C-MET RENDSZER SZEREPE A DAGANAT PROGRESSZIÓBAN

A HGF/C-MET RENDSZER SZEREPE A DAGANAT PROGRESSZIÓBAN

Fazekas Károly

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

Témavezeto: Dr. Tímár József Országos Onkológiai Intézet Tumor Progressziós Osztály

Budapest 2003

Tartalomjegyzék Összefoglalás Summary I. Bevezetés A daganatos progresszió Az áttétképzés folyamata, a metasztatikus kaszkád A lokális invázió mechanizmusa Adhézió Mátrixbontás Migráció A szóródás mechanizmusa Tumorsejt – ECM kölcsönhatások a keringésben Tumorsejt – normál sejt kölcsönhatások az érpályában A/ Tumorsejt – endotél kölcsönhatás B/ Tumorsejt – trombocita kölcsönhatás Az extravazáció mechanizmusa A daganatok szervi áttétei Tüdo metasztázis Májáttét Csontáttét Agyi áttét A metasztázis képzés szerv-specifitása A hepatocita növekedési faktor és receptora, a c-met onkoprotein Tumor-indukált angiogenezis, az angiogenezis formái A vaszkulogenezis Az angiogenezis Tumor-indukálta angiogenezis Vaszkuláris mimikri Ér inkorporáció Az antiangiogenetikus terápia jelenlegi lehetoségei Hagyományos terápiás szerek Endotél növekedési faktor ligandok Endoteliális mitogén receptorok Angiogén jelátvitel Endotélsejt-ECM kölcsönhatásra ható terapeutikumok II. Cékituzések III. Anyag és módszer 1. In vitro módszerek Bázikus peptidek szintézise Sejtek Beteganyag Statisztika Sejtproliferáció vizsgálata in vitro Migrációs teszt 2. In vivo módszerek

2

4 5 6 6 6 6 7 8 9 9 9 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 15 17 17 18 19 20 20 21 21 22 23 23 24 25 27 27 27 27 28 28 28 29 29

In vivo lép-máj kolonizációs modell Szubkután tumornövekedés vizsgálata Peptid kezelés máj kolonizációs modellben Tumor-indukált angiogenezis meghatározása Angiogenezis vizsgálata in vivo 3. Molekuláris biológiai módszerek C-met expresszió meghatározása RT -PCR-ral C-met protein kimutatása western blot módszerrel Sejtvonalakon Tumorszöveten A c-met expresszió meghatározása áramlásos citometriával Heparánszulfát proteoglikán expresszió meghatározása áramlásos citometriával 4. Morfológiai módszerek C-met protein kimutatása patológiai anyagon Antigén expresszió vizsgálata adherens sejteken lézer-scanning mikroszkóppal IV. Eredmények Bázikus peptidek heparinköto képességének vizsgálata I. fejezet: C-met expresszió vizsgálata humán kolorektális karcinómákon, és a HGF in vitro biológiai hatása Humán koloektális sektvonalak áttétképzése Humán kolorektális sejtvonalak c-met expressziója HSPG expresszió vizsgálata áramlásos citometriával HGF hatása humán kolorektális karcinóma sejtvonalak motilitására in vitro A c-met fehérje expressziója primer kolón daganatokban II. fejezet: HGF mimetikus peptidek biológiai hatásai HGP peptidek hatása in vitro sejtproliferációra HGP kezelés hatása különbözo típusú tumorsejtek in vitro növekedésére és májáttét képzésére Bázikus HGP-szeru hexapeptidek in vitro hatásai III. fejezet: HGP peptidek hatása az angiogenezisre Bázikus, és HGF eredetu bázikus peptidek hatása angiogenezisre csirke chorioallantois membrán rendszerben Bázikus peptidek hatása Kaposi szarkóma sejtek proliferációjára Bázikus peptidek in vitro hatása humán agyi mikroér endotél sejtekre Tumor-indukált angiogenezis vizsgálata V. Diszkusszió 1. A HGF és c-met rendszer szerepe kolorektális daganatok áttétképzésben 2. HGF eredetu és kisméretu peptidek biológiai hatásai I.: Antitumorális hatás 3. HGF eredetu és kisméretu peptidek biológiai hatásai II.:Antiangiogén hatás 4. Új eredmények és megállapítások VI. Irodalomjegyzék VII. Az értekezés alapját képezo saját közlemények VIII. Függelék A táblázatok listája Az ábrák listája Rövidítések

3

29 29 30 30 31 31 31 32 32 32 33 33 34 34 34 36 36 37 37 37 42 43 45 49 49 50 53 55 55 57 57 58 60 60 62 65 66 69 79 81 81 81 82

Összefoglalás Az irodalomból ismert, hogy a c-met onkoprotein többféle tumorban, köztük a kolorektális daganatokban overexpresszált. Az azonban nem tisztázott, hogy ennek van-e szerepe a kolorektális tumorok áttétképzésében, s ha igen, az milyen mechanizmuson alapszik. Mivel a HGF a máj egyik növekedési faktora és ez a szerv a kolorektális daganatok áttétképzésének fo célpontja, felmerült annak a lehetosége, a HGF – c-met kapcsolat szerepet játszik ebben a folyamatban. Arra, hogy ez milyen mechanizmus szerint történik, többféle lehetoség kínálkozott. Munkánk célja néhány potenciális hatásmechanizmus vizsgálata és az eredmények gyakorlati (terápiás) hasznosítási lehetoségeinek tisztázása volt. Az elso, legkézenfekvobb lehetoség, hogy a HGF – c-met kapcsolat a tumorsejt számára mitogén, motogén, vagy mindkét úton segíti elo az áttétképzést. Mivel ismert, hogy a plazmából tisztított HGF angiogenezist indukál, másodikként megvizsgáltuk a c-met, illetve rekombináns humán HGF szerepét a daganatok angiogenezisében. Reális lehetoségként merült fel, hogy a HGF ?-láncának kisméretu bázikus, feltehetoen heparinköto peptidjei, valamint a HGFszekvenciák alapján tervezett szintetikus bázikus hexapeptidek befolyásolják a tumorok viselkedését, mivel irodalmi adatok azt igazolták, hogy a HGF heparinköto növekedési faktor, és a megfelelo szekvenciával rendelkezo bázikus, heparinköto peptidek különbözo biológiai aktivitással bírnak. Megvizsgáltuk e peptidek hatását sejtproliferációra, áttétképzésre, valamint angiogenezisre egyaránt. Azon eredményeinkbol, amelyek azt igazolták, hogy a vad típusú c-met protein expressziója csak metasztatikus sejtvonalainkon volt kimutatható, hogy a rhHGF csak az áttétképzo sejtvonalak motilitását növelte és hogy a Duke’s C stádiumú humán kolorektális adenokarcinómákban a c-met expressziója magasabb volt mint a Duke’s B stádiumúaké, arra következtetünk, hogy HGF – c-met rendszer a kolorektális daganatok áttétképzésében inkább a motogén, mintsem a mitogén hatásával vesz részt. Abból, hogy a HGP1 és HGP2 HGF ?-lánc peptidek képesek voltak gátolni a HT25 humán kolorektális adenokarcinóma és az M1/9 humán melanóma sejtvonal in vitro proliferációját, hogy a HGP1 HGF ?-lánc peptid gátolta a HT25 humán kolorektális adenokarcinóma szubkután növekedését és a HGP1 HGF ?-lánc peptid gátolta HT25 humán kolorektális adenokarcinóma, M1/9 humán melanóma, valamint 3LL-HH egér tüdokarcinóma állatokban történo áttétképzését, arra következtetünk, hogy a kisméretu HGF ?-lánc peptidek antitumorális hatással bírhatnak. Abból, hogy a HGP1, HGP2 HGF ?-lánc peptid és a BP4 bázikus hexapeptid gátolta az angiogenezist in vivo choriallantois membrán modellben, a HGP1, HGP2 HGF ?-lánc peptid és a BP4 bázikus hexapeptid gátolta humán kisagyi endotélsejtek proliferációját in vitro és hogy a HGP1 HGF ?-lánc peptid befolyásolta szubkután növo HT25 humán kolorektális adenokarcinóma által indukált angiogenezist, arra következtettünk, hogy a kisméretu HGF ?lánc peptidek, valamint kisméretu bázikus peptidek antiangiogenikus hatással bírhatnak. Mindez azt jelentheti, hogy kisméretu bázikus, növekedési faktor eredetu, vagy tervezett peptidek a tumorellenes szerek egy csoportjának kiindulópontjai lehetnek.

4

Summary It is known that c-met protein is overexpressed in several types of tumors including colorectal carcinomas. But it is not clear what is the role of this in the metastasis of colorectal cancers. Since HGF is one of the growth factors of the liver and main target of metastatsis of colorectal cancers it has been arose that relation between HGF and c-met play role in this process. There are several kinds of possible mechanism. The aim of our work was to study of some possible mechanism and to clarify the possib le therapeutic value of our results. The most obviuos possibility is that the HGF - c-met relation helps the metastasis by mitogenic or motogeginic or both way. Since it is known HGF purufied from blodd plasma induces angiogenesis secondly the role of HGF and c-met in angiogenesis of tumors was studied. It seemed to be a real possibility that small basic presumably heparin binding peptides of HGF ? chain and bsaic hexapeptides designed on the basis of HGF sequence could influence the behaviour of tumors because earlier studies has proven HGF is a heparin binding growth factor and basic heparin binding peptides have several biological activity. The effect of these peptides on cell proliferation, metastasis and angiogenesis was studied, too. We demonstrated that the expression of wild type c-met was detectable on metastatic cell lines, moreover the motility of metastatic human colorectal adenocarcinomas was increased by rhHGF treatment. On the other hand the expression of c-met was higher in Duke's C human colorectal cancer than in Duke’s B tumors. These data suggest that the HGF – c-met system plays role in metastasis of colorectal cancers by its motogenic effects. We found that proliferation of HT25 human colorectal adenocarcinoma and M1/9 human melanoma was inhibited by HGP1 and HG2 HGF ? chain peptides. Furthermore the subcutaneous growth of HT25 human colorectal adenocarcinoma was inhibited by HGP1 HGF ? chain peptide. Moreover the liver metastasis of HT25 human colorectal adenocarcinoma, M1/9 human melanoma and 3LL-HH rident lung carcinoma was inhibited by HGP1 HGF ? chain peptide. These results suggest that small HGF ? chain peptides could have antitumoral effect. We showed that angiogenesis was inhibited in chicken choriallantois membrane model by HGP1 and HG2 HGF ? chain peptides and the artificial BP4 basic hexapeptide. Moreover the proliferation of human cerebellar endothelial cells was inhibited by HGP1 and HG2 HGF ? chain peptides and the artificial BP4 basic hexapeptide. Furthermore the angiogenesis induced by subcutaneous HT25 human colorectal adenocarcinoma was influenced by HGP1 HGF ? chain peptide. These findings suggest that small basic peptides of HGF ? chain and small basic hexapeptides could have antiangiogenic effect All of these data could mean that small basic peptides derived from growth factors could be developed as of a new group of anticancer agents.

5

I. Bevezetés

A daganatos progresszió

Az áttétképzés folyamata, a metasztatikus kaszkád (1)

Az invázió folyamata a daganat típusától függetlenül hasonló lépésekben játszódik le. A folyamat több lépésbol áll, és ezek mindig feltételezik az elozo bekövetkeztét. Ez azt is jelenti, hogy a tumorsejteknek egyre összetettebb biológiai tulajdonságokkal kell rendelkezniük. Az inváziós és metasztatikus kaszkád magába foglalja tehát a folyamat egyes lépéseit, a primer tumorból történo leszakadástól, a távoli szervekben történo letelepedésig. A folyamat a primer tumorból történo sejtleválással kezdodik, ami aktív folyamat, és a környezo mátrixhoz történo kitapadást (adhézió), annak legalább részleges lebontását (degradáció) és az azon való átjutást (migráció) jelenti. A tumorsejtek ekkor addig vándorolnak, amíg újabb mátrixhatárhoz nem érnek, ami lehet a nyirokerek, vagy vérerek (általában venulák) fala, ahol a bazális membránhoz kitapadva azt lebontják, és az endotél sejtek között átnyomakodva az erek lumenébe kerülnek (intravazáció). A tumorsejtek a nyirokerekbe az érfal bontása nélkül is bejuthatnak, hiszen ezen erek fal nélküli szövetrésként kezdodnek.

Az ereken belül sajátos sejt – sejt, illetve sejt – mátrix kölcsönhatások lépnek fel. A tumorsejt – mátrix kölcsönhatás az érpályában keringo szolúbilis mátrix fehérjékkel való kapcsolatot jelenti, míg a tumorsejt – normál sejt kölcsönhatás alatt a vérlemezkékkel és az immunrendszer specifikus és nem specifikus effektor sejtjeivel való kapcsolatokat értjük. A mindezeket túlélo tumorsejtek a távoli szervek terminális érszakaszaiba jutva, ott megakadnak, és a keringésbol kiléphetnek.

Az extravazáció során a keringésben lévo tumorsejtek eloször az endotélsejtekhez kapcsolódnak, összehúzódásukat váltják ki, majd kapcsolatba lépnek az endotél alatti mátrixszal, és itt ugyanaz történik, mint az intravazáció során: kitapadás, lebontás.

6

A folyamat végén, az új helyen megtelepedett tumorsejtek proliferálni kezdenek, és a primer tumorhoz hasonlóan bizonyos nagyság elérése után stromát és érújdonképzodést indukálnak. (I. táblázat)

I. táblázat.A metasztatikus kaszkád Primer tumor Lokális invázió

Szóródás

Áttét

Proliferáció Tumor-indukált angiogenezis Kitapadás a környezo mátrixhoz Mátrix enzimatikus bontása Migráció a lebontott mátrixon át Intravazáció Kitapadás a szubendoteliális bazális membránhoz Bazális membrán enzimatikus bontása Bevándorlás az ér lumenébe Keringés Fibrinogé n és más szérumfehérjék megkötése Aggregálódás trombocitákkal Heterotípiás kölcsönhatás keringo mononukleáris sejtekkel Extravazáció Kitapadás az endotél luminális felszínéhez; endotélretrakció Kitapadás a szubendoteliális bazális membránhoz Bazális membrán enzimatikus bontása Migráció a környezo intersticiumba Proliferáció Tumor-indukált angiogenezis

Lokális invázió…

A lokális invázió mechanizmusa

Adhézió A

tumorsejtek

ECM- fehérjékkel

kialakuló

kölcsönhatása

a

fentiek

alapján

kulcsfontosságú eleme az inváziónak. A kölcsönhatást úgynevezett adhéziós receptorok közvetítik, melyek integrinek, nem- integrin típusúak és proteoglikánok.

Az integrinek normál és daganatos sejtek legfontosabb adhéziós receptorai és különleges szignálreceptorként funkcionálnak. Az integrinek expressziójában jelentos változások mennek végbe a malignus transzformáció során, az eredeti receptor mintázathoz képest. A leggyakoribb jelenség a legáltalánosabb fibronektinreceptor az ? 5? 1 integrin expressziójának csökkenése vagy eltunése. Az inváziós képesség

7

kialakulásakor nemcsak a kiinduló (normál) sejtekre jellemzo integrin expresszió vész el, hanem új, sokszor ektópiás integrin expressziója jelenik meg. Jó példa erre a limfoid daganatokban fokozódó ? 2 integrin expressziója (2, 3), a rhabdomyosarcomákban megjeleno ? 2? 1 (4), vagy a melanómákban észlelheto fokozott ? v? 3 (5, 6)és a megjeleno ? II? 3 (7) expresszió. Az integrinek mellett a lamininreceptorok is fontos szerepet játszanak; a fokozódó lamininreceptor-expresszió és –funkció általában emloés vastagbélrákok jellemzoje (8, 9, 10, 11).

A mátrixfehérjék nem specifikus, de annál fontosabb sejtfelszíni receptorai, normál és tumorsejtekben egyaránt a proteoglikánok, ezek közül is a heparánszulfát (HS) proteoglikánok. Ennek oka az, hogy a mátrixfehérjék többségén (fibronektin, laminin, vitronektin, intersticiális kollagén) specifikus HS-köto helyek vannak, míg a proteoglikánok jelentos része, mint transzmembrán fehérje, képes mátrixintegráló funkciót betölteni. Az inváziós/metasztatikus képességu tumorsejteken bizonyos típusú HS proteoglikánok mennyisége megno (12, 13, 53).

Mátrixbontás Normális sejtek esetében a kitapadás általában a sejtek lehorgonyzását eredményezi, differenciálódási lehetoséget jelent. Malignus tumorsejtek esetében pedig lizoszómális enzimek szekretálódnak a mátrix kötés helyén. A fokozott mátrixbontás másik oka az, hogy az invazív tumorsejtekben számos mátrixbontó enzim expressziója fokozódik: a mátrix metalloproteinázoké (MMP), a katepszineké, és a plazminogénaktivátoroké. Az MMP család tagjai közül az MMP9 normál sejtekben is expresszálódik, mikor azok bazális membránon jutnak keresztül (pl. limfociták, makrofágok). Ugyanakkor az MMP2, gyakran expresszálódik invazív tumorsejtekben és indukálódik a daganatos strómában is. A katepszin D, illetve G expressziója mellrákokban, a katepszin B expressziója egyéb tumorféleségekben is megemelkedik (14, 25). Legáltalánosabb jelenség, hogy a tPA, illetve uPA expressziója jelenik meg, illetve fokozódik (16). Ez az enzim nemcsak a környezo mátrixot bontja, de aktivál más mátrixbontó enzimeket is.

Természetesen a bontó enzimek aktivitása szabályozás alatt áll, ezt két mechanizmus látja el. Az egyik a génszintu szabályozás, azaz amikor az enzim génje aktiválódik a tumorsejtben, adott esetben pl. autokrin vagy parakrin nö vekedési faktor vagy citokin

8

hatására. A másik szabályozási ág a gátlórendszerek. Mind a három mátrixbontó enzimrendszernek van inhibitora. Az MMP-k gátlói a TIMP fehérjék, a katepszinek gátlói a stefinek, a plazminogénaktivátoroké a PAI-k (PA inhibitor). Invazív fenotípus esetén nemcsak a bontóenzimek expressziója fokozódhat, hanem a gátlórendszer is sérülhet (17, 18, 19).

Migráció (20, 21, 22) A migráció, az aktív mozgás képessége elengedhetetlen feltétele a lokális inváziónak, s így az áttétképzésnek. A tumorsejtek vándorlásuk során folyton kapcsolatban vannak a környezo mátrixfehérjékkel, ezért ebben a folyamatban a mátrixreceptorok, s ezeken belül különösen az integrinek alapveto szerepet töltenek be. Ezek részben olyan jeleket indítanak el a sejtekben, melyek hatására a sejtek mobilizálódnak, másrészt a degradáló enzimek hatására felszabaduló kis peptidek kemotaktikus jeleit ismerik fel. Emellett számos auto- és parakrin növekedési faktor és citokin is képes a migrációt szabályozni, mint például az AMF (autokrin motilitási faktor) és a HGF (hepatocita növekedési faktor).

Szóródás mechanizmusa

Tumorsejt-ECM kölcsönhatások a keringésben Az intravazáció során a keringésbe jutott tumorsejtek az érpályában oldott állapotban levo mátrixfehérjékkel, foleg a vitronektinnel, a fibronektinnel, és a fibrinogénnel léphetnek kapcsolatba. Ezek a kapcsolatok az integrin receptorokon keresztül valósulnak meg. Azok a tumorsejtek képesek a szérum ECM- fehérjéivel kapcsolatba lépni, melyeknek fibrinogén/vitronektin receptoruk van, mint a ? 3 integrin család (vitronektinreceptor: ? v? 3, fibrinogénreceptor: ? II? 3).

Tumorsejt – normál sejt kölcsönhatás az érpályában A/ Tumorsejt – endotél kölcsönhatás (23, 24) Az intravazáció során a szubendoteliális bazális membrán felol érkezo tumorsejt betör az endotél rétegbe és ott mechanikus károsítás révén jut az ér lumenébe. Ez a károsodás

9

bekövetkezhet attól is, hogy az endotél sejtek, ha idolegesen is, de elvesztik kapcsolatukat a bazális membránjukkal.

B/ Tumorsejt – trombocita kölcsönhatás (25) A hematogén áttétet adó tumorsejtek jó trombocita aggregáló képességgel bírnak. A kialakuló vérlemezke buroknak két szerepe lehetséges. Egyfelol a véráramban a tumorsejtek nagy mechanikai traumának va nnak kitéve, és ezt fogják fel a trombociták. Másrészrol a burokban a tumorsejtek rejtetté válnak az immunrendszer elol. Olyan tumorsejtek képesek vérlemezke aggregációra, melyek felszínén az ? II? 3 integrin vagy más fibrinogén-receptor expresszálódik, mivel a vérlemezke aggregáció elsosorban a vérlemezke ? II? 3 integrinje és a szérum fibrinogénje által mediált folyamat. A trombocita-tumorsejt aggregátumok létrejöttéhez a tumorsejteken trombocitákra jellemzo sejtadhéziós molekuláknak kell megjelenniük. Ilyenek a P-szelektinek, melyek gyenge adhéziós molekulák és a kezdeti véletlenszeru sejt – sejt találkozások hatására jelennek meg. Kapcsolódásuk hatására újabb kálcium- függo adhéziós molekula, a PECAM jelenik meg a sejten. Ezek olyan jeleket indítanak el a sejtekben, melyek hatására integrinek megjelenését váltják ki; ez utóbbiak már tartós sejt–mátrix vagy sejt-sejt kapcsolatot biztosíthat.

Az extravazáció mechanizmusa (26, 27, 28) Ebben a folyamatban a tumorsejt – endotél kapcsolat és a tumorsejt – szubendoteliális membrán kölcsönhatások játszanak szerepet. A tumorsejt és az endotél közötti kölcsönhatás a lassuló keringésben az úgynevezett gö rdülési fázisban jön létre. Ekkor Eszelektinekkel közvetített gyenge cukor – cukor kölcsönhatások alakulnak ki. A szelektinek aktiválódása révén elindított jelek az E-CAM (I-CAM) adhéziós molekula endotél- és tumorsejt felszínén fokozódó megjelenését eredményezik. Az I-CAM molekulák ligandjai az ellenoldali sejten lévo ? 4? 1 integrinek. Ez a kapcsolat olyan aktiválást eredményez a két sejttípusban, melynek eredményeként a gördülés leáll és fix tumorsejt – endotél kapcsolat alakulhat ki, amit a felszínre kerülo integrinek, a tumorsejt felol az ? v? 3 vagy ? II? 3, az endotél felol pedig az ? v? 3 közvetít. A folyamat eredményeként az érintett endotél sejtek összehúzódnak, hozzáférhetové téve a szubendoteliális membránt. A mátrix a fokozott ? 3 integrin expresszióval rendelkezo tumorsejteket kitapadásra készteti. A folyamat révén gerjesztett izgalmi állapot

10

eredményeként a tumorsejtek citoplazmájában rendelkezésre álló lizoszómális enzimek egy része (katepszin B, uPA, kollagenáz IV) szekretálódik, és az adhéziós pontoknál degradálja az ECM fehérjét. A szolubilizálódó ECM fehérjék kemotaktikus ingerként elindítják a tumorsejtek vándorlását. A szubendoteliális mátrixban levo növekedési és motilitási faktorok szintén segíthetik az extravazáció folyamatát.

A daganatok szervi áttétei Tüdo metasztázis

Az emberi daganatok áttétképzésében az egyik leggyakrabban érintett szerv a tüdo.(1. táblázat) Ezt azzal a ténnyel lehet magyarázni, hogy a rosszindulatú daganatok többsége olyan anatómiai elhelyezkedésu, ahonnan az elfolyó vénák a tüdobe vezetnek, valamint a nyirokrendszeren keresztül szóródó tumorok is végül szintén a vena cava superior-ba jutnak. Az intratumorális véredényekbe kerülo tumorsejtek gyakran a vénákon keresztül jutnak a keringésbe, majd a tüdo artériába kerülnek, és mint kis embolusok elérik prekapilláris venulákat. Említésre érdemes, hogy a tüdo metasztázisok gyakran a pleura közelében helyezkednek el, aminek az oka nagyrészt ismeretlen. A nyirokrendszeri áttét a primer tumor felszínérol indul, minthogy a tumorokon belül nincsenek nyirokerek. A tumorsejtek a tüdoparenchimát retrográd módon, a mediastinális- hiláris nyirokcsomókból is elérhetik.

1. táblázat. A különbözo primer tumorok szervi áttéteinek gyakorisága Primer hely

Metasztázis helye Csont (%)

Agy (%)

Tüdo (%)

Máj (%)

Tüdo

20-36

18-37

21-60

25-48

Emlo

33-76

9-20

59-69

56-65

Prosztata

50-70

2

15-53

5-13

22

8

25-40

60-71

Vastag- és végbél

Másrészrol, nagyon fontos és még megmagyarázatlan az, miképp képesek a tüdo artériában levo tumorsejtek átjutni a tüdo mikrocirkulációs rendszerén és az artériás keringésen át esetleg más szervekbe jutni. Ez a jelenség , melyet "ugráló

11

metasztázisnak” neveznek, tovább erosíti az áttéti folyamat szerv szelektivitásának elméletét (30).

Májáttét A

máj,

hasonlóan

a

tüdohöz,

gyakran

érintett

a

tumor

szóródásban.

A

gasztrointesztinális rendszer daganatainak állandó jellemzoje, de a tüdo, emlo, vese, húgyhólyag, here tumorai, valamint a melanóma is gyakran ad áttétet a májba. Ez utóbbiak

esetében

ez

inkább

e

tumorok

szóródásának

szervspecifitásával

magyarázhatók, mint az anatómiai elhelyezkedésükkel, miképp a gasztrointesztinális rendszer daganatai esetében. A tumorsejtek a vena porta-ból a perilobuláris ágaknál lépnek be a májba. Többségük azonban eléri a szinuszoidokat, ezért a máj mikrometasztázisainak többsége intralobulárisan kezd el fejlodni (31). Másrészrol a mikrometasztázisok májbeli eloszlása véletlenszeru, ami a lobus – preferencia hiányára utal. Jelentos, újabb keletu megfigyelés, ami ellentmond a régi dogmának, hogy a májáttétek többsége vagy szimpla portális vérellátású, vagy dupla, portális és artériás vérellátású (32). Ezt a tényt a máj metasztázisának lokoregionális kezelése tervezésénél megfontolás tárgyává kell tenni (33).

Csontáttét A harmadik leggyakoribb áttéti szerv a csont. A csontáttét az emlo- és a prosztatarák jellemzoje, de a tüdo, vastagbél, vese, pajzsmirigy, here, és a húgyhólyag, vese daganatai is az esetek 20-40 %-ban képeznek csontáttétet, amit szintén nem lehet megmagyarázni anatómiai okokkal. Korábban dogmatikusan úgy tartották, hogy a prosztata tumor a Batson vénákon kereszt ül szóródik a gerincbe (34). Manapság ezt megkérdojelezik, rámutatva a regionális artériás rendszer ezen folyamatban, hasonlóan más tumor típusokban (35, 38), betöltött szerepére. A csontvelobe bejutva a tumorsejtek vagy évekig alvó állapotban maradnak, mint ahogy az emlotumorok esetében ez általános (36), vagy proliferálni kezdenek és átalakítják a csontszövetet, ami két módon történhet. Az emlo- és vese karcinómák sejtjei, valamint a plazmocitóma sejtek osteoclast aktivációt indukálnak, ami helyi csont rezorpcióhoz, azaz oszteolitikus csont metasztázishoz vezet (37). Vannak olyan tumorok is, pl prosztata rák, amelyek gyakrabban oszteoplasztikus áttéteket képeznek, aminek az oszteoblaszt aktiváció a kulcslépése (38).

12

Agyi áttét Az áttétek negyedik leggyakoribb helye az agy. Elsosorban a tüdo és az emlo tumorok jellemzoje, más szervek malignitásainál ez sokkal ritkább. A leggyakrabban primer vagy szekunder tüdo tumorokból származó sejtek az artériás keringés által szóródnak. A tumorsejt embolusok a szürke- és fehérállomány határán elszukülo erekben elakadnak. Az agy különbözo területeinek artériás vérellátása nem egyforma. A kifejlodo metasztázisok gyakorisága követi ezt a mintázatot (80 % féltekei, 15 % kisagyi, 5 % agytörzsi). Érdekes, hogy más tumoroktól eltéroen, a melanóma és a tüdorák hajlamos többszörös agyi áttétek képzésére.

A metasztázis képzés szerv-specificitása

Az áttétkéozés szervspecificitásának problémáját Paget 1889-ben ismerte fel. Elmélete ellentétes Ewing (1928) (39) mechanikus kiszurodés elméletével. Paget felvetése a “mag és talaj” elmélet, mely szerint mind a tumorsejt, mind a gazdaszerv egyedi fenotípusa felelos az adott szervi metasztázis kialakulásáért. Az eltelt bo száz évben még mindig nem sikerült eleget megtudni a szervspecifikus áttétképzés részleteirol.

Tudjuk, hogy az MHC molekulák és a sejtadhé ziós molekulák alapján a szervek mikroerei, a tumorsejtek elsodleges szuroi, szerv-specifikus fenotípussal rendelkeznek. Így ez a fenotípus szolgálhat elsodleges felismerési mechanizmusként (40). A szubendoteliális mátrix, amely szerkezetileg eltéro szervenként, és különbözo szervspecifikus citokineket tartalmaz, ami egy másik felismerési mechanizmust jelenthet (40). Fontos felidézni azokat a kísérletes tanulmányokat, melyek azt mutatják, hogy a bazális membránok különbözo módon érintettek erosen metasztatikus tumorok szerv kolonizációjában: A máj metasztázisok a szinuszoidális szubendoteliális mátrix heparán - szulfát komponensétol, a tüdo metasztázisok pedig a mátrix laminin és fibronektin komponenseitol függtek (41). Végül a tumorsejteknek képesnek kell lenni arra, hogy reagáljanak a helyi mitogénekre, s ez korlátozó tényezo lehet a szervi metasztázis kialakulásában. Kísérletes adatok arra utalnak, hogy a különbözo tumortípusok fokozott agyi és tüdo áttét-képzo képessége tüdo- vagy agyi- eredetu transzferrinre való válaszképességtol függhet (42). Ugyanakkor a receptor, melyhez ez a transzferrin

13

kötodhet a tumorsejten, még nincs azonosítva: ez lehet maga a transzferrin receptor, vagy más transzferrin köto sejtfelszíni fehérjék. Sajnos, ezeket a megfigyeléseket nem követték humán tüdo vagy agyi metasztatikus tumorokon végzett tanulmányok. Az olyan, májeredetu, a humán kolón karcinóma sejtek májmetasztázis kialakulását elosegíto mitogének, mint a TGF? , EGF, és a HGF, bizonyultak a helyi növekedési faktoroknak. Másrészrol, a kolón karcinóma sejtek EGFR expresszióját próbálták összefüggésbe

hozni

májmetasztatikus

potenciáljukkal,

hogy

legalább

egy

munkamodellt hozzanak létre a gasztrointesztinális rendszer tumorainak májszelektivitására (43). A metasztatikus folyamat csont specifitásban csont mátrix- fehérjék tumorsejtekben történo ektópiás expressziója játszhat szerepet. Azok a tumorok, amelyekben oszteonektin, oszteokalcin, és/vagy csont-szialoprotein expresszió fordul elo, (emlo-, prosztata-, és pajzsmirigydaganatok), jellemzoje a csontáttétképzés. Ezeket a daganatokat csontmetasztázis preferencia jellemzi (44, 45, 46). Szintén vannak arra utaló adatok, hogy a prosztata tumorsejtek által termelt endothelin-1, uPA és PSA a csont stróma sejtek csont növekedési- (bFGF, TGF? , HGF, IGF) és csont morfogén fehérjék (BMP) termeléséhez és így az áttéti fókusz körüli új csont képzodéshez vezet (46). Oszteolítikus metasztázis akkor alakul ki, mikor a tumorsejtek oszteoklasztaktváló citokineket, PTH-szeru peptideket, TGF? -t, TNF? -t, TNF? -t, M-CSF-t, IL-16t, vagy prostanoidokat termelnek.

Jelen dolgozat szempontjából a daganatos progresszió elemei közül a HGF- fel, mint lokális növekedési faktorral, az angiogenezissel, mint a folyamat egyik limitáló lépésével, valamint a proteoglikánok ezen folyamatokban betöltött szerepével óhajtunk részletesebben foglalkozni.

14

A hepatocita növekedési faktor és receptora, a c-met onkoprotein

Irodalmi adatok szerint kísérletes körülmények között a megnövekedett májáttét képzo képesség a tumorsejtek megnövekedett sejtfelszíni heparánszulfát proteoglikán expressziójával volt kapcsolatos (53).

A hepatocita növekedési faktort (HGF) eloször patkány vérlemezkékbol (55), fulmináns májkárosodott betegek szérumából (56), valamint nyúlszérumból (57) izolálták. A HGF egy heterodimér protein, mely egy 69 kDa ? láncból és egy 34 kDa ? láncból áll (55, 56, 57). A humán HGF teljes aminósav szekvenciája ismert. (1. ábra) 1. ábra. A humán HGF szekvenciája és domén szerkezete. K1-K4=Kringle1-4 domén. Dolt betu=bázikus szekvenciák. Félkövér dolt betuk=megszintetizált bázikus szekvenciák. (54, 55, 56,57, 58, 59) signal peptide 32-alpha chain 1 MWVTKLLPAL LLQHVLLHLL LLPIAIPYAE G QRKRRNTIH EFKKSAKTTL IKIDPALKIK hairpin loop 61 TKKVNTADQC ANRCTRNKGL PFTCKAFVFD KARK QCLWFP FNSMSSGVKK EFGHEFDLYE 128 K1 121 NKDYIRNCII GKGRSYKGTV SITKSGIKCQ PWSSMIPHEH SFLPSSYRGK DLQENYCRNP 206 211 K2 181 RGEEGGPWCF TSNPEVRYEV CDIPQCSEVE CMTCNGESYR GLMDHTESGK ICQRWDHQTP 288 241 HRHKFLPERY PDKGFDDNYC RNPDGQPRPW CYTLDPHTRW EYCAIKTCAD NTMNDTDVPL 305 K3 301 ETTECIQGQG EGYRGTVNTI WNGIPCQRWD SQYPHEHDMT PENFKCKDLR ENYCRNPDGS 383 391 K4 361 ESPWCFTTDP NIRVGYCSQI PNCDMSHGQD CYRGNGKNYM GNLSQTRSGL TCSMWDKNME 469 421 DLHRHIFWEP DASKLNENYC RNPDDDAHGP WCYTGNPLIP WDYCPISRCE GDTTPTIVNL 495-beta chain HGP2 481 DHPVISCAKT KQLRVVNGIP TRTNIGWMVS LRYRNKHICG GSLIKESWVL TARQCFPSRD 541 LKDYEAWLGI HDVHGRGDEK CKQVLNVSQL VYGPEGSDLV LMKLARPAVL DDFVSTIDLP HGP1 601 NYGCTIPEKT SCSVYGWGYT GLINYDGLLR VAHLYIMGNE KCSQHHRGKV TLNESEICAG 661 AEKIGSGPCE GDYGGPLVCE QHKMRMVLGV IVPGRGCAIP NRPGIFVRVA YYAKWIHKII 721 LTYKVPQS

15

A HGF egyláncú 728 aminosavból álló prepropeptidként szintetizálódik, amibol 29 aminosav a szignálszekvencia és 25 aminosav a pro-szekvencia. A láncot a 494. arginin és a 495. valin között széthasítja egy proteáz, majd a keletkezett láncok diszulfid híddal kapcsolódnak. Mindkét alegységen 2 potenciális N-glikolizációs hely van, és O-kötött szénhidrátot is megfigyeltek a ? láncon (57). Az ? alegységen 4 db u.n. kringle domén van, és az ? lánc szerepel a c- met receptor, valamint a heparin-kötésben is. A HGF-nek létezik 2 rövidebb alternatív formája is, az NK1 és az NK2. Az NK1 az ? lánc N terminusától az elso kringle domén végéig tart és tartalmaz egy intron szekvenciát is (58, 59). Az NK2 lánc az ? lánc N terminusától a második kringle domén végéig tart (60). A HGF génje egy másolatban van jelen a genomban, egérben az 5. kromoszómára, emberben a 7. kromoszóma q21.1 helyére lokalizálódik (61, 62).

A HGF receptora a c-met onkoprotein (63), melynek génje emberben a 7. kromoszóma q21-31 helyére lokalizálódik. A c- met szintén hetrodimér protein, ami az 50 kDa ? láncból, valamint a hozzá diszulfid hidakkal kötött, 145 kDa molekula tömegu, extracelluláris, transzmembrán, és intracelluláris katalitikus doménekbol felépülo ? alegységbol áll (64, 65, 66, 67). Humán hámsejteken a c- met többféle formában expresszálódhat, melynek oka az alternatív splicing, s ennek eredményeként 200, 170, 65 kDa formák jelenhetnek meg. Ez utóbbinak, melynek nincs extracelluláris doménje, src-szeru tirozin-kináz aktivitása van, s elsosorban tumorsejteken jelenik meg (68).

Irodalmi adatok szerint a HGF sejtfelszíni heparánszulfát-proteoglikánokhoz történo kötodése segíti a c- met jelátviteli aktiválódását (69). Korábbi cikkek rámutattak arra, hogy a sejtfelszíni proteoglikánok fontos szerepet játszanak egyes rágcsáló és humán tumorok májáttét képzésében (30). Ezek az adatok a sejtfelszíni HSPG-k metasztázisban betöltött szerepére utalnak, ugyanakkor a HGF – c- met rendszerrel fennálló esetleges kapcsolatról nincs még adatunk.

A HGF és heparin közötti kölcsönhatást a citokin pozitívan töltött aminosav csoportjai (Lys, Arg, His) és a proteoglikánok glikózaminóglikánjainak negatívan töltött cukor tagjai (szulfát vagy karboxil láncok) közvetítik (70, 71, 72). A protein – GAG

16

kölcsönhatás minimum feltétele az 5-6 egységbol álló oligoszachharid, valamint az 5-6 aminosavból álló bázikus peptid szakasz (73, 74).

A HGF-et a májban az Ito-sejtek termelik (82), fiziológiás szerepe a májkárosodás utáni májregenerációban van (83). A májban a HGF jelentos része a periportális területekre lokalizálódik, s a májkárosodás utáni mitogén jel eloször a periportális területekrol indul (84). A HGF plazmaszintje emberben kisebb, mint 0.5 ng/ml (85), patkányban 20 ng/ml (86).

Tumor-idukált angiogenezis, az angiogenezis formái (III)

A véredények az embrióban az u.n. vaszkulogenezis során alakulnak ki. E folyamat során a differenciálatlan angioblastok in situ endotél sejtekké érnek, amelyek érhálózattá állnak össze (87). Az angoigenezis kifejezés újabban azt a folyamatot jelenti, melynek során az egyszeru érhálózat átalakul komplex hálózattá (88). Felnottben új erek foleg angiogenezissel alakulnak ki, de vaszkulogenezis is elofordulhat. A vaszkuláris miogenezis során a periciták stabilizálják az újonnan képzodött véredényeket, úgy, hogy gátolják az endotél sejtek proliferációját és migrációját, valamint serkentik az extracelluláris mátrix képzését. Az új erek gyorsabban degradálódnak, ha nem fedik oket simaizom-sejtek (89).

A vaszkulogenezis

A vaszkulogenezis folyamata a következo: Az endotél sejteknek és a hemopoietikus sejteknek közös osük van, a hemangioblast. A szikzacskóban a hemangioblastok csoportokat képeznek, a belso sejtek hematopoietikus progenitorokká, a külso sejtek pedig endotél sejtekké fejlodnek. Az angioblasztok migrálni képesek az in situ differenciáció elott. A VEGF, a VEGFR2, és a bFGF és receptora a FGFR (FGF receptor) befolyásolja az angioblast differenciációt (90, 91, 92, 93). A FN és receptorai az ? 5? 1 és ? 5? 3, valamint ? v? 3 integrinek, amelyek kölcsönhatásokat közvetítenek az endotél sejtek és a mátrix makromolekulák között, szintén befolyásolják a

17

vaszkulogenezist. Madarakban az ? v? 3 integrin részt vesz a vaszkulogenezisben, de rágcsáló embriókban nem (95). Korábban úgy gondolták, hogy endotél prekurzor sejtek csak az embrionális élet során vannak jelen, azonban felnott csontveloben és perifériás vérben kimutattak ilyen sejteket. VEGF, GM-CSF, bFGF és IGF-1 stimulálja differenciációjukat és mobilizációjukat (96, 97).

Az angiogenezis

Az angiogenezis újabb értelmezés szerinti folyamata az (88) a 2. táblázatban látható.

Az angiogenezis vazodilatációval kezdodik, mely folyamat résztvevoje a nitrogén monoxid. VEGF hatására megno az éral permeabilitás, így plazma fehérjék jutnak ki, amelyek kijelölik a lehetséges útvonalat a migráló endotél sejteknek. Ez a permeabilitás növekedés fenesztrációk, vezikulo-vakouláris organellumok, valamint a PECAM-1 és VE-cadherin molekulák átrendezodése által jön létre (98). Az angiopoietin-1, endotél sejtek Tie2 receptorának liganduma, a vaszkuláris permeabilitás természetes gátlója. Ha kifejlett erekhez adják, védelmet ad a plazmaszivárgás ellen anélkül, hogy alapvetoen befolyásolná az ér morfológiáját (99). Az endotél sejteknek ahhoz, hogy migráljanak el kell

veszíteniük

interendoteliális

kapcsolataikat,

tehát

az

érett

ereknek

destabilizálódniuk kell. Az angiopoietin2, a Tie2 receptor szignál gátlója, feltehetoen a simaizom-sejtek endotélrol történo leválásában vesz részt (100).

2. táblázat. Az angiogenezis lépései Vazodilatáció, endotél permeabilitás növekedés és periendoteliális támogatás Endotél sejt proliferáció és migráció Endotél túlélés Endotél differenciáció

A vaszkularizáció alapveto fontosságú a növekvo szövetek, de különösképpen a malignus tumorok számára, melyek e nélkül 1-2 mm- nél nagyobbra nem képesek noni (101). Az érképzodés egyik, és a legjobban tanulmányozott formája a tumor- indukálta

18

érújdonképzodés. Azonban más lehetoségek is vannak a tumor beerezodésre: 1. az ér inkorporáció és 2. az embrionális genotípus visszaszerzése, a vaszkuláris mimikri. Az, hogy melyik következik be a tumor típusától és a karcinogenezis során érvényesülo genetikai változásoktól függ.

Tumor-indukálta neoangiogenezis Tulajdonképpen a tumor- indukálta érújdonképzodés az angiogén folyamatok túlsúlyát jelenti az anti-angiogén folyamatok felett. Napjainkra elfogadottá vált, hogy a tumorsejtek fiziológiás útvonalakat használva tudják bekapcsolni az angiogén geno- és fenotípust. (102, 103, 104). Ebben az esetben a növekvo tumorszövet hipoxiás sejtjei, melyek vad típusú HIF1a gént expresszálnak, aktiválják a HRE-t tartalmazó angiogén faktorok, köztük

a fo angiogén mitogén, a VEGF génjeinek expresszióját.

Daganatokban különbözo onkogének amplifikációja az angiogén faktorok túlzott kifejezodéséhez vezet. Ez jellemzo genetikai változás azon humán daganatok jelentos részében, melyekben a vad p53 expresszió elvész. Ennek az angiogenezisre ható következménye az, hogy az ilyen sejtek nem képesek expresszálni az egyik fiziológiásan legjelentosebb angiogenezis inhibitort, a thrombospondint. Ezen változások eredményeként felborul az egyensúly az angiogén és antiangiogén faktorok expressziója közt, ami elosegíti az angiogén konverzió kialakulását (105). A tumorindukált angiogenezis elso lépése az, hogy a tumorszövet körüli venulák teljes kerületén megváltozik a bazális membrán. Ez a folyamat valószínuleg a tumorsejtek által termelt mátrix metalloproteinázok, vagy plazminogén aktivátorok közremuködésével történik. Ez a változás lehet részben felelos az endotélsejtek osztódásának és migrációjának megindulásáért. Másrészt, a folyamat során olyan, a tumorsejtek, vagy a gazda sejtek által termelt angiogenetikus faktorok szabadulhatnak fel, mint a bFGF vagy VEGF. A migráló endotélsejteknek csak egyik pólusukon nincs bazális membrán. A migráció során az endotélsejtek egymással párhuzamosan helyezkednek el és megtartják bazálisluminális polaritásukat (106), következésképpen, az endotélsejtek egy hasadék-szeru lument alkotnak. Ez a lumen az eredeti ér- lumenének folytatása és intakt interendoteliális kapcsolat zárja le. Ezen modell szerint nem kell külön stimulus a lumen kialakításához, és az endotélsejtek megtartott polaritása lehetové teszi a bazális membrán folyamatos kialakítását.(106) Számos adat arra utal, hogy az új érsarjadékok

19

nem irányulnak a tumor felé, inkább a folyamat a tumorsejt szigetek perifériáján dús kapilláris hálózatot eredményez (107). Ez vezet ahhoz a megfigyelt tulajdonsághoz, miszerint az érdenzitás a tumor körül sokkalta nagyobb, mint magában a tumor belsejében. Az egyik lehetséges magyarázat az, hogy a folyamatosan növekvo tumorszigetek benövik az ereket a tumorfészkek perifériáján így vékonyítva ezt az érhálózatot, míg az érháló folyamatosan fejlodik az elorehaladó tumor – kötoszövet határfelületen. Az erek intuszuszceptív típusú növekedése az aktív kapilláris növekedési zónán kívüli, nagyszámú nagy átméroju ereket eredményez, melyek feltehetoen a tumor táplálásában jelentosen nem vesznek részt, inkább az új érhajtásoknak biztosít helyet (106).

Vaszkuláris mimikri Azok a megfigyelések, hogy a tumorsejtek maguk is képesek csatornákat formálni in vitro, a tumor erezodés egy új formáját jelenthetik. A tumorsejtek ektópiásan expresszálhatnak olyan endotél-specifikus géneket, mint pl. a TIE1, uPA, HGF/c- met, amivel embrionális geno- és fenotípusra térnek vissza. A tumorsejtek csatornákat képezhetnek,

melyek

véletlenszeruen

összekapcsolódhatnak

a

tumor

mikrokapillárisaival. Ilyen típusú tumor szinuszok létezését humán tumorokban többen is megfigyelték (108, 109). Egyébiránt más, elméleti lehetoségek is vannak az ilyen szinuszok kialakulására, pl. a már tumor által benott normál erek programozott sejthalála (110) vagy az intratumorális erek tumorsejtek általi infiltrációja révén, ami úgynevezett mozaik erek kialakulásához vezet, amelyekben mind az endotél sejtek, mind a tumorsejtek résztvesznek a lumen megformálásában (111).

Ér inkorporáció Ez a folyamat a malignus tumorok vérellátásának egyik alternatív mechanizmusa lehet. Ebben az esetben a növekvo tumorszövet benövi a már korábban létezo gazda ereket (112). Kimutatták, hogy az ilyen tumorok angiogenetikus és antiangiogenetikus faktorokat termelnek, melyek egyensúlya alapvetoen befolyásolja mind az érképzodés folyamatát,

mind

a

bekebelezett

erezet

20

átépülését.

Megfigyelték,

hogy

az

antiangiogenetikus

faktorok

túlsúlya

az

inkorporált

erek

endotél

sejtjei

degenerációjához és apoptózisához vezet (113). Ez a folyamat tumorsejtek által szegélyezett szinuszok kialakulásához vezethet. Ezek a csatornák elméletileg fenntarthatják kapcsolatukat a “túlélo” intratumorális kiserekkel, az átalakulást túlélo szubendoteliális mátrix hálózat segítségével. Ha ilyen kapcsolat létezik, akkor az ilyen szinuszokat szegélyezo tumorsejtek igen egyszeruen beléphetnek a keringésbe (ami az elso lépése a hematogén szóródásnak!) a komplex intravazációs folyamat nehézségei nélkül (114).

Az antiangiogenetikus terápia jelenlegi lehetoségei

Napjainkra elege ndo adat gyult össze az angiogenezist szabályzó molekuláris mechanizmusokról. Világossá vált, a patológiás neoangiogenezis befolyásolása több úton érheto el, és ehhez különbözo molekulák és antiangiogenikus faktorok kombinációja szükségeltetik.

Hagyományos terápiás szerek 3. táblázat. Antiangiogenikus potenciálú hagyamányos szerek Primer indikáció Vinblasztin daganat Taxol daganat Dolestatin daganat Combrestatin A daganat flavon ecetsav daganat alacsony dózisú 5- daganat FU alacsony dózisú daganat metotrexát Irsogladine gyomor fekély Radicicol bakteriális fertozés Cyclosporin immunszupresszió Captopril ACE gátló Celecoxib gyulladás

Molekuláris célpont Mikrotubulus Mikrotubulus Mikrotubulus Mikrotubulus Citokin expresszió Timidilát szintáz

Angiogenikus célpont Endotél permeabilitás Endotél proliferáció Endotél proliferáció Endotél proliferáció Angiogenezis Endotél proliferáció

Antifólsav

Endotél proliferáció

? Hsp90

Angiogenezis Angiogenezis

Jelátvitel ACE COX-2

Angiogenezis Ér fejlodés Endotél proliferáció

Ez az érdekes csoport olyan hagyományos szereket foglal magába, amelyeket nem feltétlenül angiogenezissel kapcsolatos betegségekre terveztek eredetileg, azonban olyan mellékhatással

rendelkeznek,

mint

pl.

antiangiogenetikus

képesség.

Fole g

daganatellenes szerek tartoznak ebbe a csoportba, de más szerek is csatlakozhatnak a

21

csoporthoz (3. táblázat). Ez a folyamatosan növekvo csoport új szereket biztosított már klinikai próbákra elorehaladott daganatos betegségek és szembetegségek esetében (179).

Endotél növekedési faktor ligandok Mivel az elmúlt évek kutatásai azonosították a fo endotél mitogén növekedési faktorokat (VEGF, FGF, PDGF, HGF), ezek a ligandumok és a receptoraikkal történo kölcsönhatásaik lettek a fo farmakológiai célpontok. A csoport közös tulajdonsága, a heparin kötés, aminek felismerése egyszeru, de nem antiangiogén specifikus terápiás célpontot biztosít. Az elso gátlószerek szulfatált poliszacharidok (D54152), kationos peptidek (protamin) vagy molekulák (suramin) voltak. A fo angiogén mitogének peptid szekvenciáinak megismerése megkönnyítette a VEGF vagy a HGF heparinköto peptidjeinek azonosítását. Ezek az általában kis molekulájú gátlószerek kompetitív antagonistaként hatnak megakadályozva a receptor aktivációt. Bár a koncentrációjuknak in vivo sokkalta magasabbnak kell lennie a liganduménál, mégis biztonsággal adhatók, mert aránylag nem toxikusak. A legspecifikusabb megközelítés a legspecifikusabb endoteliális mitogén, a VEGF165 célpontként alkalmazása. A VEGF165 másodlagos és harmadlagos szerkezetének megismerése új információkat nyújt olyan ligandumok, monoklonális antitestek, vagy peptidomimetikumok tervezéséhez, amelyek képesek eliminálni a VEGF hatását. Különbözo sikeres kísérleti angiogenezis modellek, köztük tumor progressziós modellek után klinikai fázisba lépett a humanizált anti-VEGF165 monoklonális antitest. Egy klinikumba már régen bevezetett citokint, az interferont (? /? ) újabban arra használják, hogy mind az endotél sejtekben, mind a stróma- és tumorsejtekben gátolják a FGF expressziót.(101, 105, 180, 179, 181, 182). (4. táblázat)

4. táblázat. Angiogén mitogéneken ható inhibitorok. Célpont D54152-szulfatált poliszacharid FGF kationos protein (Protamin) Heparin köto ágensek kationos peptid – VEGF-bol VEGF suramin (poliszulfonált naftil- urea) FGF, VEGF, HGF anti-VEGF antitest VEGF165 DistamycinA BFGF, PDGF-B Citokin expresszió Interferon ? és ? Angiozyme (ribozim) VEGF

22

Klinikai vizsgálat

+

+ +

Endoteliális mitogén receptorok A fo endoteliális növekedési faktorok megismerése lehetové tette receptoraik (flt1, KDR) azonosítását is. A VEGF165 receptor (KDR) majdnem kizárólag az endotél sejteken expresszálódik, ami egy nagyon specifikus endoteliális célpontot jelent. Már hozzáférhetoek olyan monoklonális antitestek, melyek felismerik a KDR extracelluláris doménjének különbözo epitopjait. Némely antitest, mint pl. a DC101 képes a KDR jelátvitelét befolyásolni, hasonlóan néhány anti-c-erb2 monoklonális antitesthez. Önmagában nem túl ígéretes a tumorok antiangiogén terápiája, alacsony dózisú hagyományos citosztatikus szerekkel (pl. vinblasztin) kombinálva lehetové teszi a nem kívánt mellékhatások csökkentését úgy, hogy a tumorellenes hatás megmaradjék. A PF4 egy természetes, endotél sejteken ható angiogenezis gátló, és rekombináns variánsát az FGF receptor kötés gátlására használják. (105)

Angiogén jelátvitel Mivel az angiogén mitogének többsége tirozin kináz receptorhoz kötodik, a proliferáló endotél sejtek tirozin kináz aktivitása terápiás célpont lehet. Az angiogén jelátvitel további lépései, úgy, mint a PKC aktiváció vagy a kalcium jeltovábbítás, eroteljes de kevésbé specifikus célpontot jelenthetnek. Minthogy a mitogén jelátviteli utak révén mind a tumorsejtek, mind az endotél sejtek érintettek a terápiában, a széles spektrumú tirozin kináz gátlók használata hasznos lehet. (105, 180, 181, 183). Az ilyen hatásmechanizmusú ve gyületek az 5. táblázatban láthatók. 5. táblázat. Jelátvitelre ható angiogenezis inhibitorok. Célpont Izoflavonoidok Nem specifikus PTK gátlók Staurosporin származékok Nem specifikus PTK gátlók Genistein Nem specifikus PTK gátló SU5416(adenin mimetikus) VEGFR2 - PTK gátló Tyrphostinek VEGFR2 - PTK gátló Izoquinolinok PDGFR - PTK gátló Retinsav PKC gátló Karboxiamidotriazol Ca2+ csatorna blokkoló TNP-470 Sejtciklus kontroll Ocreotide Jelátvitel PTK=protein tirozin kináz PKC=protein kináz C

23

Klinikai vizsgálat + + + + + + + +

Endotél sejt - ECM kölcsönhatásra ható terapeutikumok A neoangiogenezist az endotélsejt - ECM kapcsolatok megváltozása jellemzi. Az angiogén faktorok hatására olyan új adhéziós molekulák jelennek meg, mint az ? v? 3 vagy ? v? 5 integrinek (98). A permeábilis véredényfal átenged olyan oldékony mátrix ligandumokat, mint a vitronektin, fibrinogé n, tenascin, amelyek alapveto összetevoi az újjáalakuló véredény mátrixának (184). A mitotikusan aktivált endotél sejteknek legalább részben degradálniuk kell a saját szubendoteliális membránjukat. Ezért a mitogének proteáz szekréciót is indukálnak (uPA, MMP-2, MMP-9). Mivel ezek az események mind alapvetok az angiogenezis megindulásához, gyógyszerek támadási pontjai lehetnek. (6. táblázat)

6. táblázat. Endotél sejt - ECM kölcsönhatásra ható terápiás lehetoségek. Célpont

Klinikai próba

Mátrix ligandum Rh-angiostatin

UPAR, ATP-szintáz

+

Rh-endostatin

Kollagén receptorok

+

? v? 3

Ciklikus RGD peptid Accutin-disintegrin

? v? 3, ? v? 5 ? v? 3

Benzodiazepinek

Mátrix receptor ? v? 3

Humanizált anti-? v? 3 Ab

+

Proteáz Rh-PAI-2

UPA

Amilorid

UPA

p-amidobenzamidin

UPA

Anti- uPA Ab

UPA

Anti- uPAR Ab L-fenilalanin-N-metilamidok

UPAR MMP-2, MMP-9

+

AG3340

MMP-k

+

Minocycline

MMP-k

(Batimastat, Marimastat)

24

Az ? v? 3 integrinért folyó ligand kompetíció elegendo ahhoz, hogy az endotél sejtek leváljanak mátrixukról, és mozgásképtelenné váljanak, ami apoptózishoz vezet (98). Ezt különbözo módon lehet elérni: ciklikus RGD peptidek (185), kémiai RGD mimetikumok (186), vagy kígyóméreg ligandumok (? v? 3 specifitású disintegrinek [187]). A neoangiogenezist és az endotélsejtek proliferációját és migrációját legerosebben gátló mátrix ligandumok a perivaszkuláris mátrix degradációjának termékei, a plazmin, a kollagén XVIII, angiostatin (188), valamint az endostatin (189). Ezek a proteinek igen hatékonyak mind in vitro, mind in vivo. Széles terápiás ablakkal rendelkeznek, továbbá hosszú ideig adagolható anélkül, hogy az endotél sejtekben rezisztencia alakulna ki. Az ? v? 3 integrin expresszió egyértelmu markere a proliferáló endotél sejtnek. Némely anti-? v? 3 monoklonális antitest antiangiogenetikus hatásúnak bizonyult, részben azért, mert apoptózist indukál. A humanizált ? v? 3 antitest kifejlesztése (Vitaxin MedImmune, RheoPro - Centocor) lehetové tette ilyen típusú ágensek klinikai alkalmazását. Az endotél sejtek migrációjához elengedhetetlen az olyan mátrix degradáló enzimek, mint a MMP-2 és uPA muködése. Érdekes, hogy bár számos terápiás értéku uPA inhibitor (kémiai gátlók, anti uPA antitestek, anti- uPAR antitestek), 2001 elso feléig egy sem került klinikai vizsgálatra (180). A MMP gátlók azonban klinikai vizsgálatra kerültek (179). Mind széles spektrumú, mind MMP-2 és MMP-9 specifikus gátlók léteznek.

25

II. Célkituzések

Humán kolorektális daganatokban kimutatták a c-met protein overexpresszióját, illetve ezen esetek 10 %-ban a gén amplifikációját. Bár a stádiummal az overexpresszió nem mutatott korrelációt, a c-met proteint overexpresszáló daganatok szignifikánsan nagyobb

méretunek

bizonyultak

társaiknál,

továbbá

a

vastagbél

daganatok

májáttéteteinek 90 %-a fokozottan expresszálta a c-met onkoproteint, az azonban nem tisztázott, hogy a HGF – c- met rendszer mitogén vagy motogén hatásain keresztül játszik szerepet a kolorektális daganatok áttétképzésében (140, 141, 142, 143).

A különbözo méretu bázikus peptidek különbözo biológiai aktivitással rendelkeznek a sejtproliferációban, a véralvadásban, a sejtadhézióban, stb (75, 76, 77, 78, 79, 80, 81). A HGF trunkált változatainak kísérletes rendszerekben antitumorális hatása van (192, 193). A HGF és a sejtfelszíni HSPG-k májáttétképzésben betöltött általános fontos szerepének figyelembevételével felmerült a kérdés, vajon a HGF kisméretu bázikus peptidjeinek van-e biológiai hatása a tumorsejtekre. Hogy megválaszoljuk ezt a kérdést, megszintetizáltattuk a HGF béta- láncának bázikus hexapeptid részeit és hasonló u.n. “kevert” bázikus hexapeptideket, azon célból, hogy megvizsgáljuk antitumorális hatásukat (7. táblázat).

Jelen munka során a következo kérdések megválaszolását tuztük ki:

1. A HGF, mint a máj egyik lokális növekedési faktora szerepet játszik-e a kolorektális daganatok májáttét képzésében, azaz a HGF befolyásolja-e humán kolorektális daganatok biológiai viselkedését (proliferáció, migráció)? 2. A HGF, mint angiogén faktor befolyásolja-e a humán kolorektális daganatok esetében a neoangiogenezist? 3. A HGF heparin köto peptid szekvenciáinak van-e tumorbiológiailag értékelheto aktivitása. 4. A HGF heparin köto peptid szekvenciáinak van-e antiangiogén hatása.

26

III. Anyag és módszer

1. In vitro módszerek

Bázikus peptidek szintézise A HGF béta- lánc bázikus peptid doménjai és a “kevert” hexapeptidek a korábban leírtak szerint került szintézisre (115). Az oldallánc-védo csoportok lehasadása analitikai reverz- fázisú HPLC-vel 280/215 nm adszorpciós karakterisztika segítségével volt ellenorizve. A termékek további tisztítása preparatív HPLC-vel történt. A peptidek aminosav

sorrendjének

meghatározása

aminosav

analízissel

és

ES-MS

spektroszkópiával történt, melyet Zaránd i M (Szentgyörgyi Egyetem Orvosi Kar, Orvosi Kémiai Intézet, Szeged) végzett (7. táblázat).

7. táblázat. A szintetizáltatott bázikus peptidek aminosav szekvenciája. HGF ? -lánc peptidek HGP1 HHRGK 645-649 HGP2 RYRNKH512-516 Szintetikus bázikus hexapeptidek BP3 KHKHKH BP4 KRKRKR BP5 HRHRHR BP6 HRKHRK

A peptidek heparinköto képességét heparin-Sepharose oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Svédország) végrehajtott affinitás-kromatográfiával teszteltük. Ennek során a nem specifikusan kötött peptideket 0.24 M NaCl- dal, míg a heparin köto frakciót 0.6 M NaCl-dal eluáltuk. Az eluált peptideket a 280 nm-es adszorpcióval azonosítottuk.

Sejtvonalak Kísérleteink során a HT29 ( ATCC HTB38 USA), a WiDr (M. C. Hendrix, University of Iowa, Iowa), a HT25 (M. C. Hendrix, University of Iowa, Iowa) humán kolorektális daganat sejtvonalakat, az M1/9 humán melanóma (Ladányi et al 1990) valamint az

27

A431 (ATCC CRL1555) laphámrák, KS-IMM (Kaposi szarkóma), HBE (humán agyi mikroér endotél) sejtvonalat használtuk. A WiDr sejtvonal in vitro tenyésztéséhez 10 % FCS-val kiegészített DMEM tápfolyadékot, a többi sejtvonal fenntartásához 5 % FCSvel kiegészített RPMI1640 tápfolyadékot használtunk. A 3LL-HH magas májáttét képzo képességu rágcsáló tüdo karcinóma vonalat a 3LL tumorból szelektáltákés folyamatos lép-máj transzplantációval C57Bl6 egétben tartják fenn (116).

Beteganyag Az Országos Onkológiai Intézet 86 kolorektális adenokarcinómás páciensének szövettani anyagát vizsgáltuk, a tudományos etikai eloírások szerint, a betegek hozzájárulásáva l. A 41 no és 45 férfi beteg kora 42 és 89 év közé esett. A vizsgált adenokarcinómák Duke’s B1-C2 stádiumúak voltak (B1: 17, B2: 27, C1: 17, C2: 25), Duke’s A és D stádiumú mintát nem vizsgáltunk.

Statisztika Adatainkat egyfaktoros ANOVA, illetve ? 2 módszerrel elemeztük.

Sejtproliferáció vizsgálata in vitro A vizsgált sejt tenyészetébol 96 lukú tenyésztolemezre lyukanként 3.5x103 sejtet raktunk ki, 100 ? l szérummal kiegészített tápfolyadékban. Másnap a tenyésztolemezre letapadt sejteket szérummentes médiummal háromszor mostuk, majd a sejtekre szérummentes médiumot helyeztünk. Ezt követoen a sejteket 1, 10, 100, 1000 ng/ ml HGP1, HGP2, BP3, BP4, BP5, BP6 peptidekel, illetve 1, 10, 20 ng/ml rhHGF (R&D)fel kezeltük. A 48, illetve 72 órás inkubálás után a sejteken levo tápfolyadékhoz 10 ? l 5 mg/ml koncentrációjú MTT oldatot adtunk, amivel 37 ?C-on további 4 órán át inkubáltunk. Ezután a tápfolyadékot a sejtekrol eltávolítottuk, majd 100 ? l dimetilszulfoxidban a keletkezett kristályokat feloldottuk, s 570 nm-en történo fotometrálással határoztuk meg a koncentrációt (Bio Rad Model 550).

28

Migrációs teszt 5x105 sejtet helyeztünk 24 lukú tenyészto lemezre helyenként, 500? l, szérummal kiegészített tápfolyadékban. Huszonnégy órával késobb a sejteket szérummentes médiummal mostuk, és különbözo koncentrációjú HGF- fel kezeltük. Huszonnégy óra múlva a sejteket mostuk és újra kezeltük HGF- fel. Újabb huszonnégy óra múlva a sejteket 1 % paraformaldehiddel fixáltuk, majd fáziskontraszt mikroszkópon lefényképeztük. A sejtvándorlás mértékét a sejtkolóniák nagyságának meghatározásával végeztük el, megmérve azok legkisebb és legnagyobb átmérojét. A kolónia területét a következo képlet alapján számoltuk ki: T=? x (átméro1)/2 x (átméro2)/2.

2. In vivo módszerek

In vivo lép-máj kolonizációs modell HT29, HT25, WiDr humán kolorektális karcinóma sejtvonalak sejttenyészetébol tripszinezéssel egysejtszuszpenziót állítottunk elo, s elobb szérummal kiegészítet, majd szérummentes médiummal mostuk oket. Ezután 106 sejt/0,02 ml/állat mennyiségu sejtet injektáltunk Nembutállal altatott SCID egerek lépébe. Általában 6 hét elteltével az elso állat elhullása után az állatokat Nembutállal túlaltattuk, majd boncolás során a primer tumor, illetve a májáttét jelenlétét megvizsgáltuk.

Szubkután tumornövekedés vizsgálata A HT25 sejteket tripszinizációval vettük fel tenyészetbol, s elobb szérummal kiegészítet, majd szérummentes médiummal mostuk oket. SCID egerekbe szubkután leoltottunk 2x106 sejtet 500 ? l médiumban állatonként. Amikor a tumorok tapinthatóvá váltak (kb 5 mm, a 14. napon) elkezdtük kezelni az állatokat szubkután peritumorálisan naponta

50 ? l térfogatú peptid oldattal. Hetente kétszer mértük a tumorok két

átmérojét. A kezelés 16. napján az állatokat Nembutállal túlaltattuk, mert a tumorok kifekélyesedtek. A tumorokat eltávolítottuk, formalinban fixáltuk, szövettani vizsgálat

29

céljára beágyaztuk. A tumorok térfogatát az irodalomban korábban leírt módon számítottuk (116).

Peptid kezelés máj kolonizációs modellben Az M1/9 sejteket szövettenyészetbol EDTA-val történo mosással nyertük, míg a 3LLHH sejteket májáttétekbol izoláltuk a korábban leírtak szerint (116, 117). Sejtvonaltól függoen 106 (M1/9) vagy 103 (3LL-HH) sejtet injektáltunk 20 ? l térfogatban állatonként Nembutállal altatott SCID egerek lépébe. Az elso és a második (3LL-HH sejtek) vagy a hetedik és a nyolcadik napon (M1/9 sejtek) a peptideket intravénásan adtuk be az állatoknak, a máj kolonizációs folyamat befolyásolása céljából. Ketto (3LL-HH) vagy három (M1/9) hét múlva, amikor az elso állatok elhullottak, Nembutállal túlaltattuk oket, a lépüket és a májukat eltávolítottuk, a primer léptumort megmértük, a májáttéteket sztereomikroszkóp alatt megszámoltuk. A HT25 sejteket tripszinizációval nyertük szövettenyészetbol. Állatonként 20

?l

térfogatban 106 sejtet injektáltunk Nembutállal altatott SCID egerek lépébe. A tumor hordozó állatokat a 14. naptól kezdve 11 napon keresztül 0.05-5 mg/kg/nap dózisú peptiddel kezeltük intraperitoneálisan. Amikor az elso állatok elhullottak, Nembutállal túlaltattuk oket, a lépüket és a májukat eltávolítottuk, a primer lép tumort megmértük, a májáttéteket sztereomikroszkóp alatt megszámoltuk.

Tumor-indukált angiogenezis meghatározása HT25 humán kolón karcinóma sejteket oltottunk SCID egerek bore alá 106 sejtszámmal. A tumor kezelését az 5 mm nagyság elérésekor (2 hét) kezdtük és két héten át folytattuk 50 ? g/állat/nap HGP1 s.c. peritumorális oltás formájában Boehm, Folkman 1997 szerint (118). A tumor nagyságát folyamatosan mértük 1 hónapon át. Ekkor az állatokat Nembutál túlaltatással öltük le, a tumorokat formalinban fixáltuk, majd paraffinban ágyaztuk. A blokkokból 5 ? m vastag metszetek készültek Superfrost + tárgylemezre. A metszeteket deparaffináltuk, az endogén peroxidáz aktivitást 3%-os hidrogénperoxiddal blokkoltuk. A jobb antigenitás céljából a metszeteket pronázzal (Sigma) 15 percig eloemésztettük. Az aspecifikus kötéseket 3 %-os BSA- val blokkoltuk. A primer antitesttel (nyúl poliklonális anti- humán Faktor VIII, 1:100 hígítás) a metszeteket 37

30

C?-on 60 percig inkubáltuk. A specifikusan kötött ellenanyagot a megfelelo szekunder antitesttel (anti- nyúl IgG-biotin konjugátum, 1:100 hígítás, Amersham), majd tercier rétegként Streptavadin-peroxidáz komplexxel (1:100 hígítás, Amersham) inkubáltuk. A peroxidáz enzim elohívása diamino-benzidinnel (Sigma) történt. A minták értékelésekor metszetenként 3 intratumorális 300 x 400 ? m látótérben történt meg a tumorok vaszkularizáltságának számítógépes morfometriai analízise a CUE2 morfometriai program

segítségével

(Olympus),

melynek

során

meghatároztuk

az átlagos

intratumorális érszámot, az erek átlagos kerületét és területét, valamint az 1 mm2 -re eso érdenzitást.

Angiogenezis vizsgálat in vivo Nullnapos megtermékenyített tyúktojásokat egy hétig 38?C-on magas páratartalom mellett elokeltettünk. Ezután hideg fénnyel történo átvilágítással megállapítottuk, mely tojásokban van élo embrió. Ezeknek a héján egy legfeljebb 5 mm átméroju ablakot nyitottunk, úgy, hogy a chorioallantois membrán sérülése nélkül héjhártyát is eltávolítottuk. Az ablakon keresztül 100 ? l össztérfogatban becsöpögtettük a kezeloszert különbözo koncentrációkban, majd az ablakot Tesa? ragasztószalaggal zártuk. Négy nap múlva a ragasztószalagot eltávolítottuk, s a tojásokon a lehetséges legnagyobb ablakot nyitottuk, ügyelve a chorioallantois membrán épségére, a chorioallantois membránról makrofotót készítettünk, melyet kétféle módszerrel értékeltünk: 1. 50 % gátlás módszer: gátoltnak vettük azt a csoportot, ahol a tojások legalább felénél vizuálisan értékelheto gátlás látszott; 2. morfometriás értékelés: ekkor a makrofotók két átlóját metszo ereket megszámoltuk, majd a kapott értéket 15 cm hosszú átlóra normalizáltuk.

3. Molekuláris biológiai módszerek

C-met expresszió meghatározása RT -PCR módszerrel A szövettenyészetbol készült sejtszuszpenzióból teljes celluláris RNS-t izoláltunk AquaPure RNA izoláló kit-tel (Bio-Rad) a gyártó eloírásának megfeleloen. Mintánként

31

1 mikrogram RNS-t fordítottan átírtunk oligo(dT)(12-18) primer (GibcoBRL) és Moloney

leukemia

vírus

reverz

transzkriptáz

(GibcoBRL)

segítségével.

A

reakcióelegyet 37 ?C-on 90 percig inkubáltuk, majd 70 ?C-ra melegítettük 20 percre, ezután felhasználásig –20 ?C-on tároltuk. A DNS amplifikációt Taq polimerázzal (GibcoBRL) Crocodile III hociklizálóval (Appligene/Oncor) végeztük. A minták számára a reagensekbol, reakció puffer (10 mM Tris-HCl pH=9.0, 50 mM KCl, 0.1% TritonX 100), 200 mM dNTP mindfajtából, 1.5 mM MgCl2 , 100 pM / reakció mindegyik primerbol, 4 egység Taq polimeráz / reakció tartalmú törzsoldatot készítettünk. A PCR feltételek a következok voltak: 95 ?C, 30 mp, majd 60 ?C, 45 mp, és 72 ?C, 45 mp 40 cikluson át, végül 72 ?C 5 percig. A primerek szekvenciái a következok voltak: szenz 5’-ACAGAAATGCCTGCCTTCAAAGG-3’ és antiszenz 5’-CGGAGCGACACATTTTACGTTCAC-3’. Az amplifikáció után 15 ? l mennyiségu PCR terméket 1.2 %-os agaróz gélben méret-szeparáltunk. A mintákat etidium bromiddal festettük, és Geldoc (BioRad) rendszeren digitalizáltuk.

C-met protein kimutatása Western blot módszerrel

Sejtvonalakon A vizsgált sejtvonalakból sejtlizátumot készítettünk a következo lízispufferal: 760 g/l Tris, 100 ml/l glicerol, 10 g/l SDS, 10 ml/l 2-merkapto-etanol. A fehérjéket 8%-os poliakrilamid gélelektroforézisel szétválasztottuk, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Az aspecifikus kötodéseket 0.1 % zsírtartalmú tejporból készített 5 %-os oldattal blokkoltuk. Az elohívás polikloná lis nyúl antihumán c- met antitesttel (1:1000, Santa Cruz Biotechnology) történt. Az immunreakciót DAB reakcióval detektáltuk.

Tumorszöveten A szövetmintákat 1% NP40, 0,5% Na-deoxikolát, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 50? g/ml tartalmú RIPA pufferben homogenizáltuk. A törmeléket 12000 g 30 perces centrifugálással távolítottuk el. A felülúszók fehérje tartalmát 7,5-12% SDS poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk szét, majd Immobilone P membránra (Sigma) blottoltuk. Az aspecifikus kötohelyek 10% FCS és 0,1% Tween tartalmú PBSsel történo blokkolása után a membránokat blokkoló pufferben hígított elsodleges

32

antitesttel egész éjszakán át 4?C-on inkubáltuk (Santa Cruz H- met c28), majd háromszor tizenöt percig mostuk blokkoló pufferben. Következo lépésben a mintákat 45 percig inkubáltuk a másodlagos antitesttel (alkalikus foszfatázzal konjugált anti- nyúl IgG). A 0,1% Tween-PBS-sel történo háromszori mosás után NBT/BCIP szubsztráttal hívtuk elo a jelölést. A csíkok denzizását a normál szövetbol nyert minták csíkjaihoz, mint kontrollhoz hasonlítottuk digitalizált felvételek alapján denzitometriával.

A c-met protein expresszió meghatározása áramlásos citometriával A vizsgált sejtvonalak tenyészetébol egysejt-szuszpenziót készítettünk, majd legalább 106 sejtet fixáltunk, -20?C-os metanollal 20 percig teljes (citoplazmatikus plusz sejtfelszíni) antigén expresszió, illetve 1%-os paraformaldehiddel 10 percig sejtfelszíni antigén expresszió vizsgálata esetén. Az aspecifikus kötohelyek 1% BSA-PBS-sel történo blokkolása után a sejteket antigén specifikus antitesttel (c- met extracelluláris domén elleni monoklonális antitest, 1:100 – Upstate Biotechnology, C28 c-met intracelluláris domén elleni poliklonális antitest 1:100 – Santa Cruz Biotechnolo gy) 1 órán át szobahon inkubáltuk. A be nem kötodött antitestek kimosása után a mintákat 1:100 hígított fajspecifikus (antinyúl- ill. antiegér-) biotinilált imunoglobulinnal (Amersham LifeScience) 1 órán át szobahon inkubáltuk. A kötött másodlagos antitesteket 1:100 hígított streptavidin konjugált FITC-cel (Amersham LifeScience) jelöltük. A fluoreszcenciát 104 sejten mértük le FACStar (Becton and Dickinson) áramlásos citométerrel.

Heparán szulfát proteoglikán expresszió meghatározása áramlásos citometriával A vizsgált sejtvonalak tenyészetébol egysejt-szuszpenziót készítettünk, majd legalább 106 sejtet fixáltunk, -20?C-os metanollal 20 percig teljes (citoplazmatikus plusz sejtfelszíni) antigén expresszió, illetve 1%-os paraformaldehiddel 10 percig sejtfelszíni antigén expresszió vizsgálata esetén. Az aspecifikus kötohelyek 1% BSA-PBS-sel történo blokkolása után a sejteket antigén specifikus primer antitesttel (CD44v3 elleni egér monoklonális antitest, 1:100 hígítás, R&D Systems; MAB458 egér monoklonális antitest, 1:100 hígítás, Chemicon; poliklonális nyúl anti-perlekán antitest, 1:100 hígítás, Dr. Rásó Erzsébet és Dr. Pogány Gábor S.E. I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató

33

Intézet; anti-peptid szindekán [KQEEFYA] peptid elleni poliklonális nyúl antitest, 1:100 hígítás, Dr. Rásó Erzsébet S.E. I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet) 1 órán át szobahon inkubáltuk. A be nem kötodött antitestek kimosása után a mintákat 1:100 hígított fajspecifikus (antinyúl- ill. antiegér-) biotinilált immunoglobulinnal (Amersham LifeScience) 1 órán át szobahon inkubáltuk. A kötött másodlagos antitesteket 1:100 hígított streptavidin konjugált FITC-cel (Amersham LifeScience) jelöltük. A fluoreszcenciát 104 sejten mértük le FACStar (Becton and Dickinson) áramlásos citométerrel.

4. Morfológiai módszerek

C-met protein kimutatása patológiai anyagon A vizsgált blokkokból superfrost tárgylemezre készült metszeteket deparaffináltuk, majd az endogén peroxidáz aktivitást metanolban oldott 5% H2 O2-dal blokkoltuk. Ezután 0.01 M citrát pufferben mikrohullámú antigén feltárását végeztünk. A mintákat egész éjszakán át 4 C? inkubáltuk poliklonális antihumán c-met antitesttel (G Vande Woude NCI, Frederick MD). A primér antitestet LSAB-2 kittel (DAKO) hívtuk elo. A keletkezett immunkomplexet AEC (Vector) reakcióval detektáltuk.

Antigén expresszió vizsgálata adherens sejteken konfokális lézer-scanning mikroszkóppal Lamininnal, illetve fibronektinnel borított tárgylemezekre ültettünk 105 sejtet. Miután a sejtek teljesen kiterültek, fixáltuk oket 1 %-os paraformaldehiddel (10 perc), ezt citoplazmatikus

jelölés

esetén

0,5%-os

TritonX-100–zal

(Sigma)

történo

permeabilizálás követett. Az aspecifikus kötohelyeket 1 % BSA-PBS-sel blokkoltuk (1 óra szobahon), majd a sejteket antigén specifikus antitesttel inkubált uk 1 órán át szobahon (monoklonális c- met extracelluláris domén elleni antitest – Upstate Biotechnology, poliklonális c- met intracelluláris domén elleni antitest – Santa Cruz Biotechnology, mindketto 1:100 hígításban, illetve monoklonális anti- foszfotirozin antitest 1:200 hígításban – Transduction Laboratories). Ezt követoen a mintákat

34

fajspecifikus (antiegér vagy antinyúl) 1:100 hígított biotinilált immunoglobulinnal (Amersham LifeScience) inkubáltuk 1 órán át szobahon. A kötodött másodlagos antitesteket 1:100 hígított streptavidin konjugált FITC-cel (Amersham LifeScience) mutattuk ki. Kettos antigén jelölés esetén ezt egy kétlépéses immunjelölés követte: a sejteket antigén specifikus antitesttel, majd TexasRed konjugált fajspecifikus immonuglobulinnal (Amersham LifeScience) inkubáltuk. A fluoreszcenciát Bio-Rad MRC1024 lézer-scanning mikroszkópon határoztuk meg LaserSkarp program segítségével.

35

IV. Eredmények

Bázikus peptidek heparinköto képességének vizsgálata

Bár az általunk szintetizáltatott peptidek bázikus aminosavakból épültek fel, ez önmagában csak lehetoséget teremt ahhoz, hogy ezek heparinnal léphessenek kölcsönhatásba. Ennek tisztázására heparin-szefaróz oszlopon affinitás kromatográfiás vizsgálatot végeztünk. A HGP1 peptid egyáltalán nem bizonyult heparin kötonek, míg a HGP2 és a BP4 mérsékelt heparin affinitást mutatott (2. ábra). Adataink azt mutatják, hogy a HGP1 peptid nem heparin köto, a HGP2 biztosan heparin köto. A BP4 peptid nem egyértelmuen heparin köto, mert minden frakcióban megjelent.

0,25 OD280

0,2 0,15 0,1 BP4 HGP2 HGP1

0,05 0 0

0,24

0,6

1

NaCl (M)

2. ábra. Szintetikus penta- és hexapeptidek heparinköto képeségének vizsgálata. A peptideket heparin-Sepharose oszlopra vittük fel, az aspecifikus kötött peptideket 0.24 M NaCl-dal, a heparin köto frakciót 0.6 m NaCl- dal eluáltuk. Az eluált peptideket 280 nm-es adszorpcióval azonosítottuk. (Dudás József SE. I. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet által kollaborációban végzett vizsgálat).

36

I. fejezet: C-met expresszió vizsgálata humán kolorektális karcinómákban, valamint a HGF in vitro biológiai hatásai. Humán kolorektális sejtvonalak áttétképzése

Az általunk használt humán kolorektális karcinóma sejtvonalak biológiai viselkedését elsoként állatkísérletesen teszteltük SCID egerekben. Miután a vastagbélrákok jellegzetes áttétképzési helye a máj, ezért lép-máj modellt használtunk. SCID egér lép- máj modellben mindhárom vizsgált sejtvonal tumorigénnek bizonyult (a primer léptumorok aránya 100 % volt). A sejtvonalak metasztatikus képességében viszont jelentos különbség mutatkozott: a HT29 sejtvonal nem bizonyult áttétképzonek, míg a másik két sejtvonal esetében az áttétek gyakorisága 30 % (WiDr), illetve 50 % (HT25) volt (8. táblázat).

8. táblázat Humán kolorektális tumor sejtvonalak máj áttétképzo képessége. SEJTVONAL PRIMER TUMOR (LÉP) MÁJÁTTÉT HT29 4/5 0/5 (0 %) HT25 6/8 4/8 (50 %) WIDR 4/6 2/6 (30 %) 6 SCID egerek lépébe 10 sejtet oltottunk le állatonként, majd az elso állat elhullása után az állatokat leöltük, s a primer tumor, ill. a májáttétek jelenlétét megvizsgáltuk sztereomikroszkóppal, illetve szövettanilag. A feltüntetett adatok a primer tumor, illetve a szervi áttét elofordulási gyakoriságát jelentik.

Humán kolorektális sejtvonalak c-met expressziója A továbbiakban összefüggést próbáltunk keresni a sejtvonalak biológiai viselkedése és c-met expressziója között. Ezért elso lépésként immuncitokémiával meghatároztuk a cmet expressziót szuszpendált tumorsejtekben. Áramlásos citometriás vizsgálataink azt mutatják, hogy a citoplazmatikus c- met domén elleni antitest a kolorektális karcinóma sejtek többségében (60-90 %) pozitív reakciót ad, s a sejtvonalak közt nincs jelentos különbség ebben a tekintetben. Ezzel szemben a receptor extracelluláris doménje elleni antitest differenciált jelölodést mutatott a sejtvonalakban: a nem metasztatizáló HT29 populáció gyakorlatilag negatívnak bizonyult (? 10 % pozitív sejt), míg a két metasztatizá ló sejtvonalban 30 és 50 %-ban találtunk pozitív sejtet (9. táblázat).

37

9. táblázat Humán kolorektális sejtvonalak c- met onkoprotein expressziójának meghatározása áramlásos citometriával. Sejtvonal Intracelluláris c- met Extracelluláris c- met HT29 92,7 10,56 HT25 76,1 29,38 WiDr 62,36 51,63 4 Az áramlásos citometriás adatok 10 sejt fluoreszcenciájának lemérésébol származnak. A mérés során a c-met citoplazmatikus doménje elleni poliklonális, illetve a c- met extracelluláris doménje elleni monoklonális antitestet alkalmaztuk. A táblázatban a pozitív sejtek százalékát adtuk meg. Az adatok egy reprezentatív kísérlet adatai.

A c-met protein vázlatos szerkezete. A transzmembrán protein egy ? és egy ? láncból áll, melyek extracelluláris résznél kovalensen kapcsolódnak.

A kövezkezo lépésben a sejtvonalakból proteint izoláltunk és western bloton határoztuk meg a c- met protein jelenlétét. A három kolon karcinóma sejtvonal a C28 c-met ? -lánc elleni antitesttel elvégzett analízise kizárólag a két metasztatikus sejtvonalban

HT25, WiDr mutatta ki az

autentikus 145 kDa ? láncot. Ez arra utal, hogy a vad típusú c-met ebben a két sejtvonalban detektálható mértékben expresszálódik, míg a nem metasztatikus HT29 sejtvonalban nem, vagy igen alacsony szinten (3. ábra).

kD 38

208

3. ábra. Különbözo metasztatikus potenciálú humán kolorektális tumor sejtvonalak cmet expressziójának Western blot analízise. A sejtlizátumokból azonos fehérje mennyiségeket választottunk szét poliakrilamid gélelektroforézissel, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Az elohívás poliklonális nyúl antihumán c-met antitesttel (Santa Cruz Biotechnology) történt. Elso sáv: WiDr, második sáv: HT25, harmadik sáv:HT29. A vad típusú c- met ? -láncot (p145) csak a két metasztatikus sejtvonalban láthatjuk. Az alacsonyabb halvány csíkok degradációs termékek (116, 84 kDa).

A továbbiakban mRNS szinten is igazolni kívántuk a c- met eltéro expresszióját a sejtvonalakban. RT-PCR segítségével a két metasztatikus sejtvonalban kimutatható volt az autentikus cmet mRNS, míg a nem metasztatikus HT29 sejt negatívnak bizonyult. (4. ábra ).

bp 500

39

neg

HT29

HT25

A431

WiDr

4. ábra. Különbözo metasztatikus potenciálú humán kolorektális tumor sejtvonalak cmet expressziójának RT-PCR analízise. A K562 (neg), HT29, HT25 és WiDr sejtekbol származó teljes RNS-t c-met primerekkel amplifikáltuk, a keletkezett termékeket 2 % agaróz gélben méret szeparáltuk. A mintákat etidium bromiddal festettük. A sávokat a pozitív kontrol (A431) termékével hasonlítottuk össze.

A következokben megvizsgáltuk a c- met protein szubcelluláris lokalizációját. Mivel a tumorsejtek migrációja az extracelluláris mátrixban történik, vizsgálatainkat fibronektinre tapasztott sejteken végeztük. A mátrix felé eso (adhéziós) sejtmembránt konfokális mikroszkópiával tanulmányoztuk. A nem metasztatikus HT29 sejtek gyenge és diffúz c-met/C28 citoplazmatikus domén jelölodést mutattak (A). Ezzel szemben mindkét metasztatikus sejtvonal jellegzetes, fokális adhéziós plakkokra emlékezteto plazmamembrán jelölodést mutattak a vad típusú c- metre. (5. ábra C, E).

Minthogy a c- met molekula protein tirozin kináz aktivitással rendelkezik, fibronektinre tapasztott kolón karcinóma sejteken megvizsgáltuk a szubcelluláris foszfotirozin eloszlását, összevetve citoplazmatikus c- met/c28 jelöléssel. A három sejtvonalban a foszfotirozinált fehérjék eloszlása jelentosen különbözött. A HT29 sejtek elsosorban a sejt-sejt érintkezési pontokon tartalmaztak foszfotirozint, míg a HT25 és a WiDr sejteket a sejt-test és periferiális membrán típusú fokális érintkezési pont pozitivitás jellemezte. A várakozásoknak megfeleloen a C28/c-met jelölés nem társult a foszfotirozinnal a HT29 sejtekben, míg a két metasztatikus sejtvonalban (HT25, WiDr) a c-met és a foszfotirozin kolokalizációja elsosorban a fokális adhéziós plakkokra emlékezteto periferiális plazmamembrán területeken volt megfigyelheto. (5. ábra). Mindezen morfológiai adatok arra utalnak, hogy a c- met protein részt vehet a sejtmátrix adhézióban és az ehhez kapcsolódó integrin-jelátvitelben.

40

A

D

B

E

C

F

5. ábra A c- met (A, C E) és a tirozin foszforillált proteinek (B, D, F) konfokális mikroszkópiája fibronektinre tapasztott humán kolón karcinóma sejteken. A, C, E: A fibronektinre kitapasztott sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd a c- met ? -láncát C28 antitesttel jelöltük (zöld), a sejtmagokat propidium jodiddal (piros) festettük. A = HT29, C=HT25, E=WiDr sejtek. Az üveg felszínétol 25 ? -ra készített optikai metszeten jól látható a kizárólag a HT25 és WiDr sejtek perifériáján a lineáris jelölodést. Nagyítás: 1500 x. B, D, F: Az adherens tumorsejtek c- met ? -lánc (piros) és foszfotirozin (zöld) kettos jelölése; a kolokalizáció sárga. A fázis-kontraszt és a fluoreszcens képeket egymásra illesztettük. B=HT29, D=HT25, F=WiDr sejtek. A HT29 sejtekben foszfotirozin proteineket csak a sejt kontaktusoknál látható 1 ? -re az üveg felszínétol. Vegyük észre a két antigén részleges kolokalizációját (sárga) a HT25 és WiDr sejtek periferiális membránjában, az üveg felszínétol 0.25 ? -ra készült optikai metszeten. Nagyítás: B=4500 x, D, F=3000 x.

41

HSPG expresszió vizsgálata áramlásos citometriával

10. táblázat. Humán kolorektális tumor sejtvonalak heparánszulfát-proteoglikán expressziójának vizsgálata áramlásos citometriával (az adatok a pozitív sejtek százalékát mutatják). Sejtvonal CD44v3 f szindekánö g-BM HSPGf Perlekánf HT29 8,28 91,12 8,75 58,78 HT25 1,67 93,15 5,42 22,58 WiDr 3,99 82,04 3,24 39 g-BM HSPG=glomeruláris sejt bazálmembrán HSPG, f=sejtfelszíni expresszió, ö=citoplazmás és sejtfelszíni expresszió. Az eredmények 104 sejt fluoreszcenciájának mérésébol származnak, és a mérés során monoklonális anti CD44v3, monoklonális anti glomeruláris sejt bazálmembrán HSPG (MAB458), poliklonális anti-szindekán, poliklonális anti-perlekán antitestet alkalmaztunk. (az adatok a pozitív sejtek százalékát mutatják). Minthogy irodalmi adatok alapján a c-met/HGF kölcsönhatás feltétele egy sejtfelszíni HSPG molekulával történo kooperáció, megvizsgáltuk, hogy a kolorektális rák sejtvonalaink expresszállnak-e ilyet. Adataink azt mutatják, hogy az egyedüli transzmembrán HSPG, amely jelentos mennyiségben expresszálódik a vizsgált humán kolón karcinóma vonalakban, egy szindekán (1-4), ugyanis a használt antitest egy pán-szindekán (1-4) antitest. A perlekán a HT29 sejtvonal esetében a sejtek több mint 50 %-án expresszálódott, míg a másik 2 vizsgált sejtvonal esetén az expresszió mértéke ennél kisebb volt. A vese típusú HSPG, illetve a CD44v3 igen alacsony szinten volt jelen sejtvonalainkban (10. táblázat).

Hepatocita növekedési faktor hatása humán kolorektális tumor sejtvonalakra in vitro

A továbbiakban vizsgáltuk, mi a biológiai következménye a tanulmányozott sejtvonalakban a c- met protein specifikus aktiválódásának, ami HGF kapcsolódására következik be. In

vitro

a

rekombináns

humán

hepatocita

növekedési

faktor

különbözo

koncentrációkban (1, 10, 20 ng/ml), szérum mentes körülmények között nem befolyásolta a vizsgált három humán kolorektális adenokarcinóma (HT29, HT25, WiDr) proliferációs képességét 72 óra alatt (6. ábra)

42

kontroll %

150

HT25 HT29 WiDr

100

50

0 0

5

10

15

20

25

HGF (ng/ml)

6. ábra Humán rekombináns hepatocita nö vekedési faktor hatása humán kolorektális adenokarcinóma sejtvonalakra szérum mentes körülmények között (72 óra) in vitro. Az ábrán az adatok a kezeletlen kontroll százalékában? SD vannak megadva (n=5).

HGF hatása humán kolorektális karcinóma sejtvonalak motilitására in vitro

Minthogy az adenokarcinóma sejtvonalak in vitro mirigy-szeru sejtcsoportokban nonek, motilitásuk szóródási tesztben vizsgálható. Ennek során a kialakult sejtcsoportok mérete fokozott motilitás esetén csökken, illetve megjelennek egyedülálló vagy kisebb új sejtcsoportok. Vizsgálataink során az emelkedo HGF koncentráció hatására a két metasztatikus sejtvonal (HT25 és WiDr) esetén a sejtcsoportok mérete csökkent, azaz a sejtek szétvándorlása fokozódott, míg a nem metasztatikus HT29 sejtvonal esetén jelenséget nem tapasztaltunk (7. 8. és ábra). A sejtcsoportok méretének sejtpusztulás általi csökkenése kizárható, ugyanis a HGF nem volt toxikus hatású a sejtekre (6. ábra).

43

A

B

C

D

E

F

7. ábra. 24 órás rhHGF kezelés (20 ng/ml) hatása adherens kolón karcinóma sejtek szétvándorlására. Fázis kontraszt mikroszkópia. A,B= HT29; C,D= HT25; E,F= WiDr sejtek. A, C, E= kontrol; B, D, F= rh HGF kezelé s. A HT29 sejtek esetén nincs észlelheto különbség a sejtcsoportok méretei közt (B szemben A), de a HT25 (D szemben C), és a WiDr (F szemben E) sejtek esetében a HGF kezelt sejtcsoportok mérete jelentosen kisebb.

44

175

HT25 WiDr HT29

Kontroll %

150 125 100 75 50 25 0 0

5

10

15

20

25

HGF (ng/ml)

8. ábra. HGF hatása humán kolorektális sejtvonalak szóródására. A kísérlet végén a sejteket fixáltuk, majd a sejtcsoportokat fáziskontraszt mikroszkóppal lefotóztuk, területüket ellipszisként modellezve a T=? x (átméro1)/2 x (átméro2)/2 képlettel meghatároztuk. Mindezek alapján megállapítható, hogy a modellként használt sejtvonalak esetében a HGF-nek csak morfogén hatása volt és ez is csak a metasztatikus sejtvonalak esetében jelentkezett, amelyek a vad típusú c- met proteint expresszálták.

A c-met fehérje expressziója primer kolón daganatokban

A továbbiakban nyolcvanhat Duke’s B és C stádiumú primer kolon daganat protein mintájából Western blot analízissel határoztuk meg a c- met fehérje szintu expresszióját. A Duke's B és C csoport választása azért történt, mert e ketto inváziós stádium között elsosorban nem a tumor méretében, hanem áttétképzésében van a különbség. (Duke's B= csak lokális invázió, Duke's C= regionális nyirokcsomó áttét).

45

A

B

9. ábra. A.: c- met ? -lánc immunhisztokémiai kimutatása humán kolón mukóza és kolón karcinóma szövetben. A: normál kolón mukóza, B: kolón adenokarcinóma (Duke's C). A betegek sebészeti anyagá t fixáltuk, parafinba ágyaztuk, majd a blokkot lemetszettük. Az antigéneket az Anyag és módszer fejezetben leírtak szerint tártuk fel. A metszeteket C28 poliklonális anti - c-met antitesttel jelöltük. A kötött antitesteket DAB kromogénnel tettük láthatóvá (barna). A sejtmagokat Hematoxillinnal jelöltük (kék). Jól látható a daganatos sejtek eros immunreakciója (B) szemben a normál mukóza sejtjeivel (A).

A továbbiakban nyolcvanhat Duke’s B és C stádiumú primer kolon daganat protein mintájából Western blot analízissel határoztuk meg a c- met fehérje szintu expresszióját. A Duke's B és C csoport választása azért történt, mert e ketto inváziós stádium között elsosorban nem a tumor méretében, hanem áttétképzésében van a különbség. (Duke's B= csak lokális invázió, Duke's C= regionális nyirokcsomó áttét).

46

kD 208

T1

N1

T2

N2

Dukes’s B p145

116 84 kD 208

T3

N3

T4

N4

Duke’s C p145

116 84

denzitás ( a normál kolón %-ban)

10. ábra. C-met ? -lánc Western blot analízise humán kolón adenokarcinómákon. Fehérjét izoláltunk a Duke's C vagy B stádiumú daganat szö vetbol (T) és a környezo nem daganatos mukózából (N), majd a fehérjéket PAGE elektroforézissel szeparáltuk, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Az elohívás poliklonális C28 antitesttel történt. (ld. immunhisztokémia). 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Duke's B

Duke's C

(n=46)

(n=40)

11. ábra. Duke’s B és C stádiumú humán kolorektális karcinómák c- met expressziójának denzitometriás elemzése. A relatív denzitást úgy határoztuk meg estenként, hogy a c-met csíkjának a denzitását normál mukóza c- met expresszió denzitásához hasonlítottuk, s ezt százalékban fejeztük ki. Az adatok átlag ? SD-t jelentenek.

47

Az eredményeket denzitométerrel értékeltük ki. Ennek eredményeként megállapítható volt, hogy a Duke’s C esetekben (n=42) a c-met protein expressziója szignifikánsan emelkedettnek bizonyult a Duke's B (n=44) esetekhez képest (11. ábra). A 86 betegbol 25 esetben immunhisztokémiával is meghatároztuk a c- met expresszióját. A patológiai minták immunhisztokémiai eredményeit is kiértékeltük, ahol a reakcióintenzitást 3 kategóriába soroltuk: negatív, gyenge (halvány barna citoplazmás reakció a tumorsejtekben), eros (intenzív barna szín a tumorsejt citoplazmában). Ennek alapján látható, hogy a Duke's B esetekben több mint 40 % a negatív esetek aránya és ilyen alig fordul elo a Duke's C csoportban. Ugyanakkor mind a gyenge, mind az eros csoportban a Duke's C esetek domináltak (12. ábra).

az esetek %-a

60 50

Duke's B n=11 Duke's C n=14

*

40 30 20 10 0

* negatív

gyenge

erõs

(az immunreakció intenzitása)

12. ábra. A c-met humán kolón karcinómákbeli immunhisztokémiai jelölodésének morfometriai elemzése. A c- met expressziót negatív (9. ábra), gyenge (halványbarna citoplazmás reakció a tumorsejtekben) és eros (intenzív barna szín a tumorsejt citoplazmában) csoportokba osztottuk. Az adatok az összes vizsgált eset százalékában vannak kifejezve. * P<0.05 (? 2 teszt). A fentiek alapján megállapítható, hogy a c-met expresszió humán kolorektális karcinóma sejtvonalakon és mutéti anyagban összefüggést mutat az áttétképzo képességgel. Vizsgálataink azt is bemutatták, hogy a HGF morfogén hatású az áttétképzo sejtvonalak esetében. Miután a HGF heparin köto képességu, és ezt bázikus doménjei mediálják, felmerült, hogy ezen doméneknek szerepe lehet a biológiai hatásban. A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a HGF protein ? lánc bázikus peptid-doménjeinek illetve az ezekbol tervezett peptid variánsoknak van-e biológiai aktivitásuk. 48

II. fejezet: HGF mimetikus peptidek biológiai hatásai

HGP peptidek hatása in vitro sejtproliferációra A HT25 humán kolorektális daganatsejteket 1-1000 ng/ml HGP peptiddel kezeltük szérum mentes médiumban, 72 órán keresztül. Mindkét peptid 100 ng/ml dózisnál kezdodo és 1000 ng/ml- nél 50 % gátlás maximumot adó szignifikáns antiproliferatív hatást mutatott (13. ábra). Szérummentes körülmények között a HT25 sejtek apoptózis arány alacsony (3 %), ami a peptid kezelés hatására nem változott szignifikánsan. Az M1/9 humán melanóma sejtek hasonló érzékenységet mutattak a HGP peptidekkel szemben (14. ábra), mint a kolorektális karcinóma sejtvonalak. Bár ez utóbbi sejtvonal spontán apoptózis rátája magasabb a HT25 sejtekénél (6 %), a HGP peptidek ezt nem

Sejt denzitás (kontroll %)

befolyásolták szignifikánsan (nem közölt adat).

125

HGP1 HGP2

100 75 50 25 0 1

10

100

1000

peptid koncentráció (ng/ml)

nzitás (kontroll %)

13. ábra. HGP peptidek hatása HT25 sejtek proliferációjára in vitro. Tenyészto lemezre lukanként 2000 sejtet ültettünk ki szérummal kiegészített médiumban. Mikor a sejtek kitapadtak, a médiumot szérum mentesre cseréltük, s a sejteket ilyen körülmények között kezeltük a peptidekkel 72 órán át. A kísérlet végén a sejtdenzitást MTT módszerrel határoztuk meg. Az adatok a kontroll csoport sejtdenzitásának százalékában ? SD vannak megadva (n=5).

125

HGP1 HGP2

100 75

49

14. ábra. HGP peptidek hatása M1/9 sejtek proliferációjára in vitro. Tenyészto lemezre lukanként 3000 sejtet ültettünk ki szérummal kiegészített médiumban. Mikor a sejtek kitapadtak, a médiumot szérum mentesre cseréltük, s a sejteket ilyen körülmények között kezeltük a peptidekkel 72 órán át. A kísérlet végén a sejtdenzitást MTT módszerrel határoztuk meg. Az adatok a kontroll csoport sejtdenzitásának százalékában ? SD vannak megadva (n=5).

HGP kezelés hatása különbözo típusú tumorsejtek in vivo növekedésére és májáttét képzésére.

A lépbe oltott, metasztatikus egér 3LL-HH sejtek 2 héten belül májáttéteket adnak. A májkolonizáció szempontjából az elso 3 nap kritikus. Ezért az állatokat az elso és a második napon kezeltük intravénásan két dózisban (0.05 és 0.5 ? g/állat) HGP peptiddel. Megállapítottuk, hogy egyik sem befolyásolta a primer lép tumor növekedését, ugyanakkor a HGP1- nek szignifikáns anti- metasztatikus hatása volt a nagyobb dózisban (15. ábra) .

ájáttétek száma

40

kontroll HGP1 HGP2

30

20

50

*

15. ábra. Intravénás HGP1 kezelés hatása lépbe oltott 3LL-HH sejtek májkolonizálására. A tumorsejteket az egerek lépébe injektáltuk (103 sejt / állat), a peptideket i.v. adtuk az állatoknak a tumor oltás utáni elso és második napon (50 és 500 ng /állat). Két hét múlva az állatokat Nembutállal túlaltattuk, a lépet és a májat eltávolítottuk, a májáttéteket megszámoltuk. Az adatok átlag ? SD. (n=10) szerint vannak kifejezve. *=p<0.05, ANOVA teszt.

A kísérletet megismételtük az M1/9 erosen metasztatikus humán melanóma sejtvonallal is. A sejteket SCID egerek lépébe oltottuk. Minthogy ezen a sejttípus májkolonizációs folyamata lassúbb, és a kritikus idoszak az elso és a második hét (Ladányi és mtsai 1990), az állatokat a hetedik és a nyolcadik napon kezeltük intravénásan 50 és 500 ng/állat HGP-vel. Az adataink szerint a primer tumort a kezelés nem befolyásolta, de a HGP1,

bár

csak

az

alacsonyabb

dózisnál

(50

ng/állat),

szignifikánsan

antimetasztatikusnak bizonyult (16. ábra).

Mivel a HGP2 nem mutatott szignifikáns biológiai aktivitást in vivo ezekben a kísérletekben vizsgálatainkat a HGP1 peptiddel folytattuk tovább, elsoként kolorektális karcinómán a lokális HGP1 kezelés hatását egérben szubkután növekvo HT25 humán kolón karcinóma xenograftra. Az állatokat peritumorálisan kezeltük (Boehm és mtsai 1997) a HGP1 peptiddel két héten át a 14-dik naptól (amikor a tumor mérhetové vált) 0.05-0.5 mg/kg/nap dózisokban. A HGP1 koncentrációtól független növekedés gátló hatást mutatott, amely elérte az 50 %-t a kísérlet végére (17. ábra).

játtétek száma

40

kontroll HGP1 HGP2

30 51

20

*

Tumor térfogat a kiindulási térfogat %-ában

16. ábra Intravénás HGP kezelés hatása lépbe oltott M1/9 sejtek májkolonizálására. A tumorsejteket az egerek lépébe injektáltuk (106 sejt / állat), a peptideket i.v. adtuk az állatoknak a tumor oltás utáni 7-ik és 8-ik napon (50 és 500 ng /állat). Két hét múlva az állatokat nembutállal túlaltattuk, a lépet és a májat eltávolítottuk, a májáttéteket megszámoltuk. Az adatok átlag ? SD. (n=10)-t jelentenek. *=p<0.05, ANOVA teszt.

550

kontroll 0.05 mg/kg/nap 0.5 mg/kg/nap

500 450 400 350

* **

300 250 200 150 100 0

5

10

15

kezelési napok

17. ábra Peritumorális HGP1 kezelés (0.05, 0.5, mg/kg/nap) hatása s.c. HT25 humán kolorektális karcinóma növekedésére. A kezelést a tumor tapinthatóvá válásától számítva 16 napon át folytattuk, a tumorok méretét naponta mértük. A tumortérfogat meghatározását a korábban leírtak szerint végeztük (Pál 1983). A tumorok kifekélyesedésekor a az állatokat Nembutállal túlaltattuk. Az adatok az elso kezelési nap tumortéfogatának (=100 %) százalékában ? SD vannak megadva (n=5). *=p<0.005; **=p<0.05 ANOVA teszt. A HT25 sejtek nem metasztatikusak szubkután transzplantálás esetén, ezért a HGP1 áttétképzésre történo hatását lép- máj modellben vizsgáltuk, mikor is a peptidet szisztémásan (i.p.) alkalmaztuk. Minthogy a használt modellek közül ezen sejttípus májkolonizációs folyamata a leglassabb, az egereket a tumor oltásától számított 14-dik

52

naptól 11 napon át kezeltük i.p. 50-500 mg/kg/nap HGP1 peptiddel. A HGP1 ezen modellben sem befolyásolta a primer tumor növekedését, de legnagyobb dózisa

májáttétszám (átlag?SD)

szignifikánsan csökkentette a májáttétek képzodését (18. ábra).

100

75

50

* 25

0

0

50

500

mg HGP1 / ttkg / nap

18. ábra. Intraperitoneálisan adagolt HGP1 peptid hatása lépbe oltott HT25 humán kolorektális karcinóma májáttétképzésére SCID egerekben. Az egereket a tumor oltásától számított 14-dik naptól 11 napon át kezeltük 50-500 mg/kg/nap HGP1 peptiddel. Az adatok átlag ? SD-t jelentenek. *=p<0.05, ANOVA teszt.

Bázikus HGP-szeru hexapeptidek in vitro hatásai Mindezek alapján azt mondhatjuk, hogy a HGF ? lánc egyik doménjének jelentos biológiai aktivitását észleltük. Kérdés volt, hogy ebben bázikus tulajdonsága játszik-e szerepet, ezért BP (bázikus peptid) variánsokat szintetizáltattunk, és ezek biológiai hatásait teszteltük. A HT25 humán kolón karcinóma sejteket 1-1000 ng/ml bázikus peptiddel kezeltük szérum mentes médiumban, 72 órán keresztül. Mind a négy vizsgált peptid 100 ng/mlnél kezdodo és 1000 ng/ml- nél maximumot mutató szignifikáns antiprolifertív hatást mutatott (20 A. ábra). A peptidek hatása hasonló volt az M1/9 májmetasztatikus humá n melanóma sejtek esetén is (20 B. ábra).

nzitás (kontroll %)

A. 150

100 53

BP3 BP4 BP5 BP6

sejt denzitás (kontroll %)

B.

125

BP3 BP4 BP5 BP6

100 75 50 25 0 1

10

100

1000

10000

peptid koncentráció (ng/ml)

20. ábra Bázikus hexapeptidek sejtproliferációra gyakorolt in vitro hatása. A/ HT25 humán kolón karcinó ma sejtvonal; B/ M1/9 humán melanóma sejtvonal. A sejteket a peptidekkel szérum mentes környezetben kezeltük 72 órán keresztül. A sejtsuruséget MTT teszttel mértük. Az adatok a kontroll százalékában vannak kifejezve (átlag ? SD, n=5). III. fejezet: HGP peptidek hatása az angiogenezisre

A továbbiakban HGP és BP peptidek hatásait vizsgáltuk angiogenezisre, mivel az angiogenezis a tumorprogresszió fontos lépése, és a HGF-t mint angiogén faktort jellemzik az irodalomban. Ezért felmerült a HGF ? lánc bázikus doménjeinek valamint a BP bázikus peptidek angiogenezisre gyakorolt hatásuk vizsgálata. 54

Bázikus, és HGF eredetu bázikus peptidek hatása angiogenezisre csirke choriallantois membrán rendszerben A peptideket 7 napos elokeltetet tojásokon teszteltük, 4 napig, 1-100 ? g / tojás dózisban. Egyik peptid sem segítette az érképzodést, de 3 közülük (HGP1, HGP2, BP4) 10-100 ? g dózisban gátló hatású volt (21., 22. ábra).

A

B

21. ábra. Angiogenezis gátlása csirke CAM módszerben HGF HHRGK 654-659 (HGP1) peptiddel. A/ 11 napos kontroll chorioallantois membrán. B/ 11 napos HGF peptid kezelt CAM (HGP1 kezelés: 4 nap 100 ? g/tojás). Jól látható a az erek csökkent számú elágazása.

100

gátlás %

75

HGP1 HGP2 BP4 BP3 BP5 BP6

50

25 55

0 1

10

100

1000

22. ábra Bázikus peptidek hatása csirke CAM angiogenezisre. A 7 napig elokeltetett tojásokat 4 napig kezeltük a peptiddel. A kiértékelést az Anyag és módszer fejezetben leírtak szerint végeztük. A HGP1, HGP2, BP4 peptidek gátolják az angiogenezist csirke choriallantois membrán modellben (hatásosnak azt a szert tekintettük, amelyik 50 %- nál nagyobb mértékben gátolt).

gátlás %

75

50

25

0

0.00

1.00

10.00

100.00

GRGESP (? g/tojás)

23. ábra GRGESP peptid hatása csirke CAM angiogenezisre. A 7 napig elokeltetett tojásokat 4 napig kezeltük a peptiddel. A kiértékelést az Anyag és módszer fejezetben leírtak szerint végeztük. Kontroll peptidként a GRGESP szekvenciájú peptidet gondoltuk használni vizsgálataink során, mivel ezt a peptidet fibroblaszt letapadási assay-ban negatív kontrollként használják. A többször megismételt mérések azt mutatták, hogy ezen peptid az általunk alkalmazott chorioallantois membrán modellben határozottan gátolta az angiogenezist (23. ábra).

Bázikus peptidek hatása Kaposi szarkóma sejtek proliferációjára 96 lukú tenyészto lemezen szérum mentes körülmények közt Kaposi szarkóma sejteket (KS-IMM) 72 órán keresztül kezeltünk 1-1000 ng/ml dózisú bázikus peptidekkel (HGP1, HGP2, BP3-6 bázikus peptidek). Megállapítottuk, hogy egyik peptid sem befolyásolta szignifikánsan a Kaposi szarkóma sejtek növekedését (24. ábra).

56

125

HGP2 BP3 BP4 BP5 BP6 HGP1

kontroll %

100 75 50 25 0 1.0

10.0

100.0

1000.0

peptid koncentráció (ng/ml)

24. ábra. Bázikus peptidek hatása humán Kaposi szarkóma sejtek növekedésére. A sejteket szérummentes körülmények között kezeltük 1-1000 ng /ml HGP1, HGP2, BP3, BP4, BP5, BP6 peptiddel. A sejtek denzitását a kísérlet végén MTT módszerrel határoztuk meg. Szignifikánsan egyik peptid sem befolyásolta a sejtek proliferációját. Az adatok a kontrol százalékát? SD mutatják (n=4).

Bázikus peptidek in vitro hatása humán agyi mikroér endotél sejtekre

Mivel a CAM módszerben aktív peptidek in vitro KS-IMM sejteken aktivitást nem mutattak, megvizsgáltuk hatásukat humán agyi mikroér endotél sejtekre is (HBE sejtek, OPNI Stroke Osztály, Dr. Csonka Éva szívessége), amelyek jóval lassabban növekednek in vitro és magasan differenciált humán endotélnek felel meg. Adataink szerint a CAM assayban aktív három peptid képes volt gátolni a HBE sejtek proliferációját az alkalmazott legmagasabb dózisban (1000ng/ml), a gátló hatás a HGP1, HGP2 és BP4 peptidek esetén 100 ng/ml dózisnál már elkezdodött (25. ábra).

125

HGP1 HGP2 BP4

kontroll %

100 75 50 25

57

25. ábra. Bázikus peptidek hatása humán agyi mikroér endotél sejtek növekedésére. A sejteket szérummentes körülmények között kezeltük 1-1000 ng /ml HGP1, HGP2, BP4 peptiddel. A sejtek denzitását a kísérlet végén MTT módszerrel határoztuk meg. Az adatok a kontrol százalékát? SD mutatják (n=4).

Tumor-indukált angiogenezis vizsgálata

Az angiogenezis egy sajátos fajtája a tumor- indukált neoangiogenezis, melynek mechanizmusa jelentosen eltér az embrionális formától, amelyet a CAM assay reprezentál. Ezért végeztünk a HGP1 peptiddel ilyen rendszerben vizsgálatot HT25 kolón karcinómát s.c. oltottuk SCID egerekbe. A tumorsejtek szolid tumorrá történo növekedéséhez intenzív neoangiogenezis társul, melynek eredményeként a burjánzó egér-eredetu erek belenonek a mikroszkópikus tumorszövetbe, biztosítva annak további növekedését.

11.táblázat. HGP1 kezelés hatása a tumor- indukált angiogenezisre in vivo. Érdenzitás Érkerület Érterület 2 (ér/cm ) (? m) (? m2 ) Kontroll 889? 325 189,1? 51,3 1392,7? 894 50 ? g HGP1 2980? 487* 109,1? 35,8* 504,4? 198* HT25 humán kolón karcinóma sejteket oltottunk SCID egerek hátbore alá. Az oltást követo 14-ik naptól kezeltük az egereket s.c. peritumorálisan 50 ? g/nap dózisban 14 napon át HGP1-gyel. A tumorok erezettségét immunhisztokémiai és morfometriai módszerrel határoztuk meg. Az adatok átlag? SD értéket jelölnek, ahol n=3. *=P<0.005 (ANOVA).

Eredményeink azt mutatják, hogy a HGP1 kezelés nem akadályozza meg a tumorindukált neoangiogenezis megindulását, sot még fokozta is (érdenzitás növekedés), ugyanakkor a keletkezo erek kerülete és így az erek területe is jelentosen lecsökkent. Ez a jelenség arra utalhat, hogy a HGP1 peptid nem tudta megakadályozni az

58

érproliferációt, talán még fokozta is azt, de a keletkezo erek nagy része nem tudott megfelelo méretu (funkcionáló) erekké differenciálódni, és így történhetett, hogy az érkerület/terület jelentosen csökkent (11. táblázat).

V. Diszkusszió

1. A HGF és c-met rendszer szerepe kolorektális daganatok áttétképzésében

59

A daganatok áttétképzési folyamata sejtproliferációval, és invázióval kapcsolatos eseményekbol áll, melyek közül a mitogén szignálok szükségesek, de nem korlátozó tényezok. Másrészrol egyre elfogadottabb, hogy a metasztatikus fenotípus szorosan kapcsolódik az autokrín és parakrín faktorok által szabályozott motogén fenotípushoz. A különbözo tumorféleségek áttétképzésének szervspecificitása, mint például vastagbél tumorok, a parakrín faktorok fontosságára mutat rá (119). Minthogy a sejt, illetve a tumorsejt migráció egyik leghatékonyabb szabályzója a HGF (120), amely egyben májspecifikus növekedési faktor (121), feltételezik, hogy a HGF és receptora, a c- met szerepet játszhat a vastagbélrák májpreferenciájában (122, 123). Adataink alapján arra következtettünk, hogy a vizsgált humán kolón karcinóma sejtvonalakon a HGF biológiai hatása a vad típusú c- met ? -lánc expressziójától függ. Bár mindhárom sejtvonal expresszálta a c-met/C28 antigént (c-met intracelluláris domént), csak azok válaszoltak a humán rekombináns HGF motogén szignáljára, melyek RT-PCR-ral, Western blottal és áramlásos citometriával bizonyítottan jelentos mennyiségben expresszálják a vad típusú c- met-et, amit az extracelluláris domén párhuzamos kimutatásával is igazoltunk. Arra is következtettünk, hogy a humán kolónkarcinóma sejtvonalak esetén kapcsolat volt a májáttétképzo képesség és a HGF-re adott motogén válasz között. Ez rámutat ezen sejtvonalak esetén a HGF/c- met rendszer lehetséges szerepére a vastagbélrákok májmetasztatizálásban. Érdekes módon a korábbi irodalmi adatokkal ellentétben (124) a rhHGF-nek nem volt mitogén hatása a vizsgált sejtvonalakra a motogén dózisokban. A c- met tumorprogresszióban betöltött szerepe az érdeklodés központjában van, mivel számos humán tumorban a c-met gén amplifikált és expressziója konstitutív (121). A cmet protein expresszióját mutatták ki hepatocelluláris karcinó mában, kolorektális karcinómákban (124, 125), gyomor- (126, 127, 128), vese- (192, 130), ovárium- (131), bor-, tüdo- (132, 133), pajzsmirigy- (134, 135, 136), valamint hasnyálmirigy karcinómákban (137, 138, 139). Humán kolorektális daganatokban kimutatták a c-met protein overexpresszióját, illetve ezen esetek 10 %-ban a gén amplifikációját. Bár a stádiummal

az

overexpresszió

nem

mutatott

korrelációt,

a

c- met

proteint

overexpresszáló daganatok szignifikánsan nagyobb méretunek bizonyultak társaiknál, továbbá a vastagbél daganatok májáttéteteinek 90 %-a fokozottan expresszálta a c- met onkoproteint (140, 141, 142, 143). Gyomorrákokban mind a fehérje overexpresszióját, mind a gén amplifikációját kimutatták (144, 145, 146). A c-met protein fokozott expresszióját nem kissejtes tüdorákban (147) ovárium daganatban (148), laryngealis 60

karcinómákban (149) mutatták ki. Másrészt a c- met normál sejtekbe történo transzfekciója tumorigenitást és fokozott áttétképzo-képességet eredményez (150). Mindezen túlmenoen a c- met citoplazamatikus doménjének konstitutív PTK aktivációt eredményezo mutációi tovább erosítik a tumorigén/áttétképzo képességet (151). Mindazonáltal az ilyen mutációk, a papilláris vese daganatok kivételével ritkák. Az irodalmi adatok körültekinto elemzése azt mutatja, hogy nehéz szétválasztani a HGF tumorigén és áttétképzo szerepeit. Így ebbol a szempontból egyedülálló a modellünk, mivel a HGF-nek mitogén hatása nem, csak motogén hatása volt a célsejtre. Ez azt jelzi, hogy a motogén c-met szignál aktiválása elege ndo a metasztatikus fenotípus létrehozásához. A nem- metasztatikus HT29 kolónkarcinóma sejtvonalat a HGF indukálta motilitási szignál hiányát eredményezo alacsony sejtfelszíni extracelluláris cmet domén expresszió jellemzi. A tumorsejtek mozgása az oket körülvevo mátrixban történik, így érinti az integrinek muködését is. Ezért arra lehet gondolni, hogy a c- met motogén szignálja valamilyen módon befolyásolja az integrin jelátvitelt is. Más rendszerekbol származó adatok arra utalnak, hogy a c- met aktiváció FAK, (az integrin jelátvitel egyik fontos eleme és a fokális adhéziós plakkok összetevoje), foszforilációját eredményezi, míg a tumorsejtek mátrixhoz kitapadása c-met foszforilációt eredményez (152). Mindez a c- met motogén jelátvitele és az integrin jelátvitel közötti kooperáció létezését jelzi. Adataink, melyek szerint a c- met fellelheto a HGF érzékeny kolón tumorvonalak periferiális fokális adhéziós plakkjaiban, valamint, hogy a c- met kolokalizál a foszfotirozin pozitív fokális adhéziós plakkokkal, tovább erosítik ezen megfigyeléseket. A kolorektális daganatok prognosztikus patológiája a primer tumor makro- és mikroszkópos jellemzoire, valamint a “staging”- re és a “grading”-re alapul. Az egyik legrégibb tumor stádium beosztás a Duke féle osztályozás, ami módosításokkal, de túlélte a XX. századot. A tumor helyi kiterjedésén (az invázió mélysége) és a mezenterikus nyirokcsomók érintettségén, illetve a távoli áttétek értékelésén alapul. A kolorektális daganatok lefolyásában betöltött elorejelzo értékét eleddig még nem vonták kétségbe (48). Mindeközben olyan molekuláris markerek jelentek meg, melyek a kolorektális

daganatok

invazív/metasztatikus

viselkedésének

elorejelzésére

is

alkalmasak. A proliferációs markerek közül a PCNA, a ciklin D1 (48) és a Ras expresszió (153 ) negatív elorejelzok, míg a p27 és DCC pozitív elorejelzok kolorektális daganatok esetén (154). Más daganatokhoz hasonlatosan, a kolorektális tumorok vaszkularizáltsága is érzékeny "rossz-prognózis" marker (155). A CD44 molekula v6

61

variánsának expressziója volt az egyik elso azonosított markere a kolorektális daganatok metasztatikus potenciáljának, azonban patomechanikai szerepe még nem teljesen tisztázott (156). Más, metasztatizáláshoz kapcsolódó fehérjék, mint az uPA (157), és az MMP-2 (158) expressziója, valamint az AMFR (AMF receptor) (159) jelenléte negatív elorejelzo. A kolorektális daganatok áttétképzésének fo célpontja a máj, amit gyakran anatómiai okokkal magyaráznak. Azon ismétlodo megfigyelések melyek szerint a humán kolorektális daganatok májáttéteiben a c- met gén felsokszorozódása, illetve túlzott kifejezodése figyelheto meg (140, 143), arra utalnak, hogy az anatómiai tényezok mellett ebben a folyamatban a tumorsejtek geno- és/vagy fenotípusának megváltozása is szerepet játszhat. Megfigyeléseink alapján, két különbözo módszer szerint is (Western blot és immunhisztokémia) a Duke C tumorokban a c-met szignifikánsan túlzottan expresszálódik a Duke B tumorokhoz képest. A Duke B és C stádium közötti különbség a regionális nyirokcsomó érintettségben van (a Duke C-ben van), ami egyértelmu jele a tumorsejtek metasztatikus képességének. Eszerint megfigyeléseink szoros kapcsolatra utalnak a c- met túlzott kifejezodése és a kolón ráksejtek metasztatikus fenotípusa között. In vitro adataink arra utalnak, hogy ebben az átalakulásban a HGF – c- met receptor- ligand rendszernek inkább a motogén sajátosságai érvényesülnek, mintsem a mitogének. Ezen adatok tovább támogatják a c- met kifejezodés metasztázis markerként történo alkalmazását kolorektális daganatok esetében.

2 HGF eredetu és kisméretu peptidek biológiai hatásai I. Antitumorális hatás.

Az auto- és parakrín szabályozásért felelos citokinek többsége heparin köto (160, 161, 162, 163). A heparin köto fehérjék sokfélesége a HSPG-k tumorprogresszióban betöltött szerepének kutatására ösztönöz. Ezek a proteoglikánok képesek kölcsönhatásba lépni a heprin-köto fehérjékkel, továbbítják az ezek által generált jeleket. A kétségkívül legjoban ismert HSPG a bazálismembrán perlekánja (164). A CD44 sokféle humán sejtben expresszálódik, mint amilyenek az epiteliális, mezenhimális, és limfoid sejtek. Olyan

humán

tumorokban,

mint

a

nagysejtes

tüdorák,

kolón

karcinóma,

neuroblasztóma, aggreszív non-Hodgkin limfóma, a CD44v6 variáns túltermelését írták le (165, 166, 167, 168, 169).

62

Az A-2058 és HT18 daganatokból származó, különbözo metasztatikus képességu humán melanóma sejtvonalakon összehasonlították a primer tumort a májáttétekkel a GAG szintézis szempontjából (170, 117). A metasztázis-eredetu sejteket a primer tumor eredetuekhez viszonyítva magasabb intra- és pericelluláris GAG bioszintetikus potenciált figyeltek meg (171). Az alacsony metasztatikus képességu melanóma sejtvonal májáttétei olyan GAG-ot expresszált, amit a primer tumorban hiányzott (171).

Különbözo metasztatikus, de azonos proliferációs képességu humán melanóma sejtvonalakat (A-2058, HT168, HT168-M1) összehasonlítva a GAG bioszintézis szempontjából, azt találták, hogy az alacsony metasztatikus képességu HT168, és a magas metasztatikus képességu M1 variánsa hasonló mennyiségu GAG-ot tartalmaz. Azonban

az

M1

a

kondroitin-szulfátot

intracellulárisan

felhalmozza,

így

következésképp e sejtek felszínén a heparán-szulfát dominál a kondroitin-szulfát felett (53).

Adherens HT168-M1 sejteken a CS felszíni eloszlása erosen polarizált. A HS expressziója alacsony és diffúz eloszlású az alacsony metasztatikus potenciálú HT168 sejteken, míg a metasztatikus melanó ma vonalakon az expresszió eros és a letapadási membránokra lokalizálódik (53). Ez arra utal, hogy a HSPG-k a tumorsejt adhéziójában játszhatnak szerepet (172). Az M1 sejtekben a HSPG kizárólag az adhéziós plakkokban van jelen, ami a HSPG-k adhézióban betöltött szerepére utal (53). Kísérleti és humán epiteliális tumorok esetében a malignus transzformáció során a szindekán-1 HSPG expresszió eltunik (173). A perlekán HSPG expressziója ugyanekkor drámaian megemelkedik melanómákban (174).

A fentiek alapján tumorsejt HSPG-k tumorprogresszióban betöltött szerepe felveti annak a lehetoségét, hogy a proteoglikánokat az áttétképzés gátlásában terápiás célpontként használjuk. A tumorsejt HSPG bioszintézis gátolható, pl. a HUdR-val (155, 176). A tumorsejt HS bioszintézisének gátlása mind a tüdo és a máj kolóniaképzést gátolja, anélkül, hogy a primer tumor növekedését gátolnák. Ez arra utal, hogy a tumorsejt HSPG a tumor szóródáshoz szükséges (194). A HSPG bioszintézis gátlása akadályozza mind a tumorsejt – ECM kölcsönhatást (adhézió és szétterülés), mind a fibroblaszt rétegen történo mikroinvazivitást (176). Néhány citokin esetében, mint pl. a

63

FGF, HGF a célsejt felszíni HSPG szerepe ismertté vált, de nem a citokin jelátvivojeként szolgálnak (69, 163).

Mindezek alapján feltételeztük, hogy a heparinköto citokinek peptid részletei olyan biológiai aktivitással bírhatnak, amelyek befolyásolhatják a tumorsejtek biológiai viselkedését. Modellnek a HGF-t használtuk, mert az olyan daganatféleségekben, mint a kolón karcinóma és melanóma, a májáttétképzésben betöltött szerepe ismert (143). A citokin és heparin közötti kölcsönhatás bázikus penta/hexa-peptideken alapul. Ezért megszintetizáltattuk a HGF ? -láncának 2 doménját: HHRGK (HGP1), és RYRNKH (HGP2). Célsejtként három olyan tumorsejt vonalat választottunk, amelyeket nagy májmetasztatikus potenciál és kiemelkedo sejtfelszíni HSPG expresszió jellemez: HT25 kolón tumor, M1/9 humán melanóma, 3LL-HH rágcsáló tüdo karcinóma) (197, 117, 116, 171). A vizs gált penta- és hexapeptidek hasonló antiproliferatív hatást mutattak in vitro 0,1-1 ? g/ml dózisban. Szisztémás kezeléssel egyik HGP sem mutatott szignifikáns antitumorális hatást sem a 3LL-HH, sem a két humán tumor vonal primer tumorain. Azonban a HGP1 lokális kezelés esetén HT25 humán kolón tumor xenografton antitumorális hatást mutatott. Továbbá a HGP-kel történo szisztémás kezelés azt mutatta, hogy csak a HGP1 gátolta a májmetasztatizálást mindhárom vizsgált tumor vonalban, míg a HGP2 inaktív volt. A bázikus HGP peptidek in vitro antiproliferatív hatása nem egyedi, mert a 4 szintetizált és vizsgált HGP-szeru bázikus hexapeptid hasonló aktivitást mutattak. Mindazonáltal csak egyikük, a BP4 (KRKRKR) bírt szignifikáns máj metasztázis- gátló hatással, miközben a primer tumorra ez sem volt hatásos. Vizsgálatok azt mutatják, hogy a HGP1 erosebben kötodik a heparinhoz, mint a BP4. Ez azt mutatja, hogy ez a tulajdonság önmagában nem magyarázza a két peptid hasonló anti- metasztatikus potenciálját. Ennek megfeleloen a bázikus aminosavak sorrendje is fontos az antitumorális hatás szempontjából.

A tumorsejtek felszínén levo HSPG-k, rágcsáló és humán tumor modellekben történo májáttétképzésbeli szerepe már ismert (53, 171). A heparán-szulfát és bioszintézisének gátlása gátolhatja a máj áttétképzést (171). Másrészrol a heparin és a heparin-szeru glükózaminoglikánok egyértelmu antimetasztatikus potenciállal bírnak (177). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az olyan sejtfelszíni HS(PG)-kel való kölcsönhatás, amelyek a heparin-köto citokinek kötésért felelosek, befolyásolhatja a tumorsejtek metasztatikus képességét. 64

Mindezek alapján a kisméretu bázikus penta/hexapeptidek a biológiai válaszmódósító anyagok egy új csoportját képezhetik.

3. HGF eredetu és kisméretu peptidek biológiai hatásai II: Antiangiogén hatás. A glükózaminoglikánok és a peptidek közötti kölcsönhatás a bázikus aminosav szekvenciákhoz történo nem kovalens kötodéseken alapul. A kötés szükséges feltétele a pentapeptid régió, valamint a szulfatált régió a GAG-on, beleértve a heparán szulfátokat is (73). Minthogy ilyen szekvenciák jelen vannak a heparin köto angiogén citokinekben, így a HGF-ben is, feltételeztük, hogy az ilyen peptidek biológiai aktivitással bírhatnak. A HGF ? láncának két bázikus peptidje szignifikáns antiangiogenetikus hatást mutatott in vivo CAM (chorioallantois membrán) modellben. Továbbá ezek a peptidek antiproliferatív hatásúak voltak normál kapilláris endotél sejteken, míg proliferáló Kaposi szarkóma sejtekre nem hatottak. Ez, a különbözo differenciáltságú endotél sejtekre kifejtett hatások közötti különbség, valamint az a tény, miszerint a CAM modellbeli gátlás soha nem érte el a 100 %-t, mind arra utalnak, hogy a bázikus HGFszeru peptidek hatása nem kizárólag antiproliferatív tulajdonságukon alapszik. Ezt a feltételezést tovább erosíti azon megfigyelés, mely szerint a HHRGK HGF-szeru peptid helyi alkalmazása a szubkután tumor növekedése során nem gátolta a tumor- indukálta érképzodést, mi több, indukálta az éretlen erek keletkezését. Ugyanekkor ezen erek képtelenek voltak tovább fejlodni a bázikus peptidek hatása alatt, ami szignifikánsan kisebb ereket eredményezett. Ez arra utal, hogy a HGF-szeru bázikus peptidek az érképzodés morfogén fázisát képesek befolyásolni. Ez a biológiai aktivitás szekvencia specifikusnak látszik, mivel a szintetikus HGF-szeru peptidek közül csak a KRKRKR – nek volt hasonló gátló hatása.

HGF eredetu és bázikus peptidek helye az antiangiogenetikus terápiában Kevés az adat az irodalomban arról, hogy angiogén fehérjék heparin köto részt tartalmazó peptidjei antiangiogén hatással bírnak. Ilyen a PF-4 23 tagú peptide (190), valamint a HGF 1-4 kringle doménja (191). Újabban a VEGF egy bázikus hexapeptidjérol bizonyosodott be, hogy in vitro és in vivo antiangiogén hatású (101). Ez azt mutatja, hogy a kis bázikus hexapeptidek az antiangiogén molekulák egy új

65

csoportját alkothatják (178). Vizsgálataink alapján az ilyen peptidek nem az angiogenezis korai “proliferatív” szakaszában hathatnak, hanem inkább az érképzodés késobbi, morfogén szakaszában. Mivel a terápiás érképzodés gátlásnak az érképzodés proliferatív és morfogén fázisaira is hatással kell lennie, az ilyen szereknek farmakológiai jelentosége lehet.

4. Új eredmények és megállapítások

A. Abból az eredményeinkbol, hogy ?

A vad típusú c- met protein expressziója a metasztatikus sejtvonalainkon volt kimutatható,

?

A rhHGF a metasztatikus sejtvonalak motilitását növelte,

?

A Duke’s C stádiumú humán kolorektális adenokarcinómákban a c-met expressziója magasabb volt mint a Duke’s B stádiumuaké,

arra következtetünk, hogy HGF – c-met rendszer a kolorektális daganatok áttétképzésében inkább a motogén, mintsem a mitogén hatásával vesz részt. B. Azokból az eredményeinkbol, hogy ?

A HGP1 és HGP2 HGF ? -lánc peptidek gátolni képesek a HT25 humán kolorektális adenokarcinóma és az M1/9 humán melanóma sejtvonal in vitro proliferációját,

?

A HGP1 HGF ? -lánc peptid gátolta a HT25 humán kolorektális adenokarcinóma szubkután növekedését in vivo,

?

A HGP1 HGF ? -lánc peptid gátolta HT25 humán kolorektális adenokarcinóma, M1/9 humán melanóma, valamint 3LL-HH egér tüdokarcinóma in vivo metasztatikus képességét,

arra következtetünk, hogy a kisméretu HGF ? -lánc peptidek antitumorális hatással bírhatnak.

C. Azokból az eredményeinkbol, hogy ?

A HGP1, HGP2 HGF ? -lánc peptid és a BP4 bázikus hexapeptid gátolta az angiogenezist in vivo choriallantois membrán modellben,

?

A HGP1, HGP2 HGF ? -lánc peptid és a BP4 bázikus hexapeptid gátolta humán kisagyi endotélsejtek proliferációját in vitro,

66

?

A HGP1 HGF ? -lánc peptid befolyásolta szubkután növo HT25 humán kolorektális adenokarcinóma által indukált angiogenezist,

arra következtetünk, hogy a kisméretu HGF ? -lánc peptidek, valamint kisméretu bázikus peptidek antiangiogenikus hatással bírhatnak.

Mindez azt jelentheti, hogy kisméretu bázikus, növekedési faktor eredetu, vagy tervezett peptidek a tumorellenes szerek egy csoportjának kiindulópontjai lehetnek.

V. Köszönetnyilvánítás Szeretném kifejezni köszönetemet Prof.Dr.Tímár Józsefnek az OOI Tumor Progressziós Osztályának osztály vezeto foorvosának, a SOTE I. Pathológiai és kísérleti rákkutató intézete egyetemi tanárának, aki PhD és diákköri témavezetom volt, hogy mind tudományos szempontból, mind financiális szempontból lehetové tette, hogy csoportjában végezhessem munkámat.

67

Kiemelten kell szólnom dr. Rásó Erzsébetrol, elso diákkörös témavezetomrol, aki fáradtságot nem kímélve megtanított a laboratóriumi kíséleti munka szilárd alapjaira. A tole megkapott tudás nélkül semmire se mentem volna. Rásó dr. alapveto segítséget nyújtott a PCR reakciók kivitelezésében is. Köszönet illeti dr Ladányi Andreát is építo minoségu kritikai munkájáért. Dr Paku Sándor a western blot technika betanításával játszott szerepet e munka létrejöttében. Köszönettel tartozom Csorba Gézáné Maricának a szövettenyésztési technikák elsajátításában nyújtott segítségéért, Kovács László állatház vezetonek (SOTE I. Pathológia) valamint az állatház munkatársainak. Köszönettel tartozom technikai segítségükért a SOTE I. Pathológiai és kísérleti rákkutató intézete és az Orszá gos Onkológiai Intézet alábbi munkatársainak: Dr Bocsi József Dr Tímár Ferenc Dr Mihalik Rudolf Dr Tóvári József Bakonyi Ildikó Parragné Derecskei Katalin Sinka Andrásné Rajnainé Akantisz Beatrix Rázsóné Tamási Anna Kónya Miklós Piturcza János és kollegái.

Itt szeretném megköszönni drága feleségemnek a támogatást, megértését és türelmét, mert bizony néha kevesebb ido jutott rá a munka mellett; igen nagy segítség volt a biztos családi háttér. Szeretném megköszönni szüleimnek azt a bo két és fél évtizednyi idot, amellyel lehetségessé tették, hogy eljussak eddig a napig. Köszönet illeti minden közelebbi és távolabbi családtagjaimat akik, ilyen vagy olyan módon hozzájárultak ahhoz, hogy tanulmányaimban és munkámban elorejussak. Rendhagyó módon szeretném kifejezni köszönetemet a Magyar Államnak, hogy tanulmányaimhoz nem kevés pénzzel hozzájárult.

VI. Irodalom 1. Tímár J. A metasztatikus kaszkád. In: Ádány R, Kásler M, Ember I, Kopper L, Thurzó L (eds): Az onkológia alapjai. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest,1997. 2. Zakalka MA, Naor D. Beta-2 integrin dependent aggregate formation between LBT cell lymphoma and spleen cells: assesment of correlation with spleen invasiveness. Int Immunol 1994; 6: 917-924.

68

3. Aho R, Kalimo H, Salmi M et al. Binding of malignant lymphoid cells to the white matter of the human central nervous system: role of dofferent CD44 isoforms, ? 1, ? 2, ? 7 integrins and L-selectin. J Neuropathol Exp Neurol 1997; 56: 5 57-568. 4. Chan BMC, Matsura N, Takada Y et al. In vitro and in vivo consequences of VLA-2 expression on rhabdomyosarcoma cells. Science 1991; 251: 1600-1602. 5. Seftor RE, Seftor EA, Gehlsen KR et al. Role of ? v? 3 integrin in human melanoma cell invasion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 1557-1561. 6. Van Leeuwen RL, Yoshinaga IG, Akasaka T et al. Attachement, spreading, and migration of melanoma cells on vitronectin. The role of alpha V beta 3 and alpha V beta 5 integrins. Exp dermatol. 1996; 5: 308-15. 7. Onoda JM, Picchocki MP, Honn KV. Radiation induced increase in expression of the ? IIb beta 3 integrin in melanoma cells: effects on metastatic potential. Radiat Res. 1992; 130: 281-8. 8. Martignone S, Pellegrini R, Villa E, Tandon NN et al. Characterization of two monoclonal abtibodies directed against the 67 kDa high affinity laminin receptor and application for the study of breast carcinoma progression. Clin Exp Metast. 1992; 10: 379-86. 9. Gasparini C, Barbareshi M, Boracchi P, Bevalicqua P et al. 67 kDa laminin receptor expression adds prognostic information to intra-tumoral microvessel density in node negative breast cancer. Int J Cancer 1995; 60: 604-10. 10. Hand PH, Thor A, Schlom J, Rao CN, Liotta L. Expression of laminin receptor in normal and carcinomatous human tissues as defined by a monoclonal antibody. Cancer Res. 1985; 45: 2713-2719. 11. Lotz MM, Korzelius CA, Mercurio AM. Human colon carcinoma cells use multiple receptors to adhere to laminin: involvement of ? 6? 4 and ? 2? 1 integrins. Cell Regul. 1990; 1: 249-57. 12. Saunderson RD. Heparan sulphate proteoglycans in invasion and metastasis. Semin Cell Dev Biol. 2001; 12: 89-98. 13. Nakamishi H, Oguri K, Yoshida K, Itano N et al. Strucutral differences between heparan sulphates of proteoglycan involved in the formation of basement membranes in two Lewis lung carcinoma derived cloned cells with different metastatic potentials. Biochem J. 1992; 288: 215-24. 14.

15. Sameni M, Elliott E, Ziegler G, Fortgens PH et al. Cathepsin B and D are localized at the surface of the human breast cancer cells. Pathol Oncol Res. 1995; 1: 43-53. 16. Fernandez PL, Farre X, Nadal A, Fernandez E et al. Expression of cathepsin B and S in the progression of prostate carcinoma. Int J Cancer 2001; 95: 51-55. 17. Mai J, Waisman DM, Sloane BF. Cell surface complex cathepsin B / annexin II tetramer in malignant progression. Biochim Biophys Acta 2000; 1477: 215-30. 18. Reid HM, McElligott AM, McGlynn H. Phenotypic alterations in Caki-1 cells as a consequence of TIMP1 overexpression. Cancer Lett. 2001; 169: 189-98. 19. Beaulieu E, Kachra Z, Mousseau n, Delbecchi L et al. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in human pituitary tumors. Neurosurgery 1999; 45: 1432-40. 20. Luparello C, Avanzato G, Carella C, Pucci-Minafra I. tissue inhibitor of metalloprotease (TIMP)-1 and proliferative behaviour of clonal breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat. 1999; 54: 235-44. 21. Comoglio PM, Trusolino L. Invasive growth: from development to metastatsis. J Clin Invest. 2002; 109: 857-62. 22. Staff AC. An introduction to cell migration and invasion. Scand J Clin Lab Invest. 2001; 61: 257-68.

69

23. Mercurio AM, Rabinovitz I. towards a mechanistic understanding of tumor invasion. Semin cancer Biol. 2001; 11: 129-41. 24. Jahroudi N, Greenberger JS. The role of endothelial cells in tumor invasion and metastasis. J Neurooncol. 1995; 23: 99-108. 25. Weiss L, Orr FW, Honn KV. Interactions of cancer cells with the microvasculature during metastasis. FASEB J. 1988; 2: 12-21. 26. Nierodzik ML, Kleptish A, Karpatkin S. Role of platelets, thrombin, integrin IIb-IIa, fibronectin and von Willebrand factor on tumor adhesion in vitro and metastasis in vivo. Thromb Haemost. 1995; 74: 282-90. 27. Bohle AS, Kalthof H. Molceular mechanisms of tumor metastasis and angiogenesis. Langenbecks Arch Surg. 1999; 384: 133-40. 28. Kannagi R. Carbohydrate mediated cell adhesion involved in hematogenous metastasis of cancer. Glycoconj J. 1997; 14: 77-84. 29. Clezadrin P. Recent insights into the role of integrins in cancer metastasis. Cell Mol Life Sci. 1998; 54: 541-8. 30. Tímár J, Moczar E, Timár F et al. Comparative study on Lewis lung tumor lines with low and hogh metastatic capacity. II. Cytochemical and biochemical differences og glycosaminoglycans. Clin Exp Metast 1987; 5: 79-87. 31. Fidler IJ. Moleculaer biology of cancer: Invasion and metastasis. Cancer In: DeVita VT, Helman S, Rosenberg SA (eds): Principles and Practice of Oncology. Fifth edition, 1997, Lipincott-Raven Publ. Philadelphia, Vol 1. 135-152. 32. Paku S, Lapis K. Morphological aspects of angiogenesis in experimental liver metastasis. Am J Pathol. 1993; 143: 926-936. 33. Paku S, Bodoky G, Kupcsulik P, Tímár J. Blood supply of metastatic hepatic tumors: Suggestions for improved delivery of chemotherapeutic agents. J Natl Cancer Inst. 1998; 90: 936-937. 34. Riccardo A, Audisio H, Stoldt HS et al. Regional infusion therapy. In: Garden OJ, Geraghty JG, Nagorney DM (eds): Liver metastases, bilogy, diagnosis, and treatment. 1998 Springer, London, 141-152. 35. Batson OV. The role of vertebral veins in metastatic processes.Ann Int Med. 1942; 16: 38 36. Dodds PR, Dagan AR. The role of vertebral veins in the dissemination of prostatic carcinoma. J Urol 1981; 126: 753 37. Hart IR. Perspective: tumor spread – the problems of latency. J Pathol. 1999; 187: 91-94. 38. Fleisch H. Osteolytic tumor bone disease. In: Fleisch H (ed): Bisphosphonates in bone disease. The Parthenon Publishing Group, 1997, New York, London, 86-106. 39. Honn KV, Aref A, Chen YQ et al. Prostate cancer. Old problems and new approaches. Part III. Prevention and treatment. Pathol Oncol Res. 1996; 2: 276-292. 40. Ewing J. Neoplastic diseases. 1928 WB Saunders, Philadelphia 41. Glinsky GV. Cell adhesion and metastasis: is the site of cancer metastasis determined by leukocyte-endothelial cell recognition and adhesion. Crit Rev Oncol/Hematol 1993; 14: 229-278. 42. Tóvári J, Paku S, Rásó E et al. Role osf sinusoidal heparan sulphate proteoglycan in liver metastasis formation. Int J Cancer 1997; 71: 825-831. 43. Nicolson GL. Paracrine and autocrine growth mechanisms in tumor metastasis to specific sites with particular emphasis on brain and lung metastasis. Cancer Metast Rev. 1993; 12: 325-343. 44. Radinsky R. Paracrine growth regulation of humían colon carcinoma-specific metastasis. Cancer Metast Rev. 1993; 12: 345-361.

70

45. Gillespie MT, Thoma RJ, Pu ZY et al. Calcitonin receptors, bone sialoprotein and osteopontin are expressed in primary breast cancer. Int J Cancer 1997; 73: 812-815. 46. Bellahcene A, Albert V, Pollina L et al. Ectopic expression of bone sialoprotein in human thyroid cancer. Thyroid 1998; 8: 637-641. 47. Koennemann KS, Yeung F, Chung LW. Osteomimetic properties of prostate cancer cells: a hypothesis supporting the predilection of prostate cancer metastasis and growth in the bone environment. Prostate 1999; 39: 246-261. 48. Nicolson GL. Paracrine/autocrine growth mechanisms in tumor metastasis. Oncol Res 1992; 4: 229-399. 49. Cohen AM, Minsky BR, Schilsky RI. Cancer of the colon. In(DeVita VT, Hellman S, RosenbergSA) Principles of Oncology, Fifth edition, Lippincott-Raven Publ. Philadelphia, 1997, Vol 1., pp 1144-1162.1997 50. Gyorfi T, Tímár J, Lapis K. Liver-specific human colon-carcinoma in immunosuppressed mice. Neoplasma 1991; 38: 49-55. 51. Paku S, Rot A, Ladányi A, Lapis K. Demonstration of the organ preference of liver selected high metastatic lewis lung tumor cell line. Clin Exp Metast 1989; 7: 599607. 52. Yasui N, Sakamoto M, Ochiai A et al. Tumor growth and metastasis of human colorectal cancer cell lines in SCID mice resemble clinical metastatic behaviours. Invasion Metastasis 1997; 17: 259-69. 53. Tóvári J, Paku S, Rásó E et al. Role osf sinusoidal heparan sulphate proteoglycan in liver metastasis formation. Int J Cancer 1997; 71: 825-831. 54. Tímár J, Ladányi A, Lapis K, Moczar M. Diferential expression of proteoglycans on the surface of human melanoma cells characterized by altered experimental metastatic potential. Am J Pathol. 1992; 141: 467-474. 55. Nakamura T, Nawa K, Ichihara A, Kaise N and Nishino T. Purification and subunit strucuture of hepatocyte growth factor from rat platelet. FEBS Lett. 1987; 224: 311316. 56. Gohda E, Tsubouchi H, Nakayama H et al. Purification and partial characterization of hepatocyte growth factor from plasma of a patient with fulminant hepatic failure. J Clin Invest. 1988; 81: 414-419. 57. Zarnegar R and Michalapoulos G. Purification and biological characterization of human hepatopoietin A, a polypeptide growth factor for hepatocytes. Cancer Res. 1989; 49: 3314-3320. 58. Nakamura T, Nishiwaza T, Hagiya M et al. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor. Nature 1989; 342: 440-443 59. Loker NA, Godowski PJ. Generation and characterization of a competitive antagonist of human hepatocyte growth factor HGF/NK1. J Biol Chem. 1993; 268: 17145-17150. 60. Cioce C, Csaky KG, Chan AML et al. Hepatocyte growth factor (HGF) / NK1 is a naturally occuring HGF/scatter factor variant with agonist / antagonist activity. J Biol Chem 1996; 271: 13110-13115. 61. Chan AM, Rubin JS, Bottaro DP et al. Identification of a compeptitive HGF antagonist encoded by an alternative transcript. Science 1991; 254: 1382-1385. 62. Weidner KM et al. Evidence for identity of human scatter factor and human hepatocyte growth factor. Proc. Natl Acad Sci. USA 1991; 88: 7001-5. 63. Fukuyama R, Ichijoh Y, Minoshima S et al. Regional localization of the hepatocyte growth factor (HGF) gene to human chromosome 7 band q21.1. Genomics 1991; 11: 410-415.

71

64. Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL et al. Identification of the hepatocxte growth factor receptor as the c- met proto-oncogene product. Science 1991; 251: 802-804 65. Tempest PR, Stratton MR and Cooper CS. Structure of of the met protein and variation of met protein kinase activity among human tumour cell lines. Br J Cancer 1988; 58: 3-7. 66. Giordano S, Ponzetto C, Di Renzo MF, Cooper CS and Comioglio PM. Tyrosine kinase receptor indistinguishable from the c- met protein. Nature1989; 339: 155-156. 67. Gonzatti-Haces M, Seth A, Park M et al. Cha racterization of TRP-MET oncogene p65 and the MET prototncogene p140 protein-tyrosine kinases. Proc. Natl Acad Sci USA 1988; 85: 21-25. 68. Sonnenberg E, Meyer D, Weidner KM, Birchmeier C. Scatter factor / hepatocyte growth factor and its receptor, the c-met tyrosine kinase, can mediate a signal exchange between mesenchyme and epithelium during mouse development. Cell Biol 1993; 123: 223-235. 69. Rodrigues NA, Naujokas MA,. Park M. Alternative splicing generates isoforms of the met receptor tyrosine kinse which undergo differential processing. Mol Cell Biol 1991; 11: 2962-2970. 70. Van deer Voort R, Taher TE, Wielenga VJ et al. Heparan sulphate- modified CD44 promotes hepatocyte growth factor / scatter factor –induced signal transduction through the receptor tyrosine kinase Met. 1999 71. Zhou H, Casa-Finet JR, Heath, Ciats R et al. Identification and dynamics of a heparin binding site in hepatocyte growth factor. Biochemistry 1999; 38: 1473914802. 72. Aoyama H, Naka D, Yoshiyama Y, Ishii T et al. Isolationand conformational analysis of fragment peptide corresponding to the heparin binding site of hepatocyte growth factor. Biochemistry 1997; 19: 10286-291. 73. Kinosaki M, Yamaguchi K, Murakami A et al. Identification of heparin-binding stretches of a naturally occuring deleted variant of hepatocyte growth factor. Biochim Biophys Acta 1998; 1384: 93-102. 74. Lander AD. Targeting the glycosaminoglycan-binding sites on proteins. Chem Biol. 1994; 1: 73-78. 75. Jayaraman G, Wu CW, Liu YJ et al. Binding of a de novo designed peptide to specific glycoseaminoglycans. FEBS Lett. 2000; 482: 154-158. 76. Guo N, Krutzsch E, Negre E et al. Heparin binding peptides from the type I repeats of thrombospondin. J Biol. Chem. 1992; 267: 19349-19355. 77. Healy KE, Rezania A, and Stile RA. Designing biomaterials to direct biological responses. Ann NY Acad Sci. 1999; 875:24-35. 78. Liu S, Zhou F, Hook M and Carson DD. A heparin-binding peptide of heparin/heparan sulphate – interacting protein modulates blood coagulation activities. Proc Natl Sci USA 1997; 94: 1739-1744. 79. Murphy-Ullrich JE, Gurusiddappa S, Frazier WA, Hook M. Heparin-binding peptides from thrombospondin 1 and 2 contain focal adhesion- labilizing activity. J Biol Chem. 1993; 268: 26784-9. 80. Sakiyama SE, Schense JC, Hubbel JA. Incorporation of heparin-binding peptides into fibrin gels enhances neurite extension: an example of designer matrices in tissue engineering. FASEB J. 1999; 13: 2214-2224. 81. Tashiro K, Monji A, Yoshida I et al. An IKLLI-containing peptide derived from the laminin alpha1 chain mediating heparin-binding, cell adhesion, neurite outgrowth and proliferation, represents a binding site for integrin ? 3? 1 and heparan sulphate proteoglycan. Biochem J. 1999; 340: 119-126.

72

82. Tolsma SS, Volpert OV, Good DJ et al. Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angigenic activity. J Cell Biol. 1993; 122: 497-511. 83. Ramadori G, Neubauer K, Odenthal M, et al. The gene of hepatocyte growth factor is expressed in fat-storing cells of liver and is downregulated during cel growth and by transforming growth factor-beta. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 183: 739-742. 84. Kinoshita I, Hiaro S, Matsumoto K, Nakamura T. Possible endocrine control by hepatocyte growth factor of liver regeneration after partial hepatectomy. Biochem Biophys Res Commun. 1991; 177: 330-337. 85. Liu ML, Mars WM, Zarnegar R, Michalapoulos GK. uptake and distribution of hepatocyte growth factor in normal and regenerating adult rat liver. Am J Pathol. 1994; 144: 129-140. 86. Tsubouchi H, Hirono S, Gohda E, et al. Clinical significance of human hepatocyte growth factor in blood from patients with fulminant hepatic failure. Hepatology 1989; 9: 875-881. 87. Lindroos PM, ZarnegarR, Michalapoulos GK. Hepatocyte growth factor (hepatopoietin A) rapidly increases in plasma before DNA synthesis and liver regeneration stimulated by partial hepatectomy and carbon tetrachloride administration. Hepatology 1991; 13: 734-749. 88. Risau W. Mechanism of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671-674. 89. Carmeliet P. Mechanism of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine 2000; 6: 389-395. 90. Benjamin LE, Hemo I, Keshet E. A plasticity window for blood vessel remodelling is denied by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development 1998; 125: 1591-1598. 91. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int 1999; 56: 794-814. 92. Carmeliet P, Ferreira V, Breier G et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single vascular endothelial growth factor allele. Nature 1996; 380: 435-439. 93. Ferrara N, Carver-Moore K, Chen H et al Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature1996; 380: 439-442. 94. Shalby F, Ho J, Stanford WL et al. A requirement for Flk-1 in primitive and definitive hematopoeisis and vasculogenesis. Cell 1997; 89: 981-990. 95. Fong GH, Zhang L, Bryce DM, Peng J. Increased hemangioblast commitment, not vascular disorganisation, is the primary deffect in flt-1 knock out mice. Development 1999; 126: 3015-3025. 96. Bader BL, Rayburn H, Crowley D, Hynes RO. Extensive vasculogenesis, angiogenesis, and organogenesis precede lethality in mice lacking ? v integrins. Cell 1998; 95: 507-519. 97. Takahashi T, Kalka C, Masuda H et al. Ischemia- and cytokine- induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nature Medicine 1999; 5: 434-438. 98. Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursorrs. Blood 2000; 95: 952-958. 99. Elicieri BP et al. Selective requirement for Src kina ses during VEGF induced angiogenesis abd vascular permeability. Mol Cell 1999; 4: 915-924.

73

100. Thurston G, Rudge JS, Ioffe E et al. Angiopoietin protects the adult vasculature against plasma leakage. Nature Medicine 2000; 6: 1-4. 101. Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF et al. Angiopoietin2 a natural antagonist for Toe2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 1997; 277: 55-60. 102. Bae DG, Gho, YS, Yoon WH, Chae CB. Arginic-rich anti-vascular endothelial growth factor peptides inhibit tumor growth and metastatsis by blocking angiogenesis. J Biol Chem 2000; 275: 13588-13596. 103. Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996; 86: 353-364. 104. Fidler IJ, Ellis LM. The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell 1994; 79: 185-188. 105. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine 1995; 1: 27-31. 106. Kerbel RS. Tumor angiogenesis: past, present and the near future. Carcinogenesis 2000; 21: 505-515. 107. Paku S. Current concepts of tumor- induced angiogenesis. POR 1998; 4: 62-65. 108. Döme B, Paku S, Somlai B, Tímár J. Vascularization of cutaneous melanoma involves vessel co-option and has clinical significance. J Pathol. 2002; 197: 355-62. 109. Maniotis AJ, Folberg R, Hess A et al. Vascular chanel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicri. Am J Pathol 1999; 155: 739-752. 110. Kellner B. Fettmorphologie der Sarkome. Z krebsforsch 1941; 52:240-246. 111. Holmgren L, O'Reilly MS, Folkman J. Dormancy of micromatsases: balanced proliferation and apoptosis inthe prefence of angiogenesis suppression. Nat Med 1995; 1: 149-153. 112. Chang YS, DiTomaso E, McDonald DM et al. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in cintact with flowing blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 14608-14613. 113. Holash J, Maisonpierre PC, Compton D et al. Vessel cooption, regressio n and growth in tumrs mediated by angiopoietins and VEGF. Science 1999; 284: 19941998. 114. Jimenez B, Volpert OV, Crawford SE et al. Signals leading to apoptosisdependent inhibition of neovascularisation by thrombospondin-1. Nat Med 2000; 6: 41-48. 115. Tímár J, Tóth J,. Tumor-sinuses – vascular channels. POR 2000; 6: 83-86. 116. Tóth GK, Pataricza J, Janaky T, Mak M et al. Synthesis of two peptide scorpion toxins and their use to investigate the aortic tissue regulation. Peptides 1995; 16: 1167-1172. 117. Pál K, Kopper L, Lapis K. Chemotherapeutic sensitivty of liver metastases from intrasplenically – growing Lewis lung tumor. Clin Exp Metastasis 1983; 1: 341-347. 118. Ladányi A, Tímár J, Paku S et al. Selection and characterization of human melanoma lines with different liver-colonizing capacity. Int J Cancer 1990; 46: 45661. 119. Boehm T, Folkman J, Browder T, O’Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 1997; 390: 404-407. 120. Singh RK, Tsan R, Radinsky R. Influence of the host microenvironment on the clonal selection of human colon carcinoma cells during primary tumor growth and metastasis. Clin Exp Metast. 1997; 15: 140-150.

74

121. Tajima H, Matsumoto K, Nakamura T. Regulation of growth and motility by hepatocyte growth factor and receptor expression in various cell species. Exp Cell Res 1992; 202: 423-431. 122. Jiang WG, Hallett MB, Puntis MCA. Hepatocyte growth factor / scatter factor, liver regeneration and cancer metastasis. Br J Surg. 1993; 80: 1368-1373. 123. Imai J, Watanabe M, Sasaki M et al. Induction of c- met proto-oncogene expresion at the metastatic site. Clin Exp Metast. 1999; 17: 457-62. 124. Nakayama Y, Okazaki K, Shibao K et al. Alternative expression of the collagenase and adhesion in the highly metastatic clones of human colonic cancer cell lines. Clin Exp Metast 1998; 16: 461-469. 125. Herzig K. Functional expression of HGF and its receptor in human coorectal cancer. Digestion 2000; 61: 237-246. 126. Fujita S, Sugano K. Expression of c- met proto-oncogene in primary colorectal cancer and liver metastases. Jpn J Clin Oncol 1997; 27: 378-83. 127. Huang TJ, Wang JY, Lin SR et al. Overexpression of the c-met protooncogene in human gastric carcinoma – correlation to clinical features. Acta Oncol. 2001; 40: 638-43. 128. Park WS, oh RR, Kim YS et al. Abscene of mutations in the kinase domain of the Met gene and frequent expression of Met and HGF/SF protein in primary gastric carcinomas. APMIS 2000; 108: 194-200. 129. Lin W, Kao HW, Robinson D et al. Tyrosine kinases and gastric cancer. Oncogene 2000; 19: 5680-9. 130. Inoue K, Karashima T, Chikazawa M et al. Overexpression of c- met protooncogene associated with chromophilic renal cell carcinoma with papillary growth. Virchows Arch 1998; 433: 511-516. 131. Fisher J, Palmedo G, Von Knobloch R et al. Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumors. Oncogene 1998; 17: 733-739. 132. Corps AN, Sowter HM, Smith SK. Hepatocyte growth factor stimulates motility, chemotaxis and mitogenensis in ovarian cells expressing high levels of c-met. Int J Cancer 1997; 73: 151-155. 133. Harvey P, Warn A, Newman P et al. Immunoreactivity for hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, met, in human lung carcinomas and malignant mesotheliomas. J Pathol 1996; 180: 389-94. 134. Ichimura E, Maeshima A, Nakajima T, Nakamura T. Expression of c- met/HGF receptor in human non-small cell lung carcinoma s in vitro and in vivo and its prognostic significance. Jpn J Canc Res 1996; 87: 1063-1069. 135. DiRenzo MF, Olivero M, Ferro S et al. Overexpression of the c- met/HGF receptor gene in human thyroid carcinomas. Oncogene 1992; 7:2549-2553. 136. Ruco LP, Ranalli T, Marzulo A et al. Expression of Met in thyroid tumors. J Pathol 1996; 180: 266-270. 137. Trovato M, Villari D, Bartolone L et al. Expression of the hepatocyte growth factor and c- met in normal thyroid, non-neoplastic, and neoplastic nodules. Thyroid 1998; 8: 125-131. 138. DiRenzo MF, Poulsom R, Olivero M et al. Expression of the MET/hepatocyte growth factor receptor in human pancreatic cancer. Cancer Res 1995; 55: 11291138. 139. Duh FM, Schere SW, Tsui LC, Lerman MI, Zbar B, Schnidt. Gene structure of the human MET protooncogene. Oncogene 1997; 15: 1583-1586.

75

140. Prat M, Narsimhan RP, Crepaldi T et al. The receptor encoded by the human cmet oncogene is expressed in hepatocytes, epithelial cells and solid tumors. Int J Cancer 1991; 49: 323-328. 141. Umeki K, Shiota G, Kawasaki H. Clinical significance of c- met oncogene alterations in human colorectal cancer. Oncology 1999; 56: 314-321. 142. DiRenzo MF, Narsimhan R, Olivero M, et al. Expression of c- met oncogene alterations in human colorectal cancer. Oncogene 1991; 6: 1997-2003. 143. Liu C, Park M, Tsao MS. Overexpression of c- met proto-oncogene but not epidermal frowth factor receptor or c-erbB-2 in primary human colorectal carcinomas. Oncogene 1992; 7: 181-186. 144. DiRenzo MF, Olivero M, Giacomini A et al. Overexpression and and amplification of Met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer. Cli Canc Res 1995; 1: 147-154. 145. Hara T, Ooi A, Kobayashi M et al. Amplification of c- myc, K-sam, and c- met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization. Lab Invest 1998; 78: 1143-1153. 146. Tsugawa K, Yonemura Y, Hirono Y et al. Amplification of c-met, c-erbB-2 and epidermal growth factor receptor gene in himan gastric cancers: correlation to clinical features. Oncology 1998; 55: 475-481. 147. Nakajima M, Sawada H, Yamada Y et al. The prognostic significance of amplification and overexpression of c- met and c-erbB-2 in human gastric carcinomas. Cancer 1999; 85: 1894-1902. 148. Liu C, Tsao MS. In vitro and in vivo expressions of transforming growth factoralpha and tyrosine kinase receptors in human non-small-cell lung carcinoma. Am J Pathol 1993; 142: 1155-1162. 149. DiRenzo MF, Oliviero M, Katsaros D et al. Iverexpression of the Met / HGF receptor in ovarian cancer. Int J Cancer 1994; 58: 658-662. 150. Sawatsubashi M, Sasatomi E, Mizokami H et al. Expression of c- met in laryngeal carcinoma. Virchows Arch 1998; 423: 331-335. 151. Rong S, Segal S, Anver M et al. Invasiviness and metastasis og NIH 3T3 cells induced by Met-Hepatocyte growth factor / scatter factor autocrine stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 4731-4735. 152. Jeffers M, Fiscella M, Webb CP et al. The mutationally activated Met receptor mediates motility and metastasis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 1441714422. 153. Matsumoto K, Nakamura T, Kramer RH. Hepatocyte grpwth factor / scatter factor induces tyrosine phosphorilation of focal adhesion kinase (p125FAK) and promotes migration and invasion by oral squamous cell carcinoma cells. J Biol Chem 1994; 269: 31807-13. 154. Sun XF, Ekberg H, Zheng et al. Overexpression of ras is an independent prognostic factor in colorectal adenocarcinoma APMIS 1998; 106: 657-664. 155. Fredersdorf S, Burns J, Milne AM et al. High level expression of p27(kip1) and cyclin D1 in some human breast cancer cells: inverse correlation betwen the expression of p27(kip1) and degree of malignancy in human breast and colorectal cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 93: 6380-6385. 156. Tanigawa S, Hirokazu M, Matsumura M et al. Tumor angiogenesis and mode of metastasis in patients with colorectal cancer. Cancer Res 1997; 57: 1043-1046. 157. Goodinson S, Tarin D. Clinical implications if anomalous CD44 gene expression in neoplasia. Front Biosci. 1998; 3: 89-109.

76

158. Duffy MJ. Proteases as prognostic markers in cancer. 1996; Clin Canc Res 2: 613-618. 159. Parsons SL, Watson SA, Collins HM et al. Gelatinase (MMP-2 and 9) expression in gastrointestinal malignancy. Br J Canc 1998; 78: 1495-1502. 160. Nakamori S, Watanabe H, Kameyama M. et al. Expression og autocrine motility factor receptor in colorectal cancer as a predictor for disease recurrence. Cancer 1994; 74: 1855-1962. 161. Fowlkes JL, Serra DM. Charcterization of glycosaminoglycan-binding domains present in insulin- like growth factor-binding protein-3. J Biol chem. 1996; 271: 331335. 162. Lyon M, Deakin JA, Mizuno K et al. Interaction of hepatocyte growth factor with heparan sulphate. J. Biol. Chem. 1994; 269: 11216-11223. 163. Ruoslahti E, Yamaguchi Y. Proteoglycans as modulators of growth factor activities. Cell 1991; 64: 867-869. 164. Yayon A, Klagsburn M, Esko JD et al. Cell surface, heparin –like molecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor. Cell 1991; 64: 841-846. 165. Dodge GR, Kovalszky I, Chu ML et al. Heparan sulphate proteoglycan of human colon: partial molecular cloning, cellular expressin, and mapping of the gene (HSPG2) to the short arm of human chromosome 1. Genomics 1991; 10: 673-680. 166. Hoffmann M, Rudy W, Zoller M et al. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res 1991; 51: 5292-97. 167. Wielenga VJ, Heider KH, Offerhaus GJ et al. Expressinon of CD44 variant proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Res 1993; 53: 4754-56. 168. Heider KH, Hoffmann M, Hors E et al. A human homologue of the rat metastasis associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J Cell Biol. 1993; 120: 227-33. 169. Gross N, Beretta C, Peruisseau G et al. CD44H expression by human neuroblastoma cells: relation to MYCN amplification and lineage differentation. Cancer Res. 1994; 54: 4238-42. 170. Koopman G, Heider KH, Horst E et al. Activated human lymphocytes and aggressive non-Hodgkin's lymphoma express a homologue of the rat metastasisassociated variant of CD44. J Exp Med. 1993; 177: 879-904. 171. Tímár J, Kovalszky I, Paku S et al. Two human melanoma xenografts with different metastatic capacity and glycosaminoglycan pattern. J Cancer Res Clin Oncol 1989; 115: 554-557. 172. Tímár J, Kovalszky I. Differential expression of proteoglycans on the surface of malignant cells and in the tumor stroma. In: Tumor Matrix Biology, chapter 2., ed. By R Adany, CRC Press, Boca Raton, 1995, pp 23-53. 173. Iida J, Skubitz AP, frucht LT et al. Cordinate role for cell surface chndroitin sulphate proteoglycan and alpha 4 beta 1 integrin in mediating melanoma cell adhesion to fibronectin. J Cell Biol. 1992; 118: 431-444. 174. Inki P, Stenback F, Talve L, Jalkanen M. Immunohistochemical localization of syndecan in mouse skintumors induced by UV radiation. Loss of expression associated with malignant transformation. Am J Pathol. 1991; 139: 1330-40. 175. Cohen IR, Murdoch AD, Naso MF et al. Abnormal expression of perlecan proteoglycan in metastatic melanomas. Cancer res. 1994; 54: 5771-74.

77

176. Lapis K, Tímár J, Tímár F et al. Differences in cell surface characteristics of poorly and highly metastatic Lewis lung tumor variants. In: Biochemistry and molecular genetics of cancer metastasis, eds: Lapis K, Liotta LA and Rabson AS, Martinus Nijhoff Publ. Co., Boston, 1985, pp 225-235. 177. Tímár J, Pogány G, Balázs M et al. Modulation of membrane phenotype, matrix adhesion and microinvasiveness of metastatic tumor cells by HudR. Cell Biochem Funct. 1990; 8: 211-20. 178. Fazekas K, Janovics A, Döme B et al. Effect of HGF- like basic hexapeptides on angiogenesis. Microvascular research 2001; 62:440-444. 179. Rha SY, Noh SH, Kim TS et al. Modulation of biological phenotypes for tumor growth and metastasis by target specific biological inhibitors in gastric cancer. Int J Mol Med. 1999; 4: 203-212. 180. Schiller J. Early trials of antiangiogenic agents. Anticanc Oncol 1999; 15: 3-11. 181. Malonne H, Langer I, Kiss R et al. Mechanisms of tumor angiogenesis and therapeutic implications: angiogenesis inhbitors. Clin Exp Metast 1999; 17: 1-14. 182. Schlaeppi JM, Wood JM. Targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) for antitumor therapy, by anti- VEGF neutralizing monoclonal antibodies or by VEGF receptor tyrosine-kinase inhibitors. Canc Metast 1999; 18: 473-481. 183. Thompson WD, Li WW, Maragoudakis M. The clincal manipulation of angiogeneisi: pathology, side-effects, surprises, and opportunuties with novel human therapies. J Pathol 2000; 190: 330-337. 184. Luzi KJ, Varghese HJ, MacDonald IC et al. Arginine-rich anti- vascular endithelial growth factor peptides inhibit tumor growth and metastasis by blockin angiogenesis. J Biol Chem 1998/99; 4: 373-379. 185. Bowder T, Folkman J, Pirie-Shepherd S. The hemostatic system as a regulator of angiogenesis. J Biol Chem 2000; 275: 1521-1524. 186. DeNardo SJ, Burke PA, Leigh BR et al. Neovascular targeting with cycle RGD peptide (cRGDf-ACHA) to enhance delivery of radioimmunotherapy. Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 2000; 15: 71-79. 187. Nicolaou KC, Trujilo JI, Jandeleit B, et al. Design, synthesis and biological evaluation of nonpeptide integrin antagonists. Bioorg Med Chem 1998; 6: 11851208. 188. Yeh ChH, Peng H-Ch, Huang T-F. Accutin, anew desintegrin, inhibits angiogenesis in vitro and in vivo by acting as integrin ? v? 3 antagonist and inducing apoptosis. Blood 2000; 92: 3268-3276. 189. O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y et al. Angiostatin: a novel angiogeneisi inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 1994; 79: 315-328. 190. O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997; 88: 277-288. 191. Cherrington JM, Strawn LM, Shawver LK. New paradigms for the treatment of cancer: the role of antiangiogenesis agents. Adv Canc Res 2000; 79: 1-38. 192. Kuba K, Matsumoto K, Ohnishi K et al. Kringle 1-4 of hepatocyte growth factor inhibits proliferation and migration of microvascular endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 293: 846-852. 193. Date k, Matsumoto K, Kuba K et al. Inhibition of tumor growth and invasion by a four-kringle antagonist (HGF/NK4) for hepatocyte growth factor. Oncogene 1998; 17: 3045-54.

78

194. Schwall RH, Chang LY, Godowski PJ et al. Heparin induces dimerization and confers proliferative activity onto hepatocyte growth factor antagonists NK1 and NK2. J Cell Biol 1996; 133: 709-18. 195. Jeney A, Tímár J, Pogány G et al. Glycosaminoglycans as novel target in antitumor therapy. Tokai J Exp Clin Med 1991; 15: 167-177.

VII. Az értekezés alapját képezo saját közlemények Az értekezés tárgyában megjelent saját publikációk Angol nyelvu közlemények I. Fazekas K., Janovics Á., Döme B., Albini A., Tímár J:Effect of HGF- like basic hexapeptides on angiogenesis. Microvascular Research. 2001; 62:440-444. II. Döme B., Somlai B., Ladányi A., Fazekas K., Zöller M., Tímár J.:Expression of CD44v3 splice variant is associated with the visceral metastatic phenotype of human melanoma. Virchows Archiv.2001; 439:628-635. III. Tímár J., Döme B., Fazekas K., Janovics Á., Paku S.:Angiogenesis-dependent diseases and angiogenesis therapy. Pathology Oncology Research 2001; 7:85-94. IV. Fazekas K., Csuka O., Köves I., Rásó E., Tímár J.:Experimental and clinicopathologic studies on the function of the HGF receptor in human colon cancer metastasis. Clinical Experimentel Metastatis. 2001; 18:639-649 V. Fazekas K.,Rásó E., Zarándi M., Dudás J., Tímár J.:Basic HGF-like peptides inhibit generation of liver metastases in murine and human tumor models. Anticancer Rsearch 2002; 22:2575-2580. Magyar nyelvu közlemények VI. Janovics Á., Fazekas K., Döme B., Hatvani I., Tímár J.:Rekombináns humán hepatocita növekedési faktor (rhHGF) és ? láncának pentapeptidje (HGF 645-649 ) gátolja a kísérletes angiogenezist. Magyar Onkológia 1999, 43(2):129-135. VII. Janovics Á., Fazekas K., Hatvani I., Tímár J.:A neoangiogenezis szemészeti jelentosége és gátlásának új lehetoségei. Szemészet 2000, 137:187-195.

Könyvfejezetek: IX. Tímár J., Tóvári J., Fazekas K., Tóth Sz., Rásó E., Paku S., Ladányi A.:Tumorsejtek invazív fenotípusának citokin modulációja.In: Biomedica II. Szimpózium, Új eredmények a laboratóriumi diagnosztikában. Pp 60-72. Budapest 1997, Biomedica Hungaria Kft. Absztraktok: X. Tímár J., Fazekas K., Csuka O., Köves, Rásó E.:Experimental aand clinicopathologic studies on the function of the HGF receptor in human colon cancer metastases. Proc. AACR 42:613, 2001. XI. Tímár J., Fazekas K., Janovics Á., Tóvári J., Rásó E., Ladanyi A.: Hepatocyte growth factor-derived peptides inhibit tumor cell proliferation in vitro, angiogenesis and metastasis in vivo. Proc EACR 1998, 126. XII. Fazekas K., Paku S., Tímár J.:C - met onkoprotein (HGF receptor) szerepe humán kolorektális tumorok biológiai viselkedésében. Magyar Onkológia 43(2):254, 1999.

79

XIII. Fazekas K, Janovics Á, Hatvani I, Tímár J.: Bázikus hexapeptidek antiangiogenetikus hatásának elemzése in vitro és in vivo. XXXII. Membrán-transzport konferencia, Sümeg, 2002. E32.

VIII. Függelék

A táblázatok listája

80

1. táblázat. A különbözo primer tumorok szervi áttéteinek gyakorisága 2. táblázat. Az angiogenezis lépései 3. táblázat. Antiangiogenikus potenciálú hagyamányos szerek 4. táblázat. Angiogén mitogéneken ható inhibitorok. 5. táblázat. Jelátvitelre ható angiogenezis inhibitorok. 6. táblázat. Endotél sejt - ECM kölcsönhatásra ható terápiás lehetoségek. 7. táblázat. A szintetizáltatott bázikus peptidek aminosav szekvenciája. 8. táblázat Humán kolorektális tumor sejtvonalak máj áttétképzo képessége. 9. táblázat Humán kolorektális sejtvonalak c- met onkoprotein expressziójának meghatározása áramlásos citometriával. 10. táblázat. Humán kolorektális tumor sejtvonalak heparánszulfát-proteoglikán expressziójának vizsgálata áramlásos citometriá val (az adatok a pozitív sejtek 11.táblázat. HGP1 kezelés hatása a tumor- indukált angiogenezisre in vivo.

Az ábrák listája 1. ábra. A humán HGF szekvenciája és domén szerkezete. 2. ábra. Szintetikus penta- és hexapeptidek heparinköto képeségének vizsgálata. 3. ábra. Különbözo metasztatikus potenciálú humán kolorektális tumor sejtvonalak cmet expressziójának Western blot analízise. 4. ábra. Különbözo metasztatikus potenciálú humán kolorektális tumor sejtvonalak cmet expressziójának RT-PCR analízise. 5. ábra A c- met (A, C E) és a tirozin foszforillált proteinek (B, D, F) konfokális mikroszkópiája fibronektinre tapasztott humán kolón karcinóma sejteken. 6. ábra Humán rekombináns hepatocita növekedési faktor hatása humán kolorektális adenokarcinóma sejtvonalakra szérum mentes körülmények között (72 óra) in vitro. 7. ábra. 24 órás rhHGF kezelés (20 ng/ml) hatása adherens kolón karcinóma sejtek szétvándorlására. Fázis kontraszt mikroszkópia. 8. ábra. HGF hatása humán kolorektális sejtvonalak szóródására. 9. ábra. A.: c-met ? -lánc immunhisztokémiai kimutatása humán kolón mukóza és kolón karcinóma szövetben. 10. ábra. C-met ? -lánc Western blot analízise humán kolón adenokarcinómákon. 11. ábra. Duke’s B és C stádiumú humán kolorektális karcinómák c- met expressziójának denzitometriás elemzése.

81

12. ábra. A c- met humán kolón karcinómákbeli immunhisztokémiai jelölodésének morfometriai elemzése. 13. ábra. HGP peptidek hatása HT25 sejtek proliferációjára in vitro. 14. ábra. HGP peptidek hatása M1/9 sejtek proliferációjára in vitro. 15. ábra. Intraperitoneális HGP1 kezelés hatása lépbe oltott 3LL-HH sejtek májkolonizálására. 16. ábra Intraperitoneális HGP kezelés hatása lépbe oltott M1/9 sejtek májkolonizálására. 17. ábra Peritumorális HGP1 kezelés (0.05, 0.5, mg/kg/nap) hatása s.c. HT25 humán kolorektális karcinóma növekedésére. 18. ábra. Intraperitoneálisan adagolt HGP1 peptid hatása lépbe oltott HT25 humán kolorektális karcinóma májáttétképzésére SCID egerekben. 20. ábra Bázikus hexapeptidek sejtproliferációra gyakorolt in vitro hatása. 21. ábra. Angiogenezis gátlása csirke CAM módszerben HGF HHRGK 654-659 (HGP1) peptiddel. 22. ábra Bázikus peptidek hatása csirke CAM angiogenezisre. 23. ábra GRGESP peptid hatása csirke CAM angiogenezisre. 24. ábra. Bázikus peptidek hatása humán Kaposi szarkóma sejtek növekedésére. 25. ábra. Bázikus peptidek hatása humán agyi mikroér endotél sejtek növekedésére. A

Rövidítések AMF=Autokrin Motilitási Faktor AMFR= AMF receptor CAM=Kálcium függo adhéziós molekula CAM modell=choriallantois membrán modell CS=kondroitin-szulfát CSPG=kondroitin-szulfát proteoglikán DCC=deleted in colon cancer DSPG=dermatán-szulfát proteoglikán ECM=extracelluláris mátrix EGF=Epidermális növekedési faktor FGF=Fibroblaszt növekedési faktor FITC=Fluorescein- izotiocianát konjugátum FN=fibronektin GAG=glükóz-aminoglikán GM-CSF=granulocita-monocita kolónia stimuláló faktor HA=hialuronsav HGF=Hepatocita Növekedési Faktor HS=heparán-szulfát

82

HSPG=Heparánszulfát proteoglikán IGF=Inzulin- szeru növekedési faktor KSPG=keratán-szulfát proteoglikán MMP=Mátrix metalloproteináz PAI=Plazninogén-aktivátor inhibitor PCNA=proliferáli sejt nukleáris antigén PCR=polimeráz láncreakció PDGF=Vérlemezke eredetu növekedési faktor PG=proteoglikán PSA=Prosztata specifikus antigén RT-PCR=reverz transzkripció utáni PCR SF=Scatter Faktor TGF=Tumor növekedési faktor TIMP=MMP szöveti inhibitor TNF=Tumor nekrózis faktor tPA=szöveti típusú plazminogénaktivátor uPA=urokináz tipusú plazminogénaktivátor VEGF=Vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

83