Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif Transgenik Padi Gen CryIA Generasi T0, T1, T2, dan T3

Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif Transgenik Padi Gen CryIA Generasi T0, T1, T2, dan T3 Tri J. Santoso, Aniversari Apriana, A. Dinar Ambarwati, Iswari S. Dewi, dan Ida H. Somantri Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian

ABSTRAK Analisis molekuler pada tanaman transgenik merupakan analisis yang dilakukan pada tingkat gen maupun ekspresinya. Usaha tersebut salah satunya bertujuan untuk mengkonfirmasi integrasi gen yang diintroduksi. Identifikasi dari jaringan tanaman yang tertransformasi dapat dilakukan dengan sejumlah teknik di antaranya adalah penggunaan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Pada penelitian tahun 2002 dilakukan analisis PCR lanjutan untuk mengidentifikasi keberadaan gen cryIAb pada tanaman putatif transgenik cv. Taipei-309. Analisis dilakukan pada 44 tanaman putatif transgenik generasi T0 (PCR VI dan VIII) dan 21 tanaman generasi T1, T2, dan T3 (PCR VII). Hasil analisis menunjukkan bahwa pada PCR VI tidak ada tanaman yang mengandung gen cryIAb semen-tara pada PCR VII diperoleh 3 tanaman yang mengandung gen cryIAb. Pada amplifikasi PCR VII diperoleh 10 tanaman (2 generasi T1, 7 generasi T2, dan 1 generasi T3) cv. Taipei-309 yang positif mengandung gen cryIAb. Kesepuluh tanaman tersebut pada bioasai menunjukkan reaksi agak tahan sampai sangat tahan terhadap hama penggerek batang. Kata kunci: Padi (Oryza sativa), gen cryIA, Polymerase Chain Reaction (PCR)

ABSTRACT Molecular analysis of transgenic plants is to identify the transgene and its expression. The experiment reported here is intended to confirm the integrity of cryIAb gene. The identification of the transgene can be carried out through a number of molecular techniques. One of the techniques is Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis. In 2002, the continuation of PCR analysis was conducted in the putative transgenic rice cv. Taipei-309. The PCR analysis VI and VIII were conducted for 44 plants (T0) generation while the PCR analysis VII was conducted for 21 plants (T1, T2, and T3 generation). The result showed that PCR VI did not identify and plants carrying cryIAb gene while PCR VIII found 3 plants containing the transgene. On the other hand, PCR VII identify 10 plants that contained the transgene and showed moderate to extremely high levels of resistance to stem borer. Key words: Rice (Oryza sativa), cryIAb gene, Polymerase Chain Reaction (PCR)

PENDAHULUAN Kehilangan hasil padi yang nyata tiap tahun disebabkan oleh faktor biotik dan abiotik. Salah satu kendala biotik utama dalam budi daya padi dan pengembangan varietas unggul selain hama wereng coklat (Hanarida dan Soewito, 1993) adalah hama penggerek batang. Perakitan varietas unggul yang tahan merupakan pilihan yang murah dan aman untuk pengendalian hama tersebut. Teknik pemuliaan konvensional masih menghadapi kendala untuk usaha tersebut karena belum ada varietas padi dengan tingkat ketahanan yang cukup untuk dikembangkan atau disilangkan. Pendekatan bioteknologi atau rekayasa genetik seperti teknik

152

Santoso et al.: Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif

transfor-masi dapat dikembangkan untuk membantu program pemuliaan konvensional. Rekayasa genetik akan memberikan perbaikan dari karakter-karakter penting seperti sifat ketahanan tanaman terhadap serangga (Bennet, 1993). Teknologi transformasi juga akan memberikan wahana bagi pemulia tanaman untuk memperoleh gen atau kelompok gen baru yang lebih luas. Suatu gen yang tidak terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang, dan tanaman lain (Herman, 1996). Bacillus thuringiensis (Bt) diketahui menghasilkan suatu kristal protein yang bersifat toksin terhadap hama. Bt toksin yang dikode oleh gen cryIA(b) telah ter-bukti efektif terhadap hama dari golongan lepidoptera, sehingga dapat digunakan untuk mengendalikan hama penggerek batang. Peneliti Maqbool et al. (1998) menggunakan gen cry2A untuk merakit tanaman padi transgenik tahan hama penggerek batang kuning dan hama penggulung daun padi. Introduksi gen cryIAb dalam genom padi merupakan alternatif untuk membentuk varietas padi tahan hama penggerek batang. Teknik transformasi di dalam usaha memperoleh tanaman padi transgenik telah dilakukan dengan menggunakan beberapa metode yang ada, seperti melalui vektor Agrobacterium tumefaciens (Hiei et al., 1994; Abedinia et al., 1997; Khanna dan Raina, 1999) atau dengan penembakan partikel (Sudhakar et al., 1998; Maqbool et al., 1998; Hanarida et al., 1998). Untuk menghasilkan tanaman transgenik melibatkan beberapa tahap dalam teknik biologi molekuler atau seluler, salah satunya adalah tahap karakterisasi atau identifikasi gen yang telah diintroduksi ke dalam jaringan tanaman (Bennet, 1993). Keberhasilan teknik transformasi ditandai dengan keberhasilan menyisipkan rang-kaian gen yang diintroduksi ke dalam genom tanaman, dapat diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Oleh karena itu, diperlukan usaha untuk mengkonfirmasi integrasi gen yang diintroduksi dan menentukan jumlah kopinya di dalam genom tanaman, serta menentukan apakah gen tersebut dapat berfungsi dengan benar atau salah. Analisis molekuler pada tanaman transgenik merupakan analisis yang dilakukan pada tingkat gen maupun ekspresinya. Identifikasi gen dari jaringan tanaman yang tertransformasi dapat dilakukan dengan sejumlah teknik di antaranya adalah penggunaan teknik Polymerase Chain Reaction/PCR (Chee et al., 1991). Teknik PCR merupakan teknik deteksi transgen yang memungkinkan analisis sam-pel dalam jumlah yang relatif banyak tetapi memerlukan waktu yang singkat. Kelemahan dari teknik ini adalah tidak dapat digunakan untuk mengetahui jumlah kopi dari transgen yang diintroduksikan dan juga tidak dapat membedakan integra-si ekstra-kromosomal dan kromosomal pada generasi T0. Pada penelitian ini dilakukan analisis PCR lanjutan (PCR VII) untuk mengkonfirmasi keberadaan gen cryIAb pada tanaman padi putatif transgenik generasi lanjutan.

Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman

153

BAHAN DAN METODE Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (Balitbiogen) dan dilaksanakan pada Januari-November 2002. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman padi generasi T0 (44 tanaman), T1 (4 tanaman), T2 (13 tanaman) dan T3 (4 tanaman) putatif transgenik cv. Taipei-309 hasil transformasi menggunakan penembakan partikel dengan plasmid pUBB yang mengandung gen cryIAb. DNA total genomik diekstraksi dari tanaman padi kontrol dan transgenik mengikuti prosedur dari Dellaporta et al. (1983) yang dimodifikasi. Pengujian PCR dilakukan dengan total volume reaksi 25 µl mengandung 100 ng DNA genomik sebagai cetakan, 10 µM masing-masing dNTPs, 1unit enzim Taq DNA Polimerase dalam larutan bufer dan 0,2 µM masing-masing dari 2 primer spesifik untuk gen cryIA(b). Sintesis urutan basa dari primer-primer tersebut adalah 5’-CGA CAT CTC CTT GTC CTT GAC AC-3’ dan 5’-ACA CCC TGA CCT AGT TGA GCA AC-3’. Reaksi amplifikasi dilakukan berdasarkan metode Wang et al. (1993) yang dimodifikasi dengan menggunakan mesin PCR MJ Research PCT100. Program PCR terdiri dari inkubasi awal pada suhu 94oC selama 5 menit dilanjutkan dengan 35 siklus pada 94oC selama 1 menit, 45oC selama 1 menit dan 72oC selama 2 menit. Siklus terakhir untuk pemanjangan akhir pada 72oC selama 5 menit. Sebanyak 10 µl produk PCR digunakan untuk elektrophoresis pada 1% gel agarose. Pada penelitian ini dilakukan tiga kali PCR (PCR VI, VII, dan VIII) sesuai ke-tersediaan sampel saat dilakukan analisis PCR tersebut. PCR VI dilakukan pada 12 tanaman putatif transgenik padi cv. Taipei-309 generasi T0. PCR VII dilakukan pada 4 tanaman T1, 13 tanaman T2, dan 4 tanaman T3 putatif transgenik padi cv. Taipei-309. PCR VIII dilakukan pada 32 tanaman putatif transgenik padi cv. Taipei-309 generasi T0. Hasil-hasil analisis PCR tersebut kemudian dibandingkan dengan data bioasai yang dilakukan oleh Dewi et al. (2002). HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis PCR merupakan metode deteksi secara cepat untuk mengetahui keberadaan transgen di dalam jaringan tanaman transgenik putatif. Dalam metode ini, dua primer nukleotida spesifik digunakan untuk mengamplifikasi daerah spesifik dari gen cryIAb. Fragmen DNA yang dihasilkan dari amplifikasi gen tersebut akan mempunyai ukuran 1000 pasangan basa (1 Kb). Hasil analisis PCR pada penelitian tahun-tahun sebelumnya disajikan pada Tabel 1 (Ambarwati et al., 2001). Analisis PCR VI dilakukan pada 12 sampel tanaman padi generasi T0. Hasil analisis menunjukkan bahwa dari 12 sampel tersebut tidak ada yang mengandung gen cryIAb. Dengan hasil ini, tanaman-tanaman tersebut tidak digunakan untuk pengujian berikutnya.

154


Tabel 1. Pengujian keberadaan gen cryIAb pada putatif transgenik padi cv. T-309 Analisis

Jumlah sampel

Generasi

Tahun

PCR I PCR II PCR III PCR IV PCR V

24 14 19 9 29

T1 T1 T1 T0 T0

2000 2000 2001 2001 2001

Hasil

Southern Blot

6(+) 10(+) Tidak ada yang (+) DNA rusak Tidak ada yang (+) 11 (+)

Telah dilakukan Belum dilakukan Tidak dilakukan Tidak dilakukan Belum dilakukan

Untuk mengetahui kestabilan keberadaan gen cryIAb dari generasi ke generasi maka pada kegiatan analisis PCR VII dilakukan pengujian tanaman generasi ke T1, T2, dan T3. Berbeda dengan penelitian sebelumnya, kegiatan pengujian PCR pada tahun ini diarahkan pada tanaman yang telah menunjukkan kategori tahan atau sangat tahan terhadap hama penggerek batang pada tahap pengujian bioasai yang dilakukan oleh Dewi et al. (2002). Hal ini dimaksudkan untuk menyeleksi tanaman yang mempunyai kategori tahan atau sangat tahan terhadap hama penggerek batang pada bioasai juga menunjukkan hasil positif pada analisis PCR. Dengan demikian, sifat ketahanan dari tanaman yang diperoleh pada kegiatan bioasai diharapkan merupakan hasil ekspresi gen cryIAb yang telah terintroduksi. Dari 90 tanaman yang dibioasai pada tahun 2002 diperoleh 21 tanaman yang menunjukkan kategori tahan dan sangat tahan. Dua puluh satu tanaman tersebut kemudian dianalisis PCR (PCR VII) untuk melihat keberadaan transgen. Hasil anali-sis PCR ditampilkan pada Gambar 1. Dari gambar tersebut terlihat bahwa 10 sam-pel, yaitu No. 5, 11, 13, 23, 28, 51, 53, 58, 60, dan 81 positif mengandung gen cryIAb. Hasil uji PCR dan bioasai disajikan pada Tabel 2. Dari tabel tersebut terlihat bahwa 10 tanaman yang menunjukkan kategori tahan atau sangat tahan pada bioasai, juga menunjukkan hasil PCR yang positif. Tanaman tersebut adalah 5H-51, 5H-7, B5-2, B5-2B, B5-4, B5-5, B24-2, B24-3B, B24-6, dan A2-1B. Dengan demikian, dapat diduga bahwa sifat ketahanan pada tanaman padi transgenik putatif tersebut berasal dari ekspresi gen cryIAb yang berhasil terintegrasi ke dalam genom tanam-an tersebut. Sedangkan tanaman padi lain yang juga termasuk kategori tahan atau sangat tahan tetapi tidak positif pada analisis PCR mungkin disebabkan ada faktor lain yang perlu penelitian lebih lanjut. Pada analisis PCR VIII yang dilakukan pada 32 tanaman transgenik putatif generasi T0 diperoleh 3 tanaman mengandung gen cryIAb (Gambar 2). Tanaman yang mengandung gen cryIAb tersebut adalah tanaman dengan nomor 88, 89, dan 95. Dengan demikian, tanaman tersebut akan dilanjutkan untuk pengujian berikut-nya.


155

M

2

5

6 11 13 15 17 23 28 49 51 53 54 58 59 60

+

M 68 69 78 81 84 - A

+

1000 bp

M = 1 Kb ladder, + = kontrol positif, - = kontrol negatif, A = air Gambar 1. Hasil analisis PCR VII pada tanaman putatif transgenik padi cv. T-309

Tabel 2. Hasil analisis PCR VII dan bioasai tanaman putatif transgenik padi cv. T-309 Asal tanaman

Generasi

T-5B T-5H

T1

B5

T2

B24

A1 A2

5B-2 5H-5-1 5H-5-1B 5H-7 B5-2 B5-2B B5-4 B5-5 B24-2 B24-3 B24-3B B24-4 B24-4 B24-4B B24-5 B24-6 B24-7 A1-3B A2-1B A2-5 A3-7

Nomor DNA 2 78 28 11 51 5 13 58 59 53 23 15 69 84 68 60 49 54 81 6 17

Ketahanan pada fase Sundep

Beluk

T T T AT ST ST T ST ST ST ST ST ST ST ST ST AP T AT AT AT

ST ST ST ST AT AT T ST ST ST ST ST ST ST ST AT ST ST ST AP T

Hasil PCR + + + + + + + + + + -

M 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 + M 103 104 105 106 109 110 111 113 115 116 117 118 119 120 A +

A3

T3

Nomor tanaman

2,0 kb 1,5 kb 0,6 kb M = 100 bp ladder, + = kontrol positif, - = kontrol negatif, A = air Gambar 2. Hasil analisis PCR VIII tanaman putatif transgenik padi cv. T-309

156


KESIMPULAN Pada penelitian tahun 2002 telah dilakukan identifikasi gen cryIAb menggunakan amplifikasi PCR sebanyak 12 tanaman padi hasil transformasi cv. T-309 generasi T0 dan 21 tanaman generasi T1, T2, dan T3 (tanaman terpilih dari hasil bioasai). Hasil analisis PCR VI (12 tanaman T0) tidak menunjukkan tanaman yang positif mengandung gen cryIAb. Pada analisis PCR VII diperoleh 10 tanaman yang positif mengandung gen cryIAb dari 21 tanaman T1, T2, dan T3. Kesepuluh tanaman tersebut pada kegiatan bioasai mempunyai kategori agak tahan sampai sangat tahan. Hasil analisis PCR VIII pada 32 tanaman transgenik putatif T0 menunjukkan 3 tanaman mengandung gen cryIAb.

DAFTAR PUSTAKA Ambarwati, A.D., I. Hanarida, T.J. Santoso, I.S. Dewi, dan A. Apriana. 2001. Perakitan tanaman pangan transgenik tahan hama dan penyakit tumbuhan. Laporan Hasil Penelitian TA 2001. Abedinia, M., R.J. Henry, A.B. Blakeney, and L. Lewin. 1997. An efficient transformation system for the Australian rice cultivar, Jarrah. Australian Journal Plant Physiology 24:133-141. Bennet, J. 1993. Genes for crop improvements. Genetic Engineering 16:93-113. Chee, P.P., R.F. Drong, and J.L. Slightom. 1991. Using polymerase chain reaction to identify transgenic plants. Plant Mol. Biol. Manual C3:1-28. Dellaporta, S.T., J. Wood, and J.B. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: Versi II. Plant Mol. Biol. Rep. 14:19-21. Dewi I.S., T.J. Santoso, I. Hanarida, D. Damayanti, dan A. Apriana. 2002. Bioasai lanjutan tanaman putatif transgenik padi cryIA generasi T1, T2, dan T3. Laporan Hasil Penelitian, ROPP No. 3. TA 2002. Hanarida, I. dan T. Soewito. 1993. Peningkatan ketahanan varietas padi terhadap wereng coklat (Nilaparvata ligens Stal.). Buletin Penelitian 6:1-24. Hanarida, I., A.D. Ambarwati, T.J. Santoso, I.S. Dewi, A. Apriana, dan D. Damayanti. 1998. Evaluasi tanaman padi transgenik tahan hama penggerek batang. Laporan Hasil Penelitian TA 1999/2000. 81 hlm. Herman, M. 1996. Rekayasa genetika untuk perbaikan tanaman. Buletin Agrobio 1(1):24-34. Hiei, Y., S. Ohta, T. Komari, and T. Kumashiro. 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6(2):271-282. Khanna, H.K. and S.K. Raina. 1999. Agrobacterium-mediated transformation of indica rice cultivars using binary and superbinary vectors. Australia Journal Plant Physiology 26:311-324.


157

Maqbool, S.B., T. Husnain, S. Riazuddin, L. Masson, and P. Christou. 1998. Effective control of yellow stem borer and rice leaf folder in transgenic rice indica varieties Basmati 370 and M7 using the novel δ-endotoxin cry2A Bacillus thuringiensis gene. Molecular Breeding 00:1-7. Sudhakar, D.G., L.T. Duc, B.B. Bong, P. Tinjuangjun, S.B. Maqbool, M. Valdez, R. Jefferson, and P. Christou. 1998. An efficient rice transformation system utilizing mature seed-derived explants and a portable, inexpensive particle bombardment device. Transgenic Research 7:1-6.

158


Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif Transgenik Padi Gen CryIA Generasi T0, T1, T2, dan T3

Recommend Documents