigén expresszión kívül komplex vírus-szerű részecskék (VLP+) is termelődnek. A DermaVir kísérletes jellemzése során igazoltuk, hogy a pDNS-ben kódolt közel teljes proteomból komplex VLP+ részecskék is képződnek. Tehát természetes konformációban expresszálja a HIV antigéneket, ami a természetes HIV fertőzéssel egyező antigén feldolgozást és immunválasz kiváltását eredményezheti. Megjegyzendő, hogy a gyógyszerjelölt ezen potenciálját akár megelőző vakcina kifejlesztéséhez is fel lehetne használni, hiszen a natív térszerkezetű felszíni fehérjék nagy hatékonyságú, polireaktív neutralizáló ellenanyagok termelését is kiválthatnák [101]. Másrészt a VLP+ termelés a CD4+ helper T sejtek indukcióját is elősegíti, ami pedig a CD8+ T sejtek érését (priming-ot), valamint a hatékony immunválaszban kulcsszerepű memóriasejtek termelődését támogatja [45,46,47]. Kísérletesen kimutattuk a DermaVir által expresszált antigén készlet termelődését, valamint igazoltuk, hogy ezek a HIV fehérjék a vad típusú HIV-hez hasonló struktúrájú komplex VLP+ részecskékké állnak össze. A vírus érési fázisainak megfelelő struktúrájú VLP+-k kimutathatók, azonban ezek biztonságosak, és nem fertőzőképesek (utóbbi eredmény nem része a dolgozatnak [92]). A VLP+ intracelluláris-, és extracelluláris térbe egyaránt ürül, akárcsak a vad HIV virionja [111]. A DermaVir pDNS-éről termelődő antigének (fehérjék és VLP+) az antigénbemutató sejt általi feldolgozását követően kerülhetnek MHCI és MHCII molekulákra. A 20. ábrán foglaltuk össze a nanomedicina pDNS immunogénjének lehetséges antigén expressziós és antigén prezentációs útvonalait [92]. A pLWXu1 pDNS-ről expresszálódó antigén készlet mindkét antigén feldolgozási útvonalon képes immunválaszt
kiváltani:
az
endogén
antigén-bemutatási
út
a
pDNS-ről
az
antigénbemutató sejtben termelődő fehérjék feldolgozásával történik (20. ábra, “a” útvonal). Az expresszált fehérjékből spontán összeszerelődő VLP+ részecskék sejten belüli vezikulumokba és a sejten kívüli térbe is juthatnak. Mindkét esetben az exogén antigének feldolgozási útvonalán halad a folyamat, ami a VLP+-ből származó MHCII epitópok bemutatásával HIV-specifikus CD4+ helper T sejtes immunválasz kiváltását eredményezi (20. ábra “b” és “c”).
64
CD8+ T sejt válasz CD4+ T sejt válasz MHCI
MHCII
MHCII
a
b T
1
2
pDNS
3
c
(…)
Nem reprodukálódik: •Reverz transzkripció gátolt •Replikáció gátolt •Integráció gátolt
20. ábra. HIV-specifikus T sejtes immunválasz kiváltásának lehetséges útvonalai a DermaVir pDNS hatóanyagáról termelődő antigénekkel. A nanomedicinát felvevő antigénbemutató sejtben a pDNS-ről HIV fehérjék termelődnek: a) az intracelluláris fehérjék feldolgozásának útvonalán halad tovább a folyamat, ami MHC I molekulákon való epitópok bemutatását, ezzel HIV-specifikus CD8+ T sejtek indukcióját eredményezi. b) Az expresszált fehérjékből VLP+ részecskék képződnek, melyek sejten belüli vezikulumokba szekretálódnak, és az antigén feldolgozás során képződő epitópok MHC II molekulákon bemutatva HIV-specifikus CD4+ T sejtek képződését indukálják. c) VLP+ részecskék a sejten kívüli térbe is szekretálódhatnak, amik kis eséllyel egy újabb antigénbemutató sejtben az antigén bemutatás CD4+ T sejt választ eredményező útján haladhatnak. Mivel a VLP+ nem képes replikálódni, a folyamat az antigén feldolgozással véget ér.
Az összetett VLP-t expresszáló HIV vakcina ötlete egyébként nem egyedülálló, bár a szintén klinikai tesztelés alatt álló másik immunogén DNS csak a HIV fehérjék kb. 50%-át expresszálja, és az éretlen vírushoz hasonló morfológiájú VLP-t, valamint fehérje aggregátumokat termel [106,112]. A vakcina hatékonyságnak van még egy fontos paramétere a sokféle antigénen kívül: a DermaVir-ből származó epitópoknak a kezelt beteg HIV epitópjaival való egyezés mértéke, vagyis a kereszt-reaktivitás. Hiába generál ugyanis a DermaVir számos HIV epitópra specifikus CD4+ és CD8+ T sejteket, ha azok nem egyeznek a fertőzött személy vírusának epitópjaival. Mert nyilvánvalóan csak azok a T sejtek tudják elpusztítani a HIV-vel fertőzött sejteket, amik felismerik őket. Hogy képet kapjunk az epitóp egyezések mértékéről, in silico modelleztük a B-szubtípusú HIV fehérjéket 65
kódoló DermaVir epitópjainak kereszt-reakcióját egy szubtípus-azonos, egy C szubtípusú, és egy A szubtípusú izolátum esetén. A szubtípus-azonos izolátum esetén a CD8+ T sejt specifikus epitópok 58%-a és a CD4+ T sejt specifikus epitópok 47%-a egyezett meg teljesen a DermaVir epitópjaival. (Ez persze a legszigorúbb egyezés mellett adódó érték, a kereszt-reaktivitás megenged néhány aminosav eltérést, ezért a valódi keresztvédettséget valamivel erősebbnek várhatjuk.) Ehhez képest viszont a C-, ill. A szubtípusú fertőzés esetén csak az MHCI epitópok 26%-a ill. 24%-a, míg az MHCII epitópok 15%-a ill. 14%-a egyezett a DermaVir epitópjaival. A keresztreaktivitást megvizsgáltuk a többi szubtípusra is, valamint az egyes szubtípusok több izolátumára (az adatokat nem mutatjuk), és hasonló eredményt kaptunk: a nem-B szubtípusba tartozó izolátumokkal kevesebb keresztvédettséget biztosító egyező epitóp mutatható ki, mint a szubtípus-azonos izolátumokkal. Ezért indokoltnak láttuk a szubtípus-optimalizált termékcsalád kifejlesztését, hogy egyszer majd minden beteg optimális immunválaszt kiváltó DermaVir-t kaphasson. Az immunválasz szempontú termék optimalizáláshoz egy, a filogenetikai rokonsági viszonyokat tükröző fával analóg eszközt fejlesztettünk ki: az immunológiai fát, ami a hasonló epitóp-összetételű szekvenciákat jeleníti meg közös ágon. Információtartalma minőségileg tér el a filogenetikai fáétól, mert az immunválasz szempontjából legjobban hasonlító szekvenciákat helyezi egymáshoz legközelebb, ami nem feltétlenül egyezik a szekvencia alapú távolsággal. Gondoljunk csak az MHCI epitópok képződésének korábban említett statisztikájára: az antigén feldolgozás során csak minden 7. peptid tud a TAP molekulán bejutni az endoplazmatikus retikulumba, ahol az MHCI molekulák csak minden 200. epitópot kötnek meg [43,44]. Két szekvencia közti különbségek tehát nem jelennek meg az immunológiai fán, ha olyan szakaszon vannak, amikre nem prediktálható epitóp. Ugyanakkor többszörös súllyal számíthat akár egyetlen bázispár eltérés, amennyiben az érintett szakaszra több, átfedő epitóp prediktálható. Az immunológiai fa csoportjai alapján kiválasztottunk négy szubtípust, ill. rekombináns formát, majd ezekre optimalizált pDNS konstrukciókat terveztünk. Tulajdonképpen nem
is
szubtípust/rekombinánst
választottunk,
hanem
“immunológiai
szubtípust/rekombinánst”, de megfelelő elnevezés híján egyelőre a szekvencia-alapú csoportosítás nevezéktanát használjuk, némi képzavart kockáztatva ezzel. A pDNS-eket elkészítettük, és az új nanomedicina termékjelölteket in silico és in vitro teszteknek vetettük alá. Az in silico keresztvédettségi vizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy 66
az
új
termékjelöltek
a
szubtípusuknak/rekombináns
csoportjuknak
megfelelő
izolátumok esetében eredményezték a legjobb keresztvédettséget, kivéve egy esetet. Ebben az immunológiai távolságok eltértek a szubtípus-alapú csoportosítástól, mert a CRF-BC rekombinánssal való fertőzés modelljében nem a pLWXu-BC termékjelölttel adódott a legnagyobb keresztvédettség, hanem MHCI esetén a pLWXu-BF termékjelölttel, MHCII esetén pedig a B szubtípus-specifikus pLWXu1-gyel. Ez a példa is megerősíti az immunológiai alapú szekvencia csoportosítás létjogosultságát. A
kereszt-reaktivitás
vizsgálatát
akár
személyre
szabottan
is
megtehetjük
módszerünkkel: a páciens HIV szekvenciája és HLA genotípusa ismeretében a termékjelöltek közül kiválasztható az adott páciensnél legmagasabb keresztvédettséget biztosító nanomedicina. Ugyanígy prediktálhatjuk egy klinikai kísérletben résztvevő páciensek HLA genotípusa és vírus szekvenciája ismeretében a várható T sejtes immunválaszt, segítséget nyújtva az immunogenitási eredmények kiértékeléséhez, ill. értelmezéséhez. Az immunológiailag optimalizált szubtípus-specifikus termék-skála tovább bővíthető, elméletben akár a személyre szabott konstrukciókig. Valószínű azonban, hogy az új termékcsalád hatékonyságát vizsgáló majdani klinikai mérések alapján nagyobb immunológiai csoportokat lehet megállapítani, és elég lesz ezekre a csoportokra egyegy termékjelöltet készíteni. A HIV diverzitása miatti kereszt-reaktivitás más vakcinajelöltek esetén is elvárt tulajdonság, amit többféle megközelítéssel terveznek elérni a fejlesztők, például több szubtípusra specifikus konszenzus antigének alkalmazásával [113]. A mozaik vakcinák fejlesztésekor pedig konzervatív, ezáltal kereszt-reaktív epitópok kiválasztására törekszenek. Tegyük fel, hogy több mozaik fehérjét egyszerre használunk immunizálásra, pl. a Barouch és munkatársai által in vivo állatmodellben sikeresen tesztelt Gag, Pol és Env mozaik antigéneket [114]. Egy B szubtípusú fertőzési modellben (szekvencia génbanki azonosítója DQ487189, a beteg meghatározott HLA allélje, amit mi is vizsgáltunk: A*0201) 114 MHCI epitóp volt prediktálható a teljes HIV proteomra. Ha az előbbi mozaik antigéneket használnánk terápiás vakcinaként, mindössze 5 azonos (kereszt-reaktív) epitóp (4%) adódna. Ehhez képest a DermaVir (B) esetében 47 egyező epitóp (41%) indukálhatná a beteg HIV vírusát felismerő CD8+ T sejtek termelődését. Egy másik példában valamivel jobb arányt találtunk (szekvencia génbanki azonosítója DQ487189, a beteg HLA allélje: B*35:01): a beteg 84 epitópjából 67
25-öt fedett le a mozaik antigén készlet (30%), míg 40-et a DermaVir antigén készlete (48%). Ehhez képest egy C szubtípusú fertőzési modellben (szekvencia génbanki azonosítója AY463231, a beteg HLA allélje: A*68:02) a beteg 95 epitópjával a mozaik antigének kereszt-reaktivitása 26% volt (25 egyező epitóp), míg a DermaVir antigén készletével 37% (35 egyező epitóp). Ha a még jobb összehasonlíthatóság érdekében pl. csak a Gag antigént vizsgáljuk mindkét vakcinából, akkor a B szubtípusú fertőzési modellekben a vírus Gag fehérjéjére prediktált 15 epitópból csak egy egyezik meg a mozaik Gag epitópjaival, és 8 a DermaVir-ével, valamint a 16 vírus epitópból 6 a mozaik Gag epitópjaival és 10 a DermaVir-ével. A C szubtípusú vírus 12 Gag epitópja közül egyaránt 7-7 egyező epitópot eredményezett a mozaik-Gag és a DermaVir-Gag. Ez persze messze nem reprezentatív vizsgálat, de ezekben a véletlenszerűen kiválasztott példákban nem látszott hatékonyabbnak a szubtípustól függetlenül kereszt-reaktívnak tervezett mozaik antigén, mint a B szubtípusra specifikus DermaVir. A fertőzés vírusával azonos szubtípusú DermaVir viszont jobbnak adódott, mint a kereszt-reaktív mozaik
antigének,
megerősítve
a
szubtípus-optimalizált
termékcsaládtól
várt
optimálisabb hatékonyságot. Az elkészített új nanomedicina termékjelöltek in vitro jellemzését is elvégeztük, és minőségüket a klinikai DermaVir-éhez hasonlítottuk. Azt találtuk, hogy a termékjelöltek képesek a kódolt antigén repertoár expressziójára, valamint komplex VLP+ részecskék expressziójára is, és biológiai aktivitásuk hasonlóan erős, mint a referencia anyagként használt klinikai tesztelés alatt álló DermaVir-é. Az új termékjelöltek biztonsági módosításait a szülői pDNS-ként használt pLWXu1-ből vettük át változtatás nélkül, ezért az új nanomedicina jelölteknél ezen változtatások eredményét már nem kellett ellenőrizni. A szubtípus-optimalizált HIV terápiás nanomedicina termékcsalád első tagjai a pDNS hatóanyagok megfelelő mennyiségben és minőségben történő előállítása után lényegében készen állnak a klinikai tesztelésre. A termékcsalád hatékonyságára vonatkozó legfontosabb eredményeket a klinikai mérések szolgáltatják majd.
68
8. Összefoglalás Kísérletesen és in silico módszerekkel jellemeztük a jelenleg klinikai kísérleti fázisban lévő HIV-1 B-szubtípus specifikus DermaVir terápiás nanomedicina termékjelölt pDNS alapú immunogénjét. Továbbá új HIV-1 szubtípus-optimalizált immunterápiás nanomedicina termékjelölteket terveztünk a vírus diverzitás és a betegek HLA hátterének figyelembe vételével. A termékjelölteket elkészítettünk és teszteltünk. Munkánk
során
bioinformatikai-,
molekuláris-
és
sejtbiológiai
módszereket
használtunk, ill. fejlesztettünk. Kimutattuk, hogy a DermaVir képes a kódolt HIV antigének (tizenhárom teljes és két részleges antigén) expressziójára humán sejtekben, valamint igazoltuk, hogy ezek az antigének a vad típusú HIV-vel immunológiai szempontból megegyező komplex vírusszerű részecskékké (VLP+) állnak össze. A DermaVir immunogénje emellett biztonságos, mert nem képes integrálódni, replikálódni, ill. fertőző virionokat termelni. Az antigén expresszió és a VLP+ termelés kimutatására vizsgálati módszereket fejlesztettünk.
Az
európai
és
amerikai
gyógyszerengedélyezési
hatóságok
követelményeinek megfelelő validált biológiai aktivitást mérő módszert fejlesztettünk a termékjelölt antigén termelési potenciáljának mérésére. Eredményeink segítettek felvázolni a DermaVir hatásmechanizmusának részleteit a DermaVir-ből származó antigének MHCI és MHCII molekulákon történő antigénbemutatási folyamatában. A B szubtípusra specifikus DermaVir in silico vizsgálati eredményei, ill. a klinikai mérési eredmények alapján indokoltnak láttuk szubtípus-optimalizált terápiás vakcina termékjelöltek kifejlesztését. Prediktáltuk a DermaVir-B T sejt specifikus immunológiai potenciálját, és modelleztük a keresztvédő képességét nem-B szubtípusú fertőzések esetén. Azt találtuk, hogy a szubtípusok között csak mérsékelt keresztvédettség prediktálható
a
T
sejtes
immunválaszban,
ami
a
nanomedicina
terápiás
hatékonyságának csökkenését vonhatja maga után bizonyos betegpopulációkban. Ezen eredmények alapján kifejlesztettünk egy in silico immunogén tervezési eszközt. Az “immunológiai fa” a hasonló epitóp összetételű vírus szekvenciák csoportjaiból épül fel, amik minőségileg hasonló immunválaszt képesek kiváltani az adott kórokozó(k) ellen. Ezt az immunológiai szempontú szekvencia csoportosítást használtuk fel négy új pDNS alapú immunogén tervezésére, amik elsősorban a szubtípus-C, CRF-BC (rekombináns forma), CRF-BF és CRF-AB-vel fertőzött betegek kezelésére nyújthatnak 69
immunológiailag optimalizált megoldást. Ezután elkészítettük a pDNS konstrukciókat és belőlük a nanomedicina termékjelölteket, majd a szubtípus-B DermaVir vizsgálatára kifejlesztett módszereinkkel jellemeztük azokat. Minden nanomedicina termékjelölt antigén termelő képességét (fehérje repertoár, VLP+, biológiai aktivitás) igazoltuk, és a termékjelöltek minőségét a klinikai vizsgálati DermaVir-hez hasonlónak találtuk. Emellett in silico modelleztük az új termékjelöltek immunológiai potenciálját és keresztvédő képességét, ami a megegyező szubtípusú/CRF-ű fertőzések esetében volt a legjobb. Az új immunológiai fa használatát javasoljuk a legjobb kersztvédő képességű termékjelölt ill. (személyre szabott) immunterápia kiválasztására is minden beteg számára.
70
9. Summary We characterized both in vitro and in silico, the HIV-1 subtype-B specific immunogen (pDNA) of DermaVir therapeutic nanomedicine presently tested in Phase II clinical trials in HIV-infected individuals. We have further designed and characterized a HIV-1 subtype-optimized nanomedicine product portfolio taking in consideration of the genetic sequence variability of the patient’s HLA and HIV. During this work we employed and developed both bioinformatics, molecular- and cell-biological methods. We confirmed that DermaVir express fifteen HIV antigens in human cells that assemble to a complex VLP (VLP+), immunological authentic to the wild-type HIV. However, it is safe because it cannot integrate or reverse-transcribe new infectious virions. To characterize the antigen expression and VLP+ release we have developed analytical methods. To meet the FDA and EMA requirements we have developed a validated potency assay for DermaVir vaccine that characterized the biological activity of the product candidate. Our results provided explanation to the mechanism of action for DermaVir-derived antigen presentation on the MHCI and MHCII molecules. During the in silico and clinical analysis of DermaVir (subtype-B) we found the rationale for the development of subtype-optimized vaccine product candidates. We predicted its T cell specific immunological potential and modeled its cross-protection capacity in non-B subtype specific infections. We found only modest cross-protection of DermaVir with other subtype-specific infections of individual patients. This suggests a decreased immunogenicity of subtype-B specific DermaVir vaccine in non-B subtype of infections. Based on these results we developed an in silico tool for the rational design of immunogens. The “immunological tree” clusters sequences containing similar epitopes that determine the quality of immune responses against the certain antigen(s). This immunological aspect of sequence grouping were used for the design of four new pDNA immunogens targeting epidemics caused by subtype-C, CRF-BC (circulating recombinant form), CRF-BF and CRF-AB. We have cloned these pDNA constructs, prepared the nanomedicine product and characterized with our molecular- and cellbiological methods developed for DermaVir subtype B vaccine. Expression of the antigen repertoire and VLP+ were confirmed for all nanomedicines and quality of the new product candidates was similar as for the clinically tested DermaVir. Additionally, we modeled in silico the immunological potency and cross-protection capacity of the new DermaVir products and showed the highest cross-reactivity with the matching subtypes. We suggest the application of the novel “immunological tree” as a selection tool for the best matching product and personalized immunotherapy for each patient. 71
10. Publikációk Az értekezés alapját képező közlemények Somogyi E, Xu J, Gudics Á, Tóth J, Kovács AL, Lori F, Lisziewicz J. A plasmid DNA immunogen expressing fifteen protein antigens and complex virus-like particles (VLP+) mimicking naturally occurring HIV. Vaccine 2011;29(4):744–753.
(IF: 3,572)
Tőke ER, Lőrincz O, Somogyi E, Lisziewicz J. Rational development of a stable liquid formulation for nanomedicine products. International Journal of Pharmaceutics 2010;392(1-2):261-7.
(IF: 3,607)
Referált folyóiratban megjelent konferencia összefoglaló: Somogyi E, Gudics Á, Forni DD, Molnár L, Lori F, Lisziewicz J. Subtype-optimized DermaVir for personalized immunotherapy. Abstracts from AIDS Vaccine 2010. AIDS Research and human retroviruses 2010, 26(10): A-1-A-184.
(IF: 2,082)
A témában megjelent egyéb közlemények Lőrincz O, Tőke ER, Somogyi E, Horkay F, Chandran P, Douglas JF, Szebeni J, Lisziewicz
J.
Structure
and
biological
activity
of
pathogen-like
nanomedicines. Nanomedicine: NMB 2011. Nyomtatás alatt.
synthetic
(IF: 4,882)
Szabadalom: Csörgő SBZ, Garaczi E, Gruber L, Hamar P, Kemény L, Kökény G, Lisziewicz J, Lőrincz O, Molnár M, Mózes M, Ötvös L, Pandur J, Pintér I, Somogyi E, Szabó KÁ, Szollár L, Tőke ER. Immunogenic nanomedicine composition and preparation and uses thereof.
Pub.
No.:
WO/2010/125544,
International
Application
No.:
PCT/IB2010/051909, Publication Date: 04.11.2010, International Filing Date: 30.04.2010
72
11. Köszönetnyilvánítás Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Lisziewicz Juliannának, a Genetic Immunity Kft. vezérigazgatójának, hogy doktori munkám az ő irányítása alatt végezhettem. A szaktudáson kívül céltudatosságot, kitartást és problémamegoldó gondolkodást tanultam tőle. Hálás vagyok kollégáimnak a közös-, és előremutató munkáért. Köszönöm a bioinformatikus csoportnak: Molnár Leventének és Tóth Józsefnek a “rám szabott” szoftvereket, amik nélkül sok in silico eredményem csak hipotézis lehetne. A vegyész laborral mindig öröm volt a sok munka is, hálás vagyok nekik: Dr. Tőke Enikő, Lőrincz Orsolya, Lakatos Mónika. Köszönöm Szűcsné Pulinka Ildikónak és Földiné Horváth Erika technikusoknak a precíz és lelkiismeretes munkát, Gudics Ágnesnek a felejthetetlen MBT éveket, és a csapatmunkát. Hálával tartozom Dr. Davide de Forninak a klónozási feladatokban való részvételéért és szakmai segítségért, valamint Dr. Franco Lorinak a mindig hasznos szakmai kritikáiért. Köszönöm Dr. Kovács Attila Lajosnak az értékes elektronmikroszkópos felvételeket, Dr. Lisziewicz Zsoltnak pedig a jó hangulatú brainstorming-eket. A doktori munka elvégzéséhez az NKTH HIKC05 és DVCLIN01 pályázatok, valamint a Research Institute for Genetic and Human Therapy (RIGHT) nyújtott anyagi támogatást. Hálával gondolok családom minden tagjára, mert szerető támogatásuk nélkül most nem kerülhetne pont a disszertációm végére.
73
12.
Irodalomjegyzék
[1]UNAIDS World AIDS Day Report 2011, www.unaids.org [2]Webster TJ. Nanomedicine: what’s in a definition? International Journal of Nanomedicine 2006;1(2) 115–116. [3]Hemelaar J, Gouws E, Ghys PD, Osmanov S. Global and regional distribution of HIV-1 genetic subtypes and recombinants in 2004. AIDS. 2006 Oct 24;20(16):W13-23. [4]World Health Organization. Antiretroviral therapy of HIV infection in infants and children. Recommendations for a public health approach. 2006, Geneva. [5]Pantaleo G, Demarest JF, Schacker T, Vaccarezza M, Cohen OJ, Daucher M, Graziosi C, Schnittman SS, Quinn TC, Shaw GM, Perrin L, Tambussi G, Lazzarin A, Sekaly RP, Soudeyns H, Corey L, Fauci AS. The qualitative nature of the primary immune response to HIV infection is a prognosticator of disease progression independent of the initial level of plasma viremia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997;94(1):254-8. [6]Wyand MS, Manson K, Montefiori DC, Lifson JD, Johnson RP, Desrosiers RC. Protection by live, attenuated simian immunodeficiency virus against heterologous challenge. Journal of Virology 1999;73(10):8356-63. [7]Gundlach BR, Lewis MG, Sopper S, Schnell T, Sodroski J, Stahl-Hennig C, Uberla K. Evidence for recombination of live, attenuated immunodeficiency virus vaccine with challenge virus to a more virulent strain. Journal of Virology 2000;74(8):3537-42. [8]Paovonen J, Naud P, Salmeron J, Wheeler CM, Chow SN, Apter D, Kitchener H, Teixeira JC, Skinner SR, Jaisamrarn U, Limson G, Romanowski B, Aoki FY, Schwarz TF, Poppe WA, Bosch FX, Harper DM, Huh W, Hardt K, Zahaf T, Descamps D, Struyf F, Dubin G, Lehtinen M; HPV PATRICIA Study Group. Efficacy of human papillomavirus (HPV)-16/18 AS04-adjuvanted vaccine against cervical infection and precancer caused by oncogenic HPV types (PATRICIA): final analysis of a double-blind, randomised study in young women. Lancet 2009;374(9686):301-14. [9]Villa LL, Perez G, Kjaer SK, Paavonen J, Lehtinen M, Munoz N, et al. Quadrivalent vaccine against human papillomavirus to prevent high-grade cervical lesions. New England Journal of Medicine 2007;356(19):1915-27. [10]Hildesheim A, Herrero R, Wacholder S, Rodriguez AC, Solomon D, Bratti MC, Schiller JT, Gonzalez P, Dubin G, Porras C, Jimenez SE, Lowy DR; Costa Rican HPV Vaccine Trial Group. Effect of human papillomavirus 16/18 L1 viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection - A randomized trial. Jama-Journal of the American Medical Association 2007;298(7):743-53. [11]Broliden K, Hinkula J, Devito C, Kiama P, Kimani J, Trabbatoni D, Bwayo JJ, Clerici M, Plummer F, Kaul R.Functional HIV-1 specific IgA antibodies in HIV-1 exposed, persistently IgG seronegative female sex workers. Immunology Letters 2001;79(1-2):29-36.
74
[12]Rowland-Jones S, Sutton J, Ariyoshi K, Dong T, Gotch F, McAdam S, et al. HIVspecific cytoptoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nature Medicine 1995;1(1):59-64. [13]Rosenberg ES, LaRosa L, Flynn T, Robbins G, Walker BD. Characterization of HIV-1-specific T-helper cells in acute and chronic infection. Immunology Letters 1999;66(1-3):89-93. [14]Lisziewicz J, Rosenberg E, Lieberman J, Jessen H, Lopalco L, Siliciano R, Walker B, Lori F. Control of HIV despite the discontinuation of antiretroviral therapy. New England Journal of Medicine 1999;340(21):1683-4. [15]Johnson RP, Glickman RL, Yang JQ, Kaur A, Dion JT, Mulligan MJ, Desrosiers RC. Induction of vigorous cytotoxic T-lymphocyte responses by live attenuated simian immunodeficiency virus. Journal of Virology 1997;71(10):7711-8. [16]Busch M, Abel K, Li J, Piatak M, Lifson JD, Miller CJ. Efficacy of a SHIV 89.6 proviral DNA vaccine against mucosal SIVmac239 challenge. Vaccine 2005;23(31):4036-47. [17]McElrath MJ, De Rosa SC, Moodie Z, Dubey S, Kierstead L, Janes H, Defawe OD, Carter DK, Hural J, Akondy R, Buchbinder SP, Robertson MN, Mehrotra DV, Self SG, Corey L, Shiver JW, Casimiro DR; Step Study Protocol Team. HIV-1 vaccineinduced immunity in the test-of-concept Step Study: a case-cohort analysis. Lancet 2008;372(9653):1894-905. [18]Weboldal: http://idshowcase.lshtm.ac.uk/ [19]Gelderblom HR, Ozel M, Pauli G. Morphogenesis and morphology of HIV. Structure-function relations. Arch Virol 1989;106:1-13. [20]Sagar M. J Infect Dis. 2010 Oct 15;202 Suppl 2:S289-96. [21]Fanales-Belasio E, Raimondo M, Suligoi B, Buttò S. Ann Ist Super Sanita. 2010;46(1):5-14. [22]Bera S, Pandey KK, Vora AC, Grandgenett DP. Molecular interactions between HIV-1 integrase and the two viral DNA ends within the synaptic complex that mediates concerted integration. Journal of Molecular Biology 2009;389(1):183–98. [23]McDougal JS, Mawle A, Cort SP, Nicholson JK, Cross GD, Scheppler-Campbell JA, Hicks D, Sligh J. Cellular tropism of the human retrovirus HTLV-III/LAV. I. Role of T cell activation and expression of the T4 antigen. J Immunol. 1985 Nov;135(5):3151-62. [24]Siliciano RF, Greene WC. HIV Latency. Cold Spring Harb Perspect Med. 2011 Sep;1(1):a007096. [25]Karn, J. Tackling Tat. J. Mol. Biol. 1999;293, 235-254. [26]Feinberg MB, Baltimore D, Frankel AD.The role of Tat in the human immunodeficiency virus life cycle indicates a primary effect on transcriptional elongation. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88: 4045-4049. [27]Hope TJ. The ins and outs of HIV Rev. Arch Biochem Biophys. 1999;15;365(2):186-91. [28]Ganser-Pornillos BK, Yeager M, Sundquist WI. The structural biology of HIV assembly. Curr Opin Struct Biol. 2008 Apr;18(2):203-17. [29]Weboldal: http://www.uptodate.com/contents/immunology-of-hiv-1-infection 75
[30]Moore JP. Coreceptors: implications for HIV pathogenesis and therapy. Science. 1997;276(5309):51. [31]Grouard G, Clark EA. Role of dendritic and follicular dendritic cells in HIV infection and pathogenesis. Curr Opin Immunol. 1997;9(4):563. [32]Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Middel J, Cornelissen IL, Nottet HS, KewalRamani VN, Littman DR, Figdor CG, van Kooyk Y.DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 2000 Mar 3;100(5):587-97. [33]Kahn JO, Walker BD. Acute human immunodeficiency virus type 1 infection. N Engl J Med. 1998;339(1):33. [34]Pantaleo G, Fauci AS.Immunopathogenesis of HIV infection. Annu Rev Microbiol. 1996;50:825-54. [35]Brenchley JM, Price DA, Schacker TW, Asher TE, Silvestri G, Rao S, Kazzaz Z, Bornstein E, Lambotte O, Altmann D, Blazar BR, Rodriguez B, Teixeira-Johnson L, Landay A, Martin JN, Hecht FM, Picker LJ, Lederman MM, Deeks SG, Douek DC. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 2006;12(12):1365. [36]Hunt PW. Th17, gut, and HIV: therapeutic implications. Curr Opin HIV AIDS. 2010;5(2):189. [37]Cooper MA, Fehniger TA, Fuchs A, Colonna M, Caligiuri MA. NK cell and DC interactions. Trends Immunol. 2004 Jan;25(1):47-52. [38]Villadangos JA, Schnorrer P. Intrinsic and cooperative antigen-presenting functions of dendritic-cell subsets in vivo. Nat Rev Immunol. 2007 Jul;7(7):543-55. [39]Bachmann MF, Lutz MB, Layton GT, Harris SJ, Fehr T, Rescigno M, RicciardiCastagnoli P. Dendritic cells process exogenous viral proteins and virus-like particles for class I presentation to CD8+ cytotoxic T lymphocytes. Eur J Immunol. 1996;26(11):2595. [40]Sabado RL, Babcock E, Kavanagh DG, Tjomsland V, Walker BD, Lifson JD, Bhardwaj N, Larsson M. Pathways utilized by dendritic cells for binding, uptake, processing and presentation of antigens derived from HIV-1. Eur J Immunol. 2007 Jul;37(7):1752-63. [41]Schwartz O, Marechal V, LeGall S, Lemonnier F, Heard JM. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. Nature Medicine 1996;2(3):338–42. [42]Stumptner-Cuvelette P, Morchoisne S, Dugast M, Le Gall S, Raposo G, Schwartz O, Benaroch P. HIV-1 Nef impairs MHCclass II antigen presentation and surface expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001;98(21):12144–9. [43]Uebel S, Kraas W, Kienle S, Wiesmuller KH, Jung G, Tampe R. Recognition principle of the TAP transporter disclosed by combinatorial peptide libraries. Proc Natl Acad Sci U S A 1997 94:8976–81. [44]Yewdell JW, Bennink JR. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annu Rev Immunol. 1999;17:51–88.
76
[45]Janssen EM, Lemmens EE, Wolfe T, Christen U, von Herrath MG, Schoenberger SP. CD4(+) T cells are required for secondary expansion and memory in CD8(+) T lymphocytes. Nature 2003;421(6925):852-6. [46]Letvin NL, Walker BD. Immunopathogenesis and immunotherapy in AIDS virus infections. Nat Med. 2003 Jul;9(7):861-6. [47]Wherry EJ, Ahmed R. Memory CD8 T-cell differentiation during viral infection. J Virol. 2004 Jun;78(11):5535-45. [48]Poignard P, Sabbe R, Picchio GR, Wang M, Gulizia RJ, Katinger H, Parren PW, Mosier DE, Burton DR. Neutralizing antibodies have limited effects on the control of established HIV-1 infection in vivo. Immunity. 1999 Apr;10(4):431-8. [49]Richman DD, Wrin T, Little SJ, Petropoulos CJ. Rapid evolution of the neutralizing antibody response to HIV type 1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 1;100(7):4144-9. [50]Pelak K, Goldstein DB, Walley NM, Fellay J, Ge D, Shianna KV, Gumbs C, Gao X, Maia JM, Cronin KD, Hussain SK, Carrington M, Michael NL, Weintrob AC, Infectious Disease Clinical Research Program HIV Working Group, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology (CHAVI). Host determinants of HIV-1 control in African Americans. J Infect Dis. 2010;201(8):1141. [51]Scorza Smeraldi R, Fabio G, Lazzarin A, Eisera N, Uberti Foppa C, Moroni M, Zanussi C. HLA-associated susceptibility to AIDS: HLA B35 is a major risk factor for Italian HIV-infected intravenous drug addicts. Hum Immunol. 1988;22(2):73 [52]De Leys R, Vanderborght B, Van den Haesevelde M, Heyndrickx L, Van Geel A, Wauters C, Bernaerts R, Saman E, Nijs P, Willems B. Isolation and partial characterization of an unusual human immunodeficiency retrovirus from two persons of west-central African origin. J Virol 1990;64(3):1207-16. [53]Keele BF, Van Heuverswyn F, Li Y, Bailes E, Takehisa J, Santiago ML, BibolletRuche F, Chen Y, Wain LV, Liegeois F, Loul S, Ngole EM, Bienvenue Y, Delaporte E, Brookfield JF, Sharp PM, Shaw GM, Peeters M, Hahn BH. Chimpanzee reservoirs of pandemic and nonpandemic HIV-1. Science. 2006 Jul 28;313(5786):523-6. [54]Taylor BS, Sobieszczyk ME, McCutchan FE, Hammer SM. The Challenge of HIV1 Subtype Diversity. N Engl J Med 2008; 358:1590-1602. [55]Korber B, Muldoon M, Theiler J, Gao F, Gupta R, Lapedes A, Hahn BH, Wolinsky S, Bhattacharya, T. Timing the Ancestor of the HIV-1 Pandemic Strains. Science. 2000 Jun 9;288(5472):1789-96. [56]Van Heuverswyn F, Li Y, Neel C, Bailes E, Keele BF, Liu W, Loul S, Butel C, Liegeois F, Bienvenue Y, Ngolle EM, Sharp PM, Shaw GM, Delaporte E, Hahn BH,Peeters M.. Human immunodeficiency viruses: SIV infection in wild gorillas. Nature 2006;444:164. [57]Rambaut A, Posada D, Crandall KA, Holmes EC. The causes and consequences of HIV evolution. Nat Rev Genet. 2004 Jan;5(1):52-61. [58]Perelson AS, Neumann AU, Markowitz M, Leonard JM, Ho DD. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science 1996;271:1582-6. 77
[59]Robertson DL, Anderson JP, Bradac JA, Carr JK, Foley B, Funkhouser RK, Gao F, Hahn BH, Kalish ML, Kuiken C, Learn GH, Leitner T, McCutchan F, Osmanov S, Peeters M,Pieniazek D, Salminen M, Sharp PM, Wolinsky S, Korber B. HIV-1 nomenclature proposal. Science. 2000 Apr 7;288(5463):55-6. [60]Natz E, Lisziewicz J. Rational design of formulated DNA vaccines: the DermaVir approach. Gene Vaccines 2012, 127-143 [61]Lori F, Lewis MG, Xu J, Varga G, Zinn DE Jr, Crabbs C, Wagner W, Greenhouse J, Silvera P, Yalley-Ogunro J, Tinelli C, Lisziewicz J (2000) Control of SIV rebound through structured treatment interruptions during early infection. Science 290(5496):1591–1593. [62]Walker BD. Elite control of HIV Infection: implications for vaccines and treatment. Top HIV Med. 2007 Aug-Sep;15(4):134-6. [63]Toke ER, Lorincz O, Somogyi E, Lisziewicz J. Rational development of a stable liquid formulation for nanomedicine products. Int J Pharm 2010; 392(1-2):261-267. [64]Lisziewicz J, Trocio J, Whitman L, Varga G, Xu J, Bakare N, Erbacher P, Fox C, Woodward R, Markham P, Arya S, Behr JP, Lori F. DermaVir: a novel topical vaccine for HIV/AIDS. J Invest Dermatol 2005;124(1):160–169. [65]Collins KL, Chen BK, Kalams SA, Walker BD, Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. Nature. 1998 Jan 22;391(6665):397-401. [66]Lőrincz O, Tőke ER, Somogyi E, Horkay F, Chandran P, Douglas JF, Szebeni J, Lisziewicz J. Structure and biological activity of pathogen-like synthetic nanomedicines. Nanomedicine: NMB 2011. In press. [67]Lisziewicz J, Gabrilovich DI, Varga G, Xu JQ, Greenberg PD, Arya SK, Bosch M, Behr JP, Lori F. Induction of potent human immunodeficiency virus type 1-specific T-cell-restricted immunity by genetically modified dendritic cells. Journal of Virology 2001;75(16):7621-8. [68]Boussif O, Lezoualc’h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JP. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(16):7297–7301. [69]Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self. Science 2002; 296(5566): 301-305. [70]Nicolas JF and Guy B Intradermal, epidermal and transcutaneous vaccination: from immunology to clinical practice. Expert. Rev. Vaccines 2008; 7(8): 1201-1214. [71]Bauer J, Bahmer FA, Worl J, Neuhuber W, Schuler G et al A strikingly constant ratio exists between Langerhans cells and other epidermal cells in human skin. A stereologic study using the optical disector method and the confocal laser scanning microscope. J. Invest. Dermatol. 2001;116(2):313-318. [72]Lisziewicz J, Trocio J, Xu J, Whitman L, Ryder A, Bakare N, Lewis MG, Wagner W, Pistorio A, Arya S, Lori F. Control of viral rebound through therapeutic immunization with DermaVir. AIDS 2005;19(1):35–43.
78
[73]Lisziewicz J, Calarota SA, Banhegyi D, Lisziewicz Z, Ujhelyi E, Lori F. Single DermaVir patch treatment of HIV+ individuals induces long-lasting, highmagnitude, and broad HIV-specific T cell responses. Poster presentation. 15th conference on retroviruses and opportunistic infections, Boston, MA, 3–6 Feb 2008. [74]Lisziewicz J, Bakare N, Calarota SA, Bánhegyi D, Szlávik J, Újhelyi E, Tőke ER, Molnár L, Lisziewicz Z, Autran B, Lori F. Single DermaVir Immunization: Dosedependent Expansion of Precursor/Memory T Cells Against All HIV Antigens in HIV-1 Infected Individuals. Plos One 2012. In press. [75]Calarota SA, Foli A, Maserati R, Baldanti F, Paolucci S Young MA, Tsoukas CM, Lisziewicz J, Lori F. HIV-1-Specific T Cell Precursors with High Proliferative Capacity Correlate with Low Viremia and High CD4 Counts in Untreated Individuals. J. Immunol. 2008; 180(9): 5907-5915. [76]Rodriguez B, Asmuth D, Matining R, Spritzler J, Li X, Jacobson J, Read S, Lisziewicz J, Lori F, Pollard R, Team AS. Repeated-dose transdermal administration of DermaVir, a candidate plasmid DNA-based therapeutic HIV vaccine, is safe and well-tolerated: a 61-week analysis of ACTG Study 5176. Presented at the XVIIIth International AIDS Conference, 2010, Vienna, Austria [77]van Lunzen J, Pollard R, Stellbrink HJ, Plettenberg A, Natz E, Lisziewicz Z, Freese R, Molnar L, Calarota SA, Lori F, Lisziewicz J. DermaVir for initial treatment of HIV-infected subjects demonstrates preliminary safety, immunogenicity and HIVRNA reduction versus placebo immunization. Presented at the XVIII international AIDS conference, 2010, Vienna, Austria [78]ICH Q2(R1) guideline: Validation of analytical procedures: Text and Methodology [79]Weboldal: http://tools.immuneepitope.org/ [80]Peters B, Bui HH, Frankild S, Nielsen M, Lundegaard C, Kostem E, Basch D, Lamberth K, Harndahl M, Fleri W, Wilson SS, Sidney J, Lund O, Buus S, Sette A. A community resource benchmarking predictions of peptide binding to MHC-I molecules. PLoS Computational Biology 2006;2(6):574–84. [81]Wang P, Sidney J, Dow C, Mothe B, Sette A, Peters B. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Computational Biology 2008;4(4). [82]Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Science 2003;12(5):1007–17. [83]Korber TMB, Brander C, Haynes BF, Koup R, Moore JP, Walker BD, et al., editors. HIV Molecular Immunology 2008. Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory, Theoretical Biology and Biophysics, 2008. [84]Saitou, N., Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987; 4;406-625. [85]Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980;16;111120. [86]Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985;39;783-791. 79
[87]Lori F, Veronese FD, Devico AL, Lusso P, Reitz MS, Gallo RC. Viral-DNA carried by human-immunodeficiency-virus type-1 virions. Journal of Virology 1992;66(8):5067-74. [88]Malykh A, Reitz MS, Louie A, Hall L, Lori F. Multiple determinants for growth of human-immunodeficiency-virus type-1 in monocyte-macrophages. Virology 1995;206(1):646-50. [89]Piccinini G, Foli A, Comolli G, Lisziewicz J, Lori F. Complementary antiviral efficacy of hydroxyurea and protease inhibitors in human immunodeficiency virusinfected dendritic cells and lymphocytes. Journal of Virology 2002;76(5):2274-8. [90]Cara A, Guarnaccia F, Reitz MS, Gallo RC, Lori F. Self-limiting, cell typedependent replication of an integrase defective human-immunodeficiencyvirus type-1 in human primary macrophages but not T-lymphocytes. Virology 1995;208(1):242–8. [91]Gruters RA, van Baalen CA, Osterhaus A. The advantage of early recognition of HIV-infected cells by cytotoxic T-lymphocytes. Vaccine 2002;20(15):2011–5. [92]Somogyi E, Xu J, Gudics Á, Tóth J, Kovács AL, Lori F, Lisziewicz J. A plasmid DNA immunogen expressing fifteen protein antigens and complex virus-like particles (VLP+) mimicking naturally occurring HIV. Vaccine 2011;29(4):744– 753. [93]Quan FS, Steinhauer D, Huang CZ, Ross TM, Compans RW, Kang SM. A bivalent influenza VLP vaccine confers complete inhibition of virus replication in lungs. Vaccine 2008;26(26):3352-61. [94]Altfeld M, Allen TM, Yu XG, Johnston MN, Agrawal D, Korber BT, Montefiori DC, O'Connor DH, Davis BT, Lee PK, Maier EL, Harlow J, Goulder PJ, Brander C,Rosenberg ES, Walker BD. HIV-1 superinfection despite broad CD8+ T-cell responses containing replication of the primary virus. Nature. 2002 Nov 28;420(6914):434-9. [95]Streeck H, Li B, Poon AF, Schneidewind A, Gladden AD, Power KA, Daskalakis D, Bazner S, Zuniga R, Brander C, Rosenberg ES, Frost SD, Altfeld M, Allen TM. Immune-driven recombination and loss of control after HIV superinfection. J Exp Med. 2008 Aug 4;205(8):1789-96. [96]Somogyi E, Gudics Á, Forni DD, Molnár L, Lori F, Lisziewicz J. Subtype optimized DermaVir for personalized immunotherapy. Abstracts from AIDS Vaccine 2010. AIDS Research and human retroviruses 2010, 26(10): A-1-A-184. [97]Weboldal: http://www.hiv.lanl.gov/ [98]Pantaleo G, Koup RA. Correlates of immune protection in HIV-1 infection: what we know, what we don't know, what we should know. Nat Med. 2004 Aug;10(8):806-10. [99]Mascola JR, Montefiori DC. The Role of Antibodies in HIV Vaccines. Annu. Rev. Immunol. 2010. 28:413–44. [100]Koup RA, Graham BS, Douek DC. The quest for a T cell-based immune correlate of protection against HIV: a story of trials and errors. Nat Rev Immunol. 2011 Jan;11(1):65-70.
80
[101]Mouquet H, Scheid JF, Zoller MJ, Krogsgaard M, Ott RG, Shukair S, Artyomov MN, Pietzsch J, Connors M, Pereyra F, Walker BD, Ho DD, Wilson PC, Seaman MS, Eisen HN, Chakraborty AK, Hope TJ, Ravetch JV, Wardemann H, Nussenzweig MC. Polyreactivity increases the apparent affinity of anti-HIV antibodies by heteroligation. Nature 2010;467(7315):591-595. [102]Mouquet H, Warncke M, Scheid JF, Seaman MS, Nussenzweig MC. Proc Natl Acad Sci U S A. Enhanced HIV-1 neutralization by antibody heteroligation. 2012 Jan 17;109(3):875-80. [103]Betts MR, Casazza JP, Koup RA. Monitoring HIV specific CD8+ T cell responses by intracellular cytokine production. Immunol Lett. 2001 Nov 1;79(1-2):117-25. [104]Abbott A. Therapeutic HIV vaccines show promise. Nature 2010;466,539, published online. http://www.nature.com/news/2010/100727/full/466539a.html [105]Sandstrom E, Nilsson C, Hejdeman B, Brave A, Bratt G, Robb M, Cox J, Vancott T, Marovich M, Stout R, Aboud S, Bakari M, Pallangyo K, Ljungberg K, Moss B,Earl P, Michael N, Birx D, Mhalu F, Wahren B, Biberfeld G; HIV Immunogenicity Study 01/02 Team. Broad Immunogenicity of a Multigene, Multiclade HIV-1 DNA Vaccine Boosted with Heterologous HIV-1 Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara. Journal of Infectious Diseases 2008;198(10):1482-90. [106]Ellenberger D, Wyatt L, Li B, Buge S, Lanier N, Rodriguez IV, Sariol CA, Martinez M, Monsour M, Vogt J, Smith J, Otten R, Montefiori D, Kraiselburd E, Moss B,Robinson H, McNicholl J, Butera S. Comparative immunogenicity in rhesus monkeys of multi-protein HIV-1 (CRF02_AG) DNA/MVA vaccines expressing mature and immxature VLPs. Virology 2005;340(1):21-32. [107]Masemola A, Mashishi T, Khoury G, Mohube P, Mokgotho P, Vardas E, Colvin M, Zijenah L, Katzenstein D, Musonda R, Allen S, Kumwenda N, Taha T, Gray G,McIntyre J, Karim SA, Sheppard HW, Gray CM; HIVNET 028 Study Team. Hierarchical Targeting of Subtype C Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proteins by CD8+ T Cells: Correlation with Viral Load. Journal of Virology 2004; 78(7):3233–3243. [108]Kiepiela P, Ngumbela K, Thobakgale C, Ramduth D, Honeyborne I, Moodley E, Reddy S, de Pierres C, Mncube Z, Mkhwanazi N, Bishop K, van der Stok M, Nair K, Khan N, Crawford H, Payne R, Leslie A, Prado J, Prendergast A, Frater J, Brander C, Learn GH, Nickle D, Rousseau C, Coovadia H, Mullins JI, Heckerman D, Walker BD, Goulder P. CD8+ Tcell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nat Med. 2007 Jan;13(1):46-53. [109]Vider-Shalit T, Fishbain V, Raffaeli S, Louzoun Y. Phase-dependent immune evasion of herpesviruses. Journal of Virology 2007;81(17):9536-45. [110]Fischer W, Perkins S, Theiler J, Bhattacharya T, Yusim K, Funkhouser R, Kuiken C, Haynes B, Letvin NL, Walker BD, Hahn BH, Korber BT. Polyvalent vaccines for optimal coverage of potential T-cell epitopes in global HIV-1 variants. Nat Med 2007;13(1)100-6. [111]Blauvelt A, Asada H, Saville MW, KlausKovtun V, Altman DJ, Yarchoan R, Katz SI. Productive infection of dendritic cells by HIV-1 and their ability to capture virus are mediated through separate pathways. Journal of Clinical Investigation 1997;100(8):2043-53. 81
[112]Ellenberger D, Li B, Smith J, Yi H, Folks T, Robinson H, Butera S. Optimization of a multi-gene HIV-1 recombinant subtype CRF02_AG DNA vaccine for expression of multiple immunogenic forms. Virology 2004;319(1):118-30. [113]Weaver EA, Lu Z, Camacho ZT, Moukdar F, Liao HX, Ma BJ, Muldoon M, Theiler J, Nabel GJ, Letvin NL, Korber BT, Hahn BH, Haynes BF, Gao F. Crosssubtype T-cell immune responses induced by a human immunodeficiency virus type 1 group M consensus env immunogen. J Virol 2006;80:6745-56. [114]Barouch DH, O'Brien KL, Simmons NL, King SL, Abbink P, Maxfield LF, Sun YH, La Porte A, Riggs AM, Lynch DM, Clark SL, Backus K, Perry JR, Seaman MS,Carville A, Mansfield KG, Szinger JJ, Fischer W, Muldoon M, Korber B. Mosaic HIV1 vaccines expand the breadth and depth of cellular immune responses in rhesusmonkeys. Nat Med. 2010 Mar;16(3):319-23.
82
