Freelite Human Kappa Free Kit for use on the Beckman AU series. For in-vitro diagnostic use Product Code: LK016.AU 1 CONTENTS. Page no

1

CONTENTS

Freelite® Human Kappa Free Kit for use on the Beckman AU® series

Page no. 1

Intended use

2

Summary and explanation

3

Principle

4

Reagents

5

Caution

6

Storage and stability

For in-vitro diagnostic use Product Code: LK016.AU Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk Telephone: +44 (0)121 456 9500 Fax: +44 (0)121 456 9749 e-mail: [email protected] In Europe and the USA, Freelite® is a registered trademark of The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK AU® is a registered trademark of Beckman Coulter Inc.

7

Specimen collection and preparation

8

Methodology

9

Quality control

10

Limitations

11

Expected values

12

Performance characteristics

13

Bibliography

FDA (USA) Information Analyte Name Complexity Cat.

1

Kappa Light Chains Moderate

INTENDED USE

This kit is intended for the quantitation of kappa free light chains in serum and urine on the Beckman AU series analysers. Measurement of free light chains aids in the diagnosis and monitoring of multiple myeloma, lymphocytic neoplasms, Waldenström‟s macroglobulinemia, AL amyloidosis, light chain deposition disease and connective tissue diseases such as systemic lupus erythematosus in conjunction with other laboratory and clinical findings. 2

SUMMARY AND EXPLANATION

Immunoglobulin molecules consist of two identical heavy chains (, , ,  or ) which define the immunoglobulin class and two identical light chains (κ or λ). Each light chain is covalently linked to a heavy chain and the two heavy chains are linked covalently at the hinge region. In healthy individuals, the majority of light chain in serum exists in this form, bound to heavy chain. However, low levels of free light chain (FLC) are found in serum of normal individuals due to the over-production and secretion of FLC by the plasma cells. Whilst the molecular weight of both light chains is 22.5kD, in serum κ free light chain (κFLC) exists predominantly as monomer and λ free light chain (λ-FLC) as a covalently linked dimer with a molecular weight of 45kD. This will lead to a differential glomerular filtration rate for κ-FLC and λ-FLC and may explain the observed ratio of κ-FLC to λ-FLC of 0.625 in serum compared to the ratio of bound κ to λ of 2.0.

Deutsch

Siehe Seite

Français

Cf. page

Español

Página

FLC levels in urine are low. In a healthy kidney the tubular cells selectively reabsorb all FLC so their presence in urine is probably due to secretion into the urinary tract. Elevated serum levels of monoclonal FLC are associated with malignant plasma cell proliferation (e.g. multiple myeloma), AL amyloidosis and light chain deposition disease. Raised serum levels of polyclonal FLC may be associated with autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus. The appearance of higher levels of FLC in urine may be indicative of kidney disease or malignant lymphoproliferative disease such as multiple myeloma. The monoclonal urinary FLC associated with lymphoid malignancy is called a Bence Jones protein (1-13). 3

PRINCIPLE

Evaluating the concentration of a soluble antigen by turbidimetry involves the addition of the test sample to a solution containing the appropriate antibody in a reaction vessel or cuvette. A beam of light is passed through the cuvette and, as the antigen-antibody reaction proceeds, the light passing through the cuvette is scattered increasingly as insoluble immune complexes are formed. Light scatter is monitored by measuring the decrease in intensity of the incident beam of light. The antibody in the cuvette is in excess so the amount of immune complex formed is proportional to the antigen concentration. A series of calibrators of known antigen concentration are assayed initially to produce a calibration curve of measured light scatter versus antigen concentration. Samples of unknown antigen concentration can then be assayed and the results read from the calibration curve. The sensitivity of turbidimetric assays can be increased by the use of particle enhancement (6). This entails linking the antibody to a suitably sized particle that increases the relative lightscattering signal of the antigen-antibody reaction. 4

REAGENTS

4.1

Latex reagent: consisting of monospecific antibody coated onto polystyrene latex. Preservatives: 0.05% ProClin™*, 0.1% E-amino-n-caproic acid (EACA) and 0.01% benzamidine.

4.2

Standard and controls: these consist of human sera that contain polyclonal kappa free light chain. They are supplied in a stabilised liquid form and contain 0.099% sodium azide, 0.1% EACA and 0.01% benzamidine as preservatives.

4.3

Supplementary reagent: containing 0.099% sodium azide as a preservative.

* ProClin™ is a trademark of Rohm and Haas Corp., Philadelphia, PA.

5

CAUTION

All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable gloves, protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures.

Insert Code: SIN069, Version: 2nd August 2011, Page 1 of 18

This product contains sodium azide and ProClin 300 and must be handled with caution. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. This product should only be used by suitably trained personnel for the purposes stated in the Intended Use. Strict adherence to these instructions is essential at all times. Results are likely to be invalid if parameters other than those stated in these instructions are used. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all the reagents are from the same batch. 6

STORAGE AND STABILITY

The unopened kit should be stored at 2-8C and can be used until the expiry date shown on the kit label. DO NOT FREEZE. The latex reagent, calibrator and control may be stored at 2-8C for up to three months after opening providing precautions to prevent evaporation and contamination are taken. 7

SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION

Use fresh or deep frozen serum or urine samples. Serum should be obtained by venepuncture, allowed to clot and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. Samples may be stored at 2-8°C for up to 21 days, for prolonged storage they should be kept frozen at -20°C or below. Repeated freeze/thaw cycles should be avoided. Microbially contaminated urine or serum samples, samples containing particulate matter and lipaemic or haemolysed serum samples should not be used. 8

Parameters - Calibration 8.4.1.9

8.4.1.10 8.4.1.11

Calibration Specific – General Tab Test Name: Calibration type

Users must enter the Out of range values and Dynamic range of each new kit as specified on the accompanying batch-specific Product Data Sheet, SIN069.DS.

8.4.2

Running a calibration curve

8.4.2.1

Transfer the latex reagent (R1) to a 15mL reagent bottle and the supplementary reagent (R2) to a separate 15mL reagent bottle. Place the bottles on the reagent carousel in the correct orientation with a partition to secure the bottles. Go to System Status, Reagent Status. Set the position of the reagent bottles as fixed reagents by selecting  Fixed Reagent and  R1 or  R2. Do not type in the reagent label lot numbers because R1 has a different No. to R2 and they need to be a matched set. Otherwise the instrument will not recognise R1 and R2 as paired reagents, and will not run. Enter the bottle size e.g. 15mL. Go to Check Start and check the reagents. Fill the sample blank cup with distilled water and place on the analyser. Transfer 100L of each calibrator into a 1.5mL sample cup and place them on the appropriate calibration rack in ascending order (i.e. lowest concentration first) before placing on the analyser. Go to Routine, Test Requisition, Calibration. Press Start Entry, select [Kap] and any other chemistries that require calibration, press Entry and start the analyser. The progress of the calibration may be viewed by selecting System Status and then Data Display. Once the calibration is complete and the system in standby, the calibration curve can be viewed by going to Routine, Calibration Monitor, Calibration Curve and selecting [Kap]

8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5

2 x 4.0mL Human Kappa Free Reagent (Latex Reagent) (R1) 2 x 6.0mL Human Kappa Free Supplementary Reagent (R2) 1 x Human Kappa Free Calibrator Set (6 x 1.0mL) 1 x 1.5mL Human Kappa Free Control 1 x 1.5mL Human Kappa Free High Control

8.2

Materials required but not provided

8.2.1

Equipment for collection and preparation of test samples e.g. sample tubes, centrifuge, etc. A fully operational and equipped Beckman AU series analyser. Beckman AU 15mL Reagent Bottles (Beckman part number: OE63165) and bottle partitions. Beckman AU calibrator and sample racks (Beckman part number: MU809600, MUJ809300 and MUJ809200).

8.4.2.5

Reagent preparation

8.4.2.7

8.3

8.4.2.2 8.4.2.3

8.4.2.4

Before loading, gently mix by inversion ensuring no foam or bubbles are generated or remain on the surface as these may interfere with reagent aspiration. 8.4

Test procedure

The user should be familiar with the use of non-barcoded reagent bottles before attempting to carry out the test procedures. In order to run a non-barcoded assay the reagents must be placed in a 15mL reagent bottle and care must be taken to orientate the bottles correctly. 8.4.1

Programming curve parameters

8.4.1.1 8.4.1.2

Go to Parameters, Common Test Parameters, Test name. Press Set, select a free test name from the Test Name tab and press Edit. Enter the test name [Kap]. In the Long Name tab, select the test, press Edit and enter the test name [Kappa free]. In the Alarm Shots tab, press Set and change the number of alarm shots for Kap to 10. Go to Parameters, Common test parameters, Round. Press Set, select the round on which [Kap] is to be placed and press Edit. Enter [Kap] onto the selected round. Go to Parameters, Specific Test Parameters, select [Kap], press Set and enter the parameters as below:

8.4.1.3

8.4.1.4

8.4.1.5

8.4.2.6

8.4.3

Programming sample parameters

NB:

The above parameters are suitable for running the calibration curve, in order to run controls or samples an instrument sample dilution of 1:10 must be selected.

8.4.3.1

Run the calibration curve using the parameters above, allow the machine to stop. Go to Parameters, Specific Test Parameters – General and change the Predilution rate to [10] and the Correlation Factor A to [10] before running controls and samples.

8.4.4

Programming automatic repeat dilutions

8.4.4.1

To programme automatic repeat dilutions, it is necessary for the correct settings to be entered in Parameters, Repeat Parameters, Repeat Common. Press the Set key. In order to allow a higher dilution for samples that run higher than the range select [F] & [H] in the Diluted AND-mode. In order to allow a lower dilution for samples that run lower than the range select [G] & [L] in the Condensed AND-mode. Select the Auto Repeat check box. The parameters for [Kap] must then be entered in Parameters, Repeat Parameters, Repeat Specific. Select [Kap] from the Test Name list, press the Set key and set the parameters as below:

8.4.4.2 8.4.4.3 8.4.4.4 8.4.4.5 8.4.4.6

Specific Test Parameters – Range Tab

8.4.4.7

8.4.1.6 8.4.1.7 8.4.1.8

Test Name:

Set decimal places to 2. Set unit to mg/L. If the “Normal Ranges” lines 1-6 are not in use, set “7.Non-specific/Non-selected” to L [10 x AU016.A value], H [10 x AU016.F value]. (If lines 1-6 are in use, input values into “8.Out of Range” instead.)

Specific Test Parameters – General Tab Test name: Sample: Reagents:

[

Kappa free

Volume R1 volume R2 volume Wavelength Pri.

[ [ [ [

Method [ Reaction slope [ Measuring point 1: First [ Measuring point 2: First [ Linearity No-Lag-Time

[ [

5.0 L 55 L 95 L 600

]

Type:

[ Serum ] Operation:

[ Yes

]

Dilution [ 0 L ] Pre-dilution rate: [ 1 ] Dilution [ 0 L ] Min OD Max OD Dilution [ 0 L ] L [ ] H [ ] Sec. [ None ] Reagent OD limit END ] First L [ -2.0000 ] First H [ 2.5000 ] + ] Last L [ -2.0000 ] Last H [ 2.5000 ] 11 ] Last [ 27 ] Dynamic range ] Last [ ] L [ AU016.A value ] H [ AU016.F value ] Correlation factor ] % A [ 1.000000 ] B [ 0.000000 ] ] Onboard stability Period [ ] ] ] ] ]

Conc Factor/OD-L Factor/OD-H ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ]  with CONC-0 Advanced Calibration [ NO ] Calibration Stability Period: [ ]

NB:

Materials provided

8.2.4

OD [ [ [ [ [ [ [ ] ]

Go to Parameter-Format-List Format Click on the Test tab Highlight your new tests to add them to the tests that are already highlighted. Repeat for the Results List and the Repeats List.

8.1

8.2.2 8.2.3

[ Kap ] Type: [ Serum ] [ 6AB ] Formula: [ Polygonal ] Counts: [ 2 ] Process: [ Conc ]

Cal no. Point 1: [ * ] Point 2: [ * ] Point 3: [ * ] Point 4: [ * ] Point 5: [ * ] Point 6: [ * ] Point 7: [ * ] 1-Point Cal. Point: [ MB Type Factor: [

METHODOLOGY

Note: to enable full interpretation of results, free kappa/lambda ratios should be determined; samples must therefore also be assayed using Binding Site‟s Freelite Lambda Free Kit (LK018.AU).

Go to Parameters, Calibration, Calibrator. Press Set, select an unused calibrator name, press Edit and enter a calibrator name [kap1], ID [AU016.A], expiration and lot number for the first calibrator. Ensure that the Calibrator type is set to [serum]. Repeat for the other calibrators and make a note of the calibrator numbers used. Go to Parameters, Calibration, Calibration Specific, select [Kap] and press Set and enter the parameters as below, where [ * ] refers to the relevant calibrator number and [ ** ] is shown on the accompanying Product Data Sheet (SIN069.DS)

[ Kap

Diluted Sample volume: Dilution volume: Pre-Dilution rate: Condense Sample volume: Dilution volume: Pre-Dilution rate: 8.4.5

]

Type:

[ Serum

]

[ 5.0 [ 0 [ 100

] L ] L ]

Normal Sample volume: Dilution volume: Pre-Dilution rate:

[ 5.0 [ 0 [ 10

] L ] L ]

[ 5.0 [ 0 [ 5

] L ] L ]

Repeat Decision Level L: [ -99999.99 ] H: [ 99999.99 ]

Programming QC samples

Go to Parameter, QC Control. QC Common – Check Verify that the single check level is set to [2SD] and that the QC mode is set to [Preset]. QC Common – Control Press Set and select a spare control number. Press Edit, enter Control Name: [Kappa Low], Control ID: [NL016.AU] and Lot Number.


QC Specific – Preset

10.4

Each monoclonal FLC contains unique amino acid combinations. It is therefore theoretically possible for certain monoclonal proteins to be undetectable by immunoassay leading to lower than expected measurements. In practice this occurs extremely rarely with the Freelite assay. Suspected samples should first be tested for antigen excess (see section 10.3 above) then further investigation by other laboratory methods (immunofixation and serum protein electrophoresis). The nature of monoclonal proteins can cause a non-linear response in immunoassays, potentially leading to inconsistent results; this can be prevented by always assaying the samples in the sequence 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 (see Section 8.6). Omitting a dilution step or using alternative dilutions must be avoided. Due to the highly variable nature of monoclonal proteins, different reagent batches may react slightly differently to the FLC epitopes in some patient samples. In these instances, sample results may vary when tested using multiple batches. Care should be taken when monitoring patients across multiple reagent lots. We recommend, wherever possible, that previous and current samples are tested on new reagent lots and the results compared.

Select test name [Kap] and type [Serum]. Press Set, press Edit, select [Kappa Low] from Control Name list. Set Multi/Single to [Single]. Mean, SD and Range should be entered as specified on the accompanying Product Data sheet (SIN069.DS). Repeat the above for the high control.

10.5

8.5

Running controls and samples

NB.

In order to run a new calibration curve the pre-dilution rate and correlation factor A in the parameters must be set back to 1. After running the curve they must then be changed back to 10 for running samples and controls.

8.5.1

Controls

8.5.1.1

Go to Routine, Test Requisition, QC, press Start Entry, highlight [Kap] and press Entry. To determine correct position for controls in control rack press QC. Transfer 100L of each control into a 1.5mL sample cup and place them in the appropriate QC position before placing on the analyser.

8.5.1.2

8.5.2

Samples

Go to Routine, Test Requisition, Normal and enter samples as standard. 8.6

Measuring range

All samples must be assayed first at the standard 1/10 sample dilution, giving an approximate measuring range of 6-150mg/L. This enables a sensitivity of 3.0mg/L on samples using a 1/5 sample dilution and 0.6mg/L on neat urine samples. The upper limit of the measuring range using a sample dilution of 1/100 is 1500mg/L. For samples measuring over this limit the following dilution series should be used: Analyser Approximate Overall dilution Manual Pre-dilution dilution range (mg/L) 1/1 (urine only) 1/1 0.6 – 15.0 1/5 1/5 3.0 – 75.0 1/10 1/10 6.0 – 150 1/100 1/100 60 – 1,500 1/1000 1/10 1/100* 600 – 15,000 1/10000 1/100 1/100* 6000 – 150,000 *Make a manual pre-dilution of 1/100 by taking 100µL of sample and add 900µL system sample diluent to achieve an initial 1/10 dilution. From this, take 100µL of this dilution and add 900µL system sample diluent to achieve a final 1/100 dilution. Present the 1/100 diluted sample for analysis. Multiply the result x 100. Non-specific precipitation can occur with neat serum assays, giving artificially elevated or flagged results. NB:

9

On the Beckman AU series samples measuring beyond the initial measuring range at 1/10 are given an extrapolated value and highlighted by G & L (low) or F & H (high) flags. These samples are then automatically rerun at the appropriate higher or lower dilution, but the new result is again flagged with L (low) or H (high) if it is outside the initial measuring range (these flags do not appear on the data review screen, but will appear on print-outs). The F & G flags are automatically linked to the sample dilution and hence only appear where a value is outside of the assay range for that dilution. Samples which give an F or G flag at any dilution must not be reported. Samples with an H or L flag can be reported (as shown below). The overall reportable range is batch specific and is stated on the product data sheet included in each Freelite kit. E.g. Free Kappa initial measuring range is 6-150 mg/L, with an initial dilution of 1/10. The reportable range including automatic high (1/100) and low (1/5) repeats is 3 – 1500mg/L. A result of “1000H” obtained at 1/100 is reportable, BUT a result of “2500FH” at 1/100 is above the reportable range so is an extrapolated result and must not be reported. A further manual dilution is required. Similarly, a result of “4L” at 1/5 can be reported, BUT “0.50GL” is lower than the overall reportable range so can only be reported as less than the sensitivity of the assay (i.e.<3mg/L). QUALITY CONTROL

The controls provided should be included in all assay runs. The kappa free concentration is stated on the accompanying Product Data sheet (SIN069.DS). Results obtained during the run should only be accepted if the control results obtained are within ±20% of the concentration(s) stated. Should a control measurement be out of range when assayed with a stored curve the assay must be recalibrated. If on recalibration the control values measured with the new curve are still out of range, the analyser and the assay parameters should be checked before repeating the assay. If problems persist, refer to supplier. 10 10.1

10.2 10.3

LIMITATIONS Turbidimetric assays are not suitable for measurement of highly lipaemic or haemolysed samples or samples containing high levels of circulating immune complexes (CICs) due to the unpredictable degree of non-specific scatter these sample types may generate. Unexpected results should be confirmed using an alternative assay method. Diagnosis cannot be made and treatment must not be given on the basis of free light chain measurements alone. Clinical history and other laboratory findings must be taken into account. Antigen excess: A small proportion of patient samples containing high concentrations of free kappa or free lambda can give a falsely low result for the “involved” light chain due to antigen excess. The amino acid composition of the light chain produced by an individual B cell clone will influence the level at which a sample may show antigen excess with the Freelite assay. In almost every case the concentration of the involved light chain will still be above the quoted normal range (3.30-19.40mg/L for free kappa and 5.71-26.30mg/L for free lambda) and/or the opposite light chain concentration will be below the quoted range and/or the free kappa/free lambda ratio will be outside the quoted range (0.26-1.65). Samples should be tested at both the initial dilution and with a 1/100 manual predilution (see section 8.6) in order to detect antigen excess if any of the following conditions are met: a) b) c)

sample shows either a free light chain concentration or a free kappa/free lambda ratio outside of the quoted range, sample is from a patient that has previously demonstrated antigen excess, or sample result does not agree with other clinical or laboratory findings.

10.6

11

EXPECTED VALUES

The ranges provided below have been obtained from a limited number of samples and are intended for guidance purposes only. Wherever possible it is strongly recommended that local ranges are generated. 11.1 Adult serum ranges 282 normal subjects aged from 20 to 90 years were assayed using Binding Site Freelite assays for the BN™II* (11). The results are shown in the table below. Normal adult serum

Mean conc.

Median conc.

95 Percentile range

Free kappa Free lambda

8.36 (mg/L) 13.43 (mg/L) Mean

7.30 (mg/L) 12.40 (mg/L) Median

3.30 - 19.40 (mg/L) 5.71 - 26.30 (mg/L) Total range

Kappa/Lambda ratio

0.63

0.60

0.26 - 1.65

In order to demonstrate equivalence of the normal range obtained with the BNII and Beckman AU assays we have assayed on 100 normal samples from normal UK donors aged from 20 to 60 years and 61 disease state sera with both the BNII and Beckman AU Freelite assays. The results of regression analysis are as follows: for the kappa assay, y=0.95x + 21.18mg/L, r=0.95, and for the lambda assay y=0.88x + 11.75mg/L, r=0.99 (y = Beckman AU value, x = BNII value). This demonstrates that the more extensive data generated at the Mayo Clinic is applicable to the Beckman AU series assays. *BN™II is a trademark of Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.

11.2 Normal urine ranges These ranges were obtained by measuring the light chain concentrations of urines provided by 66 healthy adult donors (5). Normal adult urine Mean conc. Free kappa Free lambda 12

SD

95 percentile range

κ/λ ratio & 95 percentile range

0.39 – 15.1 (mg/L) 0.81 – 10.1 (mg/L)

1.852 0.461 – 4.00

5.40 (mg/L) 4.95 (mg/L) 3.17 (mg/L) 3.30 (mg/L)

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

The following data was obtained using a Beckman AU400: 12.1 Within-run precision Three serum preparations containing different levels of free kappa were assayed. Each value given was calculated from 10 measurements made on the same assay run. All concentrations are in mg/L. Serum 1 22.05 1.97

Mean CV%

Serum 2 40.83 1.24

Serum 3 153.26 1.89

12.2 Between-run precision Three serum preparations containing different levels of free kappa were assayed on 10 separate assay runs using kits from a single batch. All concentrations are in mg/L. Serum 1 22.23 5.78

Mean CV%

Serum 2 41.35 5.17

Serum 3 135.38 6.02

12.3 Linearity The linearity of this assay has been confirmed using a serially diluted serum sample, which gave a regression plot of y = 0.98x + 1.68 (mg/L), r = 1.00 (y = measured free kappa concentration, x = theoretical concentration) at a 1/10 sample dilution. 12.4 Interference Minimal assay interference by 200mg/L bilirubin (-4.8%), 1g/L haemoglobin (5.9%) and chyle (1930 formazine turbidity units) (-10.7%) has been demonstrated using a 53mg/L free kappa control serum at a 1/10 sample dilution. 12.5 Comparison Sera: 54 sera (10 normal, 44 from known multiple myeloma or amyloid patients) were assayed by the Freelite BNII kappa and lambda kits and on three commercially available immunofixation electrophoresis (IFE) kits. The clinical samples were assayed at a major independent reference centre in the USA.

Normal sera (10) Myeloma/ amyloid sera (24) Myeloma/ amyloid sera (20)

Free kappa 10 normal 24 high

10 normal 10 low

Freelite results Free Free κ/λ ratio lambda 10 normal 9 normal 1 borderline high 12 normal 24 high 12 low 15 high 5 normal

20 low

Summary 10 normal

IFE results 10 normal

24 monoclonal kappa

19-24* show monoclonal band 20 mono12-14* show clonal lambda monoclonal band *Method dependent

All abnormal serum light chain concentrations were detected by the Freelite assays, whereas some were missed by the less sensitive IFE methods.


Urines: 28 urines (9 normal, 19 from known/suspected myeloma patients) were assayed by the Freelite kappa and lambda kits and on a commercially available immunofixation electrophoresis (IFE) method.

Normal urine (10) Kappa myeloma urine (9) Lambda myeloma urine(10)

Free kappa 8 normal 2 borderline high 9 high

7 high 3 normal

Freelite results Free Free κ/λ lambda ratio 5 normal 9 normal 5 borderline 1 borderline high high 3 high 8 high 6 borderline 1 normal high 10 high 10 low

Seite Summary

IFE Results

10 normal

10 normal

9 monoclonal kappa

9 show monoclonal band(s) 10 show monoclonal band

10 monoclonal lambda

All abnormal urine light chain concentrations were detected by both the Freelite and IFE assays. 12.6 Clinical studies Clinical studies with Binding Site‟s Freelite kits have shown that increased free light chain concentrations can be reliably measured in multiple myeloma and SLE with sensitivity far greater that achievable with current IFE assays (5). Other studies have shown the usefulness of Freelite assays in diagnosis and monitoring nonsecretory myeloma (4). 13 1.

2. 3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12. 13.

INHALT

BIBLIOGRAPHY Cole PW, Durie BGM, Salmon SE. (1978) Immunoquantitation of free light chain immunoglobulins: Application in multiple myeloma. J. Immunol. Meth. 19: 341349. Pescali E, Pezozoli A. (1988) The clinical spectrum of pure Bence-Jones proteinuria. Cancer 61: 2408-2415. Solling K, Solling J, Romer FK. (1981) Free light chains of immunoglobulins in serum from patients with rheumatoid arthritis, sarcoidosis, chronic infections and pulmonary cancer. Acta. Med. Scand. 209: 473-477. Drayson MT, Tang LX, Drew R, Mead GP, Carr-Smith HD and Bradwell AR. (2001). Serum free light chain measurements for identifying and monitoring patients with non-secretory multiple myeloma. Blood 97: 2900-2902. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, Showell PJ, Drayson MT and Drew R (2001). Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin. Chem. 47: 4, 673-680. Tang LX, Showell P, Carr-Smith HD, Mead GP, Drew R and Bradwell AR (2000). Evaluation of F(ab‟)2-based latex-enhanced nephelometric reagents for free immunoglobulin light chains on the Behring Nephelometer TM II. Clin. Chem 46:6, Suppl. 2000, 705, pA181. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Harvey TC and Drayson MT. (2003) Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma. Lancet 361: 489-491. Abraham RS, Katzman JA, Clark RJ, Bradwell AR, Kyle RA and Gertz MA (2003). Quantitative Analysis of Serum Free Light Chains: A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Am. J. Clin. Pathol. 119: (2): 274 – 278. Lachmann HJ, Gallimore JR, Gillmore JD, Carr-Smith HD, Bradwell AR, Pepys MB and Hawkins PN (2003). Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating immunoglobulin free light chains following chemotherapy. Brit. J.Haem. 122: 78-84. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP and Drayson MT (2002) Serum free light chain immunoassays and their clinical application. Clinical and Applied Immunology Reviews 3: 17 – 33. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp JF, Bradwell, AR and Kyle RA. (2002) Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin. Chem. 48: 1437-1444. Bradwell AR (2009). Serum Free Light Chain Analysis, 5th Edition, Publ. The Binding Site Ltd, Birmingham, UK. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ, Child JA and Bradwell AR (2004). Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Brit. J. Heamatol. 126, 348-354

1

Verwendungszweck

2

Einführung

3

Prinzip

4

Reagenzien

5

Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen

6

Lagerung und Stabilität

7

Probenentnahme und

8

Testdurchführung

9

Qualitätskontrolle

10

Grenzen des Tests

11

Erwartete Werte

12

Leistungsdaten

13

Referenzen


–vorbereitung

Freelite® Freie Leichtketten Kappa (Human) Kit zur Verwendung auf den Geräten der Beckman AU® Serie Nur zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.: LK016.AU In England hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK www.bindingsite.co.uk Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A, D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: [email protected]

VERWENDUNGSZWECK

Dieser Kit dient zur quantitativen Bestimmung der freien Leichtkette ‚Kappa‟ in Serum und Urin auf den Geräten der Beckman AU Serie. Die quantitative Bestimmung der Freien Leichtketten unterstützt die Diagnose und die Verlaufskontrolle bei Multiplem Myelom, lymphozytären Tumoren, Morbus Waldenström, AL-Amyloidose, Light Chain Deposition Disease und Bindegewebserkrankungen wie z.B. Systemischer Lupus erythematodes (SLE) zusammen mit anderen Befunden aus Labor und Klinik. 2

EINFÜHRUNG

Immunglobulin-Moleküle setzen sich aus zwei identischen schweren Ketten (, , ,  oder ), wodurch die Immunglobulinklasse definiert wird, und zwei identischen Leichtketten (κ oder λ) zusammen. Jede Leichtkette ist kovalent an eine schwere Kette gebunden und die zwei schweren Ketten sind in der Gelenks-Region miteinander kovalent verknüpft. Im Serum von gesunden Individuen kommt die Mehrheit der Leichtketten in dieser Form, also an die schwere Kette gebunden, vor. Allerdings werden auch geringe Mengen an freien Leichtketten (FLC) im Serum von Gesunden gefunden, da die Plasmazellen sie im Überschuss produzieren und sekretieren. Das Molekulargewicht der beiden Leichtketten beträgt ca. 22,5kD. Im Serum kommt die freie Kappa-Leichtkette (κ-FLC) überwiegend als Monomer, die freie Lambda-Leichtkette (λ-FLC) als kovalent-gebundenes Dimer, mit einem Molekulargewicht von ca. 45kD, vor. Dadurch kommt es zu einer unterschiedlichen Filtrationsrate für κ-FLC und λ-FLC, was eine mögliche Erklärung des im Serum gefundenen κ-FLC/λ-FLC Verhältnis von 0,625 ist. Das κ/λ-Verhältnis der gebundenen Leichtketten ist dagegen 2,0. Die FLC-Konzentrationen sind im Urin niedrig. In einer gesunden Niere werden sie über die Tubuluszellen selektiv resorbiert, so dass ihr Vorkommen im Urin deshalb auf eine Sekretion im Harntrakt zurückzuführen ist. Erhöhte Serumkonzentrationen an monoklonalen freien Leichtketten findet man bei malignen Plasmazellproliferationen (z.B. Multiples Myelom), AL Amyloidose und Light Chain Deposition Disease. Erhöhte Konzentrationen an polyklonalen Leichtketten können bei Autoimmunerkrankungen wie SLE auftreten. Hohe Konzentrationen an freien Leichtketten im Urin können auf eine Nierenerkrankungen oder eine maligne lymphoproliferative Erkrankung, wie z.B. Multiples Myelom, hinweisen. Die mit dem Urin ausgeschiedenen monoklonalen freien Leichtketten werden als Bence-Jones-Proteine bezeichnet (1-13). 3

Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 300 und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Dieser Test sollte nur für den angegebenen Verwendungszweck von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Die Einhaltung der Arbeitsanleitung bei allen Arbeitsschritten ist dringend notwendig. Bei Verwendung von abgeänderten Testparametern kann die Richtigkeit der Ergebnisse nicht garantiert werden. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der gleichen Charge entstammen. 6

Freelite® ist in Europa und USA ein eingetragenes Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK. AU® ist ein eingetragenes Warenzeichen Beckman Coulter Inc.

1

Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.

PRINZIP

Zur Bestimmung eines löslichen Antigens mittels Turbidimetrie wird die zu testende Probe in eine Küvette, die den entsprechenden Antikörper enthält, zugegeben. Beim Fortschreiten der Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der unlösliche Immunkomplexe gebildet werden, wird das in die Küvette eingestrahlte Licht zunehmend gestreut. Die Lichtstreuung wird bestimmt, indem die Intensitätsabnahme des einfallenden Lichtstrahls gemessen wird. Da der Antikörper im Überschuss vorliegt, ist die Immunkomplexbildung proportional zur Antigenkonzentration. Durch Messung einer Reihe von Standards mit bekannter Antigenkonzentration wird eine Kalibrationskurve mit gemessener Lichtstreuung versus Antigenkonzentration erstellt. Die Antigenkonzentration von unbekannten Proben wird nach Messung direkt anhand der Kalibrationskurve ermittelt. Die Empfindlichkeit der turbidimetrischen Tests kann durch die Verwendung einer PartikelVerstärkung erhöht werden(6). Dies erfordert die Kopplung des Antikörpers an Partikel mit geeigneter Größe, dadurch wird das relative Lichtstreuungssignal der Antigen-AntikörperReaktion erhöht.

Der ungeöffnete Kit ist bei 2-8°C bis zum auf der Packung angegebenen Verfallsdatum haltbar. NICHT EINFRIEREN! Nach dem Öffnen das Latex-Reagenz, Kalibrator und Kontrollen bei 2-8°C lagern, sie sind so bis zu 3 Monate verwendbar, vorausgesetzt Kontaminationen und Verdunstung werden vermieden. 7

4.1

8

4.2

4.3

*ProClin™ ist ein Warenzeichenvon Rohm and Haas Corp., Philadelphia, PA.

5

WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN

TESTDURCHFÜHRUNG

Hinweis: Um eine vollständige Interpretation der Ergebnisse durchführen zu können, sollte das Verhältnis ‚Freies Kappa:Freies Lambda„ berechnet werden. Deshalb sollten die Proben ebenfalls mit dem Freelite Lambda Freie Leichtketten Kit (Bestell-Nr.: LK018.AU) von Binding Site gemessen werden. 8.1

Gelieferte Materialien

8.1.1

2 x 4,0mL Human Kappa Free Reagent (Freies Kappa (Human) Reagenz, Latexreagenz, R1) 2 x 6,0mL Human Kappa Free Supplementary Reagent (Freies Kappa (Human) Zusatzreagenz, R2) 1 x Human Kappa Free Calibrator (Freies Kappa (Human) Kalibrator 1-6, 6 x 1,0mL) 1 x 1,5mL Human Kappa Free Control (Freies Kappa (Human) Kontrolle) 1 x 1,5mL Human Kappa Free High Control (Freies Kappa (Human) Kontrolle „High Level‟)

8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5

8.2

Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien

8.2.1

Laborausstattung zum Sammeln und Vorbereiten der Proben (Probenröhrchen, Zentrifuge usw.). Einen vollausgestatteten und funktionsfähigen Beckman -Analyser der AU-Serie. Beckman AU 15mL Reagenzgefäße (Beckman Bestell-Nr.: OE63165) und Gefäßadapter. Beckman AU Kalibrator- und Proben-Racks (Beckman Bestell-Nr.: MU809600, MUJ809300 und MUJ809200).

8.2.2 8.2.3 8.2.4

8.3

Vorbereitung der Reagenzien

Vor dem Gebrauch vorsichtig schütteln, dabei darauf achten, dass sich kein Schaum oder Luftblasen bilden, bzw. auf der Oberfläche zurückbleiben, da dies zu Störungen bei der Reagenzaufnahme durch das Gerät führen kann. 8.4

Testdurchführung

Der Anwender sollte mit dem Arbeiten mit nicht-barcodierten Reagenzgefäßen vertraut sein, bevor dieser Test durchgeführt wird. Bevor ein Test mit nicht-barcodierten Reagenzien durchgeführt werden kann, müssen die Reagenzien in eine 15mL Reagenzflasche überführt werden und die Flaschen müssen in der korrekten Ausrichtung in dem Gerät plaziert werden. 8.4.1

Programmieren der Kurvenparameter

8.4.1.1 8.4.1.2

Parameter, Allgemeine Test Parameter, Testname anwählen. Set anwählen, einen freien Platz in der Tabelle Testname anklicken und Funktion Edit anwählen. Den Testnamen [Kap] eingeben. In der Tabelle Name den entsprechenden Test auswählen, Funktion Edit anwählen und den vollständigen Testnamen eingeben: [Kappa frei]. In ‚Alarm Shots‟ die Funktion Set anwählen und für Kappa die Testzahl für den Alarm auf 10 setzen. Zu Parameter, Allgemeine Testparameter, Reagenzbelegung gehen. Funktion Set anwählen und festlegen auf welchem Reagenzienteller [Kap] plaziert wird. Dazu Funktion Edit anwählen und [Kap] bei dem ausgewählten Reagenzienteller eingeben. Zu Parameter, Spezifische Testparameter gehen, [Kap] anklicken und Funktion Set anwählen und die unten aufgeführten Parameter eingeben:

8.4.1.3

REAGENZIEN Latex Reagenz: Besteht aus einem monospezifischen Antikörper, der an Polysteren-Latexpartikel gekoppelt wurde. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,05% ProClin™*, 0,1% E-aminocapronsäure (EACA) und 0,01% Benzamidin. Kalibrator und Kontrollen: Sie werden aus normalem Humanserum hergestellt und enthalten polyklonales freies Kappa und liegen als stabilisierte Flüssigkeiten vor. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid, 0,1% EACA und 0,01% Benzamidin. Zusatzreagenz: Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid.

PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG

Frische oder tiefgefrorene Serum- oder Urinproben verwenden. Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel trennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Proben können bei 2-8°C bis zu 21 Tage vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen die Proben bei mindestens -20°C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Keine mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigte Urin- oder Serumproben, oder hämolytische oder lipämische Seren verwenden.

8.4.1.4 4

LAGERUNG UND STABILITÄT

8.4.1.5

Spezifische Testparameter – Bereich 8.4.1.6 8.4.1.7 8.4.1.8

2 Dezimalstellen anwählen. mg/L als Konzentrationseinheit anwählen. Wenn die Zeilen 1-6 („Normalbereiche“) nicht belegt sind, dann bei „7. Nonspecific/Non-selected“ L[10 x AU016.A-Wert] und H[10 x AU16.F-Wert] eingeben. (Sind die Zeilen 1-6 in Gebrauch, die Werte stattdessen bei „8. Out of Range“ eingeben).

Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-C-Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro


Spezifische Testparameter – Allgemein Testname:

[

Kappa frei

Probe: Volumen Reagenzien: R1 Vol. R2 Vol. Wellenlänge Primär

[ [ [ [

]

5.0 L 55L 95L 600

Typ:

[ Serum ] Betrieb:

[ Ja

]

] ] ] ]

Verdünnung [ 0L ]Vorverdünnungsverh.: [ 1 ] Verdünnung [ 0L ] Min OD Max OD Verdünnung [ 0L ] L [ ] H [ ] Sekundär [ Keine ] Reagenz OD Grenze Methode [ END ] Erster N [ -2.0000 ] Erster H [ 2.5000 ] Reaktionsverlauf [ + ] Letzter N [ -2.0000 ] Letzter H [ 2.5000 ] Messpunkt 1: Erster [ 11 ] Letzter [ 27 ] Dynamischer Bereich Messpunkt 2: Erster [ ] Letzter [ ] L [ AU016.A Wert ] H [ AU016.F Wert ] Korrelationsfaktor Linearitätsgrenze [ ] % A [ 1.000000 ] B [ 0.000000 ] Keine Verzögerungszeit [ ] Reagenzhaltbarkeit im Gerät [ ] Parameter - Kalibration 8.4.1.9

8.4.1.10 8.4.1.11

Zu Parameter, Kalibration, Kalibrator gehen und Funktion Set anwählen und einen nicht verwendeten Kalibrator auswählen, Funktion Edit anwählen und einen Kalibratornamen [kap1], ID [AU016.A], Haltbarkeit und Lotnummer für den ersten Kalibrator eingeben. Bei Typ [Serum] anwählen. Die Eingabe für die anderen Kalibratoren wiederholen und die verwendeten Kalibrator-Nummern merken. Zu Parameter, Kalibration, Kalibration Spezifisch gehen und [Kap] auswählen, anschließend die Funktion Set anwählen und die unten aufgeführten Parameter eingeben. [*] steht für die jeweilige Kalibrator-Nummer und [**] ist auf dem Kalibrator-/Kontrolldatenblatt (Product Data Sheet, SIN069.DS) angegeben.

Kalibration spezifisch – Allgemein Test name: [ Kap ] Kalibrationsart [ 6AB ] Kal Nr. Punkt 1: [ * ] Punkt 2: [ * ] Punkt 3: [ * ] Punkt 4: [ * ] Punkt 5: [ * ] Punkt 6: [ * ] Punkt 7: [ * ] 1-Punkt Kalibrationspunkt Faktor bei MB-Typ: [

Typ: [ Serum ] Formel: [ Polygonal ] Anzahl: [ 2 ] Verfahren: [ Konz ] OD [ [ [ [ [ [ [ [ ]

]

Konz Faktor/OD-N Faktor/OD-H ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ]  mit Konz-0 Erweiterte Kalibration [ Nr ] Gültigkeit der Kalibration: [ ]

8.4.2.1

Das Latexreagenz (R1) in ein 15mL Reagenzgefäß füllen und das Zusatzreagenz (R2) in ein anderes 15mL Reagenzgefäß füllen. Die Gefäße mit der korrekten Orientierung in das Reagenzienkarusell setzen. Die Gefäße mit einer Halterung sichern. System Status, Reagenz Status anwählen. Die Positionen der Reagenzgefäße als fest angeben. Dazu  Feste Reagenzien und  R1 oder  R2 anklicken. Nicht die Reagenzien-Lotnummer vom Etikett eingeben, da R1 und R2 unterschiedliche Lotnummern haben (das Gerät erwartet die gleiche Lotnummer). Bei Eingabe von unterschiedlichen Lotnummern werden die Reagenzien R1 und R2 nicht als zusammengehörende Reagenzien erkannt und der Test wird nicht gestartet. Die Flaschengröße, z.B. 15mL, eingeben. Anschließend die Funktion Prüfung Starten anklicken. Das Probengefäß für den Blankwert mit destilliertem Wasser füllen und in das Gerät setzen. Von jedem Kalibrator je 100L in ein 1,5mL Probengefäß pipettieren und in geeignetes Kalibrator-Rack in aufsteigender Reihenfolge (niedrigste Konzentration beginnen) setzen. Das bestückte Kalibrator-Rack in das Gerät setzen. Routine, Test Anforderung, Kalibration anwählen. Funktion Start Eingabe anwählen und [Kap] und weitere Tests, die kalibriert werden sollen, anwählen. Entry anwählen und das Gerät starten. Das Voranschreiten der Kalibration kann über System Status und Daten Anzeige beobachtet werden. Nach Beendigung der Kalibration und wenn das Gerät im Stand-By-Modus ist, kann die Kalibrationskurve durch anwählen von Routine, Kalibrationsmonitor, Kalibrationskurve und [Kap] aufgerufen werden.

8.4.2.6 8.4.2.7

8.4.3

Programmierung der Proben-Parameter

Hinweis: Die oben angegebenen Parameter sind für die Erstellung einer Kalibrationskurve. Zum Messen von Kontrollen und Proben muss eine 1:10 Probenverdünnung angewählt werden. 8.4.3.1

Kalibrationskurve mit den oben angegebenen Parametern erstellen. Warten bis das Gerät im Stand-By-Modus ist. Parameter, Spezifische Testparameter – Allgemein anwählen und die Vorverdünnung (Vorverdünnungsverh) auf [10] und den Korrelationsfaktor A auf [10] setzen, bevor die Kontrollen und Proben gemessen werden.

8.4.4

Programmierung von automatischen Wiederholungsmessungen

8.4.4.1

Zur Programmierung von automatischen Wiederholungsmessungen müssen die korrekten Parameter unter Parameter, Wiederholung Parameter, Wiederholung Allgemein eingegeben werden. Die Funktion Set anwählen. Für eine höhere Verdünnung der Proben, deren Konzentration oberhalb des Messbereichs liegen [F] & [H] in dem Diluted AND-mode anwählen. Für eine niedrigere Verdünnung der Proben, deren Konzentration unterhalb des Messbereichs liegen [G] & [L] in dem Condensed AND-mode anwählen. Die Automatische Wiederholung anwählen. Die Parameter für [Kap] müssen anschließend in Parameter, Wiederholung Parameter, Wiederholung spezifisch eingegeben werden. Auf der Testnamenliste [Kap] auswählen, die Funktion Set anwählen und die nachfolgenden Parameter eingeben:

8.4.4.2 8.4.4.3 8.4.4.4 8.4.4.5 8.4.4.6 8.4.4.7 Testname:

[ Kap

Verdünnung Proben Volumen: [ 5.0 Dilution volume: [ 0 Vorverdünnungsverh. [ 100

] ] L ] L ]

Typ:

[ Serum

Normal Proben Volumen: Dilution volume: Vorverdünnungsverh.:

[ 5.0 [ 0 [ 10

Programmieren der Kontrollen

QC Allgemein – Check Sicherstellen, dass der Vertrauensbereich auf [2SD] und der QC-Modus auf [Preset] eingestellt ist. QC Allgemein – Kontrolle Funktion Set anwählen und eine freie Kontroll-Position anwählen. Funktion Edit anwählen und Name der Kontrolle [Kappa Low], Kontrollen-ID [NL016.AU] und Lot-Nr. eingeben. QC Spezifisch – Preset Den Testnamen [Kap] und Typ [Serum] anwählen. Funktion Set und anschließend Funktion Edit anwählen. Aus der Liste der Kontrollen [Kappa Low] auswählen und bei Multi/Single [Single] anwählen. Mittelwert, Standardabweichung (SD) und Bereich, wie auf dem beiligenden Kalibrator-/Kontrolldatenblatt (Product Data Sheet, SIN069.DS) angegeben, eintragen. Den Vorgang für die High-Level-Kontrolle entsprechend wiederholen. 8.5

Messen der Kontrollen und Proben

Hinweis: Soll eine neue Kalibrationskurve gemessen werden, muss in den Parametern das Vorverdünnungsverhältnis und der Korrelationsfaktor A zurück auf 1 gesetzt werden. Nach der Fertigstellung der Kalibrationskurve müssen diese Parameter für die Messung der Kontrollen und Proben wieder auf 10 gesetzt werden. 8.5.1

Kontrollen

8.5.1.1

Zu Routine, Test Anforderung, QC gehen und Start Entry anwählen. [Kap] anwählen und anschließend Entry anklicken. Zur Überprüfung der korrekten Kontroll-Positionen QC anklicken. 100µL jeder Kontrolle in ein 1,5 mL Probengefäß überführen und in der korrekten QC-Position auf dem Gerät platzieren.

8.6

Durchführung der Kalibration

8.4.2.5


Proben

Zu Routine, Test Anforderung, Normal gehen und Proben normal eingeben.

8.4.2

8.4.2.4

] L ] L ]

Gehen Sie zu Parameter, QC Kontrolle.

8.5.2

Wichtiger Hinweis: Die „Out of range“-Werte und der dynamische Bereich müssen für jeden neuen Kit vom Anwender eingegeben werden, wie auf dem beiliegenden chargenspezifischen Kalibrator-/Kontrolldatenblatt (Product Data Sheet, SIN069.DS) angegeben.

8.4.2.3

8.4.5

8.5.1.2

Die Seite Parameter-Format-List Format anwählen. Den Tab der Tests anklicken und den neuen Test kennzeichnen um ihn der Liste der gekennzeichneten Tests hinzuzufügen. Dies bei der Ergebnis-Liste und Wiederholungs-Liste wiederholen.

8.4.2.2

Condense Proben Volumen: [ 5.0 Dilution volume: [ 0 Vorverdünnungsverh. [ 5

]

Messbereich

Alle Proben müssen zuerst in der Standardprobenverdünnung von 1/10 gemessen werden, mit einem Messbereich von 6-150mg/L. Daraus resultiert eine Sensitivität von 3,0mg/L für Serumproben bei Verwendung einer 1/5 Probenverdünnung und eine Sensitivität von 0,6mg/L für unverdünnte Urinproben. Die obere Grenze des Messbereichs liegt bei 1500mg/L bei Verwendung einer 1/100-Verdünnung. Für Proben, deren FLC-Konzentration bei einer 1/100-Probenverdünnung oberhalb der Kalibrationskurve liegen, wird empfohlen folgende serielle Verdünnungen manuell herzustellen: GesamtVerdünnung Manuelle Ungefährer Messbereich verdünnung des Geräts Vorverdünnung (mg/L) 1/1 (nur Urin) 1/1 0,6 - 15,0 1/5 1/5 3,0 – 75,0 1/10 1/10 6,0 – 150 1/100 1/100 60 – 1500 1/1000 1/10 1/100* 600 – 15000 1/10000 1/100 1/100* 6000 – 150000 *Hierzu eine 1/10-Verdünnung manuell herstellen (100µL Probe + 900µL SystemProbendiluens) Von dieser Probenverdünnung eine weitere 1/10-Verdünnung herstellen, um eine 1/100-Endverdünnung zu erhalten. Diese Probe (1/100-verdünnt) messen und das Ergebnis mit dem Faktor 100 multiplizieren. Bei Verwendung von unverdünntem Serum (1/1-Verdünnung) kann eine unspezifische Präzipitation auftreten, die zu artifiziell erhöhten oder als fraglich gekennzeichneten Ergebnissen führt. Hinweis: Bei der Messung mit Geräten der Beckman AU-Serie wird für Proben, die bei der initialen Messung in der 1/10-Verdünnung nicht in den Messbereich fallen, ein extrapolierter Wert angegeben, der mit G & L (niedrig) oder F & H (hoch) gekennzeichnet ist. Diese Proben werden dann automatisch in der geeigneten höheren oder niedrigeren Verdünnung nachgemessen. Das neue Ergebnis wird jedoch wieder mit einem L (niedrig) oder einem H (hoch) markiert, wenn es außerhalb des initialen Messbereiches liegt (diese Flags erscheinen nicht auf dem Bildschirm mit der Datenübersicht, aber im Ausdruck). Die F & G Flags sind automatisch mit der Probenverdünnung verknüpft, und erscheinen deshalb nur dann, wenn der Wert außerhalb des Messbereiches für diese Verdünnung liegt. Probenergebnisse, bei denen ein F- oder G-Flag in einer Verdünnung erscheint, dürfen nicht als Befund herausgegeben werden. Werte mit einem H- oder L-Flag können jedoch freigegeben werden (siehe nachfolgendes Beispiel). Der Gesamtmessbereich ist chargenspezifisch und ist auf dem Kalibrator-/Kontrolldatenblatt, das dem Kit beiliegt, angegeben. Beispiel: Der Messbereich für Freies Kappa in der Standardverdünnung (1/10) liegt bei 6-150 mg/L. Der Gesamtmessbereich, der die automatische Nachmessung in einer höheren (1/100) und in einer niedrigeren (1/5) Verdünnung umfasst, liegt bei 3-1500 mg/L. Ein Ergebnis von „1000H“ in der 1/100-Verdünnung kann als Befund herausgegeben werden, ABER ein Ergebnis von „2500FH“ in der 1/100Verdünnung liegt oberhalb des Gesamtmessbereiches, stellt daher einen extrapolierten Wert dar und darf nicht freigegeben werden. Hier ist eine zusätzliche manuelle Vorverdünnung notwendig. Entsprechend ist auch ein Ergebnis von „4L“ in der 1/5-Verdünnung verwendbar, während „0,50GL“ unterhalb des Gesamtmessbereiches liegt und hier das Ergebnis nur als unterhalb der Nachweisgrenze des Tests interpretiert werden darf (z.B. <3mg/L). 9

QUALITÄTSKONTROLLE

Die im Kit enthaltenen Kontrollen sollen bei allen Testansätzen mitbestimmt werden. Die Konzentration der Freien Leichtkette Kappa ist auf dem Kalibrator-/Kontrolldatenblatt (Product Data Sheet, SIN069.DS) angegeben, das dem Kit beiliegt. Ergebnisse sollten nur akzeptiert werden, wenn die gemessenen Konzentrationen im angegebenen Vertrauensbereich von ±20% liegen. Liegt eine Kontrolle außerhalb des Vertrauensbereichs und wurde eine gespeicherte Kalibrationskurve verwendet, so wird empfohlen den Test neu zu kalibrieren. Liegt die Kontrolle auch nach der neuen Kalibration außerhalb des Vertrauensbereichs, sollten das Gerät und die programmierten Testparameter überprüft werden. Lässt sich das Problem nicht lösen, wenden Sie sich bitte an Ihre Lieferfirma.

] L ] L ]


10 10.1

10.2 10.3

GRENZEN DES TESTS Turbidimetrische Tests sind nicht für die Bestimmung von stark lipämischen oder hämolysierten Proben, oder Proben, die zirkulierende Immunkomplexe enthalten, geeignet, da diese Proben einen nicht vorhersagbaren Anteil an unspezifischen Streulicht erzeugen können. Ungewöhnliche Ergebnisse sollten mit einer alternativen Methode überprüft werden. Die Diagnose und die Einleitung einer Therapie dürfen nicht ausschließlich auf der Bestimmung der Freien Leichtketten alleine basieren. Das klinische Bild und andere Laborbefunde müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Antigenüberschuss: Ein geringer Anteil der Patientenproben, die eine hohe Konzentration an Freiem Kappa oder Freiem Lambda enthalten, können aufgrund des Vorliegens einer Antigenüberschusssituation falsch-niedrige Ergebnisse für die ‚erhöhte‟ Leichtkette erzeugen. Die Aminosäurenzusammensetzung der Leichtkette, die von einem individuellen B-Zell-Klon produziert wird, beeinflusst die Konzentration, bei der eine Probe eine Antigenüberschuss-Reaktion im Freelite Test zeigen kann. In fast allen Fällen wird die Konzentration der erhöhten Freien Leichtkette immer noch oberhalb des angegebenen Normalbereichs liegen (3,30-19,40mg/L für Freies Kappa und 5,71-26,30mg/L für Freies Lambda) und/oder die andere Freie Leichtketten-Konzentration wird unterhalb des angegebenen Bereichs liegen und/oder das Verhältnis Freies Kappa zu Freiem Lambda (κ-λ-Ratio) wird außerhalb des geltenden Normalbereichs (0,26-1,65) liegen. Daher sollte jede Probe sowohl in der Standardverdünnung (1/10) als auch in einer manuellen 1/100-Vorverdünnung (siehe Abschnitt 8.6) gemessen werden, um einen Antigenüberschuss zu erfassen, wenn eine der folgenden Bedingungen zutrifft: a) b)

c) 10.4

10.5

10.6

11

Die Probe weist eine Konzentration an Freien Leichtketten oder eine κ-λRatio auf, die außerhalb der angegebenen Normalbereiche liegt. Die Probe stammt von einem Patienten, bei dem bereits früher ein Antigenüberschuss gefunden wurde. oder Die Probenergebnisse stimmen nicht mit dem klinischen Bild oder anderen Laborbefunden überein.

Jede monoklonale Freie Leichtkette enthält einzigartige Aminosäuresequenzen. Daher ist es möglich, dass bestimmte monoklonale Freie Leichtketten durch den Immunoassay nicht erfasst werden, was sich in niedrigeren Messwerten als erwartet äußert. In der Praxis findet man dieses Phänomen bei Verwendung der Freelite Kits extrem selten. Fragliche Proben sollten zunächst auf Vorliegen eines Antigenüberschusses (siehe Abschnitt 10.3) überprüft werden und mit anderen Labormethoden (wie z. B. Immunfixation oder Serumeiweißelektrophorese) untersucht werden. Der Charakter monoklonaler Proteine kann in Immunoassays zu einem nichtlinearen Verhalten führen, was möglicherweise in widersprüchlichen Ergebnissen resultiert. Dies kann verhindert werden, indem die Proben immer in der Reihenfolge 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 (siehe Abschnitt 8.6) verdünnt werden. Es sollte vermieden werden eine Verdünnung auszulassen oder alternative Verdünnungen zu verwenden. Aufgrund der hohen Variabilität der monoklonalen Proteine, können verschiedene Reagenzienchargen bei einigen Patientenproben möglicherweise mit den Epitopen einiger Freier Leichtketten unterschiedlich reagieren. In diesen Fällen können die Messergebnisse variieren, wenn die Probe mit verschiedenen Reagenzienchargen gemessen wird. Falls bei der Verlaufskontrolle verschiedene Reagenzienchargen verwendet werden, wird empfohlen, wenn möglich die vorhergehende Probe zeitgleich mit der aktuellen Probe zu messen und die entsprechenden Messergebnisse miteinander zu vergleichen. ERWARTETE WERTE

Die unten aufgeführten Normalbereiche basieren auf der Untersuchung eines normalen Spenderkollektivs und dienen nur zur Orientierung. Es wird dringend empfohlen, dass wenn möglich lokale Normbereiche bestimmt werden sollten. 11.1 Erwachsene – Normalbereiche im Serum 282 normalen Individuen im Alter zwischen 20 und 90 Jahren wurden mit den Binding Site Freelite BN™II* Kits gemessen. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle aufgeführt:. Normale Erwachsene Serum Freies Kappa Freies Lambda Kappa/Lambda-Ratio

Mittlere Konz. Median Konz. 95 Percentile Bereich 8,36 (mg/L) 7,30 (mg/L) 3,30 – 19,40 (mg/L) 13,43 (mg/L) 12,40 (mg/L) 5,71 – 26,30 (mg/L) Mittelwert Median Gesamt-Bereich 0,63 0,60 0,26 – 1,65

In einer Vergleichsstudie mit 100 Seren von normalen britischen Blutspendern, im Alter zwischen 20 und 60 Jahren, und 61 klinischen Proben wurde gezeigt, dass die mit dem BNII Kit ermittelten Normalbereiche auch für die Beckman AU Freelite Kits gültig sind. In einer Regressionsanalyse wurden folgende Werte erhalten: Kappa: y=0,95x + 21.18mg/L, r=0,95; Lambda: y=0,88x +11,75mg/L, r=0,99 (y = Beckman AU-Wert, x = BNII-Wert). Dies zeigt, dass die an der Mayo Clinic ermittelten Werte auch für die Kits der Beckman AU Serie verwendet werden können.

12.3 Linearität Die Linearität des Tests wurde durch Messen einer seriellen Verdünnungsreihe eines Serums bestätigt: Regressionsanalyse: y = 0,98x + 1,68 (mg/L), r = 1,00 (y = gemessene Konzentration an freiem Kappa, x = theoretische Konzentration) bei einer 1/10 Probenverdünnung gefunden. 12.4 Interferierende Substanzen Beim Messen einer Kontrolle mit einer Konzentration von 53mg/L Freies Kappa wurde eine geringfügige Interferenzen bei 200mg/L Bilirubin (-4,8%), 1g/L Hämoglobin (5,9%) und Chylus (1930 Formazin-Trübungseinheiten) (-10,7%) bei einer 1/10 Probenverdünnung gefunden. 12.5 Vergleichsuntersuchungen Serum: 54 Seren (10 Normale, 44 von bekannten Patienten mit Multiplem Myelom oder Amyloidose) wurden mit den Freelite BNII Kappa und Lambda Kits und drei kommerziell erhältlichen Immunfixations Elektrophorese (IFE) Kits untersucht. Die klinischen Proben (44) wurden an einem unabhängigen Referenzzentrum in den USA gemessen.

Normale Seren (10) Myeloma/ Amyloid Seren (24) Myeloma/ Amyloid Seren (20)

Urin Normale Erwachsene Freies Kappa Freies Lambda 12

Mittlere Konz.

SD

5,40 (mg/L) 3,17 (mg/L)

4,95 (mg/L) 3,30 (mg/L)

95 Percentile κ / λ Verhältnis & Bereich 95 Percentile 0,39 – 15,1 (mg/L) 1,852 0,81 – 10,1 (mg/L) 0,461-4,00

Normale Urine (10) Kappa Myelom Urine (9) Lambda Myelom Urine(10)

Mittelwert % VK

Serum 1 22,05 1,97

Serum 2 40,83 1,24

Serum 3 153,26 1,89

Mittelwert % VK

Serum 1 22,23 5,78

Serum 2 41,35 5,17

20 niedrig

10 normal

24 monoklonal Kappa

19-24* zeigen monoklonale Bande 20 monoklonal 12-14* zeigen Lambda monoklonale Bande *Methoden-abhängig

Freies Kappa 8 normal 2 grenzwertig hoch 9 hoch

7 hoch 3 normal

Freelite Ergebnisse Freies Freies κ/λ Lambda Verhältnis 5 normal 9 normal 5 grenzwertig 1 grenzwertig hoch hoch 3 hoch 8 hoch 6 grenzwertig 1 normal hoch 10 hoch 10 niedrig

Zusammenfassung 10 normal

IFEErgebnisse 10 normal

9 monoklonal Kappa

9 zeigen monoklonale Bande(n) 10 monoklonal 10 zeigen Lambda monoklonale Bande

12.6 Klinische Studie Eine Klinische Studie mit den Freelite Kits von Binding Site hat gezeigt, dass erhöhte Freie Leichtketten Konzentrationen bei Multiplem Myelom und SLE zuverlässig gemessen (5) werden können. Die Sensitivität ist deutlich größer als bei den IFE-Methoden . Andere Studien haben gezeigt, dass die Freelite Tests bei der Diagnose und Verlaufskontrolle von (4) Nonsekretorischen Meylomen sehr hilfreich sind . 13 1. 2. 3.

4.

5.

6.

7.

8.

10.

11.

12. 13.

12.2 Inter-Assay-Variation Drei verschiedene Serumpräparationen mit unterschiedlichen Konzentrationen an freier Leichtkette Kappa wurden mit Kits einer Charge in 10 verschiedenen Testansätzen gemessen. Alle Konzentrationsangaben sind in mg/L.

15 hoch 5 normal

IFE Ergebnisse

Alle pathologischen Konzentrationen von freien Leichtketten im Urin wurden von beiden Methoden (Freelite und IFE) erfasst.

Die folgenden Daten wurden an einem Beckman AU400 ermittelt: 12.1 Intra-Assay-Variation Drei verschiedene Serumpräparationen mit unterschiedlichen Konzentrationen an freier Leichtkette Kappa wurden gemessen. Jeder angegebene Wert wurde aus 10 Messungen, die im gleichen Testansatz durchgeführt wurden, berechnet. Alle Konzentrationsangaben sind in mg/L.

10 normal 10 niedrig

Zusammenfassung 10 normal

Urine: 28 Urine (9 Normal, 19 von bekannten/vermuteten Myelom-Patienten) wurden mit den Freelite Kappa und Lambda Kits und einer kommerziell erhältlichen Immunfixation Elektrophorese (IFE) Methode untersucht.

9.

LEISTUNGSDATEN

24 hoch

Freelite Ergebnisse Freies Freies κ/λ Lambda Verhältnis 10 normal 9 normal 1 grenzwertig hoch 12 normal 24 hoch 12 lniedrig

Alle abnormalen Serum-Leichtketten-Konzentrationen wurden mit den Freelite-Kits erfasst, während in den weniger sensitiven IFE-Methoden einige übersehen wurden.

*BN™II ist ein Warenzeichen von Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.

11.2 Erwachsene – Normalbereich Urin Diese Normalbereiche wurden durch Messung von Urinproben von 66 gesunden Erwachsenen aus Großbritannien ermittelt (5).

Freies Kappa 10 normal

REFERENZEN Cole PW, Durie BGM, Salmon SE. (1978) Immunoquantitation of free light chain immunoglobulins: Application in multiple myeloma. J. Immunol. Meth. 19: 341-349. Pescali E, Pezozoli A. (1988) The clinical spectrum of pure Bence-Jones proteinuria. Cancer 61: 2408-2415. Solling K, Solling J, Romer FK. (1981) Free light chains of immunoglobulins in serum from patients with rheumatoid arthritis, sarcoidosis, chronic infections and pulmonary cancer. Acta. Med. Scand. 209: 473-477. Drayson MT, Tang LX, Drew R, Mead GP, Carr-Smith HD and Bradwell AR. (2001). Serum free light chain measurements for identifying and monitoring patients with non-secretory multiple myeloma. Blood 97: 2900-2902. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, Showell PJ, Drayson MT and Drew R (2001). Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin. Chem. 47: 4, 673-680. Tang LX, Showell P, Carr-Smith HD, Mead GP, Drew R and Bradwell AR (2000). Evaluation of F(ab‟)2-based latex-enhanced nephelometric reagents for free immunoglobulin light chains on the Behring Nephelometer™ II. Clin. Chem 46:6, Suppl. 2000, 705, pA181. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Harvey TC and Drayson MT. (2003) Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma. Lancet 361: 489-491. Abraham RS, Katzman JA, Clark RJ, Bradwell AR, Kyle RA and Gertz MA (2003). Quantitative Analysis of Serum Free Light Chains: A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Am. J. Clin. Pathol. 119: (2): 274 – 278. Lachmann HJ, Gallimore JR, Gillmore JD, Carr-Smith HD, Bradwell AR, Pepys MB and Hawkins PN (2003). Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating immunoglobulin free light chains following chemotherapy. Brit. J.Haem. 122: 78-84. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP and Drayson MT (2002) Serum free light chain immunoassays and their clinical application. Clinical and Applied Immunology Reviews 3: 17 – 33. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp JF, Bradwell, AR and Kyle RA. (2002) Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin. Chem. 48: 1437-1444. Bradwell AR (2009). Serum Free Light Chain Analysis, 5 th Edition, Publ. The Binding Site Ltd, Birmingham, UK. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ, Child JA and Bradwell AR (2004). Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Brit. J. Heamatol. 126, 348-354.

Serum 3 135,38 6,02


CONTENU

Coffret kappa libre humain Freelite® pour une utilisation sur les séries Beckman AU®

Page 1

Indications

2

Présentation Générale

3

Principe

4

Réactifs

5

Précautions

6

Stockage et stabilité

7

Prelevement et préparation des échantillons

8

Méthodologie

9

Control de qualite

10

Limites

11

Valeurs attendues

Pour une utilisation en diagnostic in-vitro Référence : LK016.AU Produit fabriqué par : The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk Distribué en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20 e-mail : [email protected] En Europe et aux USA, Freelite® est une marque déposée de The Binding Site Group Ltd, Birmingham, RU. AU® est une marque déposée de Beckman Coulter Inc.

1

Ce coffret permet de quantifier les chaînes légères libres kappa dans le sérum et les urines sur les automates Beckman AU. La mesure des taux de chaînes légères apporte une aide au diagnostic et au suivi des myélomes multiples, des néoplasmes lymphocytaires, des macroglobulinémies de Waldenström, des amyloses AL, des maladies de dépôt des chaînes légères et des maladies des tissus connectifs comme le lupus érythémateux disséminé en corrélation avec d‟autres résultats de laboratoire et clinique. 2

12

Performances

13

Bibliographie

INDICATIONS

PRESENTATION GENERALE

Les molécules d‟immunoglobulines sont constituées de deux chaînes lourdes identiques (, , ,  ou ) qui définissent la classe d‟immunoglobuline et de deux chaînes légères identiques (κ ou λ). Chaque chaîne légère est attachée par des liaisons covalentes aux chaînes lourdes qui sont liées de façon covalente par la région charnière. Chez les patients sains, la majorité des chaînes légères dans le sérum sont liées aux chaînes lourdes. Cependant, les chaînes légères libres (ChLL) sont trouvées à de faibles taux dans le sérum des sujets normaux. Ceci est dû à une surproduction et à une sécrétion des ChLL par des plasmocytes. Bien que le poids moléculaire des deux chaînes légères soit d‟environ 22,5kD, la chaîne légère libre κ est sous forme de monomère de façon prédominante alors que la chaîne libre λ est sous forme dimérique avec un poids d‟environ 45kD. Ceci induit un taux de filtration glomérulaire différentiel pour les chaînes légères κ et λ et peut expliquer le taux sérique κ libre/λ libre observé de 0,625 comparé aux taux de chaînes légères liées κ/λ de 2,0. Les taux urinaires des ChLL sont plus faibles. Les cellules tubulaires des reins normaux réabsorbent sélectivement les ChLL et donc leur présence dans l‟urine est probablement liée à une sécrétion dans les voies urinaires. Des taux sériques élevés de chaînes légères libres sont associés à une prolifération maligne de plasmocytes (ex : myélomes multiples), une amylose AL et aux maladies de dépôt des chaînes légères. Des taux sériques élevés de chaînes légères polyclonales peuvent être associés aux maladies autoimmunes telles que le lupus érythémateux disséminé. L‟apparition de taux urinaires élevés en chaînes légères peut indiquer une maladie rénale ou une maladie lymphoproliférative maligne comme les myélomes multiples. Les chaînes légères monoclonales dans les urines associées à une malignité lymphoïde sont appelées protéines de Bence Jones (1-13). 3

PRINCIPE

L‟évaluation de la concentration d‟un antigène soluble par turbidimétrie nécessite l‟ajout de l‟échantillon à une solution d‟anticorps approprié dans une cuvette. Un faisceau de lumière traverse la cuvette et comme la réaction antigène-anticorps se produit, la diffusion de la lumière augmente au cours de la formation des complexes immuns insolubles. La lumière diffusée est mesurée par de la diminution de l‟intensité lumineuse de la lumière incidente. L‟anticorps dans la cuvette est en excès pour que la quantité de complexes immuns formés soit proportionnelle à la concentration d‟antigène. Une série de calibrateurs dont la concentration en antigène est connue est utilisée pour construire une courbe de calibration avec la lumière diffusée versus la concentration en antigène. Les échantillons de concentration inconnue sont testés et leur résultat est déterminé à partir de la courbe de calibration. La sensibilité des tests en turbidimétriques peut être augmentée par l‟utilisation de particules de latex(6). Lorsque l‟anticorps est accroché à des particules de taille convenable, il y a une augmentation du signal de la lumière diffusée relative à la réaction antigène-anticorps. 4

REACTIFS

4.1

Réactif latex : Anticorps monospécifique coaté sur du latex de polystyrène. Conservateurs : ProClin™* 0,05%, 0,1% d‟acide E-amino-n-caproïque (EACA) et 0,01% de benzamidine.

4.2

Calibrateurs et contrôles : Sérums contenant des chaînes légères libres polyclonales kappa. Ils sont fournis sous forme liquide et contiennent 0,099% d‟azide de sodium, 0,1% EACA et 0,01% de benzamidine comme conservateurs.

4.3

Réactif supplémentaire : contenant 0,099% d‟azide de sodium comme conservateur. *ProClin™ est une marque déposée par Rohm and Haas Corp., Philadelphie, PA.

5

PRECAUTIONS

Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l‟antigène de surface de l‟hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l‟hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l‟immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) soit acceptés pour un usage en diagnostic in-vitro par l‟union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent


garantir l‟absence d‟agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d‟échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret.

Paramètres spécifiques – Général

Ce produit contient de l‟azide de sodium et ProClin 300 et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d‟autres vêtements de protection doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses. S‟il y a contact, laver abondamment avec de l‟eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l‟azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d‟eau pour prévenir tout dégât.

Sample: Reagents:

Ce produit ne doit être utilisé que par du personnel entrainé. Le suivi de ces instructions est essentiel. Les résultats seront considérés comme invalides si d’autres paramètres sont utilisés. Les réactifs de différents lots NE SONT PAS interchangeables. Si un nombre important de tests est réalisé, des précautions doivent être prises pour s‟assurer que les réactifs utilisés sont issus du même lot.

Test name:

7

Linearity No-Lag-Time

8

METHODOLOGIE

Note: pour une interprétation complète des résultats, le rapport kappa/lambda doit être déterminé; les échantillons doivent être testés également en utilisant le coffret Freelite lambda libre Binding Site (référence : LK018.AU). 8.1

Matériel fourni

8.1.1 8.1.2

8.1.4 8.1.5

2 x 4,0mL Human Kappa Free Reagent (Réactif kappa libre humain, réactif latex, R1) 2 x 6,0mL Human Kappa Free Supplementary Reagent (Réactif supplémentaire kappa libre, R2) 1 x Human Kappa Free Calibrator 1-6 (Calibrateur kappa libre humain 1-6) (6 x 1,0mL) 1 x 1,5mL Human Kappa Free Control (Contrôle kappa libre humain) 1 x 1,5mL Human Kappa Free High Control (Contrôle haut kappa libre humain)

8.2

Matériel nécessaire et non fourni

8.2.1

Equipement pour la collecte et la préparation des échantillons : tubes, centrifugeuse, etc. Un Beckman AU opérationnel et équipé. Flacons de réactifs Beckman AU 15mL (référence Beckman : OE63165) et séparateurs de flacons. Racks Beckman AU pour calibrateur et échantillons (références : MU809600, MUJ809300 et MUJ809200).

8.1.3

8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.3

8.4

8.4.1.10 8.4.1.11

OD [ [ [ [ [ [ [ ] ]

Conc Factor/OD-L Factor/OD-H ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ] ] [ ** ] [-2.000 ] [2.500 ]  with CONC-0 Advanced Calibration [NO ] Calibration Stability Period: [ ]

Courbe de calibration

8.4.2.1

Transférer le réactif latex (R1) dans un flacon réactif de 15mL et le réactif supplémentaire (R2) dans un flacon réactif de 15mL. Placer les flacons sur le carrousel de réactifs correctement orientés avec un cloisonnement pour sécuriser les flacons. Aller à System Status, Reagent Status. Etablir la position des flacons de réactifs comme réactifs fixés en sélectionnant  réactif fixé et  R1 ou  R2. Ne pas saisir les numéros de lots des réactifs mentionnés sur les étiquettes car le numéro de R1 est différent de celui de R2 et ils ont besoin d‟être associés. Sinon, l‟appareil ne reconnaîtra pas R1 et R2 comme réactifs associés et ne réalisera pas l‟analyse. Entrer le volume des flacons, par exemple 15mL. Aller à Check Start et vérifier les réactifs. Remplir la cupule blanc échantillon avec de l‟eau distillée et la placer sur l‟appareil. Transférer 100µL de chaque calibrateur dans une cupule échantillon de 1,5mL et les placer sur le rack de calibration approprié dans l‟ordre ascendant (la plus basse concentration en premier) avant de les placer sur l‟appareil. Aller à Routine, Test Requisition, Calibration. Presser Start Entry, selectionner [Kap] et les autres paramètres qui requièrent une calibration, presser Entry et lancer l‟appareil. La progression de la calibration peut être visualisée en sélectionnant System Status puis Data Display. Une fois que la calibration est complète et que le système est en attente, la courbe de calibration peut être visualisée en allant sur Routine, Calibration Monitor, Calibration Curve et en sélectionnant [Kap].

8.4.2.2 8.4.2.3

8.4.2.4

8.4.2.7

8.4.1.1 8.4.1.2

Aller dans Parameters, Common Test Parameters, Test name. Presser Set, sélectionner un nom de test libre à partir du tableau Test Name et presser Edit. Entrer le nom du test [Kap]. Dans le tableau Long Name, sélectionner le test, presser Edit et entrer le nom du test [Kappa libre]. Dans le tableau Alarm Shots, presser Set et changer le numéro d‟Alarm Shots pour Kap à 10. Aller dans Parameters, Common test parameters, Round. Presser Set, sélectionner l‟emplacement sur lequel [Kap] doit être placé et presser Edit. Entrer [Kap] sur l‟emplacement choisi. Aller dans Parameters, Specific Test Parameters, sélectionner [Kap], presser Set et entrer les paramètres comme suit :

Indiquer le nombre de décimales : 2. Indiquer les unités en mg/L. Si les lignes 1-6 des « Normal ranges » ne sont pas utilisées, rentrer « 7-Non specific/Non-selected » pour L [10 x valeur de AU016.A], H [10 x valeur AU016.F]. Si les lignes 1-6 sont utlisées, mettre les valeurs dans « 8- Hors Gamme » à la place.

] ] ] ]

8.4.2

Programmation des paramètres de la courbe

8.4.1.6 8.4.1.7 8.4.1.8

Dilution [ 0 L ] Pre-dilution rate: [ 1 ] Dilution [ 0 L ] Min OD Max OD Dilution [ 0 L ] L [ ] H [ ] Sec. [ None ] Reagent OD limit END ] First L [ -2.0000 ] First H [ 2.5000 ] + ] Last L [ -2.0000 ] Last H [ 2.5000 ] 11 ] Last [ 27 ] Dynamic range ] Last [ ] L [ AU016.A value ] H [ AU016.F value ] Correlation factor ] % A [ 1.000000 ] B [ 0.000000 ] ] Onboard stability Period [ ] 5.0L 55L 95L 600

NOTE : Les utilisateurs doivent saisir les valeurs hors-gamme de mesure et les valeurs de la gamme de mesure pour chaque nouveau coffret comme indiqué sur le feuillet supplémentaire joint à la fiche technique SIN069DS.

Procédure

Paramètres spécifiques – Gamme

]

Aller à Parameter-Format-List Format. Cliquer sur l‟onglet de test. Sélectionner les nouveaux tests afin de les ajouter à ceux déjà entrés. Répéter l‟opération pour la Result List et la Repeats List.

8.4.1

8.4.1.5

[ Yes



8.4.2.5

8.4.1.4


Aller dans Parameters, Calibration, Calibrator, presser Set, selectionner un nom de calibrateur non utilisé, presser Edit et entrer un nom de calibrateur [kap1], ID [AU016.A], expiration et numéro de lot pour le premier calibrateur S‟assurer que le type de calibrateur soit [serum]. Répéter la même chose pour les autres calibrateurs et faire une marque sur les numéros de calibrateurs utilisés. Aller à Parameters, Calibration, Calibration Specific, selectionner [Kap] et presser Set et entrer les paramètres comme indiqué ci-dessous, [*] se rapporte au numéro de calibrateur et [**] se rapporte à la concentration indiquée sur le feuillet supplémanteir joint à la fiche technique (SIN069.DS).

Test Name: Calibration type

L’utilisateur doit être familiarisé avec l’utilisation de flacons de réactifs sans codebarres avant de réaliser des tests. Pour réaliser un test sans code-barres, les réactifs doivent être placés dans des flacons réactifs de 15mL et les flacons doivent être orientés correctement.

8.4.1.3

Type:

Calibration spécifique – Général

Préparation des réactifs

Avant le chargement des réactifs, les mélanger doucement par inversion en évitant la formation des bulles ou de la mousse à la surface, ceci pouvant interférer avec l‟aspiration des réactifs.

[ [

]

Paramètres - Calibration

COLLECTE ET PREPARATION DES ECHANTILLONS

Utiliser des échantillons de sérum ou d‟urines frais ou congelés. Les sérums doivent être prélevés par ponction veineuse en laissant le caillot se former puis en séparant le sérum dès que possible afin d‟éviter l‟hémolyse. Les échantillons peuvent être stockés à 2-8°C pendant 21 jours. Pour un stockage prolongé, ils doivent être gardés à -20°C ou à une température inférieure. Les congélations/décongélations répétées doivent être évitées. Les échantillons d‟urines ou de sérums contaminés par des bactéries, contenant des particules de matière et les sérums lipidiques ou hémolysés ne doivent pas être utilisés.

[ [ [ [

Method [ Reaction slope [ Measuring point 1: First [ Measuring point 2: First [

STOCKAGE ET STABILITE

Le coffret non ouvert doit être stocké à 2-8C et peut être utilisé jusqu‟à la date de péremption figurant sur l‟étiquette du coffret. NE PAS CONGELER. Le réactif latex, le calibrateur et le contrôle peuvent être conservés à 2-8C 3 mois après ouverture en prenant les précautions nécessaires afin d‟éviter une évaporation ou une contamination.

Kappa free


8.4.1.9 6

[

8.4.2.6

8.4.3

Programmation des paramètres des échantillons

NB:

Les paramètres ci-dessus permettent d’établir une courbe de calibration. Pour doser des contrôles et des échantillons, une dilution machine des échantillons au 1:10 doit être sélectionnée.

8.4.3.1

Lancer la courbe de calibration en utilisant les paramètres ci-dessus et permettre à l‟appareil de s‟arrêter. Aller dans Parameters, Specific Test Parameters – General et changer la prédilution à [10] et le facteur de corrélation A à [10] avant de lancer les contrôles et les échantillons.

8.4.4

Programmation des dilutions répétées automatiques

8.4.4.1

Pour programmer les dilutions répétées automatique, il est nécessaire d‟entrer correctement les paramètres dans Parameters, Repeat Parameters, Repeat Common. Presser la touche Set. Pour réaliser une plus grande dilution des échantillons qui sont au-dessus de la gamme de mesure, sélectionner [F] et [H] dans le AND-mode dilué. Pour réaliser une dilution plus petite des échantillons qui sont en dessous de la gamme de mesure, sélectionner [G] et [L] dans le AND-mode condensé. Sélectionner la case de vérification de répétition automatique. Les paramètres pour [Kap] doivent être entrés dans Parameters, Repeat Parameters, Repeat Specific. Sélectionner [Kap] à partir de la liste des noms de tests, presser la touche Set et établir les paramètres comme suit :

8.4.4.2 8.4.4.3 8.4.4.4 8.4.4.5 8.4.4.6 8.4.4.7


Nom du test:

]

Type:

Volume Echantillon dilué: [ 5.0 Volume de dilution: [ 0 Taux de prédilution: [ 100

[ Kap

] L ] L ]

Volume Echantillon normal: [ 5.0 Volume de dilution: [ 0 Taux de prédilution: [ 10

[ Sérum

Volume Echantillon condensé:[ 5.0 Volume de dilution: [ 0 Taux de prédilution: [ 5

] L ] L ]

] ]L ]L ]

Taux de décision répété L: [ -99999.99 ] H: [ 99999.99 ]

10 10.1

10.2

10.3 8.4.5

Programmation des échantillons de contrôle qualité

Aller dans Parameter, QC Control. QC commun – Vérification Vérifier que le taux de vérification établi est [2SD] et que le mode QC est sur [Preset]. QC commun – Contrôle Presser Set et sélectionner un nombre de contrôle supplémentaire. Presser Edit, entrer le nom du contrôle : [Kappa Low], entrer l‟identification du contrôle : [NL016.AU], entrer le numéro de lot. QC spécifique – Pré-établi

Répéter les informations ci-dessus pour le contrôle haut en modifiant le nom, la référence et la valeur du contrôle. 8.5

Contrôles et échantillons

NB :

Afin de lancer une nouvelle courbe de calibration, le taux de pré-dilution et le facteur de corrélation doivent être rentrés à 1. Une fois la courbe de calibration obtenue, ils doivent être changés à 10 pour le test des échantillons et des contrôles.

8.5.1

Contrôles

8.5.1.1

Aller à Routine, Test Requisition, QC, presser Start Entry, surbriller [Kap] et presser Entry. Pour déterminer la position correcte des contrôles dans le rack des contrôles, presser QC. Transférer 100µL de chaque contrôle dans une cupule échantillon de 1.5mL et les placer dans les positions de contrôle approriées de l‟automate.

b) c) 10.4

10.5

8.5.2

10.6

Echantillons

Aller à Routine, Test Requisition, Normal et entrer les échantillons comme des standards. 8.6

Gamme de mesure

11

La gamme de mesure approximative du test kappa libre en utilisant la dilution échantillon standard 1/10 est 6-150mg/L, ce qui permet une sensibilité de 0,3mg/L en utilisant une dilution échantillon au 1/5 et de 0,6mg/L sur des échantillons d‟urine non dilués. La limite supérieure de la gamme de mesure est 1500mg/L en utilisant une dilution échantillon au 1/100. Pour des échantillons dont la concentration est supérieure à la courbe avec une dilution machine au 1/100, nous suggérons de faire hors machine les dilutions en série suivantes afin de minimiser les tests: Dilution Dilution Gamme analyse manuelle approximative (mg/L) 1/1 (urines uniquement) 1/1 0,6 - 15,0 1/5 1/5 3,0 – 75,0 1/10 1/10 6,0 – 150 1/100 1/100 60 – 1500 1/1000 1/10 1/100* 600 – 15000 1/10000 1/100 1/100* 6000 – 150000 * Faire une dilution externe au 1/100 en prenant 100µL d'échantillon et en ajoutant 900µL de diluant échantillon système pour obtenir une dilution au 1/10. Répéter pour obtenir une dilution finale au 1/100. Tester l'échantillon dilué au 1/100. Multiplier le résultat par 100. Dilution totale

Une precipitation non spécifique peut se produire sur des sérums non dilués, donnant des résultats faussement élevés ou hors gamme. NB : Sur les automates Beckman series AU, les échantillons en dehors de la gamme de mesure initiale à la dilution 1/10 donnent une valeur extrapolée et sont marqués par des alertes G et L (faible) ou F et H (haut). Ces échantillons sont immédiatement retestés à la dilution appropriée supérieure ou inférieure. Le résultat ainsi obtenu comprendra également une alerte L (faible) ou H (haut) s’il est lui-même en dehors de la gamme de mesure (ces alertes n’apparaîtront pas sur l’écran des résultats sur l’automate mais sur les impressions de ces résultats). Les alertes F et G sont automatiquement liées à la dilution de l’échantillon et n’apparaissent ainsi que lorsqu’une valeur est hors de la gamme de mesure pour cette dilution. Les échantillons donnant des résultats avec les alertes F et G ne devront pas être rapportés. Les échantillons donnant des résultas avec les alertes H ou L pourront être rapportés (comme indiqué ci-dessou). La gamme de mesure rapportable est dépendante de chaque lot de produit et est indiquée sur le feuillet supplémentaire joint à la fiche technique. Ex : La gamme de mesure de Kappa libre est 6-150 mg/L, avec une dilution standard à 1/10. La gamme de mesure rapportable incluant une redilution automatique haute (1/100) et bass (1/5) est de 3-1500 mg/L. Une résultat « 1000 H » obtenu à la dilution 1/100 est rapportable. MAIS, un résultat « 2500 FH » à 1/100 est en dehors de la gamme de mesure rapportable. Ce resultat est extrapolé et ne doit pas être rapporté. Une dilution supplémentaire est requise. De même, un résultat « 4L » à 1/5 peut être rapporté , MAIS « 0.50GL » est inférieur à la gamme et ne pourra être rapporté que s‟il est inférieur à la sensibilité du test (i.e. <3 mg/L). 9

Les tests turbidimétriques ne sont pas applicables pour des échantillons hautement lipidiques, hémolysés ou pour des échantillons contenant des taux élevés de complexes immuns circulants (CIC). En effet, ces échantillons peuvent générer un degré imprévisible de déviation non spécifique. Des résultats inattendus doivent être confirmés en utilisant une autre méthode. Un diagnostic ne peut être fait et un traitement ne peut pas être donné uniquement sur la base des mesures des chaînes légères libres. L‟histoire clinique du patient ainsi que d‟autres analyses doivent être prises en considération. Excès d’Antigène : Un faible nombre d‟échantillons contenant des concentrations élevées en kappa libre ou lambda libre peut donner un résultat faussé pour la chaîne légère impliquée, dû à un excès d‟antigène. La composition en acides aminés de la chaîne légère produite par un clone individuel de cellules B influencera le niveau auquel un échantillon pourra présenter un excès d‟antigène avec les tests Freelite. Dans une très grande majorité de cas, la concentration de la chaîne légère impliquée sera toujours audessus de la gamme normale (3.30-19.40 mg/L pour kappa libre et 5.71-26.30 mg/L pour lambda libre) et/ou la concentration de l‟autre chaîne légère sera endessous de cette gamme normale et/ou le rapport kapp libre/lambda libre sera en dehors des valeurs de gamme acceptée (0.26-1.65). Si une des conditions cidessous est rencontrée, un échantillon devra être testé à la dilution initiale et avec une predilution manuelle au 1/100 (voir section 8.4.5) pour détecter tout excès d‟antigène. a)

Sélectionner le nom du test [Kap] et le type [Serum]. Presser Set, presser Edit, sélectionner [Kappa Low] à partir de la liste des noms de contrôle. Positionner Set Multi/Single sur [Single]. La moyenne, la DS et la gamme devront être rentrées comme indiquée sur le feuillet supplémentaire accompagant la fiche technique (SIN069.DS).

8.5.1.2

LIMITES

CONTRÔLE DE QUALITE

l‟échantillon a soit une concentration en CLL ou un rapport CLL kappa/CLL lambda en dehors des gammes de mesures l‟échantillon p^roveint d‟un patient ayant déjà présenté un excès d‟antigène ou les résultats de l‟échantillon ne sont pas en adéquation avec les autres résultats cliniques.

Les ChLL possèdent une combinaison unique d‟acides aminés. Ainsi, il est théoriquement possible que certaines protéines monoclonales soient indétectables par immunoessai, provoquant des résultats plus faibles que prévus. En pratique cela ne se produit que très rarement avec le test Freelite. Les échantillons suspects doivent d‟abord être testés pour l‟excès d‟antigène (voir section 10.3 ci-dessus) puis par d‟autres techniques d‟analyse (immunofixation et électrophorèse des protéines sériques). Dans les essais immunoenzymatiques, la nature des protéines monoclonales peut causer une réponse non linéaire et, potentiellement donner des résultats contradictoires. Ceci peut être évité en diluant les échantillons comme suit : 1/10, 1/100, 1/1000 et 1/10000 (voir section 8.6). Ne pas sauter ou omettre une de ces dilutions. La nature des protéines monoclonales est très variable, c‟est pourquoi des lots de réactifs différents peuvent réagir différemments aux épitopes présents dans certains sérums. Dans ces cas, les résultats d‟un sérum peuvent varier s‟ils ont été obtenus sur des lots différents. En suivi de patients, les résultats doivent être interprétés avec précaution si les lots sont différents. Nous recommandons, dans la mesure du possible, d‟utiliser un même lot lorsque plusieurs échantillons doivent être comparés. VALEURS ATTENDUES

Les gammes fournies ci-dessous ont été obtenues à partir d‟un nombre limité d‟échantillons et sont données à titre indicatif. Il est fortement recommandé d‟établir ses propres normes. 11.1

Gammes sériques adultes

Ces gammes ont été obtenues en mesurant les concentrations en chaînes légères de 282 sérums d.adultes sains âgés de 20 à 90 sur un BN™II(11). Les résultats sont indiqués dans le tableau ci-dessous : Sérums d’adultes sains Kappa libre Lambda libre Rapport kappa/lambda

Conc. médiane 7,30 (mg/L) 12,40 (mg/L) Médiane 0,60

Gamme 95 percentile 3,30 – 19,40 (mg/L) 5,71 – 26,30 (mg/L) Gamme totale 0,26 – 1,65

Dans le but de montrer l‟équivalence des valeurs normales obtenues avec les tests sur BNII et sur Beckman AU, nous avons testé 100 échantillons issus de donneurs de sang sains anglais âgés de 20 à 60 ans et 61 échantillons pathologiques avec les tests Freelite sur BNII et Beckman AU. Les résultats de l‟analyse de régression sont les suivants : pour le test kappa, y = 0,95x + 21,18mg/L, r=0,95, et pour le test lambda, y=0,88x +11,75mg/L, r=0,99 (y = valeur Beckman AU, x = valeur BNII). Ceci montre que les données générées par la clinique Mayo sont applicables aux tests de Beckman AU serie. *BN™II est une marque déposée par Siemens Healthcare Diagnostics, Inc..

11.2

Gammes urinaires normales

Ces gammes ont été obtenues en mesurant les concentrations en chaînes légères des urines fournies par 66 donneurs de sang adultes sains (5). Urinaire normale Conc. Gamme 95 DS adulte moy. percentile Kappa libre 5,40 (mg/L) 4,95 (mg/L) 0,39 – 15,1 (mg/L) Lambda libre 3,17 (mg/L) 3,30 (mg/L 0,81 – 10,1 (mg/L) 12

Rapport κ/λ et gamme 95 percentile 1,852 0,461-4,00

PERFORMANCES

Les données suivantes ont été obtenues en utilisant un Beckman AU400 : 12.1 Précision intra-essai Trois sérums contenant des taux différents de chaînes légères libres kappa ont été testés. Chaque valeur donnée a été calculée à partir de 10 mesures réalisées lors de la même série. Toutes les concentrations sont en mg/L. Moyenne CV en %

Les contrôles fournis doivent être inclus et utilisés dans chaque série de tests. La concentration en kappa libre est indiquée sur le feuillet supplémentaire joint à la fiche technique (SIN069.DS). Les résultats obtenus lors d‟une série ne pourront être validés que si les résultats des contrôles sont compris dans les ±20% de la/les concentration(s) indiquée(s). Si la valeur d‟un contrôle est en dehors des limites acceptables en utilisant une courbe en mémoire, il est nécessaire de faire une nouvelle calibration. Si après une nouvelle calibration, les valeurs du contrôle sont toujours en dehors des limites, l‟appareil et les paramètres du protocole doivent être vérifiés avant de répéter le test. Si le problème persiste contacter le fournisseur.

Conc. moyenne 8,36 (mg/L) 13,43 (mg/L) Moyenne 0,63

Sérum 1 22,05 1,97

Sérum 2 40,83 1,24

Sérum 3 153,26 1,89

12.2 Précision inter-essai Trois sérums contenant des taux différents de chaînes légères libres kappa ont été testés lors de 10 occasions différentes à partir de coffrets d‟un même lot. Toutes les concentrations sont en mg/L. Moyenne CV en %


Sérum 1 22,23 5,78

Sérum 2 41,35 5,17

Sérum 3 135,38 6,02

12.3 Linéarité La linéarité de ce test a été confirmée en utilisant un sérum dilué en série. L‟équation de régression obtenue est y = 0,98x + 1,68 (mg/L), r = 1,00 (y = concentration mesurée de kappa, x = concentration théorique) à une dilution au 1/10. 12.4 Interférences Des interférences minimes ont été trouvées avec la bilirubine à 200mg/L (-4,8%), l'hémoglobine à 1g/L (5,9%) et le chyle (1930 unités de turbidité de formazine) (-10,7%) en utilisant un sérum de contrôle kappa libre à 53mg/L à une dilution au 1/10. 12.5 Comparaison Sérums : 54 sérums (10 de sujets sains, 44 de patients connus atteints de myélome multiple ou d‟amylose) ont été testés avec les coffrets Freelite kappa et lambda sur BNII et sur trois coffrets commerciaux d‟immunofixation. Les échantillons pathologiques ont été testés dans un grand centre indépendant aux USA.

Sérums normaux (10) Sérums de myélome /amylose (24) Sérums de myélome /amylose (20)

Résultats Freelite Kappa Lambda Rapport Résumé libre libre κ/λ libre 9 normaux 10 normaux 10 normaux 10 normaux 1 haut limite 12 normaux 24 hauts 12 bas

24 hauts

10 normaux 15 hauts 10 bas 5 normaux

20 bas

Résultats IFE

19-24* montrent une bande monoclonale 12-14* montrent 20 lambda une bande monoclonal monoclonale *Dépendant de la méthode

Urines : 28 urines (9 de sujets sains, 19 de patients connus ou suspectés d‟avoir un myélome) ont été testés avec les coffrets Freelite kappa et lambda et un coffret commercial d‟immunofixation. Résultats Freelite Lambda Rapport libre κ/λ libre 5 normaux 9 normaux 5 hauts limite 1 haut limite

Résumé

Pagina 1

Aplicación

2

Resumen y explicación

3

Princípio

4

Reactivos

5

Precauciones

6

Almacenamiento y estabilidad

7

Obtención de muestras y preparación

8

Metodología

9

Control de calidad

10

Limitaciónes del procedimiento

11

Valores esperados

12

Características del rendimiento

13

Bibliografía

10 normaux

24 kappa monoclonal

Tous les sérums dont les concentrations en chaînes légères libres sont anormales ont été détectés avec les tests Freelite alors que certains ont été « loupés » avec des méthodes IFE moins sensibles.

Kappa libre 8 normaux 2 hauts limite 9 hauts

INDICE

Résultats IFE

Urines 10 normaux 10 normaux normales (10) Urines de 3 hauts 8 hauts 9 kappa 9 montrent myélome 6 hauts limite 1 normal monoclonal une/des bande(s) kappa (9) monoclonale(s) Urines de 7 hauts 10 hauts 10 bas 10 lambda 10 montrent une myélome 3 normaux monoclonal bande lambda (10) monoclonale Toutes les urines ayant des concentrations anormales en chaînes légères ont été détectées avec les deux coffrets Freelite et les tests IFE. 12.6 Etudes cliniques Les études cliniques avec les coffrets Freelite Binding Site ont montré que des concentrations augmentées en chaînes légères libres peuvent être mesurées de façon fiable dans les myélomes multiples et le lupus avec une sensibilité beaucoup plus importante que les tests IFE courants(5). D‟autres études ont montré l‟utilité des tests Freelite dans le diagnostic et le suivi des myélomes non sécrétants (4). 13 1.

2. 3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12. 13.

BIBLIOGRAPHIE Cole PW, Durie BGM, Salmon SE. (1978) Immunoquantitation of free light chain immunoglobulins: Application in multiple myeloma. J. Immunol. Meth. 19: 341349. Pescali E, Pezozoli A. (1988) The clinical spectrum of pure Bence-Jones proteinuria. Cancer 61: 2408-2415. Solling K, Solling J, Romer FK. (1981) Free light chains of immunoglobulins in serum from patients with rheumatoid arthritis, sarcoidosis, chronic infections and pulmonary cancer. Acta. Med. Scand. 209: 473-477. Drayson MT, Tang LX, Drew R, Mead GP, Carr-Smith HD and Bradwell AR. (2001). Serum free light chain measurements for identifying and monitoring patients with non-secretory multiple myeloma. Blood 97: 2900-2902. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, Showell PJ, Drayson MT and Drew R (2001). Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin. Chem. 47: 4, 673-680. Tang LX, Showell P, Carr-Smith HD, Mead GP, Drew R and Bradwell AR (2000). Evaluation of F(ab‟)2-based latex-enhanced nephelometric reagents for free immunoglobulin light chains on the Behring Nephelometer TM II. Clin. Chem 46:6, Suppl. 2000, 705, pA181. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Harvey TC and Drayson MT. (2003) Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma. Lancet 361: 489-491. Abraham RS, Katzman JA, Clark RJ, Bradwell AR, Kyle RA and Gertz MA (2003). Quantitative Analysis of Serum Free Light Chains: A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Am. J. Clin. Pathol. 119: (2): 274 – 278. Lachmann HJ, Gallimore JR, Gillmore JD, Carr-Smith HD, Bradwell AR, Pepys MB and Hawkins PN (2003). Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating immunoglobulin free light chains following chemotherapy. Brit. J.Haem. 122: 78-84. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP and Drayson MT (2002) Serum free light chain immunoassays and their clinical application. Clinical and Applied Immunology Reviews 3: 17 – 33. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp JF, Bradwell, AR and Kyle RA. (2002) Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin. Chem. 48: 1437-1444. Bradwell AR (2009). Serum Free Light Chain Analysis, 5th Edition, Publ. The Binding Site Ltd, Birmingham, UK. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ, Child JA and Bradwell AR (2004). Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Brit. J. Heamatol. 126, 348-354


Kit Kappa Libre Humana Freelite® para su uso en el Beckman AU® series

Los componentes del kit contienen azida sódica y ProClin 300 y deben ser manipulados con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especialmente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida.

Para uso diagnóstico in-vitro

El presente producto debe ser utilizado por personal especializado. Se recomienda observar estrictamente el procedimiento indicado. No se garantizan resultados válidos obtenidos utilizando parámetros diferentes que los indicados.

Código de Producto: LK016.AU

Los reactivos de diferentes lotes NO son intercambiables. En caso de realizar un número elevado de tests, averigue que todos los reactivos sean del mismo lote.

Producto fabricado por: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK www.bindingsite.co.uk The Binding Site Spain S.L.U C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected] web: www.bindingsite.es

6

7

En Europa y EE.UU Freelite® es una marca de The Binding Site Group Ltd., Birmingham, RU. AU® es una marca de Beckman Coulter Inc.

APLICACIÓN

Este kit tiene como objetivo la cuantificación en suero y orina de las cadenas ligeras libres kappa en los analizadores Beckman AU series. El análisis de cadenas ligeras libres es de gran ayuda en el diagnóstico y monitorización del mieloma múltiple, neoplasias linfocíticas, la macroglobulinemia de Waldenström, AL amiloidiosis, síndrome de deposición de cadenas ligeras y enfermedades del tejido conjuntivo como por ejemplo el lupus eritematoso sistémico (SLE), junto con otras determinaciones clínicas y de laboratorio. 2

RESUMEN Y EXPLICACIÓN

OBTENCIÓN DE MUESTRAS Y PREPARACIÓN

Utilizar siempre suero u orina fresca o congelada. Las muestras de sangre deben proceder de extracciones venosas, dejadas coagular naturalmente. Separe el suero lo más rápidamente posible para evitar hemólisis. El suero debe conservarse a 2-8°C si el ensayo se ejecuta dentro de 21 días. Para periodos más largos, se recomienda conservar el suero a -20°C o temperatura inferior. No congelar y descongelar los sueros más de una vez. Evitar el uso de sueros lipémicos, hemolizados o contaminados por microbios. 8

1

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Los kits no abiertos deben conservarse a 2-8°C y se pueden usar hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja. NO CONGELAR. El látex, el calibrador y el control pueden conservarse hasta tres meses a 2-8°C en un refrigerador, tomando precauciones para evitar la evaporación y la contaminación.

METODOLOGÍA

Nota: Con el fin de poder realizar una interpretación completa de los resultados, se debería determinar la relación Kappa libre/Lambda libre. Por lo tanto las muestras deberían analizarse también con el kit Freelite cadenas ligeras libres Lambda de Binding Site (LK018.AU). 8.1

Material suministrado

8.1.1

8.1.4 8.1.5

2 x 4,0mL Human Kappa Free Reagent (R1) (Reactivo de látex Kappa libre humano) 2 x 6,0mL Human Kappa Free Supplementary Reagent (R2) (Reactivo suplementario Kappa libre) 1 x Human Kappa Free Calibrator set (6 x 1,0mL) (Calibrador Kappa libre humano) 1 x 1,5mL Human Kappa Free Control (Control Kappa libre humano) 1 x 1,5mL Human Kappa Free High Control (Control alto Kappa libre humano)

8.2

Materiales necesarios no suministrados con el kit

8.2.1

Equipamiento de laboratorio para la recolección y preparación de muestras (p.ej. probetas para las muestras, centrífuga, etc.). Un analizador Beckman AU series completamente equipado. Viales para reactivo de 15mL para Beckman AU (Código de artículo Beckman: OE63165) y viales para particiones. Calibrador Beckman AU y racks para muestras (Código de artículo Beckman: MU809600, MUJ809300 y MUJ809200).

8.1.2

Las moléculas inmunoglobulinas se componen de dos cadenas pesadas idénticas (, , ,  o ) que definen el tipo de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras idénticas (κ o λ). Cada cadena ligera está unida covalentemente a una cadena pesada y las dos cadenas pesadas están entre si enlazadas covalentemente en la región bisagra. En el suero de individuos sanos la mayoría de las cadenas ligeras se presentan así, es decir ligadas a la cadena pesada. Sin embargo, también se encuentran pequeñas cantidades de cadenas ligeras en el suero de individuos sanos, ya que las células de plasma las producen y segregan en exceso. El peso molecular de ambas cadenas ligeras es de aproximadamente 22,5kD. En el suero se encuentra la cadena ligera kappa (κ-FLC) mayormente como monómero, la cadena ligera libre lambda (λ-FLC) como dímero covalentemente ligado, con un peso molecular de aproximadamente 45kD. Esto conlleva a un cociente de filtración glomerular para κ-FLC y λ-FLC distinto, lo que podría ser una posible explicación para la relación κFLC / λ-FLC de 0,625 encontrada en el suero. En contra la relación κ / λ de las cadenas ligeras ligadas es de 2,0.

8.1.3

8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.3

La concentración FLC son bajas en la orina. En un riñón sano son reabsorbidas selectivamente a través de las células tubulares, por lo que su presencia en la orina es debida a una secreción en el tracto de la orina. Una concentración elevada de las cadenas ligeras libres monoclonales en suero está asociada con la proliferación maligna de células plasmáticas (por ejemplo mieloma múltiple), amiloidosis AL y el depósito de cadenas ligeras libres (free light chain deposition disease). Con enfermedades autoinmunes como el lupus sistemico eritematoso (SLE) pueden aparecer unas concentraciones de suero elevadas en cadenas ligeras libres policlonales. La aparición de concentraciones elevadas de cadenas ligeras libres en la orina pueden indicar una enfermedad del riñón o una enfermedad de proliferación maligna linfática, como por ejemplo mieloma múltiple. Las cadenas ligeras libre monoclonales eliminadas con la orina se denominan proteínas Bence Jones (1-13). 3

PRINCIPIO

La sensibilidad de los tests turbidimétricos puede aumentar con el uso de partículas de látex (6). Esto comporta la unión del anticuerpo a una partícula de tamaño adecuado para obtener el aumento de la difusión del rayo de luz durante la reacción antígeno-anticuerpo. 4 4.1

4.2

4.3

Procedimiento de la prueba

El usuario deberá estar familiarizado con el uso de viales para reactivos sin código de barras antes de realizar la prueba. Para ejecutar un ensayo sin códigos de barras los reactivos se deben colocar en viales de 15mL y se debe tener cuidado para orientarlos correctamente. 8.4.1

Programación de los parámetros de las curvas

8.4.1.1 8.4.1.2

Ir a Parameters, Common Test Parameters, Test name. Pulsar Set, seleccionar un nombre libre para la prueba en la pestaña Test Name y pulsar Edit. Introducir el nobre de la prueba [Kap]. En la pestaña Long Name, seleccionar la prueba, pulsar Edit e introducer el nombre de la prueba [Kappa libre]. En la pestaña Alarm Shots, pulsar Set y cambiar el número de alarmas de Kap a 10. Ir a Parameters, Common test parameters, Round. Pulsar Set, seleccionar el círculo en el que hay que colocar [Kap] y pulsar Edit. Introducir [Kap] en el círculo seleccionado. Ir a Parameters, Specific Test Parameters, seleccionar [Kap], pulsar Set e introducir los parámetros como sigue:

8.4.1.4

8.4.1.5

Parámetros de Prueba Específicos – Pestaña de Rango 8.4.1.6 8.4.1.7 8.4.1.8

Poner 2 espacios para decimales. Poner la unidad a mg/L. Si las líneas 1-6 de “NormalRanges” no están en uso, poner “7.Nonspecific/Non-selected” a L [10 x AU016.A value], H [10 x AU016.F value]. (Si las líneas 1-6 están en uso, introducir los valores en “8.Out of Range”.)

Parámetros de Prueba Espeíificos – Pestaña General

REACTIVOS Reactivo látex: anticuerpo monoespecífico, el cual se ha fijado a partículas látex poliestireno. Conservante incluido: 0,05% de ProClin™*, 0,1% de ácido Eamino-n-caproico (EACA) y 0,01% de benzamidina. Estándard y controles: sueros humanos con cadenas ligeras libres policlonales Kappa. Se suministran en forma líquida estable. Conservante: 0,099% de azida sódica, 0,1% de EACA y 0,01% de benzamidina. Reactivo adicional: conservante: 0,099% de azida sódica.

* ProClin™ es una marca de Rohm and Haas Corp., Philadelphia, PA.

5

8.4

8.4.1.3

Para la determinación de un antígeno soluble mediante turbidimetría se añade la muestra a una cuveta de reacción que contiene una solución con el anticuerpo correspondiente. Durante la reacción antígeno-anticuerpo un rayo de luz pasa a través de la cuveta y aumenta mientras que se forman complejos inmunológicos insolubles. La difsión de la luz se detecta midiendo la reducción de la intensidad del rayo de luz incidente. El anticuerpo en la cuveta está en exceso, por tanto la cantidad del complejo inmunológico formado es proporcional a la concentración del antígeno. Se utiliza una serie de calibradores con concentración de antígeno conocida para realizar una curva de calibración sobre la relación entre la medición de la luz difundida y la concentración de antígeno. Las muestras con concentración de antígeno desconocida son ensayadas y los resultados pueden leerse en la curva de calibración.

Preparación de los reactivos

Mezclar suavemente por inversión evitando la formación de espuma o burbujas que podrían interferir en el momento de la aspiración del reactivo.

PRECAUCIONES

Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test.

Test name: Sample: Reagents:

[

Kappa free


[ [ [ [


[ [

5.0 L 55 L 95 L 600

]

Type:


[ Yes

]

Dilution [ 0 L ] Pre-dilution rate: [ 1 ] Dilution [ 0 L ] Min OD Max OD Dilution [ 0 L ] L [ ] H [ ] Sec. [ None ] Reagent OD limit END ] First L [ -2.0000 ] First H [ 2.5000 ] + ] Last L [ -2.0000 ] Last H [ 2.5000 ] 11 ] Last [ 27 ] Dynamic range ] Last [ ] L [ AU016.A value ] H [ AU016.F value ] Correlation factor ] % A [ 1.000000 ] B [ 0.000000 ] ] Onboard stability Period [ ]


] ] ] ]

Parámetros - Calibración

QC Específico – Predeterminación

8.4.1.9

Seleccionar nombre [Kap] y tipo [Serum] del test. Pulsar Set, Edit, seleccionar [Kappa Low] de la lista Control Name. Cambiar Multi/Single a [Single]. Mean, SD y Range se deben introducir tal y como se especifica en la Hoja de Datos de Producto adjunta (SIN069.DS)..

8.4.1.10 8.4.1.11

Ir a Parameters, Calibration, Calibrator. Pulsar Set, seleccionar un nombre nuevo para el calibrador, pulsar Edit e introducir un nombre de calibrador [kap1], ID [AU016.A], número de lote y fecha de caducidad para el primer calibrador. Asegúrese de que el tipo de Calibrador está puesto en [serum]. Repita el proceso para el resto de calibradores y apunte los números de calibrador utilizados. Ir a Parameters, Calibration, Calibration Specific, seleccionar [Kap] y pulsar Set e introducir los parámetros como sigue, donde [ * ] se refiere al número de calibrador relevante y aparece [ ** ] en la Hoja de Datos de Producto adjunta (SIN069.DS).

Repetir el proceso para el control alto. 8.5

Realización de controles y muestras

NB.

Para realizar una nueva curva de calibración se deben volver a poner a 1 el valor de pre-dilución y el factor A de correlación en los parámetros. Después de realizar la curva han de volverse a cambiar a 10 para ensayar muestras y controles.

8.5.1

Controles

8.5.1.1

Ir a Routine, Test Requisition, QC, pulsar Start Entry, seleccionar [Kap] y pulsar Entry. Para determinar la correcta posición de los controles en el rack pulsar QC.

8.5.1.2

Transfiera 100L de cada control en un vial para muestras de 1.5mL y colóquelo en la posición QC que corresponda antes de ponerlo en el analizador.

8.5.2

Muestras

Especificidades de Calibración – Pestaña General Test Name: Calibration type



OD [ [ [ [ [ [ [ ] ]


Ir a Routine, Test Requisition, Normal e introducir las muestras como estándard. 8.6

Ir a Parameter-Format-List Format Click en la pestaña Test Resaltar sus pruebas nuevas para añadirlas a las pruebas que ya se han resaltado. Repetir el proceso para Results List y Repeats List. NB:

Los usuarios deben introducir los valores Out of range y Dynamic range de cada kit nuevo tal y como se indica en la Hoja de datos de Producto específica de lote que acompaña al kit, SIN069.DS.

8.4.2

Realizar una curva de calibración

8.4.2.1

Transferir el reactivo de látex (R1) a un vial de 15mL y el reactivo complementario (R2) a un vial de 15mL aparte. Colocar los viales en el carrusel de reactivos en la orientación correcta con una partición para asegurar los viales. Ir a System Status, Reagent Status. Establecer la posición de los viales como reactivos fijos seleccionando  Fixed Reagent y  R1 o  R2. No hay que teclear los números de lote en las etiquetas de los reactivos, ya que R1 tendrá un número distinto al de R2 y es necesario que sean un conjunto que concuerde. Si no, el instrumento no reconocerá R1 y R2 como reactivos en par, y no funcionará. Introducir el tamaño del vial, 15mL. Ir a Check Start y comprobar los reactivos. Llenar el tubo del blanco con agua destilada y colocarlo en el analizador. Transfiera 100L de cada calibrador en un tubo de muestras a 1,5mL y colóquelos en el rack del calibrador que corresponda en orden ascendente (por ejemplo, la concentración más baja en primer lugar) antes de colocarlos en el analizador. Ir a Routine, Test Requisition, Calibration. Pulsar Start Entry, seleccionar [Kap] y otras sustancias que requieran calibración, pulsar Entry e iniciar el analizador. El progreso de la calibración se visualiza seleccionando System Status y después Data Display. Una vez completada la calibración y con el sistema en standby, se puede visualizar la curva de calibración yendo a Routine, Calibration Monitor, Calibration Curve y seleccionando [Kap]

8.4.2.2 8.4.2.3

8.4.2.4

8.4.2.5 8.4.2.6 8.4.2.7

8.4.3

Programación de parámetros para muestras

NB:

Los parámetros anteriores son los adecuados para realizar la curva de calibración, para poder realizar controles o muestras se debe seleccionar una dilución de 1:10.

8.4.3.1

Realice la curva de calibración según los parámetros anteriores y deje que el aparato se detenga. Ir a Parameters, Specific Test Parameters – General y cambiar el valor de pre-dilución a [10] y el Factor A de Correlación a [10] antes de realizar controles y muestras.

8.4.4

Programación de repetión automática de diluciones

8.4.4.1

Para programar la repetición automática de diluciones, es necesario introducer los parámetros correctos en Parameters, Repeat Parameters, Repeat Common. Pulsar la tecla Set. Para obtener una dilución más alta para muestras más altas que el rango seleccionar [F] & [H] en el modo Diluted AND-mode. Para obtener una dilución más baja para muestras más bajas que el rango seleccionar [G] & [L] en el modo Condensed AND-mode. Seleccionar la casilla Auto Repeat. Se deben introducir los parámetros para [Kap] en Parameters, Repeat Parameters, Repeat Specific. Seleccionar [Kap] desde la lista Test Name, pulsar la tecla Set y establecer los siguientes parámetros:

8.4.4.2 8.4.4.3 8.4.4.4 8.4.4.5 8.4.4.6 8.4.4.7

Test Name: Diluted Sample volume: Dilution volume: Pre-Dilution rate: Condense Sample volume: Dilution volume: Pre-Dilution rate:

[ Kap

]

Type:

[ 5.0 [ 0 [ 100

] L ] L ]


[ Serum

[ 5.0 [ 0 [ 5

] L ] L ]

[ 5.0 [ 0 [ 10

] ] L ] L ]


Dilución de Rango aproximado Dilución total Pre-dilución manual instrumento (mg/L) 1/1 (sólo orina) 1/1 0,6 - 15,0 1/5 1/5 3,0 – 75,0 1/10 1/10 6,0 – 150 1/100 1/100 60 – 1,500 1/1000 1/10 1/100* 600 – 15,000 1/10000 1/100 1/100* 6000 – 150,000 * Prepare una pre-dilución manual de 1/100 tomando 100µL de muestra y añada 900µL de diluyente de muestra del sistema para obtener una dilución inicial de 1/10. A partir de aquí, tome 100µL de esta dilución y añada 900µL de diluyente de muestra del sistema para obtener una dilución final de 1/100. Utilice la muestra diluida 1/100 para el análisis. Multiplique el resultado x 100. Puede tener lugar una precipitación no-específica en análisis de suero sin diluir, dando resultados anormalmente elevados o decaídos. NB:

9

Programación de muestras para QC

Ir a Parameter, QC Control. QC Común – Comprobación Verificar que el nivel de comprobación simple está puesto en [2SD] y que el modo QC está puesto en [Preset]. QC Común – Control Pulsar Set y seleccionar un número de control disponible. Pulsar Edit, introducir Control Name: [Kappa Low], Control ID: [NL016.AU], y Lot No: [número de lote].

En Beckman AU series a las muestras cuyo resultado está fuera del rango inicial de medición a 1/10 se les da un valor extrapolado y marcado con G & L (bajo) o F & H (alto). A continuación estas muestras se vuelven a analizar automáticamente a la dilución más alta o más baja adecuada. Si el nuevo resultado sigue estando fuera del rango inicial de medición, volverá a aparecer la marca L (bajo) o H (alto). Estas marcas no aparecen en la pantalla de revisión de datos, pero aparecerán en las impresiones. Las marcas F & G enlazan automáticamente a la dilución de muestra de modo que sólo aparecen cuando un valor está fuera del rango de ensayo para esa dilución. Las muestras que den una marca F o G a cualquier dilución no deben ser informadas. Las muestras con una marca H o L se pueden informar (tal y como se muestra más abajo). El rango general a informar es específico de lote y está indicado en la hoja de datos del producto incluída en cada kit Freelite. Ejemplo: El rango inicial de medición Kappa libre es 6-150 mg/L, con una dilución inicial de 1/10. El rango a informar, incluyendo las repeticiones automáticas altas (1/100) y bajas (1/5) es 3 – 1500mg/L. Un resultado de “1000H” obtenido a 1/100 es informable, PERO un resultado de “2500FH” a 1/100 está por encima del rango informable, con lo cual es un resultado extrapolado y no se debe informar. Se requiere una dilución manual más. De la misma manera, un resultado de “4L” a 1/5 se puede informar, PERO “0.50GL” es inferior al rango general informable así que sólo se puede informar como menos que la sensibilidad del ensayo (por ejemplo <3mg/L). CONTROL DE CALIDAD

Los controles suministrados se deben incluir en todas las ejecuciones del ensayo. La concentración de kappa libre correspondiente está indicada en la Hoja de Datos de Producto adjunta (SIN069.DS). Los resultados obtenidos durante la ejecución sólo deben ser aceptados si los resultados de control obtenidos están dentro del ±20% de las contraciones estipuladas. Si una medida de control está fuera de rango al realizar el ensayo con una curva almacenada, se debe recalibrar el ensayo. Si los valores de control medidos con la nueva curva siguen fuera de rango al recalibrar, se deben comprobar el instrumento y los parámetros antes de repetir el ensayo. Si el problema persiste póngase en contacto con su proveedor. 10 10.1

10.2

10.3 8.4.5

Rango de medición

Todas las muestras se deben analizar primero usando la dilución de muestra estándard 1/10, dando un rango de medición aproximado de 6-150mg/L. Esto habilita una sensibilidad de 3,0mg/L usando una dilución al 1/5, una sensibilidad de 0,6mg/L en muestras puras de orina. El límite superior del rango de medición usando una dilución de muestra de 1/100 es 1500mg/L. Para las muestras por encima del límite superior de la curva, recomendamos realizar las siguientes series de diluciones:

LIMITACIÓNES DEL PROCEDEMIENTO Los ensayos turbidimétricos no son adecuados para la medida de muestras fuertemente lipémicas o con niveles elevados de complejos inmuno circulantes (CICs) debido al impredecible grado de dispersión inespecífica que pueden generar estas muestras. Resultados inesperados deben confirmarse mediante un método alternativo. No debe realizarse el diagnóstico ni iniciarse un tratamiento basándose únicamente en la medida de la cadena ligera libre, deben tenerse en cuenta también la historia clínica y resultados de otras pruebas de laboratorio. Exceso de antígeno: Un exiguo número de muestras de pacientes que contienen concentraciones elevadas de cadenas libres Kappa o cadenas libres Lambda puede dar resultados falsos bajos para la cadena ligera presente en cantidad elevada. La composición aminoácida de las cadenas ligeras producidas durante una condición patológica de la célula B influirá el nivel, en correspondencia del cual, una muestra puede evidenciar, con el ensayo Freelite, un exceso de antígeno. En casi todos los casos la concentración de la cadena ligera presente en cantidad elevada resultará arriba del rango de normalidad previsto (3,30-19,40mg/L para las cadenas libres Kappa y 5,7126,30mg/L para las cadenas libres Lambda) y/o la concentración de la cadena ligera opuesta resultará debajo del rango de normalidad previsto y/o la relación de las cadenas Kappa libre/Lambda libre resultará fuera del rango previsto (0,26-1,65). Cualquier muestra deberá ensayarse siempre con dos diluciones, dilución manual y también a una pre-dilución manual de 1/100 (ver sección 8.6) para detectar el exceso antigénico si se da cualquiera de las siguientes condiciones:


a)

Cualquier muestra que manifieste una concentración de cadenas ligeras libres o una relación Kappa libre/Lambda libre fuera del rango previsto Cualquier muestra que provenga de un paciente que previamente haya manifestado exceso antigénico

b) o c) 10.4

10.5

10.6

11

Un resultado que no concuerde con los otros datos clínicos o de laboratorio

Las CLLS contienen combinaciones únicas de aminoácidos de regiones hipervariables. Por lo tanto es posible que algunas CLLs monoclonales sean indetectables por inmunoensayo, teniendo como consecuencia mediciones inferiores a las esperadas. En la práctica esto ocurre en raras ocasiones con el análisis Freelite. Primero se debe analizar si las muestras sospechosas contienen exceso antigénico (ver secciones 10.3) y posteriormente someterlas a análisis adicionales (inmunofijación y electroforesis de proteínas séricas). La naturaleza de las proteínas monoclonales puede ocasionar una respuesta no lineal en inmunoensayos, pudiendo llevar a resultados inconsistentes; esto se puede prevenir diluyendo siempre las muestras en la secuencia 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 – ver Sección 8.6). Se debe evitar la omisión de algún paso de dilución o el uso de diluciones alternativas. Debido a la naturaleza altamente variable de las proteínas monoclonales, los reactivos de diferentes lotes podrían reaccionar de distintas formas a los epítopos en algunas muestras. En estos casos, los resultados podrían variar al usar multiples lotes. Se debe extremar la precaución al monitorizar pacientes con reactivos de lotes distintos. Se recomienda, siempre que sea posible, que se analicen las muestras actuales y antiguas con los lotes nuevos y que se comparen los resultados.

Resultados Freelite Resultado Kappa Lambda Relación IFE Resumen Libre Libre κ/λ libre Suero normal 10 normales 10 normales 9 normales 10 normales 10 normal (10) 1 valor límite alto Sueros 24 altos 12 normales 24 altos 24 Kappa 19-24* muestran mieloma/ 12 bajos monoclonales bandas amiloidosis (24) monoclonales Sueros 10 normales 15 altos 20 bajos 20 Lambda 12-14* muestran mieloma/ 10 bajos 5 normales monoclonales bandas amiloidosis (20) monoclonales * Dependiente del método Todas las concentraciones anormales de cadenas ligeras en suero fueron detectadas con el kit Freelite, mientras que con métodos IFE algunas no se detectaron. Orina: Se analizaron 28 orinas (9 normales, 19 de pacientes conocidos/supuestos con mieloma) con kits Freelite Kappa y Lambda y un método comercialmente disponible de electroforesis de inmunofijación (IFE).

VALORES ESPERADOS

Los rangos indicados a continuación están basados enun número limitado de muestras y son orientativos. Se recomienda, cuando posible, calcular los rangos normales locales. 11.1

12.5 Estudio comparativo Suero: Se analizaron 54 sueros (10 normales, 44 de pacientes conocidos con mieloma múltiple o amiloidosis) con kits Freelite BNII Kappa y Lambda y con tres kits comerciales de electroforesis de inmunofijación (IFE). Las muestras clínicas (44) se evaluaron en un centro de referencia independiente de EE.UU.

Rangos de valores en suero de adultos

282 individuos sanos de edades comprendidas entre 20 y 90 años se sometieron a las pruebas realizadas mediante el análisis Freelite de Binding Site para BN™II* (11). Los resultados se muestran a continuación en la tabla inferior. Suero adulto normal Kappa libre Lambda libre Ratio Kappa/Lambda

Conc. media 8,36 (mg/L) 13,43 (mg/L) Media 0,63

Mediana conc. 7,30 (mg/L) 12,40 (mg/L) Mediana 0,60

95 Rango percentil 3,30 - 19,40 (mg/L) 5,71 - 26,30 (mg/L) Rango total 0,26 - 1,65

Se estudió la equivalencia del rango normal obtenido con los ensayos BNII y Beckman AU analizando 100 muestras normales de donantes de UK de edades entre 20 y 60 años y 61 muestras de pacientes enfermos con Freelite para BNII y Beckman AU. Los estudios del análisis de regresión son: para el ensayo kappa, y=0,95x + 21,18mg/L, r=0,95, y para el ensayo lambda y=0,88x + 11,75mg/L, r=0,99 (y = valor Beckman AU, x = valor BNII). Esto demuestra que los datos más amplios generados en la Mayo Clinic son aplicables a los ensayos de la serie Beckman AU.

Orina normal (10) Orina Kappa mieloma (9) Orina Lambda mieloma (10)

1.

Estos valores normales se determinaron por medición de la concentración de las cadenas ligeras libres de las orinas de 66 donantes adultos normales(5). Orina adulta normal Kappa libre Lambda libre 12

Conc. media

SD

5.40 (mg/L) 3.17 (mg/L)

4.95 (mg/L) 3.30 (mg/L)

95 rango percentil 0.39 – 15.1 (mg/L) 0.81 – 10.1 (mg/L)

Ratio κ/λ & 95 rango percentil 1,852 0,461-4,00

CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO

2. 3.

4.

5.

Los datos que siguen se obtuvieron utilizando un Beckman AU400: 12.1 Precisión intra-ensayo Se han medido tres preparaciones diferentes con concentraciones diversas de cadenas ligeras libres Kappa. Cada valor indicado se ha calculado por medio de 10 mediciones de una misma serie de análisis. Todos los valores de concentración son en mg/L. Valor medio CV%

Suero 1 22,05 1,97

Suero 2 40,83 1,24

Suero 3 153,26 1,89

12.2 Precisión serie a serie Se han medido tres preparaciones distintas con concentraciones variadas de cadenas ligeras libres Kappa con kits de un único lote en 10 series de análisis diferentes. Todos los valores de concentración son en mg/L. Valor medio CV%

Suero 1 22,23 5,78

Suero 2 41,35 5,17

Suero 3 135,38 6,02

12.3 Linearidad La linearidad de los análisis se confirmó analizando una serie de diluciones de un suero: recta de regresión y = 0,98x + 1,68 (mg/L), r = 1,00 y = concentración medida de Kappa libre, x = concentración teórica) a una dilución de muestra de 1/10. 12.4 Sustancias interferentes En una medición de control de 53mg/L de Kappa libre, se encontraron interferencias insignificantes en 200mg/L de bilirrubina (-4,8%), 1g/L hemoglobina (5,9%) y quilo (1930 formazine turbidity units) (-10,7%) utilizando 53mg/L de suero de control kappa libre a dilución de muestra 1/10.

Resumen 10 normales

Resultados IFE 10 normales

9 Kappa 9 muestran monoclonales bandas monoclonales 10 Lambda 10 muestran monoclonales bandas monoclonales

12.6 Estudios clínicos Los estudios clínicos con estos kits y kits Freelite han demostrado que pueden evaluarse con seguridad concentraciones elevadas de cadenas ligeras libres en mieloma múltiple o SLE, siendo posible que la sensibilidad sea más grande que con los tests IFE (5). Otros estudios han mostrado que el test Freelite es un óptimo auxiliar para el diagnóstico y control del mieloma no secretorio(4). 13

Rangos de valores en orina de adultos normales

7 altos 3 normales

Resultados Freelite Lambda Relación libre κ/λ libre 5 normales 9 normales 5 valor 1 valor límite límite altos alto 3 altos 8 altos 6 valor 1 normal límite altos 10 altos 10 bajos

Todas las concentraciones anormales de cadenas ligeras en suero fueron detectadas tanto con los kits Freelite así como de los IFE.

*BN™II es una marca de Siemens Healthcare Diagnostics Inc.

11.2

Kappa libre 8 normales 2 valor límite altos 9 altos

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12. 13.

BIBLIOGRAFIA Cole PW, Durie BGM, Salmon SE. (1978) Immunoquantitation of free light chain immunoglobulins: Application in multiple myeloma. J. Immunol. Meth. 19: 341-349. Pescali E, Pezozoli A. (1988) The clinical spectrum of pure Bence-Jones proteinuria. Cancer 61: 2408-2415. Solling K, Solling J, Romer FK. (1981) Free light chains of immunoglobulins in serum from patients with rheumatoid arthritis, sarcoidosis, chronic infections and pulmonary cancer. Acta. Med. Scand. 209: 473-477. Drayson MT, Tang LX, Drew R, Mead GP, Carr-Smith HD and Bradwell AR. (2001). Serum free light chain measurements for identifying and monitoring patients with non-secretory multiple myeloma. Blood 97: 2900-2902. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, Showell PJ, Drayson MT and Drew R (2001). Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin. Chem. 47: 4, 673-680. Tang LX, Showell P, Carr-Smith HD, Mead GP, Drew R and Bradwell AR (2000). Evaluation of F(ab‟)2-based latex-enhanced nephelometric reagents for free immunoglobulin light chains on the Behring Nephelometer TM II. Clin. Chem 46:6, Suppl. 2000, 705, pA181. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Harvey TC and Drayson MT. (2003) Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma. Lancet 361: 489-491. Abraham RS, Katzman JA, Clark RJ, Bradwell AR, Kyle RA and Gertz MA (2003). Quantitative Analysis of Serum Free Light Chains: A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Am. J. Clin. Pathol. 119: (2): 274 – 278. Lachmann HJ, Gallimore JR, Gillmore JD, Carr-Smith HD, Bradwell AR, Pepys MB and Hawkins PN (2003). Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating immunoglobulin free light chains following chemotherapy. Brit. J.Haem. 122: 78-84. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP and Drayson MT (2002) Serum free light chain immunoassays and their clinical application. Clinical and Applied Immunology Reviews 3: 17 – 33. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp JF, Bradwell, AR and Kyle RA. (2002) Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin. Chem. 48: 1437-1444. Bradwell AR (2009). Serum Free Light Chain Analysis, 5 th Edition, Publ. The Binding Site Ltd, Birmingham, UK. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ, Child JA and Bradwell AR (2004). Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Brit. J. Heamatol. 126, 348-354


OBSAH

Souprava Freelite® pro stanovení lidských volných řetězců kappa na analyzátorech Beckman série AU®

Strana 1

Použití

2

Souhrn a výklad

3

Princip

4

Reagencie

5

Upozornění

6

Skladování a stabilita

Dodavatel pro Českou republiku a Slovenskou republiku: The Binding Site s.r.o., Sinkulova 55, 147 00 Praha 4, Česká republika Tel : +420 223 013 988/9 Fax : +420 222 948 482 Internet: www.bindingsite.cz e-mail: [email protected]

7

Skladování a stabilita

V Evropě a USA je Freelite® registrovanou ochrannou známkou společnosti The Binding Site Group Ltd, Birmingham, UK. AU® je registrovaná ochranná známka firmy Beckman Coulter Inc.

8

Metodología

9

Řízení jakosti

10

Omezení postupu

11

Očekávané hodnoty

12

Charakteristiky stanovení

13

Literatura

Czech

Pro diagnostické použití in-vitro Kód výrobku: LK016.AU Výrobce: The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk

1

POUŽITÍ

Tato souprava je určena pro kvantitativní stanovení volných lehkých řetězců kappa v séru a moči na analyzátorech série Beckman AU. Ve spojení s dalšími laboratorními a klinickými nálezy pomáhá stanovení volných lehkých řetězců v diagnostice a monitorování mnohočetného myelomu, lymfocytárních malignit, Waldenströmovy makroglobulinémie, AL amyloidózy, chorob spojených s depozity lehkých řetězců a chorob pojiva, jako je např. systémový lupus erythematodes. 2

SOUHRN A VÝKLAD

Imunoglobulinové molekuly jsou složeny vždy ze dvou identických těžkých řetězců (, , ,  nebo ), které určují třídu imunoglobulinu a ze dvou identických lehkých řetězců (κ nebo λ). Každý lehký řetězec je kovalentně vázán na těžký řetězec a vždy dva těžké řetězce jsou kovalentně spojeny v tzv. pantové (“hinge”) oblasti. U zdravých jedinců existuje většina lehkých řetězců v séru v popsané formě, tzn. vázané na těžký řetězec, nicméně i v sérech normálních jedinců jsou přítomny nízké hladiny volných řetězců (“free light chains”, FLC) jako důsledek nadprodukce a sekrece FLC plazmatickými buňkami. Molekulová hmotnost obou lehkých řetězců je 22,5kD; sérové volné lehké řetězce κ (κ-FLC) existují převážně jako monomery a volné lehké řetězce λ (λ-FLC) ve formě kovalentně vázaného dimeru s molekulovou hmotností  45kD. Tato skutečnost je příčinou odlišné rychlosti glomerulární filtrace κ-FLC a λ-FLC a může objasnit rozdíly v poměru κ-FLC/λ-FLC nalézané v séru (0,625) a u vázaných lehkých řetězců, kde je poměr κ/λ roven 2. Hladiny FLC v moči jsou nízké. Ve zdravé ledvině reabsorbují tubulární buňky selektivně všechny FLC, proto je přítomnost FLC v moči spíše důsledkem sekrece přímo v močovém systému. Zvýšené sérové hladiny monoklonálních FLC jsou spojeny s maligní proliferací plazmatických buněk (např. u mnohočetného myelomu), AL amyloidózou a chorobou spojenou s depozity lehkých řetězců. Zvýšené sérové hladiny polyklonálních FLC se mohou vyskytovat u autoimunitních chorob, jako je systémový lupus erythematodes. Přítomnost vyšších hladin FLC v moči může indikovat postižení ledvin nebo maligní lymfoproliferativní onemocnění (např. mnohočetný myelom). Nález monoklonálních FLC v moči je spojován s další lymfoidní malignitou, která je charakterizována produkcí tzv. Bence Jonesova proteinu(1-13). 3

PRINCIP

Stanovení koncentrace rozpustného antigenu turbidimetricky je založeno na přidání testovaného vzorku k roztoku, který obsahuje příslušnou protilátku v reakční nádobě nebo kyvetě. Světelný paprsek prochází kyvetou a při pokračující reakci antigenu s protilátkou je světlo procházející kyvetou zvýšenou měrou rozptýleno v důsledku vzniku imunokomplexů. Rozptyl světla je monitorován měřením snížené intenzity dopadajícícho světelného paprsku. Protilátka v kyvetě je v nadbytku, takže množství vzniklých imunokomplexů odpovídá koncentraci antigenu. Měření řady kalibrátorů o známých koncentracích slouží pro konstrukci kalibrační křivky, kdy je vynášen měřený rozptyl světla oproti koncentraci antigenu. U vzorků s neznámou koncentrací antigenu jsou po stanovení výsledky odečteny z kalibrační křivky. Citlivost turbidimetrických metod může být zvýšena použitím tzv. částicového zesílení („particle enhancement“)(6). Principem je navázání protilátky na částice o vhodné velikosti, což zvyšuje relativní signál rozptylu světla při reakci antigenu s protilátkou. 4 4.4

4.5

4.6

REAGENCIE Latexová reagencie: Obsahuje monospecifickou protilátku navázanou na polystyrenový latex. Konzervační látky: 0,05% ProClin*, 0,1% kyselinu ε-aminoN-kapronovou (EACA) a 0,01% benzamidin. Standard a kontroly: Lidská séra obsahující polyklonální kappa volné lehké řetězce. Jsou dodávány ve formě stabilizovaných roztoků a dále obsahují 0,099% azid sodný, 0,1% EACA a 0,01% benzamidin jako konzervační látky. Doplňková reagencie (Supplementary Reagent): Obsahuje 0,099% azid sodný jako konzervační látku.

*ProClin™ je ochranná známka firmy Rohm and Haas Corp., Philadelphia, PA.

5

UPOZORNĚNÍ

Všichni dárci lidského séra obsaženého v této soupravě byli testování na přítomnost povrchových antigenů hepatitidy B (HbsAg) a protilátek proti viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV 1 a 2) a viru hepatitidy C a jejich sérum bylo shledáno jako negativní. Přestože byla použitá stanovení schválena FDA (v USA) nebo povolena k použití pro diagnostické účely in vitro v EU (Směrnice 98/97/EC, Annex II), nemohou tyto testy zaručit nepřítomnost infekčních agens. Stejně jako pro všechny potenciálně infekční materiály musí být i pro tyto materiály zavedeny vhodné metody manipulace a likvidace, což platí i pro uživatele, kteří po celou dobu používají vhodné rukavice, ochranné pomůcky a oděv (platnost však není omezena pouze na uvedené uživatele).


Provádění těchto postupů smí být povoleno pouze pracovníkům dostatečně školeným v těchto metodách.

Specifické parametry testu – tabulka obecných hodnot (General Tab) Test name:

Tento výrobek obsahuje azid sodný a ProClin 300 a musí se s ním zacházet s opatrností. Nesmí dojít k požití nebo ke styku s pokožkou (zejména s poškozenou kůží nebo s otevřenými ranami) nebo sliznicemi. V případě kontaktu omyjte postižené místo velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc. Azid sodný může reagovat s olovem nebo mědí v potrubí za vzniku výbušných azidů kovů; likvidované reagencie proto splachujte velkým množstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidu v potrubí. Tento výrobek smějí používat pouze vhodně školení pracovníci a může být používán pouze k účelům uvedeným v oddíle POUŽITÍ tohoto návodu. Přesné dodržování uvedeného postupu po celou dobu stanovení je zcela nezbytné. Výsledky získané za použití jiných než předepsaných parametrů budou pravděpodobně neplatné. NELZE zaměňovat reagencie z různých šarží soupravy. Při provádění velkého počtu testů věnujte pozornost tomu, aby všechny reagencie pocházely ze stejné šarže.

[

Kappa free

Sample: Reagents:


[ [ [ [


[ [

]

5,0 L 55 L 95 L 600

Type:


[ Yes

]

] ] ] ]

Dilution [ 0L ] Pre-dilution rate: [ 1 ] Dilution [ 0L ] Min OD Max OD Dilution [ 0L ] L [ ] H [ ] Sec. [ None ] Reagent OD limit END ] First L [ -2.0000 ] First H [ 2.5000 ] + ] Last L [ -2.0000 ] Last H [ 2.5000 ] 11 ] Last [ 27 ] Dynamic range ] Last [ ] L [ AU016.A value ] H [ AU016.F value ] Correlation factor ] % A [ 1.000000 ] B [ 0.000000 ] ] Onboard stability Period [ ]

Parametry - kalibrace 6

SKLADOVÁNÍ A STABILITA 8.4.1.9

Neotevřené soupravy je třeba skladovat při teplotě 2-8°C a lze je používat až do data exspirace uvedeného na štítku papírového obalu soupravy. NEZAMRAZUJTE. Latexovou reagencii, kalibrátory a kontroly skladujte při teplotě 2-8°C nejdéle 3 měsíce po otevření, aby nedošlo k jejich odpaření a kontaminaci. 7

ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ

Použijte čerstvé nebo hlubokozmrazené vzorky séra případně moči. Krev by měla být získána venepunkcí, ponechána přirozeně zkoagulovat a sérum by mělo být odděleno co nejdříve, aby se předešlo hemolýze. Vzorky lze uchovávat při 2-8°C nejdéle po dobu 21 dnů, pro delší skladování je nutné je zamrazit a uchovávat při teplotách -20°C nebo nižších. Vyhněte se opakovanému zamrazování a rozmrazování vzorků. Nepoužívejte mikrobiálně kontaminované sérum nebo moč, vzorky obsahující pevné částice ani hemolyzovaná nebo lipemická séra. 8

METODIKA

Poznámka: Aby byla zaručena správná interpretace výsledků, měl by být určen poměr volných řetězců kappa / lambda. Z tohoto důvodu musí být vzorky testovány také soupravou The Binding Site Freelite Lambda Free kit (LK018.AU). 8.1

Materiály obsažené v soupravě

8.1.1

2 x 4,0mL Human Kappa Free Reagent (latexové reagencie proti lidskému volnému řetězci kappa, R1). 2 x 6,0mL Kappa Free Supplementary Reagent (doplňková reagencie pro stanovení lidských volných řetězců kappa (R2). 1 x Human Kappa Free Calibrator 1-6 (sada kalibrátorů 1-6 pro stanovení lidských volných řetězců kappa)). 1 x 1,5mL Human Kappa Free Control (kontrola pro stanovení lidských volných řetězců kappa). 1 x 1,5mL Human Kappa Free High Control (kontrola o vysoké koncentraci pro stanovení lidských volných řetězců kappa).

8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5 8.2

Další potřebné materiály (nejsou součástí soupravy)

8.2.1

Vybavení pro odběr a přípravu testovaných vzorků, např. odběrové zkumavky, centrifuga atd. Plně funkční a vybavený analyzátor série Beckman AU. Beckman AU nádobky na reagencie o objemu 15mL (Beckman, kód OE63165) a přepážky pro zajištění nádobek. Beckman AU stojánky pro kalibrátory a vzorky (Beckman, kód MU809600, MUJ809300 a MUJ809200).

8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.3

8.4.1.10 8.4.1.11

Specifická kalibrace – tabulka obecných hodnot (General Tab) Test Name: Calibration type

8.4.2

Naměření kalibrační křivky

8.4.2.8

Přeneste latexovou reagencii (R1) do 15mL reagenční lahvičky; do další 15mL reagenční lahvičky přemístěte doplňkovou reagencii. Umístěte lahvičky ve správné orientaci na karusel. Lahvičky jsou zajištěny přepážkami. Zvolte System Status (Stav Systému), Reagent Status (Stav reagencie). Nastavte pozici lahviček jako fixovaných reagencií tak, že zvolíte Fixed Reagent a  R1 nebo  R2. Do pole pro zadání čísla šarže reagencie nezadávejte žádné údaje, protože R1 má jiné číslo šarže než R2 a tato čísla se musí lišit, jinak přístroj nerozezná R1 a R2 jako párové reagencie a nebude možno spustit stanovení. Zadejte objem nádobky, např. 15mL. Přejděte na Check Start (Kontrola před startem) a zkontrolujte reagencie. Naplňte nádobku určenou pro blank destilovanou vodou a vložte do analyzátoru. Přeneste 100L každého kalibrátoru do 1,5mL nádobky pro vzorky a před založením do analyzátoru umístěte kalibrátory do příslušného nosiče ve vzestupném pořadí (tzn. kalibrátor s nejnižší koncentrací jako první). Zvolte Routine (Rutina), Test Requisition (Požadavek na test), Calibration (Kalibrace). Stiskněte Start Entry (Vstup), vyberte [Kap], stiskněte Entry (Vstup) a spusťte analyzátor. Průběh kalibrace lze znázornit po vybrání System Status (Stav systému) a poté Data Display (Zobrazit data). Jakmile je kalibrace dokončena a systém je v pohotovostním stavu (standby), může být kalibrační křivka zobrazena zvolením Routine (Rutina), Calibration Monitor (Sledování kalibrace), Calibration Curve (Kalibrační křivka) a vybráním [Kap].

8.4.2.9 8.4.2.10

8.4.2.11

8.4.2.12

8.4.2.13 Programování parametrů křivky

8.4.1.1

Zvolte Parameters (Parametry), Common Test Parameters (Obecné parametry testu), Test name (Jméno testu). Stiskněte Set (Nastavit), vyberte neobsazenou položku Test Name (Název testu) a stiskněte Edit. Vložte jméno testu [Kap]. V tabulce Long Name (Celé jméno) vyberte test, stiskněte Edit a vložte jméno testu [Kappa free]. V tabulce Alarm Shots stiskněte Set a změňte počet alarmů pro Kap na 10. Zvolte Parameters (Parametry), Common test parameters (Obecné parametry testu), Round (Okruh). Stiskněte Set (Nastavit), vyberte okruh, v kterém je umístěn [Kap] a stiskněte Edit. Vložte [Kap] na vybraný okruh. Zvolte Parameters (Parametry), Specific Test Parameters (Specifické parametry testu), vyberte [Kap], stiskněte Set (Nastavit) a vložte níže uvedené parametry.

8.4.2.14

8.4.1.2 8.4.1.3

8.4.1.7

8.4.1.8

Specifické parametry testu – tabulka rozsahu (Range Tab) 8.4.1.7 8.4.1.8 8.4.1.9

Nastavte počet desetinných míst na 2. Nastavte jednotky na mg/L. Pokud se nepoužívají “Normal Ranges“ (normální rozsahy), řádky 1 – 6, nastavte “7.Non-specific/Non-selected“ (Nespecifické/Nezvolené) na L [hodnota 10 x AU016.A], H [hodnota 10 x AU016.F]. Pokud jsou řádky 1-6 používány, zadejte místo toho hodnoty do “8.Out of Range“ (mimo rozsah).

[ [ [ [ [ [ [ ] ]


Důležitá poznámka: Uživatelé musí zadat hodnoty mimo rozsah (Out of Range ) a hodnoty dynamického rozsahu (Dynamic Range) pro každou novou soupravu, jak je výslovně uvedeno v příbalovém listu (Product Data Sheet), SIN069.DS, který je specifický pro každou výrobní sérii.

Postup testu

8.4.1

Conc]

OD

Přejděte na Parameter (Parametr)-Format (Formát)-List Format (Vyhledat formát). Vyberte Test tab (Tabulka testů). Pro přidání nových testů k již vybraným (zvýrazněným) testům zvýrazněte také nově přidané testy. Postup opakujte v Results List (Přehled výsledků) a v Repeats List (Přehled opakování).

Příprava reagencií

Uživatel by se měl ještě před prováděním testu předem obeznámit s používáním reagenčních lahviček bez čárových kódů. Aby bylo možno provádět stanovení bez čárových kódů, reagencie musí být přeneseny do reagenčních lahviček o objemu 15mL, jejichž správné orientaci je třeba věnovat zvláštní pozornost.

[ Kap ] Type: [ Serum ] [ 6AB ] Formula: [Polygonal] Counts:[1] Process: [


Před vložením do analyzátoru reagencie opatrně promíchejte převracením lahvičky dnem vzhůru. Dbejte, aby se nevytvořila pěna nebo bublinky. Jejich přítomnost na hladině by mohla způsobit chybu při nasávání reagencie. 8.4

Zvolte Parameters (Parametry), Calibration (Kalibrace), Calibrator (Kalibrátor). Stiskněte Set (Nastavit), vyberte volné jméno kalibrátoru, stiskněte Edit a zadejte jméno kalibrátoru [kap1], identifikační kód [AU016.A], exspiraci a číslo šarže prvního kalibrátoru. Ujistěte se, že typ kalibrátoru je nastaven na sérum [serum]. Opakujte pro ostatní kalibrátory a poznamenejte si jejich počet. Zvolte Parameters (Parametry), Calibration (Kalibrace), Calibration Specific (Specifická kalibrace), vyberte [Kap], stiskněte Set (Nastavit) a vložte níže uvedené parametry, kde [* * ] je uveden v přiloženém Informačním listu výrobku (SIN069.DS).

8.4.3

Programování parametrů vzorku

POZN:

Výše uvedené parametry jsou určeny pro naměření kalibrační křivky; pro kontroly nebo vzorky je nutné zadat strojové ředění 1:10.

8.4.3.2

Naměřte kalibrační křivku podle výše uvedených parametrů a nechte přístroj zastavit. Před měřením vzorků a kontrol zvolte Parameters (Parametry), Specific Test Parameters – General (Specifické parametry testu - obecné) a změňte míru předředění na [10] a korelační faktor A na [10].

8.4.4

Programování automatizovaného opakovaného ředění

8.4.4.8

K naprogramování automatického opakovaného ředění musí být správně zadáno nastavení v Parameters (Parametry), Repeat Parameters (Opakované parametry), Repeat Common (Obecné opakování). Stiskněte klávesu Set (Nastavit). Pro nastavení vyššího ředění u vzorků, které byly nad rozsahem měření, zvolte [F] ] & [H] v módu Diluted AND. Pro nastavení nižšího ředění u vzorků, které byly pod rozsahem měření, zvolte[G] & [L] v módu Condensed AND . Vyberte políčko Auto Repeat. Parametry pro [Kap] pak musí být uloženy v Parameters (Parametry), Repeat Parameters (Opakované parametry), Repeat Specific (Specifické opakování). Ze seznamu jmen testů vyberte [Kap], stiskněte klávesu Set (Nastavit) a zadejte níže uvedené parametry:

8.4.4.9 8.4.4.10 8.4.4.11 8.4.4.12 8.4.4.13

8.4.4.14


Test Name:

[ Kap

Diluted Sample volume: Dilution volume: Pre-Dilution rate:

[ 5,0 [ 0 [ 100

]

Type:

[ Serum

]

] L ] L ]


[ 5,0 [ 0 [ 10

] L ] L ]

10.1

]

10.2

Condense Repeat Decision Level Sample volume: [ 5,0 ] L Dilution volume: [ 0 ] L Pre-Dilution rate: [ 5 ] 8.4.5

10

L:[-99999.99] H: [ 99999.99

10.3

Programování vzorků pro kontrolu jakosti (QC)

Zvolte Parameter (Parametr), QC Control (Kontrola jakosti). QC Common – Check (Kontrola jakosti obecná – ověření) Ověřte, že jednotlivá úroveň kontroly je nastavena na [2SD] a že QC režim je nastaven na [Preset]. QC Common – Control (Kontrola jakosti obecná – kontrola) Stiskněte Set (Nastavit) a vyberte neobsazené číslo kontroly. Stiskněte Edit, vložte jméno kontroly: [Kappa Low], vložte identifikaci (ID) kontroly: [NL016.AU] a zadejte číslo šarže (Lot No). QC Specific – Preset (Kontrola jakosti specifická – přednastavení) Vyberte jméno testu [Kap] a typ [Serum]. Stiskněte Set (Nastavit), stiskněte Edit, vyberte [Kappa Low] ze seznamu jmen kontrol. Nastavte Multi/Single (vícenásobná/jednoduchá) na [Single]. Z hodnot, specifických pro každou výrobní sérii, uvedených v příbalovém listu (Product Data Sheet, SIN069.SD) zadejte průměr („mean“), hodnotu SD a rozsah („range“).

b)

c)

Měření kontrol a vzorků

10.4

Důležité upozornění: Pro změření nové kalibrační křivky musí být míra předředění (pre-dilution rate) a korelační faktor A (correlation factor) nastaveny zpět na 1. Po ukončení kalibrace musí být tyto parametry změněny zpět na hodnotu 10, aby bylo možné měřit vzorky a kontroly. 8.5.1

Kontroly

8.5.1.1

Zvolte Routine (Rutina), Test Requisition (Požadavek na test), QC (Kontrola jakosti), stiskněte Start Entry (Příprava startu), zvýrazněte [Kap] a stiskněte Entry (Vstup). Abyste prověřili správnou pozici kontrol v nosiči, stiskněte QC.

8.5.1.2

Přeneste po 100 L každé kontroly do 1,5mL nádobek pro vzorky a umístěte je do odpovídajích QC pozic před vložením do analyzátoru.

8.5.2

Vzorky

10.5

10.6

Přejděte na Routine (Rutina), Test Requisition (Požadavek na test), Normal (Normální) a standardním způsobem zadejte vzorky. 8.6

Rozsah měření

Strojové ředění

1/1 (pouze moč) 1/5 1/10 1/100 1/1000 1/10000

1/1 1/5 1/10 1/100 1/10 1/100

Ředění manuální (mimo přístroj) 1/100* 1/100*

Přibližný rozsah (mg/L) 0,6 – 15,0 3,0 – 75,0 6,0 – 150 60 – 1500 600 – 15000 6000 – 150000

*Manuální naředění vzorku na koncentraci 1/100 proveďte následujícím způsobem: smíchejte 100 µL vzorku a 900 µL ředicího roztoku pro vzorky, čímž vznikne koncentrace 1/10. Z tohoto ředění 1/10 odeberte 100 µL a smíchejte opět s 900 µL ředicího roztoku pro vzorky, čímž vznikne finální ředění 1/100. Vzorek ředěný 1/100 připravte pro analýzu. Výsledek měření vynásobte 100krát. Pokud je k měření použito neředěné sérum, může dojít k nespecifické precipitaci a v jejím důsledku k falešně zvýšeným nebo chybným výsledkům. Důležité upozornění: Na analyzátorech Beckman série AU jsou pro měření mimo původní rozsah při ředění 1/10 zobrazovány extrapolované hodnoty a jsou opatřeny výstražnou hláškou G & L (low) nebo F & H (high). Tyto vzorky jsou potom automaticky znovu testovány při vhodném vyšším nebo nižším ředění, avšak nový výsledek je znovu opatřen výstražnou hláškou, pokud spadá mimo původní rozsah měření (tyto výstražné hlášky se neobjevují na přehledu údajů na obrazovce, ale objeví se na výtisku). Hlášky G & L jsou automaticky spojeny s ředěním vzorku, a proto se objevují pouze tam, kde je hodnota mimo rozsah testu pro dané ředění. Výsledky vzorků dávajících výstražnou hlášku F nebo G při jakémkoliv ředění nesmějí být vydány. Výsledky vzorků dávajících hlášku H nebo L je možné vydat (jak je uvedeno níže). Celkový rozsah vhodný pro vydání výsledků je specifický pro určitou výrobní sérii a je uveden v příbalovém listu v každé soupravě Freelite. Např.: Výchozí rozsah měření pro Free Kappa je 6-150mg/L při výchozím ředění 1/10. Rozsah hodnot přípustných pro vydání výsledků je včetně možných automatických opakování testů pro vysoké (1/100) a nízké (1/5) hodnoty 3–1500mg/L. Výsledek “1000H” získaný při ředění 1/100 je Přípustný, AVŠAK výsledek "2500FH" při ředění 1/100 je nad přípustným rozsahem, protože je výsledkem extrapolace a nesmí být tedy vydán. Je nutné vzorek dále ručně naředit. Obdobně výsledek “4L“ při ředění 1/5 lze vydat, AVŠAK výsledek “0,50GL“ je pod přípustným celkovým rozsahem, lze ho tedy vydat pouze jako nižší než je hodnota citlivosti testu (tedy <3mg/L). 9

vzorek vykazuje buď koncentraci volného lehkého řetězce nebo poměr volných řetězců kappa/lambda mimo uvedený rozsah, vzorek pochází od pacienta, u něhož byl při předešlém testu zjištěn nadbytek antigenu nebo výsledek vzorku neodpovídá buď klinickým nebo laboratorním nálezům

Každý monoklonální FLC obsahuje jedinečné kombinace aminokyselin. Je proto pro určité monoklonální proteiny teoreticky možné, že jsou pomocí imunoanalytického testu nedetegovatelné, a v důsledku toho zjištěné hodnoty mohou být oproti očekávání nižší. Ve skutečnosti se tato situace při použití testů Freelite vyskytuje mimořádně vzácně. Podezřelé vzorky je nutné nejprve testovat na nadbytek antigenu (viz oddíl 10.3 nahoře), potom pátrat pomocí dalších laboratorních metod (imunofixace a elektroforézy sérových proteinů). Přirozená podstata monoklonálních proteinů může způsobit v imunoanalýze nelineární odpověď, což potenciálně vede k nekonsistentním výsledkům; této situaci lze předejít testováním vzorků vždy v řadě ředění 1/10, 1/100, 1/1000 a 1/10000 (viz oddíl 8.6). Je nutné vyvarovat se toho, aby krok ředění byl vynechán nebo aby byla použita jiná ředění, než která jsou uvedena. Vzhledem k vysoce proměnlivým a různorodým vlastnostem monoklonálních proteinů mohou reagencie z různých šarží u některých pacientských vzorků různě reagovat s epitopy volných lehkých řetězců. V těchto případech se výsledky vzorku mohou při použití různých šarží souprav lišit. Při hodnocení pacientského vzorku měřeného pomocí různých šarží soupravy je třeba postupovat se zvýšenou opatrností. V každém případě je doporučeno, aby byly předchozí a stávající vzorky testovány společně pomocí nových šarží reagencií a výsledky byly porovnány.

Informace FDA (USA) - viz titulní strana anglického návodu.

Všechny vzorky musí být nejprve testovány ve standardním ředění, tj. 1/10 při přibližném rozsahu měření 6-150 mg/L. To umožňuje citlivost 3,0 mg/L u vzorků s použitým ředěním 1/5 a citlivost 0,6 mg/L u neředěných vzorků moči. Horní hranice rozsahu měření při ředění vzorku 1/100 je 1500 mg/L. Pro vzorky, které jsou při strojovém ředění 1/100 nad horní hranicí rozsahu křivky, se doporučuje provést další ředění mimo přístroj podle níže uvedené tabulky: Celkové ředění

Turbidimetrické soupravy nejsou vhodné pro měření vysoce lipemických nebo hemolyzovaných vzorků nebo vzorků obsahujících vysoké hladiny cirkulujících imunokomplexů (CIK), protože tento typ vzorků může vyvolat nespecifický rozptyl světla nepředvídatelného rozsahu. Neočekávané výsledky by měly být potvrzeny pomocí alternativní metody stanovení. Na základě samotného měření hladin volných kappa řetězců nelze stanovit diagnózu, ani zahájit léčbu. Je nutné vzít v úvahu anamnézu a další laboratorní nálezy pacienta. Nadbytek antigenu: Malý počet pacientských vzorků obsahujících ve vysoké koncentraci volné řetězce kappa nebo volné řetězce lambda mohou vlivem nadbytku antigenu poskytnout falešně nízký výsledek pro “zvýšený” volný řetězec. Aminokyselinové složení lehkých řetězců produkovaných při určitých typech onemocnění původem z buněk B může ovlivnit hladinu, kdy je při použití stanovení Freelite ve vzorku zjištěn přebytek antigenu. Téměř ve všech případech je koncentrace zvýšeného lehkého řetězce ještě nad uvedeným rozmezím normálních hodnot (3,30-19,40mg/L pro volný kappa a 5,7126,30mg/L pro volný lambda) a/nebo je koncentrace druhého lehkého řetězce pod uvedeným rozmezím a/nebo je poměr volného kappa ku volnému lambda mimo uvedené rozmezí (0,26-1,65). Proto by měl být každý vzorek s neočekávanou koncentrací volných lehkých řetězců nebo s poměrem volných řetězců kappa/lambda mimo udávaný rozsah znovu testován ve výchozím ředění a v ručně proveném předředění 1/100 (viz oddíl 8.6), aby byl zjištěn přebytek antigenu, pokud se vyskytla kterákoliv ze situací uvedených dále: a)

Opakujte výše uvedený postup pro kontrolu o vysoké koncentraci. 8.5

OMEZENÍ

KONTROLA JAKOSTI

Dodávané kontrolní vzorky musí být součástí každého běhu měření. Koncentrace volných řetězců kappa jsou uvedeny příbalovém listu (Produkt Data Sheet, SIN069.DS). Výsledky získané z běhu stanovení lze uznat pouze v případě, že výsledky kontrolních vzorků spadají do rozmezí uvedených hodnot ± 20%. Pokud jsou výsledky měření kontrol mimo rozsah a při stanovení byla použita uložená kalibrační křivka, je nutné provést novou kalibraci. Pokud jsou výsledky kontrol i s novou křivkou po rekalibraci mimo rozsah, je nutné zkontrolovat analyzátor a parametry, dříve než bude provedeno opakování testu. Pokud problém přetrvává, obraťte se na dodavatele.

11

OČEKÁVANÉ HODNOTY

Níže uvedené rozsahy hodnot byly získány při stanovení omezeného množství vzorků a mají pouze orientační charakter. Pokud je to možné, je důrazně doporučeno vytvořit si vlastní rozmezí hodnot. 11.1

Rozsahy normálních hodnot v séru dospělých

282 normálních jedinců ve věku od 20 do 90 let bylo testováno pomocí souprav Freelite pro BN™II* (11). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Prům. konc. (mg/L) 8,36 (mg/L) 13,4 (mg/L) Průměr 0,63

Normální hodnoty v séru dospělých Volné kappa řetězce Volné lambda řetězce Poměr kappa/lambda

Medián konc. (mg/L) 7,30 (mg/L) 12,40 (mg/L) Medián 0,60

Rozsah 95. percentilu 3,30 – 19,40 (mg/L) 5,71 – 26,30 (mg/L) Celkový rozsah 0,26 – 1,65

Abychom prokázali rovnocennost rozsahu normálních hodnot naměřených na BNII a na analyzátoru Beckman AU, stanovili jsme tyto údaje u 100 normálních vzorků zdravých britských dárců krve ve věku od 20 do 60 let a u 61 pacientů s různými diagnózami, a to použitím soupravy Freelite pro BNII i pro Beckman AU. Výsledky regresních analýz byly následující: stanovení volných řetězců kappa: y=0,95x + 21,18mg/L, r=0,95, stanovení volných lambda řetězců: y=0,88x + 11,75mg/L, r=0,99 (y = údaj z přístroje Beckman AU, x = údaj z BNII). Tyto výsledky dokládají skutečnost, že stanovení na analyzátoru Beckman AU je platné i pro rozsáhlý soubor dat získaných na Mayo Clinic. * BN™II je registrovaná ochranná známka firmy Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.

11.2 Rozsahy normálních hodnot v moči dospělých Rozsahy koncentrací volných lehkých řetězců v moči byly měřeny u vzorků poskytnutých skupinou 66 zdravých dárců krve (5). Normální hodnoty Průměrná Rozsah Poměr κ/λ a rozsah SD v moči dospělých koncentrace 95. percentilu 95. percentilu 1,852 Volné kappa řetězce 5,40 (mg/L) 4,95 (mg/L) 0,39 –15,1(mg/L) Volné lambda řetězce 12

3,17 (mg/L)

3,30 (mg/L) 0,81 – 10,1(mg/L)

0,461-4,00

CHARAKTERISTIKY STANOVENÍ

Následující údaje byly získány měřením na přístroji Beckman AU400: 12.1 Přesnost v rámci běhu stanovení Byly analyzovány tři sérové přípravky o různých hladinách volných řetězců kappa Každá uvedená hodnota byla vypočítána z 10 měření provedených v rámci stejného běhu stanovení. Všechny koncentrace jsou uvedeny v mg/L. Průměr Var. koef.%


Sérum 1 22,05 1,97

Sérum 2 40,83 1,24

Sérum 3 153,26 1,89

12.2 Přesnost mezi běhy stanovení Tři sérové přípravky o různých hladinách volných řetězců kappa byly analyzovány ve deset nezávislých bězích stanovení za použití souprav pocházejících ze stejné šarže. Všechny koncentrace jsou uvedeny v mg/L. Průměr Var. koef.%

Sérum 1 22,23 5,78

Sérum 2 41,35 5,17

13.

Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ, Child JA and Bradwell AR (2004). Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Brit. J. Heamatol. 126, 348-354

Sérum 3 135,38 6,02

12.3 Linearita Linearita tohoto stanovení byla ověřena u vzorku séra ředěného geometrickou řadou. Při ředění vzorku 1/10 byla získána regresní křivka s následujícími parametry: y = 0,98x + 1,68 (mg/L), r = 1,00 (y = měřená koncentrace volných řetězců kappa, x = teoretická koncentrace). 12.4 Interference U kontrolního séra o koncentraci volných kappa řetězců 53mg/L v ředění 1/10 byla prokázána minimální interference s bilirubinem o koncentraci 200 mg/L (-4,8%), s hemoglobinem o koncentraci 1g/L (5,9%) a chylem (turbidita 1930 jednotek formazinu) (10,7%). 12.5 Srovnání Séra: 54 sér (10 normálních, 44 pacientských s diagnózou mnohočetného myelomu nebo amyloidózy) bylo stanoveno soupravami Freelite BNII pro volné kappa a lambda řetězce a použitím tří komerčně dostupných souprav pro imunofixační elektroforézu (IFE). Klinické vzorky byly testovány v hlavním nezávislém referenčním centru v USA. Výsledky Freelite Výsledky Volné Volné Poměr IFE Souhrn kappa lambda volných κ/λ Normální séra 10 normální 10 normální 9 normální 10 normální 10 normální (10) 1 na horní hranici Séra pacientů s 24 vysoké 12 normální 24 vysoký 24 monoklon. 19-24* vykazuje myelomem/ 12 nízké kappa monoklon. amyloidózou (24) proužek Séra pacientů s 10 normální 15 vysoké 20 nízký 20 monoklon. 12-14* vykazuje myelomem/ 10 nízké 5 normální lambda monoklon. amyloidózou (20) proužek *V závislosti na metodě. Všechny abnormální koncentrace lehkých řetězců byly - narozdíl od méně citlivých metod IFE - stanovením Freelite detegovány. Moči: 28 vzorků moči (9 normálních, 19 získaných od pacientů s diagnostikovaným / suspektním myelomem) bylo stanoveno soupravami Freelite BNII pro volné kappa a lambda řetězce a použitím komerčně dostupných souprav pro imunofixační elektroforézu (IFE). Volné kappa Normální 8 normální moči (10) 2 na horní hranici Moči pacientů s 9 vysoké myelomem kappa (9) Moči pacientů 7 vysoké s myelomem 3 normální lambda (10)

Výsledky Freelite Volné Poměr lambda volných κ/λ 5 normální 9 normální 5 na horní 1 na horní hranici hranici 3 vysoké 8 vysoký 6 na horní 1 normální hranici 10 vysoké 10 nízký

Souhrn 10 normální

Výsledky IFE 10 normální

9 monoklon. kappa

9 vykazuje monoklon. proužek (ky) 10 monoklon. 10 vykazuje lambda monoklon. proužek

Všechny abnormální koncentrace lehkých řetězců v moči byly detegovány oběma metodami. 12.6 Klinické studie Klinické studie využívající soupravy Freelite firmy The Binding Site ukázaly, že zvýšené koncentrace volných lehkých řetězců mohou být u mnohočetného myelomu a SLE hodnověrně stanoveny s daleko větší citlivostí, než poskytují běžné IFE metody (5). Další studie prokázaly prospěšnost stanovení pomocí Freelite souprav v diagnostice a monitorování nesekrečního myelomu (4). 13 1.

2. 3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

LITERATURA Cole PW, Durie BGM, Salmon SE. (1978) Immunoquantitation of free light chain immunoglobulins: Application in multiple myeloma. J. Immunol. Meth. 19, 341349. Pescali E, Pezozoli A. (1988) The clinical spectrum of pure Bence-Jones proteinuria. Cancer 61, 2408-2415. Solling K, Solling J, Romer FK. (1981) Free light chains of immunoglobulins in serum from patients with rheumatoid arthritis, sarcoidosis, chronic infections and pulmonary cancer. Acta. Med. Scand. 209, 473-477. Drayson M, Tang LX, Drew R, Mead GP, Carr-Smith H and Bradwell AR. (2001). Serum free light chain measurements for identifying and monitoring patients with non-secretory myeloma. Blood 97, 2900-2902. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, Showell PJ, Drayson MT and Drew R (2001). Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light chains in serum and urine. Clin. Chem. 47, 673-680. Tang LX, Showell P, Carr-Smith HD, Mead GP, Drew R and Bradwell AR (2000). Evaluation of F(ab‟)2-based latex-enhanced nephelometric reagents for free immunoglobulin light chains on the Behring Nephelometer™ II. Clin. Chem 46:6, Suppl. 2000, 705, pA181. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Harvey TC and Drayson MT. (2003) Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma. Lancet 361, 489-491. Abraham RS, Katzman JA, Clark RJ, Bradwell AR, Kyle RA and Gertz MA (2003). Quantitative Analysis of Serum Free Light Chains: A new marker for the diagnostic evaluation of primary systemic amyloidosis. Aam. J. Clin. Pathol. 119, 274 – 278 Lachmenn HJ, Gallimore JR, Gillmore JD, Carr-Smith HD, Bradwell AR, Pepys MB and Hawkins PN (2003). Outcome in systemic AL amyloidosis in relation to changes in concentration of circulating immunoglobulin free light chains following chemotherapy. Brit. J. Haem. 122, 78-84 Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP and Drayson MT (2002) Serum free light chain immunoassays and their clinical application. Clinical and Applied Immunology Reviews 3, 17 – 33. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp JF, Bradwell, AR and Kyle RA. (2002) Serum and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin. Chem. 48, 1437-1444. Bradwell AR (2009). Serum Free Light Chain Analysis, 5 th Edition, Publ. The Binding Site Ltd, Birmingham, UK.


Freelite Human Kappa Free Kit for use on the Beckman AU series. For in-vitro diagnostic use Product Code: LK016.AU 1 CONTENTS. Page no

Recommend Documents