BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang telah dilakukan ini bersifat eksperimen. Menurut Nazir (1999: 74), penelitian eksperimental adalah penelitian yang dilakukan dengan memanipulasi objek penelitian disertai adanya kontrol.
B. Desain Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium dengan kondisi yang relatif homogen, oleh karena itu digunakan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 7 perlakuan dan 5 kali pengulangan. Perlakuan tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Perlakuan penelitian Pengulangan
A B C D E F G Keterangan :
1 A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1
2 A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2
3 A3 B3 C3 D3 E3 F3 G3
4 A4 B4 C4 D4 E4 F4 G4
5 A5 B5 C5 D5 E5 F5 G5
A : Inokulasi Colletotrichum gloesporioides Penz. dengan DMSO 10%, tanpa ekstrak kunyit B : Inokulasi C. gloesporioides Penz. dengan aquades, tanpa ekstrak kunyit C : Inokulasi C. gloesporioides Penz. dengan ekstrak kunyit konsentrasi 2,0%
31
32
D : Inokulasi C. gloesporioides Penz. dengan ekstrak kunyit konsentrasi 2,2% E : Inokulasi C. gloesporioides Penz. dengan ekstrak kunyit konsentrasi 2,4% F : Inokulasi C. gloesporioides Penz. dengan ekstrak kunyit konsentrasi 2,6% G: Inokulasi C. gloesporioides Penz. dengan ekstrak kunyit konsentrasi 2,8% Penentuan banyaknya pengulangan untuk setiap perlakuan diperoleh berdasarkan rumus pengulangan untuk desain penelitian RAL, yaitu dengan dengan rumus T (r-1) > 20, dimana t adalah treatment (perlakuan) dan r adalah banyaknya replikasi (pengulangan) (Gomez, 1995). Berdasarkan rumus tersebut maka dapat diperoleh jumlah pengulangan sebagai berikut: t (r-1) > 20 7 (r-1) > 20 7r – 7 > 20 7r > 27 r > 3,8 jadi, r > 4 Berdasarkan perhitungan di atas, maka banyaknya pengulangan pada penelitian ini paling sedikit dilakukan sebanyak empat kali. Pada penelitian ini variabel bebasnya, yaitu konsentrasi ekstrak kunyit, sedangkan variabel terikatnya, yaitu lesio pertumbuhan fungi C. gloeosporiodes Penz. (cm) dan persentase penghambatan (%) miselia fungi, dan variabel kendalinya adalah usia fungi C. gloeosporiodes Penz. yaitu pada umur delapan hari dalam medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan tempat inkubasi pada suhu kamar, yaitu 22oC-27oC, serta jenis buah cabai merah.
33
C. Populasi dan Sampel Populasi yang dijadikan objek penelitian adalah seluruh buah cabai merah varietas TW dari Taiwan yang ada di pasar Induk Caringin. Sedangkan sampelnya adalah 1 kg buah cabai merah yang dilukai dengan menggunakan jarum dan diberi koloni fungi C. gloeosporiodes Penz.
D. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Hama dan Penyakit, Balai Penelitian Tanaman Sayuran (BALITSA) Lembang dan Laboratorium PGSM Jurusan Pendidikan Biologi Universitas Pendidikan Indonesia pada bulan September 2007 sampai dengan bulan Maret 2008.
E. Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini tersaji pada Tabel 3.2, sedangkan bahan yang digunakan dalam penelitian ini tersaji pada Tabel 3.3. Tabel 3.2 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian No
Nama Alat 1. Autoklaf 2. Inkubator shaker 3. Neraca timbang analitis 4. Mikroskop binokuler 5. Hot plate and Magnetic stirrer 6. Pendingin ruangan 7. Shaker 8. Makro pipet 9. Mikro pipet 10. Cawan Petri 11. Loop inokulasi
Jumlah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah
Spesifikasi PT 25.211.03.001 BM PT 25.211.03.006 BF Merk dan Seri 12848143 PT25.221.03.045 BM PT25.221.03.023 BM (1/2)
1 buah 1 buah 1 buah I buah 10 buah 1 buah
PT25.03.021 BM PT25.221.03.003 BM SIBATA, 1 mL SIBATA, 0.05 mL Pyrex P = 22,5 cm dan jari-jari 5 mm
34
12. Gelas Kimia 500 ml 13. Gelas ukur 10 mL 14. Gelas ukur 50 ml 15. Botol sampel 16. Tabung reaksi 17. Rak tabung 18. Corong 19. Spatula 20. Pinset 21. Plastik Buram/bening 22. Penggaris 23. Gabus
1 buah 1 buah 1 buah 2 buah 20 buah 1 buah 1 buah 2 buah 1 buah 4 buah 1 buah 12 buah
Pyrex Pyrex Pyrex Volume 250 ml Pyrex Kayu Pyrex dengan jari-jari 5 cm Logam Logam Ukuran 25 x 20 x 5 cm Centimeter (cm) Panjang 24 cm dan lebar 3 cm
Tabel 3.3 Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian No Nama Bahan 1. Cabai Merah varietas TW 2. Kunyit 3. Aquades 4. DMSO 10% 5. Etanol 96% 6. Kertas saring 7. Larutan NaCl 0,85% 8. Kapsul chloramphenicol 9. Broth agar 10. Dextrosa 11. Kentang 12. Isolat fungi C. goeosporioides Penz.
Jumlah 1 kg 200 gram 2000 ml 5 ml 1000 ml 50 cm2 Secukupnya 1 buah 10 gram 20 gram 200 gram 5 tabung reaksi
F. Cara Kerja Cara kerja yang dilakukan pada penelitian ini dikelompokkan menjadi tiga tahap. Yaitu tahap persiapan, tahap pelaksanaan, dan tahap analisis data. 1. Tahap Persiapan a. Sterilisasi Alat dan bahan yang akan digunakan terlebih dahulu disiapkan, kemudian dibersihkan. Bahan-bahan yang akan digunakan ditimbang
35
terlebih dahulu sesuai dengan kebutuhan. Setelah itu, alat dan bahan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm (Syulasmi et al., 2005). b. Pembuatan Medium Medium yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium Potato Dextrose Agar (PDA). Adapun cara pembuatan medium ini yaitu dengan merebus 200 gram kentang ditambah dengan aquades sehingga mencapai volume 1000 ml dengan menggunakan magnetic stirrer with hotplate sampai mendidih selama 15 menit. Kemudian dilakukan penyaringan sehingga didapatkan air rebusan kentang. Setelah itu ditambahkan 10 gram agar dan 20 gram dektrosa. Kemudian dipanaskan kembali sampai bahan tercampur rata. Setelah itu lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi 9 ml. Semua medium disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf yang bertekanan pada suhu 121oC selama 15 menit. c. Subkultur Fungi Kultur fungi Colletotrichum goeosporioides Penz yang didapatkan dari koleksi Balai Penelitian Tanaman dan Sayuran (BALITSA) ditumbuhkan pada medium Potato Dextrose Agar (PDA) 9 ml. Kemudian disimpan dalam inkubator selama 8 hari pada suhu 24-28oC. d. Pembuatan Suspensi Fungi Kultur spora yang sudah berusia 8 hari ditambahkan 10 ml larutan garam fisiologis (NaCl 0.85%) kemudian dihomogenkan dengan
36
menggunakan vortex selama 1 menit. Kemudian suspensi spora dipindahkan ke dalam tabung reaksi kosong. Suspensi diambil dan diteteskan pada haemocytometer. Kemudian dihitung jumlah spora pada lima kotak dalam haemocytometer dan dikalikan 50000 (Kommendahl dan Bunes dalam Witrasari, 2008). Bila konsentrasi suspensi telah mencapai konsentrasi 107 maka suspensi diencerkan. Suspensi diencerkan dengan mengambil 1 ml dengan menggunakan mikro pipet ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) untuk mendapatkan konsentrasi suspensi spora 1,2 x 106 /ml (Hidayat et al., 2004: 16). e. Pembuatan Ekstrak Kunyit Kunyit dipotong kecil-kecil, kemudian diangin-anginkan semalam. Setelah itu 200 gram kunyit diblender lalu direndam sampai mencapai 1000 ml dengan etanol 96%. Kemudian dimaserasi dengan menggunakan shaker pada kecepatan 150 rpm selama 4 hari pada temperatur ruang, campuran tersebut kemudian disaring, lalu dimasukan ke mesin evaporator pada suhu 70oC sampai mendapatkan ekstrak kunyit yang terlihat seperti pasta. Setelah itu diambil 0,03 gram pasta kunyit yang dilarutkan dalam DMSO 10% sebanyak 1 ml lalu ditambahkan dengan aquades sampai mencapai 10 ml (Nanasomat & Lohasupthawee, 2005).
37
f. Pencucian Buah Cabai Merah Buah cabai merah yang akan digunakan dicuci bersih dibawah air mengalir. Kemudian direndam ke dalam larutan bayclin 10% (mengandung NaClO 0,525%) selama 10 menit. Setelah itu dicuci dengan menggunakan aquades lalu dikeringkan (Kim et al., 1999: 2). g. Identifikasi Isolat Fungi Identifikasi isolat fungi dilakukan melalui dua tahap. Tahap pertama yaitu, pengamatan fungi secara makroskopis yang meliputi pengamatan terhadap warna dan bentuk koloni. Tahap kedua yaitu, pengamatan secara mikroskopis yang dilakukan dengan membuat slide kutur yang meliputi pengamatan terhadap bentuk hifa, bentuk, dan ukuran konidia. Tahap pembuatan slide kultur dapat dilihat pada Gambar 3.1
Gambar 3.1
Tahap pembuatan slide kultur : (A) Potongan agar yang diambil dari medium PDA. (B) Cawan Petri berisi batang penahan dan gelas objek. (C) Inokulasi fungi pada agar yang disimpan di atas gelas objek. (D) Agar yang telah diinokulasi ditutup dengan kaca penutup. (Sumber : www.botany.utoronto.ca)
38
Disiapkan sebuah cawan Petri steril yang di dalamnya diberi kertas saring steril yang dipotong bundar dan telah dilembabkan dengan menggunakan akuades steril untuk menjaga kelembaban kultur dalam cawan Petri. Pada cawan Petri tersebut disimpan batang penahan berbentuk segitiga, dan di atas batang penahan tersebut diletakkan sebuah objek gelas steril beserta penutupnya seperti terlihat pada Gambar 3.1. Blok agar steril kira-kira berikiran satu sentimeter kuadrat dipotong dari medium PDA dalam cawan Petri steril lain (Gambar 3.1 A) dan diletakkan di atas gela objek dengan menggunakan pisau atau alat pemotong steril. Kemudian, fungi diinkubasi pada keempat blok agar (Gambar 3.1 C) dan ditutup oleh gelas penutup steril (Gambar 3.1 D). Setelah beberapa hari diinkubasi dalam suhu kamar, sllide dapat diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran rendah sampai tinggi, lalu diidentifikasi.
2. Tahap Pelaksanaan a. Uji Penelitian Pendahuluan Buah cabai yang telah dicuci bersih kemudian dilukai dengan menggunakan jarum. Pada daerah yang sudah dilukai tersebut, kemudian diberi ekstrak kunyit dengan berbagai konsentrasi yaitu 0,3%; 1,0%; 1,7%; 2,4%; dan 3,1% masing-masing sebanyak satu tetes ekstrak kunyit. Setelah agak kering kemudian diberi suspensi fungi C. goeosporioides Penz. sebanyak satu tetes (konsentrasi spora sebanyak
39
1,2 x 106 /ml) pada perlukaan yang sama. Lalu dimasukkan ke dalam plastik box yang berukuran 25 x 20 x 5 cm yang di alasi kertas tissue basah. Pengamatan dilakukan pada suhu kamar dengan menghitung besar lasio pertumbuhan jamur C. goeosporioides Penz. setiap 24 jam selama 9 hari (Hidayat et al., 2004: 162). Parameter yang diukur adalah lesio pertumbuhan koloni fungi. Uji pendahuluan dilakukan untuk memperoleh konsentrasi optimal dari ekstrak etanol kunyit yang dapat menghambat fungi lebih dari 50%. Konsentrasi ini kemudian digunakan dalam uji pokok. b. Uji Penelitian Pokok Uji ini dilakukan seperti pada langkah-langkah uji penelitian pendahuluan dengan menggunakan konsentrasi hasil dari penelitian pendahuluan yang dapat menghambat pertumbuhan fungi C. goeosporioides Penz. lebih dari 50%, dari konsentrasi tersebut dibuat konsentrasi dengan jarak yang lebih sempit, yaitu 2,0%; 2,2%; 2,4%; 2,6%; dan 2,8%. Parameter yang diukur sama dengan uji pendahuluan.
G. Tahap Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian mengenai pengaruh ekstrak kunyit terhadap pertumbuhan fungi C. goeosporioides Penz. pada buah cabai merah yaitu berupa rata-rata diameter lesio [(panjang + lebar lesio)/2] (Hidayat et al., 2004) dari tiap-tiap konsentrasi perlakuan. Besarnya persentase hambatan
40
menggunakan rumus Poisoned Food Techniques (PFT) (Ogbebor et al., 2006) yaitu : (a –b) / a X 100% Ket : a = lesio koloni fungi pada kontrol b = lesio koloni fungi pada perlakuan Untuk mengetahui apakah ekstrak kunyit berpengaruh secara signifikan terhadap penghambatan pertumbuhan fungi C. goeosporioides Penz., maka sebelumnya dilakukan uji perbandingan rata-rata dari diameter lesio uji pendahuluan. Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi 11.0 dengan langkah-langkah seperti terlihat pada Gambar 3.2. Pada penelitian ini data tidak homogen tetapi normal, maka uji statistik dilanjutkan ke uji non-parametrik. Uji Ujihomogenitas homogenitas Data tidak homogen Uji normalitas Data normal Uji non-parametrik
1 variabel
Kruscall Wallis Gambar 3.2 Diagram alur analisis data
41
H. Alur Penelitian Pembuatan medium PDA 200 gram kentang + 1000 ml akuades + 10 gram agar + 20 gram dektrosa
Sterilisasi alat dan bahan Dalam autoklaf bertekanan 1,5 atm suhu 121 oC selama 15 menit
Pemeliharaan dan perbanyakan fungi Isolat fungi dalam medium PDA
Penentuan konsentrasi ekstrak kunyit untuk uji penelitian pokok Konsentrasi ekstrak kunyit : 0%; 0,3%; 1,0%; 1,7%, 2,1%; dan 3,1%
Uji penelitian pokok Konsentrasi ekstrak kunyit: 0%; 2,0%; 2,2%; 2,4%, 2,6%; dan 2,8%
Pengolahan data
Pembuatan laporan Gambar 3.3 Diagram alur penelitian
