DIAGNOSTICKÝ PROTOKOL PRO ERWINIA AMYLOVORA, PŮVODCE SPÁLY RŮŽOVITÝCH ROSTLIN

Kokošková Blanka, Mráz Ivan

DIAGNOSTICKÝ PROTOKOL PRO ERWINIA AMYLOVORA, PŮVODCE SPÁLY RŮŽOVITÝCH ROSTLIN METODIKA PRO PRAXI

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008

Metodika vznikla za finanční podpory MZe ČR a byla vypracována v rámci projektu MZE0002700603 – Systémy ochrany rostlin a skladovaných produktů před škodlivými organismy zajišťující zdravotní nezávadnost a kvalitu rostlinných produktů a neohrožující životní prostředí a projektu GA AV ČR 1QS500510558 – Studium výskytu fytopatogenů a jejich genetických variant.

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. , 2008 ISBN 978-80-87011-93-5

DIAGNOSTICKÝ PROTOKOL PRO ERWINIA AMYLOVORA, PŮVODCE SPÁLY RŮŽOVITÝCH ROSTLIN Kokošková Blanka, Mráz Ivan

METODIKA PRO PRAXI

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. 2008

Diagnostický protokol pro Erwinia amylovora, původce spály růžovitých rostlin Předmětem metodiky je optimalizovaný diagnostický protokol pro detekci a determinaci původce spály růžovitých rostlin, karanténní bakterii E. amylovora. Choroba způsobuje značné ekonomické ztráty v porostech jádrovin a náchylných okrasných rostlin, především hlohů a skalníků. Diagnostický protokol je založený na kombinaci dvou optimalizovaných technik o různém principu účinku, a to imunochemickém (imunofluorescenční test) a molekulárním (polymerázová řetězová reakce). Předkládaný protokol umožňuje eliminovat případné falešné negativy i pozitivy a zajistit tak co nejvyšší spolehlivost výsledků. Specifická a včasná detekce původce spály umožní účinnou aplikaci ochranných opatření. Diagnostic protocol for Erwinia amylovora, the causal agent of fire blight The aim of this methodology is optimized diagnostic protocol for detection and determination of the causal agent of fire blight, quarantine bacterium E. amylovora. The disease causes high ecomomic losses in plantations of pome-ftuit trees and susceptible ornamental plants, in particular in Crataegus sp. and Cotoneaster sp. Diagnostic protocol is based on a combination of both optimized techniques utilizing different principles of action: immunochemical (immunofluorescent test) and molecular (polymerase chain reaction). The submitted diagnostic protocol alows to eliminate potential false negatives and positives and ensure the highest reliability of results. Specific and timely detection of E. amylovora alows effective aplication of plant protection mesures.

Oponenti: Ing. Jaroslav Horký, CSc. Státní rostlinolékařská správa, Olomouc Ing. Jana Víchová, PhD. Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Metodika byla schválena odborem vědy a výzkumu MZe pod č.j. 47822/2008-18020. Ministerstvo zemědělství doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.

Obsah: I) Úvod ......................................................................... II) Cíl metodiky.............................................................. III) Vlastní popis metodiky............................................. 1. Příprava a zpracování vzorků................................... 2. Identifikace a detekce spálové bakterie................... 2. 1. Sklíčková aglutinace (SA).................................... 2. 2. Imunofluorescenční test (IF)................................ 2. 3. Polymerázová řetězová reakce (PCR)................. 2. 4. Biologický test..................................................... IV) Srovnání novosti postupů.......................................... V) Popis uplatnění metodiky........................................... VI) Seznam použité související literatury........................ VII) Seznam publikací autorů předcházejících vypracování metodiky............................................... VIII) Dodatky.....................................................................

6 9 9 9 11 11 12 16 19 20 21 21 23 24

1) Úvod Bakterie Erwinia amylovora, způsobující spálu růţovitých rostlin, patří v zemích EU, Českou republiku nevyjímaje, mezi karanténní organismy (OEPP/EPPO 1992; EPPO/CABI 1997). Choroba byla u nás zjištěna poprvé v roce 1986 (Kůdela 1988) a od té doby se postupně šíří po celém území státu. Patogen ohroţuje řadu ovocných i okrasných druhů čeledi růţovitých (Van der Zwet, Beer 1991; Sobiczewski et al. 1997). V našich podmínkách patří k nejdůleţitějším hostitelským rostlinám hlohy (Crataegus sp.), z hospodářského hlediska pak jabloně (Malus sp.) a hrušně (Pyrus sp.). Protoţe původce spály patří v České republice mezi karanténní organismy, vztahují se k této fytopatogenní bakterii úřední opatření, jeţ zahrnují ohlašovací povinnost, průzkum rozsahu výskytu, zákaz dovozu a průvozu, případně jiná mimořádná rostlinolékařská opatření. Spálovou bakterií mohou být napadeny všechny nadzemní rostlinné orgány. Charakteristickým příznakem bývají hákovitě ohnuté, zhnědlé aţ zčernalé letorosty, na nichţ mnohdy zůstávají viset napadené listy. Vzácným příznakem jsou kapičky slizu na infikovaném rostlinném pletivu. Přes zimu přeţívá patogen většinou na okrajích nekróz na hostitelích a obnovuje svoji aktivitu aţ na jaře za vhodných povětrnostních podmínek. V průběhu vegetace můţe přeţívat na povrchu nebo uvnitř rostlinných pletiv aniţ by způsobil onemocnění (Van der Zwet, Beer 1991; Sobiczewski et al. 1997). Příznaky způsobené spálovou bakterií mohou být zaměněny s příznaky jiných chorob. Proto musí být bakterie diagnostikována v podezřelém rostlinném vzorku laboratorně, pomocí určitých diagnostických metod, pouţívaných závazně podle protokolu EU vypracovaném pro bakterii E. amylovora (Anonymous 2004). 6

Izolace E. amylovora z infikovaných rostlinných pletiv je poměrně snadná a kmeny spálové bakterie na masopeptonovém a jiných pevných ţivných médiích lze dobře odlišit od různých doprovodných bakterií. Pro většinu kmenů E. amylovora je charakteristická produkce levanu na sacharózových médiích, ale některým kmenům tato schopnost chybí (Geier, Geider 1993). V čisté kultuře můţe být spálová bakterie detekována sklíčkovou aglutinací, která je rychlým a levným testem, nicméně nelze se vyhnout kříţově reagujícím bakteriím (Pánková et al. 1998; Vanneste 2000; Kokošková et al. 2007) Konvenční diagnostické metody jsou však nedostatečné pro detekci původce spály z latentně infikovaných hostitelských rostlin nebo z epifytní mikroflóry zdravých hostitelských rostlin. Přímá detekce původce spály v rostlinných pletivech různými imunochemickými technikami jako jsou ELISA a IF, které umoţňují zpracování velkého počtu vzorků rutinně, vyuţívá specifické protilátky (McLaughlin et al. 1989; Goris et al. 1996; Kokošková, Mráz 2008). V případě polyklonálních protilátek nelze úplně odstranit kříţové reakce s příbuznými bakteriemi (Zielke et al. 1993; Vanneste 2000; Kokošková, Mráz 2005, Kokošková et al. 2007). Naopak monoklonální protilátky mohou být někdy příliš specifické a neschopné detekovat všechny kmeny v populaci patogena (Lin et al. 1987). Proto se někdy pouţívá směs monoklonálních protilátek. Komerčně však běţně k dispozici pro E. amylovora nejsou. Perspektivní se zdají být monoklonální protilátky, které připravili Gorris et al. (1996) pro enrichment DASI-ELISA metodu. Tato technika, která slouţí k zvýšení koncentrace patogena v rostlinném vzorku na detekovatelnou hladinu, je však poměrně pracná a časově náročná (Anonymous 2004). Při detekci E. amylovora s polyklonálním antisérem firmy NeogenEurope Ltd. (Velká Británie) a Loewe (Biochemica GmbH, SRN) se v PTA-ELISA a nepřímém IF testu objevily 7

slabé aţ středně silné kříţové reakce s některými izoláty doprovodných bakterií, které byly později identifikovány metodou Biolog Bacteria jako Pantoea agglomerans, P. dispersa, Enterobacter cloaceae, E. gergoviae a Rahnella aquatilis (Kokošková et al. 2007). Kříţové reakce se objevily i s bílými izoláty Pantoea sp., které jsou morfologicky velmi podobné spálové bakterii (Kokošková et al. 2005b; Kokošková, Mráz 2005). Molekulární techniky zaloţené na hybridizaci DNA, především na hybridizaci plazmidové DNA, která je pro E. amylovora typická jsou běţně pouţívané (Falkenstein et al., 1988). Patogen je pak detekován pomocí radioaktivně či neradioaktivně značené sondy (Steinbrenner et al. 1990). Zjednodušení přineslo vyuţití specifických primerů pro E. amylovora technikou PCR (Bereswill et al. 1992, 1995). Při ověření izolátů reagujících kříţově v PTA-ELISA a IF v PCR testu s primery podle Bereswill et al. (1995) byly zjištěny falešné pozitivy jen s některými ţlutými a bílými izoláty Pantoea sp.. Izoláty ostatních bakterií byly jednoznačně testem PCR vyloučeny (Kokošková et al. 2007). Četnost bílých kmenů Pantoea sp. v přírodě je nízká, neboť většina kmenů je ţlutě zbarvena, ale je třeba si uvědomit, ţe i s takovými kmeny se můţeme setkat. Bílé kmeny Pantoea sp. byly potvrzeny v biologickém testu na nezralých hruškách jako nepatogenní (Kokošková, Mráz 2005). Po optimalizaci PCR protokolu (Kokošková, Mráz 2005), která spočívala ve zkrácení času a zvýšení teploty annealingu, byly falešné pozitivy, které představovaly kmeny Pantoea sp., testem PCR jednoznačně vyloučeny. Po této úpravě byly zcela spolehlivě detekovány pouze izoláty E. amylovora a vyloučeny jiné bakterie bez ohledu na to, které primery byly pouţity, ať uţ to byly primery podle Bereswill et al. z roku 1992 či 1995 nebo naše vlastní primery (Kokošková et al., 2007). Optimalizace PCR protokolu jednoznačně zvýšila spolehlivost výsledků. 8

Dle našich zkušeností je vţdy vhodnější provést přímou izolaci spálové bakterie na ţivná média a pokud to není moţné, při detekci bakterie z rostlinných vzorků kombinovat jeden imunochemický a jeden molekulární test. Z literárních údajů i našich výsledků vyplývá, ţe je vhodné kombinovat nepřímý IF test, který je citlivější a specifičtější neţ ELISA s testem molekulárním (Kokošková et al. 2007, Kokošková, Mráz 2008). IF test navíc umoţňuje posouzení tvaru a velikosti bakteriálních buněk v mikroskopu na rozdíl od ELISA testu. Případné falešné pozitivy, které se objeví v nepřímém IF testu v závislosti na kvalitě pouţitých protilátek bude moţné eliminovat PCR testem, který je vysoce specifický, zvláště pokud bude pouţit v optimalizované formě. II) Cíl metodiky Cílem metodiky je optimalizovaný diagnostický protokol pro detekci a determinaci původce spály růţovitých rostlin, bakterie E. amylovora, zaloţený na kombinaci dvou optimalizovaných technik o různém principu účinku, a to imunochemickém a molekulárním. Předkládaný diagnostický protokol umoţňuje eliminovat případné falešné negativy i pozitivy a zajistit tak co nejvyšší spolehlivost výsledků. III) Vlastní popis metodiky 1. Příprava a zpracování vzorků Pro zasílání rostlinných vzorků se osvědčily papírové sáčky s „bublinkatou“ folií uvnitř, které zajišťují dostatečnou provzdušněnost prostředí a zabraňují tak vysychání nebo naopak hnití rostlinných částí. Při zasílání vzorků rostlin v době 9

velmi suchého a teplého počasí je

ţádoucí obalit

konce

odříznutých výhonů do ovlhčené buničiny. Vzorky s typickými příznaky spály: Rostlinné vzorky s typickými příznaky spály mohou zahrnovat napadené květy, výhony, listy, plůdky či korová pletiva nekrotických výhonů, větví nebo kmenu. Vzorky by měly být zpracovány co nejdříve po sběru, případně uchovány při 4-8 oC do doby zpracování. Pro úspěšné izolace původce spály jsou nezbytné čerstvě připravené rostlinné maceráty. Z příznakových vzorků se doporučuje přímá izolace spálové bakterie, neboť typické kolonie patogena narůstají v hojném počtu. Pro přímou izolaci spálové bakterie lze doporučit média jako např. MPA, King B a semiselektivní médium se sacharózou (viz dodatek č. 1). Vzorky s atypickými příznaky nebo bez příznaků spály: Pokud jsou příznaky spály pokročilé nebo naopak, kdyţ vnější podmínky nejsou příznivé pro projev příznaků, počet kultivovatelných buněk můţe být velmi nízký. Navíc, pokud jsou misky přerostlé saprofytickými bakteriemi, můţe být izolace spálové bakterie obtíţná. Polní přehlídky, které jsou zaloţeny na reprezentativních odběrech, mohou zahrnovat zdravé či zdánlivě zdravé rostliny. V případě vzorků s atypickými příznaky nebo vzorků ze zdravých rostlin by přímá izolace spálové bakterie na ţivná média z důvodu nízké koncentrace patogena ve vzorku nebyla úspěšná. Proto se doporučuje detekovat spálovou bakterii přímo, nejlépe v imunochemickém i molekulárním testu zároveň.

10

2. Identifikace a detekce spálové bakterie Připravíme maceráty z infikovaného rostlinného pletiva ve sterilní vodě na hodinovém sklíčku tak, ţe odebereme rostlinné segmenty (cca 3-4 mm) z rozhraní zdravé a napadené části rostliny (list, korové pletivo výhonu, plod apod.) a skalpelem pečlivě rozmacerujeme. Vyţíhanou kličkou odebereme do očka tekutinu a rozetřeme na Petriho misce kříţovým roztěrem. Po 2 aţ 3 dnech prohlíţíme misky pod mikroskopem a vytipováváme charakteristické kolonie, ze kterých provádíme další roztěry na P. misky. Čisté kultury podezřelých izolátů, napěstovaných z hladkých, lesklých, vypouklých a mléčně zbarvených kolonií na MPA mohou být testovány v sklíčkové aglutinaci, která je rychlým sérologickým testem umoţňujícím rutinně ověřit velké mnoţství izolátů. Poté by měly být všechny pozitivní izoláty testovány v IF a PCR testu. Pro potvrzení patogenity by měl být pouţit biologický test. V kaţdém testu by měl být pouţit jako pozitivní kontrola referenční kmen E. amylovora (viz dodatek č. 3). Rostlinné vzorky, z nichţ není moţné spálovou bakterii izolovat, by měly být zařazeny přímo do IF a PCR testu. 2. 1. Sklíčková aglutinace (SA) Postup Pouţít komerční polyklonální protilátku (z odd. bakteriologie VÚRV, v.v. i., Praha nebo např. od firmy NeogenEurope Ltd., Velká Británie) Na podloţní sklíčko s jamkou nakapat 20 μl antiséra a poté přidat trochu bakteriální masy testovaného kmene a kličkou pečlivě rozetřít Sklíčko umístit na 10-20 minut do vlhké komůrky

11

Po uplynutí určené doby pod mikroskopem při 20-40 násobném zvětšení hodnotit stav aglutinace a porovnat s pozitivní i negativní kontrolou Jako pozitivní kontrolu pouţít některý doporučený sbírkový kmen E. amylovora (viz dodatek č. 3) a jako negativní kontrolu nějakou jinou bakterii Hodnocení a interpretace výsledků Pozitivní reakce se vyznačuje tvorbou charakteristických shluků, jejichţ intenzitu zpravidla hodnotíme jedním, dvěma a třemi plus. Negativní reakce, kdy se ve vzorku netvoří ţádné shluky je totoţná s reakcí negativní kontroly. 2. 2. Imunofluorescenční test (IF) Uvádíme námi optimalizovaný IF test pro E. amylovora, který vznikl kombinací protokolů směrnice EU (Anonymous 2004), společnosti NeogenEurope Ltd., UK a vlastních zkušeností. IF test by měl být proveden s čistými kulturami podezřelých izolátů, které by měly být připraveny jako bakteriální suspenze přibliţně v koncentraci 106 cfu/ml (OD=0.001 při 620 nm) ve fosfátovém pufru (viz dodatek č. 2). Rostlinné extrakty by měly být přednostně testovány čerstvé. Pokud jsou skladovány při – 80 oC s přídavkem glycerolu, je zapotřebí před jejich testováním glycerol odstranit. To se provádí přidáním 1 ml fosfátového pufru, centrifugací vzorku 15 minut při 7000 g, odstraněním supernatantu a resuspendováním pelety ve fosfátovém pufru. Pro IF testy se pouţívají nejčastěji komerční polyklonální protilátky. Doporučuje se, aby titr a ředění bylo stanoveno pro kaţdou novou šarţi protilátek. Někdy se polyklonální protilátky nejprve ověřují ve dvou ředěních, aby se zjistily případné 12

kříţové reakce s dalšími bakteriemi, většinou se však protilátky pouţívají v ředění uvedeném na etiketě. Jako pozitivní kontrola by měl být pouţit sbírkový kmen E. amylovora v koncentraci 106 cfu/ml (viz dodatek č. 3). Jako negativní kontrola by měla být pouţita bakterie reagující negativně s pouţitou protilátkou (např. Pseudomonas fluorescens) a extrakt ze vzorku zdravé rostliny. V případě testovaných vzorků by měly být pouţity maceráty neředěné a ředěné v poměru 1:10 a 1:100, případně 1:1000 ve fosfátovém pufru. Pro kaţdý vzorek a jeho ředění se uvaţuje buď s jedním sklíčkem, tj. kaţdé ředění je 2x opakováno nebo jsou dva vzorky pouţity na jednom sklíčku. Postup Připravit bakteriální suspenze testovaných vzorků včetně pozitivních a negativních kontrol ve fosfátovém pufru. V případě čistých kultur proměřit počáteční optickou hustotu 0,1 při 620 nm na spektrofotometru, která odpovídá koncentraci 108 cfu/ml. Další koncentrace tj. 0,01, 0,001, případně i 0,0001 připravit desetinným ředěním do ependorfek. (např. 20µl suspenze + 180µl pufru PBS nebo 30µl suspenze + 270µl pufru PBS) Vzorky nakapat podle schématu do okének na podloţním sklíčku po 20 l do kaţdého okénka o průměru 7 mm Podloţní sklíčka nechat vysoušet 45 minut při teplotě 40-45 0C na desce termostatu Fixovat bakteriální buňky na podloţním sklíčku protaţením jeho spodní strany v nesvítivé části plamene, opakovat 3x (pozn. Neosvědčila se aplikace acetonu místo fixace plamenem)

13

Nakapat naředěnou protilátku po 20 l do kaţdého okénka. Podloţní sklíčka inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě v temné vlhké komůrce Podloţní sklíčka opláchnout pod mírným proudem fosfátového pufru, vloţit do nádobky s fosfátovým pufrem a promývat za stálého třepání na rotační třepačce (150 otáček/min). Po 7-10 minutách vyměnit fosfátový pufr a pokračovat v promývání stejným způsobem, tj. promývat celkem 14-20 minut Sklíčka opláchnout destilovanou vodou a ponechat na filtračním papíru do úplného oschnutí, tj. asi 10 minut Nakapat naředěný konjugát (anti-rabbit IgG) po 20 l do kaţdého okénka. Podloţní sklíčka inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě v temné vlhké komůrce Podloţní sklíčka opláchnout pod mírným proudem fosfátového pufru, vloţit do nádobky s fosfátovým pufrem a promývat za stálého třepání na rotační třepačce (150 otáček/min). Po 7-10 minutách vyměnit fosfátový pufr a pokračovat v promývání stejným způsobem, tj. promývat celkem 14-20 minut. Třepat za nepřístupu světla Sklíčka opláchnout destilovanou vodou a ponechat na filtračním papíru do úplného oschnutí, tj. asi 10 minut. Dokonale osušit obvod podloţního sklíčka Celý obvod podloţního sklíčka pokapat 0,1 M fosfátovým pufrem s glycerolem (5-10 μl v jedné kapce), překrýt krycím sklíčkem a důkladně odstranit případná vzduchem zaplněná místa Krycí sklíčko přichytit v rozích lakem k podloţnímu sklíčku Sklíčka je moţné skladovat jako trvalé preparáty v lednici nebo při –20 oC aţ 3 měsíce

14

Hodnocení IF testu Sklíčka prohlíţet v epifluorescenčním mikroskopu s filtry pro excitaci FITC pod olejovou imerzí při zvětšení 500-1000x. Zkoumat okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a podél obvodu. U vzorků s ţádným nebo malým počtem buněk prohlédnout nejméně 40 mikroskopových políček v okénku podloţního sklíčka. Odhad fluoreskujících buněk v 1 ml a na vzorek (viz dodatek č. 4). Interpretace výsledků IF testu Test je proveden správně, jestliţe v okénkách sklíčka, kde byla aplikována pozitivní kontrola, jsou pozorovány jasně zeleně fluoreskující buňky s morfologií typickou pro E. amylovora a v okénkách sklíčka, kde byla aplikována negativní kontrola, nejsou pozorovány ţádné fluoreskující buňky. Vlastní vzorky jsou pak hodnoceny jako pozitivní nebo negativní podle toho, jak odpovídají oběma kontrolám. Jako limit pro spolehlivou detekci E. amylovora v IF testu je povaţována koncentrace 103 cfu/ml a vyšší. U vzorků s niţší koncentrací E. amylovora mohou být výsledky sporné nebo negativní. V takovém případě by měl být vzorek testován znovu v IF nebo jiném testu. Vzorky se slabě fluoreskujícími buňkami by měly být testovány s jiným ředěním protilátek nebo jinými protilátkami. Při podezření z jakékoliv kontaminace musí být test opakován. To se můţe stát při kontaminaci pufru nebo při zjištění přítomnosti pozitivních buněk na povrchu sklíčka mezi okénky. Při zjištění přítomnosti fluoreskujících buněk s více či méně atypickou morfologií se můţe jednat o kříţově reagující doprovodné fytopatogenní nebo saprofytické bakterie. V takovém případě je nutné opakovat IF test s jinými protilátkami nebo pouţít jiný test, nejlépe PCR, neboť ten je velmi specifický. 15

2. 3. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Uvádíme námi optimalizovanou reakci PCR se třemi dvojicemi primerů - AMSbL, AMSbR (Bereswill et al. 1995), P29A, P29B (Bereswill et al. 1992) - viz dodatek č. 5 a s vlastními primery Eaf72, Ear560. Pro testování vzorků pomocí PCR lze pouţít bakteriální kulturu ve 3 různých variantách: 2. 3. 1. Bakteriální kulturu bez jakýchkoliv úprav odebranou z misky sterilním párátkem nebo kličkou přidat přímo do namíchané PCR reakce. 2. 3. 2. Pouţít bakteriální lyzát připravený následujícím způsobem: Připravit čerstvý 50 mM NaOH Sterilní kličkou o objemu 1 l přenést 24 hodinovou bakteriální kulturu kultivovanou při cca 28 0C (platí pro gram negativní bakterie) do 1,5 ml eppendorfky se 100 l čerstvě připraveného 50 mM NaOH a řádně vortexovat Směs na heat bloku zahřívat 5-10 min. (gram negativní bakterie) při 100 0C, pak rychle zchladit na ledu K tomuto alkalickému lyzátu přidat 900 l sterilní destilované vody a vortexovat Bakteriální lyzát uchovávat na ledu Přidat 1 l lyzátu do namíchané PCR reakce Při kaţdé nové přípravě bakteriálního lyzátu je nutné připravit nový 50 mM NaOH.

16

2. 3. 3. Pouţít vyizolovanou genomovou (bakteriální) DNA V současné době existuje více moţností pro izolaci genomové bakteriální DNA. Doporučujeme provést izolaci pomocí kitu Wizard SV Genomic DNA Purification System od firmy Promega. Srozumitelný návod je přiloţen v kaţdém balení kitu. Do namíchané PCR reakce přidat 1 l vyizolované genomové DNA. 2. 3. 4. Pouţité primery: Pro PCR reakci lze pouţít následující tři dvojice primerů pro detekci E. amylovora s dobrými výsledky:  Optimalizované primery AMSbL, AMSbR (Bereswill et al. 1995), velikost amplifikačního produktu (VAP) je 1600 bp  Optimalizované primery P29A, P29B (Bereswill et al. 1992), VAP je 1000 bp  Vlastní primery Eaf72 (5´- CgT gAC gCT ggA TgA AAT gC – 3´) a Ear560 (5´- CTC CCg CAT CCA gTC AAg Tg – 3´), VAP činí 500 bp Primery je moţné si nechat nasyntetizovat např. u firmy Generi Biotech v Hradci Králové. 2. 3. 5. Reakční směs PCR PCR reakci zcela postačuje provádět v celkem 15 l reakční směsi. Místo jednotlivých komponentů (polymeráza, nukleotidy, pufr, MgCl2 aj.) doporučujeme pouţívat tzv. PPP Master Mix (např. firma Top Bio, ČR), kde jsou výše zmiňované komponenty vyváţeně zastoupeny. Pouţívané primery skladujeme obvykle jako zásobní roztok v koncentraci 200 pmol/ l v mrazícím boxu při teplotě - 20 0C, před pouţitím je pak ředíme 10x, tj. na koncentraci 20 pmol/ l . Tyto zbylé naředěné primery skladujeme co nejkratší dobu opět v mrazícím boxu. Pouţívané balení PPP Master Mix 17

skladujeme v lednici, ostatní balení v zásobě pak v mrazícím boxu také při teplotě - 20 0C. PPP Master Mix - 7,5 l primer 1 (20 pmol/ul) - 0,5 l primer 2 (20 pmol/ul) - 0,5 l genomová DNA (bakteriální lyzát) - 1,0 l sterilní destilovaná voda - 5,5 l 2. 3. 6. Amplifikační program pro jednotlivé primery: U jednotlivých primerů se amplifikační program odlišuje teplotou a dobou annealingu a dobou syntézy DNA. Primery AMSbL, AMSbR (Bereswill et al. 1995), velikost amplifikačního produktu (VAP) je 1600 bp. Úvodní denaturace: 5 min. - 95 0C (1) Denaturace: 1 min. - 94 0C (2) Doba a teplota annealingu: 50 sec. - 55 0C (3) Syntéza DNA: 90 sec. - 72 0C (4) Krok (2) aţ (4) opakovat 35x (5) Syntéza řetězce: 15 min. - 72 0C (6) Chlazení při 4 0C (7) Primery P29A, P29B (Bereswill et al. 1992), VAP je 1000 bp. Změna v kroku (3): Doba a teplota annealingu: 40 sec. - 58 0C Změna v kroku (4): Syntéza DNA: 1 min. - 72 0C Vlastní primery Eaf72 (5´- CgT gAC gCT ggA TgA AAT gC – 3´) a Ear560 (5´- CTC CCg CAT CCA gTC AAg Tg – 3´), VAP činí 500 bp. Změna v kroku (3): Doba a teplota annealingu: 40 sec. - 69 0C Změna v kroku (4): Syntéza DNA: 1 min. - 72 0C

18

2. 3. 7. Vyhodnocení PCR na agarosovém gelu 2. 3. 7. 1. Příprava tzv. Loading Buffer (vkládacího pufru) Na 10 ml vkládacího pufru smícháme 3 ml glycerolu, 200 l 0,5% Bromphenol Blue, 200 l 0,5% Xylen Cyanol (například Sigma Aldrich) a doplníme pufrem 1 x TE (viz dodatek č. 6) do objemu 10 ml. Do 0,5 ml této směsi přidáme 0,5 l barviva Sybr Green (Sigma Aldrich), kterým se zviditelňuje DNA. Takto připravený vkládací pufr lze uchovávat v lednici v dobrém stavu přibliţně jeden týden. Po této době je potřeba připravit pufr nový. 2. 3. 7. 2. Příprava vzorků a agarosového gelu pro elektroforesu Jeden l směsi vkládacího pufru se Sybr Green smícháme s 1 l amplifikátu (naamplifikované DNA) a nanášíme na zpravidla 1 % agarosový gel umístěný v horizontální elektroforese. Pro přípravu agarosového gelu se nám osvědčila agarosa SeaKem LE Agarose (Lonza, East Port). Příslušné mnoţství agarosy s vhodným pufrem (např. TBE, TE aj.) rozvaříme v mikrovlnné troubě. Orientace běhu vzorků na gelu je od minus pólu k plus pólu. Pufr pouţívaný v elektroforese jako elektrolyt (např. 1x TE) musí být shodný s pufrem pouţitým pro přípravu agarosového gelu. Jako marker pro zjištění velikosti amplifikátů pouţíváme v tomto případě tzv. stovkový velikostní standard (marker) 100 bp DNA Ladder (Promega), který nanášíme v mnoţství 1,0 - 1,5 l ve směsi s 1 l vkládacího pufru se Sybr Green. 2. 4. Biologický test Pro potvrzení identity získaných izolátů a pro ověření jejich patogenity i virulence se pouţívá test patogenity na nezralých 19

hruškách náchylné odrůdy, např. Konference. Čisté kultury izolátů potvrzených v jednom nebo více laboratorních testech jako E. amylovora se inokulují do nezralých plodů o velikosti cca 2-3 cm.. Připraví se bakteriální suspenze v koncentraci 106 cfu/ml a aplikuje se do vyhloubených středů hrušek předem rozpůlených a poloţených na vnější stranu na ovlhčený filtrační papír v krabicích z umělé hmoty. Krabice se hermeticky uzavřou, aby se zajistila maximální vlhkost prostředí a umístí do prostředí s teplotou cca 30 oC. Napadení plodů se hodnotí podle tvorby slizových kapek na povrchu plodu, které se tvoří od třetího dne po inokulaci plodů v průběhu týdne. Pozitivní jsou ty izoláty, které způsobují tvorbu slizových kapek, hnědnutí pletiva nebo obojí. IV) Srovnání novosti postupů Optimalizovaný diagnostický protokol zahrnuje výběr, ověření a optimalizaci několika diagnostických metod z mnoha, které jsou doporučeny v EU protokolu pro E. amylovora s cílem nejen zjednodušení celého postupu, ale i dosaţení časové a finanční úspory při zachování pokynů závazných v EU protokolu. Při determinaci spálové bakterie je třeba přednostně izolovat patogena z napadených rostlinných vzorků na selektivní nebo semiselektivní ţivná média na úroveň čisté kultury. Podezřelé izoláty je moţné ověřit sklíčkovou aglutinací s komerčními polyklonálními antiséry. S vytipovanými podezřelými izoláty nebo izoláty pozitivními ve sklíčkové aglutinaci je třeba provést IF test nebo PCR test, případně oba testy. Pozitivní izoláty z obou nebo jednoho testu by se měly ověřit v testu patogenity na nezralých hruškách. Při detekci spálové bakterie z příznakově problematických vzorků nebo z epifytní mikroflóry zdánlivě zdravých rostlin je 20

zapotřebí rostlinné maceráty ověřit souběţně v IF testu a PCR testu. Kombinace IF a PCR testu, které jsou zaloţeny na různém principu účinku, se velmi osvědčila, protoţe oba testy se vyznačují jinými výhodami a nevýhodami. Případné falešné pozitivy v IF testu jsou vyloučeny v PCR testu, který je velmi specifický, zvláště pokud je optimalizovaný. DASI-ELISA a nepřímá ELISA uváděné v EU protokolu nedoporučujeme, protoţe jsou méně citlivé i specifické ve srovnání s IF a PCR testem. Metoda enrichment DASI-ELISA uvedená v EU protokolu je pracnější, časově a finančně náročnější a není spolehlivější neţ námi uváděný IF test a PCR test. V) Popis uplatnění metodiky Metodika je určena orgánům státní správy, šlechtitelským organizacím a zemědělské praxi. Předmětem uplatňované metodiky je optimalizovaný diagnostický protokol pro E. amylovora, který je určen především pro rutinní vyuţití v diagnostických laboratořích Státní rostlinolékařské správy. VI) Seznam použité související literatury ANONYMOUS: SMT project SMT-4-CT98-2252. Diagnostic protocols for organisms harmful to plants. Diagnosis of Erwinia amylovora. Published at http://www.csl.gov.uk/specialInterest/Erwinia.pdf BERESWILL S., PAHL A., BELLEMANN P., ZELLER W., GEIDER K.: Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3522-3526 (1992). 21

BERESWILL S., BUGERT P., BRUCHMUELLER I., GEIDER K.: Identification of the fire blight pathogen, Erwinia amylovora, by PCR assays with chromosomal DNA. Appl.Environ. Microbiol. 61, 2636-2642 (1995). EPPO/CABI: Quarantine pests for Europe. Second edition (Ed. by Smith J.M., Mc Namara D.G., Scott P.R., Holderness, M.), pp. 1001-1007. CAB INTERNATIONAL, Wallingford, UK (1997). FALKENSTEIN H., BELLEMANN P., WALTER S., ZELLER W., GEIDER K.: Identification of Erwinia amylovora, the fireblight pathogen, by colony hybridization with DNA from plasmid pEA29. Appl. Environ. Microbiol. 54, 27982802 (1988). Geier G., Geider K.: Characterization and influence on virulence of the levansucrose gene from the fire blight pathogen Erwinia amylovora. Physiol. Mol. Plant Pathol. 42, 387-404 (1993). GORRIS M.T., CAMBRA M., LLOP P., LÓPEZ M.M., LECOMTE P., CHARTIER R., PAULIN J.P.: A sensitive and specific detection of Erwinia amylovora based on the ELISA-DASI enrichment method with monoclonal antibodies. Acta Horticulturae 411, 41-45 (1996). KŮDELA V: Erwinia amylovora, původce spály růţovitých rostlin v Československu. Ochr. Rostl. 24, 173-182 (1988) LIN C.P. CHEN T.A. WELLS J.M., VAN DER ZWET T.: Identification and detection of Erwinia amylovora with monoclonal antibodies. Phytopathology 77, 376-380 (1987). MCLAUGHLIN R.J., ROBERTS R. G.: Monoclonal antibodies against Erwinia amylovora characterization and evaluation of a mixture for detection by Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Phytopathology 79, 610-613 (1989).

22

OEPP/EPPO: Quarantine procedures. 40. Erwinia amylovora sampling and test methods. OEPP/EPPO Bull. 22, 225-232 (1992). PÁNKOVÁ I., MRÁZ I., PETRZIK K.: Determination of optimal concentration of Erwinia amylovora and Pantoea agglomerans antigens in the slide agglutination reaction. Plant Protect. Sci. 34(2), 59-62 (1998). SOBICZEWSKI P., DECKERS T., PULAWSKA J.: Fire Blight (Erwinia amylovora). Some aspects of epidemiology and control. Res. Inst. of Pomology and Floriculture, Skierniewice, Poland, 71pp. (1997) STEINBRENNER B., ZELLER W, BELLEMANN P., GEIDER K.: DNA – hybridization, a specific method for diagnosis of fire blight. Acta Hortic. (Wageningen) 273, 91-93 (1990) VAN DER ZWET, T., BEER, S. V.: Fire blight - Its Nature, Prevention, and Control. A Practical Guide to Integrated Disease Management. Agricultural Information Bulletin no. 631. US Department of Agriculture, Washington (DC) 83 pp. (1991). VANNESTE J.: Fire blight, the disease and its causative agent Erwinia amylovora. CAB International, Wallingtford, UK (2000). ZIELKE R., SCHMIDT A., NAUMANN K.: Comparison of different serological methods for the detection of the fire blight pathogen, Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. Zentralbl. Mikrobiol. 148, 379-391 (1993). VII) Seznam publikací autorů předcházejících vypracování metodiky KOKOŠKOVÁ B., HÝBLOVÁ J., MRÁZ I.: Comparison of immunochemical and molecular techniques for reliable detection of fire blight bacterium. In: Book of abstracts of 23

the 6th International Symposium in the Series Recent Advances in Plant Biotechnology - From Laboratory to Business, České Budějovice, Czech Republic, 12 - 16 September: 87 (2005a) KOKOŠKOVÁ B., MRÁZ I., FOUSEK J.: Limitations in reliability of fire blight (Erwinia amylovora) diagnostic methods. Phytopathologica Polonica, 35, 69-72 (2005b) KOKOŠKOVÁ B., MRÁZ I.: Reliability of diagnostic techniques for Erwinia amylovora, the causative agent of fire blight disease. Folia Microbiologica 50 (3), 217-221 (2005) KOKOŠKOVÁ B., MRÁZ I., HÝBLOVÁ J.: Comparison of Specificity and Sensitivity of Immunochemical and Molecular Techniques for Reliable Detection of Erwinia amylovora. Folia Microbiologica 52 (2), 175-182 (2007) KOKOŠKOVÁ B., MRÁZ I.: Reliability of diagnostic techniques for Erwinia amylovora and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Zemdirbyste-Agriculture, 95 (3), 270276 (2008)

VIII) Dodatky Dodatek č. 1: Ţivná média: King B médium (King et al. 1954): pepton No 3 20 g; glycerol 10 mL; K2HPO4 1,5 g; MgSO4 . 7 H2O; agar 15 g; destilovaná voda do 1 L. Upravit pH na 7,0 - 7,2. Sterilizovat v autoklávu 15 minut při 120 oC. Médium s levanem: kvasničný extrakt 2 g; baktopepton 5 g; NaCl 5 g, sacharóza 50 g; agar 20 g; destilovaná voda do 1 L; Upravit pH na 7,0 - 7,2. Sterilizovat v autoklávu 15 minut při 120 oC.

24

MPA (masopeptonový) agar: ţivný agar č. 2 40 g; glukóza 7 g; agar 22 g; destilovaná voda do 1 L; Upravit pH na 7,0 7,2. Sterilizovat v autoklávu 15 minut při 120 oC. Dodatek č. 2 Pufry pro nepřímý IF test (podle NeogenEurope protokolu): Fosfátový pufr (PBS): chlorid sodný (NaCl) 8,0g; dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4) 0,2 g; hydrogenfosforečnan sodný (Na2HPO4) 1,115 g; chlorid draselný (KCl) 0,2 g; destilovaná voda 1L; Upravit pH na 7,0 7,2 Glycerolový pufr: hydrogenfosforečnan sodný (Na2HPO4 x 12 H2O) 3,2 g; di-hydrogenfosforečnan sodný (NaH2PO4 x 2 H2O) 15g; glycerol 50 ml; destilovaná voda 100 ml Dodatek č. 3 Sbírkové kmeny Jako pozitivní kontroly do testů jsou doporučovány sbírkové kmeny E. amylovora, např. kmen NCPPB683 ze sbírky National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Velká Británie a kmen CFBP 1430 ze sbírky Collection Francaise de Bactéries Phytopathogénes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francie. Dodatek č. 4 Počítání typických fluoreskujících buněk v IF testu Nejprve spočítat průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím políčku (c). Poté vypočítat počet typických fluoreskujících buněk v jednom okénku sklíčka (C). C = c x S/s kde S = plocha jednoho políčka na sklíčku s více okénky 25

s = plocha pole objektivu s = π i2 /4G 2K2 kde i = koeficient políčka (v rozmezí od 8-24 podle typu okulárů) K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25) G = zvětšení objektivu (např. 100 x aj.) Nakonec vypočítat počet typických fluoreskujících buněk na 1 ml testovaného vzorku (N). N = C x 1000/y kde y = objem vzorku aplikovaného na jedno okénko (v našem případě 20) Dodatek č. 5 Sekvence primerů pouţitých v metodice (Bereswill et al. 1995): Primer AMSbL:5´- gCT ACC AgC Agg gTg Ag - 3´ (17 - mer) Primer AMSbR:5´-TCA TCA CgA Tgg TgT Ag - 3´ (17 - mer) (Bereswill et al. 1992): Primer P29A: 5´- Cgg TTT TTA ACg CTg gg - 3´ (17 - mer) Primer P29B: 5´- ggg CAA ATA CTC ggA TT - 3´ (17 - mer) Sekvence vlastních primerů Eaf72, Ear560 uvedena v textu. Dodatek č. 6 Příprava pufru 1 x TE V současné době lze zakoupit jiţ hotový 100 x TE Buffer (AppliChem), pH 8.0, a následně vhodným naředěním získáme pufr o poţadované koncentraci.

26

Autoři:

Ing. Blanka Kokošková, CSc. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně Ing. Ivan Mráz, CSc. Biologické Centrum AV ČR, v. v. i. Ústav molekulární biologie rostlin Branišovská 31, 370 05 České Budějovice Název: Diagnostický protokol pro Erwinia amylovora, původce spály růžovitých rostlin Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně Tisk a vazba: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: [email protected]; [email protected] Autor fotografií: B. Kokošková © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. , 2008 ISBN 978-80-7427-005-5

Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN 978-80-87011-93-5