1
EFEK FARMAKOLOGI EKSTRAK ETANOL DAUN SINGAWALANG (Petiveria alliaceae) PADA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAIN H37RV Nurmawati Fatimah (Departemen Farmakologi FK Unair) ABSTRACT Tuberculosis was known bacterial diseases caused infection acute and or chronic perform on adult human lung. Singawalang leaves were predicted can be using as an antibacterial like effect. The research aim was to explored pharmacologic effect of extract singkawang leaves after extracted by ethanol. Result research appeared that crude ethanol extract of singkawang leaves was significantly can be used against to bacterial caused Tuberculosis diseases (Mycobacterium tuberculosis). Keywords: Herbal medicine, in vitro test, Mycobacterium tuberculosis, Lung diseases PENDAHULUAN Tuberkulosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis dan menjadi salah satu penyakit menular yang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat di dunia maupun di Indonesia. Angka prevalensi tuberkulosis pada tahun 2008 di negara-negara ASEAN berkisar antara 27 sampai 680 kasus per 100.000 penduduk. Indonesia saat ini berada pada ranking kelima dengan beban TB tertinggi didunia. Estimasi prevalensi TB semua kasus adalah sebesar 660.000 (WHO, 2010b) dan estimasi insidensi berjumlah 430.000 kasus baru per tahun. Jumlah kematian akibat TB diperkirakan 61.000 kematian per tahunnya (Kementerian Kesehatan RI, 2011).Tingginya angka kasus baru dan kematian yang terjadi, menjadikan tuberkulosis sebagai masalah kesehatan yang segera harus diatasi (WHO,2010a). Resistensi antibiotik merupakan masalah mendasar yang harus di tangani, Agen antimikroba dengan mekanisme baru yang berasal dari bahan sintetis atau alami akan menjadi alternatif lain. Bahan alami memberikan target dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan penyebaran resistensi antibiotik (Rieder et al., 2010). Salah satu kebijakan WHO adalah mendukung pengembangan tanaman obat dan jika memungkinkan sampai dapat ditemukan obat baru untuk mengatasi masalah infeksi tersebut (Gitawati R dkk.,2005). Berbagai percobaan juga telah dilakukan terhadap Mycobacterium tuberculosis misalnya daun waru dan pegagan memiliki daya hambat terhadap bakteri tersebut meskipun belum diketahui pasti mekanismenya (Gitawati R dkk.,2005;Zulhipri,2005). Singawalang (Petiveria alliaceae) merupakan salah satu tumbuhan yang telah diteliti memiliki aktivitas sebagai anti fungi dan anti
2
bakteri Staphylococcus aureus sehingga menumbuhkan harapan bahwa tanaman tersebut juga mampu menghambat pertumbuhan bakteri spesifik seperti Mycobacterium tuberculosis (Kim et al.,2006). Ekstrak daun singawalang mengandung senyawa organik benzyl-thiosulfinate yang mempunyai fungsi menghambat pertumbuhan bakteri Mycobacterium smegmatis dengan jalan mengganggu pembentukan dinding sel sehingga terjadi lisis dinding sel (Ayodele et al.,2000). Ekstrak daun singawalang telah dilaporkan dapat menghambat pertumbuhan kuman Mycobacterium tuberculosis pada media LJ (Arifa dkk.,2008). METODE Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik. Rancangan penelitian adalah post test only control group design. Jumlah perlakuan yang di gunakan dalam penelitian ini 5 buah termasuk kontrol, yaitu kontrol, perlakuan dengan DMSO dan perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25mg/ml; 0,5mg/ml; 1mg/ml; ), pengulangan setiap kelompok adalah 6 kali. Daun singawalang diperoleh dari Balai Materia Medika Batu, determinasi bahan dilakukan di Balai Materia Medika. Ekstraksi daun singawalang dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. DMSO di dapatkan dari Lembaga Penyakit Tropik (LPT) Universitas Airlangga. Bakteri uji yang merupakan sampel pada penelitian ini adalah Mycobacterium tuberculosis strain H37RV yang di peroleh dari Lembaga Penyakit Tropis (LPT) Universitas Airlangga di ambil dari koloni pada media perbenihan secara acak. Kepekaan Mycobacterium tuberculosis strain H37RV pada setiap level konsentrasi yang di indikasikan dengan jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh pada media middlebrook 7H10. Ekstrak etanol daun singawalang adalah penyarian daun singawalang dengan menggunakan etanol. Proses penyarian dilakukan sesuai dengan prosedur pada Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Unair. Daya hambat terhadap Mycobacterium tuberculosis merupakan kepekaan Mycobacterium tuberculosis strain H37RV yang berasal dari LPT (Lembaga Penyakit Tropis) Universitas Airlangga. Jumlah koloni bakteri yang ditanam adalah 105. Penilaian daya hambat ditentukan dengan ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri, di lanjutkan dengan menghitung jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis pada media middlebrook 7H10 pada setiap dosis ekstrak etanol daun singawalang setelah inkubasi selama 8 minggu pada suhu 370C di dalam inkubator CO2. Data yang di perlukan dalam penelitian ini adalah jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media 7H10 pada berbagai konsentrasi ekstrak etanol daun singawalang. Prosedur pengumpulan data untuk mengetahui ada tidaknya pertumbuhan koloni bakteri pada media di lakukan dengan mengacu pada metode dilusi ( Baron et al.,1994). DISKUSI DAN KESIMPULAN Data hasil penelitian eksperimental tentang efek bakterisid ekstrak etanol daun singawalang (Petiveria alliaceae) pada mycobacterium tuberculosis strain H37RV
3
yang di amati selama 8 minggu, kemudian dikumpulkan dan diolah sesuai dengan tujuan dan hipotesis penelitian yang telah dibuat. Data ini merupakan jumlah Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV yang tumbuh dalam media middlebrook 7H10 dengan berbagai dosis ekstrak etanol daun singawalang (Petiveria alliaceae). Penelitian yang dilakukan diawali dengan penanaman Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV dan berbagai dosis ekstrak etanol daun singawalang pada media cair middlebrook 7H9, selanjutnya diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 3 hari. Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV dan berbagai dosis ekstrak etanol daun singawalang pada media cair 7H9 yang telah di inkubasi selama 3 hari dalam inkubator CO2, di ambil 10µl, diinokulasikan pada media padat 7H10 lalu di ratakan dengan ose. Uji aktivitas ekstrak etanol daun singawalang dilakukan pada media padat 7H10 dengan bakteri uji Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV. Hasil uji kuantitatif di nyatakan dengan jumlah koloni yang dihitung pada minggu ke 8. Jumlah Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV yang tumbuh pada media padat 7H10 ditunjukkan pada Tabel 3.1, gambar pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV kontrol positif dapat dilihat pada gambar 3.2. Tabel 3.1 Jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV. Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV Plate keI II III IV V VI Kontrol 6 4 4 4 6 4 positif Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada kontrol positif dinyatakan dengan jumlah bakteri yang tumbuh pada media middlebrook 7H10. Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan kontrol negatif dengan DMSO yang juga dinyatakan dengan jumlah bakteri yang tumbuh pada media middlebrook 7H10 ditunjukkan pada Tabel 3.2, gambar pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV perlakuan dengan DMSO dapat dilihat pada gambar 3.2 Tabel 3.2 Jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV terhadap perlakuan kontrol positif dan kontrol negatif perlakuan dengan DMSO
Plate keKontrol positif DMSO
Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV I II III IV V 6 4 4 4 6 4
1
4
4
4
VI 4 4
4
Gambar 3.1 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV kontrol positif. Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada kontrol positif dinyatakan dengan jumlah bakteri yang tumbuh pada media middlebrook 7H10 dan pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml) yang dinyatakan dalam jumlah bakteri
5
yang tumbuh pada media middlebrook 7H10 ditunjukkan pada Tabel 3.3, dan gambar pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml) dapa dilihat pada gambar 3.3 sampai gambar 3.5, pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV didapatkan pada minggu ke-8 masa inkubasi dalam inkubator CO2.
Gambar 3.2 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan kontrol negatif dengan DMSO.
6
Tabel 3.3 Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV terhadap perlakuan kontrol positif, kontrol negatif dan perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis. Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV plate keKontrol positif
I 6
II 4
III 4
IV 4
V 6
VI 4
DMSO
4
1
4
4
4
4
ekstrak etanol daun singawalang 0,25mg/ml ekstrak etanol daun singawalang 0,5mg/ml ekstrak etanol daun singawalang 1mg/ml
2
3
1
3
3
3
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
ditunjukkan dengan pertumbuhan jumlah pertumbuhan koloni bakteri uji. Pada kelompok kontrol positif jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV lebih banyak dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml). Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,25 mg/ml jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada keenam plate media middlebrook 7H10 menunjukkan jumlah yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,5 mg/ml jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada keenam plate media middlebrook 7H10 menunjukkan jumlah yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 1 mg/ml jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada keenam plate media middlebrook 7H10 menunjukkan jumlah yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok kontrol. Jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada kelompok dengan pemberian DMSO lebih banyak dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml
7
Gambar
3.3 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,25 mg/ml.
8
Gambar 3.4 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,5 mg/ml.
9
Gambar 3.5 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 1 mg/ml. Hasil uji daya hambat ekstrak etanol daun singawalang terhadap bakteri Mycobacterium tuberculosis yang telah dilakukan menunjukkan bahwa tumbuhan tersebut mempunyai khasiat menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis. Hal ini dapat diketahui dari berkurangnya jumlah koloni bakteri yang tumbuh dari dosis terendah 0,25mg/ml sampai 1mg/ml media. Pada dosis ekstrak etanol daun singawalang 0,25 mg/ml media; 0,5 mg/ml media dan dosis 1 mg/ml media didapatkan pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis masing masing plate 1 koloni adaya hambatan pertumbuhan bakteri Mycobacterium
10
tuberculosis juga tampak pada kontrol dan perlakuan dengan pemberian DMSO, pertumbuhan bakteri Mycobacterium tuberculosis di mulai pada minggu ke-4 dan bertambah banyak pada minggu ke-8. Hal ini menunjukkan bahwa hambatan pertumbuhan kuman pada media oleh ekstrak etanol daun singawalang merupakan efek dari bahan aktif yang terkandung didalamnya bukan karena kesalahan prosedur atau kuman yang tidak virulent. Senyawa benzil thiosulfinates relatif paling kuat aktivitas antibakterinya, senyawa ini di laporkan memiliki aktivitas mengurangi fluiditas dari membran, juga dilaporkan memiliki aktivitas inhibisi terhadap sintesis makromolekul antara lain DNA, RNA, dinding sel dan protein (Kim et al,2006;Benevides et al.,2001; Musser,1995). Petiveria alliaceae mengandung senyawa benzyl-thiosulfinate yang mempunyai fungsi menghambat pertumbuhan bakteri Mycobacterium smegmatis dengan jalan mengganggu pembentukan dinding sel sehingga terjadi lisis dinding sel (Ayodele et al,2000). Berbagai macam zat tersebut yang diduga kuat mempunyai khasiat sebagai antibakteri adalah senyawa yang mengandung gugus sulfur seperti: benzyl thiosulfinat, benzyl trislfid dan benzyl sulfinic acid (Kim S et al,2005). Secara umum didalam tumbuhan singawalang juga mengandung berbagai senyawa organik yang mengandung belerang. Banyak diantaranya berupa senyawa atsiri berasa tajam atau berbau tidak enak sehingga adanya senyawa tersebut mudah diketahui ketika ekstraksi dan isolasi. Golongan dari senyawa tersebut yang penting adalah pertama golongan glukosinolat dari Cruciferae, kedua disulfida organik dari allium dan golongan ketiga adalah tiofen asetilenik. Senyawa golongan glukosinolat pada berberapa tumbuhan diketahui berfungsi sebagai antibakteri (Yan ping et al,2002). Senyawa lain yang diduga berkhasiat sebagai antibakteri adalah senyawa golongan fenol. Pada beberapa tumbuhan senyawa fenol dan derivatnya berfungsi sebagai antibakteri dengan cara menurunkan tegangan permukaan sel dan denaturasi protein walaupun demikian khasiat senyawa fenol pada tumbuhan lain bisa berbagai macam, misalnya sebagai antioksidan (Manna C,1997). Daun singawalang mengandung berbagai senyawa dari golongan polifenol yang juga ternasuk dalam golongan senyawa fenol. Jenis dan jumlah senyawa tersebut di dalam ekstrak etanol daun singawalang belum diketahui dengan pasti demikian juga dengan fungsi dan khasiatnya. Daun singawalang juga mengandung senyawa golongan triterpenoid. Pada beberapa tumbuhan senyawa golongan ini berfungsi sebagai antibakteri dengan melunakkan sel membran bakteri yang mengakibatkan hancurnya dinding sel seperti pada triterpene asiaticoside ( Gitawati,2005). Tetapi perlu diingat juga bahwa senyawa golongan triterpenoid juga bisa memiliki berbagai khasiat seperti Phylanthus niruri merupakan salah satu tumbuhan yang mengandung senyawa golongan terpenoid dan berkhasiat sebagai antibakteri (Manna et al,1997). Senyawa golongan ini juga ditemukan pada tumbuhan Eunicea pinta yang berkhasiat sebagai antikanker dan antimikroba (Yan ping et al,2002). Khasiat antikanker senyawa golongan terpenoid juga berhasil diidentifikasi pada tumbuhan Emilia Soncheifolia (Shylish,2005). Khusus senyawa triterpenoid baik jenis, jumlah maupun kahsiatnya masih perlu penelitian lebih lanjut.
11
Melihat banyaknya kandungan senyawa kimia tumbuhan singawalang, maka daya hambat ekstrak etanol daun singawalang terhadap bakteri Mycobacterium tuberculosis pada penelitian ini diduga merupakan hasil kerja kombinasi dari berbagai macam senyawa yang terkandung didalam daun tersebut, seperti yang terjadi pada terapi tuberkulosis saat ini. Manajemen terapi tuberkulosis yang digunakan saat ini tidak menggunakan monoterapi tetapi merupakan kombinasi dari berbagai macam obat dengan mekanisme kerja yang berbeda. Tujuan dari kombinasi ini adalah untuk memperpendek lama terapi, meningkatkan potensi, menurunkan efek samping dan mencegah terjadinya resistensi. Antituberkulosis yang digunakan antara lain isoniazid mempunyai cara kerja dengan menghambat sintesa asam mikolat sehingga pembentukan dinding sel bakteri terganggu, rifampisin dengan menghambat transkripsi gen , pirazinamid menyebabkan rusaknya membran plasma dan etambutol menghambat pembentukan dinding sel, kemungkinan ekstrak etanol daun singawalang mengandung lebih dari satu macam antibakteri dengan mekanisme kerja yang berbeda. Tetapi tidak menutup kemungkinan bahwa senyawa antibakteri hanya tunggal sedangkan senyawa lainnya merupakan bahan untuk meningkatkan aktifitas senyawa antibakteri. Pada penelitian ini belum dapat diidentifikasi senyawa yang mempunyai khasiat sebagai anti bakteri. Sehingga perlu dilakukan penelitian untuk identifikasi senyawa dan isolasi. Dari berbagai isolat tersebut dilakukan uji aktivitas terhadap bakteri tuberkulosis. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar untuk menemukan antibiotika baru terutama antibiotika terhadap M. Tuberculosis yang sudah resisten terhadap antibiotika yang sudah ada. Hasil penelitian yang didapat menunjukkan bahwa terjadi penurunan jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang berbagai dosis dibandingkan dengan perlakuan dengan DMSO. Pada penelitian analisis kimia yang telah dilakukan dalam proyek penelitian yang melibatkan berbagai disiplin ilmu di Haiti, Republik Dominika diketahui bahwa tanaman singawalang mengandung senyawa triterpenes jenis isoarbinol, asetat, cinnamate isoarbinol, dan coumarin. Akar dan daunnya mengandung bahan jadian sulfur, benzthydroxyethyltrisulfide, tritiolaniacine, benzenic, bensaldehide, dan benzoid acid, yang mempunyai khasiat anti bakteri (Benevides et al,2001). Diketahui bahwa senyawa benzil thiosulfinates relatif paling kuat aktivitas antibakterinya, senyawa ini di laporkan memiliki aktivitas mengurangi fluiditas dari membran, juga dilaporkan memiliki aktivitas inhibisi terhadap sintesis makromolekul antara lain DNA, RNA, dinding sel dan protein (Kim et al,2006;Benevides et al.,2001; Musser,1995). Berdasarkan hasil analisis dan pembahasan dapat disimpulkan sebagai berikut. Profil pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada perlakuan kontrol , perlakuan dengan DMSO dan perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml) berbeda dalam jumlah koloni bakteri yang tumbuh. Jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV terbanyak terdapat pada perlakuan kontrol dan berkurang jumlah koloni kuman pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,25 mg/ml keatas. Tidak terdapat pengaruh antara dosis ekstrak etanol daun singawalang dengan pertumbuhan koloni
12
Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV, Masih belum di peroleh dosis yang bersifat bakterisid. Saran dari hasil penelitian adalah perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang kandungan bahan aktif serta kadar selanjutnya dapat dilakukan isolasi. Dari hasil isolasi perlu dilakukan uji ulang daya hambat terhadap berbagai bakteri DAFTAR PUSTAKA Aditama TY, 2006. XDR-TB. Jurnal Tuberkulosis Indonesia Vol. 3 (2). 20-23. Anekaplantasia, 2008. Singawalang. Si tangguh melawan TBC. http:// aneka planta. Wordpress.com, dilihat 15 Januari 2012. Arifa,M.,Roostantia,I.,Nurmawati,F.,2008.Laporan Penelitian Unit Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (UPPM),FK Unair. Daya hambat Ekstrak singawalang terhadap Mycobacterium tuberculosis.Surabaya.hal.33. Ayodele, E.T., Hudson, H.R., Ojo, I.A.O., Pianka, M., 2000. Organosulfur compounds as potential fungicides: the preparation and properties of some substituted benzyl 2-hydroxyethyl oligosulfides. Phosphorus Sulfur Silicon and Related Elements 159, 123–142. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2007a. Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis. Diakses dari: http://www.tbindonesia.or.id/pdf/BPN_2007.pdf.Tanggal 22 Januari 2012. Gitawati R, Astuti Y, Winarno W, 2005. Herba pegagan (Centella asiatica L.): Studi pendahuluan efek anti mikobakterium secara invitro. Jurnal bahan Alam Indonesia vol.4 (2). 286-91. Katzung BG, 2009. Basic and Clinical Pharmacology, 11th Ed. The McGraw-Hill companies, Inc. The United States of America. Kementerian Kesehatan, 2011.Strategi Nasional Pengendalian TB di Indonesia: 2011- 2014. , Kementerian Kesehatan: Jakarta, Indonesia. Kim S, Kubec R, Musah RA, 2006.Antibacterial and anti fungal activity of sulfur containing compound from petiveria alliaceae.J. Ethnopharmacology 104 (12): 188-92. Kritszki A, 2007.Tuberkulosis in Adult in Tuberculosis 2007, 1st Ed. Editor Palomino JI,Leaeo SC, Ritacco V. 487-500. Kubec, R., Kim, S., Musah, R.A., 2003. The lachrymatory principle of Petiveria alliaceae. Phytochemistry 63, 37–40.
13
Macek K, 2005. Pharmaceutical application of thin layer and paper chromatograph.3rd ed. New York: Elsivier Publishing Co.p.505-7. Pramono E,2002. The commercial use of traditional knowledge and medicinal plants Indonesia. Submitted for multi-stakeholder dialogue on trade, intellectual property and biological resources in Asia. Salman MT, Khan RA, Sukha, I, 2008. Invitro anti microbial sensitivity of Nigella sativa oil against multi drug resistant bactery. http:// openmed. Nic.in/2916/01/unimed_oil.pdf ( 5 Juli 2011). Setiawati, W.Murtiningsih,R. Gunaeni,N. dan Rubiati, T.2008.Tumbuhan Bahan Pestisida Nabati dan Cara Pembuatannya untuk Pengendalian Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPT), Balai Penelitian Tanaman Sayuran. WHO,2010b. The global plan to stop TB 2011-2015: transforming the fight towards elimination of tuberculosis.Geneva,Switzerland. WHO, 2009. Global Tuberculosis Control. Geneva, Switzerland.
