AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANALISIS KOMPOSISI SENYAWA FENOLIK DARI POHON BIDARA LAUT (Strychnos ligustrina)
ARIF SADONO
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 1
ABSTRAK ARIF SADONO. Aktivitas Antioksidan dan Analisis Komposisi Senyawa Fenolik dari Pohon Bidara Laut (Strychnos ligustrina). Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan BAMBANG WIYONO. Pohon bidara laut (Strychnos ligustrina) memiliki kemampuan antioksidan. Tujuan penelitian ini menentukan aktivitas antioksidan pada ekstrak pohon bidara laut,
komposisi total fenol, dan analisis senyawa bioaktif dengan kromatografi gasspektrometer massa (GCMS). Aktivitas antioksidan ditentukan menggunakan metode 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bagian pohon yang memiliki aktivitas antioksidan paling besar ialah ekstrak metanol kayu dengan nilai IC50 148.41 mg L-1. Nilai IC50 setelah dipartisi menggunakan n-heksana ialah 103.14 mg L-1 dengan butil hidroksil toluena sebagai kontrol positif memiliki nilai IC50 sebesar 10.86 mg L-1. Kandungan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau diperoleh sebesar 1936.844 mg kg-1 sampel kering. Hasil analisis senyawa dengan GCMS menunjukkan terdapat senyawa fenolik dengan komponen utama 1,2,3-benzenatriol sebanyak 2.66% (RT 10.77).
ABSTRACT ARIF SADONO. Antioxidant Activities and Phenolic Compound Analysis of Bidara Laut (Strychnos ligustrina). Supervised by DUDI TOHIR and BAMBANG WIYONO. The bidara laut (Strychnos ligustrina) exhibits antioxidant activity. The objective of this study is to determine the highest antioxidant activity, total phenol, and bioactive compound analyzed using gas chromatography-mass spectrometer (GCMS) of the extract of bidara laut tree. Antioxidant activities was determined by radical scavenging assay using 1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl radical. The result showed that the highest of antioxidant activities is the wood methanol extract with IC50 value of 148.14 mg L-1. After partition using n-hexane the IC50 value was 103.14 mg L-1 and of butyl hydroxyl toluene which was used as control positive showed IC50 value of 10.86 mg L-1. The total phenol was determined using Folin-Ciocalteau method and resulted 1936.844 mg kg-1 dry sample. The result of compound analysis using GCMS showed that bidara laut contain phenolics with the major content is 1,2,3-benzenetriol, which is 2.66% (RT 10.77).
1
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANALISIS KOMPOSISI SENYAWA FENOLIK DARI POHON BIDARA LAUT (Strychnos ligustrina)
ARIF SADONO
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 1
Judul : Aktivitas Antioksidan dan Analisis Komposisi Senyawa Fenolik dari Pohon Bidara Laut (Strychnos ligustrina) Nama : Arif Sadono NIM : G44060841
Menyetujui Pembimbing I,
Pembimbing II,
Drs. Dudi Tohir, MS NIP 19571104 198903 1 001
Dr. Ir. Bambang Wiyono, M.For.Sc NIP 19590326198703 104
Mengetahui Ketua Departemen,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 195012271976032002
Tanggal lulus:
1
PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Aktivitas Antioksidan dan Analisis Senyawa Fenolik pada Pohon Bidara Laut (Strychnos ligustrina)” yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2010 di Laboratorium Kimia Organik Departemen Kimia, FMIPA IPB dan Laboratorium Hasil Hutan Bukan Kayu, Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan, Gunung Batu, Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drs. Dudi Tohir, MS dan Dr. Ir. Bambang Wiyono, M.For.Sc selaku pembimbing yang telah memberikan pengarahan dan bimbingannya kepada penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada keluarga dan ibu tercinta atas didikan, doa, dan kasih sayangnya yang tiada terkira, serta untuk seluruh keluarga besar di rumah, terima kasih atas dukungan dan dorongannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Sabur, Mba Nia, Ibu Yenni Karmila, Ibu Nunung, Bapak Arya, dan Ibu Siti Robiah atas bantuan yang diberikan. Tak lupa, ungkapan terima kasih penulis kepada seluruh rekan-rekan peneliti di Laboratorium Kimia Organik (Wulan, Ela, Ina, Saki, Farid, Tifah, Dinda, Risal, Ridho, Luthfan Irfana), serta teman-teman Kimia 43 atas bantuan, motivasi, diskusi, dan kebersamaan selama penulis menempuh studi dan menjalankan penelitian. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Februari 2011
Arif Sadono
1
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Madiun pada tanggal 15 November 1987 dari Alm. Bapak Budi Supangat dan Ibu Tundjiati. Penulis merupakan anak keenam dari enam bersaudara. Penulis menyelesaikan studi di SMAN 86 Jakarta pada tahun 2006. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Tahun 2007 penulis diterima pada Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis pernah menjadi pengajar Kimia di bimbingan belajar REC pada tahun 2009/2010, dan pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Dasar pada tahun 2008/2009, Kimia Organik Layanan pada tahun 2008, Kimia Organik D3 Analisis Kimia pada tahun 2010, Praktikum Kimia Organik Berbasis Kompetensi pada tahun 2010, Kimia Bahan Alam pada tahun 2010, dan Kimia Dasar Alih Tahun pada tahun 2010. Penulis juga berkesempatan melaksanakan kegiatan praktik lapangan di PT Nalco Indonesia, Bogor, Jawa Barat.
1
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .............................................................................................. viii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... viii PENDAHULUAN ................................................................................................ 1 TINJAUAN PUSTAKA Bidara Laut ................................................................................................ Antioksidan ............................................................................................... Metode DPPH ........................................................................................... Senyawa Fenolik ....................................................................................... Analisis GCMS .........................................................................................
1 1 2 2 2
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .......................................................................................... Persiapan Sampel ...................................................................................... Kadar Air ................................................................................................... Ekstraksi .................................................................................................... Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH .................................... Kandungan Total Fenol ............................................................................. Analisis Senyawa ...................................................................................... Uji Fitokimia .............................................................................................
2 3 3 3 3 3 3 3
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air ................................................................................................... Ekstraksi .................................................................................................... Aktivitas Antioksidan ............................................................................... Kandungan Total Fenol ............................................................................. Analisis Senyawa ...................................................................................... Fitokimia ...................................................................................................
4 4 4 5 6 6
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ................................................................................................... 6 Saran .......................................................................................................... 6 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 6 LAMPIRAN .......................................................................................................... 8
1
DAFTAR TABEL Halaman 1 Aktivitas antioksidan dan rendemen ekstrak ................................................................ 4
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Pohon bidara laut ........................................................................................................ 1 2 Sruktur DPPH: radikal bebas (a) bentuk tereduksi (b) ................................................ 2 3 Hubungan antara aktivitas antioksidan terhadap kandungan total fenol ...................... 5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Diagram alir penelitian ................................................................................................ 9 2 Kadar air pohon bidara laut......................................................................................... 10 3 Rendemen hasil ekstraksi ............................................................................................ 10 4 Hasil uji aktivitas antioksidan .................................................................................... 11 5 Kandungan total fenol ................................................................................................ 13 6 Kromatogram GCMS ekstrak metanol kayu hasil partisi .......................................... 14 7 Uji fitokimia ............................................................................................................... 15
viii
PENDAHULUAN
TINJAUAN PUSTAKA
Radikal bebas diketahui memiliki reaktivitas yang tinggi sehingga dapat memicu reaksi berantai dalam sel tubuh. Hal ini dapat merusak sel dan akan menyebabkan munculnya berbagai penyakit dalam tubuh, seperti inflamasi, kanker, katarak, dan penuaan dini. Selain itu, juga dapat menyebabkan penyakit kardiovaskular dan aterosklerosis (Hertog et al. 1995). Aktivitas radikal tersebut dapat dihambat oleh antioksidan. Oleh karena itu, penelitian mengenai antioksidan dalam dekade ini banyak dilakukan. Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif, dan mampu menghambat terjadinya penyakit degeneratif, serta mampu menghambat peroksidase lipid makanan. Antioksidan alami umumnya mempunyai gugus fenolik dalam struktur molekulnya. Antioksidan dapat diperoleh dari asupan makanan yang banyak mengandung vitamin C, vitamin E, β-karoten, dan senyawa fenolik (Sunarni 2005). Banyak pohon di Indonesia yang belum dieksplorasi secara luas, salah satunya ialah pohon bidara laut (Strychnos ligustrina). Pohon tumbuh di Kabupaten Bima, Nusa Tenggara Barat pada ketinggian 10 sampai 100 meter di atas permukaan laut, dan biasanya di daerah berbatu. Kayu bidara laut banyak digunakan oleh masyarakat sebagai obat kencing manis, penyakit darah tinggi, dan malaria. Fraksi etil asetat kayu bidara laut pada dosis 2.30 mg kg-1 bb telah dilaporkan memiliki aktivitas antimalaria (Lubis 2008). Kayu bidara laut memiliki aktivitas antiradang dan menurunkan kadar gula darah. Ekstrak metanol daun bidara laut dapat berfungsi sebagai antidot dan stomatis (Subehan et al. 2006). Fitokimia kayu bidara laut terdiri atas alkaloid, tanin, brusin, striknin, dan steroid/triterpenoid (Kartika 2009). Secara alami, tanin dan flavonoid dapat berfungsi sebagai antioksidan (Ciddi & Kaleab 2005). Karena kayu bidara laut mengandung tanin serta memiliki aktivitas antiinflamasi dan antiradang, kayu bidara laut diperkirakan dapat digunakan sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan menentukan bagian pohon bidara laut yang mempunyai aktivitas antioksidan. Kandungan total fenol dan analisis senyawa bioaktif dilakukan dengan kromatografi gas-spektrometer massa (GCMS).
Bidara Laut Bidara laut (Gambar 1) merupakan tumbuhan yang berasal dari Kabupaten Bima, Nusa Tenggara Barat. Tumbuh pada ketinggian 10 sampai 100 meter di atas permukaan laut dan umumnya hidup di daerah bebatuan. Secara taksonomi pohon bidara laut diklasifikasikan kerajaan Plantae, divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, bangsa Gentianales, suku Loganiaceae, marga Strychnos, dan jenis Strychnos ligustrina. Pohon bidara laut sering digunakan oleh masyarakat setempat sebagai obat kencing manis, penyakit darah tinggi, dan malaria (Edinur et al. 1979).
Gambar 1 Pohon bidara laut. Ekstrak metanol daun dan kayu bidara laut telah ditunjukkan berpotensi sebagai antidot, stomatis, antelmentik, dan dapat menghambat enzim sitokrom P450 yang dapat mengganggu metabolisme oksidatif pada hati manusia (Subehan et al. 2006). Ekstrak air kayu bidara laut dengan dosis efektif 50% (ED50) 0.45 mg kg-1 bb berpotensi sebagai antimalaria (Huda 2006). Fraksi etil asetat kayu bidara laut pada dosis 2.30 mg kg-1 bb memiliki aktivitas antimalaria (Lubis 2008). Senyawa yang terkandung pada kayu bidara laut di antaranya alkaloid, tanin, brusin, striknin, dan steroid/triterpenoid (Kartika 2009). Menurut Dzulkarnain (1996), pohon bidara laut dapat digunakan sebagai bahan kosmetik alami. Selain itu, kulit batang pohon bidara laut berpotensi sebagai antijamur dan antibakteri serta dapat menyembuhkan penyakit bisul. Antioksidan Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat memberikan satu atau lebih atom hidrogen pada radikal bebas sehingga aktivitas
1
radikal bebas tersebut dapat diredam. Antioksidan memiliki peranan yang cukup penting bagi kesehatan khususnya dalam mempertahankan tubuh dari kerusakan sel akibat adanya spesies radikal bebas. Berdasarkan sumbernya, terdapat antioksidan alami dan sintetik. Antioksidan alami mampu melindungi tubuh dari kerusakan yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif. Antioksidan alami umumnya memiliki gugus fenolik dalam struktur molekulnya (Sunarni 2005). Antioksidan sintetik seperti butil hidroksi toluena (BHT), butil hidroksi anisol (BHA) dan t-butil hidroksi kuinon (TBHQ) dapat memberikan dampak negatif bagi kesehatan. Selain itu, antioksidan sintetik mempunyai kelarutan yang rendah dibandingkan dengan antioksidan alami (Barlow 1990). Aktivitas antioksidan dari suatu bahan alam dapat diuji dengan berbagai metode di antaranya xantin oksidase, tiosianat, kemampuan mereduksi ion feri (FRAP), kapasitas mereduksi kupri (CUPRAC), dan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Metode DPPH banyak digunakan dalam penentuan aktivitas antioksidan ekstrak tanaman karena sederhana, cepat, dan tidak membutuhkan banyak reagen. Metode DPPH Salah satu metode uji aktivitas antioksidan senyawa alam adalah metode DPPH (Gambar 2a). Delokalisasi elektron pada molekul DPPH akan memberikan warna ungu yang dicirikan dengan pita serapan pada panjang gelombang 520 nm. Ketika DPPH ditambahkan ke dalam senyawa yang dapat memberikan atom hidrogen, DPPH akan berubah warna menjadi kuning, yakni warna bentuk tereduksinya, difenilpikrilhidrazin (Gambar 2b) (Molyneux 2004).
(a)
(b)
Gambar 2 Struktur DPPH: radikal bebas (a) bentuk tereduksi (b).
Senyawa Fenolik Senyawa fenolik meliputi aneka ragam senyawa dari tumbuhan yang mempunyai cincin aromatik dengan satu atau dua gugus hidroksil. Senyawa fenolik mudah larut dalam air, umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat dalam vakuola sel. Beberapa ribu senyawa fenolik telah diketahui strukturnya. Flavonoid merupakan golongan terbesar, tetapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoid, dan kuinon fenolik juga terdapat dalam jumlah besar. Beberapa golongan bahan polimer penting dalam tumbuhan seperti lignin, melanin, dan tanin adalah senyawa polifenol dan terkadang unit fenolik terdapat pada protein, alkaloid, dan di antara terpenoid. Semua senyawa fenol aromatik, maka menunjukkan serapan kuat di daerah spektrum tampak. Selain itu, secara khas senyawa fenolik menunjukkan geseran batokromik pada spektrumnya bila ditambahkan basa (Harborne 1996). Analisis GCMS Analisis dengan GCMS merupakan gabungan dari instrumen kromatografi gas (GC) dan spektrometer massa (MS) yang umumnya digunakan untuk mengidentifikasi senyawa atsiri dan semi-atsiri serta memisahkannya berdasarkan bobot per fragmennya. Sampel yang hendak dianalisis diidentifikasi dahulu dengan alat GC, kemudian dengan alat MS (Lynam & Smith 2009).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah akar, daun, kayu, dan kulit pohon bidara laut dari daerah Bima, Nusa Tenggara Barat, DPPH, metanol p.a, BHT, akuabides, asam galat, reagen Folin-Ciocalteau, Na2CO3, n-heksana, dan etanol. Selain itu, digunakan pula pereaksi Meyer, Dragendorf, Wagner, dan LiebermanBuchard. Alat-alat yang digunakan adalah alat distilasi, peralatan kaca yang lazim di laboratorium, radas ekstraksi, wadah pengembang, penguap putar, botol uji (vial), neraca analitik, spektrofotometer UV Beckman DU-700, dan instrumen GCMS (Agilent Technologies).
12
Persiapan sampel Sampel kayu, daun, akar, dan kulit batang bidara laut, dikeringudarakan hingga kering. Setelah itu, sampel diserbukkan dengan ukuran 40 mesh. Kadar Air Sampel sebanyak 3 g ditimbang ke dalam cawan yang telah diketahui bobot keringnya, kemudian dipanaskan pada suhu 105 oC selama 3 jam. Setelah didinginkan dalam eksikator, cawan yang berisi sampel ditimbang. Pemanasan dan penimbangan dilakukan berulang kali sampai diperoleh bobot tetap (stabil). Ekstraksi Serbuk akar, daun, kayu, dan kulit kayu bidara laut masing-masing 100 gram diekstraksi berturut-turut menggunakan pelarut metanol, metanol:air (1:1), dan air pada suhu 80 oC selama 8 jam. Ekstraksi dilakukan dua kali, kemudian ekstrak dipekatkan pada tekanan rendah dengan penguap putar. Setiap ekstraknya diuji fitokimia dan aktivitas antioksidan. Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan paling tinggi dipartisi dengan n-heksana hingga lapisan n-heksana tidak berwarna dari warna semula. Ekstrak hasil partisi dipekatkan dengan penguap putar untuk selanjutnya dianalisis menggunakan instrumen GCMS. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Satu mL larutan ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 3 mL larutan DPPH 0.004% (b/v) dalam metanol. Campuran dikocok kuat dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit lalu, diukur absorbansnya menggunakan spektrofotometer UV-tampak pada λ 515.5 nm. BHT digunakan sebagai kontrol positif. Nilai konsentrasi penghambat 50% (IC50) dihitung menggunakan persamaan regresi linear hubungan antara konsentrasi dan % inhibisi. Kandungan Total Fenol Kandungan total fenol ditentukan dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteau. Ekstrak metanol kayu bidara laut yang mengandung 1–5 mg bahan kering ekstrak
dilarutkan dalam 2 mL etanol dalam sederet tabung reaksi. Ke dalam setiap tabung reaksi ditambahkan 5 mL akuabides dan 0.5 mL reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Setelah 5 menit, ditambahkan 1 mL larutan Na2CO3 5% (b/v) lalu campuran dihomogenisasi dan diinkubasi pada ruang gelap selama 1 jam. Campuran dihomogenisasi kembali dan absorbansnya diukur pada panjang gelombang 954 nm. Kurva standar fenol dibuat dengan menggunakan standar asam galat (5–50 mg L1 ). Analisis Senyawa Senyawa bioaktif ekstrak metanol kayu hasil partisi dianalisis dengan GCMS menggunakan metode ionisasi Electron Impact pada GC yang digabung dengan MS 6890N; kolom kapiler HP-5MS (600.25 mm; suhu kolom 70 oC (44.67 menit) hingga 290 oC pada laju 15 oC/menit; gas pembawa helium pada tekanan tetap 18.39 psi. Uji Fitokimia Alkaloid Sebanyak 1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 mL CHCl3 dan beberapa tetes NH4OH kemudian disaring. Filtratnya (ekstrak CHCl3) dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup dan dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2 M sampai terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (tak berwarna) diteteskan pada lempeng tetes lalu ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan berturutturut endapan putih, coklat, dan merah jingga. Saponin Sebanyak 1 g ekstrak dididihkan dengan 25 mL etanol selama 25 menit, disaring dalam keadaan panas, kemudian pelarut diuapkan sampai kering. Residu dikocok kuat dengan CHCl3, ditambahkan air suling lalu dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan. Sebanyak 1 mL lapisan air dikocok selama 1 menit. Terbentuknya busa yang tidak hilang dalam 5 menit menandakan adanya saponin. Fenol Sebanyak 2 mL lapisan air pada uji saponin ditempatkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan FeCl3. Timbulnya warna ungu, biru, dan hijau menunjukkan positif fenolik. Steroid dan Triterpenoid Lapisan kloroform pada uji saponin diteteskan pada lempeng tetes dan dibiarkan
31
kering. Ditambahkan 3 tetes anhidrat asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat (pereaksi Liebermann Buchard). Terbentuknya warna merah atau ungu menunjukkan kandungan senyawa triterpernoid, sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid. Flavonoid Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol, lalu dikocok kuat. Warna merah/kuning/jingga pada lapisan alkohol menunjukkan kandungan flavonoid. Tanin Sebanyak 0.1 g ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10 mL air panas dan dikocok sampai dingin. Setelah itu, ditambahkan 4 tetes NaCl 10%, disaring, dan filtratnya dibagi dua. Filtrat pertama diberi 5 tetes gelatin 1%, endapan putih menunjukkan kandungan tanin. Filtrat kedua diberi 5 tetes FeCl3 1%, warna hijaukebiruan menunjukkan kandungan tanin. Diagram alir penelitian ini dapat ditunjukkan pada Lampiran 1.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Penentuan kadar air berfungsi untuk mengetahui cara penyimpanan terbaik untuk sampel simplisia dan dapat memperkirakan jumlah sampel yang dibutuhkan. Sampel simplisia dikeringudarakan dengan bantuan cahaya matahari. Pengeringan bertujuan agar simplisia dapat disimpan relatif lebih lama. Kadar air kayu, kulit kayu, daun, dan akar bidara laut berturut-turut ialah 9.12, 11.39, 10.90, dan 10.50% (Lampiran 2). Nilai kadar air menunjukkan bahwa hanya bagian kayu yang tahan terhadap pertumbuhan mikrob dan dapat disimpan dalam jangka relatif lama. Menurut Winarno (1997), suatu bahan berada dalam keadaan yang stabil dan pertumbuhan mikrob dapat dikurangi jika kadar air bahan kurang dari 10%.
Ekstraksi Metode ekstraksi yang digunakan adalah ekstraksi dengan bantuan pemanasan (refluks) dengan suhu 80 oC. Metode ini digunakan karena rendemen yang dihasilkan cukup besar dan tidak membutuhkan banyak pelarut. Selain itu, sampel yang digunakan memiliki sifat tahan panas sebagaimana dapat dilihat dari morfologi simplisia yang rigid baik akar, daun, kayu, maupun kulit kayu. Hasil rendemen ekstrak dapat dilihat Tabel 1 dan Lampiran 3. Rendemen ekstrak terbesar terdapat pada ekstrak metanol akar, yaitu 6.84%, sedangkan rendemen ekstrak terkecil adalah ekstrak air akar (1.30%). Tabel 1 Aktivitas antioksidan dan rendemen ekstrak Rendemen Bagian Pelarut IC50 pohon ekstrak (mg L-1) (%) Akar MeOH 239.61 6.48 MeOH:Air 267.65 2.66 Air 1134.98 1.30 Daun MeOH 2175.68 5.76 MeOH:Air 1774.96 3.84 Air 648.46 1.75 Kayu MeOH 148.41 2.62 MeOH:Air 443.87 2.71 Air 690.96 2.10 Kulit MeOH 489.46 3.67 Kayu MeOH:Air 433.25 3.51 Air 352.19 1.74 BHT 10.86 Ekstraksi menggunakan pelarut dengan perbedaan kepolaran, yaitu metanol, metanol:air, dan air. Perbedaan pelarut ini bertujuan mengetahui aktivitas antioksidan dari tiap bagian simplisia. Tabel 1 menunjukkan bahwa rendemen ekstrak tidak memengaruhi aktivitas antioksidan. Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan paling besar selanjutnya dipartisi dengan n-heksana. Hal ini bertujuan meningkatkan aktivitas antioksidan dan menghilangkan lemak, steroid/triterpenoid, serta senyawa nonpolar lainnya yang ikut terekstraksi. Aktivitas Antioksidan Metode yang digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan adalah metode serapan radikal DPPH. Metode ini sederhana, mudah, dan menggunakan sampel dalam jumlah sedikit dengan waktu yang singkat (Hanani et al. 2005). Pengukuran aktivitas antioksidan sampel dilakukan dengan spektrofotometer
14
Kandungan Total Fenol Penentuan kandungan total fenol pada ekstrak metanol kayu bidara laut 800
IC50 (mg L-1)
700 600
menggunakan metode Folin-Ciocalteau dan asam galat sebagai larutan standar. Kurva kalibrasi larutan standar dibuat dengan deret konsentrasi 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg L-1. Dari deret konsentrasi larutan standar diperoleh persamaan regresi y = 0.0241 + 0.0107x dengan R2 = 0.99946. Nilai R2 yang mendekati 1 membuktikan bahwa persamaan regresi tersebut adalah linear. Konsentrasi larutan sampel diperoleh dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan cara mengukur absorbans sampel, lalu kandungan total fenol ditentukan dengan menggunakan persamaan regresi linear. Kandungan total fenol dalam ekstrak metanol, metanol:air, dan air kayu bidara laut berturut-turut ialah 1936.844, 1874.051, dan 829.437 mg kg-1 sampel kering (Lampiran 5). Hubungan aktivitas antioksidan terhadap kandungan total fenol ditunjukkan pada Gambar 3. Aktivitas antioksidan meningkat seiring dengan meningkatnya kandungan total fenol pada kayu bidara laut. Menurut Holasova et al. (2002) dalam Kazutaka et al. (2009), kandungan total fenol meningkat seiring dengan meningkatnya aktivitas antioksidan. Senyawa fenolik mampu menangkap radikal bebas dengan cara memberikan atom hidrogen pada radikal bebas sehingga menghasilkan radikal bebas yang stabil. Senyawa fenolik memiliki sifat biologis yang berhubungan erat dengan aktivitas antioksidan (Pool-Zobel et al. 1999 dan Smith et al. 2000). Faktor-faktor yang memengaruhi ekstraksi senyawa fenolik, yaitu metode ekstraksi yang digunakan, pelarut ekstrak, banyaknya sampel, waktu ekstraksi, dan kondisi penyimpanan sampel (Cao & Prior 1990).
2500
Nilai IC50 Kandungan fenol total
2000
500
1500
400 1000
300 200
500
100 0
0 metanol
metanol:air
Kadar fenol total (mg kg--1)
UV-tampak pada panjang gelombang 515.5 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum DPPH dengan konsentrasi 0.004% (b/v). Adanya aktivitas antioksidan dari sampel mengakibatkan perubahan warna larutan DPPH yang semula berwarna violet menjadi kuning pucat (Permana et al. 2003). Besarnya aktivitas antioksidan ditandai dengan nilai IC50, yaitu konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH. Bagian pohon bidara laut yang berpotensi sebagai antioksidan ialah bagian kayu (Lampiran 4). Ekstrak metanol kayu bidara laut memiliki nilai IC50 148 mg L-1. Menurut Blouis (1958), suatu bahan dapat berpotensi sebagai antioksidan yang kuat jika memiliki nilai IC50 kurang dari 200 mg L-1. Dibandingkan dengan ekstrak lainnya, ekstrak metanol kayu memiliki aktivitas antioksidan yang paling besar. Bagian pohon yang memiliki aktivitas antioksidan terendah adalah daun dengan nilai IC50 pada ekstrak metanol, metanol:air, dan air berturut-turut 2175.68, 1774.96, dan 648.46 mg L-1. Nilai IC50 ekstrak metanol setelah dipartisi dengan n-heksana lebih kecil dibandingkan dengan ekstrak metanol kasar kayu, yaitu 103.14 mg L-1. Meskipun terdapat peningkatan aktivitas antioksidan, nilainya masih lebih kecil daripada BHT sebagai kontrol positif yang memiliki nilai IC50 10.86 mg L-1. Semakin kecil nilai IC50-nya menunjukkan semakin besar aktivitas antioksidannya (Molyneux 2004).
air
Pelarut Gambar 3 Hubungan antara aktivitas antioksidan terhadap kandungan total fenol.
1 5
Analisis Senyawa
Saran
Hasil analisis komponen senyawa dengan GCMS terhadap ekstrak metanol kayu bidara laut hasil partisi memberikan kromatogram dengan 31 senyawa (Lampiran 6). Empat komponen utama adalah striknin sebanyak 3.10 % (RT 40.52), 1,2,3-benzenatriol sebanyak 2.66% (RT 10.77), loganin aglikon sebanyak 2.44% (RT 31.96), dan asam-3hidroksi-4-metoksibenzoat sebanyak 1.67% (RT 12.41). Komponen senyawa minor lainnya dapat dilihat pada Lampiran 6. Senyawa-senyawa tersebut diperoleh berdasarkan database GCMS dengan menggunakan Wiley7n.1 dengan nilai quality atau kedekatan dengan database di atas 90%. Dari adanya senyawa fenolik pada ekstrak metanol kayu bidara laut hasil partisi, diduga ekstrak tersebut berpotensi kuat sebagai antioksidan.
Perlu dilakukan fraksionasi dan pencirian ekstrak metanol kayu hasil partisi untuk menentukan golongan senyawa yang aktif sebagai antioksidan serta identifikasi struktur senyawa aktif menggunakan HPLC, spektrum IR, dan spektrum resonans magnet inti 1H dan 13 .
Fitokimia Hasil uji fitokimia pada pohon bidara laut dapat dilihat pada Lampiran 7. Diketahui bahwa pada bagian daun, kayu, kulit kayu, dan akar terdapat golongan flavonoid, fenol, dan tanin, baik pada ekstrak metanol, maupun ekstrak metanol:air, dan air. Adanya senyawa golongan flavonoid, fenol, dan tanin pada tiap ekstrak pohon bidara laut menunjukkan bahwa pohon bidara laut berpotensi sebagai antioksidan. Menurut Taran et al. (2010), sebagian besar antioksidan alami berasal dari tanaman, antara lain berupa senyawaan tokoferol, karetenoid, asam askorbat, fenol, dan flavonoid. Tanin dan flavonoid dapat berfungsi sebagai antioksidan (Ciddi & Kaleab 2005).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Bagian pohon bidara laut yang memiliki aktivitas antikosidan paling besar adalah bagian kayu. Hal ini ditunjukkan pada ekstrak metanol kayu dengan nilai IC50 148.41 mg L-1 dan nilai IC50 ekstrak metanol kayu hasil partisi 103.14 mg L-1. Kadar total fenol pada ekstrak ini adalah 1936.844 mg kg-1 sampel kering. Hasil analisis senyawa dengan GCMS menunjukkan terdapat senyawa fenolik dengan komponen utama 1,2,3-benzenatriol sebanyak 2.66% (RT 10.77).
DAFTAR PUSTAKA Barlow SM. 1990. Toxicological aspect of antioxidants used as food additives. London: Elsevier. Blouis MS. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181:1199-1200. Cao G, Prior R. 1990. Measurements of oxygen radical absorbance capacity in biological samples. Methods in Enzymol 299:50-63. Ciddi V, Kaleab A. 2005. Antioxidants of plant origin. J Nat. Prod 21:3-17. Dzulkarnain. 1996. Penelitian Tanaman Obat di Beberapa perguruan Tinggi Indonesia. Pusat Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI. Edinur, Kosasih P, Hoyaranda E. 1979. Efek perasan Averrhoa carambola Linn., infus kayu Strychnos ligustrina Bl. 10%, infus daun Persea americana Mill.10%, infus daun Barleria dichotoma Roxb.10%, infus daun Symphytum ssp. 10% terhadap tekanan darah tikus. [skripsi]. Fakultas Farmasi, Institut Teknologi Bandung. Hanani et al. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callysongia sp dari Kepulauan Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian 2:127-133. Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia. Ed ke2. Padmawinata K, Soediro I. Penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Hertog et al. 1995. Flavonoid intake and longterm risk of coronary heart disease and
16
cancer in the seven countries study. Arch Int Med 155:381-386. Huda. 2006. Aktivitas antimalaria ekstrak air kayu bidara laut (Strychnos ligustrina BI) terhadap Plasmodium berghei in vivo [tesis]. Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga. Kartika.2009. Strychnii lignum. http:// farrmasi. usd. ac. id/ projects/simplisia/ indeks.php/ detail_simplisia/25. (14 Jul 2010). Kazutaka I, Tachibana S, Arthur R. 2009. In vitro antioxidative activities and polyphenol content of Eugenia polyantha weight grown in Indonesia. Pakistan J Biol Sci 12:1564-1570. Lubis. 2008. Aktivitas antimalaria fraksi etil asetat kayu bidara laut (Strychnos ligustrina BI) pada Plasmodium berghei in vivo [tesis]. Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga. Lynam K, Smith D. 2009. GC/MS analysis of European Union (EU) priority polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using an agilent J&W DBEUPAH GC Column with a column performance comparison. USA: Agilent Technologies I.
Permana et al. 2003. Antioxidantive constituents of Hedotis diffusa Wild. Nat Prod Sci 9:7-9. Pool-Zobel B, Bub A, Schroeder N, Rechkemmer G. 1999. Anthocyanins are potent antioxidants in model systems but do not reduce endogenous oxidative DNA damage in human colon cells. Eur J Nutr 38:227-234. Smith M et al. 2000. Bioactive properties of wild blueberry fruits. J Food Sci 65:352-356. Subehan et al. 2006. Mechanism-based inhibition of CYP3A4 & CYP2D6 by indonesian medicinal plants. J Ethnopharmacol 105:449-455. Sunarni T. 2005. Aktivitas antioksidan penangkap radikal bebas beberapa kecambah dari biji tanaman familia Papilionaceae. J Farm Indones 2:5361. Taran M, Rezazadeh S, Khanahmadi M. 2010. In vitro antimicrobial and antioxidant properties of Smyrnium cordifolium boiss. (Umbelliferae) extract. Asian J Plant Sc 9:99-103. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
Molyneux P. 2004. The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimazing antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 26:211219.
17
LAMPIRAN
viii
Lampiran 1 Diagram alir penelitian a. b. c. d.
Kayu bidara laut Kulit kayu bidara laut Daun bidara laut Akar bidara laut
Serbuk, 40 mesh Penentuan kadar air Ekstraksi dengan metanol, metanol:air (1:1), dan air
Ekstrak metanol (a,b,c,d)
Ekstrak metanol-air (1:1) (a,b,c,d)
Ekstrak air (a,b,c,d)
Aktivitas antioksidan Uji fitokimia
Ekstrak paling aktif Penentuan kandungan fenol total Partisi dengan n-heksana Aktivitas antioksidan Ekstrak aktif hasil partisi
Analisis GCMS
19
Lampiran 2 Kadar air pohon bidara laut Bagian pohon Kadar air (%) Akar 10.50 Daun 10.90 Kayu 9.12 Kulit kayu 11.39 Contoh perhitungan untuk bagian kayu: Bobot (g) Ulangan Pinggan Contoh kering + kosong Contoh pinggan 1 20.7841 3.0001 23.5111 2 24.5735 3.0000 27.2981 3 20.4780 2.9999 23.2055 100% Kadar air = = 3.0001 2.7270 100% 3.0001 = 9.10 % Keterangan : W1 = Bobot sampel W2 = Bobot sampel kering
Contoh kering 2.7270 2.7246 2.7275
Kadar air (%) 9.10 9.18 9.08
Kadar air rerata (%)
9.12
Lampiran 3 Rendemen hasil ekstraksi Bobot serbuk kayu bidara laut (W sampel) Bobot ekstrak (W ekstrak) Kadar air Rendemen (%) =
= 100.00 g = 2.38 g = 9.12 %
100% 1
2.38 100% 100 1 0.0912
= 2.62%
110
Lampiran 4 Hasil uji aktivitas antioksidan a. Aktivitas antioksidan pohon bidara laut Bagian pohon Akar
Daun
Kayu
Kulit kayu
IC50 (mg L-1) 239.61 267.65 1134.98 2175.68 1774.96 648.46 148.41 443.87 690.96 489.46 433.46 352.19
Pelarut ekstrak MeOH MeOH:Air Air MeOH MeOH:Air Air MeOH MeOH:Air Air MeOH MeOH:Air Air
b. Ekstrak metanol hasil partisi kayu bidara laut Konsentrasi (mg L-1) Inhibisi (%) 25 20.22 50 32.83 100 52.73 150 67.37 200 83.22 250 95.47 y = 0.331x + 15.86 50 = 0.331x + 15.86 x = 103.14 IC50 = 103.14 mg L-1 % Inhibisi
150 y = 0.331x + 15.86 R² = 0.989
100 50 0 0
50
100
150
200
250
300
Konsentrasi mg L-1
111
Lanjutan Lampiran 4 c. BHT Konsentrasi (mg L-1) 2 4 6 8 10 12
Inhibisi (%) 15.97 21.76 30.41 37.67 45.33 56.32
% Inhibisi
y = 3.996x + 6.604 50 = 3.996x + 6.604 x = 10.86 IC50 = 10.86 mg L-1 60 50 40 30 20 10 0
y = 3.996x + 6.604 R² = 0.992
0
2
4
6
8
10
12
14
Konsentrasi mg L-1
112
Lampiran 5 Kandungan total fenol a. Kurva standar asam galat Absorbans
0,6
y = 0,0107x + 0,0241 R² = 0,99946
0,4 0,2 0 0
10
Konsentrasi (mg L-1) 20 25 30 35 40 45 50
20 30 40 -1 Konsentrasi (mg L )
50
60
Absorbans 0.238 0.294 0.343 0.402 0.451 0.511 0.558
b. Penentuan kandungan total fenol sampel kering Ekstrak
Ulangan Absorbans
MeOH
1 2 1 2 1 2
MeOH:Air (1:1) Air
0.461 0.458 0.430 0.433 0.273 0.275
Kadar fenol (mg kg-1) 1943.508 1930.180 1867.160 1880.942 888.615 892.437
Rerata (mg kg-1) 1936.844 1874.051 892.437
Kadar fenol: !ekstrak yang dianalisis. / analisis bobot ekstrak yang diperoleh bobot sampel kering Dari deret standar diperoleh persamaan garis, y = 0.0241 + 0.0107x Jadi, konsentrasi fenolik pada ekstrak metanol 0.461 = 0.0241 + 0.0107x x = 40.83, konsentrasi fenol = 40.83 ppm Kandungan fenol =
5.565789:/9< 9< 875 9:
9: = 194.3508 mg (dalam 100 g sampel kering) = 1943.508 mg kg-1 sampel kering
113
Lampiran 6 Kromatogram GCMS ekstrak metanol kayu hasil partisi Abundance
TIC: SONGGA.D
2800000 2600000 2400000 2200000 2000000 13.87 1800000 1600000 1400000
15.07
1200000 14.66 12.91 14.51
1000000
15.38 11.86
800000 600000 400000
4 .87 13.1 8 2 14.99 13.60 16.43 1 5 .6 6 1 3 .2 6 1 5 .3 2 1 2 .3 9 6 1 . 5 6 1 3 .5 2 1 4.81 1 2 .6 7 11 .9 7 1 2 .4 4 4 15.22 1 0 .5 6 1 2 1 1 0 .7 7 1 2 .. 2 1 11.50
22.52
40.53 31.96
200000
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
Time-->
RT 0.56 10,77 11.50 11.86 11.97 12.21 12.41 12.45 12.68 12.91 12.96 13.25 13.53 13.56 13.60
% Area 1.07 2.66 0.81 2.02 2.70 1.48 1.63 1.96 2.17 3.17 1.69 1.40 0.91 0.87 1.87
Senyawa 2,6-dimetoksifenol 1,2,3-benzenatriol Eugenol 2-en-1-aminasikloheksana D-alosa 2-metoksi-4-propilfenol Asam-3-hidroksimetoksibenzoat Benzaldehida 3-metil-1-benzo(b)tiopena Asam heksanoat Asam palmitat 1,3,5,7-siklooktatetraena 4,5-dimetoksi-2-(propenil)fenol Asam benzenasetat Asam isotiosianat
RT 13.82 13.87 14.50 14.66 14.81 14.87 14.99 15.07 15.22 15.32 15.38 15.66 16.43 22.52 31.96 40.53
% Area 1.77 6.34 2.42 5.54 0.87 2.87 1.83 3.75 1.34 0.86 2.29 1.26 0.30 1.98 2.44 3,10
Senyawa Asam-4-hidroksi-3-metoksibenzenasetat Karbofuran-3-hidroksi-7-fenol (sikloheks-2-en-1-il)amina Piridina 3-florofenilmetilkarbinol Asam-4-floro-3-metoksibenzoat 3,7-dimetil-6-nona-1-ol 1,2,3-trimetil-2-metoksipropanatrikarboksilat Asam heksadekanoat 3,6,6-trimetil-2-norpinanol (3R)-3-okso-2,2,4-trimetilsikloheksana 4-etoksi-2,5-dimetilbenzaldehida N-formil-4,5-dimetil-2-nitrofenilamina Androst-5,16-diena-3-ol Loganin aglikon Striknin
114
Lampiran 7 Uji fitokimia Pohon bidara laut Senyawa kimia
Daun metanol:air + + + + -
Kayu metanol:air + + + + -
metanol air metanol Alkaloid + + Fenol + + + Flavonoid + + + Saponin Steroid + + Tanin + + + Triterpenoid + + Keterangan: (+) menunjukkan adanya warna, (-) menunjukkan tidak ada warna.
Kulit kayu air metanol metanol:air + + + + + + + + + - - + + + + - + -
air + + + + -
metanol + + + + + +
Akar metanol:air + + + + -
air + + + + -
15 viii
