61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Degradační produkty proteinových aduktů v moči jako perspektivní biomarkery kumulativní expozice reaktivním chemickým látkám ■■■
J. Mráz, I. Linhart *, I. Hanzlíková, Š. Dušková, L. Dabrowská, H. Chrástecká, R. Vajtrová Státní zdravotní ústav, Praha * VŠCHT Praha
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Biologické monitorování
Biologické expoziční testy (BET) aplikace metod biologického monitorování v případě látek, pro něž je znám vztah mezi velikostí expozice a hladinou příslušného biomarkeru, a pro něž byl stanoven biologický limit Provádění BET v ČR řídí se Vyhláškou č. 432/2003 Sb. v platném znění (Vyhláška č. 107/2013)
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Biomarkery v toxikologii
Výchozí látky v biologickém materiálu (moč, krev, vydechovaný vzduch, sliny, vlasy…)
BM vnímavosti
BM biochemického/ biologického účinku
Adukty s buněčnou DNA DNA adukty v moči Adukty s proteiny (globin, albumin) Změněné hladiny endogenních látek Cytogenetické biomarkery (CA, SCE, MN, etc.) Genotyp biotransformačních enzymů
BM expozice
Metabolity v biologickém materiálu (moč)
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Proč adukty s globinem?
Vhodná náhrada za adukty s DNA Dlouhodobá persistence v organismu po celou dobu
života erythrocytů (u člověka ca. 125 dní) Dostupnost v dostatečném množství (140 mg/ml krve) Zavedené analytické postupy Doporučené pro hodnocení expozice na pracovištích (biologické limity, BET) Použitelné pro alkylační činidla (např. epoxidy), arylaminy, isokyanáty, N,N-dimethylformamid
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Nucleophilic sites in globin CH2SH
CH(CH3)2 H2N C
HN C
CO
(CH2)4NH2
CO
HN C
H
H
H
Val
Cys
Lys OH
NH N CH2 HN C
CO
CH2 HN C
H
H
His
Tyr
CO
CO
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
MVH (nmol/g globin)
Toxicokinetika globinových aduktů u člověka
20 15 10 5 0 0
50
100
150
days
Hladina aduktu MVU (stanoveného jako MVH) v globinu po jednorázové perkutánní expozici N,N-dimethylformamidu (DMF)
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Pracovní hypotéza projektu IGA NT13401-4/2012 Po ukončení životnosti erythrocytu je globin s navázanými adukty odbourán proteolytickou degradací, při níž se uvolní:
volné aminokyseliny, které (znovu) vstoupí do fyziologických metabolických cyklů
volné aminokyselinové adukty, které se vyloučí močí
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Modifikované aminokyseliny v moči Modifikace endogenními procesy klinická medicína
3-methylhistidin: obnova/degradace kosterního svalstva prolyl-4-hydroxyprolin: obnova/degradace kostních proteinů (při osteoporóze)
Modifikace cizorodými látkami průmyslová toxikologie & hygiena: nevyužíváno
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Adukty s aminokyselinami: modelové sloučeniny Precursor in vivo
Reactive species
N,N-dimethyl- methylformamide, isocyanate N-methylformamide
Amino Adduct acid Val
N-methylcarbamoyl-Val
Lys
Nε-methylcarbamoyl-Lys
ethylene oxide
ethylene oxide Val
acrylamide
acrylamide
styrene
styrene oxide
N-(2-hydroxyethyl)-Val
Cys
S-(2-hydroxyethyl)-Cys
Val
N-(2-amidoethyl)-Val
Cys
S-(2-amidoethyl)-Cys
Val
N-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-Val N-(2-hydroxy-2-phenylethyl)-Val
Cys
N-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-Cys N-(2-hydroxy-2-phenylethyl)-Cys
AIRMON 2014, 15-19 June, 2014, Marseille, France
STEP 1
Expozice výchozí látce (Metabolismus) Transport adduktotvorných činidel do erythrocytů Tvorba globinových aduktů
STEP 2
Globinové adukty v erythrocytech Odstranění a desintegrace erythrocytů Proteolýza globinu
STEP 3
Degradační produkty globinových aduktů v krevním oběhu (Metabolismus) Vylučování ledvinami
Degradační produkty globinových aduktů v moči
12
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Totální hydrolýza globinu modifikovaného látkou (X)
X X X X VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGECGAEA----acidic hydrolysis enzymatic hydrolysis (Pronase)
S
L
A
XV P G
N
V G XK
P
T
A
G A
K
V
D K
W XH
E
A
G
A
A E
XC
A
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Stanovení degradačních produktů globinových aduktů v moči • Záchyt polárních aduktů z moči pomocí extrakce na pevné fázi (SPE)
• Analýza HPLC/MS/MS
AIRMON 2014, 15-19 June, 2014, Marseille, France
Plánované experimenty s potkany: A) Intraperitoneální podání aduktotvorných látek, stanovení aduktů v globinu a moči po celou dobu vylučování B) Intravenózní podání (transfuse) erythrocytů modifikovaných in vitro aduktotvornou látkou, stanovení aduktů v globinu a moči po celou dobu vylučování
15
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Příprava a aplikace potkaních erythrocytů modifikovaných MIC (IRE-MIC) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10)
Odběr krve potkanů-dárců (anestesie, vykrvení aortou) Oddělení a promytí erythrocytů Inkubace erythrocytů s MIC (5-50 mM) → „IRE-MIC“ Promytí IRE-MIC, stanovení hemoglobinu Odběr části IRE-MIC, izolace globinu, stanovení aduktů Podání IRE-MIC potkanům-příjemcům, 2 ml/kg (anestesie, podání kanylou do vena jugularis) Odběr vzorku celkové krve 10 min po podání IRE-MIC Uzavření veny jugularis, zašití rány Odběry krve a stanovení globinových aduktů v krvi příjemců po celou dobu života erythrocytů Odběry moči a stanovení produktů odbourávání globinových aduktů (aminokyselinových aduktů a/nebo jejich metabolitů) po celou dobu života erythrocytů
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Aminokyselinové adukty methylisokyanátu H3C
CH3
H3C O
CH3
O
O
H2N
HN OH
NH
CH3
Val
OH
N-methylcarbamoyl-Val
N CH3
H3C O
methylisocyanate
(MVU)
HN H2N
O HN
(MIC) O
O
OH
OH H2N
Lys
NH2
N(5)-methylcarbamoyl-Lys
(MLU)
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Odbourávání aduktů methylisokyanátu s globinem
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Adukty methylisokyanátu v globinu a moči: toxikokinetika
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Adukty ethylenoxidu s globinem
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Odbourávání aduktu ethylenoxidu s N-koncovým valinem globinu
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Kinetika aduktů ethylenoxidu s N-koncovým Val-Leu v globinu a moči potkanů po i.p. podání EO
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Odbourávání globinových aduktů styrenoxidu
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
HPLC/MS/MS stanovení aduktů SO v moči
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Kinetika úbytku aduktů styrenoxidu s Cys a Val v globinu a moči potkanů
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Shrnutí Fyziologické odbourávání globinových aduktů produkuje aminokyselinové adukty, které se vylučují močí ve volné formě nebo jako jednoduché metabolity. Tyto produkty představují novou kategorii biomarkerů expozice, spojující tři hlavní výhody: Specificitu pro výchozí chemickou látku Možnost monitorování dlouhodobých kumulativních expozic Neinvazivní odběr vzorků
Perspektivy Rozšíření studie na další typy aduktů Studie na člověku
61. konzultační den, 24.9.2015, SZÚ Praha
Poděkování IGA MZ ČR Grant NT13401-4/2012
Spolupracovníkům