EFEK ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL 70% DAUN SALAM (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) PADA SERUM DARAH TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR YANG DIINDUKSI KARBON TETRAKLORIDA (CCl4) SKRIPSI
Oleh :
RONY INDRAYANA K 100 040 234
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2008
EFEK ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL 70% DAUN SALAM (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) PADA SERUM DARAH TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR YANG DIINDUKSI KARBON TETRAKLORIDA (CCl4)
SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat mencapai Derajat Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta di Surakarta
Oleh: RONY INDRAYANA K 100040234
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2008
i
PENGESAHAN SKRIPSI
Berjudul : EFEK ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL 70% DAUN SALAM (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) PADA SERUM DARAH TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR YANG DIINDUKSI KARBON TETRAKLORIDA (CCl4)
Oleh : RONY INDRAYANA K 100 040 234 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Pada tanggal : Juli 2008 Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Dekan,
Dra. Nurul Mutmainah, M.Si., Apt.
Pembimbing Utama,
Pembimbing Pendamping,
Nurcahyanti W, M. Biomed., Apt.
Rima Munawaroh, S.Si., Apt.
Penguji : 1. 2. 3. 4.
dr. Em Sutrisna, M. Kes. Wahyu Utami, M.Si., Apt. Nurcahyanti W, M. Biomed., Apt. Rima Munawaroh, S.Si., Apt.
____________ ___________ ____________ ___________ ii
PERSEMBAHAN
Dengan menyebut nama Allah Yang Maha Pemurah lagi Maha Penyayang Bukankah Kami telah melapangkan dadamu? Dan Kami telah menghilangkan bebanmu Yang memberatkan punggungmu Dan Kami tinggikan derajatmu Karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan Maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), kerjakanlah urusan yang lain dengan sungguh-sungguh Dan kepada Tuhanmulah hendaknya kamu berharap. (QS. Al-Insyirah : 1-8)
Sebuah persembahan terindah untuk: Ibu dan Bapak tercinta Sebagai ungkapan rasa terimakasih dan sembah baktiku untukmu Sahabat terkasihku.................. Terimakasih, lewat lisanmu kau t’lah sampaikan do’a untuk keberhasilanku Sahabat-sahabatku.................. Terimakasih, kalian t’lah menjadi teman di saat senang dan susahku Alamamater UMS Semoga Allah membalas kebaikanmu dengan Ridlo-Nya
iii
DEKLARASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surakarta,
Juli 2008
Peneliti
( Rony Indrayana )
iv
KATA PENGANTAR
Assalaamu’alaikum wr. wb. Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT Yang Maha Bijaksana atas rahmat dan hidayah-Nya berupa kemampuan berfikir serta kekuatan bekerja sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) pada Serum Darah Tikus Putih Jantan Galur Wistar yang Diinduksi Karbon Tetraklorida (CCl4). Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Keberhasilan dalam penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan serta bantuan semua pihak. Pada kesempatan ini, penulis dengan penuh rasa hormat ingin mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah ikut membantu jalannya penelitian. 1. Dra. Nurul Mutmainah, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. 2. Nurcahyanti Wahyuningtyas, M.Biomed., Apt., selaku dosen pembimbing utama, atas keikhlasan dan kesabaran dalam membimbing, dorongan semangat serta nasehatnya. 3. Rima Munawaroh, S.Si., Apt., selaku dosen pembimbing pendamping, atas kesabaran, bantuan, dan arahan yang telah diberikan selama ini. 4. dr. Em Sutrisna, M.Kes., selaku dosen penguji I, atas kesabaran, bantuan, dan arahan yang telah diberikan selama ini.
v
5. Wahyu Utami, M.Si., Apt., selaku dosen penguji II, atas kesabaran, bantuan, dan arahan yang telah diberikan selama ini 6. Para dosen dan staf karyawan Fakultas Farmasi UMS, atas kerjasama selama penelitian. 7. Bapak dan Ibu yang telah membiayai dan selalu mendoakan penulis sampai sekarang ini. 8. Handoko dan Wijayanti yang selalu menjadi teman seperjuangan dalam penelitian ini. 9. Sahabat-sahabatku tercinta yang telah mau menampungku di rumah kontrakan “Embrio”, Jamal, Arek, Fajri, Bang Pandi, Ucup, Gloyor, Mochin, Kesit Topan, Gedang, Asep serta para pengunjung “Embrio”, Fay, Bledug, Enthong, Rinta, Mey, Putri dan semua teman-teman yang tidak bisa disebutkan semuanya, terima kasih telah memberikan semangat dan dukungan sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Penulis berusaha melakukan yang terbaik dalam penyusunan skripsi ini namun sebagai manusia tidak lepas dari kekurangan. Karena itu, penulis mohon maaf atas segala kekurangan yang ada. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi pembaca khususnya mahasiswa dan dapat dikembangkan secara luas kepada masyarakat. Wassalamu’alaikum wr. wb.
Surakarta, Juli 2008 Penulis
(Rony Indrayana)
vi
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL............................................................................................ i HALAMAN PENGESAHAN............................................................................. ii HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ iii HALAMAN DEKLARASI................................................................................ iv KATA PENGANTAR ........................................................................................ v DAFTAR ISI ..................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x DAFTAR TABEL .............................................................................................. xi DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xii INTISARI......................................................................................................... xiii BAB I.
PENDAHULUAN ............................................................................... 1 A. Latar Belakang Masalah ................................................................ 1 B. Perumusan Masalah ...................................................................... 4 C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 4 D. Tinjauan Pustaka ........................................................................... 4 1. Tanaman Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) ....... 4 2. Radikal bebas .......................................................................... 6 3. Karbon tetraklorida ................................................................. 8 4. Antioksidan ........................................................................... 11 5. Ekstraksi ................................................................................ 15
vii
E. Keterangan Empiris ..................................................................... 18 BAB II. METODE PENELITIAN .................................................................. 19 A. Rancangan Penelitian .................................................................. 19 B. Definisi Operasional Penelitian................................................... 19 C. Bahan dan Alat ............................................................................ 20 1. Bahan-bahan yang digunakan ............................................... 20 2. Alat-alat yang digunakan ...................................................... 20 D. Jalannya Penelitian ...................................................................... 21 1. Determinasi tanaman salam .................................................. 21 2. Penyiapan bahan ................................................................... 21 3. Pembuatan ekstrak daun salam ............................................. 21 4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol daun salam ..................... 22 5. Penetapan dosis karbon tetraklorida ..................................... 22 6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) 11,2 % (v/v). 22 7. Perhitungan dosis ekstrak daun salam .................................. 22 8. Penelitian pendahuluan ......................................................... 23 9. Perlakuan hewan uji .............................................................. 27 10. Pembuatan serum .................................................................. 29 11. Penetapan kadar MDA .......................................................... 29 12. Pengukuran kadar MDA ....................................................... 29 E. Cara Analisis…………………………………………………….31 BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 32 A. Determinasi Tanaman Salam ...................................................... 32
viii
B. Hasil Uji Pendahuluan................................................................. 32 C. Hasil Uji Antioksidan Ekstrak 70% Etanol Daun Salam ........... 35 BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 49 A. Kesimpulan ................................................................................. 49 B. Saran ............................................................................................ 49 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 50 LAMPIRAN ...................................................................................................... 54
ix
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Mekanisme Peroksidasi PUFA....................................................... 10 Gambar 2. Mekanisme Reaksi Antara TBA dan MDA ................................... 11 Gambar 3. Skema Pembuatan Ekstrak etanol 70% Daun Salam .................... 22 Gambar 4. Skema Orientasi Waktu Pemberian Toksik ................................... 25 Gambar 5. Skema Orientasi Waktu Optimal Pemberian Ekstrak Etanol 70% Daun Salam .................................................................................... 26 Gambar 6. Skema Uji Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) Dosis Tunggal pada Tikus Putih Jantan .......................................................................... 28 Gambar 7. Skema Uji Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) Dosis Berulang pada Tikus Putih Jantan .......................................................................... 29 Gambar 8. Grafik Data Kadar MDA Darah pada Model Toksik ..................... 33 Gambar 9. Grafik Selisih Kadar MDA Setelah Pemberian Ekstrak Dosis Tunggal dan Dosis Berulang pada Setiap Kelompok..................... 40
x
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Kurva Baku MDA ............................................................................. 30 Tabel 2. Data Optimasi Waktu Pemberian Ekstrak 1,25 g/KgBB................... 34 Tabel 3. Data Penurunan Kadar MDA pada Serum Darah Tikus Setelah Perlakuan dengan Dosis Tunggal ...................................................... 38 Tabel 4. Data Penurunan Kadar MDA pada Serum Darah Tikus Setelah Perlakuan dengan Dosis Berulang ..................................................... 39 Tabel 5. Hasil Uji Mann-Whitney Data Selisih Kadar MDA .......................... 42 Tabel 6. Persentase Penurunan Kadar MDA Setelah Diberi Ekstrak Dosis Tunggal .............................................................................................. 45 Tabel 7. Persentase Penurunan Kadar MDA Setelah Diberi Ekstrak Dosis Berulang ............................................................................................ 46 Tabel 8. Hasil Uji Statistik Data Persentase Penurunan Kadar MDA ............. 47
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Surat Keterangan Tikus Putih Jantan Galur Wistar ..................... 54 Lampiran 2. Surat Keterangan Hasil Determinasi Tanaman Salam (Syzygium polyanthum [Wight] Walp.) ......................................................... 55 Lampiran 3. Volume Pemberian Sediaan Uji ................................................... 58 Lampiran 4. Perhitungan Kadar MDA ............................................................. 60 Lampiran 5. Hasil Uji Pendahuluan.................................................................. 63 Lampiran 6. Data Kurva Baku ........................................................................... 64 Lampiran 7. Analisis Data Optimasi Waktu Pembentukan Toksik .................. 72 Lampiran 8. Uji Distribusi Normal dan Homogenitas Data Kadar MDA pada Optimasi Pemberian Ekstrak ........................................................ 73 Lampiran 9. Uji One Way Anava Data Kadar MDA pada Optimasi Pemberian Ekstrak Hasil Transformasi dalam Bentuk Log.................... ........ 74 Lampiran 10. Uji Distribusi Normal Data Kadar MDA dan Kuadrat Kadar MDA Dosis Tunggal dan Dosis Berulang........ ...................................... 75 Lampiran 11. Uji Kruskal-Wallis dan Mann-Whitney Data Kadar MDA Dosis Tunggal dan Dosis Berulang Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70 % Daun Salam ......................................................................... 76 Lampiran 12. Hasil Uji Statistik Data Persentase Penurunan Kadar MDA ....... 84 Lampiran 13. Gambar Tanaman Salam (Syzygium polyanthum [Wight] Walp.) 86
xii
INTISARI Daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) mengandung flavonoid yang diduga dapat berefek sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antioksidan ekstrak etanol 70% daun salam pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida (CCl4). Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental semu dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah dengan menggunakan 35 ekor tikus putih jantan dibagi menjadi 7 kelompok. Kelompok I (kontrol normal) diberi paraffin cair p.o 25,0 ml/KgBB. Kelompok II (kontrol toksik) diberi karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) dengan volume pemberian 2,8 ml/KgBB p.o. Kelompok III (kontrol negatif) diberi CMC Na 0,5% p.o. Kelompok IV, V dan VI diberi ekstrak etanol 70% daun salam dengan variasi dosis berturut-turut 1,25 g/kgBB, 2,5 g/kgBB dan 5,0 g/kgBB secara peroral. Kelompok VII diberi perlakuan dengan ekstrak etanol 70% daun salam dosis 5,0 g/KgBB. Kelompok III-VI dibuat toksik dengan diinduksi karbon tetraklorida 2,8 ml/kgBB secara peroral bersamaan dengan pemberian masing-masing sediaan uji. Efek antioksidan diukur berdasar penurunan kadar malonaldehid (MDA) berupa penurunan absorbansi komplek MDA-TBA (thiobarbituric acid) yang dibaca pada panjang gelombang 520 nm. Hasil uji statistik Mann-Whitney dengan taraf kepercayaan 95% menunjukkan bahwa sediaan ekstrak etanol 70% daun salam dosis 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB pada pemberian dosis tunggal mempunyai efek antioksidan pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida dosis 2,8 ml/KgBB. Ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB, 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB pada pemberian dosis berulang juga memiliki efek antioksidan dengan besar yang sama (p > 0,05) pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida dosis 2,8 ml/KgBB. Kata kunci: daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.), karbon tetraklorida, malonaldehid
xiii
BAB 1 PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah Dunia kesehatan saat ini semakin menaruh perhatian terhadap radikal bebas. Hal ini dikarenakan semakin banyak bukti ilmiah yang mengindikasikan bahwa radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan DNA yang dapat menimbulkan berbagai penyakit seperti diabetes dan kanker. Kerusakan DNA ini juga menyebabkan gangguan sistem respon imun dan inflamasi jaringan (Desmarchelier et al, 2005). Radikal bebas merupakan molekul atau atom apa saja yang tidak stabil karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas ini berbahaya karena amat reaktif mencari pasangan elektronnya. Radikal bebas yang terbentuk dalam tubuh akan menghasilkan radikal bebas yang baru melalui reaksi berantai yang akhirnya jumlahnya terus bertambah. Selanjutnya menyerang sel-sel tubuh sehingga akan terjadi kerusakan jaringan (Sibuea, 2004). Tubuh secara terusmenerus membentuk radikal oksigen dan spesies reaktif lainnya, terutama dihasilkan oleh netrofil, makrofag dan sistem xantin oksidase (Khlifi et al, 2005). Radikal bebas ini dibentuk melalui mekanisme metabolisme normal (Desmarchelier et al, 2005). Senyawa radikal bebas tersebut timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernapas, metabolisme sel, olahraga yang berlebihan, peradangan atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan seperti asap kendaraan
1
2
bermotor, asap rokok, bahan pencemar, dan radiasi matahari atau radiasi kosmis (Karyadi, 1997). Makanan tertentu seperti makanan cepat saji (fastfood), makanan kemasan, makanan kalengan juga berpotensi meninggalkan racun dalam tubuh karena kandungan lemak, pengawet serta sumber radikal bebas (Sibuea, 2004). Tubuh memerlukan antioksidan yang dapat membantu melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak negatif senyawa ini. Vitamin C dan vitamin E telah digunakan secara luas sebagai antioksidan karena lebih aman dan efek samping yang ditimbulkan lebih kecil dibandingkan antioksidan sintetik. Antioksidan sintetik seperti BHA (butil hidroksi anisol) dan BHT (butil hidroksi toluen) memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan vitamin C dan vitamin E (Han et al., 2004), tetapi antioksidan sintesis ini dapat menimbulkan karsinogenesis (Kikuzaki et al., 2002). Antioksidan dari tumbuhan dapat menghalangi kerusakan oksidatif melalui reduksi dengan radikal bebas, membentuk kelat dengan senyawa logam katalitik, dan menangkap oksigen (Khlifi et al, 2005). Oleh karena itu diperlukan eksplorasi antioksidan alami untuk mendapatkan antioksidan dengan tingkat keamanan dan aktivitas yang tinggi. Daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) mengandung minyak atsiri (sitral dan eugenol), tanin dan flavonoid (Dalimartha, 2003).
Komponen
fenolik yang terdapat dalam tumbuhan memiliki kemampuan mereduksi yang berperan penting dalam menyerap dan menetralkan radikal bebas, dan dekomposisi peroksid (Javanmardi, 2003). Secara empiris daun salam digunakan oleh masyarakat untuk pengobatan pada penyakit kolesterol tinggi, kencing manis, hipertensi, gastritis dan diare
3
(Dalimartha, 2003). Alasan pemilihan daun salam karena pada penelitian sebelumnya menyatakan bahwa ekstrak etanol daun salam dapat menurunkan kadar glukosa darah, meningkatnya kadar glukosa dalam darah disebabkan oleh kerusakan pankreas sehingga tidak dapat menghasilkan insulin, kerusakan pankreas ini dapat disebabkan oleh senyawa radikal bebas yang merusak sel-sel pada pankreas sehingga tidak dapat berfungsi (Studiawan, 2004). Alasan lain, daun salam (Syzygium polyanthum ) merupakan tanaman satu genus dengan daun dewandaru (Eugenia uniflora dengan sinonim Syzygium uniflora) yang menurut penelitian daun dewandaru memiliki aktivitas sebagai antioksidan secara in vitro, dengan mekanisme kerja menangkap radikal bebas. Hasil penelitian tersebut menunjukkan aktivitas penangkap radikal pada ekstrak etanol, etil asetat dan kloroform dengan nilai IC50 berturut-turut 8,87; 12,01; dan 53,30 µg/ml (Utami dkk, 2005). Penelitian lain juga menyatakan bahwa daun dewandaru (Eugenia uniflora Linn.) memiliki aktivitas menangkap radikal bebas dengan nilai IC50 ekstrak heksana, kloroform, etil asetat dan air masing-masing 13,0; 21,4; 1,3; dan 7,0 µg/ml (Velaquez et al., 2003). Penelitian lain menyatakan infusa daun salam (Syzygium polyantha Wight.) mempunyai aktivitas menurunkan kadar asam urat darah pada mencit putih jantan yang diinduksi dengan potasium oxonat dosis 300 mg/kgBB. Infusa daun salam dosis 1,25g/kgBB, 2,5 g/kgBB dan 5,0 g/kgBB mampu menurunkan kadar asam urat darah mencit jantan berturut-turut sebesar 54,30%, 76,22% dan 76,54%. Kemungkinan kandungan flavonoid dari daun salam dapat menurunkan kadar asam urat dalam serum darah mencit, karena flavonoid mempunyai aktifitas sebagai antioksidan yang dapat
4
menghambat kerja enzim xantin oksidase sehingga pembentukan asam urat terhambat (Ariyanti, 2003). Oleh sebab itu, perlu dibuktikan apakah daun salam yang satu genus dengan daun dewandaru juga memiliki efek sebagai antioksidan, dibuktikan dengan efek antioksidan daun salam terhadap CCl4 yang merupakan penyebab kerusakan sel.
B. Perumusan Masalah Permasalahan yang ingin dipecahkan dalam penelitian ini adalah: Apakah ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) pada dosis tunggal dan berulang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan secara in vivo pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida (CCl4)?
C. Tujuan Penelitian 1. Membuktikan adanya efek antioksidan ekstrak etanol 70% daun salam dosis tunggal pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi dengan karbon tetraklorida. 2. Membuktikan adanya efek antioksidan ekstrak etanol 70% daun salam dosis berulang pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi dengan karbon tetraklorida.
D. Tinjauan Pustaka 1. Tanaman Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.)
5
a. Sistematika tanaman Divisio
: Spermatophyta
Subdivisio
: Angiospermae
Class
: Dicotyledoneae
Ordo
: Myrtales
Familia
: Myrtaceae
Genus
: Syzygium
Species
: Syzygium polyanthum (Wight) Walp. (Backer and Van Den Brink, 1965).
b. Sinonim Sinonim dari Syzygium polyanthum (Wight) Walp. adalah Eugenia polyantha Wight., Eugenia lucidula Miq. (Tjitrosoepomo, 2002). c. Nama daerah Meselanagan, ubar serai (Melayu), gowok (Sunda), manting, salam (Jawa), salam (Madura) (Dalimartha, 2003). d. Morfologi tanaman Salam tumbuh liar di hutan dan pegunungan, atau ditanam di pekarangan atau disekitar rumah. Tanaman ini dapat ditemukan di dataran rendah sampai 1400 m dpl. Salam merupakan pohon dengan tinggi mencapai 25 m, batang bulat, permukaan licin, bertajuk rimbun dan berakar tunggang. Daun tunggal, letak berhadapan, panjang tangkai daun 0,5-1 cm. Helaian daun berbentuk lonjong sampai elips atau bundar telur sungsang, ujung meruncing pangkal runcing, tepi rata, pertulangan menyirip, permukaan atas licin berwarna hijau tua, permukaan bawah
6
berwarna hijau muda, panjang 5-15 cm, lebar 3-8 cm, jika diremas berbau harum. Bunga majemuk yang tersusun dalam malai yang keluar dari ujung ranting, berwarna putih, baunya harum. Buahnya buah buni, bulat, diameter 8-9 mm, buah muda berwarna hijau, setelah masak menjadi merah gelap, rasanya agak sepat. Biji bulat, diameter sekitar 1 cm, berwarna coklat (Tjitrosoepomo, 2002). e. Kandungan kimia Daun salam mengandung saponin, triterpen, flavonoid, tanin, dan alkaloid. Minyak atsiri dalam daun salam terdiri dari seskuiterpen, lakton dan fenol (Soedarsono et al., 2002). f. Manfaat tanaman Secara empiris daun salam digunakan untuk obat pada penyakit diabetes, jantung koroner, hipertensi, sakit maag dan diare (Dalimartha, 2003). 2. Radikal Bebas a. Pengertian radikal bebas Radikal bebas adalah atom atau gugus apa saja yang memiliki satu/lebih elektron yang tidak berpasangan yang dapat bertindak sebagai akseptor elektron (Zimmerman, 1978). Karena jumlah elektron ganjil, maka tidak semua elektron dapat berpasangan. Suatu radikal bebas tidak bermuatan positif/negatif, maka spesi semacam ini sangat reaktif karena adanya elektron tidak berpasangan (Fessenden and Fessenden, 1986). b. Sumber radikal bebas Sumber radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh (endogenus) yang terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses pembakaran) protein atau
7
karbohidrat dan lemak yang kita konsumsi. Radikal bebas dapat pula diperoleh dari luar tubuh (eksogenus) yang berasal dari polusi udara, asap kendaraan bermotor, asap rokok, berbagai bahan kimia, makanan yang terlalu hangus (carbonated) dan lain sebagainya. Beberapa contoh radikal bebas antara lain: anion superoksida (2O2•), radikal hidroksil (OH•), nitrit oksida (NO•), hidrogen peroksida (H2O2) dan sebagainya (Windono dkk, 2000). Radikal bebas yang terbentuk di dalam tubuh akan merusak beberapa target seperti lemak, protein, karbohidrat dan DNA (Halliwel et al., 1995). Anion superoksida adalah salah satu jenis radikal bebas. Radikal ini sering terbentuk di dalam reaksi oksidasi sel (agen oksidasi). Radikal superoksid dapat memproduksi jenis radikal bebas lainnya (Wang et al., 2003). c. Mekanisme pembentukan radikal bebas Reaksi pembentukan radikal bebas merupakan mekanisme biokimia tubuh normal yang terjadi melalui reaksi yang langsung memutuskan ikatan atau melalui transfer elektron (Halliwel and Gutridge, 2000). Radikal bebas lazimnya hanya bersifat perantara yang bisa dengan cepat diubah menjadi substansi yang tidak lagi membahayakan bagi tubuh. Namun, apabila radikal bebas bertemu dengan enzim atau asam lemak tak jenuh ganda, maka merupakan awal dari kerusakan sel. Radikal mampu menarik atom hidrogen dari suatu molekul disekitarnya. Pengaruh radiasi ionisasi terhadap materi biologi akan menghasilkan radikal bebas hidroksil dan radikal bebas lainnya, seperti radikal hidrogen yang siap berinteraksi dengan biomolekul-biomolekul lain yang saling berdekatan (Middleton et al., 2000).
8
Reaksi oksidasi lipid berlangsung dalam tiga tahap, yang pertama adalah inisiasi yang mana suatu radikal lipid terbentuk dari molekul lipid menurut reaksi RH→R●+H●. Pengurangan atom hidrogen oleh spesies reaktif seperti radikal hidroksil berperan dalam inisiasi oksidasi lipid. Setelah inisiasi, reaksi propagasi (perambatan) terjadi yang mana dalam reaksi propagasi ini radikal lipid diubah menjadi radikal lipid yang berbeda. Reaksi ini umumnya melibatkan pengurangan atom hidrogen dari molekul lipid atau penambahan atom oksigen pada radikal alkil. R● + O₂ → ROO● ROO● + RH → ROOH + R● Tahap terakhir adalah reaksi terminasi. Dalam reaksi ini radikal bebas bergabung untuk membentuk molekul dengan elektron berpasangan. ROO● + ROO● → ROOR + O2 ROO● + R● → ROOR R● + R● → RR Prekusor molekular untuk memulai proses tersebut umumnya merupakan produk hidroperoksida, sehingga peroksidasi lipid menyebabkan reaksi rantai dengan berbagai efek yang potensial merusak sel-sel tubuh (Pokorni et al., 2001). 3. Karbon Tetraklorida Karbon tetraklorida (CCl4) adalah cairan yang mudah terbakar, jernih, tidak berwarna, sifat pelarutnya sama dengan kloroform. Dapat bercampur dengan alkohol, eter, benzen dan pelarut organik lainnya, tetapi praktis tidak larut dalam air. Harus disimpan dalam wadah tertutup dan kedap cahaya (Doerge, 1982).
9
Pertama kali dibuat tahun 1849 dan digunakan untuk anestesi, shampo kering dan obat cacing. Namun kegunaan dalam rumah tangga telah ditinggalkan karena toksisitasnya yang hebat dan hanya digunakan untuk industri, ilmu pengetahuan, dan penggunaan non rumah tangga (Klassen, 2001). Ingesti
CCl4
secara
oral
dengan
mudah
diabsorbsi
dari
traktus
gastrointestinal, berlangsung secara lambat dan tidak mudah diramalkan. Absorbsi ini mengalami peningkatan jika bersamaan dengan ingesti lemak dan alkohol (Fauci et al., 1998). CCl4 dihimpun secara besar-besaran dalam lemak tubuh, hati, dan sumsum tulang belakang. Pada hewan percobaan, penghirupan CCl4 diekskresikan dalam 2-3 bulan, sekitar setengahnya hilang karena penguapan dan sisanya dikeluarkan sebagai urea dan metabolit lain dalam urin dan feces (Klassen, 2001). CCl4 diaktifkan oleh enzim sitokrom P-450 menjadi radikal bebas yang reaktivitasnya tinggi. Pertama, CCl4 diubah menjadi bentuk radikal triklorometil (CCl3•) dan kemudian menjadi radikal triklorometil peroksi (CCl3O2•) yang sangat reaktif. Radikal ini dapat mengakibatkan peroksidasi PUFA (poly unsaturated fatty acid) yang terdapat pada membran sel, sehingga menyebabkan kerusakan pada sel (Hodgson and Levi, 2002). Produk utama dari peroksidasi PUFA diproduksi melalui mekanisme radikal bebas. Proses ini diawali dengan inisiasi yang meliputi pengambilan atom H dari PUFA oleh oksigen bebas yang terdapat pada CCl3O2•. Stabilitas bentuk dari produk awal ini ditentukan oleh energi disosiasi ikatan antara C-H. Ikatan ganda metilen pada PUFA lebih mudah teroksidasi daripada ikatan pada monosaturated fatty acid. Reaksi selanjutnya adalah propagasi antara pentadienil radikal dengan atom oksigen. Hasil dari reaksi ini akan menjadi inisiator baru untuk
10
bereaksi dengan PUFA yang lain sehingga menghasilkan produk radikal baru. Langkah selanjutnya adalah reaksi terminasi, yaitu kombinasi dua radikal menjadi suatu produk non radikal. Mekanisme peroksidasi PUFA dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1. Mekanisme Peroksidasi PUFA (Hodgson and Levi, 2002) Peroksidasi PUFA tidak berhenti sampai disini, menurut penelitian masih ada metabolit sekunder yang dihasilkan setelah peroksidasi PUFA. Salah satunya adalah malondialdehyde (malonaldehyde, propanedial, MDA) yang merupakan hasil akhir dari peroksidasi asam arakidonat dan beberapa PUFA yang lain (Josephy, 1997). Pengukuran kinetika peroksidasi lipid secara in vitro dapat dilakukan dengan mengukur berapa banyak oksigen yang dibutuhkan. Ada beberapa metode yang dapat digunakan, salah satunya TBA (Thiobarbituric acid) reactivity test, yang dapat dilakukan baik secara in vivo maupun in vitro. Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu molekul MDA dengan dua molekul TBA pada kondisi asam. Hasilnya adalah pigmen berwarna merah yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MDA yang terdeteksi menggambarkan banyaknya peroksidasi lipid
11
yangg terjadi (Josephy, ( 1997). Mekanisme M e pembenntukan kom mpleks anntara MD DA dan TBA A dapat dillihat padaa gambar 2. 2
Gambarr 2. Mekaanisme Reaksi R anttara TBA A dan MD DA (Josep phy, 1997))
4. A Antioksid dan a. P Pengertia an antiokssidan Antiok ksidan meerupakan senyawa yang daapat meng ghambat sspesies ok ksigen reakttif/spesiess nitrogenn reaktif dan juga radikal bbebas seh hingga anntioksidan dapat mencegah pen nyakit-pennyakit yan ng dihubu ungkan deengan radiikal bebass seperti kanker, k karddiovaskuleer, dan pennuaan (Haalliwell, B. B and Guttteridge, J.M.C, J 2000). b. P Penggolon ngan antiioksidan Tubuh h memilikki sistem pertahanaan internaal terhadaap radikall bebas. Sistem S pertaahanan terrsebut dikkelompokk kan menjaadi 3 goloongan: 1) A Antioksidan primeer, (antiok ksidan en ndogen/anntioksidan n enzimattis). Conttohnya ssuperoksid da dismuttase (SOD D), katalasse dan gluutation peeroksidasee. Enzim--enzim
12
ini mampu menekan atau menghambat pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk lebih stabil. Reaksi ini disebut sebagai chain-breaking-antioxidant. 2) Antioksidan sekunder (antioksidan eksogen atau antioksidan non enzimatis). Contoh antioksidan sekunder ialah vitamin E, vitamin C, β-karoten, isoflavon, asam urat, bilirubin, dan albumin. Senyawa-senyawa ini dikenal sebagai penangkap radikal bebas (scavenger free radical). 3) Antioksidan tersier, misalnya enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang dirusak oleh radikal bebas (Winarsi, 2005). Senyawa antioksidan sintesis seperti butil hidroksi anisol (BHA) dan butil hidroksi toluen (BHT) bukan merupakan solusi untuk kontrol positif yang baik, sebab pada pemaparan yang lama diketahui dapat mempengaruhi genetika sel-sel tubuh (Poormorad et al., 2006). c. Sumber antioksidan Antioksidan sangat beragam jenisnya. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami). 1) Antioksidan sintetik Diantara beberapa contoh antioksidan sintetik yang diijinkan untuk makanan, ada lima antioksidan yang penggunaannya meluas dan menyebar di seluruh dunia, yaitu butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi toluen (BHT), propil galat, tert-butil
13
hidroksi quinon (TBHQ) dan tokoferol. Antioksidan tersebut merupakan antioksidan alami yang telah diproduksi secara sintesis untuk tujuan komersial (Pokorni et al., 2001). 2) Antioksidan alami Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari: a) Senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan b) Senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan c) Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke makanan. Kebanyakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan. Kingdom tumbuhan, Angiosperm memiliki kira-kira 200.000 sampai 300.000 spesies dan dari jumlah ini kurang lebih 400 spesies yang telah dikenal dapat menjadi bahan pangan manusia. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami terbesar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, buah, biji, dan serbuk sari (Pokorni et al., 2001). Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam
14
klorogenat, dan lain-lain. Senyawa antioksidan polifenolik ini adalah multifungsional dan dapat bereaksi sebagai: a) Pereduksi b) Penangkap radikal bebas c) Pengkelat logam d) Peredam terbentuknya singlet oksigen Kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan erat dengannya, sehingga flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar. Lebih lanjut disebutkan bahwa sebenarnya flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau, sehingga pastilah ditemukan pula pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Kebanyakan dari golongan dan senyawa yang berkaitan erat dengannya memiliki sifat-sifat antioksidan baik di dalam lipida cair maupun dalam makanan berlipida (Pokorni et al., 2001). d. Mekanisme kerja antioksidan Oksidasi dapat dihambat oleh berbagai macam cara diantaranya mencegah masuknya oksigen, penggunaan temperatur yang rendah, inaktivasi enzim yang mengkatalis oksidasi, mengurangi tekanan oksigen dan penggunaan pengemas yang sesuai. Cara lain untuk melindungi terhadap oksigen adalah dengan menggunakan bahan tambahan spesifik yang dapat menghambat oksidasi yang secara tepat disebut dengan penghambat oksidasi (oxidation inhibitor), tetapi baru-baru ini lebih sering disebut antioksidan (Pokorni et al., 2001). Penambahan antioksidan primer dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autoksidasi. Reaksi tersebut relatif stabil dan
15
tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru. Inisiasi
:
R● + AH → RH + A● Radikal lipida
Propagasi : ROO● + AH → ROOH + A● Mekanisme yang paling penting adalah reaksi antara antioksidan dengan radikal bebas (Gordon, 1990). Biasanya antioksidan bereaksi dengan radikal bebas peroksil atau hidroksil yang terbentuk dari hidroperoksida yang berasal dari lipid. Senyawa antioksidan lain dapat menstabilkan hidroperoksida menjadi senyawa non radikal. Peruraian hidroperoksida dapat dikatalisis oleh logam berat akibatnya senyawa-senyawa dapat mengkelat logam juga termasuk antioksidan. Beberapa senyawa disebut sinergis karena senyawa tersebut dengan sendirinya tidak mempunyai aktivitas antioksidan akan tetapi senyawa tersebut dapat meningkatkan aktivitas antioksidan senyawa lain. Kelompok lain adalah senyawa-senyawa yang mampu menguraikan hidroperoksida melalui jalur non radikal sehingga senyawa ini dapat mengurangi kandungan radikal bebas (Pokorni et al., 2001). 5. Ekstraksi Ekstraksi adalah penarikan zat pokok yang diinginkan dari bahan mentah obat dan menggunakan pelarut yang dipilih dimana zat yang diinginkan dapat larut. Bahan mentah obat yang berasal dari tumbuh-tumbuhan ataupun hewan tidak perlu diproses lebih lanjut kecuali dikumpulkan atau dikeringkan. Tiap-tiap bahan mentah obat disebut ekstrak, tidak mengandung hanya satu unsur saja tetapi berbagai unsur, tergantung pada obat yang digunakan dan kondisi dari ekstraksi (Ansel, 1989).
16
Ekstraksi atau penyarian merupakan peristiwa perpindahan masa zat aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari. Pada umumnya penyari akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan semakin luas (Ansel, 1989). Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair yang dibuat dengan cara menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari langsung (Anonim, 1979). Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif simplisia nabati dan hewani menggunakan pelarut yang sesuai kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Anonim, 1995). Sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimum dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1989). Kriteria cairan penyari yang baik haruslah memenuhi syarat antara lain: a. Murah dan mudah diperoleh b. Stabil secara fisika dan kimia c. Bereaksi netral d. Tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar e. Selektif yaitu hanya menarik zat yang berkhasiat yang dikehendaki f. Tidak mempengaruhi zat yang berkhasiat g. Diperbolehkan oleh peraturan (Anonim, 1986).
17
Etanol 70% adalah campuran dua bahan pelarut yaitu etanol dan air dengan kadar etanol 70% (v/v). Etanol tidak menyebabkan pembengkakan pada membran sel dan memperbaiki stabilitas bahan obat terlarut. Keuntungan lainnya adalah sifatnya yang mampu mengendapkan albumin dan menghambat kerja enzim. Etanol 70% sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif yang optimal (Voight, 1984). Maserasi (maserace = mengairi, melunakkan) adalah cara ekstraksi yang paling sederhana. Bahan simplisia yang dihaluskan sesuai syarat-syarat farmakope (umumnya terpotong-potong atau berupa serbuk kasar) disatukan dengan bahan pengekstraksi. Selanjutnya rendaman tersebut disimpan terlindungi dari cahaya langsung (mencegah reaksi yang dikatalisis cahaya atau perubahan warna) dan dikocok kembali. Waktu maserasi pada umumnya 5 hari. Setelah waktu tersebut, artinya keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan yang masuk dalam cairan telah tercapai. Dengan pengocokan dijamin keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi lebih cepat dalam cairan. Keadaan diam selama maserasi tidak memungkinkan terjadinya ekstraksi absolut. Semakin besar perbandingan simplisia terhadap cairan pengekstraksi, akan semakin banyak yang diperoleh (Voight, 1984). Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan kerugian dari maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna (Anonim, 1986).
18
Maserasi umumnya dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok dimasukkan dalam bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang-ulang diaduk. Hasil penyarian dengan maserasi perlu dibiarkan selama waktu tertentu. Waktu tersebut diperlukan untuk mengendapkan zat-zat yang tidak diperlukan tetapi ikut terlarut dalam cairan penyari seperti malam dan lain-lain (Anonim, 1986).
E. Keterangan Empiris Diharapkan dari penelitian ini didapatkan data ilmiah tentang efek antioksidan ekstrak etanol 70% daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) dosis tunggal dan dosis berulang pada tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida (CCl4).
BAB II METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental semu dengan rancangan acak lengkap pola searah sebagai penelitian pendahuluan untuk mengetahui efek antioksidan ekstrak etanol 70% daun salam.
B. Definisi Operasional Penelitian Variabel dalam penelitian ini diklasifikasikan menjadi 3, yaitu : 1. Variabel bebas : a. Konsentrasi ekstrak etanol 70% daun salam. b. Dosis pemberian ekstrak etanol 70% daun salam. 2. Variabel tergantung : Kadar MDA (malonaldehid) serum darah tikus putih jantan galur Wistar pada jam ke-24 dan jam ke-48. 3. Variabel terkendali : a. Tanaman Uji Tanaman uji yang digunakan adalah daun salam yang sudah tua diperoleh dari Desa Semail, Kelurahan Bangun Harjo, Kecamatan Sewon, Kabupaten Bantul, D.I.Y. b. Hewan uji
19
20
Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan, sehat dengan berat badan 100-200 gram. c. Metode penyarian : maserasi. d. Larutan penyari : etanol 70%. e. Suhu pengeringan : 50oC–60oC.
C. Bahan dan Alat 1. Bahan yang digunakan : a. Tanaman uji yang digunakan dalam penelitian adalah daun Salam yang sudah tua, diperoleh dari Desa Semail, Kelurahan Bangun Harjo, Kecamatan Sewon, Kabupaten Bantul, D.I.Y. b. Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan umur 23 bulan, sehat dengan berat badan 100-200 gram yang didapat dari Universitas Muhammadiyah Surakarta. c. Reagen yang digunakan adalah etanol 70%, karbon tetraklorida (CCl4), paraffin cair, CMC Na 0,5%, 1, 1, 3, 3-tetrametoksipropan, aquadest, trichloro acetat (TCA) dan thiobarbituric acid (TBA). 2. Alat yang digunakan : Timbangan hewan (Ohaus), jarum peroral, spuit injeksi, holder tikus, ependorf, sonifikator (Branson), spektrofotometer uv-vis (Shimadzu), mikropipet, kuvet, penangas air, centrifuge, vortek, minispins (ependorf), mikropipet, timbangan analitik, alat-alat gelas.
21
D. Jalannya Penelitian 1. Determinasi tanaman salam Determinasi tanaman ini adalah untuk menetapkan kebenaran sampel tanaman salam yang berkaitan dengan ciri-ciri makroskopis dengan mencocokkan ciri-ciri morfologi tanaman terhadap pustaka. Tanaman ini dideterminasi di laboratorium Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Biologi Universitas Muhammadiyah Surakarta. 2. Penyiapan bahan Pengambilan daun salam dari Desa Semail, Kelurahan Bangun Harjo, Kecamatan Sewon, Kabupaten Bantul, D.I.Y. Daun salam yang didapat dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam. Kemudian pengeringan dilanjutkan dengan oven 50oC - 60oC. Daun salam yang telah dikeringkan diserbuk dengan cara diblender kemudian diayak dengan ayakan no. 100. 3. Pembuatan ekstrak daun salam Pembuatan ekstrak etanol 70% daun salam menggunakan metode maserasi, karena maserasi tidak memerlukan proses pemanasan sehingga dapat menghindari rusaknya zat-zat dalam simplisia yang tidak tahan pemanasan. Kurang lebih 600 gram serbuk daun salam dimasukkan dalam panci kemudian diberi etanol 70% sebanyak 7,5 kali serbuk daun salam (4,5 L). Kemudian diaduk-aduk, ditutup dan didiamkan selama 5 hari ditempat terlindung cahaya, sambil berulang kali diaduk. Setelah 5 hari filtrat diambil dengan cara disaring dengan kertas saring. Ampas yang didapat diremaserasi. Filtrat yang diperoleh, dibiarkan selama 1 hari untuk
22
memisahkan dari zat-zat yang mungkin masih terlarut seperti malam dan lain-lain. Filtrat yang didapat diuapkan sampai menjadi ekstrak kental (Anonim, 1986). Secara skematis pembuatan ekstrak daun salam dapat dilihat pada gambar 3 dibawah ini. 600 g serbuk daun salam dimaserasi dengan etanol 70% 4,5 L selama 5 hari Setelah 5 hari diserkai dan ampas dipisahkan
Ampas yang didapat di remaserasi Diambil filtratnya kemudian dienapkan selama 1 hari dan dipisahkan dari endapannya filtrat diuapkan sampai kental
Ekstrak etanol daun Salam Dibuat range konsentrasi berdasarkan orientasi Gambar 3. Skema Pembuatan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam 4. Pembuatan sediaan ekstrak etanol daun salam Ekstrak etanol 70% daun salam yang didapat dilarutkan dalam suspensi CMC Na 0,5% sampai dosis yang diinginkan. 5. Penetapan dosis karbon tetraklorida (CCl4) Pada penelitian ini dipilih dosis CCl4 (p.o) berdasarkan dosis toksiknya terhadap tikus yaitu CCl4 konsentrasi 11,2% (v/v) dengan volume pemberian 2,8 ml/kgBB (Rosnalini, 1995). 6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida (CCl4) 11,2% (v/v) Sebanyak 11,2 ml CCl4 dilarutkan dalam parafin cair sampai 100 ml. 7. Perhitungan dosis ekstrak daun salam Konsentrasi acuan (pada infusa) = 10% (b/v) = 10 g/100 ml Volume pemberian maksimal secara p.o pada tikus (200 g) = 10 ml
23
Volume pemberian
= ½ x vol maksimal = ½ x 10 ml = 5 ml
Dosis pemberian pada tikus (infusa) = 10 g/100 ml = 0,5 g/5 ml = 0,5 g/ 200 g BB = 2,5 g/KgBB Dosis ekstrak dihitung berdasarkan hasil perolehan rendemen (ekstrak kental) Dari simplisia kering 600 g, diperoleh ekstrak kental 280,8 g, maka ekstrak kental yang dihasilkan = 280,8 g/600 g x 100% = 46,8% Dosis ekstrak = 0,5 g x 46,8% = 0,234 g = 0,234 g/ 200 g BB = 234 mg/200 g BB = 1,17 g/KgBB Setelah diperoleh dosis ekstrak kemudian diorientasikan pada tikus dan dibuat menjadi peringkat dosis 1,25 g/KgBB, 2,5 g/KgBB, dan 5,0 g/KgBB. 8. Penelitian pendahuluan a. Penetapan panjang gelombang maksimum Sebanyak 2 ml aquadest ditambah 1 ml TCA 20% dan 2 ml TBA 0,67% digunakan sebagai blanko. Sebagai standar digunakan 200 µl MDA baku ditambah dengan aquadest sampai 2 ml kemudian ditambah 1 ml TCA 20% dan 2 ml TBA 0,67%. Larutan dicampur homogen dan dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit, lalu didinginkan. Setelah dingin disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan berwarna merah muda kemudian diukur serapannya dengan
24
spektrofotometer pada panjang gelombang 450-600 nm. Penentuan panjang gelombang maksimum untuk menentukan panjang gelombang dengan serapan tertinggi. Didapatkan panjang gelombang maksimum sebesar 520 nm. b. Penentuan operating time (OT) Sebanyak 2 ml aquadest ditambah 1 ml TCA 20% dan 2 ml TBA 0,67% digunakan sebagai blanko. Sebagai standar digunakan 200 µl MDA baku ditambah dengan aquadest sampai 2 ml kemudian ditambah 1 ml TCA 20% dan 2 ml TBA 0,67%. Larutan dicampur homogen dan dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit, lalu didinginkan. Setelah dingin disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit.
Supernatan
berwarna
merah
muda
diukur
serapannya
dengan
spektrofotometer uv-vis pada panjang gelombang 520 nm (berdasarkan panjang gelombang MDA) dan dibaca pada menit ke 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50. Penentuan operating time (OT) dimaksudkan untuk memperoleh waktu dengan serapan yang paling stabil. Didapatkan operating time pada menit 30-35. c. Penetapan waktu pembentukan toksik dari karbon tetraklorida (Gambar 4) Pada penelitian ini dilakukan orientasi untuk menetapkan waktu pembentukan toksik dari CCl4. Tikus sebanyak 6 ekor dibagi secara acak menjadi 2 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 3 tikus. Kelompok pertama diberi larutan parafin cair sebagai kontrol negatif sedangkan kelompok kedua diberi perlakuan dengan larutan CCl4 11,2 % (v/v) (p.o). Sebelum diberi perlakuan, tikus dipuasakan terlebih dahulu selama ± 18 jam dengan tetap diberi air minum. Dilihat kadar MDA dari serum darah yang diambil pada jam ke 0, 12, 24, 36, 48, 60 setelah diberi
25
perlakuan. Waktu dengan kadar MDA tertinggi merupakan waktu maksimal terbentuknya toksik, dan didapatkan hasilnya pada jam ke-48. 6 ekor tikus putih jantan Wistar dibagi 2 kelompok, masing-masing kelompok 3 ekor
Kelompok I kontrol negatif paraffin cair (p.o)
Kelompok II CCl4 11,2 % (v/v) (p.o)
Ditentukan kadar MDA pada jam ke- 0, 12, 24, 36, 48, 60
Waktu dengan kadar MDA tertinggi merupakan waktu pembentukan toksik (jam ke-48) Gambar 4. Skema Orientasi Waktu Pembentukan Toksik d. Optimasi waktu pemberian ekstrak etanol 70% daun salam (Gambar 5) Pada penelitian ini dilakukan orientasi untuk menetapkan waktu optimal pemberian ekstrak etanol 70% daun salam. Dua belas ekor tikus dibagi secara acak menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 3 tikus. Kelompok pertama diberi larutan CCl4 11,2 % (v/v), kelompok kedua diberi ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB 1 jam sebelum pemberian CCl4, kelompok ketiga diberi ekstrak etanol daun salam bersamaan dengan pemberian larutan CCl4, kelompok keempat diberi ekstrak etanol 70% daun salam 1 jam setelah pemberian larutan CCl4. Pada jam ke-48 (hasil orientasi pembentukan toksik) diambil serum darah kemudian dihitung kadar MDA-nya. Waktu dengan kadar MDA terendah
26
merupakan waktu optimal pemberian ekstrak etanol 70% daun salam, dan didapatkan pada saat waktu bersamaan pemberian karbon tetraklorida. e. Penetapan waktu pengambilan serum. Waktu pengambilan serum darah didasarkan atas hasil orientasi. Pengambilan serum darah pertama dilakukan pada jam ke-0, yaitu 1 jam sebelum waktu pemberian ekstrak, kemudian diambil kembali serum darah kedua diambil sesaat sebelum pemberian ekstrak kedua dan serum darah ketiga diambil pada jam ke-48 (waktu pembentukan toksik). 12 ekor tikus putih jantan Wistar, dibagi 4 kelompok, masing-masing kelompok 3 ekor
Diberi ekstrak etanol 70% daun salam 1,25 g/KgBB
Kelompok I larutan CCl4 11,2 % (v/v) (p.o)
Kelompok 2 1 jam sebelum pemberian CCl4 11,2 % (v/v) (p.o)
Kelompok 3 Bersamaan dengan pemberian CCl4 11,2 % (v/v) (p.o)
Kelompok 4 1 jam setelah pemberian CCl4 11,2 % (v/v) (p.o)
Diambil serum darah pada jam ke-48, kemudian diukur kadar MDA-nya
Waktu dengan kadar MDA terendah merupakan waktu optimal pemberian ekstrak etanol 70% daun salam (bersamaaan dengan CCl4) Gambar 5. Skema Orientasi Waktu Optimal Pemberian Ekstrak Etanol 70% Daun Salam
27
9. Perlakuan hewan uji Hewan uji sebanyak 35 ekor dibagi menjadi 7 kelompok perlakuan. Setiap perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus. Sebelum percobaan dilakukan, tikus diadaptasikan dengan kondisi laboratorium selama 7 hari untuk menghindari stress pada hewan uji pada saat perlakuan. Satu hari sebelum perlakuan semua tikus dipuasakan kira-kira 18 jam, dengan tetap diberikan air minum. Hal ini dilakukan untuk menyamakan kondisi hewan uji dan mengurangi pengaruh makanan yang diberikan terhadap sediaan uji yang diberikan. Pembagian kelompok adalah sebagai berikut : a. Dosis tunggal Kelompok I
: Diberi parafin cair sebagai kontrol normal (p.o)
Kelompok II
: Diberi larutan CCl4 dalam parafin cair sebagai kontrol toksik (p.o)
Kelompok III
: Diberi larutan CCl4 dalam parafin cair + CMC Na 0,5 % sebagai kontrol negatif (p.o)
Kelompok IV
: Diberi suspensi ekstrak etanol daun Salam dosis 1,25 g/KgBB + larutan CCl4 dalam parafin cair (p.o)
Kelompok V
: Diberi suspensi ekstrak etanol daun Salam dosis 2,5 g/KgBB + larutan CCl4 dalam parafin cair (p.o)
Kelompok VI
: Diberi suspensi ekstrak etanol daun Salam dosis 5,0 g/KgBB + larutan CCl4 dalam parafin cair (p.o)
Kelompok VII : Diberi suspensi ekstrak etanol daun Salam dosis 5,0 g/KgBB (p.o)
28
Hewan uji diambil darahnya pada jam ke-0 dan jam ke-24 untuk diukur kadar MDA serumnya. Skema uji dapat dilihat pada gambar 6. .
35 ekor tikus putih jantan Wistar, masing-masing kelompok 5 ekor tikus
Kelompok I
Parafin Cair p.o
Kelompok
Kelompok
II
III
larutan CCl4 dalam
parafin cair
larutan CCl4 dalam parafin cair +CMC Na 0,5% p. o
Kelompok IV
Kelompok V
Kelompok VI
Kelompok VII
Suspensi ekstrak etanol 1,25 g/KgBB + larutan CCl4 dalam parafin cair p.o
Suspensi ekstrak etanol 2,5 g/KgBB + larutan CCl4 dalam parafin cair p. o
Suspensi ekstrak etanol 5,0 g/KgBB + larutan CCl4 dalam parafin cair p.o
Suspensi ekstrak etanol 5,0 g/KgBB
p. o
Untuk kelompok IV, V dan VI diberi ekstrak bersamaan dengan pemberian CCl4
Pada jam ke-0 dan jam ke-24 masing-masing kelompok diambil cuplikan darahnya untuk ditentukan aktivitas MDA serum
Hasilnya dianalisis dengan uji Kolmogorov Smirnof dan Levene test, jika hasilnya terdistribusi normal dan homogen dilanjutkan Anava 1 jalan, jika ada perbedaan yang signifikan antar kelompok dilanjutkan dengan uji LSD, jika data tidak terdistribusi normal dan tidak homogen, dilakukan uji non parametrik
Gambar 6. Skema Uji Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam (Syzigium Polyanthum (Wight.) Walp) Dosis Tunggal pada Tikus Putih Jantan Galur Wistar b. Dosis berulang Pada kelompok dengan perlakuan dosis berulang, hewan uji diberi perlakuan sama seperti diatas, kemudian pada hari ke-2 (jam ke-24) diberi ekstrak lagi dengan peringkat dosis sama seperti diatas. Pengambilan darah dilakukan pada jam ke-0 dan jam ke-48, kemudian diukur kadar MDA serumnya. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar 7 berikut ini.
29
35 ekor tikus putih jantan Wistar Masing-masing kelompok 5 ekor tikus
Kelompok I Kontrol normal
Parafin Cair p.o
Kelompok II
Kelompok
Kontrol positif toksik
III
larutan CCl4 dalam parafin cair
Kelompok IV
Kelompok V
Kelompok VI
Kelompok VII
Suspensi ekstrak etanol 1,25 g/KgBB +
Suspensi ekstrak etanol 2,5 g/KgBB + larutan
Suspensi ekstrak etanol 5,0 g/KgBB + larutan
Suspensi ekstrak etanol 5,0 g/KgBB
CCl4 dalam parafin cair p. o
CCl4 dalam parafin cair p.o
Kontrol negatif
larutan CCl4 dalam parafin
cair +CMC Na 0,5% p. o
larutan CCl4 dalam parafin cair p.o
p. o
Untuk kelompok III diberi CMC Na 0,5 % pada jam ke-24 dan kelompok IV, V dan VI diberi ekstrak bersamaan dengan pemberian CCl4, kemudian setelah 24 jam diberi ekstrak lagi Pada jam ke-0 dan jam ke-48 masing-masing kelompok diambil cuplikan darahnya untuk ditentukan aktivitas MDA serum
Hasilnya dianalisis dengan uji Kolmogorov Smirnof dan Levene test, jika hasilnya terdistribusi normal dan homogen dilanjutkan Anava 1 jalan, jika ada perbedaan yang signifikan antar kelompok dilanjutkan dengan uji LSD, jika data tidak terdistribusi normal dan tidak homogen, dilakukan uji non parametrik
Gambar 7. Skema Uji Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam (Syzigium Polyanthum (Wight.) Walp) Dosis Berulang pada Tikus Putih Jantan Galur Wistar 10. Pembuatan serum Serum dibuat dengan cara menggores vena lateralis ekor tikus, darah yang keluar ditampung dalam ependorf sebanyak 1 ml. Darah disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan serum yang akan digunakan dalam penetapan kadar MDA plasma. (Apabila perlu serum dapat disimpan dalam temperatur -20oC maksimal 1 bulan sampai dilakukan pemeriksaan tersebut). 11. Penetapan kadar MDA Kadar MDA diukur pada serum darah menurut metode Wills (1987). Dua ratus mikroliter serum ditambah aquades sampai 2 ml. Kemudian ditambahkan 1 ml
30
TCA 20% dan 2 ml TBA 0,67%. Larutan dicampur homogen dan dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit, lalu didinginkan. Setelah dingin disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan berwarna merah muda diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm dan didiamkan selama 30 menit (OT). Kadar MDA dihitung menggunakan kurva baku MDA dengan konsentrasi 0,00; 0,0036; 0,0072; 0,0144; 0,0288; 0,0576; 0,1152; 0,2304 dan 0,4608 μg/ml. Kurva baku selalu dibuat baru setiap pengukuran MDA. 12. Pengukuran kadar MDA Derajad peroksidasi lipid dapat ditentukan dengan mengukur kadar malonaldehid (MDA) dalam serum darah. Dasar pengukurannya adalah reaksi antara MDA dengan TBA menghasilkan senyawa kompleks MDA-TBA berwarna merah muda yang dapat diukur serapannya pada panjang gelombang 520 nm. a. Penyiapan reagen: TCA 20%: 20,0 g TCA dilarutkan dalam 100 ml aquadest. TBA 0,67%: 0,67 g TBA dilarutkan dalam 100 ml aquadest. b. Pembuatan larutan standar MDA (kurva baku MDA): Standar MDA hasil hidrolisis 1, 1, 3, 3-tetrametoksipropan = 3,593 μg/ml. Perhitungan kadar MDA tersaji pada lampiran 4. Tabel 1. Kurva baku MDA No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
St-MDA (μl) 0 5 10 20 40 80 160 320 640
H2O (μl) 2000 1995 1990 1980 1960 1920 1840 1680 1360
Konsentrasi MDA (μg/ml) 0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
31
c. Menghitung persamaan regresi Y = a + bX, dimana Y adalah nilai serapan dan X adalah konsentrasi standar. Menghitung koefisien korelasi (r) dari data Y dan X. a = (ΣY – bΣX) / n b = (nΣXY – ΣXΣY) / n X2 – (ΣX)2 r = (nΣXY – ΣXΣY) / √{nΣX2 –(ΣX)2} {nΣY2 – (ΣY)2} kadar MDA dari sampel dihitung berdasar persamaan regresi yang diperoleh.
E. Cara Analisis Data yang diperoleh dari penelitian berupa selisih kadar MDA dan persen penurunan kadar MDA terhadap kontrol positif dalam darah pada jam ke-24 dan jam ke-48. Data tersebut dianalisa distribusi normalnya menggunakan metode Kolmogorov-Smirnov dan juga homogenitasnya dengan Levene test. Jika data tersebut normal dan homogen, maka analisa dilanjutkan dengan ANAVA (Analisis of Varian) dengan taraf kepercayaan 95%. Apabila hasilnya berbeda bermakna maka analisa dilanjutkan dengan uji LSD dengan taraf kepercayaan 95% pula. Namun apabila data tidak terdistribusi normal dan tidak homogen, data tersebut dianalisa secara nonparametrik dengan metode Kruskall-Wallis dengan taraf kepercayaan 95% dan apabila hasilnya berbeda bermakna dilanjutkan dengan uji berganda MannWithney dengan taraf kepercayaan 95%. % Penurunan Kadar MDA
100
BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan secara makroskopis yang dilakukan di laboratorium
Biologi
FKIP
Universitas
Muhammadiyah
Surakarta
dengan
menggunakan literatur Flora of Java (Backer and Van Den Brink, 1965). Hasil determinasi adalah sebagai berikut. 1b_2b_3b_4b_12b_13b_14b_17b_18b_19b_20b_21b_22b_23b_24b_25b_26b__27b _799b_800b_801b_802a_803b_804b_805c_806b_807a_808c_809b_810b_811a_812 b_815b_816b_818b_820b_821b_822b_824b_825b_826b_829b_830b_831b_832b_8 33b_834a_835b_983b_984b_986b_991b_992b_993b_994b_995d_1036c_1038b___ _____________________________ Myrtaceae 1a_2b_3b_7b_8b_9b_10b______________ Syzygium 1b_7b_8b_11a_12b___________________ Syzygium polyanthum Wight (Backer and Van Den Brink, 1965) Dari hasil determinasi diatas dapat dipastikan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah Syzygium polyanthum Wight.
B. Hasil Uji Pendahuluan Uji pendahuluan yang pertama adalah penentuan panjang gelombang dengan absorbansi tertinggi (lampiran 5). Dari percobaan
tersebut didapatkan panjang
gelombang maksimum sebesar 520 nm, dengan absorbansi terbesar yaitu 0,271.
32
33
Uji pendahuluan yang kedua adalah penetapan operating time (OT). Supernatan berwarna merah muda diukur serapannya dengan spektrofotometer uvvis pada panjang gelombang 520 nm (berdasarkan panjang gelombang maksimal MDA) dan dibaca pada menit ke 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50. Operating time yang diperoleh adalah pada menit ke 30-35 (lampiran 5). Penentuan operating time (OT) dimaksudkan untuk memperoleh waktu dengan serapan yang paling stabil. Uji pendahuluan yang ketiga dilakukan untuk mengetahui bagaimana model toksik pada tikus putih jantan, yaitu dengan mencari waktu pembentukan toksik dari karbon tetraklorida dalam menaikkan kadar MDA dari kondisi normal. Waktu dengan kadar MDA tertinggi merupakan waktu pembentukan toksik. Hasil orientasi dosis setelah diinduksi dengan karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) berupa data kadar MDA dalam darah (µg/ml) yang diperoleh dari persamaan kurva baku Y = 1,365X + 0,004 dengan r = 0,996 (lampiran 6).
Estimated Marginal Means of MDA
kelompok
1.750
parafin cair CCl4
Kadar MDA Estimated Marginal Means
1.500
1.250
1.000
0.750
0.500
0.250 0
12
24
36
48
60
jam
Gambar 8. Grafik Data Kadar MDA Darah pada Model Toksik
34
Pada kelompok parafin cair hanya digunakan 1 hewan uji sehingga tidak dapat dilakukan uji statistik, maka digunakan analasis deskriptif (gambar 8). Dari hasil gambar terlihat bahwa setelah pemberian CCl4 terjadi peningkatan kadar MDA dibanding pemberian dengan parafin cair .Dari gambar tersebut terlihat jelas pembentukan toksik adalah jam ke-48, yaitu pada saat kadar MDA darah tertinggi. Pada waktu tersebut sel-sel tubuh telah mengalami kerusakan oleh adanya radikal bebas triklorometil peroksi (CCl3O2•) yang dapat menyebabkan peroksidasi lipid. Uji pendahuluan yang keempat adalah penetapan waktu optimal pemberian ekstrak. Dua belas ekor hewan uji dibagi menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok 3 ekor hewan uji. Diberi perlakuan dengan CCl4 dosis toksik dan ekstrak dengan waktu yang berbeda, kemudian diukur kadar MDA-nya. Waktu dengan kadar MDA terendah merupakan waktu optimal pemberian ekstrak. Data optimasi waktu pemberian ekstrak diperoleh dari persamaan kurva baku Y = 1,082X + 0,006 dengan r = 0,998 (lampiran 6) dapat dilihat pada tabel 2 di bawah ini. Tabel 2. Data Optimasi Waktu Pemberian Ekstrak (n=3) No HU 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Kelompok
Absorbansi
Kadar x fp (µg/ml)
CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o) Ekstrak 1 jam sebelum CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o) Ekstrak bersamaan CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o) Ekstrak 1 jam setelah CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o)
0,087 0,098 0,076 0,089 0,11 0,067 0,049 0,022 0,029 0,053 0,075 0,181
1,872 2,126 1,617 1,918 2,403 1,409 0,994 0,370 0,531 1,086 1,594 4,043
Mean ± SD 1,871 ± 0,254 1,910 ± 0,497 0,631 ± 0,324 2,241 ± 1,581
35
Dari hasil orientasi tersebut diperoleh waktu pemberian ekstrak daun salam yang paling optimal adalah bersamaan dengan waktu pemberian CCl4. Hal ini juga dapat dilihat pada uji statistik t-test dengan taraf kepercayaan 95% menunjukkan bahwa pada pemberian ekstrak bersamaan dengan CCl4 memberikan hasil kadar MDA paling kecil dengan signifikan (p < 0,05). Hasil uji statistik selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 9. Pada saat ekstrak daun salam diberikan bersamaan dengan CCl4, radikal bebas yang dibentuk oleh CCl4 langsung ditangkap oleh komponen dari ekstrak sehingga tidak begitu banyak menimbulkan kerusakan. Sedangkan ekstrak yang diberikan 1 jam sebelum CCl4 tidak cukup untuk menangkap radikal bebas yang terbentuk dari metabolisme CCl4. Ekstrak yang diberikan 1 jam setelah CCl4 juga tidak mampu menurunkan kadar MDA, dimungkinkan karena pada saat CCl4 diberikan, dalam waktu 30 menit CCl4 sudah dapat merusak sel tubuh, jadi pemberian ekstrak 1 jam setelah CCl4 tidak efektif sebab peroksidasi lipid sudah terlanjur terjadi.
C. Hasil Uji Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antioksidan ekstrak etanol 70% daun salam dalam menurunkan kadar MDA dalam serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang telah diinduksi dengan karbon tetraklorida konsentrasi 11,2 % (v/v) dengan dosis 2,8ml/KgBB. Pada penelitian ini digunakan hewan uji mamalia bukan primata yaitu tikus putih jantan yang memiliki enzim sitokrom P-450. Untuk memperkecil variasi
36
biologis, maka peneliti melakukan pengendalian terhadap beberapa variabel antara lain berat badan, umur, jenis kelamin, strain, serta makanan dan minuman yang diberikan pada hewan uji. Tujuan dilakukannya pengendalian variasi biologis tersebut adalah untuk memperkecil pengaruh variabel tersebut terhadap kadar MDA dalam darah tikus. Pengendalian dilakukan dengan menggunakan hawan uji yang kurang lebih sama variasi biologisnya yaitu diantaranya dengan berat badan sekitar 100-200 gram, umur 2-3 bulan, galur Wistar, jenis kelamin jantan dan diperlakukan sama yaitu ditempatkan dalam kandang dengan jumlah tiap kandangnya sama dan diberi makanan sama yaitu pellet dan sebelum diberi perlakuan, hewan uji dipuasakan terlebih dahulu selama 18 jam dengan tetap diberi minum ad libidum. Hal ini dilakukan agar kondisi hewan uji sama dan untuk mengurangi pengaruh makanan yang dikonsumsi terhadap sediaan uji yang diberikan dalam penelitian. Untuk mengurangi tingkat kestressan, hewan uji diadaptasikan dengan kondisi laboratorium selama 7 hari. Karbon tetraklorida digunakan sebagai kontrol toksik. CCl4 dapat diubah oleh sitokrom P-450 menjadi metabolit reaktif yaitu triklorometil peroksi yang dapat menyebabkan peroksidasi lipid sehingga mengakibatkan kerusakan sel-sel pada hati dan juga sel-sel tubuh lainnya. MDA merupakan produk peroksidasi lipid, sehingga jika terjadi kerusakan sel maka MDA ini akan terbentuk dan keluar dari sel masuk ke peredaran darah. Peningkatan kadar MDA yang sangat tinggi menandakan telah terjadi kerusakan pada sel-sel tubuh.
37
Kontrol normal yang digunakan dalam penelitian ini adalah parafin cair. Parafin cair merupakan pelarut dari CCl4, sehingga dapat diketahui apakah parafin berpengaruh pada pembentukan toksik. Sediaan uji yang digunakan untuk menurunkan kadar MDA dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol 70% daun salam yang disari dengan metode maserasi dimana metode ini merupakan metode yang sederhana dan cocok untuk menyari semua senyawa yang terkandung dalam simplisia. Daun salam yang digunakan dalam penelitian ini berupa daun yang kering. Senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman salam adalah minyak atsiri, tannin, polifenol dan flavonoid (Anonim, 1989). Kemungkinan flavonoid inilah yang dapat menurunkan kadar MDA dalam serum darah tikus, karena flavonoid mempunyai aktifitas sebagai antioksidan yang dapat menghambat kerja radikal bebas sehingga kerusakan sel terhambat (Robinson, T., 1995). Sebagian besar flavonoid mempunyai spektrum yang luas dalam aktivitas biokimia, tetapi tidak semua flavonoid memiliki efek antioksidan. Flavonoid yang berefek sebagai antioksidan adalah flavonoid yang memiliki struktur O-dihidroksi pada cincin B, ikatan rangkap pada atom C nomer 2 dan 3, dan gugus hidroksi pada posisi 3 dan 5 dalam cincin C dan A (Fuhrman dan Aviram, 2007). Pengukuran kadar MDA pada serum darah menurut metode Wills (1987). Serum yang akan dianalisis ditambahkan aquadest sampai 2 ml direaksikan dengan menggunakan 1 ml TCA dan 2 ml TBA 0,67%, kadar diukur dengan menggunakan alat spektrofotometer uv-vis Shimadzu pada panjang gelombang 520 nm. Data kadar MDA dalam serum tikus setelah diinduksi dengan karbon tetraklorida dan pemberian sediaan uji (ekstrak etanol 70% daun salam) tersaji pada tabel 3, 4 dan gambar 9.
38
Tabel 3. Data Penurunan Kadar MDA pada Serum Darah Tikus Setelah Perlakuan dengan Dosis Tunggal Kelompok
Paraffin cair (p.o)
Rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) (p.o)
Rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5% (p.o)
Rata‐rata CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB (p.o) Rata‐rata CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 2,5 g/KgBB (p.o) Rata‐rata CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o) Rata‐rata
Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o)
Rata‐rata
No HU 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Kadar x fp (µg/ml) pada jam ke‐ 0 24 0,305 0,047 0,188 0,493 0,305 0,268 0,070 0,235 0,164 0,329 0,258 0,211 1,094 1,317 0,536 0,603 0,670 0,844 0,536 0,737 0,491 0,446 0,558 0,554 0,516 0,598 0,454 0,557 0,454 0,516 0,454 0,413 0,578 0,413 0,474 0,466
0,751 0,376 0,305 0,282 0,141 0,371 1,105 1,221 1,415 1,473 1,337 1,310 1,786 1,830 2,076 1,652 1,920 1,853 1,129 1,110 1,168 1,207 1,227 1,168 0,495 0,268 0,639 0,227 0,660 0,458 0,103 0,144 0,144 0,165 0,186 0,149
0,608 0,549 0,373 0,471 0,334 0,467
0,098 0,078 0,157 0,216 0,078 0,126
Selisih jam ke‐ (0‐24) (µg/ml) 0,446 0,329 0,117 ‐0,211 ‐0,164 0,103 1,034 0,986 1,250 1,144 1,079 1,099 0,692 0,513 1,540 1,049 1,250 1,009 0,594 0,373 0,677 0,761 0,669 0,615 ‐0,021 ‐0,330 0,186 ‐0,330 0,206 ‐0,058 ‐0,351 ‐0,268 ‐0,433 ‐0,248 ‐0,289 ‐0,318 ‐0,510 ‐0,471 ‐0,216 ‐0,255 ‐0,255 ‐0,341
Mean ± SD (µg/ml)
0,103 ± 0,291
1,099 ± 0,103
1,009 ± 0,415
0,615 ± 0,147
‐0,058 ± 0,264
‐0,318 ± 0,075
‐0,341 ± 0,138
39
Tabel 4. Data Penurunan Kadar MDA pada Serum Darah Tikus Setelah Perlakuan dengan Dosis Berulang Kadar x fp (µg/ml) pada kelompok
1
Parafin cair (p.o)
2 3 4 5
Rata‐rata
1
CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o)
2 3 4 5
Rata‐rata
1
CCl4 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5% (p.o)
2 3 4 5
Rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB (p.o) Rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 2,5 g/KgBB (p.o) Rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o) Rata‐rata
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1
Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o)
2 3 4 5
Rata‐rata
jam ke‐
No HU
0
48
0,305 0,047 0,188 0,493 0,305 0,268 0,070 0,235 0,164 0,329 0,258 0,211 1,094 1,317 0,536 0,603 0,670 0,844 0,536 0,737 0,491 0,446 0,558 0,554 0,516 0,598 0,454 0,557 0,454 0,516 0,454 0,413 0,578 0,413 0,474 0,466 0,608 0,549 0,373 0,471 0,334 0,467
0,164 0,423 0,235 0,164 0,235 0,244 1,550 1,744 1,880 1,512 1,589 1,655 2,054 2,031 2,254 1,942 2,121 2,080 0,545 0,604 0,565 0,350 0,526 0,518 0,248 0,413 0,227 0,186 0,248 0,264 0,433 0,186 0,144 0,248 0,103 0,223 0,687 0,628 1,511 0,235 0,608 0,734
Selisih jam ke‐(0‐48) (µg/ml)
‐0,141 0,376 0,047 ‐0,329 ‐0,070 ‐0,023 1,480 1,509 1,716 1,183 1,331 1,444 0,960 0,714 1,719 1,339 1,451 1,237 0,009 ‐0,133 0,074 ‐0,096 ‐0,032 ‐0,036 ‐0,268 ‐0,186 ‐0,227 ‐0,371 ‐0,206 ‐0,252 ‐0,021 ‐0,227 ‐0,433 ‐0,165 ‐0,371 ‐0,243 0,078 0,078 1,138 ‐0,235 0,275 0,267
Mean ± SD (µg/ml)
‐0,024 ± 0,261
1,444 ± 0,200
1,237 ± 0,399
‐0,036 ± 0,082
‐0,252 ± 0,74
‐0,243 ± 0,165
0,267 ± 0,520
40
1.6000 1.4000 1.2000
kadar MDA (nmol/µl)
1.0000 0.8000 0.6000
Dosis tunggal
0.4000
Dosis berulang
0.2000 0.0000 ‐0.2000
I
II
III
IV
V
VI
VII
‐0.4000 ‐0.6000
Kelompok
Gambar 9. Grafik Selisih Kadar MDA pada Jam ke-24 dan Jam ke-48 Setelah Pemberian Dosis Tunggal dan Dosis Berulang pada Setiap Kelompok Keterangan : Kelompok I Kelompak II Kelompoki III Kelompok IV Kelompok V Kelompok VI Kelompok VII
: kontrol normal (parafin cair) per oral : kontrol toksik (karbon tetraklorida 11,2 % (v/v)) per oral : kontrol negatif (karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5%) per oral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 1,25 g/KgBB per oral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 2,5 g/KgBB peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 5 g/KgBB per oral : ekstrak etanol 70% daun salam 5 g/KgBB per oral
Pada tabel 3, tabel 4 dan gambar 9, jelas terlihat adanya kenaikan kadar MDA setelah diinduksi dengan CCl4 11,2 % (v/v) dibanding dengan kontrol normal. Dari tabel tersebut dapat pula dilihat adanya penurunan kadar MDA darah setelah pemberian sediaan uji. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan dengan sediaan
41
ekstrak etanol 70% daun salam memiliki efek menurunkan kadar MDA dalam darah tikus putih jantan. Data kadar MDA yang diperoleh diuji statistik dengan SPSS 12.0 for Windows. Uji yang dilakukan pertama kali adalah uji distribusi data dengan metode Kolmogorof-Smirnov. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah sampel terdistribusi normal atau tidak. Hasil uji ini menunjukkan bahwa data hasil penelitian terdistribusi secara normal dengan nilai p = 0,217 (untuk dosis tunggal) dan pada dosis berulang tidak terdistribusi normal dengan nilai p = 0,011 pada taraf kepercayaan 95%. Selanjutnya dilakukan uji homogenitas dan diperoleh hasil dengan harga Levene statistic sebesar 4,141 dan 2,459 dan signifikansi 0,004 dan 0,049 sehingga data tersebut tidak homogen karena syarat homogen p > 0,05. Oleh karena itu, agar data tersebut terdistribusi secara homogen maka data kadar MDA dalam darah ditransformasikan dalam bentuk kuadrat kadar, kemudian diuji kembali dan diperoleh hasil bahwa data tersebut tidak terdistribusi normal dengan nilai p1 = 0,021 dan p2 = 0,000 (p > 0,05) dan variannya juga tidak homogen dengan harga Levene statistic sebesar 7,400 dan 6,168 dan p1 = p2 = 0,000 (p < 0,05). Hasil uji statistiknya dapat dilihat pada lampiran 10. Karena data selisih kadar MDA tidak terdistribusi normal dan tidak homogen maka dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis dengan p = 0,000 (untuk dosis tunggal) dan p = 0,000 (untuk dosis berulang) yang berarti bahwa ada 1 atau lebih kelompok yang berbeda secara signifikan. Untuk mengetahui kelompok mana yang mempunyai perbedaan signifikan dilakukan uji Mann-Whitney. Data selisih kadar MDA dengan uji Mann-Whitney dapat dilihat pada tabel 5.
42
Tabel 5. Hasil Uji Mann-Whitney Data Selisih Kadar MDA Nilai p Kelompok I II III IV V VI VII 0,009* 0,009* 0,016* 0,421 0,009* 0,009* I 0,009* 0,009* 0,841 0.095 0,117 0,310 0,834 0,009* 0,009* 0,009* 0,009* II 0,465 0,009* 0,009* 0,009* 0,009* 0,117 0,009* 0,009* 0,009* III 0,009* 0,009* 0,009* 0,028* 0,009* 0,009* 0,009* IV 0,009* 0,047* 0,116 0,173 0,172 V 0,916 0,047* 0,917 VI 0,047* VII Keterangan :
* Kelompok I Kelompak II Kelompok III Kelompok IV Kelompok V Kelompok VI Kelompok VII
: pemberian ekstrak etanol 70% Daun Salam dosis tunggal : pemberian ekstrak etanol 70% Daun Salam dosis berulang : berbeda signifikan (p < 0,05) : kontrol normal (parafin cair) peroral : kontrol toksik (karbon tetraklorida 11,2 % (v/v)) peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5% peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 1,25 g/KgBB peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 2,5 g/KgBB peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 5 g/KgBB peroral : ekstrak etanol 70% daun salam 5 g/KgBB peroral
Pada hasil uji statistik terlihat bahwa terjadi peningkatan kadar MDA pada kelompok II (kontrol toksik) dengan signifikansi sebesar 0,009 terhadap kontrol normal (parafin cair) untuk dosis tunggal dan dosis berulang. Hal ini berarti bahwa pemberian karbon tetraklorida dosis 11,2 % (v/v) dapat mengakibatkan toksik pada jam ke-24 dan jam ke-48, Hal ini juga didukung oleh penelitian sebelumnya yang
43
menyebutkan bahwa CCl4 dapat menyebabkan toksisitas pada hati dengan konsentrasi 11,2 % (v/v) (Rosnalini, 1995). Pada uji statistik kelompok II (kontrol toksik) dan kelompok III (kontrol negatif) didapat hasil berbeda tidak signifikan dengan p = 0,834 (pada jam ke-24) dan p = 0,465 (pada jam ke-48). Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa pemberian CMC Na 0,5% tidak dapat menurunkan kadar MDA darah atau dengan kata lain CMC Na 0,5% tidak memiliki efek antioksidan. Pada jam ke-24, uji statistik untuk kelompok III dengan kelompok IV (ekstrak dosis 1,25 g/KgBB) belum menunjukkan adanya penurunan kadar MDA (p = 0,117), sedangkan dengan kelompok V (ekstrak dosis 2,5 g/KgBB) dan kelompok VI (ekstrak dosis 5,0 g/KgBB) menunjukkan penurunan yang berbeda signifikan dengan p = 0,009 untuk masing-masing kelompok. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun salam dosis 2,5 g/KgBB dan dosis 5,0 g/KgBB dapat menurunkan kadar MDA dalam darah. Ekstrak etanol 70% daun salam pada jam ke24 memiliki aktivitas antioksidan. Hal ini terlihat dari uji statistik yaitu pada kelompok IV (ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB), V (ekstrak etanol 70% daun salam dosis 2,5 g/KgBB) dan VI (ekstrak etanol 70% daun salam dosis 5,0 g/KgBB) yang mampu menurunkan kadar MDA dengan signifikansi masing-masing p1 = p2 = p3 = 0,009 dibandingkan dengan kelompok II. Pada tabel 5 terlihat bahwa dosis pemberian ekstrak yang paling optimal pada jam ke-24 adalah ekstrak etanol 70% daun salam dosis 2,5 g/KgBB, karena memiliki efek menurunkan kadar MDA yang setara dengan dosis 5,0 g/KgBB, jadi dipilih dosis yang lebih rendah.
44
Pada jam ke-48, uji statistik untuk kelompok III dengan kelompok IV (ekstrak dosis 1,25 g/KgBB), kelompok V (ekstrak dosis 2,5 g/KgBB) dan kelompok VI (ekstrak dosis 5,0 g/KgBB) menunjukkan penurunan kadar MDA yang berbeda signifikan (p = 0,009) dibandingkan kelompok III. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun salam dosis 1,25 g/KgBB, 2,5 g/KgBB dan dosis 5,0 g/KgBB dapat menurunkan kadar MDA dalam darah. Ekstrak etanol 70% daun salam yang diberikan selama 2 hari pada jam ke-48 juga memiliki aktivitas antioksidan. Hal ini terlihat dari uji statistik yaitu pada kelompok IV (CCl4 dosis toksik + ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB), V (ekstrak etanol 70% daun salam dosis 2,5 g/KgBB) dan VI (ekstrak etanol 70% daun salam dosis 5,0 g/KgBB) yang mampu menurunkan kadar MDA dengan signifikansi masing-masing 0,009 dibandingkan dengan kelompok II. Pada tabel 5 terlihat bahwa dosis pemberian ekstrak yang paling optimal pada jam ke-48 adalah ekstrak etanol 70% daun salam dosis 2,5 g/KgBB, karena memiliki efek menurunkan kadar MDA yang setara dengan dosis 5,0 g/KgBB, jadi dipilih dosis yang lebih rendah. Dari hasi uji statistik jam ke-24 terlihat bahwa pemberian ekstrak etanol 70% daun salam tanpa pemberian CCl4 dapat menurunkan kadar MDA secara signifikan (p = 0,009) terhadap kontrol normal. Pada jam ke-48 ekstrak etanol daun salam tanpa pemberian CCl4 tidak bersifat toksik (p = 0,310). Data selanjutnya yang dianalisis adalah data persentase penurunan kadar MDA terhadap kontrol toksik yang dapat dilihat pada tabel 6 dan 7.
45
Tabel 6. Persentase Penurunan Kadar MDA Setelah Diberi Ekstrak Dosis Tunggal Selisih kadar MDA jam ke‐ (0‐24) (µg/ml)
% penurunan
1
0,692
37,03%
2
0,513
53,28%
1,540
‐40,17%
1,049
4,52%
5
1,250
‐13,76%
rata‐rata
1,009
8,18%
1
0,594
45,98%
2
0,373
66,04%
0,677
38,37%
0,761
30,77%
5
0,669
39,15%
rata‐rata
0,615
44,06%
1
‐0,021
101,88%
2
‐0,330
130,04%
0,186
83,11%
‐0,330
130,04%
5
0,206
81,23%
rata‐rata
‐0,058
105,26%
1
‐0,351
131,91%
2
‐0,268
124,40%
‐0,433
139,42%
‐0,248
122,53%
5
‐0,289
126,28%
rata‐rata
‐0,318
128,91%
NO HU
3 4
3 4
3 4
3 4
Kelompok
CCl4 11,2 % (v/v)+ CMC Na o,5% (p.o)
CCl4 11,2 % (v/v)+ Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB (p.o)
CCl4 11,2 % (v/v)+ Ekstrak dosis 2,5 g/KgBB (p.o)
CCl4 11,2 % (v/v)+ Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o)
Mean ± SD (%)
8,18 ± 0,377
44,06 ± 0,134
105,26 ± 0,240
128,91± 0,068
46
Tabel 7. Persentase Penurunan Kadar MDA Setelah Diberi Ekstrak Dosis Berulang Selisih kadar MDA (µg/ml) jam ke‐(0‐48)
% penurunan
1
0,960
33,52%
2
0,714
50,53%
1,719
‐19,05%
1,339
7,24%
5
1,451
‐0,49%
rata‐rata
1,237
14,35%
1
0,009
99,34%
2
‐0,133
109,21%
0,074
94,90%
‐0,096
106,65%
5
‐0,032
102,24%
rata‐rata
‐0,036
102,47%
1
‐0,268
118,57%
2
‐0,186
112,86%
‐0,227
115,72%
‐0,371
125,72%
5
‐0,206
114,29%
rata‐rata
‐0,252
117,43%
1
‐0,021
101,43%
2
‐0,227
115,72%
‐0,433
130,00%
‐0,165
111,43%
5
‐0,371
125,72%
rata‐rata
‐0,243
116,86%
NO HU
3 4
3 4
3 4
3 4
Kelompok
CCl4 11,2 % (v/v) + CMC Na o,5% (p.o)
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB (p.o)
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 2,5 g/KgBB (p.o)
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o)
Mean ± SD (%)
14,35 ± 0,277
102,47 ± 0,057
117,43 ± 0,051
116,86 ± 0,114
47
Tabel 8. Hasil Uji Statistik Data Persentase Penurunan Kadar MDA Kelompok
Nilai p IV V 0,148 0,002* 0,000* 0,000* 0,048* 0,126
III
III IV
V
VI 0,000* 0,000* 0,001* 0,075 0,093 0,777
VI
Keterangan :
* Kelompok III Kelompok IV Kelompok V Kelompok VI
: pemberian ekstrak etanol 70% daun Salam dosis tunggal (jam ke-24) : pemberian ekstrak etanol 70% daun Salam dosis berulang (jam ke-48) : berbeda signifikan (p < 0,05) : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5% peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 1,25 g/KgBB peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 2,5 g/KgBB peroral : karbon tetraklorida 11,2 % (v/v) + ekstrak etanol 70% daun salam 5 g/KgBB peroral
Pada uji statistik data persentase penurunan kadar MDA tampak bahwa pada jam ke-24 ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB belum mampu menurunkan kadar MDA secara signifikan dibandingkan kelompok III (p = 0,148). Ekstrak etanol daun salam dosis 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB memiliki efek antioksidan. Dosis yang paling optimal pada jam ke-24 adalah 5,0 g/KgBB, karena persentase penurunannya paling besar dibandingkan ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB dan 2,5 g/KgBB. Pada jam ke-48, ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB, 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB dapat menurunkan kadar MDA secara signifikan (p = 0,000) dibandingkan kontrol negatif. Hal ini membuktikan bahwa ekstrak etanol 70%
48
daun salam dosis 1,25 g/KgBB, 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB memiliki efek antioksidan. Dosis optimal pada jam ke-48 adalah ekstrak etanol 70% daun salam dosis 1,25 g/KgBB karena mampu menurunkan kadar MDA setara dengan ekstrak etanol 70% daun salam dosis2,5 g/KgBB dan dosis 5,0 g/KgBB. Mekanisme penurunan kadar MDA pada penelitian ini belum diketahui secara pasti. Menurut Fuhrman dan Aviram (2007), antioksidan fenolik (salah satunya flavonoid) dapat menghambat peroksidasi lipid melalui donasi atom H kepada radikal peroksil (ROO●) dan menghasilkan suatu bentuk alkil/aril hidroperoksida. Mekanismenya dapat digambarkan sebagai berikut: ROO● + PPH (Phenolic Antioxidant)
ROOH + PP●
Radikal polifenol fenoksil (PP●) yang dihasilkan dari reaksi tersebut dapat distabilkan melalui donasi dari atom H dan membentuk suatu senyawa quinolon, atau bereaksi dengan radikal lain, misalnya radikal polifenol fenoksil lain (Fuhrman and Aviram, 2007).
BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan Berdasarkan data hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa: 1. Ekstrak etanol 70 % daun salam (Syzygium polyanthum Wight) dosis 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB pada pemberian dosis tunggal mempunyai efek antioksidan pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida 11,2% (v/v). 2. Ekstrak etanol 70 % daun salam (Syzygium polyanthum Wight) dosis 1,25 g/KgBB, 2,5 g/KgBB dan 5,0 g/KgBB pada pemberian dosis berulang memiliki besar efek antioksidan yang sama (p > 0,05) pada serum darah tikus putih jantan galur Wistar yang diinduksi karbon tetraklorida 11,2% (v/v).
B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui zat aktif dalam daun salam yang bertanggung jawab terhadap penurunan kadar MDA.
49
50
DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1980, Materia Medika Indonesia, Ed IV, 109, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Ed V, 203, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Ansel, H. C., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, diterjemahkan oleh Ibrahim, Farid, Edisi 4, 607-608, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Ariyanti, R., 2007, Pengaruh Pemberian Infusa Daun Salam (Eugenia polyantha Wight) Terhadap Penurunan Kadar Asam Urat Darah Mencit Putih Jantan yang Diinduksi dengan Potasium Oxonat, Skripsi, Fakultas Farmasi, Univrsitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta. Backer, A. and Van Den Brink, B., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only), Volume I, N.V.P. The Nederlands, Noordhoff-Groningen. Dalimartha,S., 2003, Atlas Tubuhan Indonesia, jilid 2, 162- 165, Trubus Agriwidya, Jakarta. Desmarchelier, C., Mongelli, E., Loussio, J., and Ciccia, G.,1997, Inhibition of lipid peroxidation and iron (II) – dependent DNA damage by extract of Pothomorphe petalta (L.) Miq., Braz J Biol Res, 31 (9), 1163-1170. Doerge, R. F., 1982, Buku Teks Wilson and Gisvold Kimia Farmasi dan Medisinal Organik II, Edisi 8, 858, IKIP Semarang Press, Semarang. Fauci, A. S., Ginsberg, H. N.,and Golberg, I. J., 1998, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Ed XIV, 686-687, The McGraw-Hill Company Inc., USA. Fessenden, R. J., Fessenden, J. S., 1986, Kimia Organik, Jilid I, Edisi III, 223-226, 238-240, diterjemahkan oleh A.H. Pudjaatmaka, Airlangga, Jakarta.
51
Fuhrman and Aviram, 2007, Polyphenols, Flavonoids and LDL Protection, Edisi II dalam : E. Cadenas and L. Packer, Handbook of Antioxidant, Taylor and Francis, California. Gordon, 1990, The Mechanism of Antioxidant Action In Vitro, dalam: B.J.F. Hudson, Food Antioxidant, Elisivier, Science Pulisher, London. Halliwell, B., Aeschbach, R., and Aurona, O.I., 1995, The Caracterization of Antioxidant, Food Chem Toxic, Vol.33, No.7: 601-617. Halliwell, B and Gutteridge, J.M.C, 2000, Free Radical in Biology and Medicine, Oxford Univercity Press, New York. Han, S. S., Lo. S. C., Choi, Y, W., Kim, J. H., and Baek, S. H., 2004, Antioxidant Activity of Crude Extract and Pure Compounds of acer ginnala Max., Bull. Korean Chem. Soc., Vol.25, no.3, 389. Hodgson, E., and Levi, P. E., 2002, A Textbook of Modern Toxicology, 2nd edition, 199-203, McGraw-Hill Companies Inc., USA. Javanmardi, J., Stushnoff, C., Lockeb, E., Vivanedo, J. M., 2003, Antioxidant activity and Total Phenolic content of Iranion Ocimum accessions, J. Food Chem., 83, 547-550. Josephy, P., David, 1997, Molecular Toxicology, 99-103, Oxford University Press, New York. Khlifi, S., Hachimi, Y., Khalil, A., Essafi, N., and Abboyi, A., 2005, In vitro antioxidant effect of Globularia alypim L, hydromethanolic extract, Indian Journal of Pharmacology, vol 2. Karyadi, E., 1997, Antioksidan : Resep Sehat dan Umur Panjang (online), (http://www.Indomedia.com/intisari/1997/judii, antioks.htm, diakses 7 Juli 2007). Kikuzaki. H., Hisamoto, M., Hirose, K., Akiyama., and Taniguchi, H., 2002, Antioxidant Properties of Ferulic Acid and Its Related Compounds, J. Agric. Food Chem., 50: 2161-2168. Klassen, C. D., 2001, Goodman and Gilman: The Pharmalogical Basic of Therapeutic 2nd edition, 1884-1885, McMillan Publishing Co, Inc New York. Middleton, E., Kandaswani, C., Theonaris, L., 2000, The Effect of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implication For Inflamation, Heart Disease & Cancer, 711-722, Pharmacological Reurelus, Vol.52, No.4.
52
Pokorni, J., Yanishlieva, N., and Gordon, M., 2001, Antioxidant in food, Practical Applications, CRC Press, New York. Poormorad, F., Hosseinimehr, S. J., Shahabimajd, N., 2006, Antoxidant Activity , Phenol and Flavonoid Contents of Some Selected, Iranian Medicinal Plants, African Journal of Biotechnology, Vol.5 (II), pp. 1142-1145. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Jilid 6, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 191 – 193, ITB press, Bandung Rosnalini, 1995, Optimasi Dosis Hepatoprotektor Kurkuminoid pada Tikus Terangsang Karbon Tetraklorida, Galaktosiamin dan Parasetamol, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Sandritter, W., and Thomas, C., 1988, Histologi Buku Teks dan Atlas untuk Pelajaran Patologi Umum dan Khusus. Edisi 10, 160, diterjemahkan oleh H. Tonang dkk. EGC, Jakarta. Sibuea, P., 2004. Antioksidan : Senyawa Ajaib Penangkal Penuaan Dini, (online), (http://www.sinar harapan .co.id/Iptek/kesehatan.htm, diakses 7 Juli 2007). Studiawan, H., 2004, Uji Aktivitas Penurunan Kadar Glukosa Darah Ekstrak Daun Eugenia polyantha Pada Tikus dengan Metode Aloksan, jurnal Medika Eksata, Vol 5 No.3, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. Soedarsono et al, 2002, Tumbuhan Obat Jilid II, 174, Pusat Studi Obat Tradisional, Yogyakarta Tjitrosoepomo, G., 2002, Taksonomi Tumbuhan, 211, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Utami, W., Da’i, M., dan Sofiana, Y., R., 2005, Aktivitas Penangkap Radikal Bebas Dengan Metode DPPH Serta Penetapan Kandungan Fenol dan Flavonoid dalam Ekstrak Kloroform, Ekstrak Etil Asetat, Ekstrak Kloroform Daun Dewandaru, 5-9, Majalah Pharmacon, Vol 6 No. 1, Jakarta. Valequez, E. L., Tournier, H. A., and Saavedra, G., 2003, Antioxidant Activity of Paraguayan Plant Extracks, Fitoterapia, Vol 74, 91-97, Paraguay. Voight, R., 1984, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, diterjemahkan oleh Soewandi, S.N., Edisi 5, 564, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Wang. S., Chang, H., Lin, K., Lo, C., Yang, N., Shyur, L., 2003 Antioxidant Properties and Phytochemicals Characteristics of Extracts from Lactuca Indica, J. Agric. Food Chem., 51, p. 1506-1512.
53
Wills, E. D, 1987, Biochemical Toxicology, a practical approach, IRL Press Limited, England. Winarsi, H., 2005, Isoflavon; Berbagai Sumber, Sifat dan Manfaatnya pada Penyakit Degeneratif, Cetakan Pertama, Hal.38, UGM Press, Yogyakarta. Windono, T., Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita, A., dan Erawati, T.I., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1, 1- Diphenyl-2picrilhidrazil (DPPH) dai Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis liniferol) Probolinggo Biru dan Bali, Artikel Hasil Penelitian, Artocarpus, Vol 1 no.1, Fakultas Farmasi UNAIR, Surabaya, hal 34-43. Zimmerman, H. J., 1978, Hepatotoxicity, 56, 198-208, Aplleton Century Croffts, New York.
54
Lampiran 1. Surat Keterangan Tikus Putih Jantan Galur Wistar
55
Lampiran 2. Surat Keterangan Hasil Determinasi Tanaman Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.)
56
Salam (Syzygium polyanthum [Wight] Walp.)
Klasifikasi
:
Divisio
: Spermatophyta
Sub Divisio
: Angiospermae
Classis
: Dicotyledoneae
Sub Classis
: Dialypetalae
Ordo
: Myrtales
Familia
: Myrtaceae
Genus
: Syzygium
Spesies
: Syzygium polyanthum Wight
Deskripsi : Pohon atau perdu, daun tunggal, bersilang berhadapan, pada cabang – cabang mendatar seakan – akan terusun dalam 2 baris pada 1 bidang. Kebanyakan tanpa daun penumpu. Bunga kebanyakan banci, kelopak dan mahkota masing – masing terdiri atas 4 – 5 daun kelopak dan sejumlah daun mahkota yang sama, kadang – kadang berlekatan. Benang sari banyak, kadang – kadang berkelopak berhadapan dengan daun – daun mahkota. Mempunyai tangkai sari dengan warna cerah, kadang – kadang menjadi bagian bunga yang paling menarik. Bakal buah tenggelam, mempunyai 1 tangkai putik, beruang 1 sampai banyak dengan 1-8 bakal biji dalam tiap ruang. Biji dengan sedikit atau tanpa endosperm, lembaga lurus, bengkok atau melingkar.
Kunci Determinasi : 1b_2b_3b_4b_12b_13b_14b_17b_18b_19b_20b_21b_22b_23b_24b_25b_26b__27b _799b_800b_801b_802a_803b_804b_805c_806b_807a_808c_809b_810b_811a_812 b_815b_816b_818b_820b_821b_822b_824b_825b_826b_829b_830b_831b_832b_8 33b_834a_835b_983b_984b_986b_991b_992b_993b_994b_995d_1036c_1038b___ ___________________________________ Myrtaceae
57
1a_2b_3b_7b_8b_9b_10b______________ Syzygium 1b_7b_8b_11a_12b___________________ Syzygium polyanthum Wight ¼ Familia : Myrtaceae ¼ Genus : Syzygium ¼ Spesies : Syzygium polyanthum Wight
Sumber : Backer, A. and Van Den Brink, B., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only), Volume I, N.V.P. The Nederlands, Noordhoff-Groningen.
58
Lam mpiran 3. Volume P Pemberia an Sediaa an Uji
11. Optim masi waktuu pembenttukan tokssik No o
Kelompok
Be erat HU (g)
Vol pemb berian (ml)
171,5
4 4,29
143
3,56
3
218
5,45
1
229
5,73
187
4 4,68
165,5
4 4,14
1 2
2
Parrafin cair (p.o)
CCl4 2 2,8 ml/KgBB B (p.o)
3
22. Optim masi waktuu pemberiaan ekstrak k
No o
Kelompok
1 1 2 2
CCl4 4 2,8 ml/K KgBB (p.o)
3 3 1 1 2 2 3 3
ekkstrak 1 jaam sebelum CCl4 4 2,8 ml/KgBB B
1 1 2 2
ekstrak bersamaan CCl4 4 2,8 ml/K KgBB
3 3 1 1 2 2 3 3
ekkstrak 1 jaam settelah CCl4 4 2,8 ml/KgBB B
33. Uji Uttama
Be erat HU (gg)
Vol pem mberian (m ml)
181
4,,52
167
4,175
152
3 3,8
167
4,,18
178
4,,45
173.5
4,,34
167
4,,51
158,5
3,,96
157
3,,93
131,1
3,,33
132,5
3,,31
141
3,,53
59
No
Kelompok
BB (g)
Vol pemberian (ml)
1
202
5,05
2
235
5,875
176
4,4
4
167
4,175
5
181
4,525
1
172
4,3
183
4,575
148
3,7
4
147,5
3,69
5
189,5
4,74
3
Paraffin cair p.o
2 3
CCl4 2,8 ml/KgBB p.o
1 2 3 4
CCl4 2,8 ml/KgBB p.o + CMC Na 0,5%
5 1 2 3 4
CCl4 2,8 ml/KgBB p.o + ekstrak dosis 1,25 g/KgBB
5 1 2 3 4
CCl4 2,8 ml/KgBB p.o + ekstrak dosis 2,5 g/KgBB
5 1 2 3 4
CCl4 2,8 ml/KgBB p.o + ekstrak dosis 5,0 g/KgBB
BB (g)
CCl4
CMC Na
164,5
4,11
2,06
153
3,83
1,91
167
4,18
2,08
175
4,38
2,19
168
4,2
2,1
BB (g)
CCl4
Ekstrak
160
4
2
173,5
4,34
2,17
146
3,65
1,83
159,5
3,99
1,99
151
3,78
1,89
BB (g)
CCl4
Ekstrak
178,5
4,46
2,23
145
3,63
1,81
164
4,1
2,05
169
4,23
2,11
169
4,23
2,11
BB (g)
CCl4
Ekstrak
159
3,98
1,99
136
3,4
1,7
154,5
3,86
1,93
135
3,38
1,69
5
143
3,58
1,79
1
182
4,55
150,5
3,76
126
3,15
4
122
3,05
5
134
1,68
2 3
ekstrak dosis 5,0 g/KgBB
Lampiran 4. Perhitungan Kadar MDA
60
1, 1, 3, 3-tetrametoksipropan = (CH3O)2CHCH2CH(OCH3)2 , 99% BM = 164 d = 0,997 x 10-3 g/ml v = 100 ml Larutan stok 1, 1, 3, 3-tetrametoksipropan Volume pengambilan = 1,24 µl ad 150 ml = 1,24 x 10-3 ml ad 150 ml Misal: Konsentrasi larutan stok = C2 V1 x C1 = V2 x C2 1,24 x 10-3 ml x 99% (b/v)
= 150 ml x C2
C2 = 8,184 x 10-4 % (b/v) = 8,184 x 10-4 g/100ml = 818,4 µg/100ml = 8,184 µg/ml Misal: Konsentrasi MDA = x BM MDA = Konsentrasi MDA BM tetrametoksipropan Konsentrasi tetrametoksipropan 72/164 = x/8,184 µg/ml x = 3,593 µg/ml
61
Pembuatan kurva baku 1. Volume pengambilan MDA = 0 µl Volume pengambilan H2O = 2000µl = 2 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0 x 3,593 µg/ml x fp = 0 µg/ml 2. Volume pengambilan MDA = 5 µl = 0,005 ml Volume pengambilan H2O = 1995µl = 1,995 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,005 ml/5 ml x 3,593 µg/ml = 0,0036 µg/ml 3. Volume pengambilan MDA = 10 µl = 0,010 ml Volume pengambilan H2O = 1990µl = 1,99 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,010 ml/5 ml x 3,593 µg/ml = 0,0072 µg/ml 4. Volume pengambilan MDA = 20 µl = 0,020 ml Volume pengambilan H2O = 1980µl = 1,98 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,020 ml/5 ml x 3,593 µg/ml = 0,0144 µg/ml 5. Volume pengambilan MDA = 40 µl = 0,040 ml Volume pengambilan H2O = 1960 µl = 1,97 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,040 ml/2 ml x 3,593 µg/ml = 0,288µg/ml
62
6. Volume pengambilan MDA = 80 µl = 0,080 ml Volume pengambilan H2O = 1920µl = 1,92 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,080 ml/2 ml x 3,593 µg/ml = 0,0576 µg/ml 7. Volume pengambilan MDA = 160 µl = 0,160 ml Volume pengambilan H2O = 1840µl = 1,84 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,160 ml/2ml x 3,593 µg/ml = 0,1152 µg/ml 8. Volume pengambilan MDA = 320 µl = 0,320 ml Volume pengambilan H2O = 1680µl = 1,68 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,320 ml/2 ml x 3,593 µg/ml = 0,2304 µg/ml 9. Volume pengambilan MDA = 640 µl = 0,640 ml Volume pengambilan H2O = 1360 µl = 1,36 ml Volume pengambilan TCA = 1 ml Volume pengambilan TBA = 2 ml Konsentrasi MDA = 0,640 ml/2 ml x 3,593 µg/ml = 0,4608 µg/ml
63
Lampiran 5. Hasil Uji Pendahuluan 1. Hasil penetapan panjang gelombang maksimum Panjang Gelombang maksimum (nm) 480
Absorbansi 0,010
490
0,095
500
0,156
510
0,208
520
0,271
530
0,255
540
0,143
550
0,084
560
0,045
570
0,008
2. Hasil penentuan operating time
Menit
Absorbansi
5
0,252
10
0,245
15
0,265
20
0,160
25
0.259
30
0,247
35
0,247
40
0,242
45
0,236
50
0,333
64
Lampiran 6. Data Kurva Baku Vol, pengambilan H2O (µl) 2000
5
1995
10
1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
kadar (µg/ml)
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
17 apr
A 0 0,005 0,007 0,046 0,055 0,084
A
Vol, pengambilan MDA (µl) 0
0.8 0.6 0.4 0.2 0
y = 1.365x + 0.004 R² = 0.996
A Linear (A) 0
0,142
0.5 kadar
0,312 0,64
Kurva baku: Y = 1,365x + 0,004 kelompok 1 (n = 1)
Paraffin cair (p.o)
kelompok 2 (n = 3)
CCl4 2,8ml/KgBB (p,o)
Jam ke‐ 0 12 24 36 48 60
A
Kadar x fp (µg/ml)
0,021 0,023 0,029 0,019 0,021 0,024
0.311 0.348 0.457 0.275 0.311 0.367
Jam ke‐ 0
A 0,019
12
0,044
24
0,051
36
0,040
48
0,094
60
0,045
HU 1 Kadar x fp r(µg/ml)
Contoh perhitungan: Kelompok 1 jam ke-0 Î A = 0,021 Y = 1,365x + 0,004 0,021 = 1,365x + 0,004 x = 0,013 µg/ml kadar MDA = x . fp = 0,013 µg/ml x 25 = 0,311 µg/ml
0.275 0.734 0.860 0.659 1.648 0.752
A 0,021 0,039 0,042 0,037 0,097 0,029
HU 2 Kadar x fp (µg/ml)
0.311 0.641 0.695 0.605 1.702 0.457
A 0,023 0,028 0,052 0,043 0,093 0,040
HU 3 Kadar x fp (µg/ml)
0.348 0.440 0.878 0.713 1.630 0.659
65
Vol, pengambilan H2O (µl)
0 5 10 20 40 80 160 320 640
2000 1995 1990 1980 1960 1920 1840 1680 1360
kadar (µg/ml)
A
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
0 0,005 0,008 0,028 0,049 0,072 0,133 0,249 0,507
18 apr absorbansi
Vol, pengambilan MDA (µl)
y = 1.082x + 0.006 R² = 0.998
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
A Linear (A) 0
0.2
0.4
0.6
kadar
Kurva baku: Y = 1,082 x + 0,006 No HU 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Kelompok
Absorbansi
Kadar x fp
Mean ± SD
(µg/ml) 0,087
CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o)
0,098 0,076
Ekstrak 1 jam sebelum CCl4 2,8 ml/KgBB (p,o)
0,089
Ekstrak bersamaan CCl4 2,8 ml/KgBB (p,o)
0,049
Ekstrak 1 jam setelah CCl4 2,8 ml/KgBB (p,o)
0,053
0,110 0,067
0,022 0,029
0,075 0,181
1,872 2,126 1,617 1,918 2,403 1,409 0,994 0,370 0,531 1,086 1,594 4,043
1,871 ± 0,254
1,910 ± 0,497
0,631 ± 0,324
2,241 ± 1,581
Contoh perhitungan: Kelompok CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o) HU 1 Î A = 0,087 Y = 1,082x + 0,006 0,087 = 1,082x + 0,006 x = 0,075 µg/ml Kadar MDA = x . fp = 0,075 µg/ml x 25 = 1,872 µg/ml
66
Vol, pengambilan H2O (µl) 2000
5
1995
10
1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
kadar (µg/ml)
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
8 Mey
A
0 0,009 0,034 0,044 0,051 0,094 0,165 0,276 0,502
Absorbansi
Vol, pengambilan MDA (µl) 0
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
A Linear (A) 0
hasil 0
kelompok A
Kadar x fp
24 A
(µg/ml) 0,034
0,305
0,053
2
0,023
0,047
0,037
0,029
0,188
0,042
3 4
48 A
(µg/ml)
1
Parafin cair (p,o)
Kadar x fp
Kadar x fp (µg/ml)
0,751
0,028
0,164
0,376
0,039
0,423
0,034
0,305
0,031
0,235
0,493
0,033
0,282
0,028
0,164
5
0,034
0,305
0,027
0,141
0,031
0,235
Rata‐ rata
0,268
0,371
0,244
1
0,024
0,070
0,031
0,235
0,028
0,164
0,035
0,329
5
0,032
0,258
rata‐ rata
0,211
2 3 4
CCl4 2,8 ml/KgBB (p,o)
0.2
0.4 kadar
Kurva baku: Y = 1,065x + 0,021 No HU
Contoh perhitungan: Kelompok Parafin cair (p.o)HU 1 Î A = 0,034 Y = 1,065x + 0,021 0,034 = 1,065x + 0,021 x = 0,012 µg/ml . Kadar MDA = x . fp = 0,012 µg/ml x 25 = 0,305 µg/ml
y = 1.065x + 0.021 R² = 0.992
0.6
67
Vol, Vol, kadar pengambilan pengambilan (µg/ml) MDA (µl) H2O (µl) 0 2000 0 1995 1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
9 Mey
0 0,006 0,008 0,03 0,055 0,06 0,15 0,298 0,599
0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
y = 1.290x + 0.002 R² = 0.998
0.8 absorbansi
5 10
A
0.6 0.4
A
0.2
Linear (A)
0 0
0.2
kadar
Kurva baku: Y = 1,290 x + 0,002 hasil No HU
24
kelompok
48
Kadar x fp
1 2 3 4
CCl4 2,8 ml/KgBB (p,o)
Kadar x fp
A
(µg/ml)
A
(µg/ml)
0,059
1,105 1,221 1,415 1,473 1,337 1,310
0,082
1,105
0,092
1,221
0,099
1,415
0,08
1,473
0,084
1,337
1,310
0,065 0,075 0,078
5
0,071
rata‐rata
0.4
Contoh perhitungan: Kelompok CCl4 2,8 ml/KgBB (p.o) HU 1 Î A = 0,059 Y = 1,290x + 0,002 0,059 = 1,290x + 0,002 x = 0,044 µg/ml Kadar MDA = x . fp = 0,044 µg/ml x 25 = 1,105 µg/ml
0.6
68
Vol, pengambilan H2O (µl) 2000
5
1995
10
1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
kadar (µg/ml)
A
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
0 0,006 0,012 0,017 0,021 0,053 0,135 0,253 0,516
14 Mey 0.6 absorbansi
Vol, pengambilan MDA (µl) 0
y = 1.120x ‐ 0.001 R² = 0.998
0.4 A
0.2
Linear (A)
0 ‐0.2
0
0.2
0.4
0.6
kadar
Kurva baku: Y = 1,120x - 0,001 hasil No HU
kelompok A
1 2 3 4 5
CCl4 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5% (p,o)
0 Kadar x fp (µg/ml)
1,094
0,079
1,786
0,091
2,054
0,058
1,317
0,081
1,830
0,09
2,031
0,023 0,026
0,536
0,092 0,073
2,076
0,1 0,086
2,254
0,094
2,121 2,080
0,029
0,603
0,670 0,844
1
0,023
0,536
0,032
0,737
0,021
0,491
0,019
0,446
0,024
0,558
0,554
3 4 5 rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB
A
48 Kadar x fp (µg/ml)
0,048
rata‐rata 2
A
24 Kadar x fp (µg/ml)
0,085
1,652 1,920 1,853
Contoh perhitungan: Kelompok CCl4 11,2 % (v/v) + CMC Na 0,5% (p.o) HU 1 Î A = 0,048 Y = 1,120x - 0,001 0,048 = 1,120x - 0,001 x = 0,043 µg/ml Kadar MDA = x . fp = 0,044 µg/ml x 25 = 1,094 µg/ml
1,942
69
Vol, pengambilan H2O (µl) 2000
5
1995
10
1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
kadar (µg/ml)
A
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
0 0,006 0,01 0,016 0,026 0,063 0,141 0,284 0,593
15 Mey 0.8
y = 1.284x ‐ 0.004 R² = 0.999
0.6
absorbansi
Vol, pengambilan MDA (µl) 0
0.4
A
0.2
Linear (A)
0 ‐0.2 0
0.2 0.4 kadar
0.6
Kurva baku: Y = 1,284x - 0,004 hasil No HU
24
kelompok
48
Kadar x fp
1 2 3 4 5 rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB
Kadar x fp
A 0,054
(µg/ml) 1,129
A 0,024
(µg/ml) 0,545
0,053
1,110
0,027
0,604
0,056
1,168
0,025
0,565
0,058
1,207
0,014
0,350
0,059
1,227
0,023
0,526
1,168
0,518
Contoh perhitungan: Kelompok CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 1,25 g/KgBB HU 1 Î A = 0,054 Y = 1,284x - 0,004 0,054 = 1,285x - 0,004 x = 0,045 µg/ml Kadar MDA = x . fp = ,045 µg/ml x 25 = 1,129 µg/ml
70
Vol, pengambilan H2O (µl) 2000
5
1995
10
1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
kadar (µg/ml)
A
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
0 0,006 0,008 0,03 0,055 0,06 0,15 0,298 0,599
16 Mey y = 1.212x ‐ 0.001 R² = 0.997
0.6 absorbansi
Vol, pengambilan MDA (µl) 0
0.4 A
0.2
Linear (A)
0 ‐0.2
0
0.2 0.4 kadar
0.6
Kurva baku: Y = 1,212x - 0,001 hasil No HU
0
kelompok
24
Kadar x fp
1 2 3 4 5
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 2,5 g/KgBB (p,o)
rata‐rata 1 2 3 4 5 rata‐rata
CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p,o)
48
Kadar x fp
A 0,024
(µg/ml) 0,516
A 0,023
0,028
0,598
0,012
0,021
0,454
0,03
0,026
0,557
0,01
0,021
0,454
0,031
0,516
0,021
0,454
0,004
0,019
0,413
0,006
0,027
0,578
0,006
0,019
0,413
0,007
0,022
0,474
0,008
0,466
(µg/ml)
0,495 0,268 0,639 0,227 0,660 0,458 0,103 0,144 0,144 0,165 0,186 0,149
Kadar x fp
A 0,011
(µg/ml) 0,248
0,019
0,413
0,01
0,227
0,008
0,186
0,011
0,248
0,264
0,02
0,433
0,008
0,186
0,006
0,144
0,011
0,248
0,004
0,103
0,223
Contoh perhitungan: Kelompok CCl4 11,2 % (v/v) + Ekstrak dosis 2,5 g/KgBB (p.o) HU 1 Î A = 0,024 Y = 1,212x - 0,001 0,024 = 1,212x - 0,001 x = 0,021 µg/ml Kadar MDA = x f.p = 0.021 µg/ml x 25 = 0,516 µg/ml
71
Vol, pengambilan H2O (µl)
0
2000
5
1995
10
1990
20
1980
40
1960
80
1920
160
1840
320
1680
640
1360
kadar (µg/ml)
17 Mey
A
1
0 0,004 0,01 0,013 0,027 0,075 0,152 0,299 0,582
0 0,0036 0,0072 0,0144 0,0288 0,0576 0,1152 0,2304 0,4608
absorbansi
Vol, pengambilan MDA (µl)
y = 1.274x ‐ 0.000 R² = 0.999
0.5 A 0 ‐0.5
Linear (A) 0
0.2
0.4
0.6
kadar
Kurva baku: Y = 1,274x - 0,000 No HU 1 2 3 4 5 rata‐rata
hasil 24
0
kelompok
Kadar x fp
A 0,031 0,028 0,019 0,024 0,017
Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p,o)
(µg/ml)
A 0,005 0,004 0,008 0,011 0,004
0,608 0,549 0,373 0,471 0,334 0,467
48
Kadar x fp
Kadar x fp
A 0,035 0,032 0,077 0,012 0,031
(µg/ml) 0,098 0,078 0,157 0,216 0,078 0,126
Contoh perhitungan: Kelompok Ekstrak dosis 5,0 g/KgBB (p.o)HU 1 Î A = 0,031 Y = 1,274x - 0,000 0,031 = 1,274x - 0,000 x = 0,024 µg/ml Kadar MDA = x . fp = 0,024µg/ml x 25 = 0,608 µg/ml
(µg/ml) 0,687 0,628 1,511 0,235 0,608 0,734
72
Lampiran 7. Analisis Data Optimasi Pembentukan Toksik
Estimated Marginal Means of MDA
kelompok
1.750
parafin cair CCl4
Estimated Marginal Means
1.500
1.250
1.000
0.750
0.500
0.250 0
12
24
36
48
60
jam
kelompok 1 (n = 1)
Paraffin cair (p.o)
kelompok 2 (n = 3)
CCl4 2,8ml/KgBB (p,o)
Jam ke‐ 0 12 24 36 48 60
A
Kadar x fp (µg/ml)
0,021 0,023 0,029 0,019 0,021 0,024
0.311 0.348 0.457 0.275 0.311 0.367
Jam ke‐ 0
A 0,019
12
0,044
24
0,051
36
0,040
48
0,094
60
0,045
HU 1 Kadar x fp r(µg/ml)
0.275 0.734 0.860 0.659 1.648 0.752
A 0,021 0,039 0,042 0,037 0,097 0,029
HU 2 Kadar x fp (µg/ml)
0.311 0.641 0.695 0.605 1.702 0.457
A 0,023 0,028 0,052 0,043 0,093 0,040
HU 3 Kadar x fp (µg/ml)
0.348 0.440 0.878 0.713 1.630 0.659
73
Lampiran 8. Uji Distribusi Normal dan Homogenitas Data Kadar MDA pada Optimasi Pemberian Ekstrak
NPar Tests One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test MDA N Normal Parameters a,b Most Extreme Differences
12 .127660 .0744067 .150 .150 -.091 .520 .950
Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative
Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.
Oneway Test of Homogeneity of Variances
MDA log
Levene Statistic 6.125 2.359
df1
df2 3 3
8 8
Oneway Test of Homogeneity of Variances log Levene Statistic 2.359
df1
df2 3
8
Sig. .148
Sig. .018 .148
log 12 -.9686 .28406 .170 .121 -.170 .590 .877
74
Lampiran 9. Uji One way Anava Data Kadar MDA pada Optimasi Pemberian Ekstrak Hasil Transformasi dalam Bentuk Log
Explore ANOVA log
Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares .587 .301 .888
df 3 8 11
Mean Square .196 .038
F 5.201
Sig. .028
Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: log LSD
(I) kelompok CCl4
ekstrak 1 jam sebelum
ekstrak bersamaan
ekstrak 1 jam sesudah
(J) kelompok ekstrak 1 jam sebelum ekstrak bersamaan ekstrak 1 jam sesudah CCl4 ekstrak bersamaan ekstrak 1 jam sesudah CCl4 ekstrak 1 jam sebelum ekstrak 1 jam sesudah CCl4 ekstrak 1 jam sebelum ekstrak bersamaan
Mean Difference (I-J) -.00136 .50602* -.01220 .00136 .50737* -.01085 -.50602* -.50737* -.51822* .01220 .01085 .51822*
*. The mean difference is significant at the .05 level.
Std. Error .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833 .15833
Sig. .993 .013 .940 .993 .013 .947 .013 .013 .011 .940 .947 .011
95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -.3665 .3638 .1409 .8711 -.3773 .3529 -.3638 .3665 .1423 .8725 -.3760 .3543 -.8711 -.1409 -.8725 -.1423 -.8833 -.1531 -.3529 .3773 -.3543 .3760 .1531 .8833
75
Lampiran 10. Uji Distribusi Normal Data Kadar MDA dan Kuadrat Kadar MDA Dosis Tunggal dan Dosis Berulang One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test Kuadrat_0_24Kuadrat_0_48 selisih_0_24 selisih_0_48 35 35 35 35 .004487 .006104 .030094 .034174 .0057621 .0093950 .0607144 .0712846 .255 .359 .178 .272 .255 .359 .178 .272 -.218 -.258 -.099 -.138 1.507 2.124 1.054 1.611 .021 .000 .217 .011
N a,b Mean Normal Parameters Std. Deviation Most Extreme Absolute Differences Positive Negative Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.
Test of Homogeneity of Variances
selisih_0_24 selisih_0_48 Kuadrat_0_24 Kuadrat_0_48
Levene Statistic 4.141 2.459 7.400 6.168
df1
df2 6 6 6 6
28 28 28 28
Sig. .004 .049 .000 .000
76
Lampiran 11. Uji Kruskal Wallis dan Mann-Whitney Data Kadar MDA Dosis Tunggal dan Dosis Berulang Efek Antioksidan Ekstrak Etanol 70% Daun Salam
Descriptive Statistics N selisih_0_24 selisih_0_48 kelompok
35 35 35
Mean .030094 .034174 4.00
Std. Deviation .0607144 .0712846 2.029
Minimum -.0511 -.0434 1
Kruskal-Wallis Test Ranks selisih_0_24
selisih_0_48
kelompok kontrol normal kontrol toksik kontrol negatif ekstrak dosis I+CCl4 ekstrak dosis II+CCl4 ekstrak dosis III+CCl4 ekstrak dosis III Total kontrol normal kontrol toksik kontrol negatif ekstrak dosis I+CCl4 ekstrak dosis II+CCl4 ekstrak dosis III+CCl4 ekstrak dosis III Total Test Statisticsa,b
Chi-Square df Asymp. Sig.
selisih_0_24 29.232 6 .000
selisih_0_48 26.221 6 .000
a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: kelompok
N 5 5 5 5 5 5 5 35 5 5 5 5 5 5 5 35
Mean Rank 16.60 30.70 29.30 23.80 12.20 6.60 6.80 14.80 31.20 29.40 16.20 6.80 7.80 19.80
Maximum .1540 .1719 7
77
Kelompok 1 Vs 2 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 1 Vs 3 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 1 Vs 4 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 1.000 16.000 -2.402 .016 .016
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 11.000 26.000 -.313 .754 a
.841
a
78
Kelompok 1 vs 5 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 8.000 23.000 -.943 .346 .421
selisih_0_48 4.000 19.000 -1.776 .076 a
.095
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 1 vs 6 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 5.000 20.000 -1.567 .117 a
.151
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 1 vs 7 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 7.000 22.000 -1.152 .249 a
.310
a
79
Kelompok 2 Vs 3 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 11.500 26.500 -.210 .834 .841
selisih_0_48 9.000 24.000 -.731 .465 a
.548
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 2 vs 4 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 2 vs 5 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
80
Kelompok 2 vs 6 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 2 Vs 7 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.619 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 3 vs 4 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 5.000 20.000 -1.567 .117 .151
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
81
Kelompok 3 vs 5 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 3 vs 6 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 3 vs 7 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 2.000 17.000 -2.200 .028 a
.032
a
82
Kelompok 4 vs 5 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
selisih_0_48 .000 15.000 -2.611 .009 a
.008
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 4 vs 6 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.611 .009 .008
selisih_0_48 3.000 18.000 -1.984 .047 a
.056
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 4 vs 7 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 .000 15.000 -2.619 .009 .008
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 5.000 20.000 -1.571 .116 a
.151
a
83
Kelompok 5 vs 6 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 6.000 21.000 -1.362 .173 .222
selisih_0_48 12.000 27.000 -.105 .916 a
1.000
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 5 vs 7 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 6.000 21.000 -1.366 .172 .222
selisih_0_48 3.000 18.000 -1.991 .047 a
.056
a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
Kelompok 6 vs 7 Test Statisticsb Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
selisih_0_24 12.000 27.000 -.105 .917 1.000
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: kelompok
selisih_0_48 3.000 18.000 -1.991 .047 a
.056
a
84
Lampiran 12. Hasil Uji Statistik Data Persentase Penurunan Kadar MDA
Explore One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test N Normal Parameters
a,b
Most Extreme Differences
kuadrat_0_24 20 7877.7366 7160.11876 .209 .209 -.191 .936 .345
Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative
Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)
kuadrat_0_48 20 9733.5584 5663.32236 .210 .148 -.210 .939 .341
a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.
Oneway Test of Homogeneity of Variances
kuadrat_0_24 kuadrat_0_48
Levene Statistic 1.483 2.636
df1
df2 3 3
16 16
Sig. .257 .085
ANOVA
kuadrat_0_24
kuadrat_0_48
Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares 8.43E+08 1.31E+08 9.74E+08 5.65E+08 44100956 6.09E+08
df 3 16 19 3 16 19
Mean Square 281121053.4 8169722.048
F 34.410
188430075.5 2756309.726
68.363
Sig. .000
.000
85
Post Hoc Tests Multiple Comparisons LSD
Dependent Variable kuadrat_0_24
(I) kelompok kontrol negatif
ekstrak dosis I
ekstrak dosis II
ekstrak dosis III
kuadrat_0_48
kontrol negatif
ekstrak dosis I
ekstrak dosis II
ekstrak dosis III
(J) kelompok ekstrak dosis I ekstrak dosis II ekstrak dosis III kontrol negatif ekstrak dosis II ekstrak dosis III kontrol negatif ekstrak dosis I ekstrak dosis III kontrol negatif ekstrak dosis I ekstrak dosis II ekstrak dosis I ekstrak dosis II ekstrak dosis III kontrol negatif ekstrak dosis II ekstrak dosis III kontrol negatif ekstrak dosis I ekstrak dosis III kontrol negatif ekstrak dosis I ekstrak dosis II
*. The mean difference is significant at the .05 level.
Mean Difference (I-J) -885.87024 -10337.740* -15460.635* 885.87024 -9451.8699* -14574.765* 10337.740* 9451.86992* -5122.8947* 15460.635* 14574.765* 5122.89472* -9713.3749* -12998.705* -12948.209* 9713.37492* -3285.3299* -3234.8338* 12998.705* 3285.32992* 50.49612 12948.209* 3234.83380* -50.49612
Std. Error 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1807.730 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011 1050.011
Sig. .631 .000 .000 .631 .000 .000 .000 .000 .012 .000 .000 .012 .000 .000 .000 .000 .006 .007 .000 .006 .962 .000 .007 .962
95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -4718.0873 2946.3468 -14169.9572 -6505.5231 -19292.8519 -11628.4178 -2946.3468 4718.0873 -13284.0870 -5619.6529 -18406.9817 -10742.5476 6505.5231 14169.9572 5619.6529 13284.0870 -8955.1118 -1290.6777 11628.4178 19292.8519 10742.5476 18406.9817 1290.6777 8955.1118 -11939.2996 -7487.4502 -15224.6295 -10772.7802 -15174.1334 -10722.2840 7487.4502 11939.2996 -5511.2546 -1059.4052 -5460.7585 -1008.9091 10772.7802 15224.6295 1059.4052 5511.2546 -2175.4286 2276.4208 10722.2840 15174.1334 1008.9091 5460.7585 -2276.4208 2175.4286
86
Lampiran 13. Gambar-gambar Tanaman Salam (Syzygium polyanthum [Wight] Walp.)
Gambar 1. Tanaman salam (Syzygium polyanthum [Wight] Walp.)
Gambar 2. Daun Salam Basah
