BAB III METODE PENELITIAN
A.
Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimen. Menurut Nazir (1999), penelitian eksperimental adalah penelitian yang dilakukan dengan mengadakan manipulasi terhadap objek penelitian serta adanya kontrol.
B.
Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan pada Uji Antagonisme adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena dilakukan di Laboratorium dengan kondisi yang relatif homogen. Jumlah perlakuan yang digunakan adalah 2 perlakuan dengan menggunakan variasi isolat yang berbeda dengan 1 kontrol. Adapun isolat
Pseudomonas spp. yang digunakan
dalam penelitian ini sebanyak 2 isolat, satu isolat berasal dari isolasi rizosfer bawang daun dan diberi nama Isolat B1 serta isolat yang berasal dari kultur murni yang sudah tersedia di Laboratorium Balitsa dan diberi nama Isolat G1. Banyaknya
pengulangan
untuk
setiap
perlakuan
diperoleh
berdasarkan rumus pengulangan Gomez dan Gomez (1995), dengan rumus T ( r-1 ) ≥ 20, dimana T adalah perlakuan atau treatment dan r adalah banyaknya replikasi (pengulangan).
26
27
T(r -1) ≥ 20 3(r-1) ≥ 20 3r –3 ≥ 20 3r
≥ 23
r ≥ 7.6 r~8
Berdasarkan perhitungan di atas, setelah nilai akhirnya dibulatkan maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan paling sedikit delapan kali. Oleh sebab itu, dalam penelitian ini dilakukan pengulangan sebanyak delapan kali. Pada penelitian ini terdapat dua variabel yaitu variasi isolat bakteri sebagai variabel bebas dan pertumbuhan diameter jamur yang ditumbuhkan pada medium PDA yang telah diinokulasikan dengan suspensi bakteri sebagai variabel terikat.
C. Populasi dan Sampel 1. Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah jamur Fusarium sp. yang ditumbuhkan dalam medium PDA pada cawan Petri. 2. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari isolasi biakan jamur Fusarium sp. yang akan diberi perlakuan dengan variasi isolat bakteri Pseudomonas spp.
28
D. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2007 sampai bulan Juni 2008 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI, Jl. Setiabudhi no. 229 – Bandung.
E. Alat dan Bahan Penelitian Peralatan
yang digunakan
pada penelitiaan
ini
terdapat
di
Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia. Alat-alat yang digunakan selama penelitian ini terdapat pada Tabel 3.1, sedangkan daftar bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdapat pada Tabel 3.2. Tabel 3.1. Daftar alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian Nama Alat
Jumlah
Spesifikasi
1.
Mikroskop binokuler
1 buah
2.
Hot plate and Magnetic stirrer
1 buah
Merk Shimadzu S12 – D180 F Merk EYELA, RSCH - 3
3.
1 buah
UVP Upland, CA.
4.
High Performance UV Transilluminator Autoclave
1 buah
5.
Vorteks
1 buah
Merk Hirayama Mode HC36At Merk SIBATA
6.
Waterbath shaker
1 buah
7.
Timbangan Analitik
1 buah
8.
Spectrophotometer
1 buah
9.
Transfer box
1 buah
Milton Roy Spectronic 20D PT 25.221.03.019BM
10.
Penggaris
1 buah
Milimeter (mm)
11.
Cawan Petri
30 buah
Pyrex;
No.
UNI Thermoshaker NTS1300 Merk AND, HF 300
= 9 cm
29
12.
Lup inokulasi
1 buah
P = 22,5 cm; = 5 mm
13.
Tabung reaksi
50 buah
Pyrex
14.
Rak tabung
3 buah
-
15.
Gelas ukur 10 mL
1 buah
Pyrex
16.
Gelas ukur 50 mL
1 buah
Pyrex
17.
Gelas kimia 500 mL
1 buah
Pyrex
18.
Makropipet 1 ml
30 buah
Merk SIBATA
19.
Lemari pendingin
1 buah
PT25.221.03.021.BM
20.
Batang pengaduk
2 buah
P = 29,5 cm
21.
Spatula
2 buah
Logam
22.
Pelubang gabus
1 buah
23.
Botol sampel
4 buah
= 6 mm Volume 100 ml
Tabel 3.2 Daftar bahan-bahan penelitian No.
Nama Bahan
Jumlah
1.
Alkohol 70 %
1 liter
2.
Akuades
5 liter
3.
Medium King’s B
4.
Kristal violet
3 ml
5.
Lugol
3 ml
6.
Safranin O
3 ml
7.
Gelatin
5 gram
8.
Pati
5 gram
9.
H2O2
1 ml
10.
Nutrien Agar (NA)
11.
Kultur jamur Fusarium sp.
12.
Kultur bakteri Pseudomonas spp.
8 tabung
13.
Medium PDA (Potato Dextrose Agar)
39 gram
10 gram
10 gram 1 cawan Petri
30
14.
Medium PDB (Potato Dextrose Broth)
250 ml
F. Prosedur Penelitian 1. Persiapan Penelitian Persiapan awal penelitian ini meliputi penyediaan kultur murni bakteri Pseudomonas spp. dan kultur murni jamur Fusarium sp. dari Balitsa, Lembang, Bandung. Penyediaan alat-alat yang dibutuhkan penelitian, pembuatan berbagai jenis medium yang dibutuhkan dalam penelitian (medium PDA, PDB, King’s B, NA, kaldu laktosa, kaldu sukrosa, kaldu dekstrosa, medium pati, medium gelatin,medium lipid). Pembuatan larutan zat warna dan reagen (larutan zat warna lugol, safranin O, crystal violet, reagen uji katalase dan reagen uji oksidase). Subkultur jamur Fusarium sp. pada medium PDA dan subkultur beberapa isolat bakteri murni dari Balitsa pada medium NA miring.
2. Isolasi Bakteri Salah satu isolat
yang akan digunakan dalam penelitian ini
berasal dari tanah di sekitar akar (rizosfer) tanaman bawang daun. Pengisolasian mikroba diutamakan untuk memperoleh bakteri Pseudomonas spp. yang berpendar jika ditanam pada medium Kings’B. Isolasi mikroba ini dilakukan dengan teknik pengenceran dan menanam langsung sampel pada medium (Machmud et al., 2003). Untuk isolasi dengan teknik pengenceran diambil sebanyak 1
31
gram tanah di sekitar tanaman bawang daun dimasukkan ke dalam botol yang berisi akuades steril dan divorteks selama satu menit, sehingga membentuk suspensi bakteri. Kemudian diencerkan dari 10-1 sampai 10-6, serta diambil 1 ml suspensi bakteri untuk di tuangkan pada medium Kings’B. Bakteri diinkubasi pada suhu ruang selama 1-2 x 24 jam dan dari koloni yang berpendar ketika disinari di bawah UV dibuat kultur murninya.
3. Penapisan Bakteri Metode yang digunakan untuk menguji kemampuan isolatisolat bakteri dalam menghambat pertumbuhan jamur secara in vitro adalah uji biakan ganda, dimana semua isolat bakteri diuji kemampuan antagonistiknya dalam menghambat pertumbuhan jamur pada medium PDA (Johnson & Curl, 1972). Uji biakan ganda pada penelitian ini meliputi uji penapisan dan uji antagonisme. Untuk uji penapisan, metode uji biakan ganda didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Maria dan Widodo (2004). Potongan medium PDA berdiameter 6 mm yang telah ditumbuhi jamur Fusarium sp. umur 7 hari diletakkan di tengah - tengah cawan Petri dan diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar. Selanjutnya pada empat sisi yang berlawanan dengan koloni jamur digoreskan koloni bakteri dari contoh isolat yang berbeda dengan jarak 2 cm dari tepi
32
koloni jamur. Perkembangan jamur diamati dengan melihat ada tidaknya zona bening selama dua minggu. Daya hambat isolat bakteri yang diuji dikelompokkan berdasarkan pada tidak menunjukkan kemampuan antibiosis yang ditandai dengan simbol negatif (-). Kemampuan antibiosis rendah yang ditandai dengan adanya zona bening diantara koloni bakteri dan jamur Fusarium sampai satu minggu, kemudian koloni jamur Fusarium mampu melewati koloni bakteri yang ditandai dengan simbol positif satu (+) dan kemampuan antibiosis tinggi yang ditandai dengan adanya zona bening di antara koloni bakteri dan Fusarium, koloni jamur Fusarium tidak mampu melewati koloni bakteri sampai dua minggu yang ditandai dengan simbol positif dua (++). Gambar 3.1 menunjukkan uji penapisan yang dilakukan.
Isolat B3 Gambar 3.1 Isolat B3 dengan kriteria ++ pada inkubasi dua minggu
Pada uji selanjutnya, bakteri yang mempunyai kemampuan untuk menghambat jamur dengan kriteria ++ , diuji kembali untuk menghitung persentase daya hambat dan lebar zona beningnya. Potongan medium PDA berdiameter 6 mm yang telah ditumbuhi
33
jamur Fusarium sp. diletakkan pada cawan Petri yang berisi medium PDA dengan jarak 3 cm dari pinggir cawan yang berdiameter 9 cm dan diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar, selanjutnya satu isolat bakteri digoreskan pada sisi yang berlawanan dengan jarak 3 cm dari pinggir cawan, lalu diinkubasikan pada suhu kamar. Sebagai kontrol, ditumbuhkan hanya jamur tanpa bakteri. Setelah salah satu sisi koloni jamur pada kontrol ke arah 3 cm telah mencapai pinggir cawan (± 7 hari), dilakukan pengukuran zona bening antara koloni jamur dan bakteri. Hasil uji lanjut ini dapat dilihat pada gambar 3.2 berikut :
Kontrol
Isolat B2
Gambar 3.2 Uji lanjut Isolat B2 umur 7 hari
Persentase penghambatan tertinggi, baik dari isolat bakteri koleksi Balitsa maupun hasil isolasi sendiri akan digunakan dalam uji antagonisme selanjutnya. Isolat terpilih bakteri hasil isolasi sendiri yang diuji antagonisme selanjutnya akan diidentifikasi.
4. Identifikasi Bakteri
34
Metode yang digunakan untuk mengetahui karakteristik dari bakteri yang akan diuji yaitu metode yang dikemukakan oleh Cappucino dan
Sherman (1983). Uji-uji yang dilakukan adalah
sebagai berikut : a. Pewarnaan Gram Membuat sediaan mikroskopik untuk biakan bakteri yang akan diwarnai. Sediaan bakteri tersebut ditetesi dengan crystal violet, diamkan selama 3 menit. Zat warna yang berlebihan dibuang dengan menggunakan akuades yang mengalir. Sediaan bakteri tersebut diteteskan dengan larutan lugol, diamkan selama 45-60 detik. Kemudian sediaan bakteri dimasukkan ke dalam staining jar yang berisi alkohol 96 %, lalu digoyang-goyangkan selama 1 menit. Sediaan bakteri dibilas dengan menggunakan akuades yang mengalir kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas isap. Setelah itu, sediaan diteteskan larutan Safranin O, diamkan selama 3 menit, lalu dibilas dengan akuades dan dikeringkan, biakan diamati di bawah mikroskop. b. Uji Hidrolisis Pati Menginokulasikan
bakteri
pada
medium
pati,
kemudian
diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam. Setelah terlihat adanya pertumbuhan, larutan Lugol dituangkan dan biarkan beberapa menit, perubahan warna yang terjadi diamati. Uji positif
35
ditandai dengan tampaknya area jernih di sekitar pertumbuhan bakteri yang diinokulasikan.
c. Hidrolisis Lipid Menginokulasikan
bakteri
pada
diinkubasikan pada suhu 22-28
medium
lipid,
kemudian
o
C selama 24 jam, amati
perubahan warna koloni bakteri. Uji positif ditandai dengan warna medium di sekitar koloni bakteri yang berwarna merah. d. Uji Hidrolisis Gelatin Menginokulasikan bakteri pada medium gelatin, kemudian diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam, simpan di inkubator suhu 4 0C selama 30 menit, cair tidaknya medium diamati. Uji positif ditandai dengan cairnya medium gelatin setelah diinokulasikan bakteri. e. Uji Produksi Katalase Bakteri diinokulasikan pada medium NA miring. Kemudian diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 24 jam, di atas permukaan kultur diteteskan 3 tetes H2O2 3%, uji positif ditandai oleh terbentuknya gelembung udara di atas permukaan kultur. f. Uji Produksi Oksidase Bakteri diinokulasikan pada medium NA miring. Kemudian diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 24 jam, setelah itu digenangi dengan reagen uji oksidase, uji positif ditandai dengan
36
berubahnya koloni bakteri menjadi merah muda, lalu merah tua, merah gelap dan akhirnya hitam.
g.
Uji Fermentasi Karbohidrat Bakteri diinokulasikan pada medium : a. Kaldu laktosa 10 ml bersama tabung Durham yang terbalik b. Kaldu
dekstrosa 10 ml bersama tabung Durham yang
terbalik c. Kaldu sukrosa 10 ml bersama tabung Durham yang terbalik Masing-masing medium
yang telah diinokulasi bakteri
diinkubasikan selama 24 jam. Uji positif ditandai dengan berubahnya warna media menjadi kuning serta diikuti oleh terbentuknya gas yang dapat diamati pada tabung Durham.
5. Pembuatan Kurva Tumbuh dan Kurva Baku Bakteri Pseudomonas spp. Isolat B1 dan Isolat G1 Metode yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh adalah metode Turbidimetri (Cappucino dan Sherman, 1983), dengan cara melihat kekeruhan bakteri (Optical Density / OD), dengan menggunakan alat Spectrofotometer. Sebelum melakukan pengukuran terhadap kekeruhan bakteri bakteri, diperlukan pengaktifan kultur terlebih dahulu. Aktivasi dilakukan secara bertahap dengan menggunakan medium PDB.
37
Masing-masing isolat bakteri diinokulasikan sebanyak satu ose ke dalam 10 ml medium PDB dan dikocok pada kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28 0C dengan menggunakan Waterbath shaker. Kultur cair pada masing-masing isolat bakteri yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh adalah kultur hasil aktivasi pada 10 ml medium PDB yang telah dikocok selama 24 jam, kemudian dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok pada kecepatan 120 rpm pada suhu 28 0C. Setiap interval waktu 2 jam diambil sampel kultur sebanyak 5 ml untuk mengetahui harga OD masing-masing isolat bakteri yang terlarut dalam medium biakan, kemudian dimasukkan ke dalam kuvet. Kekeruhan bakteri pada kuvet diukur
dengan
menggunakan
Spectrofotometer
pada
panjang
gelombang 620 nm. Kurva tumbuh dapat dibuat berdasarkan hasil korelasi antara harga OD (sumbu Y) terhadap selang waktu tertentu (sumbu X). Kurva baku dibuat berdasarkan waktu logaritmik bakteri yang dapat diketahui dari kurva tumbuh. Masing-masing isolat bakteri diaktivasi terlebih dahulu dengan cara menginokulasikan satu ose biakan bakteri ke dalam 10 ml medium PDB dan dikocok pada kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28
0
C dengan
menggunakan Waterbath shaker. Setelah 24 jam, sampel kultur 10 ml dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok kembali pada
38
kecepatan 120 rpm selama waktu yang diperlukan bakteri untuk mencapai fase log, kemudian ditentukan batas waktu yang akan ditentukan harga OD-nya. Berdasarkan kurva tumbuh masing-masing isolat bakteri, batas waktu yang ditentukan harga OD-nya adalah sebagai berikut : a. Untuk bakteri isolat B1 , batas waktu yang digunakan untuk menentukan harga OD-nya yaitu pada jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6. b. Untuk bakteri isolat G1 , batas waktu yang digunakan untuk menentukan harga OD-nya yaitu pada jam ke-6, jam ke-8 dan jam ke-10. Pada jam-jam tersebut di atas, diambil sebanyak 5 ml kultur ke dalam kuvet untuk diukur absorbansinya dengan menggunakan alat Spectrofotometer. Pada waktu yang sama, kultur diambil juga sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril untuk pengenceran 10-1, begitu seterusnya sampai pengenceran 10-10, dilakukan secara berurutan. Pada pengenceran 10-8, 10-9 dan 10-10, diambil 1 ml untuk ditumbuhkan pada medium PDA dengan menggunakan metode cawan tuang. Biakan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar, kemudian koloni bakteri yang tumbuh dihitung dengan menggunakan alat Colony counter. Dengan diketahui jumlah bakteri dan harga OD-nya maka dapat dibuat kurva baku.
39
Kurva
baku
merupakan
hasil
regresi
linier
yang
menghubungkan antara kerapatan optik (optical density) suspensi bakteri sebagai sumbu X dengan hasil perhitungan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada medium PDA sebagai sumbu Y.
6. Membuat Suspensi Bakteri Pseudomonas spp. Isolat B1 dan Isolat G1 sebagai Sumber Inokulum Konsentrasi suspensi bakteri sebagai sumber inokulum yang akan digunakan untuk perlakuan adalah 1011cfu/ml. Konsentrasi ini diperoleh dari perhitungan persamaan regresi linear pada kurva baku, dengan memasukan harga OD pada persamaan linear tersebut, maka akan diperoleh konsentrasi yang diperlukan. Masing-masing isolat bakteri diinokulasi berdasarkan kurva tumbuh, yaitu pada fase stasioner. Pengambilan pada fase ini dikarenakan pengeluaran antibiotik sebagai metabolit sekunder bakteri biasanya dieksresikan pada
fase
stasioner.
Suspensi
bakteri
dibuat
dengan
cara
menginokulasikan satu ose koloni bakteri pada 10 ml medium PDB, dan dikocok pada kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28 0C dengan menggunakan Waterbath shaker. Setelah 24 jam, sampel kultur 10 ml dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok kembali pada kecepatan 120 rpm selama waktu yang diperlukan bakteri untuk mencapai fase stasioner,
40
tepatnya pada jam ke – 14. Penentuan waktu ini didasarkan pada kurva baku dari kedua bakteri tersebut.
7. Uji Antagonisme Metode uji biakan ganda pada uji antagonisme didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Yusriadi (2004) yang telah dimodifikasi. Uji antagonisme bakteri Pseudomonas spp. dengan jamur Fusarium sp. dilakukan dengan cara meletakkan biakan murni jamur Fusarium sp. yang berumur 7 hari (Djatnika dan Nuryani, 1993) pada medium PDA dengan menggunakan pelubang gabus berdiameter 6 milimeter dan diletakkan pada tengah-tengah permukaan medium PDA pada cawan petri yang sebelumnya diinokulasi suspensi bakteri, dengan konsentrasi inokulum sebesar 1011 cfu/ ml. Perlakuan ini diinkubasi selama 7 hari. Peubah yang diamati adalah diameter pertumbuhan koloni jamur yang terbentuk dengan menggunakan mistar.
G. Analisis Data 1. Penentuan Kurva Tumbuh dan Kurva Baku Data yang diperoleh pada kurva tumbuh berupa harga OD bakteri yang menunjukkan fase-fase pertumbuhan populasi bakteri. Fase – fase pertumbuhan bakteri tersebut adalah fase lag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian.
41
Hasil kurva tumbuh berupa grafik pertumbuhan hasil korelasi antara harga OD (sumbu Y) pada selang waktu tertentu (sumbu X). Data ini diolah dengan menggunakan software Microsoft Excel sehingga dapat ditentukan fase-fase pertumbuhan bakteri, selain itu dapat diketahui umur biakan pada saat mencapai fase stasioner untuk pembuatan inokulum. Pada penentuan kurva baku, data yang diperoleh berupa korelasi antara harga OD sebagai variabel bebas (sumbu X) terhadap jumlah bakteri yang dilogaritmakan sebagai variabel terikat (sumbu Y). Hubungan kedua variabel ini dapat dimodelkan dalam persamaan matematik, yaitu : y = bx + a. Dengan menggunakan software Microsoft Excel dapat ditentukan persamaan regresinya.
2. Uji Daya Hambat pada Penapisan Bakteri Data yang diperoleh berupa data kualitatif dapat menghambat atau tidaknya dari semua isolat bakteri yang diujikan dan data kuantitatif uji lanjut yang berupa persentase daya hambat yang didasarkan pada rumus Fokkema dan van deur Meulen (1976, dalam Maria dan Widodo, 2004), yaitu : I = R1- R 2 X 100 % R1 Keterangan : I
= persentase hambatan
R1 = jari-jari koloni jamur Fusarium sp. pada kontrol
42
R2 = jari-jari koloni jamur Fusarium sp. yang berhadapan dengan goresan bakteri
3. Analisis Data Uji Antagonisme Data yang diperoleh berupa pertumbuhan diameter jamur Fusarium sp. setelah diberi perlakuan suspensi bakteri yang berbeda setelah diinkubasi selama 7 hari. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis statistika dengan program SPSS 12.0 for windows. Uji
software statistika
pertama yang dilakukan adalah uji
homogenitas varians dengan menggunakan uji Levene’s statistik, kemudian dilanjutkan dengan uji normalitas Kolmogorov-Smirnov. Hasil pengujian menunjukkan bahwa data homogen dan berdistribusi normal maka pengujian hipotesis dilanjutkan dengan menggunakan one way ANOVA. Hasil uji one way ANOVA menjelaskan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antara variasi isolat bakteri dengan diameter pertumbuhan jamur Fusarium sp. Untuk membandingkan perbedaan signifikan antara kelompok data yang satu dengan kelompok data yang lainnya, maka uji lanjut yang digunakan adalah Uji Tukey.
43
H. Alur Penelitian Persiapan penelitian : 1. Penyediaan kultur murni bakteri 2. Penyediaan kultur murni jamur 3. Pembuatan medium yang diperlukan 4. Pembuatan larutan zat warna dan reagen yang diperlukan 5. Subkultur jamur dan bakteri
Isolasi bakteri dari rizosfer bawang daun
Uji penapisan bakteri Pseudomonas spp.
Identifikasi bakteri Pseudomonas spp.
Pembuatan kurva tumbuh dan kurva baku bakteri Pseudomonas spp.
Uji Antagonisme Pseudomonas spp. terhadap Fusarium sp. pada cawan petri
44
..........
Lanjutan bagan Uji Antagonisme Pseudomonas spp. terhadap Fusarium sp. pada cawan petri
Pengamatan
Analisis Data
Penyusunan Laporan
Gambar 3.3 Bagan alur penelitian
