DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
KÓSA ESZTER IMOLA
KESZTHELY 2009
PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskola
Témavezetı:
Társtémavezetı:
Dr. habil. Szabó István
Dr. habil. Páldi Emil
biológia tudomány kandidátusa
MTA doktora
ABIOTIKUS STRESSZOROK ÉS STRESSZTOLERANCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZİK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KUKORICÁBAN (ZEA MAYS L.)
Készítette: Kósa Eszter Imola
Keszthely 2009 2
ABIOTIKUS STRESSZOROK ÉS STRESSZTOLERANCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZİK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KUKORICÁBAN (ZEA MAYS L.) Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében
Írta: Kósa Eszter Imola Készült a Pannon Egyetem Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskolája keretében. Témavezetı: Dr. habil. Szabó István Elfogadásra javaslom (igen / nem)
……………………. (aláírás)
A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el.
Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………… (aláírás) Bíráló neve: …........................ ….............. igen /nem ………………………… (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el. Keszthely,
…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke
A doktori (PhD) oklevél minısítése…................................. ..………………… az EDT elnöke
3
TARTALOMJEGYZÉK KIVONAT .................................................................................................................................. 7 ANGOL NYELVŐ KIVONAT .................................................................................................. 9 NÉMET NYELVŐ KIVONAT ................................................................................................ 10 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE .................................................................................................. 11 1. BEVEZETÉS ....................................................................................................................... 14 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................ 16 2.1. A növényi stresszfolyamatokról általában ..................................................................... 16 2.1.1. Az alacsony hımérséklet növényi anyagcserére gyakorolt hatásai ....................... 16 2.1.1.1. Az alacsony hımérséklet hatásai hidegérzékeny növényekre ...................... 17 2.1.2. Az UV-B sugárzás hatásai a növényekre................................................................ 21 2.2. Az oxidatív stressz ......................................................................................................... 32 2.2.1. A reaktív oxigénformák típusai ............................................................................... 32 2.2.2. Az antioxidáns védekezırendszer ........................................................................... 33 2.2.2.1. Szuperoxid-dizmutázok ................................................................................ 34 2.2.2.2. A víz-víz ciklus ............................................................................................. 34 2.2.2.3. Az aszkorbát-glutation ciklus ...................................................................... 35 2.2.2.4. Aszkorbát-peroxidázok ................................................................................ 35 2.2.2.5. Glutation-reduktázok ................................................................................... 36 2.2.2.6. Katalázok ..................................................................................................... 37 2.2.3. A reaktív oxigénformák élettani szerepe ................................................................ 39 2.3. A növények fluoreszcencia sajátságai ........................................................................... 40 2.3.1. Stresszelt növények leveleinek fluoreszcenciája..................................................... 42 2.4. Az S-metilmetionin élettani szerepe .............................................................................. 44 2.4.1. Az SMM-ciklus........................................................................................................ 45 2.4.2. Az SMM-ciklus szerepe a Met és AdoMet-szint szabályozásában .......................... 47 2.4.3. Az SMM metilcsoportjának szerepe........................................................................ 49 2.4.4. Az SMM szerepe a S szállításában és raktározásában, az SMM-ciklus eltolódásai térben és idıben ............................................................................................................... 50 2.4.5. Az SMM szerepe a dimetil-szulfopropionát (DMSP) szintézisében ....................... 51 2.4.6. Az SMM hidegstressz elleni védıhatása ................................................................. 52 2.4.7. Az SMM hatása az etiléntermelésre ....................................................................... 53 3. KUTATÁSI CÉLOK ............................................................................................................ 54 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ........................................................................................... 55 4.1. Növényi anyagok, mintavételek és kezelések ............................................................... 55 4
4.1.1. SMM-kezelés........................................................................................................... 55 4.1.2.1. UV-B kísérletek szabadföldön ..................................................................... 56 4.1.2.2. UV-B kamrakísérletek ................................................................................. 56 4.2. A fluoreszcencia-indukció mérése ................................................................................. 57 4.3. A több hullámhosszú fluoreszcencia leképezı rendszer mőködése .............................. 58 4.4. Gázcsere vizsgálatok ..................................................................................................... 59 4.5. Relatív klorofilltartalom mérése.................................................................................... 59 4.6. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitásuk mérése................................................... 60 4.7. Antocián kivonás és relatív antociántartalom meghatározása ....................................... 62 4.8. Hajtáshossz mérése ....................................................................................................... 62 4.9. Szabadföldi kísérletek UV-B sugárzási adatai és statisztikai értékelésük ..................... 62 4.10. Statisztikai analízis ...................................................................................................... 62 5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ................................................................................ 63 5.1. SMM-kezelések ............................................................................................................. 63 5.1.1. SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására 5°C-on ........................ 63 5.1.2. SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett ................................................................................................. 65 5.1.3. SMM-kezelés hatása a fotoszintézisre chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett ............................................................................................................................... 67 5.1.3.1. A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai .................................... 67 5.1.3.2. A fotoszintetikus aktivitás és az intercelluláris CO2 tartalom alakulásának összefüggései ............................................................................................................ 69 5.1.3.3. Az SMM hatása stresszvédı metabolitok keletkezésére ............................... 71 5.1.3.4. SMM-kezelés hatása a relatív klorofilltartalomra chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett ......................................................................................... 72 5.1.4. Alacsony hımérsékleti stressz és SMM-kezelés hatására történt változások eredményeinek értékelése ................................................................................................. 74 5.2. A magasabb szabadföldi UV-B sugárzás és a növényi antociántartalom alakulásának összefüggései ........................................................................................................................ 77 5.2.1. Szabadföldi UV-B kísérletek eredményeinek értékelése ......................................... 83 5.3. UV-B kezelés anyagcserére gyakorolt hatásai kukoricában .......................................... 84 5.3.1. Az UV-B sugárzás antioxidáns enzimek aktivitására gyakorolt hatása ................. 84 5.3.2. A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai UV-B sugárzás hatására ...... 85 5.3.3. A fotoszintetikus aktivitás változása UV-B sugárzás hatására .............................. 86 5.3.4. A relatív klorofilltartalom változásai UV-B sugárzás hatására ............................. 87 5.3.5. A relatív antociántartalom változásai UV-B sugárzás hatására ............................ 87 5.3.6. UV-B kezelés hatása a növények hajtáshosszára ................................................... 88 5.3.7. UV-B kamrakísérletek eredményeinek értékelése................................................... 88 5.3.7.1. Az UV-B sugárzás antioxidáns enzimek aktivitására gyakorolt hatása ...... 88 5
5.3.7.2. Az UV-B kezelés fotoszintézisre gyakorolt hatása ....................................... 89 5.3.7.3. A relatív antociántartalom változásai UV-B sugárzás hatására ................. 90 5.3.7.4. UV-B kezelés hatása a növények hajtáshosszára ........................................ 90 6. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................. 91 7. IRODALOMJEGYZÉK ....................................................................................................... 95 8. TÉZISEK ............................................................................................................................ 118 9. THESES ............................................................................................................................. 120 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................ 122
6
KIVONAT Részletesen tanulmányoztuk a nemesítés szempontjából fontos két abiotikus stresszfaktor
(alacsony
hımérséklet,
UV-B
sugárzás)
hatását
a
kukorica
anyagcseréjére. A stresszélettani vizsgálatokat elsısorban Martonvásáron, az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet fitotronjában lévı alacsony hımérsékleti és UV-B kezelést biztosító növénynevelı kamráiban, míg a szabadföldi kísérleteket részben a martonvásári, illetve a második generáció felnevelésének helyt adó Buin-i (Chile) tenyészkertben végeztük. Kísérleteink egyik fontos része - elızetes eredmények alapján - annak bizonyítása volt, hogy a kénanyagcsere intermedier vegyülete, az S-metilmetionin (SMM) mennyiben tudja a fiatalkori kukoricanövények alacsony hımérséklettel szembeni
ellenállóságát
befolyásolni.
Folyadékkultúrás
kísérleteink
során
hımérsékleti gradiens mellett (6-14°C) mértük a második fotokémiai rendszer (PSII) mőködését reprezentáló Fv/Fm fluoreszcencia indukciós paramétert, nyomon követtük a relatív klorofilltartalom alakulását, valamint tanulmányoztuk a reaktív oxigénformák eliminálásáért felelıs antioxidáns enzimek aktivitás-változását SMM-kezelés hatására. Igazoltuk, hogy az SMM a legalacsonyabb - a kukorica számára károsodást okozó gradiens hımérsékleteken (8 és 6ºC) növelni tudta a Fv/Fm hányadost, ami az SMM védıhatását bizonyította az alacsony hımérsékletre igen érzékeny PSII esetében. Ugyanezeken a hımérsékleteken az SMM a kevésbé károsodott struktúrák miatt megakadályozta a klorofilltartalom csökkenését. Megállapítottuk, hogy ha eltérı mértékben is, valamennyi antioxidáns enzim aktivitása szignifikánsan emelkedett a legalacsonyabb gradiens hımérsékleten (6ºC) és a kukorica számára már letális hımérsékleten, 5ºC-on is SMM-kezelés hatására. A kulcsfontosságú szerepet az APX képviseli, mely a gradiens valamennyi hımérsékletén aktivitásemelkedést mutatott. Kísérleteink másik fontos célja - szabadföldi és UV-B kamrás körülmények között - az volt, hogy eltérı rokonsági körökhöz tartozó és különbözı érésidejő beltenyésztett kukoricavonalakban a magasabb ultraibolya sugárzás hatását vizsgáljuk a levelek antociántartalmára, a fotoszintézis paramétereire, és az antioxidáns enzimek aktivitására. Több éves szabadföldi kísérleteink adatai azt igazolták, hogy a chilei 7
levélmintákban - a közel 30%-kal nagyobb UV-B sugárzás miatt, 5 év átlagában 18%-kal magasabb volt az antociánok mennyisége, mint Martonvásáron. UV-B kamrás vizsgálataink azt bizonyították, hogy az UV-B sugárzás eltérı mértékben hatott az antioxidáns enzimek aktivitására. Aktivitás növekedés csak az APX enzim esetében volt megfigyelhetı, de csak a korai tenyészidejő vonal esetében. Legnagyobb mértékben a POD és a GST enzimek aktivitása csökkent. Ez utóbbi enzimek aktivitáscsökkenése
jó
paraméter
lehet
a
beltenyésztett
érzékenységének jellemzésére.
8
kukoricavonalak
UV-B
ANGOL NYELVŐ KIVONAT
STUDIES ON THE EFFECT OF ABIOTIC STRESSORS AND FACTORS INFLUENCING STRESS TOLERANCE IN MAIZE (ZEA MAYS L.)
Experiments carried out in the temperature gradient chamber of the phytotron at the Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences proved that S-methylmethionine reduced the low temperature sensitivity of maize plants in the seedling stage by increasing the efficiency of the PSII system, the relative chlorophyll content of the leaves and the activity of antioxidant enzymes. It was confirmed in field experiments that enhanced UV-B radiation induces a rise in the quantity of anthocyanines, which absorb this radiation. Tests in a UV-B chamber proved that the activities of individual antioxidant enzymes respond differently to UV radiation. The reduction in the activity of the POD and GST enzymes could be a suitable parameter for characterising the UV-B sensitivity of inbred maize lines.
9
NÉMET NYELVŐ KIVONAT
DIE UNTERSUCHUNG DER EFFEKTE DER ABIOTISCHEN STRESSOREN UND DER AUF DIE STRESSTOLERANZ EINWIRKENDEN FAKTOREN IN MAIS (ZEA MAYS L.)
Die
stressphysiologischen
Experimente
werden
im
Phytotron
des
landwirtschaftlichen Forschungsinstituts der UAdW in Martonvásár gemacht. Das erste Ziel war die Demonstration der Wirkung von S-methylmethionin (SMM) auf die Photosynthese und auf die Aktivität der antioxidativen Enzyme in Mais. Die SMM erhöhte die Wirksamkeit der Photosynthese (PSII) und die Aktivität der antioxidativen Enzyme. Die SMM reduzierte die Empfindlichkeit des Maises gegen die niedrige Temperatur (unter 12 °C). Das zweite Ziel war die Untersuchung der Wirkung der UV-B Radiation auf den Stoffwechsel in den differenten Inzuchtlinien des Maises. Die höhere UV-B Radiation erhöhte den Gehalt von Anthocyan in den Blättern und reduzierte die Aktivität der antioxidativen Enzyme, besonders bei POD und GST.
10
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
A
fotoszintetikus aktivitás
ACC
1-aminociklopropán-1karboxilát
APX
aszkorbát-peroxidáz
AdoHcy
S-adenozil-homocisztein
AdoMet
S-adenozil-metionin
CAT
kataláz
Ci
intercelluláris széndioxid-koncentráció
CBF
C-repeat binding factor
CC
citozin-citozin
CDNB
1-kloro-2,4-dinitrobenzén
CHS
kalkon-szintáz
CPD
ciklobután típusú pirimidin dimerek
DDH
DMSP-aldehid dehidrogenáz
DMS
dimetil-szulfid
DMSP
dimetil-szulfopropionát
DTNB
5,5’-ditio-bis-(2-nitro-benzoesav)
EDTA
etilén-diamin-tetraecetsav
Fo
kezdeti fluoreszcencia sötétadaptált állapotban
Fo’
kezdeti fluoreszcencia fényadaptált állapotban
Fm
maximális fluoreszcencia sötétadaptált állapotban
Fm’
maximális fluoreszcencia fényadaptált állapotban
11
Fv
változó fluoreszcencia sötétadaptált állapotban
GR
glutation-reduktáz
GSH
redukált glutation
GSSG
oxidált glutation
GST
glutation-S-transzferáz
HMT
S-metilmetionin:homocisztein S-metiltranszferáz
IES
indolecetsav
LHC
fénygyőjtı komplex
Met
metionin
MMT
S-adenozilmetionin:metionin S-metiltranszferáz
NADP
β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát, oxidált
NADPH
β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát, redukált
PAL
fenilalanin-ammónia-liáz
PAR
fotoszintetikusan aktív sugárzás
POD
gvajakol-peroxidáz
PPFD
fotoszintetikusan aktív fotonfluxus denzitás
PSI
elsı fotokémiai rendszer
PSII
második fotokémiai rendszer
QA
elsıdleges kinon akceptor
QB
másodlagos kinon akceptor
qN
nem-fotokémiai kioltás
qP
fotokémiai kioltás
ROS
reaktív oxigénformák
SMM
S-metilmetionin
12
SMT
szelenocisztein-metiltranszferáz
SOD
szuperoxid-dizmutáz
TC
timin-citozin
TT
timin-timin
13
1. BEVEZETÉS Az ısidık emberének hiedelemvilágához tartozott, hogy az idıjárás irányítása isteneknek (pl. Napisten, Esıisten) tulajdonítható. A ma embere az objektív adatok között tájékozódva azt gondolhatja, hogy az idıjárás alakulásáért csupán a légkört leíró állapotjelzık (nyomás, sőrőség, hımérséklet, moláris összetétel, stb.), a besugárzás, a felszín tulajdonságai, a légkör átlátszósága, stb. a felelısek. Talán kevesebben vannak azok, akik végiggondolják, hogy az idıjárás nagyléptékő alakítója az ipari forradalom óta maga az ember. A világmérető
éghajlatváltozás
tény,
ugyanis
az
ipari
tevékenység
következtében - az üvegház gázok fokozott kibocsátásával - a Föld átlaghımérséklete 0,6ºC-kal emelkedett (HANSEN és mtsai., 2005). A globális klímaváltozás egyik negatív következménye, hogy az - ugyancsak ipari tevékenység során kibocsátott ózon-antagonista gázok révén, az élılények számára káros UV-B sugárzás ellen védıpajzsként funkcionáló sztratoszférikus ózonréteg vékonyodik (ANDERSON és mtsai., 1991; MCFARLAND és KAYE, 1992; MCKENZIE és mtsai., 1999), így a Földre jutó UV-B sugárzás szintje magasabb. Az ózonréteg vékonyodás a déli féltekén, az Antarktisz és annak közelében lévı területek fölött a legnagyobb mértékő. A változó környezethez való szüntelen alkalmazkodás, a stressz, az élet természetes velejárója E fogalom biológiai értelmezése és az alapjaiban máig elfogadott stresszelmélet megalkotása a magyar származású Selye János (1907-1982) nevéhez főzıdik. Definíciója szerint „a stressz egy fajlagos tünetcsoportban megnyilvánuló állapot, mely magába foglal minden nem-fajlagosan elıidézett változást egy biológiai rendszeren belül” (SELYE, 1936, 1978). Megfigyelései szerint a szervezet számos olyan reakciót mutat, mely a stresszt kiváltó stresszor fajtájától függetlenül minden esetben lényegében hasonló tüneteket produkál. Ez vezetett az ún. általános adaptációs szindróma elméletének kidolgozásához. Eszerint a szervezetben egy stresszor megjelenését követıen 3 stádium figyelhetı meg: az elsı az alarm, vagy készültségi reakció, amikor az alkalmazkodási készség a normális szint alá kerül. A második az ellenállás stádiuma, amelyben alkalmazkodási és reparációs folyamatok eredményeként ismét normális életmőködések, fokozott ellenálló képesség jellemzı. A 14
harmadik a kimerülés szakasza, ami az alkalmazkodóképességet meghaladó intenzitású igénybevétel esetén következik be és fokozatos leromláson át krónikus károsodáshoz, majd a pusztuláshoz vezet. Bár Selye kutatóorvosként fıleg állati és emberi szervezeteket tanulmányozott, elméletének alapjai növényi rendszerekre is érvényesek (LARCHER, 1995). A növények - az állatokkal és az emberrel ellentétben helyhez kötöttségüknél fogva nem tudnak a kedvezıtlen környezeti feltétételek elıl kitérni, így akár idıjárásból (alacsony, magas hımérséklet, szárazság, áradás stb.), akár emberi tevékenységbıl (UV-B sugárzás erısödése, nehéz fémek, savas esı stb.) adódó kedvezıtlen környezeti tényezık hatására az anyagcsere szintjén stressz-indukált válaszokkal felelnek. E válaszok gyorsasága és eredményessége a növényfajta, adott esetben a faj életképességét is meghatározza. Az idıjárás szélsıségessé válása hazánk mezıgazdaságát is egyre inkább érinti, így a növénynemesítı szakemberek egyik sürgetıvé vált feladata olyan genotípusok elıállítása, amelyek a környezet változásait a lehetı legkisebb mértékő károsodás mellett tolerálják. Ahhoz, hogy ilyen növényeket elı lehessen állítani, elıször a növények egyes védekezı és szabályozási folyamatait kell megismerni. A különbözı növényfajok között az alacsony hımérséklettel és az UV-B sugárzással szembeni érzékenységet tekintve is igen nagy különbségek vannak, hiszen az evolúció során szelekciójuk a termıhely ökológiai adottságainak megfelelıen történt. A szubtrópusi eredető gazdasági növények (pl. kukorica, paradicsom, paprika, szója, rizs stb.) már 10-12ºC alatt jelentıs károsodást szenvedhetnek. Hazánkban és a világ számos más országában az egyik legfontosabb élelmiszer- és takarmánynövény, a kukorica esetében a hideg károsító hatásával elsısorban a növény fejlıdésének kezdeti szakaszában kell számolni. E növényfaj a fokozott UV-B sugárzással szemben is érzékenységet mutat (TERAMURA és SULLIVAN, 1994). Mind elméleti, mind gyakorlati szempontból nagy jelentısége van azon vegyületek vizsgálatának, amelyek a gazdasági növények stressz érzékenységét csökkenteni képesek. Korábbi vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy egy biológiailag aktív, nem fehérjeépítı szabad aminosav, az S-metilmetionin (SMM) exogén módon bejuttatva - kedvezıen befolyásolja a növények hidegtőrı képességét és hatása számos vonatkozásban hasonlít az ugyancsak stresszvédı poliaminok hatásához (SHEN és mtsai., 2000). 15
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A növényi stresszfolyamatokról általában
A növények életük során számtalan biotikus és abiotikus stresszhatásnak vannak
kitéve.
A
biotikus
stresszorok
közül
elsısorban
a
kártevı
mikroorganizmusokat, köztük a vírusokat, baktériumokat, gombákat kell említeni, de a rovarok, csigák - okozta rágás is ide sorolható, abiotikus stresszoroknak pedig a növényi környezet extrém megváltozásaiból adódó hatásokat, pl. hıség, fagy, szárazság, fénystressz, UV-stressz, tápanyaghiány, toxikus nehézfémek, stb. tekintik. Mindkét típusba sorolt stresszorok általában a védekezést, a jobb alkalmazkodást szolgáló, többletenergiát, egyes anyagok szintézisét igénylı válaszreakciókat váltanak ki a növényekben, és jelentıs mértékben megváltoztatják a növények anyagcseréjét, ami a stresszor hatásának tartósságától függıen termesztett növények esetén terméscsökkenést, és/vagy minıségcsökkenést okoz.
2.1.1. Az alacsony hımérséklet növényi anyagcserére gyakorolt hatásai Míg egyes stresszfaktorok (pl. herbicidek) többé-kevésbé jól meghatározható elsıdleges hatóhellyel rendelkeznek, addig a hidegstressz az anyagcsere valamennyi mőködését befolyásolja, érthetı módon, hiszen minden biokémiai folyamat sebessége hımérsékletfüggı,
minden
enzim
meghatározott
hımérsékleti
optimummal
rendelkezik. Az optimálistól eltérı hımérsékleten egyrészt a szubsztrátmolekulák csökkent diffúziója révén, másrészt az enzimek alacsonyabb aktivitása miatt megváltozik az enzimatikus folyamatok sebessége. Az egyes anyagcsere folyamatok eltérı mértékben reagálnak a hideghatásra, a sejt metabolikus egyensúlya felborul. Egyes folyamatoknál az alacsony hımérséklet hatása csak a hidegstressz alatt jelentkezik, majd miután a növény optimális hımérsékletre kerül vissza, a funkció helyreáll. Ezzel szemben más folyamatok tartósan károsodhatnak a stressz következtében, így a csökkent mőködés a hideghatás megszőnése után is kimutatható. Bizonyos esetekben a hidegstressz látható jelei alacsony hımérsékleten nem, csak azt 16
követıen, normál hımérsékleten jelentkeznek. A szubtrópusi eredető fajok jelentıs hidegérzékenységgel bírnak, és szélsıséges esetben már rövid hideghatás után sem képesek regenerálódni.
2.1.1.1. Az alacsony hımérséklet hatásai hidegérzékeny növényekre Az alacsony hımérséklet hatásait növényekben - fıként a hımérséklettıl és idıtartamtól
függıen
-
többféle
szemszögbıl
vizsgálják.
Például
a
fiatal
kukoricanövények fejlıdéséhez, egyéb környezeti tényezıktıl és genotípustól függıen, 20-27ºC tekinthetı optimálisnak. A 15-20ºC-os hımérsékleti intervallum az ún. szuboptimális tartomány, melyen a növények még megfelelı mértékben fejlıdhetnek. Amennyiben
a
növények
12-15ºC-os
hımérséklettartományban
növekednek, kismértékő edzıdés is megfigyelhetı (JANDA és mtsai., 1998). Ez alatti hımérséklettartományban azonban már egyre inkább a károsodás tünetei mutatkoznak (chilling). 7ºC alatt ezek a növények nem növekednek, és egy rövid idı múlva elpusztulnak. A különbözı eredető növényfajok az alacsony, fagypont feletti hımérsékletre eltérı érzékenységet mutatnak. Ugyanakkor egy növényen belül is tapasztalhatunk különbségeket az egyes szövetek, sejttípusok hidegérzékenységében. A növény stressztőrı képességét az adott szövet, vagy szerv kora is befolyásolhatja. Mindemellett az is ismert, hogy például a kukorica mezofillsejtek érzékenyebbek a hideg károsító hatására, mint a hüvelyparenchima sejtek (KRATSCH és WISE, 2000). A növény anyagcseréjének számos folyamata membránhoz kötött. Emiatt a hideghatás alatt a membránokban lejátszódó folyamatoknak kulcsszerepük van mind a hidegkárosodás
kialakulásában,
mind
az
alacsony
hımérséklethez
történı
alkalmazkodásban (LYONS és RAISON, 1970; LYONS, 1973; LYONS és mtsai., 1979; MURATA és mtsai., 1983). A membrán lipid fázisátmenet hipotézis hosszú ideig egyféle magyarázatot adott a hideg okozta károsodásokra (LYONS, 1973). Ezen elmélet szerint a membránlipidek valószínőleg folyadék kristályos állapotban vannak, hogy el tudják látni a szemipermeábilis gát szerepét a sejtkompartmentek között, és megfelelı környezetet
biztosítsanak
az
intrinsic
membránproteineknek.
Hidegérzékeny
növényeknél egy kritikus hımérsékleten a membránlipidek egy gélszerő állapotba mennek át, s ez zavart okoz a membránok mőködésében. Újabb eredmények azt mutatják, hogy a fázisátmenet hipotézis eredeti formájában arra alkalmas, hogy 17
megmagyarázza a termofil cianobaktériumok membránjainak mőködési zavarait chilling hatására (MURATA, 1989), de magasabb rendő növényeknél ez elég kétséges (MARTIN, 1987). Manapság az elfogadott álláspont, hogy az alacsony hımérsékletre érzékeny növények hidegkárosodásánál a membránlipidek nagy részénél nem történik fázisátmenet, bár elıfordulhat, hogy kisebb lipidfrakciók lokálisan fázisátalakulást szenvedhetnek alacsony hımérsékleten (QUINN, 1988). A membránösszetétel különbségei
részben
megmagyarázhatják
a
hidegérzékenységben
tapasztalt
különbségeket. Ennek közvetlen bizonyítéka az, hogy akár a hidegérzékeny Anacystis nidulans kékalgába, vagy egyes magasabbrendő növényekbe egy a lipidek telítetlenségéért felelıs gén (az ún. desA gén) bevitele a hidegtőrést jelentısen megnövelte (WADA és mtsai., 1990; ISHIZAKI-NISHIZAWA és mtsai., 1996). Hideghatás szempontjából a fotoszintetikus apparátus a növény egyik legérzékenyebb pontja. Hidegstressz hatására a leveleken klorotikus foltok jelennek meg, melynek oka, hogy alacsony hımérsékleten gátolt a klorofill molekulák bioszintézise, az etioplasztok és kloroplasztiszok fejlıdése (BERRY és BJÖRKMAN, 1980; YOSHIDA és mtsai., 1996; BÖDDI és mtsai., 1997). A
fénygátlás
(fotoinhibíció)
jelensége,
melynek
során
a
magas
fényintenzitásnak kitett növény fotoszintetizáló képessége károsodik (VASS és mtsai., 1992), alacsony hımérséklet hatására már viszonylag alacsony fényintenzitáson is felléphet. A PSII maximális kvantumhatékonyságát jelzı Fv/Fm paraméter sötétben, 5ºC-on még 2 nap után sem utalt a kukorica növények fotoszintetikus rendszerének károsodására, fényen viszont már pár órás hideghatás után lecsökkent (JANDA és mtsai., 1994; SZALAI és mtsai., 1996). Az alacsony hımérséklet által indukált fotoinhibíció nemcsak a fotoszintetikus folyamatok, hanem egyéb stresszmarkerek, mint például szabad aminosavak és poliaminok szintjén is megnyilvánul (SZALAI és mtsai.,
1997). A fénygátlás
során
fokozott
mértékben
képzıdnek
reaktív
oxigénformák. Ennek következtében felborul az egyensúly az elnyelt és a felhasznált energia között, az elektrontranszportlánc túlgerjesztett állapotba kerül. A felborult egyensúly oka egyrészt a Calvin-ciklus enzimeinek nem megfelelı mértékő aktivitása, illetve a zárt gázcserenyílások következtében kialakuló kisebb intercelluláris CO2 koncentráció (Ci). A Calvin-ciklus csökkent mőködése nyomán a NADP+ utánpótlás csökken, így az elektronok a fotoszintetikus elektrontranszportláncról az O2 18
molekulákra juthatnak, és szuperoxid gyökök keletkezhetnek. A PSII-ben kétszeresen redukált és/vagy protonált QA keletkezik, ami elhagyhatja a kötıhelyét. A P680 triplet állapotba (3P680*) kerül, ami szinglet oxigén képzıdéséhez vezethet. A szinglet oxigén károsítja a PSII-t, és a D1 protein degradációját okozza (VASS és mtsai., 1992). A fénygátlás károsító hatásainak kiküszöbölésére különbözı mechanizmusok léteznek (AROCA és mtsai., 2001). A fénygyőjtı rendszert érı gerjesztési energiafelesleg károsító hatásának kivédése bekövetkezhet egyrészt azáltal, hogy az energiának a két fotoszisztéma közötti eloszlása változik meg. Az energia felvételét és továbbítását a növény pl. a fénybegyőjtı protein-pool genetikai szintő szabályozásával, az LHC proteinek foszforilációjával és defoszforilációjával, vagy a PSII-rıl a PSI-re történı közvetlen
energiaátadással
is
tudja
szabályozni.
Másrészt
megtörténhet
az
energiafelesleg disszipációja hı formájában a violaxantin dezepoxidációja által a xantofill ciklus során keletkezı anteraxantin ill. zeaxantin segítségével. Ugyancsak az energiafelesleg elvezetését szolgálja a kloroplasztiszban az ún. víz-víz ciklus. Ennek során a PSII-bıl a vízmolekuláról származó elektronok a PSI-ben az O2 redukciójára fordítódnak, így gyakorlatilag az O2 mennyiségében nem történik változás (ASADA, 1999). A ciklus mőködtetésében antioxidáns enzimek is részt vesznek, úgymint a szuperoxid-dizmutáz (SOD), az aszkorbát-peroxidáz (APX), és a glutation-reduktáz (GR). A fénygátlás károsító hatását csökkenti továbbá a keletkezett reaktív oxigénszármazékok közömbösítése antioxidáns vegyületek és enzimek segítségével (AROCA és mtsai., 2001). Miután az alacsony hımérséklet károsító hatásának egyik fı oka a reaktív oxigénformák felhalmozódása (PRASAD és mtsai., 1994), az antioxidáns rendszer válasza különleges fontosságú a hidegstressz károsító hatásainak kivédésében. A különbözı kukorica genotípusok eltérı hidegérzékenységének hátterében részben az antioxidáns rendszer eltérı mőködése áll (PRASAD és mtsai., 1994). Kukorica levelekben a legtöbb antioxidáns enzim, úgymint SOD, APX, gvajakol-peroxidáz (POD) és GR aktivitásának növekedésérıl számoltak be, egyedül a kataláz aktivitásában mutattak ki csökkenést (LEE és LEE, 2000). A kukoricalevelek kétféle sejttípusának fentebb említett eltérı hidegérzékenysége mögött is részben az eltérı oxidatív hatás áll. A hüvelyparenchima sejtek kloroplasztiszában az O2 termelés csak kis mértékő, így szuperoxidgyök keletkezésének kisebb az esélye. A mezofill sejtekben 19
nagyobb hidrogén-peroxid koncentrációt mutattak ki (DOULIS és mtsai., 1997). Ugyancsak eltérés mutatkozik a két szövet között az antioxidánsok eloszlásában. A NADPH szintézis a mezofill sejtekre jellemzı, így a GR jelenléte is erre a sejttípusra korlátozódik, ugyanakkor az APX fıként a hüvelyparenchima sejtekben található, kataláz mindkét sejttípusban jelen van. Az alacsony hımérséklet hatására még kifejezettebb az eltérés az antioxidáns enzimek eloszlásában (PASTORI és mtsai., 2000). A mezofill sejtekben 15ºC-on fokozódik a glutation-reduktáz aktivitása, míg kataláz aktivitás már nem mutatható ki. A hüvelyparenchima sejtekben hideghatásra megnıtt az aszkorbát-peroxidáz aktivitás. Rizs növényekben alacsony hımérséklet hatására gyors növekedést tapasztaltak az APX és a POD aktivitásában. A SOD és a GR enzimek lassabb aktivitásnövekedést mutattak, míg a kataláz aktivitásában nem történt változás (OIDAIRA és mtsai., 2000). Az alacsony hımérséklethez való akklimatizáció kialakulása hormonális szabályozás alatt áll. Alacsony hımérsékleti kezelés során megnı az abszcizinsav mennyisége (JANOWIAK és DÖRFFLING, 1996). Különbözı kukorica genotípusokban kimutatták, hogy szoros összefüggés van a hidegtolerancia és az abszcizinsav akkumuláció között (JANOWIAK és mtsai., 2002), de ez lehet, hogy csak az alacsony hımérsékleten fellépı vízhiány következménye. Kimutatták, hogy a rövid idejő szárazságstressz fokozza a kukorica (SÁNCHEZ-DÍAZ és mtsai., 1993) vagy a rizs hidegtőrését (KITAGAWA és YOSHIZAKI, 1998). A kutatások külön ágát képezik azok a vizsgálatok, melyek a gazdasági növények stressztőrı képességének növelésére alkalmas vegyületek keresésére irányulnak. Az ilyen vegyületeknél kétféle megközelítés alkalmazható: vagy az adott anyag szintézisét fokozzuk, vagy külsıleg adjuk a növénynek. Az irodalomban mindkét esetre több vizsgálati eredmény is található.
20
2.1.2. Az UV-B sugárzás hatásai a növényekre
Az UV-B sugárzás (280-320 nm) viszonylag kis részét (kb. 1,5%) képezi a Föld felszínét érı teljes elektromágneses sugárzásnak, azonban már kismértékő növekedése is elegendı ahhoz, hogy a növényekben közvetlenül vagy közvetve számos olyan molekuláris szintő folyamatot befolyásoljon, amelyek
változásai a
növény
növekedésében, fejlıdési fázisainak bekövetkezésében, a primer és szekunder anyagcsere intenzitásában és arányának eltolódásában jelentkezhetnek. Mivel a növények törzsfejlıdésük során szinte állandóan ki voltak téve bizonyos mértékő UV-sugárzásnak, ezért ez a sugárzás természetes stresszfaktornak tekinthetı, és ennek megfelelıen a növények az evolúció által próbára tett védekezési mechanizmusokkal rendelkeznek a sugárzás által kiváltott károsodások kivédésére vagy kijavítására. Azonban a globális klímaváltozás egyik negatív következményeként a sztratoszférában a káros sugárzások ellen védıpajzsként funkcionáló ózonréteg vékonyodik. E negatív jelenség egyik okozója maga az ember, a fıleg ipari tevékenysége
során
kibocsátott
ózon-antagonista
gázok
-
pl.
halogénezett
szénhidrogének, nitrogén oxidok - révén (ANDERSON és mtsai., 1991; MCFARLAND és KAYE, 1992; MCKENZIE és mtsai., 1999; REDDY és HODGES, 2000). Az elmúlt években korlátozták ugyan az ózonkárosító vegyületek légkörbe bocsátását, azonban a sztratoszférikus ózonréteg vékonyodása és így a földfelszínt elérı UV-B sugárzás mennyiségének növekedése nem állt meg. Ez egyrészt arra vezethetı vissza, hogy az ózonkárosító gázok hosszú ideig tartózkodnak a légkörben, másrészt pedig arra, hogy az üvegházhatású gázok növekvı mennyisége az atmoszféra alsó részét melegíti, ami a sztratoszféra hőlését és további ózonbomlást okoz. Az ózoncsökkenés mértéke nem egyenletes a Föld különbözı pontjain, a sarkoknál a legjelentısebb, különösen a déli féltekén, bár a mérsékelt övben is megfigyelhetı egy egyenletes vékonyodás. A globális ózoncsökkenés évente átlagosan 3%-ra tehetı, amit nagymértékben befolyásol a légkörben lévı szennyezıanyagok és aeroszolok mennyisége is. A becslések szerint minden 1%-nyi ózonszint csökkenés következményeként a bioszférát elérı UV-B sugárzás 1,3 -1,8%-nyi emelkedése állhat be (MADRONICH, 1993). A káros sugárzás mértéke természetesen számos tényezıtıl függ, ilyen például az adott hely szélességi foka, tengerszint feletti magassága, az atmoszférikus viszonyok (felhıtakarás, köd, 21
pára), a felszín fényvisszaverı képessége stb. (CALDWELL, 1981). Hasonló megállapítást tettek ZEREFOS és mtsai. (1997) is, amikor több éven át mérték az UV-B sugárzást, s annak változását négy, eltérı szélességi fokon és tengerszint feletti magasságon lévı európai városban. Erısebb UV-B sugárzásra a növények válaszreakciói elsısorban fiziológiai és biokémiai szinten következnek be (HOLLÓSY, 2002). A sejteket felépítı vegyületek jelentıs része UV-abszorpcióra képes, így potenciális célpontjai az UV-sugárzásnak. A DNS-molekula az elsıdleges célpont, melynek közvetlen fotonabszorpciója két olyan folyamatot indít el, mely komoly károsodáshoz vezet. Egyrészt ugyanazon a DNSszálon ciklobután típusú pirimidin dimerek (CPD) jöhetnek létre a szomszédos pirimidin bázisok között (TT, TC, CT, CC), másrészt pedig pirimidin (6-4) pirimidon dimer fénytermékek alakulhatnak ki, melyek mutációt okozhatnak a replikáció során. Az UV-B sugárzás emellett okozhat még DNS-protein keresztkötést, DNS-száltörést, bázispárkiesést vagy –beépülést is. Az UV-B sugárzás hatására bekövetkezı DNSkárosodás 75%-a a CPD-termékek képzıdésének köszönhetı (HOLLÓSY, 2002). A sejt makromolekulái közül a fehérjék is erısen abszorbeálnak UV-B tartományban, ami elsısorban az aromás aminosavaknak (fenilalanin, triptofán, tirozin, hisztidin) köszönhetı. Az UV-B tartományban tapasztalható nagymértékő abszorpciójuk a szerkezetükben fotokémiai változásokat idéz elı, ami a növényi szövetekben számos fehérjekomponens és enzim (Rubisco, ATP-áz, violaxantindezepoxidáz, PSII, PSI) inaktiválódását eredményezi (PFÜNDEL és mtsai., 1992). Ebben közvetlen szerepet játszik az aminosavak fotokémiai átalakulása, de nagy jelentısége van a fehérjék harmadlagos szerkezetét fenntartó diszulfid-hidak fotolízisének és a reaktív szulfhidrilcsoportok képzıdésének is. Különösen érzékenyek a növényi citoszkeleton fehérjekomponensei, különösen az aromás aminosavakban gazdag mikrotubulus szerkezet, így UV-sugárzás hatására a sejtciklus (S, G1 és G2 fázisok) lelassulása figyelhetı meg. UV-B sugárzás hatására a sejtmembránok integritása is jelentısen megváltozik. A növényi membránok fı alkotói, a foszfolipidek és a glikolipidek telítetlen zsírsavakat tartalmaznak, amelyek szükségesek a membránstruktúra stabilitásához. A telítetlen zsírsavak UV-B sugárzás során O2 jelenlétében könnyen oxidálódnak és lipid-peroxid gyökök képzıdnek (HOLLÓSY, 2002). Különösen érzékenyek a kloroplasztisz belsı membránjai. A kloroplasztisz 22
tilakoidok mono- és digalaktozil-diacilglicerol alkotói közül az elızıek nagyfokú telítetlenséggel rendelkeznek, ami a membránstabilitás fenntartása szempontjából fontos tulajdonság. UV-B sugárzás során a tilakoidok monogalaktozil-diacilglicerol /digalaktozil-diacilglicerol arányának csökkenése a stabilitás csökkenését okozza (PREDIERI és mtsai., 1995). Az UV-B hatására bekövetkezı sejtmembrán-károsodás számos folyamatra hatással van a fotoszintetizáló és nem fotoszintetizáló sejtekben egyaránt. Az UV-B sugárzás hatására a szárazanyag- és biomassza-gyarapodás csökkenése is megfigyelhetı, melynek okai a szén-anyagcsere folyamataiban bekövetkezı változások. A növényi anyagcsere folyamatok közül leggyakrabban az UV-B sugárzás fotoszintézisre kifejtett hatását vizsgálták, mivel a sejtorganellumok közül az UV-B sugárzással szemben a kloroplasztisz tőnik a legérzékenyebbnek. Az UV-B sugárzásnak a fotoszintetikus apparátusra gyakorolt hatásai több komponenst és részfolyamatot érintenek. Az UV-B közvetlen hatása elsısorban a PSII károsodásában jelentkezik, de emellett csökkenhet a PSI mérete, a Rubisco-aktivitás, a CO2-fixáció és az O2-képzıdés is. Hatása a fotoszintetikus apparátus aktivitására a száraz tömegen kívül a keményítı- és a klorofilltartalom csökkenésében is kimutatható. Az UV-B sugárzás a CO2-fixációra nemcsak az elızı folyamatokon keresztül van hatással, hanem közvetve a gázcsere hatékonyságát mérséklı sztómazáródás kiváltásával, a levélbeli fényfeltételek megváltoztatásával és a diffúziós ellenállások növelésén keresztül is (a levélvastagság és levélfelépítés megváltozása). A fotoszintetikus aktivitás csökkenését egyrészt a kulcsfontosságú komponensek - pl. a D1 protein (VASS és mtsai., 1996) vagy a fotoszintetikus pigmentek (MÉSZÁROS és mtsai., 2001) - direkt fotooxidatív károsodása, másrészt a fotoszintézis szempontjából fontos gének (klorofillok, az LHC-antennaproteinek, a PSII D1 protein , ATP-szintáz, Rubisco szintéziséért felelıs gének) csökkent mértékő kifejezıdése (MACKERNESS és mtsai., 1999) okozhatja. Az UV-B sugárzás csökkenti a cab gén átírását is, mely az LHCII klorofill a/b kötı fehérjéinek szintéziséért felelıs, így hatására elmarad a funkcionális egységet alkotó LHCII és a PSII reakcióközpont összekapcsolódása. A fotoszintetizáló apparátus komponensei közül a PSII bizonyult az UV-B-vel szemben a legérzékenyebbnek, míg a PSI és a citokróm b/f-komplex jóval ellenállóbb. A PSII rendszeren belül legérzékenyebben a vízbontó Mn komplex reagál. A legújabb adatok 23
szerint a D1 protein degradációja sokkal inkább a Mn komplex inaktiválódására vezethetı vissza, mint a QA és QB akceptorok érzékenységére. A D1 protein metabolizmusa és regenerálódása nagyon komplex folyamat, mely függ a fény mennyiségétıl és összetételétıl is (BERGO és mtsai., 2003). Az UV-B sugárzás során bekövetkezı ultrastrukturális változások közül kiemelendı, hogy a kloroplasztiszban a gránum- és sztrómatilakoidok elvesztik szabályos mintázatukat, a tilakoidok egy része gyengén fellazul, kitágul. A sztróma egy része félkristályos szerkezetet vesz fel, amit az UV-B okozta vízhiány stressznek tulajdonítanak (HOLLÓSY, 2002). Sérülékeny a Calvin-ciklus kulcsenzime, a Rubisco is, egyrészt mivel elnyelést mutat az UV-tartományban, másrészt mivel az enzim nagy alegysége a kloroplasztisz DNS-ben kódolt, és az UV-B sugárzás gátolja a nagy alegység fehérjéit kódoló gének expresszióját. Mindezt azok a kísérletek bizonyítják, melyek során az UV-B megvonás hatására egyrészt a Rubisco aktivitásának, másrészt a sejten belüli koncentrációjának növekedését figyelték meg (BISCHOF és mtsai., 2002). A Rubisco gátlását azonban az UV-B/PAR arány is erısen befolyásolja. Az emelt UV-B sugárzás a Rubisco enzimet csak alacsony PAR mellett gátolja, magas PAR mellett azonban a gátlás mérsékelt, vagy nem mutatható ki. Az UV-B gátolhatja a PSI által közvetített ciklikus fotofoszforilációt is. A kloroplasztisz ultrastrukturális károsodását a keletkezı reaktív oxigéngyökök hatására bekövetkezı lipid-peroxidáció eredményezi. Az UV-B sugárzás hatására - elsısorban alacsony PAR mellett - egyes fajoknál megfigyelték a fénygyőjtı-pigment
proteinkomplexhez
kapcsolódó
fényvédı
xantofill
ciklus
kulcsenzimének, a violaxantin dezepoxidáz aktivitás csökkenését és emiatt a violaxantin-anteraxantin-zeaxantin átalakulás gátlását (PFÜNDEL és mtsai., 1992). Ezzel azonban nagymértékben növekszik a reaktív oxigénformák képzıdésének kockázata, ugyanis a zeaxantin - és valószínőleg az anteraxantin is - részt vesz a fotoszintetikus apparátusban a gerjesztési energiafelesleg hı formájában történı kisugárzásában. Az UV-B sugárzás hatására e védımechanizmusban bekövetkezı gátlás következményeként a kloroplasztisz membránok károsodása, a CO2-fixáció csökkenése és a kapcsolódó anyagcsere folyamatok zavara várható. Az UV-B gátolhatja a gerjesztési energia átvitelét a fotorendszerekben az antennapigmentek és a reakciócentrumok között (TURCSÁNYI és VASS, 2000). Az UVB sugárzás károsíthatja a fotoszintetikus pigmenteket, különösen a klorofillokat, bár 24
egyes fajoknál UV-B sugárzás hatására a fotoszintetikus pigmentek mennyiségének növekedését mutatták ki (MIDDLETON és TERAMURA, 1994). A klorofilltartalom csökkenésének az oka egyrészt a fotodestrukció, másrészt a klorofill bioszintézis gátlása. Az UV-B-vel szemben a klorofill-b érzékenyebb, mint a klorofill-a, emiatt a klorofill a/b arány növekedése az UV-B érzékenység jó indikátora lehet. A mezıgazdasági
növények
vizsgálatával
foglalkozó
tanulmányok
alapján
megállapítható, hogy az UV-B sugárzás hatására a klorofilltartalom csökkenése a kétszikő fajokban nagyobb mértékő (10-78%), mint az egyszikőekben (0-33%) (KAKANI és mtsai., 2003). Az UV-B sugárzás során fellépı CO2-asszimiláció csökkenést elıidézheti a sztóma konduktancia csökkenése is. A sztóma konduktanciában UV-B expozíció során bekövetkezı csökkenést azzal magyarázzák, hogy UV-B sugárzás hatására a sztómazárósejtek membránjának ionpermeabilitása megváltozik és a zárósejtek K+-ion koncentrációja csökken (NEGASH és BJÖRN, 1986). Az UV-B nemcsak a sztómanyitottságra lehet hatással, KOSTINA és mtsai. (2001) terepi vizsgálatai igazolták, hogy az emelt szintő UV-B sugárzás hatására a sztómaméret és a sztómasőrőség is nı. Az emelt szintő UV-B sugárzás növekedésre való hatásával kapcsolatos eredmények alapján elmondható, hogy a növények érzékenysége eltérı az egyes fejlıdési stádiumokban, így nemcsak a fiatal és idıs levelek, hanem a magoncok, a csemeték és a kifejlett, idıs növények válaszai is nagyon eltérıek lehetnek. Az UV-B sugárzás a növényi szervek közül a leveleken okozhatja a legfeltőnıbb változásokat (perzselıdés, bronzosodás, klorózis, a levélalak torzulása). A növények különbözı levélmorfológiai és anatómiai változások révén elkerülhetik, hogy az UV-B sugárzás a mélyebben elhelyezkedı asszimiláló szövetekhez nagy dózisban bejuthasson. A levélepidermisz UV-B áteresztıképessége a különbözı növénycsoportokban és termıhelyeken azonban jelentıs eltérést mutat. UV-B sugárzásnak kitett növényeken különbözı növekedési és fejlıdési rendellenességek léphetnek fel. A levélterület, amelynek nagysága
a
fényabszorpció
hatékonyságát döntıen
meghatározza,
legtöbbször jelentısen csökken, egyes fajoknál akár 60%-kal is (KULANDAIVELU és mtsai., 1997). Ugyanakkor a levelek vastagságában vagy a hajtáshosszban fajtól függıen pozitív és negatív irányú változásokat egyaránt megfigyeltek (JOHANSON és 25
mtsai., 1995). SANTOS és mtsai.(1993) levél vékonyodásról számoltak be a nagyobb UV-B kitettség következményeként. A növekedési rendellenességek molekuláris okai a DNS és/vagy a fitohormonok szerkezetében bekövetkezı változások. A megnyúlásos növekedést stimuláló fitohormon, az indolecetsav (IES) az UV-B-tartományban jól abszorbeál, és ennek következményeként fotolitikusan bomlik. Az IES-koncentráció csökkenése és a bomlás során képzıdı gátló hatású termék (3-metilén-oxindol) pedig csökkenti a hosszanti növekedést (ROS és TEVINI, 1995). Az UV-B sugárzásnak a növekedésre és a fejlıdésre gyakorolt hatását kapcsolatba hozzák az etilénprodukció megemelkedésével (PREDIERI és mtsai., 1995) is. Az UV-B hatására növekszik a peroxidázok (pl. IES-oxidáz) aktivitása is, amelyek meghatározó szerepet játszanak a sejtmegnyúlás csökkentésében és az oxidatív gyökök közömbösítésében. Az UV-B hatására csökken a gyökér/hajtás arány is (POULSON és mtsai., 2002), ami a fajok közötti kompetíciós viszonyokat és egyes fajoknál a mikorrhizagyökér kapcsolatok kialakulását is befolyásolhatja (VAN DE STAAIJ és mtsai., 2001). Az UV-B sugárzás hatására a növény föld feletti részein kisebb levelek, rövidebb hajtás, de több hajtás és több levél kialakulása jellemzı. Az UV-B sugárzás során változás léphet fel a virágzási idıben és idıtartamban (STAXÉN és BORNMAN, 1994), sıt a virágok számában is. Dél-Amerikában, különösen Chilében, ahol az UV-B sugárzás jelentısen emelkedett az elmúlt években, a kukorica esetében a porzós és a termıs virágok érésének aszinkronitása ma is aktuális problémát jelent. BARNES és mtsai.(1990) és TEVINI (1993) tanulmányaikban arról tesznek említést, hogy a mesterséges körülmények között alkalmazott nagyobb UV-B sugárzás a kukorica virágzási idejét 2-3 nappal késlelteti, valamint szignifikánsan növeli a portok falában a sugárzást abszorbeáló pigmentek mennyiségét, és hatással van a pollen termékenyítı képességére is (SANTOS és mtsai., 1998). Az UV-B sugárzásnak a kukorica pollenre gyakorolt negatív hatásáról számolt be WALBOT (1999) is. Többek között megállapította, hogy a károsítás mértéke nagymértékben a sugárzás idıtartamától függ. Transzgénikus Bt kukoricákkal végzett kísérletek eredménye viszont az, hogy a hosszabb ideig tartó UV-B kezelés a pollen rovarral szembeni toxicitására nincs hatással (OHLFEST és mtsai., 2002). FLINT és CALDWELL (1984) megállapította, hogy a portok fala az UV-B abszorbeáló pigmentek nagymértékő felhalmozódásának köszönhetıen az UV-B közel 80%-át képes elnyelni. A bibére 26
kerülı pollent azonban az UV-B közvetlenül károsíthatja, és ez különbözı rendellenességeket okozhat nemcsak a megtermékenyítés folyamatában, hanem a fejlıdı növény tulajdonságaiban is. A levelek epidermisze az elsı, napsugárzásnak közvetlenül kitett szövet, amely azonban a belsı szövetekbe bejutó fény mennyiségét és összetételét képes megváltoztatni. Fontos szerepe van az UV-B sugárzás károsító hatásaival szembeni védelemben, és hatékonysága függ a levélfelszín sajátosságaitól (kutikula, viasz felhalmozódás, levélszırök), valamint az UV-B abszorbeáló pigmentek jelenlététıl (flavonoidok, antociánok). Fényáteresztı képessége fordítottan arányos az UV-B szőrı pigmentek mennyiségével és a levélvastagsággal (DAY és mtsai., 1992). A levélfelszíni tulajdonságok és velük együtt az UV-B áteresztı képesség még ugyanazon faj, ill. levél esetében is nagy változatosságot mutat a fejlıdési fázisoktól vagy a térbeli elhelyezkedéstıl függıen. Fiatal, fejlıdı levelek mindkét oldalukon szırözöttek, a fejlıdés során azonban az adaxiális oldalon lévı szırök folyamatosan eltőnnek (KARABOURNIOTIS és mtsai., 1992). Az epikutikuláris viaszok felhalmozása a növények fontos védelmi mechanizmusa, ami csökkenti egyrészt a transzspirációs vízvesztést, másrészt pedig a levelek belsejébe bejutó UV-B sugárzást. Az UV-B sugárzás hatására a DNS-molekulában képzıdı ciklobután típusú pirimidin dimerek (CPD) javítása a fotoreaktiváció során megy végbe. A javító mechanizmus a DNS-fotoliáz nevő enzimhez kötıdik, amely fényfüggı, és mivel a 370-450 nm közötti tartomány (kék/UV-A) energiáját használja fel a CPD-k monomerizálásához, ezért elmondható, hogy az UV-A sugárzás jelenléte a javító mechanizmus hatékonyságát nagymértékben meghatározza (QUAITE és mtsai., 1992). Az UV-B abszorbeáló aminosavak átalakulása miatt ez a javító kapacitás csökkenhet, különösen az epidermiszben lokalizálódó fotoliáz esetében. A kloroplasztiszokban az UV-B sugárzás hatására bekövetkezı fotoszintézis aktivitás-csökkenés miatt jelentısen megnövekszik a felesleges gerjesztési energia kisugárzásában résztvevı fotoprotektív folyamatok (pl. xantofill ciklus) szerepe. Nagyobb UV-B dózis vagy hosszan tartó UV-B expozíció során azonban e folyamatok kimerülhetnek vagy sérülhetnek, és reaktív oxigénformák (hidroxil- és szuperoxid gyökök, hidrogén-peroxid) képzıdhetnek (MÉSZÁROS, 2003). A szuperoxid gyökök fıleg a PSI és a PSII közelében keletkeznek, míg a hidroxil gyökök és a H2O2 27
mennyisége a tilakoid membránok sztróma felıli oldalán emelkedik meg. A reaktív oxigénformák, mint másodlagos stressztényezık a sejtmembrán-lipidek peroxidációját okozzák (DAWAR és mtsai., 1998), mellyel szemben a szuperoxid-dizmutáz (SOD) nyújt védelmet. A peroxidázok és katalázok mőködése szorosan kapcsolt a SOD aktivitásával. Az UV-B sugárzás által generált reaktív oxigénformákkal szembeni biokémiai védelemben fontos szerepe van a nem enzimatikus antioxidánsoknak, az αtokoferolnak (E vitamin), a glutationnak (GSH), az aszkorbinsavnak, a ß-karotinnak és a flavonoidoknak is. A növényekben az UV-B sugárzás által kiváltott legáltalánosabb válaszreakció a flavonoidok felhalmozódása (DAY és mtsai., 1992; LÁPOSI és mtsai., 2002) elsısorban az epidermiszben. A flavonoidok az edényes növényekben széles körben elterjedt vízoldékony fenolszármazékok, melyek 280-320 nm között erıs elnyelést mutatnak, abszorpciós maximumuk 300 nm körül van, és hosszú idın keresztül stabilak maradnak. Az UV-B sugárzás hatására (de a PAR és az UV-A hatására is), ha nem túlságosan nagy a dózisa, fokozódik azon gének kifejezıdése (BUCHHOLZ és mtsai., 1995), melyek a flavonoidok bioszintéziséért felelıs kulcsenzimeket (PAL, CHS) kódolják. A flavonoidok számos csoportja közül a legelterjedtebbek és legjelentısebbek a flavonolok, a flavonok és az antocianinok. A flavonoidok a fenilpropanoid anyagcsereút során képzıdnek (1. ábra) az epidermisz és mezofillum sejtek citoplazmájában, és az adaxiális levélepidermisz vakuólumaiban vagy a levélszırökben halmozódnak fel (HUTZLER és mtsai., 1998) rendszerint O-glikozidok formájában (KARABOURNIOTIS és mtsai., 1992), esetleg a pollenekben, a termı- és porzótáj egyes részeiben, a vakuólumokban és a sejtfalban. A kétszikőek többségére (pl. bab, szója, borsó, mustár, petrezselyem) általában a flavonoidok epidermális felhalmozódása jellemzı, míg az egyszikőek nagy részénél (pl. árpa, rozs, kukorica, rizs) az epidermiszben és a mezofillumban egyaránt felhalmozódnak. A flavonoidok UV-B sugárzás során nemcsak epidermális szőrıként játszanak fontos védıszerepet, hanem részt vesznek a reaktív oxigénformák eltávolításában is (CHALKER-SCOTT, 1999).
28
1. ábra. Flavonoid formák eredete növényekben
UV-B kezelés során az oxidatív károsodás megelızésében elıször az antioxidáns enzimek (SOD, kataláz, APX) aktivitása növekszik, majd további UV-B expozíció során fokozódik a flavonoid-felhalmozódás, mely vegyületcsoport hatásának végeredménye azonos az antioxidáns enzimekével (DAWAR és mtsai., 1998). A 29
szekunder metabolitok különbözı csoportjai közül a flavonoidok rendelkeznek a legnagyobb számú hidroxilcsoporttal, ezek jelenlétének tulajdonítható gyökfogó képességük. A reaktív oxigénformák eltávolításával részt vesznek az oxidatív károsodások elkerülésében és így stabilizálják a membránstruktúrát, gátolják a lipidperoxidációt. Az elmúlt kb. 20 év vizsgálatai alapján világosan látszik, hogy az UV-B sugárzás
leggyakoribb
hatása
az
UV-B
szőrı
pigmentek
mennyiségének
növekedésében nyilvánul meg (ROZEMA és mtsai., 2002), és ez hatékony védelmet nyújthat a növényekben lévı érzékeny célpontoknak, mint pl. a fotoszintetikus apparátusnak. Ez a védelem gyorsan aktiválható, széles skálán mozog, de fajonként eltérı. Éppen ezért az UV-B sugárzás károsító hatása a növények növekedésére, a fotoszintetikus
folyamatokra
(levél
gázcsere
és
klorofill-fluoreszcencia),
a
fotoszintetikus pigmentek koncentrációjára (klorofillok és karotinoidok) nem minden fajnál jelentkezik egyértelmően (SEARLES és mtsai., 2001). A napsugárzás napszakos és évszakos fluktuációja során az UV-B sugárzás magas értékei együtt jelentkeznek a fotoszintetikusan aktív sugárzás (PAR) nagy intenzitásával, és ez utóbbi önmagában is képes a fotoszintetikus apparátus károsítására és fotoinhibíció elıidézésére. Az UV-B sugárzás hatása nagymértékben függ a fotoszintetikusan aktív sugárzás szintjétıl (MEIJKAMP és mtsai., 2001). A növények jóval érzékenyebben reagálnak az UV-B sugárzásra, ha a nevelıkamrákban kisebb a látható fény és az UV-A intenzitása, mint a természetes napsugárzási feltételek között (MIDDLETON és TERAMURA, 1994; MÉSZÁROS és mtsai., 2000). Ezért a nevelıkamrás UV-B expozíciós kísérletek eredményei alapján csak korlátozott mértékben vonhatók le következtetések a termıhelyi hatásokat illetıen. Megfigyelték, hogy minél magasabb a kísérletekben a PAR szintje, annál kisebb mértékő az UV-B sugárzás génszintő hatása a fotoszintetikus rendszerekre (STRID és mtsai., 1994). A különbözı növényfajok az UV-B sugárzással szemben igen eltérı érzékenységet mutatnak. Az evolúció során a termıhely ökológiai adottságaitól függıen szelektálódtak ki a magasabb UV-B szintet tolerálni képes fajok. Számos szerzı tanulmányozta a megemelkedett UV-B sugárzás kultúrnövényekre gyakorolt hatását szántóföldi és üvegházi körülmények között. KAKANI és mtsai. (2003) 30
összefoglaló munkája szerint a leggyakrabban vizsgált növények a rizs (DAI és mtsai., 1994), a szója (YANQUN és mtsai., 2003), búza (DAWAR és mtsai., 1998), bab (BOLINK és mtsai., 2001), lóbab (MEIJKAMP és mtsai., 2001), borsó (MACKERNESS és mtsai., 1999), árpa (LIU és mtsai., 1995), napraforgó (ROS és TEVINI, 1995), dohány (IZAGUIRRE és mtsai., 2003), uborka (BALLARÉ és mtsai., 1991), melyek tanulmányozása során jelentıs különbségeket tapasztaltak faj, fajta és populáció tekintetében is az UV-B sugárzás növekedésre, fotoszintézisre és a terméshozamra vonatkozó hatásaival kapcsolatban. Egyértelmő tendenciák a megfigyelt paraméterek esetében nem voltak kimutathatóak. Ugyanazon biokémiai/fiziológiai/növekedési paraméter esetében egyaránt megfigyeltek drasztikus csökkenést (DAI és mtsai., 1994), semleges hatást (TERAMURA és MURALI, 1986) és stimulációt is (TERAMURA és mtsai., 1990). Azonban kísérleti növényként e témában viszonylag kevés tanulmányban találkozhatunk az egyik legfontosabb gazdasági növényünkkel, a kukoricával. HART és mtsai. (1975), SANTOS és mtsai. (1998) a megemelkedett UV-B sugárzásnak a kukorica virágzásának idıtartamára, PFAHLER (1981) a pollen csírázóképességére és a pollentömlı növekedésére, VU és mtsai. (1982), SANTOS és mtsai. (1990) a szénhidrát akkumulációra, BASIOUNY és mtsai. (1978), SANTOS és mtsai. (1993) pedig a levél klorofill és az összes oldható fehérje mennyiségére gyakorolt hatását vizsgálták. CASATI és WALBOT (2003, 2005), valamint LONG és mtsai. (2003) tanulmányaikban a kukorica epidermisz UV-B sugárzás abszorbeálásában szerepet játszó pigment- és viaszrétegének fontosságát hangsúlyozták. BARZIG és MALZ (2000) csemegekukorica levelek mintáit vizsgálva megállapították, hogy a magas UV-B sugárzás nem okozott számottevı károsodást. Ugyanakkor az epidermális sejtrétegek kb. egyharmadánál történı változások - sejtfal és membrándeformálódások - arra figyelmeztetnek, hogy a tolerancia nem véges. TERAMURA és SULLIVAN (1994) a kukoricát az UV-B sugárzásra érzékeny fajok közé sorolta. A mezıgazdasági növények vizsgálata során kapott eredményekkel közelebb kerültünk az UV-B sugárzás hatásainak megértéséhez. A teljesség igénye nélkül megemlítendı ezek közül az UV-B sugárzás potenciális molekuláris célpontjainak meghatározása (STRID és mtsai., 1994), az UV-B akciós spektrumának meghatározása a PSII károsodásában, a karotinoidok és flavonoidok szerepe az UV-B sugárzás elleni 31
védelemben, az UV-B génszintő hatása a klorofill bioszintézisre, antioxidáns rendszerek szerepe az UV-B alatti lipid peroxidáció kivédésében (BARABÁS és mtsai., 1998; HIDEG és mtsai., 2002), a reaktív oxigéngyökök szerepe a génaktivációban (MACKERNESS és mtsai., 1999), vagy az UV-B sugárzás növényi hormonokra gyakorolt hatása (ROS és TEVINI, 1995). Az UV-B sugárzás hatására indukálódó kék és zöld fluoreszcencia - mely fajonként eltérı, és amelyet pl. a flavonoidok, a ferulasav, a különbözı fenolvegyületek, NADPH- és flavinnukleotidok sugároznak ki - jól tükrözi a növény fiziológiai állapotát, és detektálása lehetıséget nyújt az UV-B sugárzás hatására felhalmozódó vegyületek elhelyezkedésének megállapítására mezıgazdasági növényekben is (HIDEG és mtsai., 2002).
2.2. Az oxidatív stressz A legtöbb stresszhatás - így az alacsony hımérsékleti és UV-B stressz is közvetve vagy közvetlenül oxidatív károsodással jár együtt. A reaktív oxigénformák az aerob anyagcsere eredményeként különbözı mértékben minden növényben jelen vannak. Stressz hatására azonban jelentısen megnıhet a reaktív oxigénformák (ROS – reactive oxygen species) koncentrációja a sejtekben. Amennyiben ez a növekedés nagymértékővé válik, a reaktív oxigénformák a legtöbb biomolekulával, elsısorban nukleinsavakkal, lipidekkel, fehérjékkel és szénhidrátokkal reakcióba lépve azokat károsítják, mely folyamat akár a sejt pusztulásához is vezethet (HASEGAWA és mtsai., 2000).
2.2.1. A reaktív oxigénformák típusai Gerjesztési energia hatására a molekuláris oxigénbıl szinglet oxigén (¹O2) keletkezik. Ez vizes közegben 4 µs ideig van jelen, majd átadja gerjesztési energiáját, illetve reakcióba lép egyes biológiai vegyületekkel és endoperoxidokat, vagy hidroperoxidokat hoz létre. Egy elektron felvételével a molekuláris oxigénbıl szuperoxid-aniongyök (O2˙‾) keletkezik, mely kinonokat vagy átmeneti fémkomplexeket (Fe3+, Cu2+) redukálhat, így befolyásolva egyes fémtartalmú enzimek aktivitását. Ez közepesen reakcióképes, 32
rövid féléletidejő (2-4 µs) ROS, mely nem jut át a sejtmembránon. Vizes oldatban egy proton felvételével hidroperoxil gyökké (HO2·) alakul, mely már át tud jutni a sejtmembránon és hidrogén atomok elvonásával lipid autooxidációt indíthat A szuperoxid-gyök további elektronfelvétellel hidrogén-peroxiddá (H2O2) alakulhat (VRANOVÁ és mtsai., 2002). A hidrogén-peroxid közepes reakcióképességő, viszonylag hosszú (1 ms) féléletidejő molekula, amely bizonyos távolságra membránokon keresztül is képes diffundálni. Tiol-csoportjuk oxidációja által enzimeket is inaktiválhat (pl. Cu/Zn-SOD, Fe-SOD). A legreaktívabb oxigénforma a hidroxil-gyök (OH˙), mely hidrogén-peroxidból keletkezik a Haber-Weiss vagy Fenton reakció során fém katalizátor jelenlétében. A fémionok általában oxidált formában fordulnak elı a sejtekben. Szuperoxid-gyök jelenlétében azonban redukálódnak és így képessé válnak arra, hogy a hidrogénperoxid átalakulását katalizálják hidroxil-gyökké. A hidroxil-gyök bármely biológiai molekulával képes reakcióba lépni, túlzott termelıdése a sejt halálához vezet. A sejtek nem rendelkeznek olyan enzimmel, mely képes lenne eliminálni a hidroxil-gyököt, ezért fontos, hogy szigorú szabályozás alatt álljon a hidrogén-peroxid és a szuperoxidgyök mennyisége a sejtekben.
2.2.2. Az antioxidáns védekezırendszer Az
antioxidáns
komponensekre
védekezırendszert
különíthetjük
el.
A
enzimatikus
nem-enzimatikus
és
nem-enzimatikus
rendszert
antioxidáns
tulajdonságú vegyületek alkotják, melyek lehetnek vízben oldódók, ezek közül kiemelt fontosságú a glutation (GSH, γ-glutamil-ciszteinil-glicin) és az aszkorbinsav, illetve zsírban oldódók, mint például az α-tokoferol, vagy a β-karotin. Az enzimatikus elemek egy része (APX, GR) e vegyületek reakcióit, vagy regenerációját katalizálva vesz részt a reaktív oxigénformák eliminálásában. A legfontosabb enzimatikus antioxidánsokat több nagy rendszerbe sorolhatjuk, amelyek a reaktív oxigénformák keletkezésének helyén fordulnak elı. Ide tartoznak pl. a SOD-ok, a víz-víz ciklus, az aszkorbátglutation ciklus, a katalázok, és a glutation-peroxidáz ciklus (MITTLER, 2002; HOLUIGUE és mtsai., 2007). 33
2.2.2.1. Szuperoxid-dizmutázok A szuperoxid-dizmutázok (SOD; EC 1.15.1.1) az oxidatív károsodás elleni védelem elsı vonalát alkotó fém-tartalmú enzimek, melyek a szuperoxid gyököket alakítják át hidrogén-peroxiddá az alábbi reakció alapján: 2 O2.-+ 2 H+→ O2 + H2O2 Minden aerob szervezetben megtalálhatók, növényekben a fém kofaktor alapján háromféle SOD-ot különböztetünk meg: • Cu/Zn-SOD, mely elsısorban a citoszolban, de a kloroplasztisz sztrómában és a peroxiszómában is megtalálható, • Mn-SOD, mitokondriális és peroxiszomális enzim, • Fe-SOD, csak egyes fajok kloroplasztiszaiban azonosították eddig (BUENO és mtsai., 1995).
2.2.2.2. A víz-víz ciklus A víz-víz ciklus lényege, hogy a fotoszintetikus elektrontranszportláncon a PSIen
keresztül
érkezı
elektronok
egy
része
molekuláris
oxigénre
kerülhet
szuperoxidgyököt képezve. Ezt a SOD alakítja hidrogén-peroxiddá, melyet egy, a kloroplasztisz tilakoidmembránjában lokalizált APX monodehidro-aszkorbinsav képzıdése mellett alakít vízzé. Az így keletkezett monodehidro-aszkorbinsav a PSI ferredoxinja segítségével redukálódik ismét (ASADA, 1999).
34
2.2.2.3. Az aszkorbát-glutation ciklus A kloroplasztiszokban nincs katalázaktivitás, így az ott keletkezı H2O2 -ot az ún. aszkorbát-glutation ciklus semlegesíti (2. ábra). A folyamat elsı lépéseként a keletkezett hidrogén-peroxidot a kloroplasztiszok sztrómájában lokalizált APX monodehidro-aszkorbinsavvá
redukálja
aszkorbinsav
felhasználásával.
A
monodehidro-aszkorbinsav egyrészt spontán aszkorbinsavvá és dehidroaszkorbinsavvá diszproporcionálódik, másrészt NADPH-függı monodehidro-aszkorbinsav-reduktáz segítségével közvetlenül aszkorbinsavvá alakulhat. A diszproporció során keletkezett dehidroaszkorbinsav redukcióját a dehidroaszkorbinsav-reduktáz végzi redukált glutation (GSH) hidrogénjének kárára. Az így keletkezett oxidált glutation (GSSG) redukcióját a GR enzim végzi NADPH felhasználásával. E rendszer enzimei és szubsztrátjai nemcsak a kloroplasztiszban, hanem más sejtkompartmentekben is megtalálhatók (KLAPHECK és mtsai., 1990).
2. ábra. Az aszkorbát-glutation ciklus (Mittler, 2002, Trends in Plant Science alapján).
2.2.2.4. Aszkorbát-peroxidázok Az aszkorbát-peroxidázok (EC 1.11.1.11) vastartalmú fehérjék, melyek kulcsszerepet játszanak az oxidatív stressz elleni védelemben (SHIGEOKA és mtsai., 2002). Szemben számos gvajakol-peroxidáz (EC 1.11.1.7) izoenzimmel, melyek a vakuólumban, sejtfalban vagy a citoszolban találhatók, az APX-ok a citoszolon kívül több elkülönült sejtkompartmentben, a kloroplasztisz sztrómájában ill. tilakoid 35
membránjában, mikroszómákban, úgymint glioxiszómában és peroxiszómákban, vagy membránhoz kötötten helyezkednek el. Mitokondrium membránhoz kötött, ill. kloroplasztiszok tilakoidmembránjának lumenében lokalizált APX jelenlétét is igazolták. Az APX-ok zöme nagy specifitással rendelkezik aszkorbinsavra, mint elektrondonorra nézve, bár egyes izoenzimek bizonyos mértékben képesek mesterséges donorokat (pirogallol, gvajakol) is használni. Jellemzı rájuk, hogy különösen fotooxidatív körülmények között aszkorbinsav hiányában aktivitásukat veszthetik. Aszkorbinsav jelenlétében a következı reakciót katalizálják: 2 aszkorbinsav + H2O2→ 2 dehidroaszkorbinsav + 2 H2O Jelenlegi ismereteink szerint Arabidopsis növényekben az Apx géncsaládot két citoszolikus
(AtApx1,
AtApx2),
két
peroxiszómás
(AtApx3,
AtApx4)és
két
kloroplasztidális gén (egy tilakoidkötött, tAtApx és egy sztróma-lokalizált, sAtApx) alkotja (SHIGEOKA és mtsai., 2002). Ezzel szemben rizsben jelenleg 8 Apx gén, két citoszolikus, két peroxiszómás és két kloroplasztidális ismert (TEIXEIRA és mtsai., 2004), paradicsomban pedig feltehetıen 7 Apx gén található.
2.2.2.5. Glutation-reduktázok A glutation-reduktázok (EC 1.6.4.2) NADPH-függı heterotetramer enzimek, melyek a következı reakciót katalizálják: GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+ Növényekben a GR aktivitás nagy része a kloroplasztiszokban mutatható ki (BIELAWSKI és JOY, 1986), de azonosították a mitokondriumban, a peroxiszómákban és a citoszólban is (FOYER és mtsai., 1991; HOLUIGUE és mtsai., 2007). A fentebb említett aszkorbát-glutation cikluson kívül a citoszolban és a peroxiszómákban részt vesz az ún. glutation-peroxidáz ciklusban is a
glutation-peroxidáz enzim
hidrogéndonoraként szolgáló redukált glutation (GSH) regenerációja által (HOLUIGUE és mtsai., 2007). Borsólevélben több izoenzimét is kimutatták (EDWARDS és mtsai., 1990). Stresszhatásra általában növekedés tapasztalható az enzim aktivitásában, 36
melynek szerepe lehet a tolerancia kialakulásában (FOYER és mtsai., 1991). Egyes vizsgálatok szerint a kukorica hidegtőrése szoros összefüggést mutat a GR aktivitásával. Gátolt enzimaktivitás hatására csökken a növények hidegtőrése (KOCSY és mtsai., 2000), míg a hidegtőrés indukciója során a GR aktivitása megnı (KOCSY és mtsai., 2001). Transzgenikus nyárfa növényeken végzett vizsgálatokból kitőnik, hogy a glutation-reduktázt túltermelı növények fokozott ellenállóságot mutatnak a fotoinhibícióval szemben (FOYER és mtsai., 1995). Ugyanakkor az összglutation szint növelése a glutation-szintetáz enzimet túltermelı transzgenikus növényekben nem eredményezett hasonlóan fokozott stressztoleranciát (FOYER és mtsai, 1995).A GR szerepe nem egyszerően a hidrogén-peroxid detoxifikációjában rejlik, hanem a redukált:oxidált glutation (GSH:GSSG) arány finom szabályozásával részt vesz a sejt redox állapotának kialakításában, a védekezı folyamatok beindításában (FOYER és mtsai., 1991).
2.2.2.6. Katalázok A katalázok (EC 1.11.1.6.) a hidrogén-peroxid dizmutációval történı közömbösítését végzik az alábbi reakció alapján: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 A H2O2 koncentrációtól függıen azonban a kataláz enzimnek kétféle lehetséges mőködése van (DEISSEROTH és DOUNCE, 1970). Magas H2O2 koncentráció mellett a fent leírt gyorsabb, ún. katalitikus módon mőködik. Ennek során mind a donor, mind pedig az akceptor szerepét a H2O2 tölti be, így a kataláz egyszerre két molekula H2O2-t képes közömbösíteni, és ehhez nem igényel redukáló erıt. Alacsony hidrogén-peroxid koncentráció (<10-6 M) mellett viszont, az ún. peroxidatikus út mőködik, ahol különbözı vegyületek (etanol, aszkorbát, RH2) tölthetik be a hidrogén-donor szerepét az alábbi reakció szerint: RH2 + H2O2→ R + 2 H2O
37
A kataláz széles körben elterjedt enzim, mely aerob baktériumoktól kezdve a magasabb rendő növényekig és állatokig minden élılényben elıfordul. A kataláz négy alegységbıl felépülı hem-tartalmú enzim. Elıfordul homo-, illetve heterotetramerként is. A különbözı alegységek expressziója fejlıdés- és szövetspecifikus. A növényi katalázokat egy kis géncsalád kódolja, mely általában három, de legfeljebb négy izoenzim génbıl áll. Kukoricában és dohányban jól ismert a különbözı izoformák elıfordulása, expressziójuk szabályozása (SCANDALIOS és mtsai., 1997). Kukoricában három, egymástól független gént (cat1, cat2 és cat3) találtak, melyek biokémiailag különbözı kataláz enzimeket kódolnak (kataláz1, kataláz2 és kataláz3). A kataláz1 és kataláz2 izoenzimek a glioxiszómákban vagy peroxiszómákban, míg a kataláz3 fehérjék a mitokondriumban találhatók. Ez utóbbi C-terminálisáról hiányzik a feltételezett peroxiszomális lokalizációs szignál (SRL motivum: Ser-Arg-Leu). Ugyanez figyelhetı meg a rizs KatA és az árpa kataláz2 fehérjék esetében is, melyek aminosav-szekvenciájukban nagy hasonlóságot mutatnak. Ezt a fajta kataláz izoenzimet eddig csak egyszikőekben mutatták ki. A kataláz1 és kataláz2 izoenzimek elıfordulnak
homotetramerként,
de
ahol
mindkét
gén
expresszálódik,
heterotetramereket is alkothatnak alegységeik. A kataláz3 in vivo csak homotetramer lehet, mert térben elkülönül a másik két izoformától. A háromféle izoenzim közül a kataláz3 biokémiai tulajdonságai térnek el a leginkább a többitıl. Egyrészt nagyobb peroxidatikus aktivitással bír, mint a kataláz1 vagy a kataláz2. A katalitikus és a peroxidatikus út aránya (RP/C) jellemzi az egyes kataláz enzimeket. A kataláz2 esetében ez RP/C = 0,25, tehát az enzim inkább a katalitikus úton mőködik, míg kataláz3 esetében (RP/C = 17,6) a peroxidatikus út dominál. Másik jelentıs különbség, hogy különféle gátlószerekkel szemben (aminotriazol, cianid, stb.) ellenállóbbnak bizonyul a kataláz3. A kataláz gének expressziója egyrészt változik az egyedfejlıdés során, másrészt a különbözı szövetekben, illetve sejttípusokban is eltérı lehet (SCANDALIOS és mtsai., 1997). A kukorica levélben például a kataláz1 és a kataláz3 izoenzim a mezofillsejtekben fordul elı, a kataláz2 pedig a hüvelyparenchima sejtek peroxiszómáiban (TSAFTARIS és mtsai., 1983). Részletesen vizsgálták különbözı kezelések, stresszek hatását a kataláz enzim expressziójára, és megállapították, hogy az egyes izoenzimek eltérıen reagálnak. Külsıleg alkalmazott H2O2 hatása 38
koncentrációfüggı volt. Alacsony H2O2 koncentráció (1 mM) serkentette a cat1 expresszióját, míg magasabb koncentrációk hatására alacsony szintre csökkent. A cat2 expressziója ellenben 10 mM H2O2 felett mutatott indukciót. Alacsony hımérséklet (14ºC, illetve 4ºC) hatására megnıtt a kataláz mennyisége. Ez elsısorban a cat1 indukciójából ered, a kataláz2 növekedése kisebb mértékő (SCANDALIOS és mtsai., 1997). A hidrogén-peroxid lebontásban a kataláznak elsıdleges szerepe van (WILLEKENS és mtsai., 1997). A katalázhiányos transzgenikus dohánynövényeken alacsony fényintenzitás mellett nem látszott kóros elváltozás, magas fényintenzitáson viszont szöveti elhalás történt, ami a fotorespiráció következménye volt. A nekrózis során a H2O2 szint nem emelkedett meg, a kataláz hiányát ebbıl a szempontból kompenzálta a megemelkedett APX és POD aktivitás. Ellenben a sejt redox egyensúlya nem maradt fenn a kataláz hiányában: az oxidált glutation felhalmozódott, és az aszkorbát szint negyedére csökkent (WILLEKENS és mtsai., 1997). A katalázhiányos transzgenikus dohánynövények továbbá érzékenyebbnek bizonyultak a parakvát- só- és ózonstresszre, viszont az alacsony hımérséklettel szemben nem mutattak nagyobb érzékenységet (WILLEKENS és mtsai., 1997).
2.2.3. A reaktív oxigénformák élettani szerepe A sejtekben keletkezı reaktív oxigénformák mennyiségét - a fentebb leírtak alapján is látható módon - összetett antioxidáns védekezı mechanizmusok szabályozzák. A reaktív oxigénformáknak sejtkárosító hatásuk mellett azonban szerepük lehet jelátviteli folyamatokban is, elsısorban az antioxidáns és más védekezı mechanizmusok beindításában (PRASAD és mtsai., 1994; FOYER és mtsai., 1997). Az antioxidánsok tehát nemcsak megakadályozzák a reaktív oxigénformák nagy mennyiségő felhalmozódását, hanem lehetıvé teszik kis koncentrációváltozások érzékelését, finom szabályozását. Az elmúlt években számos esetben igazolták a reaktív oxigénformák génexpresszió-reguláló szerepét többek között biotikus stresszfolyamatok (ALVAREZ és mtsai., 1998), ózonstressz (LANGEBARTELS és mtsai., 2002) vagy pl. fénystressz (KARPINSKI és mtsai., 1999; VANDENABEELE és mtsai., 2003; VANDERAUWERA és mtsai., 2005) során. Külsıleg adott abszcizinsav hatására 39
megnı a H2O2 mennyisége, így feltételezik, hogy a H2O2 szerepet játszhat a különbözı abszcizinsav-hatások közvetítésében, mint pl. a cat1 expresszió, vagy a sztómazáródás indukciójában. A hidrogén-peroxid számos különbözı stresszhatás következtében aktiválódó jelátviteli folyamat közös komponense, így szerepe lehet a kereszttolerancia jelenségének kialakulásában (PASTORI és FOYER, 2002). Dohány, paradicsom és nyír fajokban az ózon-indukált sejthalált hidrogén-peroxid felhalmozódás elızi meg, ezzel szemben Arabidopsis, Rumex és Malva fajok esetében a szuperoxid-gyök a felhalmozódó reaktív oxigénforma (WOHLGEMUTH és mtsai., 2002). Szójababban a NO és a H2O2 aránya volt döntı a sejthalál indukciójában (OVERMYER és mtsai., 2003). Biotikus stresszválaszok mellett úgy tőnik, hogy abiotikus stresszek esetén is szerepet játszhat a membránkötött NADPH-oxidáz. Kukoricában kimutatták, hogy ozmotikus stresszhatásra, illetve külsıleg adott abszcizinsav hatására megnı a NADPH-oxidáz aktivitása (JIANG és ZHANG, 2002). Ezzel együtt megnıtt a levelek szuperoxid-gyök tartalma, és számos antioxidáns enzim aktivitása fokozódott (szuperoxid-dizmutáz, kataláz, aszkorbát-peroxidáz és glutation-reduktáz).
2.3. A növények fluoreszcencia sajátságai
A növényekben elıforduló anyagok nagy része megfelelı hullámhosszú gerjesztés hatására fluoreszkálni képes. UV-gerjesztés hatására a levelek a kék spektrális tartományban 440 és 460 nm között emissziós maximumot (F440), illetve a zöld tartományban 520 és 530 nm körül egy változó mértékben jelentkezı vállat (F520) mutatnak (CHAPPELLE és mtsai., 1984; STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A zöld levelekben a kék és zöld fluoreszcencia elsısorban a klorofillmentes epidermiszsejtekbıl és a legnagyobb levélerekbıl, sejtfalakból származik (LANG és LICHTENTHALER, 1994; STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A mezofill sejtekben kék és zöld fluoreszcencia emissziót nem, vagy alig tapasztalunk, mert azt a mezofillsejtek fotoszintetikus pigmentjei részben, vagy egészben abszorbeálják (STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A reabszorpció a zöld fluoreszcenciát kevésbé érinti, ezért az a kék fluoreszcenciához képest az erek közötti területen intenzívebb, mint az
40
edénynyalábokban, de mindezzel együtt is csak esetenként magasabb, mint a kék fluoreszcencia intenzitása (LICHTENTHALER és mtsai., 1996). SCHWEIGER (1999) vizsgálatai 21 különbözı növényfajban azt mutatták, hogy jelentıs kék fluoreszcencia kibocsátó a sejtfal-poliszaharidokkal észteresített ferulasav. A kék fluoreszcenciához a sejtfal más hidroxifahéjsav származékai, mint a p-kumársav és a kávésav csak csekély mértékben járul hozzá. A zöld spektrális tartományban fluoreszkálnak a kempferol és kvercetin glikozidok (SCHWEIGER, 1999), valamint a berberin és a riboflavin (LANG és mtsai., 1991). Ezen kívül a zöld fluoreszcenciát a karotinoidok általi reabszorpció, és az ezt követı reemisszió is befolyásolhatja (LICHTENTHALER, 1995). A gerjesztı UV-sugárzás, ha nem abszorbeálódik az epidermiszben és eljut a parenchima sejtekig, gerjeszti a klorofill-a vörös (F690) és távoli vörös (F740) fluoreszcenciáját elsısorban a paliszád parenchima sejtek felsı kloroplasztisz rétegében, közvetlenül az epidermisz alatt. A laboratóriumban, vagy üvegházban nevelt növények, melyek általában a szabadföldi körülményekhez képest alacsony és UV-szegény megvilágításon nınek, viszonylag intenzív UV-indukálta klorofill-a fluoreszcenciát mutatnak, ami azonban a növénynevelési fény intenzitásának emelkedésével progresszíven csökken (STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A teljes napfénynek, a természetes UV-sugárzásnak kitett szabadföldi növényekben ugyanis az oldható flavonoidok (flavonok, flavonolok, kalkonok), valamint a fahéjsav származékok szintje többszöröse az üvegházi növényekének (LICHTENTHALER és SCHWEIGER, 1998). Ilyenkor a növényt érı UV-sugárzás legnagyobb részét az epidermisz sejtek abszorbeálják, így csak kevés UV-sugárzás jut a levél mezofillumába, s ennek következtében a szabadföldi növényeknek a klorofill-a-tól származó vörös és távoli vörös fluoreszcenciája viszonylag alacsony lesz. Zöld levelekben a klorofill fluoreszcencia az erek közötti intercostalis területekrıl származik. A kék és/vagy a zöld fluoreszcencia mértéke és aránya a vörös klorofill fluoreszcenciához képest fajonként különbözı. Ismeretes, hogy az egyszikőekben a sejtfalhoz kötött fenolok mennyisége sokkal magasabb, mint a kétszikőekben (HARRIS és HARTLEY, 1976; SCHWEIGER, 1999), ennek megfelelıen az egyszikőek pl. főfélék, sások nagyobb intenzitású kék és zöld fluoreszcenciát emittálnak (CHAPPELLE és 41
mtsai., 1985; STOBER és LICHTENTHALER, 1993; JOHNSON és mtsai., 2000). A fluoreszcencia intenzitás egyrészt az emittáló anyag koncentrációjától, a leveleknek a spektrális tulajdonságokat befolyásoló tulajdonságaitól, pl. a sejtek elrendezıdésétıl, a sejtek közötti üregektıl, az emittált fluoreszcencia reabszorpciójától, valamint a vörös és távoli vörös fluoreszcenciát illetıen a fotoszintézis, a hıkibocsátás és a klorofill flureszcencia közötti energia eloszlástól függ (BUSCHMANN és mtsai., 2000). A fluoreszcencia sávok intenzitása egy növényen belül (LANG és mtsai., 1991) és fajok között is nagy variabilitást mutat.
2.3.1. Stresszelt növények leveleinek fluoreszcenciája A különbözı stresszorok hatására fellépı válaszreakciók során a növényekben jellegzetes fluoreszcencia sajátságokkal rendelkezı metabolitok is felhalmozódnak. Ezek éppen olyan anyagok, melyek a kék és a zöld spektrális tartományban emittálnak. A stresszorok közvetve, vagy közvetlenül a fotoszintetikus apparátus módosulását, vagy akár károsodását is okozhatják, ezért a legfontosabb fotoszintetikus pigment, a klorofill-a fluoreszcencia jellemzıit is megváltoztatják. A fluoreszcencia leképezést elsısorban a vörös és a távoli vörös régióban - kiterjedten alkalmazzák a fotoszintetikus apparátus mőködésének jellemzésére. E célra kidolgozott speciális technikákkal olyan - a fotoszintetikus mőködést jellemzı - paraméterek is közvetlenül leképezhetık, mint az Fv/Fm, fotokémiai kioltás, nem-fotokémiai kioltás paraméterek (GENTY és MEYER 1994; BAKER és mtsai., 2001; NEDBAL és WHITMARSH, 2004; RALPH és mtsai., 2005). A stresszfiziológiai vizsgálatokban azonban a fotoszintetikus mőködést
jellemzı
paramétereken
kívül
nagyon
informatív
az
egyes
stresszmetabolitoktól származó, a kék és a zöld spektrális régióban emittált fluoreszcencia mértéke és aránya a vörös és távoli vörös fluoreszcenciához. E fluoreszcenciás sajátságok képszerő megjelenítésére és meghatározására nyújt lehetıséget a több hullámhosszú fluoreszcencia leképezı módszer. Egyes növényi stresszorok, mint pl. a nagy fényfelesleg a klorofill-a vörös fluoreszcenciáját csökkenti akár úgy is, hogy közben a kék és a zöld fluoreszcencia intenzitása változatlan marad, vagy akár nıhet is (LANGSDORF és mtsai., 2000; STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A kék és zöld fluoreszcencia intenzitása azért is 42
emelkedik, mert tartós stressz esetén a kék és zöld fluoreszcenciát abszorbeáló pigmentek (klorofillok és karotinoidok) mennyisége lassan csökken, másrészt pedig az UV-abszorbeáló, kék és zöld tartományban fluoreszkáló anyagok mennyisége az epidermiszben nı. Ezáltal kevesebb UV sugárzás jut a mezofill sejtekbe, ami ugyancsak a vörös fluoreszcencia csökkenését eredményezi (SCHWEIGER és mtsai., 1996). Ugyanakkor természetesen elıfordul az is, hogy egyes strresszorok hatására a klorofill destrukció fokozódik, vagy a bioszintézis lelassul, ami a klorofill-a fluoreszcenciájának az alacsonyabb klorofilltartalom miatti kisebb önabszorpciója révén, 690 nm-nél nagyobb intenzitású vörös fluoreszcenciát eredményez. Ezért az F690/F740 arány is nagyobb lesz, mely arány az in situ klorofilltartalom inverz indikátora (LICHTENTHALER és mtsai., 1990; SUBHASH és mtsai., 1999; GITELSON és mtsai., 1999). A fiziológiai állapotváltozások tehát a különbözı fluoreszcencia arányokban (F440/F690, F440/F740, F690/F740) jól tükrözıdnek. Egy fotoszintézisgátló herbiciddel, a diuronnal kezelt dohánynövényben a F440/F690 és a F690/F740 fluoreszcencia arányok csökkentek, mivel a klorofill fluoreszcenciája a fotoszintézis gátlása következtében megnıtt, miközben a kék fluoreszcencia intenzitása nem változott szignifikánsan (LICHTENTHALER és mtsai., 1997). Hasonló változások voltak megfigyelhetık a hıkezelt dohánynál (LANG és mtsai., 1996). Stresszorok hatására a kék fluoreszcencia intenzitása általában kisebb ingadozásokat mutat, mint a klorofill fluoreszcencia változásai (LICHTENTHALER és RINDERLE, 1988; STOBER és LICHTENTHALER, 1993), ezért az F440/F690 és az F440/F740 arányok jó és korai stressz indikátorok, melyek érzékenyen reagálnak a megváltozott környezeti feltételekre, és jól tükrözik a megváltozott fotoszintetikus funkciókat is. (HEISEL és mtsai., 1996; BUSCHMANN és LICHTENTHALER, 1998; LANGSDORF és mtsai., 2000). A kék és a zöld fluoreszcencia reabszorpciója is szerepet játszik az arányok változásában, a zöldé lényegesen kisebb mértékő, mint a kéké - mivel a klorofill-a-nak e spektrális régióban nincs elnyelése - és ezért a klorofilltartalom csökkenésekor az F440/F520 fluoreszcencia arány csökkenhet (LICHTENTHALER és mtsai., 1996). Ez az arány rövidtartamú stresszhatás esetén viszonylag stabil, hosszantartó hatás esetén a zöld fluoreszcencia emissziója gyakran fokozódik (LANG és mtsai., 1996; BUSCHMANN és LICHTENTHALER, 1998). Bizonyos kórokozók, pl. növénypatogén 43
gombák önmaguk által emittált fluoreszcencia révén is fokozhatják a kék-zöld fluoreszcencia intenzitását (LÜDECKER és mtsai., 1996). A stressz típusa és a növény válaszreakciójának sajátosságai határozzák meg, hogy mely fluoreszcencia arányok csökkennek és melyek nınek.
2.4. Az S-metilmetionin élettani szerepe Az S-metilmetionin (SMM, (CH3)2-S-(CH2)2-CH(NH2)-COOH) - triviális nevén U-vitamin - biológiailag aktív természetes vegyület, egy nem proteinogén jellegő szabad aminosav, mely a növényi kénanyagcsere jelentıs komponense. Növényekbıl elsıként káposztából azonosították, mely nagy mennyiségben halmozza ezt a vegyületet (MCRORIE és mtsai., 1954), késıbb azonban számos egyéb magasabb rendő növényben is kimutatták jelenlétét (WILLIAMS és NELSON, 1974; GIOVANELLI és mtsai., 1980; SCHWENN és mtsai., 1983; DUFOUR, 1986; MACNICOL, 1986; MACNICOL és RANDALL, 1987). Elıfordulása a növényvilágban általánosnak tekinthetı. Az utóbbi évek irodalmi adataiból kiderül, hogy az SMM metioninból (Met) szintetizálódik, szerepe van a metionin és az S-adenozil-metionin (AdoMet) szint szabályozásában (PIMENTA és mtsai., 1998; HACHAM és mtsai., 2002; KOCSIS és mtsai., 2003), részt vesz a sejtben zajló metilálási folyamatokban (RANOCHA és mtsai., 2000), valamint szállított és raktározott kénvegyületként is jelentıs (BOURGIS és mtsai., 1999). Számos abiotikus és biotikus stresszor káros hatását képes mérsékelni az ozmoprotektánsként mőködı dimetil-szulfopropionát (DMSP) termelésének (TROSSAT és mtsai., 1998; KOCSIS és mtsai., 1998) és a poliaminok bioszintézisének fokozása, az etilén termelés leszabályozása révén (LÁSZTITY és mtsai., 1992; KISSIMON és mtsai., 1994; GYETVAI és mtsai., 2002; RÁCZ és mtsai., 1996) (3. ábra). Mindezek számos kedvezı fiziológiai hatását eredményezik (csírázás és növekedés-serkentés, fotoszintetikus aktivitás, fehérje- és nukleinsav- szintézis fokozása) és magyarázzák stresszvédı hatását is szárazság és alacsony hımérsékleti stressz, valamint a biotikus és abiotikus stresszválaszban szerepet játszó metabolitok, pl. antociánok, karotinoidok termelése terén (Rácz I. és Lásztity D. személyes közlése nyomán). Az SMM-et szintetikusan is elıállították, és széles körben használják a 44
humán-, illetve állatgyógyászatban a béltraktus fekélyeinek kezelésében, bélfertızések utókezelésében (AUGSPURGER és mtsai., 2005; KOPINSKI és mtsai., 2007).
3. ábra. S-metilmetionin anyagcsere magasabb rendő növényekben
2.4.1. Az SMM-ciklus Számos növényfajban nyomon követett metionin metabolizmus igazolta, hogy az SMM szintézise metioninból, metilálási folyamat révén megy végbe. Izotópos jelöléssel végzett vizsgálatok igazolták, hogy az SMM a homocisztein metilálásával visszaalakul metioninná, létrehozva ezzel az SMM-ciklust (4. ábra).
45
4. ábra. Az S-metilmetionin (SMM)-ciklus és a kapcsolódó reakciók
HANSON és KENDE (1976), MUDD és DATKO (1990), és RANOCHA és mtsai. (2001) mutatták ki a teljes SMM-ciklus meglétét in vivo Ipomoea tricolor, Lemna paucicostata fajokban, és Arabidopsis különbözı szerveiben. Az SMM szintézisét metioninból, sejtmentes közegben, elıször tölgyben vizsgálták (SATO és mtsai., 1958). Az irreverzibilis reakciót katalizáló enzim az Sadenozilmetionin:metionin S-metiltranszferáz (EC 2.1.1.12, MMT) (GIOVANELLI és mtsai., 1980). Az MMT specifikus az L-metioninra, metildonorként pedig az Sadenozil-metionint (AdoMet) fogadja el (GREENE és DAVIS, 1960). Az MMT-t elsıként Wollastonia biflora-ból (JAMES és mtsai., 1995a), majd árpából izolálták (PIMENTA és mtsai., 1998) és késıbb bizonyítást nyert, hogy ez az enzim a citoplazmában lokalizált (TROSSAT és mtsai., 1996). Arabidopsisban és kukoricában az MMT egykópiás génként van jelen a genomban (BOURGIS és mtsai., 1999; RANOCHA és mtsai. 2001). BOURGIS és mtsai. (1999) szekvenálták meg a W. biflora MMT cDNSét, majd ennek segítségével azonosították az adatbázisokból az Arabidopsis és a kukorica MMT-k szekvenciáját. 46
Az
SMM-ciklus
másik
tagja
az
S-metilmetionin:homocisztein
S-
metiltranszferáz (EC 2.1.1.10, HMT), mely 2 M metionin keletkezését katalizálja 1 M SMM-bıl és 1 mol homociszteinbıl. A HMT enzimaktivitását elsıként TURNER és SHAPIRO (1961) mutatta ki, különbözı növényi fajok magjaiból. Szekvencia keresési vizsgálatok 3, egykópiás HMT gént azonosítottak az Arabidopsis genomjában (AtHMT-1, -2, -3), míg kukoricában 4 HMT gént találtak (ZmHMT-1, -2, -3, -4) (RANOCHA és mtsai., 2001). A HMT-k fı metildonora az SMM, de minden esetben megfigyelték az AdoMet kismértékő hasznosítását is (RANOCHA és mtsai., 2000). RANOCHA és mtsai. (2001) megvizsgálták az Arabidopsis és kukorica HMT enzimek aktivitását és génexpresszióját a növények különbözı részeiben. A HMT enzimek esetében a gyökérben találták a legmagasabb enzimaktivitást, melyet elsısorban az AtHMT-1 és -2 erıs expressziója okozhatott. Az AtHMT-3 expressziója viszont a levelekben volt a legmagasabb. Kukoricában a ZmHMT-4 kizárólag a magban, a ZmHMT-1 pedig kismértékben a virágban, de fıleg a magban expresszálódott. A ZmHMT-2 és -3 expressziója szintén a magban volt a legmagasabb. A brokkoliban azonosított BoHMT-1 gén gyökérben, virágban és fiatal levélben egyaránt expresszálódott, idıs levélben azonban nem (LYI és mtsai., 2007). A HMT enzimeknek ez a térben és idıben eltérı expressziója, valamint a metioninra való érzékenységük különbözısége az SMM-ciklus többrétő szerepét, összetett hatását vetíti elıre.
2.4.2. Az SMM-ciklus szerepe a Met és AdoMet-szint szabályozásában Az SMM-ciklus komponenseinek vizsgálata egyértelmővé tette, hogy a ciklus a növényvilágban mindenütt jelenlevı anyagcsere folyamat. MUDD és DATKO (1990) említi elsıként, hogy az SMM-ciklus fontos szerepet tölthet be a Met szint szabályozásában, abban az esetben, ha túl nagy mértékő átalakulás történik az AdoMet irányába. A Met-szint lecsökkenése esetén ugyanis, az AdoMet SMM-en keresztül gyorsan
vissza
tud
alakulni
metioninná,
biztosítva
ezzel
a
zavartalan
fehérjeszintézishez szükséges szabad Met-szintet. Az SMM-ciklusnak ezt a jelentıségét RANOCHA és mtsai. (2001) számítógépes modell segítségével vizsgálták, szimulálva a Met anyagcserét egy kifejlett Arabidopsis levélben. A modellhez a Met Sizotópos nyomon követésébıl származó adatait, és az egyes komponensek 47
növényekben mért mennyiségét használták fel. A modell a teljes SMM-ciklus kiiktatása esetén az AdoMet jelentıs felhalmozódását mutatta. MUDD és DATKO (1990) elméletének részletesebb vizsgálatához a teljes Met-készletet az AdoMet-té alakulás irányába vitték el a modellben. Majd 2 esetet vizsgáltak, az egyikben az SMM-ciklust épen hagyták; míg a másikban az SMM-ciklust kiiktatták, de az AdoMet szintézisét lassították. A Met-szint mindkét esetben hamar helyreállt, míg az AdoMetszint helyreállása az SMM-ciklus jelenlétében gyorsabb volt. A modell mőködésének vizsgálatából így azt tapasztalták, hogy az SMM-ciklus nem szabályozza a szabad Met szintet. A metabolikusan aktív, szabad Met-szint lecsökkenését a fehérjékbıl és a raktározott készletekbıl felszabaduló Met állítja helyre. Ugyanakkor, a modell alapján, az SMM-ciklus egyértelmően meghatározza az AdoMet-szintet. KOCSIS és mtsai. (2003) kísérletesen is igazolták, hogy az SMM-ciklus a Metszintre nem hat, az AdoMet szintet viszont szabályozza. Az SMM-ciklus és az SMM hosszú távú, a növény teljes fejlıdésére kiterjedı hatását tudták megvizsgálni olyan Arabidopsis és kukorica mutánsokban, melyek az MMT génben bekövetkezı mutáció, és ez által az MMT enzim mőködésképtelensége miatt SMM-t nem termeltek, az SMM-ciklusuk hiányzott. Mindkét mutánsban azt igazolták, hogy a vad típushoz hasonló arányban épült be a jelölt Met fehérjékbe, vagyis a szabad Met-készlet nem változott a mutáció következtében. Az MMT mutáns Arabidopsis esetén a Met-szintet közvetlenül is megmérték, és a vad típusnak megfelelınek bizonyult. Az SMM-ciklus hiánya tehát hosszú távon, stresszmentes közegben nem okozott a szabad Met szintben rendellenességet. Ugyanakkor az SMM-ciklus AdoMet-szintre kifejtett hatását mutatja, hogy az MMT mutáns Arabidopsisnál mért AdoMet szint magasabb volt a vadhoz képest. További bizonyítékul szolgál az SMM-nek erre a szerepére az a transzgénikus dohány is, melyben a Met szintézisében résztvevı egyik enzimet, az Arabidopsis cisztationin γ-szintázát túlexpresszáltatták (GAKIÉRE, 2002). A növényben megnövekvı Met- és SMM-szint mellett ugyanis az AdoMet-szint nem változott a vad típushoz képest. Az SMM-nek tehát meghatározó szerepe van az AdoMet szinten tartásában, mely azért is lényeges eleme a növényi anyagcserének, mert a növényekbıl hiányzik az a más eukariótákban meglévı negatív visszacsatolás, mely során az AdoMet saját szintézisét gátolja (SCHRÖDER, 1997).
48
2.4.3. Az SMM metilcsoportjának szerepe Az SMM szerkezetébıl adódóan joggal merül fel az a lehetıség, hogy az SMM általános metildonor szerepet tölthet be az élı szervezetben. Így a homocisztein metilálásán kívül más metilálási folyamatban is részt vehet. Ezt támasztja alá az a kísérlet, melyben jelölt metilcsoport beépülését követték nyomon a hajnalka reproduktív fejlıdési fázisba való átmenete során a különbözı merisztéma szövetekben (HANSON és KENDE 1976). Megállapították, hogy - annak ellenére, hogy az SMM→Met átalakulása hiányzott a korai fázisban - az SMM metilációs folyamatokban vett részt, ami azt jelenti, hogy a homociszteinen kívül egyéb metilakceptorokkal kellett reagálnia. A szelén metabolizmusában szerepet játszó szelenocisztein-metiltranszferáz
enzim
(SMT)
esetén
is
megfigyelték,
hogy
metildonorként AdoMet mellett SMM-t is elfogad (NEUHIERL és mtsai., 1999). Ezen kívül SATO és mtsai. (1958) tölgyben kimutatták az SMM részvételét a pektinek metilálásában, szerepe azonban nem jelentıs e folyamatokban. Az SMM izotóposan jelölt metilcsoportjának nyomon követése Lemnában (MUDD és DATKO 1990) azt igazolta, hogy az SMM metilcsoportja elıször Met-ba kerül át, és az izotópos jel csak ezt követıen jelenik meg olyan komponensekben (foszfatidil-kolin, neutrális lipidek, stb.), melyek metilcsoportja tulajdonképpen a Met-ból származik. Azokban az Arabidopsis és kukorica mutánsokban, melyek mőködı MMT génnel és így SMM szintézissel nem rendelkeztek (KOCSIS és mtsai., 2003), az SMM hiány nem okozott a fejlıdési állapot szintjén megjelenı zavart a metilálási folyamatokban, tehát nem tekinthetı általános, vagy kizárólagos metildonornak. A közvetlen metilálási reakciókon kívül azonban más szempontból is szerepe lehet az SMM-nek a metilcsoport anyagcseréjében. KOCSIS és mtsai. (2003) fent említett MMT mutáns növényeiben, az SMM hiánya 45%-os emelkedést eredményezett az ún. metilációsrátában, azaz az AdoMet/S-adenozil-homocisztein (AdoHcy) arányban. Ez a vadhoz képest magasabb AdoMet és alacsonyabb AdoHcy szintnek volt köszönhetı. Az AdoMet a transzmetilációs folyamatok legfıbb metilforrása, az AdoMet-függı metiltranszferázok fehérjék, DNS, mRNS, pektin, szterol, etanolamin, lignin monomerek, fenolok, ozmolitok metilálásában vesznek részt, így jelentıs szerepük van a növény anyagcseréjében, fejlıdésében, stressz tőrésében egyaránt (MOFFATT és mtsai., 2001). A metil-transzferázok mőködését az AdoHcy gátolja, így a metilálási folyamatok 49
aktivitását az AdoMet/AdoHcy arány határozza meg, melynek szabályozásában a fenti kísérlet szerint az SMM is részt vesz. GIOVANELLI és mtsai. (1980) felvetése alapján az SMM-ciklus lehetıvé teszi a metil-csoport raktározását is. Abban az esetben, ha a metilcsoport de novo szintézise lecsökkenne a homocisztein szintéziséhez képest, az SMM a homociszteint metilálva helyre tudja állítani a Met, és a belıle származó AdoMet-szintet, biztosítva ezzel a szükséges metil-donor mennyiséget.
2.4.4. Az SMM szerepe a S szállításában és raktározásában, az SMM-ciklus eltolódásai térben és idıben
Az SMM S-szállításában betöltött szerepére kifejlett, a termésérés állapotában lévı búzával végzett kísérletek hívták fel a figyelmet (BOURGIS és mtsai., 1999). Ennek során jelölt kénnel rendelkezı Met-t juttattak a levélbe, majd a kalászhoz közeli szárrészen, levéltetvek segítségével győjtött floem exudátumban vizsgálták a S szállítási formáit. A S-tartalmú komponensek összmennyiségének 80%-át az SMM tette ki, megelızve a glutationt, melynek szerepét már korábban igazolták a szállítási folyamatokban. Ezek alapján BOURGIS és mtsai. (1999) azt feltételezték, hogy bár az SMM-ciklus a növény minden részében teljesen végbe tud menni, a ciklust képzı két reakció aránya eltolódhat. Így a levélben az SMM szintézise lehet aktívabb, mely biztosítja a floemen keresztül szállítódó SMM-t. Ez az érıfélben lévı terméshez jut, ahol pedig az SMM metioninná alakítása felé tolódik el az SMM-ciklus. Az SMM Sszállításban betöltött szerepét számos más növényi fajban is igazolták, kimutatva az SMM jelenlétét a floem exudátumban. Jellegzetes az SMM-ciklus idıbeli eltolódása, az SMM-szint változása a csírázás során, mely arra enged következtetni, hogy az SMM-nek szerepe lehet a S szállításában és raktározásában a csíranövényeknél is. Például búzában a száraz magban és a csírázás kezdetén a HMT bizonyult aktívabbnak, majd a csírázás késıbbi szakaszában az MMT mutatott nagyobb aktivitást (ALLAMONG és ABRAHAMSON, 1977). A csírázó árpában a kezdeti alacsony SMM-szint csak a 4. naptól kezd el emelkedni (DETHIER és mtsai., 1991), az MMT enzim pedig a 3-4. naptól kezdve mutat
aktivitásnövekedést
immunohisztokémiai
(PIMENTA
vizsgálata
azt
és
mtsai.,
mutatta, 50
1998).
hogy
az
A
csírázó
MMT
enzim
árpa az
endospermiumban és az aleuron sejtekben aktív (PIMENTA és mtsai., 1998). Ennek alapján a kutatók azt feltételezik, hogy az itt raktározott tartalékfehérje lebontásából keletkezı Met az MMT enzim révén SMM-é alakul, mely képes a csíra más részeibe elszállítódni, majd Met-á visszaalakulni, és így a fehérjeszintézisben részt venni. Az adott növényben lévı, különbözı HMT-k eltérı tulajdonságai arra utalnak, hogy a növény különbözı részeiben, és az egyedfejlıdés egyes szakaszaiban más-más HMT játszhat fontos szerepet. Így például kifejezetten metionin inszenzitív HMT-t találtak bab (ABRAHAMSON ÉS SHAPIRO, 1965) és borsó magjában (DODD és COSSINS, 1970) ill. az Arabidopsis csírázása során is elsısorban a metionin inszenzitív AtHMT-2 expresszálódott (RANOCHA és mtsai., 2000). A metionin gátlásának hiánya pedig lehetıvé teszi, hogy a magban, a növény többi részéhez képest nagyobb mértékben halmozódjon fel a metionin (RANOCHA és mtsai., 2000; GIOVANELLI és mtsai., 1980).
2.4.5. Az SMM szerepe a dimetil-szulfopropionát (DMSP) szintézisében A dimetil-szulfopropionátot (DMSP) elıször algákban mutatták ki magas koncentrációban. A növényvilágban való elterjedtsége korlátozott, ugyanakkor a cukornád és a sótőrı Spartina és Wollastonia nemzetségek egyes tagjai nagy mennyiségben halmozzák fel (OTTE és mtsai., 2004 összefoglalója alapján; PAQUET és mtsai., 1995; DACEY és mtsai., 1987). A DMSP a magasabb rendő növényekben részt vehet a metilációs folyamatokban, metioninná való visszaalakulása lehetıvé teszi, hogy S raktárként funkcionáljon. Krioprotektáns és antioxidáns szerepét fıleg az algákon elvégzett kísérletek alapján feltételezik, ozmoprotektáns szerepét azonban magasabb rendő növényekben is vizsgálták. Elsısorban bizonyos sótőrı, DMSP-t akkumuláló növényeknél elfogadott, hogy a DMSP ezt a funkciót látja el. Az ozmoregulációban betöltött szerepére szerkezete is utal, ugyanis hasonlóságot mutat a szintén ozmoprotektáns glicinbetainnal (MCNEIL és mtsai., 1999). A DMSP szintézise a magasabb rendő növényekben kétféle útvonalon valósulhat meg. Az Asteraceae családba tartozó Wollastonia bifloraban a DMSP az SMM-bıl DMSP-aldehiden, mint intermedieren keresztül szintetizálódik (JAMES és mtsai., 1995), míg a Poaceae családba tartozó Spartina alternifloraban DMSP-aminon keresztül zajlik a szintézis (KOCSIS és mtsai., 1998). A DMSP szintézis útvonala tehát 51
ebben a két, evolúciósan távoli családban egymástól függetlenül fejlıdött ki. A DMSP szintézis lépéseinek sejten belüli helyét W. biflora-ban TROSSAT és mtsai. (1996) vizsgálták sejtfrakcionálást követı enzimaktivitás mérés és immunofestés alapján. Megerısítették, hogy az SMM szintézisért felelıs MMT enzim a citoplazmában található, ugyanakkor azt találták, hogy a DMSP-aldehid → DMSP reakciót katalizáló DMSP-aldehid dehidrogenáz (DDH) enzim a kloroplasztiszban lokalizált. SMMinkubált intakt kloroplasztisz DMSP termelése bizonyította, hogy a citoplazmában szintetizálódó SMM transzportálódik a plasztiszba, majd itt alakul át DMSP-aldehiddé és végül DMSP-vé. A növények DMSP akkumuláló képessége így nagyban összefügghet a kloroplasztisz SMM transzportáló hatékonyságával. TROSSAT és mtsai. (1998) azt mutatták ki, hogy a DMSP-t nem akkumuláló növényekben a teljes SMM tartalomnak csupán az 1-15%-a található a kloroplasztiszban, míg a DMSP-t akkumuláló W. biflora esetén ez 40% volt. Sóstressz hatására a kloroplasztisz SMM tartalma tovább emelkedett a W. biflora-ban, az össz SMM 80%-ára, mely változást a DMSP-szint növekedése is követte, biztosítva ezzel a plasztiszban végbemenı folyamatok ozmotikus védelmét.
2.4.6. Az SMM hidegstressz elleni védıhatása Az SMM lehetséges hidegstressz védı szerepére az a tény hívta fel a figyelmet, hogy a Brassicaceae család tagjaira kifejezetten jellemzı a magas SMM tartalom és a faggyal szembeni ellenállóságuk is ismert. Joggal merült fel a kérdés arra vonatkozóan, hogy az SMM-nek szerepe lehet e növényfajokban a hideggel szembeni ellenállóság biztosításában (GYETVAI és mtsai., 2002; RÁCZ és mtsai., 2008), ennek megfelelıen hidegre érzékeny növényeknél is elérhetı az ellenállóság fokozása SMMkezelés hatására. Hidegkezelt kukoricában megfigyelhetı volt a fotoszintetikus aktivitás javulása SMM adása esetén (KISSIMON és mtsai., 1994). Az SMM kedvezı hatását mutatják azok a vizsgálatok is, melyekben a membránok áteresztı képességének fokozódását, és a sejtek ez általi ionleadását vizsgálták hidegstressz hatására. Borsó, kukorica és különbözı hidegtőréső búza fajtáknál mind a levelekben, mind a gyökerekben, a tápoldaton keresztül felvett SMM kivédte a hidegstressz membránkárosító hatását, ugyanis az SMM kezelést követıen a hidegstressz nem 52
fokozta az ionvesztés mértékét (RÁCZ és mtsai., 2008; GYETVAI és mtsai., 2002). GYETVAI és mtsai. (2002) 3 lehetséges utat feltételeznek, melyeken keresztül érvényesülhet az SMM hidegstressz elleni védıhatása. Egyrészt a belıle képzıdı DMSP szintézisének fokozásával biztosítja a sejtek megfelelı ozmotikus állapotát, másrészt fokozza a dimetilszulfid (DMS) képzıdését, melynek gyökfogó tulajdonsága csökkenti a membránkárosító hatásokat. Ezen kívül az SMM kifejtheti hatását a poliaminokon - elsısorban a spermidinen - keresztül is, melyek szintézisét az SMM befolyásolja. A külsıleg adott SMM számos növényben (kukorica, búza, borsó, szója) megnövelte a különbözı poliaminok szintjét, így a putreszcin, agmatin és a spermidin mennyiségét, de nem befolyásolta a spermin-szintet (RÁCZ és mtsai., 2008). Az SMM poliaminok szintézisében játszott szerepe részben az AdoMet-szint szabályozásával is összefügghet, ugyanis az AdoMet dekarboxilált származéka szolgáltatja azt a propilamino-csoportot, mely révén a putreszcinbıl spermidin, majd a spermidinbıl spermin képzıdik. A poliaminok szerteágazó hatása a növényi életfolyamatokra magyarázatul szolgál az SMM sokrétő szerepére, és a poliaminok okozta membrán, fehérje és DNS stabilizálás egybevághat az SMM stressz elleni védımechanizmusával is (GALSTON és KAUR-SAWHNEY, 1995; BOUCHEREAU, 1999).
2.4.7. Az SMM hatása az etiléntermelésre Az SMM AdoMet-szintet szabályozó hatása lehetıvé teszi, hogy az SMM részt vegyen azon anyagcsere utakban, melyek az AdoMet-bıl indulnak ki. Ugyanakkor a növények SMM tartalma befolyásolja az etilén szintézisét is, mely Met-on keresztül szintén az AdoMet-bıl indul ki. Az etiléntermelésre gyakorolt hatás összetett. Ennek egyik oka egyrészt az, hogy mind a poliamin, mind az etilén bioszintézisben egyaránt közös intermedier, az AdoMet iránti kompetíció zajlik a két folyamat között, másrészt, hogy a poliaminok az etilén szintézis több pontját (AdoMet-1-aminociklopropán-1karboxilát (ACC) átalakulást, valamint az ACC - Met átalakulást) gátolják. Ugyanakkor az etilén is gátló hatású a poliaminszintézis során. Az etilén szintézisét végzı 1-aminociklopropán-1-karboxilát (ACC) szintáz enzim mőködését in vitro körülmények között maga az SMM is gátolta, ami ugyanakkor a növényben nem feltétlenül jut érvényre (KO és mtsai, 2004). 53
3. KUTATÁSI CÉLOK Munkánk egyik célja az volt, hogy a kukorica alacsony hımérsékleti stressztőrı képességét és az SMM növényi stresszválaszban betöltött szerepét komplex módon vizsgáljuk. Vizsgálataink másik fı céljaként azt tőztük ki, hogy több kukorica genotípus esetében szabadföldi kísérletekben nyomon kövessük a magyarországi viszonyoktól eltérı, magasabb UV-B sugárzási szint hatására bekövetkezı - a védekezı mechanizmusban fontos szerepet játszó - antocián képzıdés mennyiségi változásait, illetve, hogy kontrollált körülmények között mőködı UV-B kamra segítségével tanulmányozzuk az UV-B sugárzás hatását az egyes anyagcsere folyamatokra. A magasabb UV-B sugárzás növényi anyagcserére gyakorolt hatásainak vizsgálata munkánk során azon gyakorlati okból kapott kitüntetett szerepet, mert az északi féltekén lévı nemesítı cégek és intézetek a kukorica hibridek elıállításának gyorsítása végett az évenkénti második, ún. „téli generációt” a déli féltekén nevelik fel.
54
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Növényi anyagok, mintavételek és kezelések 4.1.1. SMM-kezelés A növények nevelése és kezelése Martonvásáron, az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet fitotronjában történt. Az SMM-kezelt kukorica (Zea mays L., Norma hibrid) hidegtőrésének vizsgálatához a magokat 5 percig 5%-os nátrium-hipoklorit oldatban fertıtlenítettük, majd a desztillált vízzel lemosott magvakat nedves szőrıpapír között csíráztató szekrényben (típus: G 30, Conviron, Canada) csíráztattuk 72 órán keresztül, 26°C-on, sötétben. A 72 órás csíranövényeket rozsdamentes hálóra rakva (5-7 csíranövény/edény) gyökerüket a következı összetételő Hoagland tápoldatba merítettük:
Makroelem összetétel:
Mikroelem összetétel:
0,3125 mM KNO3
11,92 µM HBO3
0,45 mM Ca(NO3)2
4,57 µM MnCl2·4H2O
0,0625 mM KH2PO4
0,191 µM ZnSO4·7H2O
0,125 mM MgSO4·7H2O
0,08 µM CuSO4·5H2O 0,024 µM (NH4)6Mo7O24·4H2O 15,02 µM FeSO4·7H2O 23,04 µM Na2EDTA·5H2O
A növényeket 21 napig (a 3. levél teljes kifejlıdéséig) PGV-36 típusú növénynevelı kamrában (Conviron, Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Canada) neveltük (16 óra fény és 8 óra sötét; 22°C fényben és 20°C sötétben; fényerısség a levelek szintjén 340 µmol /m2s PPFD, 70%-os relatív páratartalom). A tápoldatot kétnaponként cseréltük. Az SMM kezelésre a 22. napon került sor, a tápoldat 0,01% SMM-t is tartalmazott. A kontroll növények tápoldata SMM-mentes volt. Az SMM-os tápoldatot 1 nap után nevelési tápoldatra cseréltük és a növényeket gradiens növénynevelı kamrába helyeztük el alacsony hımérsékleti kezelés céljából (TISCHNER 55
és VEISZ, 1996). A hımérsékletet kivéve a nevelési paraméterek az elıbbiekben leírtakkal megegyeztek. Az elsı kísérletben az alacsony hımérsékleti kezelés 5°C-on történt, a másikban a hımérsékleti gradiens 6, 8, 10, 12 és 14°C között volt. Az antioxidáns enzimaktivitások vizsgálatához szükséges mintavétel az elsı kísérletben 1, 4 és 6 napos hidegkezelés után, a hımérsékleti gradiens kísérletben a 4. nap után történt. A fotoszintézis hatékonyságának meghatározásával összefüggı vizsgálatokra a hideg kezelés 1., 3. és 4. napján került sor. Mind a mintavételhez, mind az intakt levélen történı mérésekhez a teljesen kifejlett 3. levelet használtuk. A felhasznált vegyszereket a Sigma és Merck cégektıl vásároltuk analitikai minıségben. 4.1.2.1. UV-B kísérletek szabadföldön Ugyanazon 10 martonvásári beltenyésztett kukoricavonalat (5 korai: L2-E, L3E, L4-E, L9-E, L10-E, valamint 5 közép- és késıi tenyészidejő: L1-L, L5-L, L6-L, L7L, L8-L) négyismétléses kísérletbe állítottuk be Martonvásáron és Buin-ban (Chile) lévı tenyészkertünkben 2000-2004. években. Az év egymásnak megfelelı hónapjainak (Martonvásár: május, június, július; Buin: november, december, január) utolsó dekádjaiban (a tenyészanyagok virágzását követıen) történt az antociántartalom vizsgálathoz szükséges mintavételezés. Ismétlésenként mintáztunk, a címer alatti 3-4. levélbıl. A Chile-i minták hazaszállítása szárazjégben, 24 órán belül megtörtént, majd feldolgozásig -80°C-on tároltuk.
4.1.2.2. UV-B kamrakísérletek A növények nevelése és kezelése Martonvásáron, az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet fitotronjában történt. A kísérletekhez két beltenyésztett kukorica vonalat használtunk (Zea mays L., CM7 és HMv651). A CM7 korai-, a HMv651 közép tenyészidejő. A nevelıközeg erdei talaj, Vegasca és homok 3:1:1 arányú keverékét tartalmazta. A növényeket a magok elültetésétıl számított 21 napig (a 3. levél teljes kifejlıdéséig)
G-48
típusú
növénynevelı
kamrában
(Conviron,
Controlled
Environments Ltd, Winnipeg, Canada) neveltük a következı paraméterek szerint: 16 óra megvilágítás, 8 óra sötét, fényerısség a levelek szintjén 300 µmol /m2s PPFD, 22°C-os levegı hımérséklet fényben, 18°C sötétben, 70%-os relatív páratartalom, a 56
kontroll növények UV-B dózisa a levelek szintjén 38 µWatt/cm2, a kezelteké 430 µWatt/cm2. A növények megvilágítása 4,3 m2-es területen történt, melynek egyik felére a kontroll, másik felére a kezelendı növényeket helyeztük. Az UV-B sugárzást 175 cm hosszú, Philips gyártmányú, 100 W-os, TL 100W/01 típusú Narrowband Ultraviolet-B csövek biztosították, melyek sugárzási hullámhossz-maximuma 311 nm volt (5. ábra). A mérések és a mintavétel a növénynevelés és - kezelés utolsó hetében történtek, a teljesen kifejlett harmadik levélbıl.
5.ábra. UV-B kamra: a kép bal oldalán a kontroll, jobb oldalt az UV-B kezelt növények láthatók.
4.2. A fluoreszcencia-indukció mérése A fluoreszcencia indukciós kísérleteket impulzus amplitúdó moduláció elvén mőködı PAM-2000 típusú klorofill fluoriméterrel (Heinz Walz GmbH, Germany) végeztük. A kifejlett leveleket 20 perc sötétadaptáció után kis intenzitású (kb. 1 µmol /m2s, kb. 10 mW /m2), szaggatott, 1,6 kHz frekvenciájú vörös fénnyel világítottuk meg. A kibocsátott fluoreszcenciát fotodióda detektálta. Mind a fluoreszcens, mind a gerjesztı fényt száloptikán keresztül vezettük. A készülék a jelet ugyancsak szaggatottan (1,6 kHz), a mérıfénnyel szinkronban, szelektíven erısítette (amplitúdó 57
moduláció). Az amplitúdó moduláció tette lehetıvé, hogy olyan kis intenzitású modulált mérıfényt alkalmazhattunk, ami nem okozott észlelhetı fluoreszcencia átmeneteket. Így jutottunk az Fo, azaz a kiindulási fluoreszcencia-hozamhoz. A maximális (Fm) fluoreszcencia értéket 0,7 s idıtartamú, a PSII elektrontranszportot telítı (kb. 3500 µmol /m2s, minden PSII reakciócentrum zárt állapotban), fehér fényfelvillanás hatására kaptuk meg (fényforrás: Schott, KL 1500 electronic). Az Fm meghatározása után a kioltásanalízishez folyamatos, közepes intenzitású aktinikus fényt (kb. 150 µmol /m2s) használtunk (Ft). Az indukciós görbe felvétele alatt telítési intenzitású fényfelvillanásokat adtunk, hogy meghatározhassuk a fényadaptált minta maximális fluoreszcencia (Fm’), illetve az aktinikus fény kikapcsolása után 3 s idıtartamú, hosszú hullámhosszú vörös fényt (λ=735 nm) bekapcsolva a minimális fluoreszcencia értékét (Fo’). A paramétereket a következı egyenletek alapján számoltuk, melynek során a VAN KOOTEN és SNEL (1990) által leírt nomenklatúrát követtük: A PSII maximális kvantumhatékonysága: (Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm A PSII aktuális kvantumhatékonysága: (∆F/Fm’)=(Fm’-Ft)/Fm’
4.3. A több hullámhosszú fluoreszcencia leképezı rendszer mőködése Az
ELTE
TTK,
Biológiai
Intézet,
Növényélettani
és
Molekuláris
Növénybiológiai Tanszékén az országban egyedüliként alkalmazott fluoreszcencia leképezı rendszert egy INCO Copernicus együttmőködés keretében német, francia és magyar kollégákkal közösen alakították ki, hogy növényi minták mérésének lehetıségeit teszteljék Szigeti Zoltán professzor vezetésével. A fluoreszcencia leképezı rendszerben a növényi minta fluoreszcenciáját egy 16,7 Hz-cel villogó (flash) Xe kisülési lámpa gerjeszti, melynek a növényi mintát érı gerjesztı fénye 350 nm hullámhosszú, amit egy DUG 11 (Schott, Jena, Germany) szőrı biztosít. Ez a hullámhossz technikai okokból létrejött kompromisszum eredménye, ami a kék és zöld, valamint a vörös és távoli vörös fluoreszcencia egyidejő gerjesztését lehetıvé teszi.
58
A minta által emittált fluoreszcencia egy optikai és erısítı rendszeren keresztül jut a CCD kamerába. A kamerába épített szőrıknek a fényútba helyezése biztosítja, hogy a kibocsátott fluoreszcens fénybıl az éppen vizsgálni kívánt, megfelelı hullámhosszúságú jusson a xenon lámpa villogásával szinkronizáltan mőködı, fél megapixel felbontású CCD kamerába, s képezzen így 440, 520, 690 és 740 nm-nél teljes képet az objektumról. A kis intenzitású fluoreszcens jel felerısítése az intenzitástól függıen változtatható számú (több száz, vagy akár több ezer) kép összegzésével történik. A különbözı hullámhosszaknál egymást követı mérések során kapunk képet. A kamera mőködését számítógépes program vezérli, és ugyancsak ez teszi lehetıvé a képek korrekcióját, analízisét, s a képekkel végzendı mőveleteket (arányok, különbségek képzése). A képeket a kiértékelés során a program a szőrık spektrális
érzékenységével
korrigálja.
A
módszer
részletes
leírását
lásd
LICHTENTHALER és BABANI (2000), valamint LENK és BUSCHMANN (2006) cikkében.
4.4. Gázcsere vizsgálatok
A gázcsere vizsgálatokat nyitott rendszerő LI-6400 típusú infravörös gázanalizátorral
(LI-COR,
fényforrásként
a
Lincoln,
mérıfejhez
Nebrasca,
USA)
csatlakoztatható
végeztük.
6400-02
Megvilágító
LED
lámpát,
hımérsékletszabályozásra beépített Peltier elemet használtunk. A mért víz- és széndioxid mennyiség változásának értékei segítségével VON CAEMMERER és FARQUHAR (1981) módszere szerint határoztuk meg a fotoszintetikus aktivitást (A) és az intercelluláris széndioxid-koncentrációt (Ci).
4.5. Relatív klorofilltartalom mérése
A klorofilltartalom mennyiségét SPAD-502-es típusú automata berendezéssel mértük. A mérés lényege, hogy a
levélben lévı klorofill a
különbözı
hullámhosszúságú fényt különbözı mértékben nyeli el. A klorofill fényelnyelésének mértéke szoros összefüggésben van a levél klorofilltartalmával. A klorofill molekulák fényelnyelési maximuma a kék és a vörös hullámhossz tartományban található. 59
Alacsony a fényabszorpció a zöld- és sárga-, közel nulla az infravörös tartományban. Ebbıl adódóan érdemes az infravörös tartományt viszonyítási értéknek választani, és a kék vagy a vörös tartományt használni a méréshez. A SPAD-502 készülék vörös fény mellett mér, mivel ennek elnyelését nem befolyásolja a levél karotintartalma. A klorofilltartalom számítás alapját a levélen áthaladt infravörös és vörös fény erısségének aránya képezi. Ez az arány annál nagyobb, minél több vörös fény nyelıdik el a növény levelében, ami szoros összefüggést mutat a klorofilltartalommal (MARKWELL, 1995; HAWKINS és mtsai., 2009). A SPAD értéktartománya 0-100 között van (Minolta Camera Co. Ltd. 1989).
4.6. Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitásuk mérése Az izolálás során 0,5 g növényi anyagot (középsı levélér nélküli levelet) kvarchomokkal dörzsöltünk el 2,5 ml jéghideg 3 mM MgCl2-ot és 1 mM EDTA-t tartalmazó 0,5 mM TRIS-HCl puffer (pH 7,4) hozzáadásával, mélyhőtött dörzsmozsárban. A homogenizátumot lecentrifugáltuk (4°C, 20 perc, 15000 g), a felülúszót Eppendorf csövekbe osztottuk szét. A minták összfehérje koncentrációját BRADFORD (1976) módszerén alapuló Bio-Rad reagenssel határoztuk meg, spektrofotométerben 595 nm-en
mérve
a reakcióelegy abszorbanciáját. Az
enzimaktivitás vizsgálatok során a glutation-reduktáz (GR) aktivitását a friss, míg a többi esetben a -20°C-on tárolt fagyasztott felülúszóból mértük. Az enzimaktivitásokat fotometriásan határoztuk meg (UV-VIS 160A, Shimadzu, Japan). Mérésig a mintákat jégen tartottuk, a méréseket szobahımérsékleten végeztük. Az enzimaktivitásokat 1 g enzimfehérje által 1 perc alatt okozott abszorbancia változásban (∆A min-1g-1 fehérje) adtuk meg.
Kataláz A CAT (EC 1.11.1.6) aktivitását 240 nm-en mértük, a hidrogén-peroxid fogyását követve nyomon. A reakcióelegy össztérfogata 3 ml volt, és 0,5 mM TRIS pufferben (pH 7,4) 10 mM H2O2-t és 50 µl növényi mintát tartalmazott (ÁDÁM és mtsai., 1995). A reakciót H2O2 hozzáadásával indítottuk el. 60
Gvajakol-peroxidáz A POD (EC 1.11.1.7) aktivitását ÁDÁM és mtsai. (1995) módszere szerint határoztuk meg. A gvajakol oxidációja nyomán bekövetkezı abszorbancia-növekedést 470 nm-en mértük. A reakcióelegy 3 ml-éhez 50 µl növényi mintát adtunk. A reakcióelegy 0,1 mM acetát (pH 5,5) pufferben 10 mM H2O2 -ot, és 1 mM gvajakolt tartalmazott. A reakciót H2O2 hozzáadásával indítottuk el. Aszkorbát-peroxidáz Az APX (EC 1.11.1.11) aktivitását 25 mM aszkorbinsavat és 0,5 mM H2O2tartalmazó TRIS pufferben (0,2 mM pH 7,8) mértük. A reakcióelegy össztérfogata 2,25 ml volt, melyhez 50 µl növényi mintát adtunk, a reakciót H2O2 hozzáadásával indítottuk. Az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en követtük nyomon (NAKANO és ASADA, 1987).
Glutation-reduktáz A GR (EC 1.6.4.2) aktivitásának meghatározásakor SMITH és mtsai. (1988) módszere szerint az 5,5’-ditio-bis-(2-nitro-benzoesav) (DTNB) redukcióját mértük 412 nm-en, melyet az enzimmőködés során keletkezett GSH okozott. A reakcióelegy összetétele: 0,1 M foszfát puffer (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,75 mM DTNB, 0,1 mM NADPH, 1 mM GSSG. A reakcióelegy 1 ml össztérfogata 50 µl növényi mintát tartalmazott.
Glutation-S-transzferáz A GST (EC 2.5.1.18) enzim aktivitásának meghatározásához 72,7 mM Nafoszfát puffer (pH 6,5), 3,6 mM redukált glutation (GSH), 1 mM 1-kloro-2,4dinitrobenzén (CDNB) és enzimkivonat (2,75 ml reakcióelegyben 100 µl növényi minta)
elegyének
abszorbancia
növekedését
(MANNERVIK és GUTHENBERG, 1981).
61
követtük
nyomon
340
nm-en
4.7. Antocián kivonás és relatív antociántartalom meghatározása A középsı levélér eltávolítása után 250 mg levelet 2x1 ml 1 N HCl-metanol oldatban kvarchomokkal dörzsmozsárban eldörzsöltünk, majd a növényi kivonatot centrifugáltuk (4°C, 20 perc, 12000g). Az antociántartalom meghatározása spektrofotometriásan történt UV-VIS spektrofotométerben (Shimadzu 160-A, Japán). A készüléket az izoláló oldattal nulláztuk. Az antociánokat tartalmazó felülúszó 530 nm-en leolvasott abszorbanciáját a 479 nm-en mért nem-specifikus abszorbancia értékkel korrigáltuk. Az ábrákon az 1 g friss tömegre vonatkozó abszorbancia különbségeket (A530-A479/g friss tömeg) adtuk meg (LANGE és mtsai., 1970).
4.8. Hajtáshossz mérése Az UV-B kamrakísérleteknél lemértük az egyes növények hajtáshosszát a talajfelszín és a felszíntıl legtávolabb lévı levélcsúcs közötti távolság cm-ben történı kifejezésével.
4.9. Szabadföldi kísérletek UV-B sugárzási adatai és statisztikai értékelésük Az UV-B sugárzási adatokat Chile és Magyarország Meteorológiai Szolgálata bocsátotta rendelkezésünkre. A statisztikai értékeléshez (két- és háromtényezıs varianciaanalízis) az AGROBASE’99 ANOVA programját használtuk.
4.10. Statisztikai analízis Az eredmények 30 ismétlés átlagai a klorofilltartalom-mérés, 15 ismétlés átlagai a klorofill fluoreszcencia-indukciós és a hajtáshossz mérések, 5 mérés átlagai a gázcsere, 5 mérés átlagai az enzimaktivitás és 4 mérés átlagai az antociántartalom meghatározás esetében. A szignifikancia vizsgálathoz a Student-féle kétmintás t-próbát használtuk. Az eredmények feldolgozása Microsoft Excel programmal történt.
62
5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 5.1. SMM-kezelések 5.1.1. SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására 5°C-on Kísérleteink elsı részében arra a kérdésre kerestünk választ, hogy 5°C-os hidegkezelés során aktiválódnak-e az egyes antioxidáns enzimek, valamint arra, hogy a kontroll és az SMM-kezelt növények között mutatkozik-e különbség e tekintetben. Ennek érdekében a hidegkezelés 1., 4. és 6. napján a 3. levélbıl vett mintákból mértük a GR, GST, CAT, APX és a POD antioxidáns enzimek aktivitását. Eredményeink alapján (6. ábra) megállapíthatjuk, hogy mindegyik vizsgált antioxidáns enzim aktiválódott az 5°C-os hidegkezelés hatására, bár különbözı mértékben és ütemben. A GR, a GST és a CAT aktivitása már az elsı napra elérte a maximumát. A GR és a CAT aktivitása jelentısebb mértékben, kb. kétszeresére nıtt, a GST ezzel szemben csak mintegy másfélszeresére. A CAT esetében azonban már a 4. naptól csökkenı tendenciát tapasztaltunk, míg a másik két enzim a 6. napig megtartotta magasabb aktivitását. Az APX aktivitása igen nagymértékben emelkedett a hidegkezelés hatására, már az elsı napon kétszeresére, a negyedik napra pedig a maximumát elérve ötszörösére növekedett. A POD az elsı napon még nem mutatott változást, aktivitása a 4. napra is csak kis mértékben, nem szignifikáns mértékben nıtt meg. Az SMM kezelés hatására különbséget mutattunk ki egyes enzimek aktiválódásának ütemében és mértékében. A hidegkezelés során a GR, a GST és a CAT enzimek az elsı napon hasonló mértékben aktiválódtak az SMM-kezelt és a kontroll növényekben, azonban az SMM kezelés hatására aktivitásuk a 4. napra tovább nıtt, és így szignifikáns mértékben meghaladta a kontroll növényekét. A 6. napra azonban már mindhárom enzimnek csökkent aktivitása (a katalázé legnagyobb mértékben). Az APX már az elsı napon nagyobb mértékben aktiválódott az SMM hatására, több mint kétszeresére nıtt az enzim aktivitása. A 4. napon is hasonlóan magas aktivitás volt megfigyelhetı, 6. napon azonban csökkent, így kisebb különbséget mutatott a kontroll növényekhez képest. A POD aktivitása a kontrollhoz viszonyítva korábban, már az elsı napon is jelentıs mértékben megnıtt az SMM-kezelt növényekben. Ez az aktivitás - bár csökkent a hosszú hidegperiódus alatt - még a 6. napon is szignifikánsan magasabb maradt, mint a kontroll növényé (6. ábra). 63
0,10
*
1.nap
4.nap
6.nap
5°C
5°C
5°C
∆ A412 min
-1
***
A
0,05 0,00 22°C
0,10 ∆ A412 min
-1
*
B
0,05 0,00 22°C
1.nap
4.nap
6.nap
5°C
5°C
5°C
0,02 -1
∆ A240 min
C
***
0,01 kontroll SMM
0,00
∆ A290 min
-1
22°C
0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
1.nap
4.nap
6.nap
5°C
5°C
5°C
D
*
22°C
1.nap
4.nap
6.nap
5°C
5°C
5°C
∆ A470 min
-1
0,40 ***
0,30
*
E
0,20 0,10 0,00 22°C
1.nap
4.nap
6.nap
5°C
5°C
5°C
6. ábra. A hidegkezelés (5ºC, 1, 4, 6 nap) hatása a GR (A), a GST (B), a CAT (C), az APX (D) és a POD (E) aktivitására kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,***: szignifikáns P≤0.05, és 0.001 szinten a kontroll aktivitáshoz képest.
64
Az eredmények ismeretében elmondható, hogy az SMM-kezelt növényekben a GR, a GST és a CAT aktivitása a legnagyobb mértékben a hidegkezelés 4. napjára nıtt meg. Az APX-nél az aktiválódás ütemét gyorsította fel az SMM, míg a POD-nál mind az aktiválódás ütemére, mind mértékére pozitív hatással volt az SMM kezelés. 5.1.2. SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett A
továbbiakban
tanulmányoztuk
az
a SMM
chilling
hımérséklet
szélesebb
kukorica
csíranövények
hatását
tartományában antioxidáns
enzimrendszerére hımérséklet gradiens (14, 12, 10, 8 és 6°C) mellett (7. ábra). Az enzimaktivitás méréseket a hidegkezelés 4. napján végeztük a 3. levélbıl vett minták segítségével. A GR aktivitása a kontroll növényekben 10°C-on kezdett emelkedni, maximumát a 8°C-os hidegkezelés során érte el. Az SMM-kezelés hatására csak 8°Con indult meg az enzim aktiválódása, és 6°C-on még tovább erısödött, így szignifikánsan meghaladta a kontroll növényekben mért értéket. A GST aktivitása a 10°C körüli hımérsékleteken valamivel magasabb volt a kontroll növényekben, mint az SMM-kezeltekben, az alacsonyabb, 6°C-os hımérsékleteken azonban már csökkent a kontroll növényekben. Az SMM hatása viszont ezen a hımérsékleten jelentkezett igazán; a GST aktivitás 6°C-on szignifikánsan magasabbnak bizonyult mind a kontroll növényekéhez, mind pedig a 10°C-hoz közeli hımérsékleteken tartott SMM-kezelt növényekéhez képest. A CAT aktivitása hideg hatására a kontroll és az SMM-kezelt növényekben egyaránt fokozatosan emelkedett, bár végig nagyon alacsony értéket képviselt, szignifikáns különbség nélkül. Az APX aktivitásában nem mutatkozott jelentıs különbség a kontroll növényekben a különbözı mértékő hidegkezelések között. Az SMM-kezelés hatására azonban minden hımérsékleten szignifikánsan magasabb értéket ért el az enzim aktivitása. A legmagasabb aktivitást 8°C-on tapasztaltuk. A POD aktivitása szintén nem változott számottevıen a kontroll növényekben a különbözı hımérsékletek mellett. Az SMM hatására azonban 6°C-on érte el az enzimaktivitás a maximumát, meghaladva a kontroll növényekben 6°C-on mért értéket (7. ábra).
65
∆ A412 min
-1
0,10 **
**
A
0,05
0,00
14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
0,10 -1
∆ A340 min
B
** *
0,05
0,00 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
0,010
∆ A240 min
-1
C 0,005
0,000 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
**
**
*
***
*
12°C
10°C
8°C
6°C
∆ A290 min
-1
0,10
D
0,05
0,00 14°C
∆ A470 min
-1
0,30
**
0,20
E
0,10 0,00 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
kontroll SMM
7. ábra. GR (A), GST (B), CAT (C), APX (D), POD (E) aktivitása kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid) alacsony hımérsékleti grádiens (14-6ºC, 4. nap) mellett. *,**,***: szignifikáns P≤0.05, 0.01 és 0.001 szinten a kontroll aktivitáshoz képest
66
Megfigyeléseink alapján megállapíthatjuk, hogy az SMM-kezelés hatása elsısorban alacsonyabb hımérsékleten számottevı: 6°C-on megnövelte a GR, valamint a GST és a POD aktivitását a kontrollhoz képest. Az APX esetében az alacsony hımérsékleti grádiens valamennyi hımérsékletén megmutatkozott az SMM enzimaktivitást fokozó hatása.
5.1.3. SMM-kezelés hatása a fotoszintézisre chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett
Chilling hımérsékleti gradiens mellett az SMM-kezelés fotoszintézisre gyakorolt hatását is megvizsgáltuk fluoreszcencia-indukció mérés, fotoszintetikus aktivitás,
intercelluláris
széndioxid-koncentráció
és
relatív
klorofilltartalom
meghatározás segítségével. Mindegyik vizsgálatot a hidegkezelés 1., 3. és 4. napján végeztük a legfiatalabb, teljesen kifejlett 3. levélen.
5.1.3.1. A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai A PSII maximális kvantumhatékonyságát jelzı Fv/Fm paraméter meghatározás eredményeit a 8. ábra mutatja be. Az eredmények alapján megállapítható, hogy chilling hımérsékleti tartomány legalacsonyabb értékei (6 és 8°C) mellett voltak mérhetık a legalacsonyabb Fv/Fm hányados értékek a kontroll növényekben, a hideg kezelés teljes ideje alatt. SMMkezelés hatására e paraméter értéke e két hımérséklet mellett (6 és 8°C) szignifikánsan növekedett a kontrollhoz képest, a mérés mindhárom napján. A 3. és 4. napon, 12°Con is szignifikáns növekedést mutatott az Fv/Fm érték az SMM-kezelt növényekben, a kontrollhoz viszonyítva. Mindez arra utal, hogy e vegyület védıhatást biztosított a második fotokémiai rendszer mőködése számára a chilling hımérséklet károsító hatásaival szemben.
67
Fv/Fm
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
Fv/Fm
14°C 12°C 10°C
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
*
Fv/Fm
*** A
8°C
6°C
*
**
B
control SMM
14°C 12°C 10°C 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
**
*
8°C
*
14°C 12°C 10°C
8°C
6°C
*
C
6°C
o
Hımérséklet ( C)
8. ábra. A PSII maximális kvantumhatékonyságát jelzı fluoreszcencia-indukciós paraméter (Fv/Fm) változásai hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,**,***: szignifikáns P≤0.05, 0.01 és 0.001 szinten a kontrollhoz képest.
68
5.1.3.2. A fotoszintetikus aktivitás és az intercelluláris CO2 tartalom alakulásának összefüggései
E kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a chilling hımérsékleti gradiens hogyan befolyásolja a növények fotoszintetikus aktivitását és az intercelluláris szén-dioxid koncentrációt. Az eredményeket a 9-10. ábra mutatja be. 10 A [µ mol CO2 m-2 s-1]
**
***
**
A
5
0 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
A [µ mol CO 2 m -2 s-1]
10 *
*
**
B control
5
SMM
0 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
A [µ mol CO 2 m -2 s-1]
10
*
*** C
**
5
0 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
o
Hımérséklet ( C)
9. ábra. A fotoszintetikus aktivitás változása hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,**,***: szignifikáns P≤0.05, 0.01 és 0.001 szinten a kontrollhoz képest.
69
Ci [µ mol CO 2(mol air) -1]
500 ***
***
14°C
12°C
10°C
*
*
A
200 100 0 8°C
*
6°C
***
B
400 300
control
200
SMM
100 0 14°C
12°C
10°C
500 Ci [µ mol CO 2(mol air) -1]
***
300
500 Ci [µ mol CO 2(mol air) -1]
*
400
8°C
*
6°C
*** C
400 300 200 100 0 14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
Hımérséklet (o C)
10. ábra. Intercelluláris CO2-koncentráció (Ci) változásai hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,***: szignifikáns P≤0.05 és 0.001 szinten a kontrollhoz képest.
A 9. ábra alapján az a tendencia látszik, hogy a hımérséklet csökkenést többségében fokozatosan csökkenı mértékő fotoszintetikus aktivitás követi mind a kontroll, mind az SMM-kezelt növények esetében. Azonban az SMM-kezelés hatására több esetben is szignifikáns fotoszintézis aktivitás-növekedést tapasztaltunk a 70
kontrollhoz képest: a legalacsonyabb hımérséklet mellett, 6°C-on a hideg kezelés mindhárom mérési napján, 8°C-on a 3. napon, 10°C-on az 1. és 3. napon, 12°C-on az 1. és 4. napon. A 10. ábra alapján megállapítható, hogy az intercelluláris szén-dioxid koncentráció értékek korrelálnak a fotoszintetikus aktivitás eredményeivel: a hideg kezelés 3., 4. napján 6°C-on a Ci értékek szignifikáns csökkenése volt megfigyelhetı az SMM-kezelt növényekben a kontrollhoz képest, az 1. és 3. napon pedig a 10, 12 és 14°C-os hımérsékletnek kitett növényekben szintúgy.
5.1.3.3. Az SMM hatása stresszvédı metabolitok keletkezésére A különbözı mértékő chilling stressz hatására fellépı válaszreakciók során keletkezı stresszvédı fenoloidok keletkezését jellegzetes, 430 és 450 nm között (F440) a kék, illetve 520-530 nm-nél a zöld tartományban maximumot (F520) mutató fluoreszcencia emissziójuk alapján floureszcencia leképezı módszerrel követtük nyomon, összevetve a fotoszintetikus apparátus állapotváltozásait jellemzı vörös (F690) és távoli vörös (F740) hullámhosszaknál mérhetı, fıként a klorofill-a fluoreszcenciájából adódó emisszió változásokkal. Megállapítottuk, hogy a 22 oC-on nevelt növényekben 4 nappal az SMM kezelést követıen a fenoloidok klorofill-a-hoz viszonyított fluoreszcencia emissziója mind a kék tartományban (440/690, 440/740), mind a zöld tartományban (520/690, 520/740) mintegy 5-8 %-al kisebb, mint a kontroll növényekben. A hidegstressz során azonban az SMM kezelt növényekben sokkal nagyobb mértékben emelkedik a 440 és 520 nm-nél mérhetı fluoreszcencia, mint a kontroll növényeknél. Az SMM hatására bekövetkezı fluoreszcencianövekedés mértéke a 6 oC-os hidegstressznek kitett növényeknél a legmagasabb (1. táblázat).
71
1. táblázat. 4 napos hidegstressznek kitett levelek fluoreszcencia arányainak hımérsékletfüggése kontroll és SMM kezelt kukoricában
Treatment Control 6 °C SMM 6 °C Control 8°C SMM 8 °C Control 10 °C SMM 10 °C Control 12 °C SMM 12 °C Control 14 °C SMM 14 °C
Fluorescence ratio at 440/690 nm 1,324
Fluorescence ratio at 440/740 0,806
Fluorescence Fluorescence Fluorescence ratio at ratio at ratio at 520/690 520/740 690/740 0,815 0,499 0,647
2,234
1,164
1,210
0,631
0,524
2,948
1,636
1,669
0,928
0,554
3,584
1,935
1,986
1,082
0,515
3,142
1,715
1,688
0,993
0,546
3,328
1,715
1,953
1,006
0,513
3,610
2,060
2,185
1,247
0,572
3,408
1,834
1,905
1,088
0,534
2,562
1,290
1,472
0,742
0,507
2,669
1,881
1,517
0,785
0,516
5.1.3.4. SMM-kezelés hatása a relatív klorofilltartalomra chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett
A relatív klorofilltartalom alakulása chilling hımérséklet és SMM-kezelés hatására hasonló tendenciát mutatott, mint az Fv/Fm hányados esetében (11. ábra). A két legalacsonyabb hımérsékleten, 6 és 8 °C-on szignifikáns relatív klorofill-többlet volt kimutatható az SMM-kezelt növényekben a kontrollhoz képest, a hidegkezelés mindhárom napján. 10°C-on a hidegkezelés elsı és második napján, 14°C-on 1 napos hidegkezelés után a növények relatív klorofilltartalma az SMM-kezelés hatására szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontroll növényeké. Az eredmények azt igazolják, hogy e vegyület a kevésbé károsodott struktúrák miatt megakadályozza a klorofilltartalom csökkenését.
72
50 Klorofill-tartalom (rel.)
*
***
***
** A
8°C
6°C
**
*** B
40 30 20 10 0
14°C
12°C 10°C
Klorofill-tartalom (rel.)
50
*
40 30
kontroll
20
SMM 10 0
14°C
12°C
10°C
8°C
6°C
Klorofill-tartalom (rel.)
50 **
*** C
8°C
6°C
40 30 20 10 0 14°C
12°C
10°C
o
Hımérséklet ( C)
11. ábra. Relatív klorofilltartalom hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,**,***: szignifikáns P≤0.05, 0.01 és 0.001 szinten a kontrollhoz képest.
73
5.1.4. Alacsony hımérsékleti stressz és SMM-kezelés hatására történt változások eredményeinek értékelése
Mind az 5°C-on, mind pedig a chilling hımérsékleti gradiens (14-6°C) mellett végzett végzett kísérletek eredményei kapcsán összefoglaló értékelésként elmondható, hogy a növényi stressztolerancia kialakulása kapcsolatban van az antioxidáns rendszerek aktivitásának emelkedésével. Az alacsony hımérsékleti stressznek kitett növényekben a membránok fluiditása csökken, az elektrontranszportlánc kevésbé mőködik, a membránkötött, illetve hidegérzékeny enzimek aktivitása csökken, vagy elvész. A membránintegritás csökkenése növeli a reaktív oxigén vegyületek keletkezésének és az oxidatív stressznek a veszélyét. A megnövekedett ROS szintje kiváltja az antioxidáns enzimek aktivitásának up-regulációját, mely folyamat megvédi a növényeket az oxidatív stressz károsító hatásaival szemben (DAVEY et al. 2000). Az antioxidáns védekezı rendszer aktivitásának növekedése a kedvezıtlen környezeti stresszorokkal szemben hosszú idı alatt alakul ki és ezt a folyamatot nevezzük adaptációnak. A szubtropikus eredető gazdasági növények közül nagy számban vannak olyanok (pl. kukorica, rizs, paradicsom, paprika, tök, uborka stb.), melyeket a mérsékelt égöv alatt is, de nem optimális körülmények mellett termesztenek, és ezek a fajok eredetileg nem rendelkeztek a fent említett védekezı mechanizmusokkal. Ebben az esetben a növénynemesítés feladata megfelelı toleranciával rendelkezı genotípusok szelektálása és ezek segítségével toleráns fajták elıállítása. Ez a folyamat azonban fajtól függıen - sok idıt vesz igénybe. Az utóbbi évtizedben egyre több kutató foglalkozott olyan, az anyagcserében is szerepet játszó vegyületekkel, melyek külsı alkalmazásával növelni lehetett az antioxidáns rendszerek teljesítményét. Ilyen vegyületek többek között a poliaminok (ZHANG és mtsai. 2009), a szalicilsav és származékai (JANDA és mtsai. 1999; KANG és mtsai. 2003; WANG és LI, 2006), metiljazmonsav (CAO és mtsai. 2009), valamint az általunk is alkalmazott SMM (GYETVAI és mtsai. 2002; RÁCZ és mtsai. 2008; SZEGİ és mtsai. 2009). Az SMM szabályozza a metionin és az AdoMet szinteket, a kén transzportot és kiinduló vegyülete az eddig ismert legerısebb növényi ozmoprotektáns, a DMSP kloroplasztiszban történı szintézisének (HANSON és mtsai. 1994). Védi a fotoszintetikus apparátust, elsısorban a PSII rendszert, átalakulása révén részt vesz a spermidin szintézisben, amely viszont a 74
sejt membránok integritását biztosítja (RÁCZ és mtsai. 2008; SZEGİ és mtsai. 2009). Adataink alapján az SMM hatására emelkedik egyes antioxidáns enzimek aktivitása, és ezen keresztül részt vesz az ROS eliminálásában. Több szerzı kiemeli az APX és GR szerepét a H2O2 szint csökkentésében (NOCTOR és FOYER, 1998; ASADA, 1992; MITTOVA és mtsai., 2000; SHIGEOKA és mtsai., 2002). Mivel a kloroplasztiszokban nincs katalázaktivitás, így az ott keletkezı H2O2-t az ún. aszkorbát-glutation ciklus semlegesíti az APX segítségével. E folyamat végén keletkezı oxidált glutationt a GR redukálja NADPH felhasználásával. Ezt a megfigyelést támasztja alá chilling hımérsékleten az SMM-kezelt növényekben tapasztalható GR és APX aktivitás növekedése is. Kutatásaink során mi is azt igazoltuk, hogy az APX jelentısége meghatározó, hiszen a kukorica levélben az alacsony hımérséklet gradiens valamennyi értékénél az SMM növelte tudta az enzim aktivitását, hozzájárulva a chilling okozta károk kivédéséhez, ill. enyhítéséhez. A GST-vel kapcsolatban meg kell említeni, hogy összetett funkciójú enzim. Szubsztrátként ugyan glutationt használ, ami redoxállapot-szabályozó a sejtben, így számít a GST mennyisége, illetve rendelkezésre állása. Nagyon fontos a GST, mint az intracelluláris
transzportfolyamatokban
szállított
komplexek
létrehozója
és
méregtelenítı, ugyanis az általa létrehozott glutationhoz kötıdı vegyületek azok, legyenek akár antociánok, akár toxikus anyagok - amik transzportálhatók. Az összefoglaló munkák rámutatnak arra is, hogy az exogén módon használt vegyületek, a különbözı abiotikus stresszorokhoz hasonlóan nem egyformán hatnak az egyes antioxidáns enzimekre. Ez jól kimutatható a poliaminok, szalicilsav és az SMM esetében is. További kiterjedt vizsgálatokra van szükség ahhoz, hogy az antioxidáns enzimek kedvezıtlen körülmények alatti eltérı viselkedését, azaz aktivitásbeli különbözıségüket meg tudjuk magyarázni. Az SMM fotoszintézisre gyakorolt kedvezı hatása feltehetıen annak köszönhetı, hogy közvetlenül, vagy közvetetten a poliaminokon át megnyilvánuló membránvédı és gyökvédı hatása révén csökkenti a membránkárosodásokat, elısegítve
a fotoszintetikus
membránok integritásának és
a fotoszintetikus
elektrontranszport láncban részt venni képes PSII reakciócentrumok, valamint a fotoszintetikus apparátus további szupramolekuláris komplexei épségének és funkcióképességének megırzését. Ez jelentıs funkció megırzı hatást eredményezhet, 75
különös tekintettel arra, hogy a javító enzimaktivitások és az új fehérjék és pigmentek szintézise alacsony hımérsékleten jellemzıen kisebb sebességgel megy végbe, vagy nem is történik meg. A fotoszintetikus apparátus kisebb mértékő károsodása az SMM kezelt növényeknél abban is megnyilvánul, hogy az SMM kezelt növények fotoszintetikus aktivitása magasabb értéken marad, mint a kontroll növényeké. Ez feltehetıen azzal magyarázható,
hogy
a
kukorica,
lévén
C4-es
növény,
alacsonyabb
CO2
koncentrációknál is maximális hatékonysággal tud széndioxidot megkötni, így a fotoszintezis
hatékonysága
inkább
a
fotoszintetikus
elektrontranszportlánc
mőködésének hatékonyságától, semmint az aktuálisan valamelyest csökkent CO2 mennyiségtıl függ. Fluoreszcencia leképezı vizsgálatokkal nyomonkövetve a kék és a zöld fluoreszcencia
emisszió
növekedést
elıidézı
fenoloidok
(hidroxifahéjsav
származékok, ferulasav észterek, p-kumársav), és flavonoidok (pl. kempferol és kvercetin) mennyiségében bekövetkezı változásokat megfigyelhetı volt, hogy noha a hidegstressz
önmagában
is
elıidéz
növekedést
ezen
stresszvédı
anyagok
mennyiségében, az SMM elıkezelést követıen nagyobb mértékben emelkedik a hidegstressz során 440 és 520 nm-nél mérhetı fluoreszcencia, mint a kontroll növényeknél. A fluoreszcencia-növekedés mértéke a 6 oC-os hidegstressznek kitett SMM kezelt növényeknél a legmagasabb. E kísérletek eredményei - összhangban a korábbi vizsgálatok eredményeivel - az SMM sokoldalú szerepét támasztják alá a hidegstressz elleni védelemben, mely a fotoszintetikus apparátus funkcióképességének megóvásában, valamint a stresszvédelemben szerepet játszó metabolitok szintézisének növelésében egyaránt megnyilvánul.
76
5.2. A magasabb szabadföldi UV-B sugárzás és a növényi antociántartalom alakulásának összefüggései
A 2 kísérleti helyen, Martonvásáron és Buin-ban (Chile), az 5 kísérleti év 3 azonos hónapjára számított biológiailag effektív UV-B sugárzás szignifikánsan eltért egymástól. Ez a különbség Chilében közel +28%-ot jelentett. A legnagyobb különbség 2001-ben volt, amikor is a Chilében mért adatok 37 %-kal voltak nagyobbak, mint Magyarországon. Az adatok elemzése során azt is megállapítottuk, hogy a szórás értéke Magyarországon volt nagyobb. Nálunk a napi adatok között lényeges ingadozás volt megfigyelhetı, ugyanakkor Chilében - e hónapokra jellemzı teljesen felhıtlen égbolt miatt - ez nem volt tapasztalható (12. ábra).
Buin 30 25
MED 20 Martonvásár
15 10 5 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 days
12.ábra. A biológiailag effektív UV-B sugárzás napi összegeinek átlagos menete 5 év (2000-2004) alapján, az év egymásnak megfelelı idıszakaiban Buinban (Chile) [november, december, január] és 2 Martonvásáron [május, június, július] 1 MED=21 mJ/m , MED= Minimális Erythema Dózis
Mind az 5 évben ugyanazzal a 10 beltenyésztett (5 korai: L2-E, L3-E, L4-E, L9E, L10-E és 5 közép-, illetve késıi tenyészidejő: L1-L, L5-L, L6-L, L7-L, L8-L) kukoricavonallal dolgoztunk. A két- és háromtényezıs varianciaanalízisek eredményei alapján a következıket állapíthatjuk meg: a Chilébıl hozott minták relatív 77
antociántartalma - a 10 vonal és az 5 év átlagában - szignifikánsan (16%-kal) nagyobb volt, mint a Magyarországon vett minták (Buin: A530-479 = 0,555, Martonvásár: A530-479 = 0,478) abszorbancia átlagértékei (2. táblázat). A háromtényezıs varianciaanalízis eredménytáblázatainak MQ értékei alapján megállapítható, hogy a levelek antociántartalmára legnagyobb hatása a helynek volt, ezt követte a genotípusok hatása, míg a tényezık közül a vizsgált tulajdonságra a legkisebb befolyást az évjárat gyakorolta. A kölcsönhatások közül legnagyobb volt a fajta x hely, fajta x év, majd ezt követte az év x hely interakció. A vizsgált tulajdonságnál a tényezık fı hatása és a kölcsönhatások P = 0,1%-os szinten szignifikánsak voltak. 2. táblázat. A relatív antociántartalomban jelentkezı különbségek beltenyésztett kukoricavonalak leveleiben 2 eltérı kísérleti helyen 5 év átlagában. LSD5%=0,023 (vonalak között), LSD5%=0,010 (kísérleti helyek között), LSD5%=0,016 (évek között). A táblázatban szereplı számok az abszorbancia különbségeket (A530-A479 nm/g friss tömeg) mutatják.
MARTONVÁSÁR (HUNGARY) YEARS No.
LINES
2000 2001 2002 2003 2004
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
L1-L L2-E L3-E L4-E L5-L L6-L L7-L L8-L L9-E L10-E
0,566 0,257 0,371 0,308 0,692 0,223 0,390 0,472 0,473 0,333
MEAN OF YEARS
0,800 0,229 0,357 0,387 0,863 0,674 0,590 0,860 0,206 0,436
0,680 0,238 0,434 0,209 0,731 0,501 0,685 0,604 0,390 0,385
0,659 0,312 0,301 0,430 0,672 0,460 0,479 0,344 0,454 0,338
BUIN (CHILE) YEARS
MEAN OF LINES
2000 2001 2002 2003 2004
0,684 0,293 0,681 0,311 0,730 0,704 0,333 0,474 0,423 0,366
0,678 0,266 0,429 0,329 0,737 0,513 0,495 0,551 0,407 0,372
0,776 0,358 0,381 0,568 0,564 0,428 0,621 0,595 0,660 0,440
0,622 0,536 0,608 0,291 0,587 0,429 0,464 0,657 0,639 0,384
0,674 0,457 0,537 0,480 0,615 0,506 0,526 0,641 0,582 0,524
0,409 0,540 0,486 0,454 0,500
0,478
0,539 0,617 0,509 0,583 0,522
0,554
78
0,616 0,463 0,523 0,580 0,809 0,734 0,447 0,754 0,562 0,681
0,675 0,350 0,512 0,542 0,474 0,370 0,528 0,520 0,483 0,639
0,679 0,578 0,660 0,420 0,640 0,566 0,569 0,682 0,566 0,476
MEAN OF LINES
A 13. ábrán az egyes években kapott relatív antociántartalom értéket tüntettük fel a két kísérleti helyen. Mind az 5 kísérleti évben a chilei minták átlagértékei voltak magasabbak.
0,8
A530-A479/g
0,617 0,583
0,6
0,539
0,540
0,522
0,509 0,500
0,486
0,454
0,409
0,4
0,2
0,0 2000
2001
2002 Martonvásár
2003
2004
Buin
13. ábra. Tíz beltenyésztett kukoricavonal leveleiben mért abszorbancia értékek 5 év átlagában, 2 kísérleti helyen (Martonvásár, Buin).
Mindez arra enged következtetni, hogy a kukoricára is feltehetıen negatívan ható biológiailag effektív és igazolhatóan nagyobb UV-B sugárzás a kukorica genotípusok átlagában anyagcsere szinten történı válaszreakciót eredményezett. Nagyobb UV-B sugárzás hatására az antocián szintézis a legtöbb genotípusnál aktiválódik. Míg a késıi beltenyésztett vonalaknál az amúgy is magasabb antociántartalom értékek gyakorlatilag változatlanok a megnövekedett UV-B sugárzás hatására, addig az 5 korai (F2, CM7, stb. rokonsági körbe tartozó) anyagnál (L2-E, L3E, L4-E, L9-E, L10-E) igen jelentıs, antociántartalom növekedés volt megfigyelhetı 5 év átlagában. Ezen az anyagoknál az évenkénti chilei értékek is kivétel nélkül mind szignifikánsan magasabbak voltak, az ottani tenyészkerti munkáknál fıleg e genotípusoknál találtunk többször virágzásbeli aszinkronizációt és meddıséget. (Volt olyan év, hogy egyes vonalak fajtafenntartása a nıvirágzat megjelenésének hiányában egyáltalán nem sikerült.)
79
A 2. táblázat adatainak részletes elemzése alapján megállapítható, hogy a késıi tenyészidejő vonalaknál az 5 év átlagában mindkét helyen közel azonos és magas értékek voltak. Ezek közül az egyik legkésıbbi tenyészidejő, L1-L jelzéső beltenyésztett vonal szintetizálta a legtöbb antociánt. A korai érésidejőek között találtunk olyan beltenyésztett vonalat, melyek ugyanazon a helyen minden évben szinte azonos reakciót mutattak (pl. L2-E, L4-E). Más korai vonalaknál (L9-E, L10-E) pedig a kapott értékek közötti szórás jóval nagyobb volt. Mindez feltehetıen azt igazolja, hogy az eltérı genotípusú kukoricavonalak között magasabb UV-B sugárzásra adott válaszreakciók tekintetében lényeges különbségek vannak. Az évek és termıhelyek átlagában (14. ábra) e korai anyagoknál a spektrofotometriásan mérhetı növekmény chilei átlagértéke több mint 45%-kal volt magasabb, mint a Magyarországon mért érték. Az L2-E jelzéső vonalnál a chilei relatív antociántartalom növekedésének mértéke meghaladta a 71%-ot, de az L4-E, L9-E és az L10-E vonalaknál is ez az érték 40% feletti volt.
0,8
A530-A479/g
0,6
+42,8%
+25,2%
+41,0% +45,9%
+71,9%
0,4
0,2
0,0 L2-E
L3-E
L4-E Martonvásár
L9-E
L10-E
Buin
14. ábra. Öt korán érı beltenyésztett kukoricavonal abszorbancia értékei 3 év átlagában (2000-2002) 2 kísérleti helyen.
80
Az eredmények alapján megállapítható, hogy vannak olyan genotípusok (vizsgálatainkban a késıi tenyészidejőek), melyek relatív antociántartalma eleve magasabb, így az erısebb UV-B sugárzással szembeni védekezési mechanizmusuk adott, s feltehetıen ezért is maradtak el a látványos válaszreakciók. Kísérleteinkben ezek a vonalak bizonyultak stressztőrıbbeknek. Ezt erısítették meg a fiziológiai állapot jellemzésére szolgáló több hullámhosszú fluoreszcencia leképezés módszerével kapott eredmények is. Az 5 késıi vonalnál az F440/F690 arányok magas értékei azt jelzik (nincs bemutatva), hogy a kék spektrális tartományban fluoreszkáló anyagok (köztük valószínőleg a védelmi rendszerben jelentıs szerepet játszó antociánok) mennyisége ezeknél a legtöbb. Ezek a változások, a stressz akklimációként értékelhetık. Ugyanakkor vannak olyan - fıleg korai tenyészidejő - genotípusok, melyek leveleiben jóval alacsonyabb az antociántartalom, de egy nagyobb UV-B sugárzás következtében annak mennyisége ugrásszerően megnı. Ami viszont nem jelenti biztosan azt, hogy ez által e vonalak stressztőrıbbekké is válnának, mint ahogy erre - a chilei tapasztalataink alapján - a korábbiakban már utaltunk. A stresszeltségi szintet mutató F440/F690 arányok értékei ezeknél lényegesen alacsonyabbak voltak, jelezvén e vonalak kisebb mértékő akklimációs képességét. A több hullámhosszú leképzési technika képi megjelenítését egy késıi (L1) és egy korai (L2) beltenyésztett kukoricavonal leveleiben az UV-B sugárzás hatására (Martonvásár, 2006; UV-B sugárzási dózis: 21 MED) bekövetkezett változással mutatjuk be (15. ábra). Négy hullámhossznál - a kék (F440), a zöld (F520), a vörös (F690) és a távoli vörös (F740) spektrális tartományban - végeztük a fluoreszcencia leképzést. A különbözı stresszfaktorok (jelen esetben az UV-B sugárzás) által okozott funkciócsökkenés, megváltozott állapot képszerően megjeleníthetı, ami lehetıvé teszi a kukoricalevél különbözı részein bekövetkezı, eltérı változások regisztrálását a stressz kezdeti szakaszán már akkor is, amikor a károsodások még szabad szemmel nem láthatóak. A leképzési módszerrel kapott képek megbízható kiértékeléséhez a fotoszintézissel összefüggı, de más módszerekkel kapott értékekre (fotoszintetikus aktivitás, sztóma konduktancia, klorofill-a és -b , valamint antociánok mennyisége stb.) is szükség van.
81
15. ábra. Fluoreszcencia leképzési technika alkalmazása UV-B indukált élettani/biokémiai változások képi megjelenítésében L1 késıi (felsı ábra) és L2 korai (alsó ábra) éréső beltenyésztett kukoricavonalak leveleiben. Mintavétel idıpontja: 2006. július 25., az UV-B sugárzás mértéke: 21 MED
82
5.2.1. Szabadföldi UV-B kísérletek eredményeinek értékelése Az 5 éves kísérleti eredményeink azt mutatták, hogy a magasabb UV-B sugárzási szinten (Chilében) a vizsgálatba vont beltenyésztett kukoricavonalak levélmintáiban - a Magyarországon kapott (szignifikánsan alacsonyabb sugárzási szint) értékekhez képest - magasabb volt az abszorbcióban fontos szerepet játszó antociántartalom. Ez megegyezik CHAPPEL és HAHLBROCK (1984) következtetésével, valamint TEVINI és mtsai. (1991) rizsnél kapott eredményeivel, miszerint az epidermális sejtekben a magasabb UV-B sugárzást elnyelni képes flavonoid típusú pigmentek képzıdnek. Ugyanerre az eredményre jutott SANTOS és mtsai. (1993), a nagyobb
UV-B sugárdózist kapott hibridkukorica
levélminták vizsgálatánál.
Eredményeik alapján megállapították, hogy a kukorica esetében az UV-B sugárzás serkentette azoknak az enzimeknek a szintézisét (PAL, CHS), melyek kapcsolódnak a flavonoid anyagcsere úthoz. Az elektronmikroszkópos vizsgálatok alapján nem találtak károsodást a levélsejtekben, ami itt is feltehetıen a megemelkedett flavonoid szintnek tudható be. A mi adatainkhoz hasonló következtetés vonható le SANTOS és mtsai. (1998) eredményeibıl is, miszerint az erıs sugárzás következtében a pollenszemekben szignifikánsan megnövekedett az UV-B sugárzást elnyelı pigmentek mennyisége. Az abszorbancia különbség 30%-kal volt magasabb a kezelt növényeknél. Az általunk vizsgált 10 beltenyésztett vonalból az 5 korainál 5 év átlaga alapján a chilei minták 43%-kal mutattak magasabb abszorbancia értéket. Kísérleteinkben eltérı rokonsági körökhöz tartozó és eltérı érésidejő beltenyésztett kukoricavonalakat vizsgáltunk. A különbözı fajtáknál kapott igen eltérı abszorbancia értékek is azt igazolják, csak úgy, mint SEMENIUK és STEWART (1979), valamint MURALI és mtsai. (1988) eredményei, hogy nemcsak a különbözı növényfajok, hanem még a fajták között is van különbség az UV-B érzékenységben. Több éves adataink is azt mutatják, hogy UV-B stressznél a nagyobb sugárzást abszorbeáló antociánok szintézisében és a válaszreakciók milyenségében az eltérı kukorica genotípusok között lényeges különbségek vannak.
83
5.3. UV-B kezelés anyagcserére gyakorolt hatásai kukoricában 5.3.1. Az UV-B sugárzás antioxidáns enzimek aktivitására gyakorolt hatása
Az UV-B kezelés hatására bekövetkezı antioxidáns enzimaktivitás változásokat a 16. és 17. ábra szemlélteti. 0,10
∆ A412 min
-1
A
0,05
0,00 HMv651
CM7
0,10
A340 min -1
***
**
B
0,05 kontroll UV-B
0,00 HMv651
CM7
0,15
∆ A290 min
-1
**
C
0,10
0,05
0,00 HMv651
CM7
16. ábra. A GR (A), a GST (B), az APX (C) aktivitása kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben. **,***: szignifikáns P≤0.01 és 0.001 szinten a kontroll aktivitáshoz képest.
84
0,15
**
∆ A470 min
-1
*
D
0,10
0,05
0,00 HMv651
CM7
17. ábra. A POD (D) aktivitása kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben. *,**: szignifikáns P≤0.05 és 0.01 szinten a kontroll aktivitáshoz képest.
Az eredmények alapján megállapítható, hogy a GST és a POD enzimeknél mind a két genotípusban (HMv651, CM7) csökkent a kontrollhoz képest az UV-B-kezelt növények enzimaktivitása, míg a GR esetében szignifikáns változás nem volt kimutatható. Ezzel ellentétes tendenciát regisztráltunk az APX-nél, mely az egyetlen enzim volt, ahol szignifikáns aktivitás-növekedést tudtunk kimutatni a kezelt növényekben a kontrollhoz képest, de csak a CM7-es vonal esetében. Az UV-B kamrakísérletek keretében - az elıbb említett eredmények alapján elsısorban a GST és a POD vonatkozásában - kódszámmal ellátott beltenyésztett kukoricavonalsorozatokkal további méréseket végeztünk. Megfigyeléseink megerısítették az általunk már az imént említett 2 kukoricavonalban megállapított tényt, miszerint a magasabb UV-B sugárzás a POD és a GST enzimek aktivitásában nagymértékő csökkenést idézett elı (nem közölt eredmények).
5.3.2. A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai UV-B sugárzás hatására
A 2 beltenyésztett kukoricavonalban a PSII aktuális kvantumhatékonyságát illetıen eltérı tendencia volt tapasztalható. A HMv651-es vonalban a kontrollhoz képest szignifikánsan emelkedett az UV-B-kezelt növények ∆F/Fm’ paraméter értéke, míg a CM7-es genotípusban szignifikánsan csökkent (18. ábra). 85
0,8 *
**
0,7 0,6 ∆ F/Fm'
0,5 kontroll
0,4
UV-B
0,3 0,2 0,1 0,0 HMv651
CM7
18. ábra. A PSII aktuális kvantumhatékonyságát jelzı ∆F/Fm’ paraméter változása kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben. *,**: szignifikáns P≤0.05 és 0.01 szinten a kontrollhoz képest.
5.3.3. A fotoszintetikus aktivitás változása UV-B sugárzás hatására A 19. ábra alapján az a tendencia állapítható meg, hogy az UV-B-kezelésnek
kitett növények fotoszintetikus aktivitása csökkent a kontrolléhoz képest, de a különbség nem szignifikáns.
10
A (mmol CO 2 m -2 s-1)
8
6 kontroll UV-B 4
2
0 HMv651
CM7
19. ábra. A fotoszintetikus aktivitás kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben.
86
5.3.4. A relatív klorofilltartalom változásai UV-B sugárzás hatására UV-B kezelés hatására mindkét genotípusban szignifikánsan csökkent a relatív klorofilltartalom a kontrollhoz képest (20. ábra).
Klorofill-tartalom (rel.)
60 50
***
*
40 kontroll
30
UV-B
20 10 0 CM7
HMv651
20. ábra. Relatív klorofilltartalom kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben.*,***: szignifikáns P≤0.05 és 0.001 szinten a kontrollhoz képest.
5.3.5. A relatív antociántartalom változásai UV-B sugárzás hatására A 21. ábra alapján az állapítható meg, hogy a magasabb szintő UV-B sugárzás magasabb relatív antociántartalmat eredményezett a kontroll növényekéhez képest, bár a különbség nem volt szignifikáns. Antocián-tartalom (rel.)
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
kontroll
0,3
UV-B
0,2 0,1 0 HMv651
CM7
21. ábra. Relatív antociántartalom kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben.
87
5.3.6. UV-B kezelés hatása a növények hajtáshosszára Megállapítható a 22. ábra alapján, hogy az UV-B-kezelt növények alacsonyabbak voltak a kontrollhoz képest, a köztük lévı különbség szignifikáns volt. A HMv651 genotípus UV-B kezelt példányai átlagosan 15%-kal, a CM7 képviselıi mintegy 9,4%-kal voltak alacsonyabbak a kontrollhoz képest. 40 Magasság (cm)
***
***
30 kontroll
20
UV-B
10 0 HMv651
CM7
22. ábra. Növénymagasság-változások kontroll és UV-B kezelt kukoricanövényekben.***: szignifikáns P≤ 0.001 szinten a kontrollhoz képest.
5.3.7. UV-B kamrakísérletek eredményeinek értékelése 5.3.7.1. Az UV-B sugárzás antioxidáns enzimek aktivitására gyakorolt hatása Az alacsony hımérsékleti stressz és az SMM-kezelés eredményeinek értékelésében leírtakon kívül elmondható, hogy UV-B kezelés során az oxidatív károsodás megelızésében az antioxidáns enzimek közül az APX aktivitása növekszik (DAWAR és mtsai., 1998). Kísérleteink azt is igazolták, hogy az UV-B hatása különbözı mértékő, de szignifikáns aktivitáscsökkenést is eredményezhet. Ezt igazolják a POD és a GST enzimekkel összefüggı eredmények. E kísérletek egyik gyakorlat
szempontjából
fontos
célja
-
olyan
biokémiai/élettani
paraméter
„megtalálása”, mely alkalmas lehet a nemesítés szempontjából perspektívikus beltenyésztett kukoricavonalak UV-B érzékenységének elırejelzésére a növény korai fejlıdési stádiumában. További, kódszámmal ellátott kukoricavonalakban kapott eredmények azt valószínősítik, hogy a POD és a GST enzimeknél kapott szignifikáns
88
enzimaktivitás-csökkenés mértéke összefüggést mutat a kukoricavonalak UV-B érzékenységével.
5.3.7.2. Az UV-B kezelés fotoszintézisre gyakorolt hatása A PSII aktuális kvantumhatékonyságának vizsgálatát bemutató 18. ábra - a kezelt-kontroll növények értékei közti kis differencia - alapján arra lehet következtetni, hogy a növényeket nem érte jelentıs UV-B stresszhatás, így a PSII nem károsodott jelentısen a fényszakaszban. A fotoszintetikus aktivitás eredményeit bemutató 19. ábra ugyan nem mutatott szignifikáns különbséget a kezelt és a kontroll növények értékei között, de az a tendencia mutatkozott, hogy a magasabb szintő UV-B sugárzás hatására csökkent a növények fotoszintetikus aktivitása. Ennek oka a következı lehet: a Calvin-ciklus kulcsenzime, a Rubisco sérülékeny, egyrészt mivel elnyelést mutat az UVtartományban, másrészt mivel az enzim nagy alegysége a kloroplasztisz DNS-ben kódolt, és az UV-B sugárzás gátolja a nagy alegység fehérjéit kódoló gének expresszióját. Mindezt azok a kísérletek bizonyítják, melyek során az UV-B megvonás hatására egyrészt a Rubisco aktivitásának, másrészt a sejten belüli koncentrációjának növekedését figyelték meg (BISCHOF és mtsai., 2002). A Calvin-ciklusban a Rubisco gátlását az UV-B/PAR arány is erısen befolyásolja, ha az UV-B sugárzás szintje magas, a PAR szintje pedig alacsony. A mi vizsgálatainknál ez az arány volt jellemzı. Az UV-B sugárzás hatására - elsısorban alacsony PAR mellett - egyes fajoknál megfigyelték a fénygyőjtı-pigment proteinkomplexhez kapcsolódó fényvédı xantofill ciklus kulcsenzimének, a violaxantin dezepoxidáznak aktivitás csökkenését és emiatt a violaxantin-anteraxantin-zeaxantin átalakulás gátlását (PFÜNDEL és mtsai., 1992). Ezzel azonban nagymértékben növekszik a reaktív oxigénformák képzıdésének kockázata, ugyanis a zeaxantin - és valószínőleg az anteraxantin is - részt vesz a fotoszintetikus apparátusban a gerjesztési energiafelesleg hı formájában történı kisugárzásában. Az UV-B sugárzás hatására e védımechanizmusban bekövetkezı gátlás következményeként a kloroplasztisz membránok károsodása, a CO2-fixáció csökkenése és a kapcsolódó anyagcsere folyamatok zavara várható.
89
A relatív klorofilltartalom csökkenését magyarázhatja, hogy az UV-B sugárzás csökkenti a cab gén átírását is, mely az LHCII klorofill a/b kötı fehérjéinek szintéziséért felelıs, így hatására elmarad a funkcionális egységet alkotó LHCII és a PSII reakcióközpont összekapcsolódása (BERGO és mtsai., 2003). A klorofilltartalom csökkenésének az oka a fotodestrukció és a klorofill bioszintézis gátlása is. A mezıgazdasági
növények
vizsgálatával
foglalkozó
tanulmányok
alapján
megállapítható, hogy az UV-B sugárzás hatására a klorofilltartalom csökkenése a kétszikő fajokban nagyobb mértékő (10-78%), mint az egyszikőekben (0-33%) (KAKANI és mtsai., 2003). 5.3.7.3. A relatív antociántartalom változásai UV-B sugárzás hatására Az UV-B sugárzás hatására (de PAR és UV-A hatásra is), ha nem túlságosan nagy a dózisa, fokozódik azon gének kifejezıdése (BUCHHOLZ és mtsai., 1995), melyek a flavonoidok (flavonolok, flavonok, antocianinok) bioszintéziséért felelıs kulcsenzimeket (PAL, CHS) kódolják, így fokozódik a flavonoid-felhalmozódás a növényekben (DAWAR és mtsai., 1998), az epidermisz- és mezofillum sejtek citoplazmájában, az adaxiális levélepidermisz vakuólumaiban vagy a levélszırökben (HUTZLER és mtsai., 1998). 5.3.7.4. UV-B kezelés hatása a növények hajtáshosszára A növekedési rendellenességek molekuláris okai a DNS és/vagy a fitohormonok szerkezetében bekövetkezı változások. A megnyúlásos növekedést stimuláló fitohormon, az indolecetsav (IES) az UV-B-tartományban jól abszorbeál, és ennek következményeként fotolitikusan bomlik. Az IES-koncentráció csökkenése és a bomlás során képzıdı gátló hatású termék (3-metilén-oxindol) pedig csökkenti a hosszanti növekedést (ROS és TEVINI, 1995). Az UV-B sugárzásnak a növekedésre és a fejlıdésre gyakorolt hatását kapcsolatba hozzák az etilénprodukció megemelkedésével (PREDIERI és mtsai., 1995) is. Az UV-B hatására növekszik a peroxidázok (pl. IESoxidáz) aktivitása is, amelyek meghatározó szerepet játszanak a sejtmegnyúlás csökkentésében és az oxidatív gyökök közömbösítésében.
90
6. ÖSSZEFOGLALÁS A kukoricatermesztés biztonságát hazánkban több környezeti abiotikus stresszor is veszélyezteti. A kukorica korai fejlıdési szakaszában az alacsony hımérséklet, virágzáskor rendszerint a vízhiánnyal párosuló magas hımérséklet, majd a betakarítás elıtt a fagy. A nemesítési idı lerövidítése miatt az európai, és így a magyar nemesítı intézetek a második generáció felnevelését a déli félteke valamelyik országában végzik. Az itt - a mi esetünkben Chile-ben - tapasztalható lényegesen magasabb UV-B sugárzás viszont a beltenyésztett kukoricavonalak egy részénél virágzási anomáliákat okoz. Munkánkat az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézetben végeztük, így a kutatás középpontjába az alacsony hımérséklet és az UV-B sugárzás kukorica anyagcseréjére kifejtett hatásának tanulmányozása került. Az alacsony hımérséklettel (chilling hatás) összefüggı stresszélettani vizsgálatokat az intézet hımérséklet gradiens kamrájában, a martonvásári nemesítéső Norma hibriddel végeztük. Kísérleteink e részének feladata - az elmúlt években az anyagcsere más szintjén kapott eredményekre alapozva - annak bizonyítása volt, hogy a kénanyagcsere sokoldalú intermedier vegyülete, az S-metilmetionin (SMM) mennyiben tudja a kukorica korai fejlıdési stádiumában a sokszor bekövetkezı alacsony hımérséklettel szembeni érzékenységét csökkenteni. A kukoricánál általában 13°C az a hımérsékleti küszöbérték, mely alatt a klorofill lebomlása gyorsabb mértékő, mint annak szintézise. Ennek eredménye a levelek sárgulása, azaz a klorózis. Ebbıl adódóan munkánk súlypontját a fotoszintézis hatékonyságának tanulmányozása képezte. Folyadékkultúrás kísérleteink során alacsony hımérsékleti gradiens mellett (6-14ºC) - 1 napos 0,01 %-os SMM elıkezelés, majd azt követı 4 napos hidegkezelés után - elıször az alacsony hımérsékletre igen érzékeny második fotokémiai rendszer (PSII) mőködését, az azt reprezentáló Fv/Fm fluoreszcencia-indukciós paramétert mértük. Megállapítottuk, hogy az SMM-kezelés a legalacsonyabb (6, 8°C) - a kukorica számára csaknem letális károsodást okozó - hımérsékleteken növelni tudta az Fv/Fm hányadost, ami az SMM védıhatását bizonyította a chilling-érzékeny PSII számára. A fotoszintézis hatékonyságával szorosan összefügg a levelekben található relatív 91
klorofilltartalom. Igazoltuk, hogy az SMM a kevésbé károsodott struktúrák miatt megakadályozta a klorofilltartalom csökkenését. Ez abban mutatkozott meg, hogy a legalacsonyabb hımérsékleteken a kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan magasabb klorofilltartalmat mértünk. Az abiotikus stresszfaktoroknak, így az alacsony hımérsékletnek is az anyagcserét negatívan befolyásoló hatásának egyik fı oka a reaktív oxigénformák (ROS) felhalmozódása. A ROS elsıdleges hatáshelye a sejtek, illetve a sejtben található
sejtszervecskék
membránstruktúrája.
Ezek
hatástalanítását
a
sejtek
antioxidáns elemei (részben enzimek, részben nem enzimatikus vegyületek) végzik. Az antioxidáns rendszer válasza nagy fontosságú az alacsony hımérsékleti stresszel szembeni védelemben. Ezért a továbbiakban vizsgálataink középpontjába az antioxidáns rendszer egyes enzimeinek (glutation-reduktáz /GR/, aszkorbát-peroxidáz /APX/, gvajakol peroxidáz /POD/, glutation-S-transzferáz /GST/, kataláz /CAT/) vizsgálata került. A hımérséklet gradiens kamrában végzett kísérletek azt bizonyították, hogy SMM-kezelés hatására a GR, GST, CAT és a POD enzimek aktivitása a legalacsonyabb hımérsékleteken (5°C és 6°C) szignifikánsan emelkedett. Ugyanakkor az APX enzim a gradiens valamennyi hımérsékletén aktivitás-emelkedést mutatott. Az eredményekbıl az a következtetés vonható le, hogy az általunk vizsgált antioxidáns enzimek aktivitását az SMM-kezelés növelni tudta, és ez által részt vettek az alacsony hımérséklet indukálta reaktív oxigénformák eliminálásában elsısorban letális hımérsékleteken (5-6ºC). Ez lehetett az alapvetı ok, amiért az SMM növelni tudta a PSII rendszer aktivitását és gátolni a klorofilltartalom csökkenést a fiatal kukoricanövényekben, alacsony chilling hımérsékleten. Ezzel sikerült nemzetközi vonatkozásban elsıként bizonyítani az exogén módon adott S-metilmetionin alacsony hımérséklettel szembeni védıhatását kukoricában. A másik abiotikus stresszfaktor az UV-B sugárzás volt. Az emberi tevékenység eredményeképpen a megemelkedett UV-B szint kedvezıtlen hatást fejtett ki egyes beltenyésztett kukoricavonalak virágzására. Az UV-B kísérleteink két részbıl álltak. Az egyik részében ugyanazokkal a beltenyésztett vonalakkal végeztünk vizsgálatokat Martonvásáron, és Buin-ban (Chile). A vizsgálatok célja annak megállapítása volt,
92
hogy a hazánkéhoz viszonyítva kb.30%-kal magasabb UV-B sugárzás Chile-ben a vegetációs idıszakban milyen mértékben befolyásolja az antociántartalmat. Öt éves kísérletsorozat eredményeképpen igazoltuk, hogy az UV-B sugárzást elnyelı antociánok mennyisége átlagban 16-18%-kal volt magasabb, mint ugyanazon kukoricavonalakban Martonvásáron. Megállapítottuk azt is, hogy az UV-B indukált antociánok mennyisége a beltenyésztett kukoricavonalak származásától is függött. Figyelembe véve az UV-B sugárzás virágzási folyamatot befolyásoló hatását, arra kívántunk információt kapni, hogy milyen módon lehet elıre jelezni egy genotípus UV-B érzékenységét a kukorica korai fejlıdési stádiumában. Módszertani kísérletet végeztünk a martonvásári intézet UV-B kamrájában 2 eltérı származású, az UV-B sugárzással is eltérı viselkedéső beltenyésztett vonallal. Az eredmények azt mutatták, hogy az érzékeny (CM7) és a toleráns (HMv651) vonalakban a 3 hetes UVB kezelés hatására szignifikáns csökkenés volt kimutatható a növények magasságában, a relatív klorofilltartalomban, és nem szignifikáns csökkenés a fotoszintetikus aktivitást
illetıen. A két
beltenyésztett
kukoricavonalban
a
PSII
aktuális
kvantumhatékonyságát illetıen eltérı tendencia volt tapasztalható. A toleráns vonalban szignifikánsan emelkedett a ∆F/Fm’ paraméter mértéke, ugyanakkor az érzékeny genotípusban szignifikánsan csökkent. Különös figyelmet érdemelnek az antioxidáns enzimek analízise révén kapott eredmények. A GST és a POD enzimeknél mind a két genotípusban csökkent a kontrollhoz képest az UV-B-kezelt növények enzimaktivitása, míg a GR esetében szignifikáns változás nem volt kimutatható. Ezzel ellentétes tendenciát regisztráltunk az APX-nél, mely az egyetlen enzim volt, ahol szignifikáns aktivitás-növekedést tudtunk kimutatni a kezeltekben a kontrollhoz képest, de csak az érzékeny vonalban. További kísérleteket végeztünk az antioxidáns enzimek aktivitásváltozásával
kódolt beltenyésztett kukoricavonalakkal. Az itt kapott
eredmények egyértelmően azt igazolták, hogy az UV-B sugárzás a legnagyobb csökkenést a GST és a POD enzimek aktivitásában okozta. Az UV-B kamrában végzett módszertani kísérletekbıl az a következtetés vonható le, hogy a kukorica korai fejlıdési stádiumában elsısorban a POD és a GST enzimek aktivitásában beálló csökkenés lehet az a javasolt paraméter, melyeknek mérése révén a kukorica beltenyésztett vonalak UV-B érzékenységét elıre lehet jelezni. De ahhoz, hogy e
93
paraméterek értékei felhasználhatóak legyenek a kukoricanemesítık számára, nagyszámú genotípussal végzendı további kísérletekre van szükség. A kísérleti munkánk során felhasználtuk a hazánkban még teljesen új, a fluoreszcencia leképzésen alapuló laboratóriumi technikát. Az ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszékén mért eredmények azt igazolták, hogy e módszerrel az abiotikus stressznek a fotoszintetikus rendszerre történı hatása már akkor kimutatható, amikor a károsodás szabad szemmel még nem érzékelhetı. E módszerrel elért eredmények is igazolták, hogy az SMM-kezelés elısegíti a fiatal kukoricanövények túlélését letális hımérsékleteken.
94
7. IRODALOMJEGYZÉK Abrahamson, L., Shapiro, S.K. (1965): The biosynthesis of methionine: partial purification and properties of homocysteine methyltransferase of jack bean meal. Arch. Biochem. Biophys., 109, 376-382. Ádám, A., Bestwick, C.S., Barna, B., Mansfield, J.W. (1995): Enzymes regulating the accumulation of active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringae pv. Phaseolica. Planta 197, 240-249. Allamong, B.D., Abrahamson, L. (1977): Methyltransferase activity is dry and germinating wheat seedling. Bot. Gaz., 138, 46-51. Alvarez, M., Pennell, R., Meijer, P., Ishikawa, A., Dixon, R., Lamb, C. (1998): Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of pant immunity. Cell 92, 773-784. Anderson, J.G., Toohey, D. W., Brune, W. H. (1991): Free radicals within the Antarctic vortex: the role of CFCs in Antarctic ozone loss. Science, 251, 39-46. Aroca, R., Irigoyen, J.J., Sánchez-Díaz, M. (2001): Photosynthetic characteristics and protective mechanisms against oxidative stress during chilling and subsequent recovery in two maize varieties differing in chilling sensitivity. Plant Sci. 161, 719-726. Asada, K. (1992): Ascorbate-peroxidase: a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants. Physiol. Plant. 85, 235-241. Asada, K. (1999): The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, 601-639. Augspurger, N.R., Scherer, C.S., Garrow, T.A., Baker, D.H. (2005): Dietary Smethylmethionine, a component of foods, has choline-sparing activity in chickens. J. Nutr., 135, 1712-1717. Baker, N.R., Oxborough, K., Lawson, T., Morison, J.I.L. (2001): High resolution imaging of photosynthetic activities of tissues, cells and chloroplasts in leaves. J. Exp. Bot. 52, 615-621.
95
Ballaré, C.L., Barnes, W.P., Kendrick, R.E. (1991): Photomorphogenetic effects of UV-B radiation on hypocotil elongation in wild type and stable-phytochromedeficient mutant seedlings of cucumber. Physiol. Plant. 83, 651-658. Barabás, K.N., Szegletes, Z., Pestenácz, A., Fülöp, K., Erdei, L. (1998): Effects of excess of UV-B irradiation on the antioxidant defence mechanisms in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. J. Plant Physiol. 153, 146-153. Barnes, P.W., Flint, S.D., Caldwell, M.M. (1990): Morphological responses of crop and weed species of different growth forms to ultraviolet-B radiation. Am. J. Bot. 77, 1354-1360. Barzig, M., Malz, R. (2000): Fine structure, carbohydrates and photosynthetic pigments of sugar maize leaves under UV-B radiation. Environ. Exp. Bot. 43, 121-130. Basiouny, F.M., Van, T.K., Biggs, R.H. (1978): Some morphological and biochemical characteristics of C3 and C4 plants irradiated with UV-B. Physiol. Plant. 42, 2932. Bergo, E., Segalia, A., Giacometti, G.M., Tarantino, D., Soave, C., Andreucci, F., Barbato, R., (2003): Role of visible light in the recovery of photosystem II structure and function from from ultraviolet-B stress in higher plants. J. Exp. Bot. 1-9. Berry, J., Björkman, O. (1980): Photosynthetic response and adaptation to temperature in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 25, 403-411. Bielawski, W., Joy, K.W. (1986): Properties of gluthathione reductase from chloroplasts and roots of pea. Phytochemistry 25, 2261-2265. Bischof, K., Krabs, G., Wiencke, C., Hanelt, D. (2002): Solar ultraviolet radiation affects the activity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase and the composition of photosynthetic and xantophyll cycle pigments in the intertidal alva (Ulva lactuca L.). Planta 215, 502-509. Bolink, E.M., van Schalkwijk, I., Posthumus, F., van Hasselt, P.R. (2001): Growth under UV-B radiation increases tolerance to high-light stress in pea and bean plants. Plant Ecol. 154, 149-156.
96
Bouchereau, A., Aziz, A., Larher, F., Martin-Tanguy, J. (1999): Polyamines and environmental challenges: recent development. Plant Sci. 140, 103-125. Bourgis, F., Roje, S., Nuccio, L.M., Fisher, D.B., Tarczynski, M.C., Li, C., Herschbach, C., Rennenberg, H., Pimenta, M.J., Shen, T.L., Gage, D.A., Hanson, A.D. (1999): S-methylmethionine plays a major role in phloem sulfurtransport and is synthesized by a novel type of methyltransferase. Plant Cell, 11, 14851497. Böddi, B., Keresztes, Á., Csapó, B., Kovács, J., Páldi, E., Láng, F. (1997):Differences in the etioplast ultrastructure and chlorophyll biosynthesis time course of cold tolerant and cold sensitive maize lines under cold treatment. Maydica 42, 305311. Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254. Buchholz, G., Ehmann, B., Wellmann, E. (1995): UV-inhibition of phytochrome induced flavonoid biosynthesis and DNA-photolyase formation in mustard cotyledons (Sinapis alba L.). Plant. Physiol. 108, 22-234. Bueno, P., Varela, J., Gimenez-Gallego, G., del Río, L.A. (1995): Peroxisomal copper, zinc superoxide dismutase. Plant Physiol. 108, 1151-1160. Buschmann C., Lichtenhaler, H.K. (1998): Principles and characteristics of multicolour fluorescence imaging of plants. J. Plant Physiol. 152, 297-314. Buschmann, C., Lichtenhaler, H.K. (2000): Imaging of the blue, green, and red fluorescence emission of plants: An overview. Photosynthetica 38, 483-491. Caldwell, M.M. (1981): Plant response to solar ultraviolet radiation. In: Lange, O.L., Nobel, P.S., Osmond, C.B., Ziegler, H (eds.): Encyclopedia of Plant Physiology, Vol. 12A Physiological Plant Ecology I., Springer-Verlag, Berlin, 169-197. Cao, S., Zheng, Y., Wang, K., Rui, H., Tang, S. (2009): Effect of methyl jasmonate on cell wall modification of loquat fruit in relation to chilling injury after harvest. Food Chem., 115, 1458-1463.
97
Casati, P., Walbot, V. (2003): Gene expression profiling in response to ultraviolet radiation in maize genotypes with varying flavonoid content. Plant Physiol. 132, 1739-1754. Casati,
P.,
Walbot,
V.
(2005):
Differential
accumulation
of
maysin
and
rhamnosylisoorientin in leaves of high-altitude landraces of maize after UV-B exposure. Plant Cell Environ. 28, 788-799. Chalker-Scott, L. (1999): Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses. Photochem. Photobiol. 70, 1-9. Chappel, J., Hahlbrock, K. (1984): Transcription of plant defense genes in response to UV light or fungal elicitor. Nature, 311, 76-78. Chappelle, E.W., Wood, F.M., McMurtrey, J.E., Newcomb, W.W. (1984): Laserinduced fluorescence of green plants. 1: A technique for remote detection of plant stress and species differentiation. Appl. Opt. 23, 134-138. Chappelle, E.W., Wood, F.M., McMurtrey, J.E., Newcomb, W.W. (1985): Laserinduced fluorescence of green plants.3: LIF spectral signatures of five major plant types. Appl. Opt. 24, 74-80. Dacey, J.W.H., King, G.M., Wakeham, S.G. (1987): Factors controlling emission of dimethylsulphide from salt marshes. Nature, 330, 643-645. Dai, Q., Peng, S., Chavez, A. Q., Vergara, B.S. (1994): Intraspecific responses of 188 rice cultivars to enhanced UV-B radiation. Environ. Exp. Bot. 34, 433-442. Davey, M.W., Van Montagu, M., Sanmatin, A., Kanellis, N., Smirnoff, N., Benzie, I.J.J., Strain, J.J., Flavell, D., Fletcher, J. (2000): Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing. J. Sci. Food Agr., 80, 825-86. Dawar, S., Vani, T., Singhal, G.S. (1998): Stimulation of antioxidant enzymes and lipid peroxidation by UV-B radiation in thylakoid membranes of wheat. Biol. Plant. 41, 1: 65-73. Day, T.A., Vogelmann, T.C., DeLucia (1992): Are some plant life forms more effective than others in screening out ultraviolet-B radiation? Oecologia 83, 513-519.
98
Deisseroth, A., Dounce, A. (1970): Catalase: physical and chemical properties, mechanism of catalysis and physiological role. Physiol. Rev. 50, 319-326. Dethier, M., De Jaeger, B., Barszczak, E., Dufour, J.P. (1991): In vivo and in vitro investigations of the synthesis of S-methylmethionine during barley germination. Am. Soc. Brew. Chem., 49, 31-37. Dodd, W.A., Cossins, E.A. (1970): Homocysteine-dependent transmethylases catalyzing the synthesis of methionine in germinating pea seeds. Biochim. Biophys. Acta, 201, 461-470. Doulis, A.G., Debian, N., Kingston-Smith, A.H., Foyer, C.H. (1997): Differential localization of antioxidants in maize leaves. Plant Physiol. 114, 1031-1037. Dufour, J.P., (1986): Direct assay of S-methylmethionine using high-performance liquid chromatography and fluorescence techniques. Am. Soc. Brew. Chem., 44, 1-6. Edwards, E.A., Rawsthorne, S., Mullineaux, P.M. (1990): Subcellular distribution of multiple isoforms of glutathione reductase in leaves of pea (Pisum sativum L.). Planta. 180, 278. Flint, S.D., Caldwell, M.M. (1984): Partial inhibition o fin vitro pollen germination by stimulated solar ultraviolet-B radiation. Ecology 65, 792-795. Foyer, C.H., Lelandais, M., Galap, C., Kunert, K.J. (1991): Effects of elevated cytosolic gluthatione reductase activity on the cellular glutathione pool and photosynthesis in leaves under normal and stress conditions. Plant Physiol. 97, 863-872. Foyer, C.H., Lopez-Delgado, H., Dat, J.F., Scott, I.M. (1997): Hydrogen peroxide- and glutathione-associated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signalling. Physiol. Plant. 100, 241-254. Foyer, C.H., Souriau, N., Perret, S., Lelandais, M., Kunert, K.J., Pruvost, C., Jouanin, L. (1995): Overexpression of glutathione reductase but not glutathione syntetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees. Plant Physiol. 109, 1047-1057.
99
Gakiére, B., Denis, L., Droux, M., Job, D. (2002): Over-expression of cystathionine γsynthase in Arabidopsis thaliana leads to increased levels of methionine and Smethylmethionine. Plant Physiol. Biochem., 40, 119-126. Galston, A.W., Kaur-Sawhney, R. (1995): Polyamines as endogenous growth regulators. In: Plant hormons physiology, biochemistry and molecular biology. pp. 158-178. Genty, B., Meyer, S. (1994): Quantitative mapping of leaf photosynthesis using chlorophyll fluorescence imaging. Aust. J. Plant Physiol. 22, 277-284. Giovanelli, J., Mudd, S.H., Datko, A.H. (1980): Sulfur amino acids in plants. In The Biochemistry of Plants. Academic Press, London. 5, 453-505. Gitelson, A.A., Buschmann, C., Lichtenhaler, H.K. (1999): The chlorophyll fluorescence ratio F735/F700 as an accurate measure of the chlorophyll content in plants. Remote Sens. Environ. 69, 296-302. Greene, R.C., Davis, N.B. (1960): Biosynthesis of S-methylmethionine in the jack bean. Biochim. Biophys. Acta, 43, 360-362. Gyetvai, E., Rácz, I., Lásztity, D., Szalai, G., Janda, T., Marton, L., Horváth, E., Páldi, E. (2002): Effect of S-methylmethionine as a protective compound on the metabolism of agricultural plants at low temperature. Acta Biol. Szegediensis, 46, 3-4. Hacham, Y., Avraham, T., Amir, R. (2002): The N-terminal region of arabidopsis cystathionine-synthase plays an important regulatory role in methionine metabolism. Plant Physiol., 128, 454-462. Hansen, J., Nazarenko, L., Ruedy, R., Sato, M., Willis, J., Del Genio, A., Koch, D., Lacis, A., Lo, K., Menon, S., Novakov, T., Perlwitz, J., Russell, G., Schmidt, G.A., Tausnev, N. (2005): Earth’s energy imbalance: confirmation and implications. Science, 308, 1341. Hanson, A.D., Kende, H. (1976): Methionine metabolism and ethylene biosynthesis in senescent flower tissue of Morning-Glory. Plant Physiol., 57, 528-537.
100
Hanson, D., Rivoal, J., Paquet, L., Gage, D.A. (1994): Biosynthesis of 3dimethylsulfoniopropionate in Wollastonia biflora (L.) DC. Plant Physiol., 105, 103-110. Harris, P.J., Hartley, R.D. (1976): Detection of bound ferulic acid in the cell walls of the Gramineae by ultraviolet fluorescence microscopy. Nature 259, 508-510. Hart, R.H., Carlson, G.E., Klueter, H.H., Carns, H.R. (1975): Response of economically valuable species to ultraviolet radiation. In: Nachtway, D.S., Caldwell, M.M., Biggs, R.H. (eds.): Climatic Impacts Assessment Program (CIPA), Monograph 5, Springfield. VA. 263-275. Hasegawa, P.M., Bressan, R.A., Zhu, J.K., Bohnert, H.J. (2000): Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Mol. Plant Physiol. 51, 463-499. Hawkins, T.S., Gardiner, E.S., Comer, G.S. (2009): Modeling the relationship between extrable chlorophyll and SPAD-502 readings for endangered plant species research. J. Nature Conservation, 17, 123-127. Heisel, F., Sowinska, M., Miehé, J.A., Lang, M., Lichtenthaler, H.K. (1996): Detection of nutrient deficiencies of maize by laser induced fluorescence imaging. J. Plant Physiol. 148, 622-631. Hideg, É., Barta, C., Kálai, T., Vass, I., Hideg, K., Asada, K. (2002): Detection of singlet oxygen and superoxide with fluorescent sensors in leaves under stress by photoinhibition or UV radiation. Plant Cell Physiol. 43, 1154-1164. Hollósy, F. (2002): Effects of ultraviolet radiation on plant cells. Micron, 33, 179-197. Holuigue, L., Salinas, P., Blanco, F., Garretón, V. (2007): Salicylic acid and reactive oxygen species in the activation of stress defense genes. In: Hayat, S., Ahmad, A. (eds.) Salicylic acid: A plant hormone. Springer, Dordrecht, The Netherlands. 197-246. Hutzler, P., Fishback, R., Heller, W., Jungblut, T.P., Reuber, S., Schmitz, R., Veit, M., Weissenböck, G., Schnitzler, J.P. (1998): Tissue localisation of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp. Bot. 49, 953965.
101
Ishizaki-Nishizawa, O., Fujii, T., Azuma, M., Sekiguchi, K., Murata, N., Ohtani, T., Toguri, T. (1996): Low-temperature resistance of higher plants is significantly enhanced by a nonspecific cyanobacterial desaturase. Nature Biotech. 14, 10031006. Izaguirre, M.M., Scopel, A.L., Baldwin, I.T., Ballaré, C.L. (2003): Convergent responses to stress. Solar ultraviolet-B radiation and Manduca sexta herbivory elicit overlapping transscriptional responses in field-grown plants of Nicotiana longiflora. Plant Physiol. 4, 1755-1767. James, F., Nolte, K.D., Hanson, A.D. (1995): Purification and properties of Sadenosyl-L-methionine: L-methionine S-methyltransferase from Wollastonia biflora leaves.The J. Biol. Chem., 270, 22344-22350. James, F., Paquet, L., Sparace, S.A., Gage, D.A., Hanson, A.D. (1995): Evidence implicating
dimethylsulfoniopropionaldehyde
as
an
intermediate
in
dimethylsulfoniopropionate biosynthesis. Plant Physiol., 108, 1439-1448. Janda, T., Szalai, G., Ducruet, J.-M., Páldi, E. (1998): Changes in photosynthesis in inbred maize lines with different degrees of chilling tolerance grown at optimum and suboptimum temperatures. Photosynthetica 35, 205-212. Janda, T., Szalai, G., Kissimon, J., Páldi, E., Marton, C., Szigeti, Z. (1994): Role of light intensity int he chilling injury of young maize plants studied by chlorophyll fluorescence induction measurements. Photosynthetica 30, 293-299. Janda, T., Szalai, G., Tari, I., Páldi, E. (1999): Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta, 208, 175-180. Janowiak, F., Dörffling, K. (1996): Chilling of maize seedlings: Changes in water status and abscisic acid content in ten genotypes differring in chilling tolerance. J. Plant Physiol. 147, 582-588. Janowiak, F., Maas, B., Dörffling, K. (2002): Importance of abscisic acid for chilling tolerance of maize seedlings. J. Plant Physiol. 159, 635-643. Jiang, M., Zhang, J. (2002): Involvement of plasma-membrane NADPH oxidase in abscisic acid- and water stress-induced antioxidant defense in leaves of maize seedlings. Planta 215, 1022-1030.
102
Johanson, U., Gehrke, C., Björn, L.O., Callaghan, T.V. (1995): The effects of enhanced UV-B radiation on the growth of dwarf shrubs in a subarctic heathland. Funct. Ecology 9, 713-719. Johnson, G.A., Mantha, S.V., Day, T.A. (2000): A spectrofluorometric survey of UVinduced blue-green fluorescence in foliage of 35 species. J. Plant Physiol. 156, 242-252. Kakani, V.G., Reddy, K.R., Zhao, D., Sailaja, K. (2003): Field crop responses to ultraviolet-B radiation: a review. Agr. Forest Meteorol. 120, 1919-218. Kang, G., Wang, C., Sun, G., Wang, Z. (2003): Salicylic acid changes activities of H2O2-metabolizing enzymes and increases the chilling tolerance of banana seedlings. Environ. Exp. Bot., 50, 9-15. Karabourniotis, G., Papadopoulos, K., Papamarkou, M., Manetas, Y. (1992): Ultraviolet-B radiation absorbing capacity of leaf hairs. Physiol. Plant. 86, 414418. Karpinski, S., Reynolds, H., Karpinska, B., Wingsle, G., Creissen, G., Mullineaux, P. (1999): Systemic signalling and acclimation in response to excess excitation energy in Arabidopsis. Science 284, 654-657. Kissimon, J., Lásztity, D., Páldi, E. (1994): Effect of S- methylmethionine on cold tolerance of inbred maize lines. Biol. Plant. 36, 146. Kitagawa, Y., Yoshizaki, K. (1998): Water stress induced chilling tolerance in rice: putative relationship between chilling tolerance and Ca2+ flux. Plant Sci. 137, 7385. Klapheck S., Yimmer, I., Cosse, H. (1990): Scavenging of hydrogen peroxide in the endosperm of Ricinus communis by ascorbate peroxidase. Plant Cell Physiol. 31, 1005-1012. Ko, S., Eliot, A.C., Kirsch, J.F.( 2004): S-methylmethionine is both a substrate and an inactivator of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase. Arch. Biochem. Biophys., 421, 85-90.
103
Kocsis, M.G., Nolte, K.D., Gage, D.A., Rhodes, D., Shen, T.L., Gage, D.A., Hanson, A.D. (1998): Dimethylsulfoniopropionate biosynthesis in Spartina alterniflora. Evidence that S- methylmethionine and dimethylsulfoniopropylamine are intermediates. Plant Physiol., 117, 273-281. Kocsis, M.G., Ranocha, P., Gage, D.A., Simon, E.S., Rhodes, D., Peel, G.J., Mellema, S., Saito, K., Awazuhara, M., Li, C., Meeley, R.B., Tarczynski, M., Wagner, C., Hanson, A.D.
(2003):
Insertional
inactivation
of
the
methionine
S-
methyltransferase gene eliminates the S-methylmethionine cycle and increases the methylation ratio. Plant Physiol., 131, 1808-1815. Kocsy, G., von Ballmoos, P., Rüegsegger, A., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C. (2001): Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using safeners increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiol. 127, 1147-1156. Kocsy, G., von Ballmoos, P., Suter, M., Rüegsegger, A., Galli, U., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C. (2000): Inhibition of glutathione synthesis reduces chilling tolerance in maize. Planta 211, 528-536. Kopinski, J.S., Fogarty, R., McVeigh, J. (2007): Effect of S-methylmethionine sulphonium chloride on oesophagogastric ulcers in pigs. Aust. Vet. J., 85, 362367. Kostina, E., Wulff, A., Julkunen-Tiitto, R. (2001): Growth, structure, stomatal responses and secondary metabolites of birch seedlings (Betula pendula) under elevated UV-B radiation in the field. Trees 15, 483-491. Kratsch, H.A., Wise, R.R. (2000): The ultrastructure of chilling stress. Plant Cell Environ. 23, 337-350. Kulandaivelu, G., Lingakumar, K., Premkumar, A. (1997): UV-B radiation In: Prasad M.N.V. ed., Plant Ecophysiology, pp. 41-60. Lang, M., Lichtenthaler, H.K. (1994): Blue, green and red fluorescence signatures and images of tobacco leaves. Bot. Acta 107, 230-236. Lang, M., Lichtenthaler, H.K., Sowinska, M., Heisel, F., Miehé, J.A. (1996): Fluorescence imaging of water and temperature stress in plant leaves. J. Plant Physiol. 148, 613-621.
104
Lang, M., Stober, F., Lichtenthaler, H.K.(1991): Fluorescence emission spectra of plant leaves and plant consituents. Radiat. Environ. Biophys. 30, 333-347. Lange, H., Shropshire, W., Mohr, H. (1970): An analysis of phytochrome-mediated anthocyanin synthesis. Plant Physiol., 47, 649-655. Langebartels, C., Wohlgemuth, H., Kschieschman, S., Grun, S., Sandermann, H. (2002): Oxidative burst and cell death in ozone-exposed plants. Plant Physiol. Biochem. 40, 567-575. Langsdorf, G., Buschmann, C., Sowinska, M., Babani, F., mokry, M., Timmermann, F., Lichtenhaler, H.K. (2000): Multicolour fluorescence imaging of sugar beet leaves with different nitrogen status by flash lamp UV-excitation. Photosynthetica 38, 539-551. Láposi, R., Veres, Sz., Mile, O., Mészáros, I. (2002): Photosynthesis-ecophysiological properties of beech (Fagus sylvatica L.) under exclusion of ambient UV-B radiation. Acta Biologica Szegediensis 46, 243-245. Larcher, W. (1995): Physiological Plant Ecology. 3rd edition, Springer-Verlag, Berlin, 506p. Lásztity, D., Rácz, I., Páldi, E. (1992): Effect of DL-S-methylmethionine on polyamine biosynthesis. Physiol. Plant. 85, A 68, 389. Lee, D.H., Lee, C.B. (2000): Chilling stress-induced changes of antioxidant enzymes in the leaves of cucumber: in gel enzyme activity assays. Plant Sci. 159, 75-85. Lenk, S., Buschmann, C. (2006): Distribution of UV-shielding of the epidermis of sun and shade leaves of the beech (Fagus sylvatica L.) as monitored by multi-colour fluorescence imaging. Plant Physiol. 163, 1273-1283. Lichtenhaler, H.K., Babani, F. (2000): Detection of photosynthetic activity and water stress by imaging the red chlorophyll fluorescence. Plant Physiol. Biochem. 38, 889-895. Lichtenthaler, H.K. (1995): Spektroskopische Eigenschaften von Pflanzen und ihre Nutzung zur Fernerkundung der Vegetation. Fridericiana 49, 25-45. Lichtenthaler, H.K., Hák, R., Rinderle, U. (1990): The chlorophyll fluorescence ratio F690/F730 in leaves of different chlorophyll content. Photosynth. Res. 25, 295298.
105
Lichtenthaler, H.K., Lang, M., Sowinska, M., Heisel, F., Miehe, J.A. (1996): Detection of vegetation stress via a new high resolution fluorescence imaging system. J. Plant Physiol. 148, 599-612. Lichtenthaler, H.K., Lang, M., Sowinska, M., Summ, P., Heisel, F., Miehé, J.A. (1997): Uptake of the herbicide diuron as visualised by the fluorescence imaging technique. Bot. Acta 110, 158-163. Lichtenthaler, H.K., Rinderle, U. (1988): The role of chlorophyll fluorescence in the detection of stress conditions in plants. CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 19, 29-85. Lichtenthaler, H.K., Schweiger, J. (1998): Cell wall bound ferulic acid, the major substance of the blue-green fluorescence emission of plants. J. Plant Physiol. 152, 272-282. Liu, L., Gitz, D. C., McClure, J.W. (1995): Effects of UV-B on flavonoids, ferulic acid, growth and photosynthesis in barley primary leaves. Physiol. Plant. 93, 725-733. Long, L.M., Patel, H.P., Cory, W.C., Stapleton, A.E. (2003): The maize epicuticular wax layer provides UV protection. Funct. Plant Biol. 30, 75-81. Lüdecker, W., Dahn, H.-G., Günther, K.P. (1996): Detection of fungal infection of plants by laser-induced fluorescence: An attempt to use remote sensing. J. Plant Physiol. 148, 579-585. Lyi, S.M., Zhou, X., Kochian, L.V, Li, L. (2007): Biochemical and molecular characterization of the homocysteine S-methyltransferase from broccoli (Brassica oleracea var. Italica). Phytochemistry, 68, 1112-1119. Lyons, J.M. (1973): Chilling injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 24, 445-466. Lyons, J.M., Raison, J.K. (1970): Oxidative activity of mitochondria isolated from plant tissues sensitive and resistant to chilling injury. Plant Physiol. 45, 386-389. Lyons, J.M., Raison, J.K., Steponkus, P.L. (1979): The plant membrane in response to low temperature: An overview. In: Lyons J.M., Graham, D., Raison, J.K. (eds.): Low Temperature Stress in Crop Plants: the Role of the Membrane. New York, Academic Press, pp. 1-24.
106
Mackerness, S.A.H., Jordan, B.R., Thomas, B. (1999): Reactive oxygen species in the regulation of photosynthetic genes by ultraviolet radiation in green and etiolated buds of pea (Pisum sativum L.). J. Photochem. Photobiol. B: Biology 48, 180188. Macnicol, P.K.(1986): Analysis of S-methylmethionine and S-adenosylmethionine in plant tissue by a dansylation, dual-isotope method. Anal Biochem., 158, 93-97. Macnicol, P.K., Randall, P.J. (1987): Changes in the levels of major sulfur metabolites and free amino acids in pea cotyledons recovering from sulfur deficiency. Plant Physiol., 83, 354-359. Madronich, S. (1993): UV radiation in the natural and perturbed atmosphere. In: Tevini, M. (ed.): Effects of UV-B Radiation on Humans, Animals, Plants, Microorganism and Materials. Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 17-69. Mannervik, B., Guthenberg, C. (1981): Glutathione transferase (Human placenta). Methods in Enzymol. 77, 231-235. Markwell, J., Osterman, J.C., Mitchell, J.L. (1995): Calibration of the Minolta SPAD502 leaf chlorophyll meter. Photosynth. Res., 46, 467-472. Martin, B. (1987): Arrhenius plots and the involvement of thermotropic phase transitions of the thylakoid membrane in chilling impairment of photosynthesis in thermophylic higher plants. Plant Cell Environ. 9, 323-331. McFarland, M., Kaye, I. (1992): Chlorofluorocarbons and ozone. J. Photochem. Photobiol. 55, 911-929. McKenzie, R., Connor, B., Bodeker, G. (1999): Increased summertime UV radiation in New-Zealand in response to ozone loss. Science, 285, 1709-1711. McNeil, S.D., Nuccio, M.L., Hanson, A.D. (1999): Betaines and related osmoprotectants. Targets for metabolic engineering of stress resistance. Plant Physiol., 120, 945-949. McRorie, R.A., Sutherland, G.L., Lewis, G.L., Barton, M.S., Glazener, M.R., Shive, W. (1954): Isolation and identification of a naturally occuring analog of methionine. J. Am. Chem. Soc. 76, 115-118.
107
Meijkamp, B.B., Doodeman, G., Rozema, J. (2001): The response of Vicia faba to enhanced UV-B radiation under low and near ambient PAR levels. Plant Ecol. 154, 137-146. Mészáros, I. (2003): A fotoszintézis teljesítmény és a fotoprotektív folyamatok változásai termıhelyi feltételek között. In: Jávor A. (szerk.) 2003: Növényi élet és a stressz. DE ATC, Debrecen. (ISBN 963 472 782 4). 75-82. Mészáros, I., Láposi, R., Veres, S., Bai, E., Lakatos, G., Gáspár, A., Mile, O. (2001): Effects of supplemental UV-B and drought stress on photosynthtic activity of sessile oak (Quercus petraea L.) PS2001. Proceedings of 12th International Congress on Photosynthesis. Csiro Publ., (ISBN:0643 067116), S3-036. Mészáros, I., Láposi, R., Veres, S., Mile, O., Béres, C., Bai, E., Bibók, B. (2000): Differential effects of enhanced UV-B radiation on photosynthtic apparatus of sessile oak seedlings in growth chamber and outdoor UV-B supplementation experiments. Plant Physiology and Biochemistry 38 (Suppl.), 259. Middleton, E.M., Teramura, A.H.(1994): Understanding photosynthesis, pigment and growth responses induced by UV-B and UV-A irradiances. Photochem. Photobiol. 60, 38-45. Mittler, R. (2002): Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 7, 405-410. Mittova, V., Volokita, M., Guy, M., Tal, M. (2000): Activities of SOD and the ascorbate-glutathione cycle enzymes in subcellular compartments in leaves and roots of cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycopersicum pennellii. Physiol. Plant. 110, 42-51. Moffatt, B.A., Weretilnyk, E.A. (2001): Sustaining S-adenosyl-L-methioninedependent methyltransferase activity in plant cells. Physiol. Plant. 113, 435-442. Mudd, S.H., Datko, A.H. (1990): The S-methylmethionine cycle in Lemna paucicostata. Plant Physiol., 93, 623-630. Murali, N.S., Teramura, A.H., Randall, S.K. (1988): Response differences between two soybean cultivars with contrasting UV-B radiation sensitivites. Photochem. Photobiol. 48, 653-657.
108
Murata, N. (1989): Low-temperature effects on cyanobacterial membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 61-75. Murata, N., Wada, H., Omata, T., Ono, T. (1983): Low temperature stress and membrane lipid phase in blue-green algae. In: Marcelle, R., Clijsters, H., van Poucke, M. (eds.): Effects of Stress on Photosynthesis pp. 193-199. Nakano, Y., Asada, Y. (1987): Purification of ascorbate peroxidase from spinach chloroplasts: its activation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant Cell Physiol. 28, 131-140. Nedbal, L., Whitmarsh, J. (2004): Chlorophyll fluorescence imaging of leaves and fruits. In: Papageorgiou, G.C., Govindjee (ed.) Chlorophyll fluorescence: a signature of photosynthesis. Springer, Dordrecht, The Netherlands pp. 389-407. Negash, L., Björn, L.O. (1986): Stomatal closure by ultraviolet radiation. Physiol. Plant 63, 413-416. Neuhierl, B., Thanbichler, M., Lottspeich, F., Böck, A. (1999): A family of Smethylmethionine-dependent thiol/selenol methyltransferases. The J. Biol. Chem., 274, 5407-5414. Noctor, G., Foyer, C.H. (1998): Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49, 249-279. Ohlfest, J.R., Jesse, L.C.H., Jurenka, R., Obrycki, J.J. (2002): Stability of insecticidal CryIAb protein in transgenic Bt corn pollen exposed to UV irradiation. J. Kansas Entomol. Soc. 75, 48-51. Oidaira, H., Sano, S., Koshiba, T., Ushimaru, T. (2000): Enhancement of antioxidative enzyme activities in chilled rice seedlings. J. Plant Physiol. 156, 811-813. Otte,
M.L.,
Wilson,
G.,
Morris,
J.T.,
Moran,
B.M.
(2004):
Dimethylsulphoniopropionate (DMSP) and related compounds in higher plants. J. Exp. Bot. 55, 1919-1925. Overmyer, K., Brosché, M., Kagasjärvi, J. (2003): Reactive oxygen species and hormonal control of cell death. Trends Plant Sci. 8, 335-342. Paquet,L., Lafontaine, P.J., Saini, H.S., James, F., Hanson, A.D (1995): Évidence en faveur de la présence du 3-diméthylsulfoniopropionate chez une large gamme d’Angiospermes. Can. J. Bot., 73, 1889-1896.
109
Pastori, G., Foyer, C.H. (2002): Common components, networks, and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of „redox” and abscisic acid-mediated controls. Plant Physiol. 129, 460-468. Pastori, G., Foyer, C.H., Mullineaux, P. (2000): Low temperature-induced changes in the distribution of H2O2 and antioxidants between the bundle sheath and mesophyll cells of maize leaves. J. Exp. Bot. 51, 107-113. Pfahler, P.L. (1981): In vitro germination characteristics of maize pollen to detect biological
activity
of
environmental
pollutants.
Environmental
Health
Perspectives. 37, 125-132. Pfündel, E.E., Pan, R.S., Dilley, R.A. (1992): Inhibition of violaxanthin deepoxidation by ultraviolet-B radiation in isolated chloroplasts and intact leaves. Plant Physiol. 98, 1372-1380. Pimenta, M.J., Kaneta, T., Larondelle, Y., Dohmae, N., Kamiya, Y. (1998): S-adenosylL-methyltransferase from germinating barley. Plant Physiol., 118, 431-438. Poulson, M. E., Donahue, R.A., Konvalinka, J., Regina, M., Boeger, T. (2002): Enhanced tolerance of photosynthesis to high-light and drought stress in Pseudotsuga menziesii seedlings grown in ultraviolet-B radiation. Tree Physiol. 22, 829-838. Prasad, T.K., Anderson, M.D., Martin, B.A., Stewart, C.R. (1994): Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and regulatory role for hydrogen peroxid. Plant Cell 6, 65-74. Prasad, T.K., Anderson, M.D., Stewart, C.R. (1994): Acclimation, hydrogen peroxide and abscisic acid protect mitochondria against irreversible chilling injury in maize seedlings. Plant. Physiol. 105, 619-627. Predieri, S., Norman, H.A., Krizek, D.T., Pillai, P., Mirecki, R.M., Zimmerman, R.H. (1995): Influence of UV-B radiation on membrane lipid composition and ethylene evolution in ’Doyénne d’hiver’ pear shoots grown in vitro under different photosynthetiv photon fluxes. Environ. Exp. Bot. 35, 151-160. Quaite, F.E., Sutherland, B.M., Sutherland, J.C. (1992): Action spectrum for DNA damage in alfalfa lowers predicted impact of ozone depletion. Nature 358, 576578.
110
Quinn, P.J. (1988): Effects of temperature on cell membranes In: Long, S.P., Woodward, F.I. (eds.): Plants and Temperature. Symp. Soc. Exp. Biol. Vol. 42, Cambridge, The Company of Biologists Limited, pp. 237-258. Rácz, I., Kovács, M., Lásztity, D., Veisz, O., Szalai, G., Páldi, E. (1996): Effect of short-term and long-term low temperature stress on polyamine biosynthesis in wheat genotypes with varying degrees of frost tolerance. J. Plant Physiol., 148, 368-373. Rácz, I., Páldi, E., Szalai, G., Janda, T., Pál, M., Lásztity, D. (2008): Smethylmethionine reduces cell membrane damage in higher plants exposed to low temperature stress. J. Plant Physiol., 165, 1483-1490. Ralph, P.J., Schreiber, U., Gademann, R., Kühl, M., Larkum, A.W.D. (2005): Coral photobiology studied with a new imaging pulse amplitude modulated fluorometer. J. Phycol. 41, 336-338. Ranocha, P., Bourgis, F., Ziemak, M.J., Rhodes, D., Gage, D.A., Hanson, A.D. (2000): Characterization and functional expression of cDNAs encoding methioninesensitive and –insensitive homocysteine S-methyltransferases from Arabidopsis. J. Biol. Chem., 275, 15962-15968. Ranocha, P., McNeil, S.D., Ziemak, M.J., Li, C., Tarczynski, M.C., Hanson, A.D. (2001): The S-methylmethionine cycle in angiosperms: ubiquity, antiquity and activity. Plant Journal, 25, 575-584. Reddy, K.R., Hodges, H.F. (2000): Climate change and global crop productivity. CABI Publishing. Wallingford, UK., XVI+472 pp. Ros, J., Tevini, M. (1995): Interaction of UV-radiation and IAA during growth of seedlings and hypocotil segments of sunflower. J. Plant Physiol. 146, 295-302. Rozema, J., Bjorn, L.O., Bornman, J.F., Gaberscik, A., Hader, D.P., Trost, T., Germ, M., Klisch, M., Groniger, A., Sinha, R.P., Lebert, M., He, Y.Y., Buffoni-Hall, R., de Bakker, N.V.J., van de Staaij, J., Meijkamp, B.B. (2002): The role of UV-B radiation in aquatic and terrestrial ecosystems-an experimental and functional analysis of the evolution of UV-absorbing compounds. J. Photochem. Photobiol. B: Biology 66, 2-12.
111
Sánchez-Díaz, M., Pérez de Juan J., Irigoyen, J.J. (1993): The effect of chilling on stomatal behaviour, transpiration, water absorption and carbon dioxide exchange rate in drought-hardened and non hardened maize (Zea mays L.). In: Wilson D., Thomas H, Pithan K (eds.): Crop adaptation to cool, wet, climates. E GUYOT SA, Brussels, pp. 245-250. Santos, I., Almeida, J.M., Salema, R. (1990): Effect of UV-B radiation on the C4 plant Zea mays L. Proceedings of the XIIth International Congress for Electron Microscopy, 654-655. Santos, I., Almeida, J.M., Salema, R. (1993): Plants of Zea mays L. developed under enhanced UV-B radiation. I. Some ultrastructural and biochemical aspests. J. Plant. Physiol. 141, 450-456. Santos, I., Almeida, J.M., Santos, I., Salema, R. (1998): Biochemical and ultrastructural changes in pollen of Zea mays L. grown under enhanced UV-B radiation. Ann. Bot. 82, 641-645. Sato, C.S., Byerrum, R.U., Albersheim, P., Bonner, J. (1958): Metabolism of methionine and pectin esterification in a plant tissue. J. Biol. Chem., 23, 128-130. Scandalios, J.G., Guan, L., Polidoros, A.N. (1997): Catalases in plants: gene structure, properties, regulation and expression. In: Scandalios, J.G. (ed.) Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Pp. 343-406. Schröder, G., Eichel, J., Breinig, S., Schröder, J. (1997): Three differentially expressed S-adenosylmethionine synthetase from Catharanthus roseus: molecular and functional characterization. Plant Mol. Biol., 33, 211-222. Schweiger, J. (1999): Untersuchungen über die möglichen Beziehungen zwischen der Blaugrünfluoreszenz und dem Phenolgehalt der Pflanzen. Karlsr. Beitr. Pflanzenphysiol. 34, 1-132. Schweiger, J., Lang, M., Lichtenhaler, H.K. (1996): Differences in fluorescence excitation spectra of leaves between stressed and non stressed plants. J. Plant Physiol. 148, 536-547. Schwenn, J., Ulrich, S., Kiltz, H.H. (1983): Dissimilation of methionine in cell suspension cultures from Catharanthus roseus L. Planta, 158, 540-549.
112
Searles, P.S., Flint, S.D., Caldwell, M.M. (2001): A meta-analysis of plant field studies simulating stratospheric ozone depletion. Oecologia 127, 1-10. Selye, J. (1936): A Syndrome Produced by Diverse Noxious Agents. Nature, 138, 3245. Selye, J. (1978): Életünk és a stress. Akadémiai Kiadó, Budapest. Semeniuk, P., Stewart, R.N. (1979): Comparative sensitivity of cultivars of coleus to increased UV-B radiation. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 104, 471-474. Shen, W., Kazuyoshi, N., Shoji, T. (2000): Involvement of Polyamines in the Chilling Tolerance of Cucumber Cultivars. Plant Physiology, 124, 431-439. Shigeoka, S., Ishikawa, T., Tamoi, M., Miyagawa, Y., Takeda, T., Yabuta, Y., Yoshimura, K. (2002): Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. J. Exp. Bot. 53, 1305-1319. Smith, I.K., Vierheller, T.L., Thorne, C.A. (1988): Assay of gluthatione reductase in crude tissue homogenates using 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid). Anal. Biochem. 175, 408-413. Staxén, I., Bornman, J.F. (1994): A morphological and citological study of Petunia hybrida exposed to UV-B radiation. Physiol. Plant 91, 735-740. Stober, F., Lichtenthaler, H.K. (1993): Characterization of the laser-induced blue, green, and red fluorescence signatures of leaves of wheat and soybean grown under different irradiance. Physiol. Plant. 88, 696-704. Strid, A., Chow, W.S., Anderson, J.M. (1994): UV-B damage and protection at the molecular level in plants. Photosynt. Res. 39, 475-489. Subhash, N., Wenzel, O., Lichtenhaler, H.K. (1999): Changes in blue-green and chlorophyll fluorescence emission and fluorescence ratios during senescence of tobacco plants. Remote Sens. Environ., 69, 215-223. Szalai, G., Janda, T., Bartók, T., Páldi, E. (1997): Role of light in changes in free amino acid and polyamine contents at chilling temperature in maize (Zea mays L.). Physiol. Plant. 101, 434-438. Szalai, G., Janda, T., Páldi, E., Szigeti, Z. (1996): Role of light in the development of postchilling symptoms in maize. J. Plant Physiol. 26, 148, 378-383.
113
Szegı, D., Lırincz, I., Soós, V., Páldi, E., Visnovitz, T., Bratek, Z., Lásztity, D., Szigeti, Z. (2009): Protective effect of the naturally, biologically active compound S-methylmethionine in maize seedlings exposed to a short period of cold. Cereal Res. Commun., 37, 419-429. Teixeira, F.K., Menezes-Benavente, L.., Margis, R., Margis-Pinheiro, M.J. (2004): Analysis of the molecular evolutionary history of the ascorbate peroxidase gene family: inferences from the rice genome. Mol. Evol. 59, 761-770. Teramura, A.H., Murali, N.S. (1986): Intraspecific differences in growth and yield of soybean exposed to ultravioletr-B radiation under greenhouse and field conditions. Environ. Exp. Bot. 26, 89-95. Teramura, A.H., Sullivan, J.H. (1994): Effects of UV-B radiation on photosynthesis and growth of terrestrial plants. Photosynth. Res. 39, 463-473. Teramura, A.H., Sullivan, J.H., Ziska, L.H. (1990): Interaction of elevated ultravioletB radiation on CO2 on productivity and photosynthetic characteristics in wheat, rice, and soybean. Plant Physiol. 94, 470-475. Tevini, M. (1993): Effect of enhanced UV-B radiation on terrestrial plants. In: Tevini, M. (ed.): UV-B Radiation and Ozone Depletion. Effects on Humans, Animals, Plants, Microorganism and Materials. Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 125153. Tevini, M., Braun, J., Fieser, G. (1991): The protective function of the epidermal layer of rye seedlings against ultraviolet-B radiation. Photochem. Photobiol. 53, 329333. Tischner, T., Veisz, O. (1996): Cross-gradient growth bench for the optimization of plant growth conditions. Biotronics, 25, 89-96. Trossat, C., Nolte, K.D., Hanson, A.D. (1996): Evidence that the pathway of dimethyl sulfoniopropionate biosynthesis begins in the cytosol and ends in the chloroplast. Plant Physiol., 111, 965-970.
114
Trossat, C., Rathinasabapathi, B., Weretilnyk, E.A., Shen, T.L., Huang, Z.H., Gage, D.A.,
Hanson,
A.D.
(1998):
dimethylsulfoniopropionate
and
Salinity its
promotes
precursor
S-
accumulation
of
3-
methylmethionine
in
chloroplasts. Plant Physiol. 116, 165-171. Tsaftaris, A.S., Bosabalidis, A.M., Scandalios, J.G. (1983): Cell-type-specific gene expression and acatalasemic peroxisomes in a null Cat2 catalase mutant of maize. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5549-5553. Turcsányi, E., Vass, I. (2000): Inhibition of photosynthetic electron transport by UV-B radiation targets the photosystem II complex. Photochem. Photobiol. 72, 513-520. Turner, J.E., Shapiro, S.K. (1961): S-methylmethionine- and S-adenosylmethioninehomocysteine transmethylase in higher plant seeds. Biochim. Biophys. Acta, 51, 581-584. van de Staaij, J.W.M., Rozema, J., van Beem, A. (2001): Increased solar UV-B radiation may reduce infection by arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in dune grassland plants: evidence from five years of field exposure. Plant Ecol. 154, 171-177. van Kooten, O., Snel, J.F.H. (1990): The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25, 147-150. Vandenabeele, S., Van Ser Kelen, K., Dat, J., Gadjev, I., Boonefaes, T., Morsa, S., Rottiers, P., Slotten, L., Van Montagu, M., Zabeau, M., Inzé, D., Van Breusegem, F. (2003): A comprehensive analysis of hydrogen peroxide-induced gene expression in tobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 16113-16118. Vanderauwera, S., Zimmermann, P., Rombauts, S., Vandenabeele, S., Langebartels, C., Gruissem, W., Inzé, D., Van Breusegem, F. (2005): Catalase deficiency drastically affects gene expression in Arabidopsis revels a high light-induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis. Plant Physiol. 139, 806-821. Vass, I., Sass, L., Spetea, C., Bakou, A., Ghanotakis, D.F., Petrouleas, V. (1996): UV-B induced inhibition of photosystem II electron transport studied by EPR and chlorophyll fluorescence. Impaiment of donor and acceptor side components. Biochemistry 35, 8964-8973.
115
Vass, I., Styring, S., Hundall, T., Koivuniemi, A., Aro E.-M., Andersson, B. (1992): Reversible and irreversible intermediates during photoinhibition of photosystem II: Stable reduced QA species promote chlorophyll triplet formation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 1408-1412. Von Caemmerer, S., Farquhar, G.D. (1981): Some relationships between the biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta, 153, 376387. Vranová, E., Inzé, D., Van Breusegem, F. (2002): Signal transduction during oxidative stress. J. Exp. Bot. 53, 1227-1236. Vu, C.V., Allen Jr., L.H., Carrard, L.H. (1982): Effects of supplemental UV-B radiation on primary photosynthetic carboxylating enzymes and soluble proteins in leaves of C3 and C4 plants. Physiol. Plant. 55, 11-16. Wada, H., Gombos, Z., Murata, N. (1990): Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation. Nature 347, 200-203. Walbot, V. (1999): UV-B damage amplified by transposons in maize. Nature 397, 398399. Wang, L.J., Li, S.H. (2006): Salycilic acid-induced heat or cold tolerance in relation to Ca2+ homeostasis and antioxidant systems in young grape plants. Plant Sci., 170, 685-694. Willekens, H., Chamnongpol, S., Davey, M., Schaudner, M., Langebartels, C., Van Montagu, M., Inzé, D., Van Camp, W. (1997): Catalase is a sink for H2O2 and is indispensible for stress defence in C3 plants. EMBO J. 16, 4806-4816. Williams, M.P., Nelson, P.E. (1974): Kinetics of the thermal degradation of methylmethionine sulfonium ion sin citrate buffers and in sweet corn and tomato serum. J. Food Sci. 39, 457. Wohlgemuth, H., Mittelstrass, K., Kschieschan, S., Bender, J., Weigel, H.J., Overmyer, K., Kangasjarvi, J., Sandermann, H., Langebartels, C. (2002): Activation o fan oxidative burst is a general feature of sensitive plants exposed to the air pollutant ozone. Plant Cell Environ. 25, 717-726.
116
Yanqun, Z., Yuan, L., Haiyan, C., Jianjun, C. (2003): Intraspecific differences in physiological response of 20 soybean cultivars to enhanced ultraviolet-B radiation under field conditions. Environ. Exp. Bot. 50, 87-97. Yoshida, R., Kanno, A., Sato, T., Kameya, T. (1996): Cool-temperature-induced chlorosis in rice plants. Plant Physiol. 110, 997-105. Zerefos, C.S., Balis, D.S., Bais, A.F., Gillotay, D., Simon, P.C., Mayer, B., Seckmeyer, G. (1997): Variability of UV-B at four stations in Europe. Geophys. Res. Lett. 24, 1363-1366. Zhang, W., Jiang, B., Li, W., Song, H., Yu, Y., Chen, J. (2009): Polyamines enhance chilling tolerance of cucumber (Cucumis sativus L.) through modulating antioxidative system. Scentia Hort., 122, 20-208.
117
8. TÉZISEK
1. Megállapítottuk, hogy az ún. chilling (14-6°C) és a kukorica számára már letális (5°C) hımérsékleteken a kénanyagcsere meghatározó vegyülete, az Smetilmetionin (SMM) megnöveli a fiatal kukoricanövények alacsony hımérséklettel szembeni ellenálló képességét. 2. Az SMM megvédi az alacsony hımérséklettel szemben igen érzékeny PSII rendszert, sıt hatékonyságát javítja az által, hogy az Fv/Fm klorofill-a fluoreszcencia hányadost növeli. 3. A chilling hımérsékleti tartományban az SMM a kevésbé károsodott struktúrák miatt megakadályozza a klorofilltartalom csökkenését. 4. Megállapítottuk, hogy az SMM hatással van az oxidatív stresszt okozó reaktív oxigénformák káros következményeit mérséklı antioxidáns rendszer általunk vizsgált enzimatikus tagjaira (glutation-reduktáz, glutation-S-transzferáz, aszkorbát-peroxidáz, gvajakol-peroxidáz, kataláz) is, mivel azok aktivitását a chilling (14-6°C) és a már letálisnak számító 5°C-os hımérsékleten is, eltérı mértékben ugyan, de növeli. Az antioxidáns enzimek közül a kulcs szerepet az aszkorbát-peroxidáz képviseli, amely a gradiens valamennyi hımérsékletén aktivitás-emelkedést mutatott. 5. Öt éves szabadföldi kísérletekben eltérı származású és tenyészidejő beltenyésztett kukoricavonalakban bizonyítottuk, hogy a második generáció felnevelésének helyet adó Buin-i kísérleti telepen (Chile) tapasztalható kb. 30%-kal magasabb UV-B sugárzás szignifikánsan, átlagban 18%-kal megemelte a kukoricalevelek relatív antociántartalmát a Magyarországon nevelkedett ugyanezen genotípusokéhoz képest.
118
6. Az UV-B kamrában végzett módszertani kísérletek részben igazolták, hogy az ultraibolya sugárzás eltérı mértékben hat a genetikailag eltérı genotípusok anyagcseréjére (fotoszintézis, növekedés, antioxidáns enzimek). 7. Az UV-B sugárzás a gvajakol-peroxidáz (POD), és glutation-S-transzferáz (GST) enzimek aktivitását szignifikánsan csökkentette. Az aszkorbát-peroxidáz (APX) volt az egyetlen enzim, amelynél szignifikáns aktivitás-növekedést tudtunk kimutatni a kezelt növényekben a kontrollhoz képest, de csak a CM7-es vonal esetében. A POD és a GST aktivitásának mérésén keresztül lehetıség mutatkozik a kukorica hibridek elıállításánál számba jövı nemesítési alapanyagok
(beltenyésztett
kukoricavonalak)
UV-B
érzékenységének
meghatározására, így a magasabb UV-B sugárzás miatt bekövetkezı virágzási anomáliák elırejelzésére. 8. A fluoreszcencia leképzés módszerével kapott kísérleti adatok, és felvételek azt igazolják, hogy ez a laboratóriumi mérési eljárás alkalmas az abiotikus stresszhatások mértékének megjelenítésére kukoricában.
119
9. THESES The novel results achieved in experiments on the effect of low temperature and UV-B stress on maize hybrids and inbred lines can be summarised as follows: 1. It was found that S-methylmethionine (SMM), an important compound in the sulphur metabolism, improved the resistance of maize seedlings to low temperature in experiments carried out at chilling temperatures (14–6°C) and at 5°C, which is lethal for maize. 2. SMM protects the PSII system, which is extremely sensitive to low temperature, and improves its efficiency by increasing the Fv/Fm chlorophyll-a fluorescence ratio. 3. SMM protected the membrane structures from damage, thus preventing a reduction in the chlorophyll content. 4. SMM was found to influence enzymes (glutathione reductase, glutathione-Stransferase, ascorbate peroxidase, guaiacol peroxidase, catalase) belonging to the antioxidant system that moderates the damaging effects of the reactive oxygen species responsible for oxidative stress. The activity of these enzymes was enhanced to varying extents both at chilling temperatures and at the lowest (lethal) temperature tested (5°C). Among the antioxidant enzymes tested, ascorbate peroxidase appears to play a key role, as it exhibited an increase in activity right across the temperature gradient.
120
5. Five-year field experiments on inbred maize lines of various origin and vegetation period proved that the approx. 30% higher rate of UV-B radiation experienced in Buin (Chile), where the second generation is raised, caused a significant (18% on average) increase in the anthocyanin content of maize leaves when compared with the same genotypes grown in Hungary. 6. Methodological experiments carried out in a UV-B growth chamber partially confirmed that UV radiation influences the metabolism (photosynthesis, growth, antioxidant enzymes) of different genotypes to varying extents. 7. UV-B radiation significantly reduced the activity of the guaiacol peroxidase (POD) and glutathione-S-transferase (GST) enzymes, so the measurement of POD and GST activity could be used to determine the UV-B sensitivity of inbred maize lines intended for use in breeding new maize hybrids, i.e. the likelihood of flowering anomalies in the case of higher rates of UV-B radiation. 8. The results obtained with the fluorescence imaging method confirmed that this laboratory technique could be suitable for estimating the level of abiotic stress effects in maize.
121
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönettel tartozom témavezetımnek, Dr. Szabó Istvánnak a martonvásári kutatómunka felé való irányításáért, hasznos tanácsaiért, együttmőködéséért. Köszönöm az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet vezetıségének mindazt a támogatást, amely lehetıvé tette e munka elvégzését. Külön köszönettel tartozom társtémavezetımnek, Dr. Páldi Emilnek szakmai irányításáért, hatékony együttmőködéséért és nagy türelméért. Köszönettel tartozom Dr. Janda Tibornak a kezdeti nehézségek leküzdésében nyújtott segítségéért, a mérési módszerek bemutatásáért. Megköszönöm Dr. Pintér Jánosnak az együttmőködést és elıremutató javaslatait. Köszönetemet fejezem ki Kóti Gyulánénak és Kövesdi Ferencnének a kísérletek kivitelezésében
nyújtott
nélkülözhetetlen
segítségükért
és
nem utolsósorban
kedvességükért, biztatásukért is hálás vagyok. Köszönöm a Fitotron munkatársainak a növénynevelés során nyújtott segítségüket. Köszönet illeti Valent Ferencnét segítıkészségéért, empátiájáért, bátorításáért. Megköszönöm Szörényi Zoltánnak, munkahelyem, a keszthelyi Vajda János Gimnázium
igazgatójának
a
kétféle
munka
összeegyeztetésénél
tanúsított
rugalmasságát, nélkülözhetetlen erkölcsi támogatását. Végül, de nem utolsósorban köszönöm családtagjaimnak, hogy mindvégig mellettem álltak, bátorítottak, szeretetükkel támogattak.
A dolgozat a T042621, T37987, T73178 sz. OTKA pályázat támogatásával készült.
122
