A Liparis loeselii aktív védelmét célzó aszimbiotikus és szimbiotikus nevelése és szimbionta gombapartnereinek molekuláris azonosítása

A Liparis loeselii aktív védelmét célzó aszimbiotikus és szimbiotikus nevelése és szimbionta gombapartnereinek molekuláris azonosítása

Szakdolgozat

Készítette: Illyés Zoltán biológus hallgató Témavezető: Dr. Bratek Zoltán

Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar, Növényélettani Tanszék Budapest 2003.

1

2

Bevezetés Napjainkban az évmilliók alatt kialakult élőlénytársulások az emberi tevékenység következtében tűnnek el és a mesterséges környezet egyre fokozódó térhódítása egyre kisebb életteret biztosít a speciális igényekkel rendelkező, szűk tűrésű növényfajoknak. A jelenkori kipusztulási hullám csak a földtörténeti természeti katasztrófák okozta kihalási hullámokhoz hasonlítható. A védett növényfajok egyedszámának csökkenése populációik genetikai leromlását is eredményezi. Ezen negatív folyamatok lelassításában vagy akár megállításában a konzervációs törekvések mellett egyre nagyobb hangsúlyt kap az aktív természetvédelem, ezen belül is az aktív fajvédelem. Az orchideák kiemelt csoportja a természetvédelemnek. Hazánk közel hatvan orchideafajának mindegyike védelem alatt áll és tizenhárom faj fokozott védelemben részesül. Speciális élőhelyigényüket sajátos, teljes mértékben gombákhoz kötött fejlődésük eredményezi. A hagymaburok (Liparis loeselii (L.) Rich) egyik legveszélyeztetettebb, fokozottan védett lápi orchideánk. Hideg mikroklímájú láprétekhez és úszólápokhoz kötődik. Életfeltételeit háborítatlan meszes, tőzeges és állandó vízellátottságú láprétek biztosítják. Hazánktól északra (pl. Csehország) többezres állományokat alkot, a szubmediterrán övben viszont már csak szórványosan és kis egyedszámban fordul elő hidegebb élőhelyekre szorulva. Hazánkban élőhelyeinek felszámolása sodorta ezt a törékeny orchideát a kipusztulás szélére. Első hazai lelőhelyéről, Budapesten a Városligetből már az 1900-as évek elején kipusztult. A múlt század közepén a Hanságból és Fertőd (Eszterháza) környékéről került elő, majd ezen állományai is eltűntek. Kisebb megszakításokkal, de 1938 óta jelenléte folyamatosan kimutatható volt a kis-tómalmi lápréten (Sopron). Jelenleg négy hazai elfordulása ismert, melyek közül két helyen kis egyedszámban fordul elő: Kis-Tómalom (Sopron), Vajai-tó (Vaja), további két helyen pedig százas nagyságrendű állományt alkot: Soroksári-Duna, 3

Velencei-tó (Dinnyés). A velencei-tavi madárrezervátum úszólápjain első ízben Balogh Márton talált rá 1969-ben, később még a tó mintegy tizenöt további úszólápján regisztrálta elfordulását. Az 1980-as évek közepétől 2000-ig L. loeselii egyedek észlelése nem történt. A tó 1990-es évek elején bekövetkezett részleges kiszáradása, és ennek következményeként bekövetkező úszólápi tőzegmineralizálódás szinte teljesen kizárja annak lehetőségét, hogy a L. loeselii populáció túlélhette ezt a krízist. A Duna-Ipoly Nemzeti Park nemzetközi projektet indított a L. loeselii visszatelepítési lehetőségeinek vizsgálatára. E projekt célja a faj ökológiai igényeinek részletesebb megismerése, a potenciális élőhelyek rehabilitációs lehetőségeinek felmérése és a mesterségesen nevelt növényekre épülő visszatelepítés tudományos megalapozása. 2000-ben a növényt újra felfedeztük a velencei-tavi madárrezervátum úszólápjain, 2001-ben pedig több száz töves populációjára bukkantunk (Balogh et al. 2002). Munkámban a hagymaburok aszimbiotikus és szimbiotikus in vitro szaporításával kapcsolatos kísérleteimről számolok be. Célul tűztem ki egy hatékony ex situ szaporítási eljárás kidolgozását, mellyel a jövőben természetes populációit leszünk képesek megerősíteni. Az orchideák aszimbiotikus szaporítási eljárásainak Liparis loeselii-re való specifikálásán kívül szimbionta gombapartnerének izolálását és ennek molekuláris taxonómiai módszerekkel való azonosítását végeztem el, ezzel előkészítve a szimbiotikus nevelési kísérleteket. A növénygomba kultúra létrehozásakor szerzett tapasztalatok pedig újabb hasznos ismereteket szolgáltatnak az orchidea-mikorrhiza kutatás ma is aktuális kérdéseihez.

4

Irodalmi áttekintés

Az Orchidea-típusú mikorrhiza Az Orchidaceae család közismerten rendkívül fajgazdag (hozzávetőleg 15000 - 30000 faj alkotja), melyek közt számos (kb. 150) részben vagy teljesen heterotróf faj is található. A családban túlnyomó többségben vannak a trópusi fajok, melyek jobbára epifiton életmódot folytatnak. A nem trópusi fajok többségükben talajlakók. Az orchideák számos egyedi jellegzetessége közül leginkább a mag sajátos tulajdonságait és a növény obligát mikorrhizaképzését érdemes kiemelni.

1. ábra: L. loeselii magok. A csökevényes szuszpenzorral rendelkező embriót a nagy elhalt sejtekből álló külső maghéj veszi köröl A magok igen kicsik, tömegük 0,3-14 µg, differenciálatlanok és szokatlanul nagy számban termelődnek (1. ábra). A magok annyira kevés tartaléktápanyagot (fehérje, lipid, cukor, esetenként keményítő) tartalmaznak, hogy az nem képes fedezni a fotoszintézis megindulása 5

előtti differenciálódás energiaigényét. Az orchideáknak tehát ezen életszakaszukban szükségük van a gombapartnerek által biztosított tápanyagra (szénforrás, vitaminok, növekedési faktorok). A csíranövény kapcsolata a gombával a talajban alakul ki, azaz a magok nem hozzák magukkal az anyanövényről szimbiontájukat. A heterotróf fajok egész életükben a gomba segítségével szerzik meg a tápanyagokat. A kifejlett, fotoszintetizáló orchideák

gyökérzetében

is

szinte

kivétel

nélkül

találtak

mikorrhizált

részt

(Niewieczerzalowna 1932). Az Orchidea-típusú mikorrhiza endomikorrhiza, mert a gomba kizárólag az orchideagyökér kortikális sejtjeinek belsejében hozza létre mikorrhiza képletét. A mikorrhizált gyökérszakasz hossza (illetve a mikorrhizált sejtek százalékos aránya) igen változó, és egyes szerzők szerint éves ciklust követ. A terresztris orchideák gyökerei rövidek, gyakran vastagodottak, húsosak, a gyökérszőr kevés, a felvételi folyamatokhoz szükséges felületet ilyenkor a talajt átszövő gombamicélium biztosítja. Számos talajlakó orchidea kedvezőtlen körülmények között akár évekig a földben marad, hajtást nem képez (pl.: Goodyera repens, Limodorum abortivum), a tápanyagellátásukat ilyenkor szimbiontájuk biztosítja. Az epifiton fajok gyökereinek mikorrhizáltsága lényegesen alacsonyabb és többnyire csak a szubsztrátummal érintkező oldalai kolonizáltak.

A gombapartner morfológiája és rendszertani helyzete Az orchideákat mikorrhizáló gombák steril tenyészeteinek létrehozása számos nehézséggel jár (Vértényi és Bratek 1996). A mikorrhizált gyökérrészekből izolált gombák a mesterséges mikorrhizálási kísérletek szerint a morfológiai bélyegeik alapján közös csoportot alkotó Rhizoctonia forma-nemzetség (Mycelia sterilia) fajai. A Rhizoctonia forma-nemzetség jellegzetességei: a fiatal hifák áttetszők, oldalágaik hegyesszögben erednek, míg az idősödő hifák megbarnulnak, elágazódásuk szöge megnő.

6

A hifák átalakulhatnak vékony falú, sárgásbarnás színű moniliform sejtekké (2. ábra), melyek kétféle kitartóképletté alakulhatnak tovább. Szétdarabolódásuk osztódásuk,

klamidospórákat, elágazódásuk

és

aggregálódásuk mikroszkleróciumokat hoz létre. 2. ábra: Aggregálódó moniliform sejtek

Az izolátumok egy része bizonyos körülmények között képes ivaros formát, bazídiumot produkálni. Warcup és Talbot (1980) jelentős számban azonosította az orchideákkal együtt élő Rhizoctonia fajok ivaros (teleomorf) alakjait, melyek a Tulasnella, a Ceratobasidium, a Sebacina, a Thanatephorus és az Ypsilonidium nemzetségekbe tartoznak. Az ivartalan (anamorf) alakok egyik lehetséges csoportosítása a sejtmagok száma alapján történik: a kétmagvú Rhizoctoniák között a Rhizoctonia repens (teleomorf: Tulasnella calospora) és a Rhizoctonia goodyerae-repentis (teleomorf: Ceratobasidium cornigerum), a sokmagvú Rhizoctoniák közül a Rhizoctonia solani (teleomorf: Thanatephorus cucumeris) fajokat izolálták gyakrabban, de előkerültek még a R. anaticula, R. stahlii, R. mucoroides fajok is. Moore (1987) a dolipórus szerkezete alapján csoportosította az anamorfokat, a Rhizoctonia, az Epulorhiza, a Ceratorhiza és a Moniliopsis nemzetségekbe. Az orchideák leggyakoribb mikorrhiza gombái a Ceratorhiza és az Epulorhiza nemzetségekhez tartoznak (Currah et al. 1997). A Rhizoctonia a Helicobasidium purpureum, a Moniliopsis a Thanatephorus cucumeris, az Epulospora a Tulasnella calospora, a Ceratorhiza a Ceratobasidium cornigerum ivartalan alakja. Sneh et al. (1991) Rhizoctonia monográfiája az orchideákból

7

kitenyésztett gombák anamorfjait anasztomózis-csoportokba osztja (csak az azonos csoporthoz tartozó fajok hifái képesek kizárólag egymással fúzionálni, azaz anasztomózisokat képezni) és a következő fajokat illetve anasztomózis-csoportokat említi: R. repens, R. anaticula (AG-A, AG-C, AG-E, AG-I), R. solani (AG 5, AG 6). Az ivaros és ivartalan alakok klasszikus rendszerezése tehát alapjaiban már megoldottnak tekinthető (Andersen és Stalpers 1994), a biokémiai és molekuláris-genetikai vizsgálatok pedig - pl. DNS-fragment analízis (Vilgalys és Gonzalez 1990), enzimanalízis (Sweetingham et al. 1986) - lehetővé teszik a további részletek feltárását. Nagyszámú további izolátum vizsgálata alapján lehet majd érdemben állást foglalni az egyes szimbionta gombafajok növénypartnerrel kapcsolatos specifitásáról. Ausztrál orchideák szimbiontáival végzett vizsgálatokban (Warcup 1988) egyes mikorrhizagombákat számos gazdanövényen megtaláltak, másokat viszont csak egy, vagy néhány közeli rokon orchideafajon. Mikorrhizaoltásokkal sem sikerült egy-egy orchideafajra specializálódott gombafajt kimutatni, sőt gabonafélékre patogén R. solani izolátummal is sikeresen tudtak csíranövényt fertőzni, és növekedését serkenteni (Masuhara et al. 1993). Az orchideák arbuszkuláris mikorrhiza-képzésére csupán egyetlen adat van (Hall 1976). Nehezen értelmezhető az orchideák gyökereiből esetenként izolált aszkuszos gombák, és egyéb gombák (Armillaria mellea, Fomes sp., stb.), valamint az ún. pszeudomikorrhizás gombák, Leptodontidium orchidicola, Phialocephala fortinii stb. (Currah et al. 1989) jelenléte.

Molekuláris biológiai módszerek az orchidea-típusú mikorrhiza kutatásában Az utóbbi évtizedekben új lehetőségek nyíltak a rendszertan területén. Biokémiai és molekuláris biológiai módszerek jelentek meg az addig hagyományosnak nevezhető,

8

morfológiai bélyegek alapján történő elválasztások mellett. A morfológiai jellegek vizsgálata általában egyszerűbb és olcsóbb, viszont sok, általuk fel nem tárható információ nyerhető a molekuláris technikákkal, ezért mindkét módszer egyidejű alkalmazása fontos lehet (Mitchell et al. 1995). Az azonosítás és rendszerezés terén, molekuláris szinten a fehérjék és nukleinsavak szekvenciája és szerkezete áll az érdeklődés középpontjában. A génekben mind a fehérjék, mind az RNS-ek szekvenciája kódolva van, ezenkívül az RNS-ekkel való műveletek sok buktatót rejtenek magukban, ezért a DNS vizsgálata terjed legdinamikusabban világszerte. Ehhez nagy segítséget nyújtanak az utóbbi másfél évtizedben kifejlesztett PCR (polymerase chain reaction) technikák. A PCR készülékek segítségével a DNS molekulák adott szakaszai nagy

számban

fel-szaporíthatók

(amplifikálhatók),

majd

különféle

módszerekkel

vizsgálhatóak. A legtöbb információ a különböző szakaszok direkt szekvenálásából nyerhető (White et al. 1990), de sok egyéb módszer is létezik az amplifikált DNS régiók vizsgálatára. Ezek közül megemlítendő a DNS-hibridizáció és egyéb, vele rokon technikák; a RAPD, ahol véletlenszerűen választott primerekkel sokszorosítanak fel genomi szakaszokat, és azok mintázatából nyernek információt; valamint az RFLP (Restrection Fragment Length Polymorphism) technikák, amelyekben amplifikált régiók restrikciós endonukleázokkal emésztett fragmentjeinek mintázatát vizsgálják (Hibbett 1992, Rygiewicz és Armstrong 1992). Azon gének szekvenciái adnak összehasonlítható eredményeket, amelyek különböző taxonokban ugyanazt a funkciót látják el, nagyjából hasonló az evolúciós sebességük és egy kópiában vannak jelen egy genomban, vagy úgy viselkednek. Néhány egyéb gén mellett az rRNS molekulákat kódoló rDNS régiók tesznek eleget legjobban ezen kritériumoknak (Mitchell et al. 1995).

9

A gombákban (és más eukariótákban is) az rRNS gének (3. ábra) szerveződése jellegzetes, a 18S, az 5,8S és a 25/28S (S: Swedberg-féle centrifugális ülepedési állandó) rRNS-ek génjeiről a transzkripció során egyetlen RNS molekula íródik át, mely tartalmazza a gének közötti nem kódoló régiók másolatát is, amelyek később kivágódnak (Hibbett 1992). Ez a transzkripciós egység, egymás után elhelyezkedve a kromoszómán, sok példányban található meg a genomban, de egy kópiaként evolválódik (Mitchell et al. 1995).

3. ábra: Az rRNS gének szerveződése gombákban (Vilgalys (1998) alapján módosítva)

A transzkripció során egy kópia készül az ETS (external transcribed spacer) régiótól kezdődően a 28S génnel bezárólag. Az IGS (InterGenic Spacer) régió át nem íródó része (NTS: non-transcribed spacer) tartalmazhatja az 5S rRNS génjét is, ám ez taxononként változó, sokszor ez a gén egészen máshol helyezkedik el (Bruns et al. 1991, Hibbett 1992). Azt, hogy mely lokusz milyen taxonómiai kategóriák összehasonlítására alkalmas, elsősorban bázissorrendjének változékonysága szabja meg. Az rDNS kódoló régiói konzervatívabbak, evolúciójuk sokkal lassúbb, mint a nem kódoló, „elválasztó” szakaszoké, ezért a különböző régiók, taxonok közötti összehasonlítása más-más rendszertani szinteken vezethet eredményre. A sejtmagi rRNS gének szekvenálása és RFLP vizsgálata főleg faj feletti szinten eredményes. A nem kódoló régiók közül leggyakrabban az ITS szakaszt (ITS1 + 5,8S rDNS + ITS2) vizsgálják, amely főként nemzetség- és fajszinten szolgáltat információt (Bruns et al. 1991).

10

Az egyre nagyobb számban izolált orchidea szimbionta gombák nemzetségeinek rokonsági viszonyairól, melyeket eddig csak morfológiai alapon, valamint anasztomózis csoportokba sorolással tudtak rendszerezni, ITS szekvenciájuk analízisével pontosabb információk nyerhetők (Kuninaga et al. 1997, Gonzalez et al. 2001). Az egyre növekvő számú ITS szekvencia pedig lehetőséget kínál újabb izolátumok szekvencia alapon történő taxon szintű besorolásához.

Az orchideák aszimbiotikus szaporításának lehetőségei Az orchidea magvak nagyon aprók és rendkívül kevés tartaléktápanyagot tartalmaznak (Arditti et al. 1979). A glioxiszómák hiánya miatt a lipidek hasznosítása nem lehetséges. A keményítőszemcsék felhasználásával sem képes a növény a leveles fotoszintetizáló állapotig eljutni. Képes azonban pusztán nedves közegben is megkezdeni a differenciációt, mely során a mag megduzzad, majd a maghéj felreped és vékony gyökérszerű képletek (rhizoidok) alakulnak ki. Ez a képződmény az ún. protokorm. Abban az esetben, ha cukrok felvehető állapotban állnak a protokorm rendelkezésére, számos faj esetében gombapartner nélkül is tovább fejlődik a levelek, vagy esetenként a virág képződéséig. A felvehető cukor lehet Dglükóz, D-fruktóz, szacharóz, nem alkalmasak viszont az L-cukrok, és a szerves savak sem (Harley és Smith 1983). A gomba cukoranyagcseréjében fontos trehalóz (diszacharid) szinte mindig, a mannitol (redukált monoszacharid) pedig csak egyes fajoknál (Purves és Hadley 1976) képes tovább lendíteni a protokorm fejlődését. A szénhidrátok mellett vitaminok (főleg B), növekedési faktorok és aminosavak is szükségesek az aszimbiotikus nevelés során. Történeti érdekesség, hogy 1914-ben Galambos Mária aszimbiotikus módszerrel a világon először nevelt fel kifejlett orchidea növényeket. Azóta is születnek jelentős eredmények

11

hazánkban (Szendrák és Eszéki 1993). A terresztris orchideák aszimbiotikus nevelése még napjainkban is nagy kihívást jelent.

Az orchideák szimbiotikus szaporításának lehetőségei Az aktív Rhizoctonia törzsek hatására a magok nagyobb számban csíráznak ki, és nő a csírázás sebessége is. A már kialakult protokormot

fertőzik

a

gombahifák

a

protokorm rhizoidjain (Rasmussen et al. 1990), vagy a szuszpenzor sejtjein keresztül (Clements 1988). Egyes vizsgálatok alapján a szuszpenzor sejtjein keresztül történő kolonizáció

nem

vezet

szimbiózishoz

(Rasmussen 1990). A gyökér kortikális sejtjeibe, ill. a protokorm sejtjeibe bejutó hifa

felszaporodva,

elágazódva

és

feltekeredve egy "hifa-gombolyagot", un. pelotont képez (4. ábra). 4. ábra: Orchidea gyökér kortikális sejtjei pelotonokkal A peloton hifái és a gazdasejt plazmalemmája között csak egy vékony szénhidrátréteg található, ennek anyaga kallóz, pektin és kevés cellulóz (Peterson és Currah 1990). Hasonló szénhidrátsapka fogja körül a parazita gombák behatoló hausztóriumait is. E szénhidrát réteg a

peloton

képződésének

befejeződése

után

még

tovább

vastagszik,

jellegzetes

elektrontranszparens, anilinkékkel jól festhető réteget képez. A peloton nem állandó képlet a

12

gyökér sejtjeiben, hifái idővel ellaposodnak, majd a peloton zsugorodni kezd, a hifák degenerálódnak, végül a peloton szinte teljesen eltűnik. Hadley és Williamson (1971) szerint a pelotonok képződése és eltűnése a Dactylorhiza purpurella esetében 30-40 óra alatt lejátszódhat. Bár bizonyítani nem sikerült, sokan a peloton degenerálódását nem tápanyaghiánnyal, hanem a gazdasejtek védekező reakciójával magyarázzák. Ezt támasztja alá a degenerált pelotonokat tartalmazó sejtekben a savas foszfatáz aktivitás növekedése (Williamson 1973). Feltehetően a gomba lízisében van szerepe a kitináz és a β(1,3)glükanáz aktivitásnak (Zengming és Zhong 1990). A protokorm fertőzött sejtjei fiziológiailag aktívak, nagy számú mitokondriumot, jól fejlett endoplazmatikus retikulumot, diktioszómákat és különböző méretű vakuólumokat tartalmaznak. A gazdasejtekben a magok térfogata és a DNS mennyisége is megnő (Williamson 1970). Megjegyzendő, hogy megfigyeltek kolonizálatlan gyökerek sejtjeiben is nagymértékű (4 vagy 8-szoros) poliploidiát. A gyökércsúcshoz közeli sejtekben (európai terresztris orchideáknál a csúcstól számított 1-2 cm-en belül) nincs fertőzés, csak a távolabb fekvő gyökérrészek kortikális sejtjeiben. A mikorrhizált gyökérrész sejtjeinek egy része nem tartalmaz pelotont, ezekben a sejtekben mindig találunk keményítőszemcséket. A pelotont tartalmazó sejtekben viszont nincs keményítő. A növény gomba segítségével történő felnevelése csak akkor lehetséges, ha nincs jelen könnyen hozzáférhető szénforrás és a felhasználható nitrogén mennyisége is csekély, különben a gomba parazitálja a növényt (Smith 1967, Beyrle et al. 1991).

Orchideák magvetésénél alkalmazott táptalajok Az orchideák steril szaporításának kezdete Knudson (1946) nevéhez fűződik, aki mesterséges táptalajt állított össze steril magvetéshez, melyet még ma is alkalmaznak kiegészítésekkel (Yam és Weatherhead 1988, Stenberg és Kane 1998). Az elmúlt évek alatt igen nagyszámú,

13

egymástól eltérő táptalajformulát írtak le, melyek alkalmasak orchideák in vitro tenyésztéséhez. Vannak közöttük, melyek ásványi só és cukor egyszerű keverékéből állnak, de

vannak

nagyon

növekedésszabályozó

bonyolult anyagokat

összetételűek

is,

(hormonokat),

melyek

szerves

vitaminokat

és

adalékanyagokat, egyéb

járulékos

alkotóelemeket is tartalmazhatnak (Thompson 1977). A receptek összeállításánál olyan kérdésekre keresik a választ, mint hogy miért előnyösebb az egyik só a másiknál, vagy miért fontos egy adott ion koncentrációja (Kishi és Takagi 1997). A jelenlegi kutatások abba az irányba haladnak, hogy tisztázzák ezeket a pontokat, illetve olyan összehasonlító tanulmányok készüljenek, amelyek alapján javaslatot lehet tenni az optimális táptalaj formulára a különböző orchideanemzetségek és fajok in vitro tenyésztéséhez (Stenberg és Kane 1998). Thompson (1977) szerint a legtöbb termesztő üzemben használt táptalajok gerincét a jól ismert Knudson ’C’ [KC] tápoldat adja, amelyet gyakran kiegészítenek valamilyen szerves adalékanyaggal, mint pl. banánpéppel, annak érdekében, hogy ellensúlyozzák a közeg meglehetősen alacsony tápanyagtartalmát, különösen a redukált nitrogén alacsony koncentrációját. Az ELTE Botanikus Kert Orchidea laboratóriumában is folynak kísérletek a KC táptalaj módosítására. Jó eredményeket értek el a kálciumszint csökkentésével és egyúttal az ammónium-ionok koncentrációjának növelésével. Ez a módosított formula [melynek jelölése KCM] további vizsgálatok tárgyát képezi (Eszéki és Györváry 2000). Fast (1976) európai orchideák szaporításához állított össze tápközeget, amelynek számos módosított változatát trópusi orchideák magvetéséhez és szaporításához is használják. Az ELTE Botanikus Kert Orchidea laboratóriumában a magvetésekhez a wroclawi egyetemen módosított Fast táptalajt használnak [F]. E receptnél külön megjegyezhető az alacsony

14

sókoncentráció, továbbá peptont tartalmaz, melyet a fiatal növények mint nitrogénforrást (aminosavak) hasznosítanak (Eszéki 1996). Az orchidea magok csíráztatásánál szükség van szerves nitrogén forrásokra, ugyanis a magok olyan kis méretűek, hogy nem képesek a szervetlen N források felhasználására, azaz az aminosavak megfelelő szintézisére. A leggyakrabban használt aminosavak a táptalajban a következők: alanin, aszparagin, cisztein, glutamin, glicin, arginin, lizin stb. (Jámborné 1993). Murashige és Skoog (1962) eredetileg dohány szövettenyésztéséhez kifejlesztett tápközege [MS] nagyon hatékonynak bizonyult orchideafajok számára is. Nagyon magas nitrogén- és káliumtartalma, számos különféle növekedésszabályozó anyagot és vitaminokat is tartalmaz (Thompson 1977). Sókoncentrációját a legtöbb szerző magasnak találta, ezért különféle csökkentéseket alkalmaztak, a legtöbben fél makroelem töménységet használnak (Zel et al. 1988, Mante et al. 1989). Az Arditti és Ernst (1984) által megvizsgált 37 különböző tápoldat közül az MS bizonyult a legmagasabb ásványisó tartalmúnak. Megállapításaik szerint ez a közeg 136-szor töményebb, mint azoknak a fatörzseknek a kimosódó nedve, melyekkel az epifiton orchideák protokormjai természetes élőhelyükön találkoznak. Az orchideák magvetésénél alkalmazott táptalajokat gyakran egészítik ki növényi eredetű természetes növekedésserkentőkkel, melyek egyik csoportját a könnyezési nedvek alkotják. Ezek nagy biológiai aktivitásúak, részben cukortartalmuk, részben ásványi anyag- és növekedésserkentő (hormon és vitamin) tartalmuk miatt (Mándy 1987). Másik csoportját a terméskivonatok alkotják. Terméskivonatokat nagyon kis méretű explantátumok életben tartásához használnak. A természetes kivonatok közül a kókusztej bizonyult a leghatásosabbnak a kultúrák növekedésében (Richter 1982). A kókusztej kedvező hatását Datura-embriókultúrákon figyelték meg először. Hatása elsősorban citokinin-aktivitásában rejlik: serkenti a sejtosztódást, de nem hat a sejtek megnyúlásos növekedésére (van Overbeek et al. 1941). A kókusztej egymagában is hat a szövetek növekedésére, de serkentőkkel és más

15

kivonatokkal együttesen alkalmazva szembetűnő a hatása. Aránylag tömény oldatban (10-30 %) fejti ki hatását, amely friss állapotban, de autoklávozás után is megmarad (Maróti 1976). A kókusztejet a még éretlen termésből nyerik, a táptalajhoz 50-100 ml/l töménységben adagolják (Richter 1982). Egyes szerzők növényi hormonok, például benzaminopurin (BA), kinetin, naftilecetsav alkalmazásával érnek el jó eredményeket. Steele (1995) citokinint érett magok esetében adott a táptalajhoz, éretlen magvaknál nem alkalmazott hormonkezelést.

Orchidea magok sterilizálásának módjai A magvetéshez éretlen magtokokat használva, melyek még nem repedtek fel, sterilnek tekinthető magvakkal dolgozhatunk. Az érett magtokokon lehetnek vékony repedések, vagy esetleg már fel is nyíltak a bordák mentén, így a magok már érintkezhettek a szabad levegővel. Ez azt jelenti, hogy megfertőződhettek a levegőben terjedő spórákkal, vagyis innentől kezdve nem tekinthetők sterilnek. A még ép, fel nem nyílt termésekből steril körülmények között kinyert magok fertőtlenítés nélkül vethetők (Richter 1982). Ebben az esetben, előzőleg magát a termést kell fertőtleníteni, úgy, hogy a leszedett magtokokat alkoholba mártva denaturált szesz égő lángja fölött áthúzzuk. Így a felületen megtapadt baktérium- és gombaspórák jó része elpusztul a magvak károsodása nélkül (Eszéki 1996). Az orchideamagvak sterilizálásánál nagyon fontos a helyes sterilizálószer, annak töménysége és a fertőtlenítés idejének helyes megválasztása (Jámborné 1993). Mivel a magok nem élnék túl az autoklávozást, ezért fertőtlenítésükhöz valamilyen vegyszeres kezelést kell alkalmazni (Thompson 1977). A leggyakrabban használatos a klórmeszes oldat, de arra figyelni kell, hogy csak valóban friss és légmentesen zárt klórmész alkalmazható (Thompson 1977).

16

Az oldat készítésekor a kimért port a szükséges vízzel össze kell keverni egy üvegben, amit azután ajánlott egy gumidugóval lezárni. Az oldatot jól fel kell rázni, majd hagyni leülepedni. Az oldat leszűrésére legalább fél órás állást követően kerül sor. Erre azért van szükség, mert a klórmész nem oldódik fel tökéletesen és egy fakó, fehéres szuszpenziót ad. Ezt leszűrve egy tökéletesen tiszta, halványzöld színű folyadék lesz. Az átszűrt oldatot tartalmazó üveget rögtön le kell zárni és sötétben tartva még aznap fel kell használni (Richter 1982). Az elkészített oldathoz detergenst is adnak, melynek koncentrációja 100 ppm-nél nagyobb nem lehet a magok roncsolása miatt. A fertőtlenítő oldatokhoz adott nedvesítőszerek (pl. Tween 80, Tween 20) növelik az oldat hatékonyságát, amire azért lehet szükség, mert vannak olyan magvak, melyek maghéjában levegő van és ezek a magok nehezebben áztathatók (Jámborné 1993). Thompson (1977) a klórmeszes oldatot 100 g / 100 ml töménységben ajánlja alkalmazni. Eszéki (1996) orchideamagok sterilizálásához a 10 g klórmeszet 90 ml desztillált vízben javasolja feloldani, majd 30 perces állás után szűrni. A sterilizálás időtartama orchideamagvaknál általában 8-10 perc (Eszéki 1996). Thompson (1977) szerint erősen szennyezett magvak esetén szükséges a sterilizálás idejét 15-20 percre meghosszabbítani, azért, hogy a legtöbb baktérium- és gombaspóra elpusztuljon, és ez rendszerint még nem árt az orchideamagvaknak. A magok sterilizálásának legelterjedtebb módja a következő: a kémcsövekbe helyezett száraz magokhoz 5-10 ml sterilizáló oldatot adnak. A kémcsöveket ezután gumidugóval lezárva 2-3 percen keresztűl intenzíven rázatják, majd a megfelelő idő elteltével a fertőtlenítő oldatot leöntik a magvakról (Richter 1982, Eszéki 1996). Egyes szerzők ezt követően 2-3-szor ismételt steril desztillált vizes öblítést is javasolnak (Thompson 1977, Jámborné 1993).

17

Anyag és módszer

Liparis loeselii A magvetési kísérletekben felhasznált L. loeselii magok a bevezetőben már említett három hazai állomány közül az újonnan felfedezett, legnagyobb egyedszámú, velencei-tavi populációból származtak. Az 5-25 cm magas növény május végén, június elején virágzik. Laza fürtvirágzatát 2-10 sárgászöld virág alkotja (5. ábra). Az érett magtokok a szeptember

végi

magszórást

megelőzően

kerültek begyűjtésre 2001 és 2002-ben. Vetésig a magokat hűtve (5 oC) tároltam, ugyanis

magasabb

hőmérsékleten

az

orchideák magjai gyorsan elvesztik csírázóképességüket. A magok egy részét a magvetést megelőző két hétben mélyhűtőben (-20 oC) tároltam. Az így előkezelt magokat az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben használtam fel. 5. ábra: Liparis loeselii virágzó egyed a 2001-ben felfedezett velencei-tavi populációból (2001. május 18.)

Alkalmazott szimbionta gombatörzsek A szimbiotikus nevelési kísérletekhez számos hazai orchideáról izolált szimbionta gombatörzs állt rendelkezésre. Liparis loeselii gyökeréből három izolátummal is rendelkezünk (O-318, O18

36, X/9a). Mivel egyre több kutatási eredmény szól amellett, hogy az orchidea fajok és potenciális szimbiontáik között nincs szoros fajspecifitás, ezért a szimbiotikus szaporítási kísérleteimben egy másik, Dactylorhiza incarnata gyökeréből izolált gombatörzset (VII/17d) is alkalmaztam.

A mikorrhizaképző gomba izolálása és az izolátumok fenntartása A szimbiotikus kultúrák előkészítéséhez használt két gombatörzs (X/9a, VII/17d) izolálásánál a gyökérszegmens technikát alkalmaztam (Vértényi és Bratek 1996). A lemosott gyökereket 3 percig 0,1 %-os AgNO3–oldatattal fertőtlenítettem, majd 0,5 – 1,0 cm-es darabokra vágtam és burgonyakeményítős táptalajra (Potato Dextrose Agar, PDA) helyeztem. A gombatáptalajon kifejlődő szimbionta gombákat izoláltam, majd ugyancsak PDA táptalajon tartottam fent a tiszta törzseket. A PDA táptalaj összetétele: burgonyapehely 3 g/l, glükóz 10 g/l, agar 15 g/l.

A gombatörzsek azonosítása molekuláris módszerrel

DNS kivonása a gombatörzsekből A DNS kinyerésében néhány módosítással Kårén et al. (1997) módszerét alkalmaztam. A gombatörzseket rázatott folyadékkultúrában szaporítottam föl. A leszűrt micélium-szövedéket 50 °C-on, szárítószekrényben szárítottam meg. Ebből az anyagból vettem mintánként 20-30 mg tömegű mennyiséget a DNS kivonáshoz. A mintákat kis méretű dörzsmozsarakban dörzsöltem el, kvarchomok és folyékony nitrogén jelenlétében. Az eldörzsölt anyagot 1,5 mles Eppendorf-csövekbe vettem fel, 600-750 µl 2 %-os CTAB lízis pufferben (lízis puffer: 2 % CTAB, 100 mM Trisz-HCl, 1,4 M NaCl, 20mM EDTA). A csöveket 65 °C-os vízfürdőben inkubáltam 40-60 percig, közben 10-15 percenként keveréssel homogenizáltam. Ezt követően

19

a mintákat centrifugába tettem és 13000 rpm fordulatszámon, 10 perc alatt lecentrifugáltam a törmeléket. Minden centrifugálás szobahőmérsékleten zajlott. A fehérjéket kloroformos kicsapással távolítottam el, két lépésben. A mintákhoz egy térfogat (kb. 600 µl) kloroformot adtam, majd alaposan összeráztam és 13000 rpm fordulatszámon, 15 percig tartó centrifugálással elválasztottam a vizes és a kloroformos fázist. A DNS-t is tartalmazó vizes fázist új, tiszta csőbe pipettáztam, a fehérjetartalmú kloroformos fázist elöntöttem. Ezután ezt a lépést megismételtem. A vizes fázisú felülúszóból a DNS-t két - két és fél térfogat –20 °C-os abszolút etanollal csaptam ki. A kicsapott DNS-t egy éjszakán át –20 °C-on tartottam, hogy elősegítsem a DNS kiválását, majd 13000 rpm fordulatszámon, 30 percig centrifugáltam. A felülúszó elöntése után a DNS csapadékot háromszor mostam a következő módszerrel: 200 µl 70 %-os, -20 °Cos etanolt adtam a csapadékhoz, majd rövid keverés után 7000 rpm fordulatszámon, 5 percig centrifugáltam, végül az alkoholos felülúszót elöntöttem. Ezt a mosási eljárást tehát még kétszer megismételtem. Végül az alkoholt leöntöttem a csapadékról és az eppendorf-csöveket kiszárítottam, így eltávolítottam a mintából az alkoholt. Végezetül a csapadékot pH=8 értékű 50-100 µl ultratiszta Milli-Q vízben (Millipore) vettem föl.

PCR reakció és gélelektroforézis Mivel ultratiszta vizet használtam a DNS oldására és vízben a DNS oldódása nem tökéletes, ezért az inhomogén oldatból több különböző hígítással végeztem a PCR reakciót, így közelítve a reakció optimális templát koncentrációját.

20

Az amplifikációhoz a Perkin Elmer cég GeneAmp PCR System 2400 típusú készülékét használtam

(6.

ábra),

amelyben maximum 24 darab, 0,2 ml-es PCR cső használható.

A

PCR

elegyek végső térfogata minden esetben 50 µl volt. A reakcióelegyek összetételéről

tájékoztat

az 1. táblázat. 6. ábra: GeneAmp PCR System 2400-as készülék

1. táblázat A PCR elegyek és a mastermix térfogata és összetétele Kiindulási koncentráció steril ultratiszta víz reakciópuffer 10×RB dNTP mix 2-2-2-2 mM MgCl2 25 mM primer 1 10 µM primer 2 10 µM Taq polimeráz 5 u/µl mastermix térfogat templát DNS-oldat térfogat Teljes térfogat

1 reakcióelegy (µl) 8,75 5 5 4 1 1 0,25 25 25 50

Elsőként a DNS templátot, vagyis a mintákat mértem be a PCR csövekbe, és a térfogatot steril Milli-Q vízzel kiegészítettem 25 µl-re. Ezután a mastermixet, azaz a PCR elegyek DNS templátot nem tartalmazó, a megfelelő reakciókörülményeket biztosító, azonos alapoldatát készítettem el, minden összetevőt belemérve, az enzim kivételével. Végül a Taq DNS polimeráz enzimet is hozzáadtam a mastermix-hez, és rövid keverés után ebből az

21

alapoldatból adtam minden csőhöz szintén 25 µl-t. A reakcióelegyekben 2 mM volt a végső Mg2+ koncentráció. Az enzim számára a polimeráz reakció megkezdéséhez szükséges oligonukleotidokként

az

ITS1

(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)

eukariótákhoz

univerzálisan

-

használt

ITS4

(5’-

primerpárt

alkalmaztam, amely a teljes ITS régió felszaporításához használatos (Gardes et al. 1991, Vilgalys 1998). A reakció során beállított paraméterekről a 7. ábra nyújt tájékoztatót.

7. ábra: Az amplifikáció folyamán alkalmazott hőmérsékletek előzetes denaturáció

denaturáció

94 oC 4 perc 30 mp

94 oC 30 mp

primerkötés

DNS szintézis

51 oC 30 mp 33 ciklus * +1 mp ciklusonként

72 oC 30 mp*

végső szintézis

eltartás

72 oC 7 perc 4 oC

A polimeráz enzim aktiválásához és a templát DNS nagyfokú denaturációjának eléréséért az első ciklus beindítása előtt 4 és fél percig tartó, 94 °C-os inkubációt alkalmaztam, ezen kívül a Taq polimeráz ciklusonként csökkenő aktivitását a szálszintézis idejének ciklusonkénti 1 másodperces növelésével ellensúlyoztam. A reakció végeztével (kb. 2 óra múltán) a mintákat azonnal vizsgáltam gélen. A gélelektroforézishez Horizon 11-14 típusú futtató rendszert (Gibco BRL) használtam. A gél elkészítéséhez és futtató pufferként egyaránt 0,5× Trisz-bórsav-EDTA (TBE) puffert használtam. A gél 1 % agaróz tartalmú volt. A kb. 50-60 °C-ra visszahűtött agarózoldathoz adtam hozzá a DNS kimutatására használt etidium-bromidot, 100 ml gélhez 16 µl mennyiségben (0,5 mg/ml törzsoldatból). A mintákból 5 µl-t kivéve és ehhez 1 µl 6×LB jelzőpuffert adva, ezeket a 6 µl térfogatú keverékeket juttattam a mintafelvevő zsebekbe. A 22

PCR termékek ellenőrzéséhez 5,5-7,5 V/cm fajlagos feszültség mellett 35-60 percig hagytam vándorolni a DNS mintákat az agaróz gélben. A futtatási idő letelte után a gélt UV fénnyel átvilágítva, 595±50 nm-en áteresztő interferenciaszűrőt alkalmazva, digitális, hűtött CCD kamerával fényképeztem le, a WinView/32 és az Image-Pro Plus kameravezérlő és képfeldolgozó programok segítségével. A fotókat szabad szemmel, ill. a Phoretix-1D gélkiértékelő program felhasználásával vizsgáltam.

PCR termékek tisztítása, szekvenálás A PCR termékek tisztítását ultraszűrő membrán (Amicon membrán, Millipore) segítségével végeztem. A tisztítás során a megfelelő pórusméretű ultraszűrő membrán visszatartja a PCR termék DNS molekuláit, míg a fölösleges kismolekulájú anyagok (dNTP, oligonukleotidok, sók) átcentrifugálhatók, végül a DNS a membránról lemosható. A tisztítás eredményét mindkét esetben a már említett módon gélelektroforézissel ellenőriztem. A szekvenáló reakcióhoz a BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit-et (Applied Biosystems) használtam. A szekvenáló elegy összetétele a 2. táblázatban látható.

2. táblázat: A szekvenáló reakcióelegyek összetétele. kit higító puffer 5× PCR termék primer víz összesen

3 µl 2,5 µl 4-8 µl 30 pmol a maradék 20 µl

A szekvenáló kit tartalmazza a fluoreszcens nukleotidokat (dNTP és ddNTP), a DNS polimerázt (módosított Taq) és egyéb segédanyagokat. A gélelektroforézis eredményétől

23

függően az egyes mintákból 4-8 µl mennyiséget használtam, a végső térfogatot steril ultratiszta vízzel állítottam be 20 µl-re. A reakció során beállított paramétereket a 8. ábra tartalmazza. 8. ábrat: A szekvenáló reakció körülményei denaturáció 96 oC 10 mp

primerkötés

50 oC 5 mp 28 ciklus

DNS szintézis

eltartás

60 oC 4 perc 4 oC

A szekvenáló reakcióelegyekből a jelölt DNS-t 50µl 96 %-os etanollal és 2µl 3M Na-acetáttal csaptam ki, majd keverés és rövid szobahőmérsékletű inkubálás után 20 percig 14000 rpm fordulatszámmal centrifugáltam. A felülúszó eltávolítása után etanollal mostam a DNS-t, majd a csapadékot PCR-készülék segítségével 90 °C-on kiszárítottam. A mintákat formamid tartalmú pufferben denaturáltam, a kapilláris gélelektroforézis ABI PRISM 310 Genetic Analyser, illetve 3100 Genetic Analyser készülékben (Applied Biosystems) történt.

A szekvenciák ellenőrzése és adatbázisba helyezése A kromatogram formájú DNS-szekvenciákat a Chromas program felhasználásával ellenőriztem. Az ellenőrzött szekvenciákhoz hasonló, már leközölt adatokat a nemzetközi adatbázisokban (GenBank, EMBL) a BlastN 2.2.2 (Altschul et al. 1997), illetve a Fasta33 (Pearson és Lipman 1988) programok segítségével kerestem, a DNS szekvenciák pontos illesztését pedig a ClustalW (Thompson et al. 1994) programmal végeztem. A szekvenciákat az európai nemzetközi adatbázisban (EMBL) helyeztem el.

24

Az aszimbiotikus csíráztatási kísérletekben felhasznált táptalajok Az első csíráztatási kísérletben a L. loeselii magokat négy különböző táptalajra vetettem el. Az alkalmazott táptalajok a wroclawi egyetemen módosított Fast [F], a Van Waes és Debergh (1986) [DEB], kókusztejjel kiegészített DEB tápalaj [DK], valamint egy kizárólag kókusztejet, mint természetes serkentő anyagot tartalmazó [ZAK] (Borris 1969) táptalajok voltak (3. táblázat). A második csíráztatási kísérletben az F és DEB táptalajok mellett a Murashige és Skoog (1962) [MS], felére csökkentett makroelem tartalmú MS [MS1/2] és 10-5 M BA (citokinin) tartalmú ugyancsak felére csökkentett makroelem szintű MS [MS1/2+BA] táptalajokra vetettem a L. loeselii magjait (3. táblázat). Ezenkívül desztillált vízbe is vetettem magokat.

A szimbiotikus csíráztatási kísérletben alkalmazott táptalaj A szimbiotikus csíráztatási kísérlet során a táptalajra a növény magjai mellett, a szimbionta gomba is felkerül. Az alkalmazott csökkentett glükóz tartalmú táptalaj a Pfeffer agar [P] (Weber és Webster 2001) volt (3. táblázat). A gomba a táptalaj felszínére helyezett 2×5 cm-es autoklávozott szűrőpapírra került (9. ábra).

9. ábra: Szimbiotikus orchidea magvetés Petri-csészébe

25

3. táblázat: Az aszimbiotikus és szimbiotikus csíráztatási kísérletekben felhasznált táptalajok MS

MS1/2

F

DEB

DK

ZAK

P

Összetevők (mg/l) Makroelemek Ammónium-nitrát

NH4NO3

1650

825

166,7

-

-

-

-

Kálium-nitrát Kálium-klorid

KNO3 KCl

1900 -

950 -

166,7

-

-

-

50 25

Kálcium-klorid

440

220

-

-

-

-

-

Kálcium-nitrát

CaCl2 x 2H2O Ca(NO3)2x4H2 O

-

-

83,3

-

-

-

290

Magnézium-szulfát

MgSO4 x 7H2O 370

185

83,3

100

100

-

50

Kálium-foszfát Mikroelemek Kálium-jodid

KH2PO4

170

85

83,3

300

300

-

50

KI

0,83

0,83

0,83

-

-

-

0,83

Bórsav

H3BO3

6,2

6,2

6,2

10

10

-

6,2

Mangán-szulfát

MnSO4 x 4H2O 22,3

22,3

22,3

25

25

-

22,3

Cink-szulfát

8,6

8,6

8,6

10

10

-

8,6

Nátrium-molibdenát

ZnSO4 x 7H2O Na2MoO4 x H2O

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

-

0,25

Réz-szulfát

CuSO4 x 5H2O

0,025

0,025

0,025

0,025

0,025

-

0,025

Kobalt-klorid Vas forrás

CoCl2 x 6H2O

0,025

0,025

0,025

-

-

-

0,025

Vas-szulfát FeNaEDTA Vitaminok Inozit Nikotinsav

FeSO4 x 7H2O

27,8 37,3

27,8 37,3

16,66

27,85 37,25

27,85 37,25

-

27,8 37,3

100 0,5

100 0,5

0,1

100 5

100 5

-

-

Piridoxin HCl (B6)

0,5

0,5

-

-

-

-

-

Tiamin HCl (B1) Fólsav Biotin (H-vit.) Aminosavak Glicin Glutamin Egyéb Kazein Pepton Élesztőkivonat Növekedésserkent ő Kókusztej (ml/l) Szénhidrát Szacharóz (g/l) Fruktóz (g/l) Glükóz (g/l) Agar (g/l)

0,5 -

0,5 -

0,01

0,5 0,5 0,05

0,5 0,5 0,05

-

-

2 -

2 -

-

2 102,3

2 102,3

-

-

-

-

1660 8330

500 -

500 -

-

-

-

-

-

-

20

20

-

30 -

30 -

11,7 5

20 -

10 -

10 -

8

8

8

8

8

8

1 15

26

A magok sterilizálása és vetése A L. loeselii magok sterilizálásához klórmész oldatot használtam, amit Eszéki (1996) módszere alapján készítettem. Az oldatot 30 perc állás után szűrtem le, majd 2 csepp Tween 80-at adtam hozzá. A sterilizáláshoz a magvakat kémcsövekbe helyeztem el, majd az oldat hozzáadását követően a csöveket gumidugóval zártam le. A sterilizálási idő alatt a kémcsöveket folyamatosan rázattam, majd az áztatást követően az oldatot óvatosan leöntöttem a magokról, melyek így a kémcső belső falára tapadtak. A sterilizálás időtartama 10 perc volt. Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben sterilizálást követő kétszeres desztillált vizes mosást alkalmaztam a magok egy részénél. A magvakat steril szike segítségével juttattam a táptalajra. A magok egyenletes eloszlása érdekében steril üvegbot segítségével 1-2 csepp desztillált vizet juttattam a táptalaj felszínére, majd a vízzel szétoszlattam a magokat.

Tenyésztési körülmények Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérlet beállításának helye és időpontja: ELTE Botanikus Kert Orchidea laboratórium, 2002. április 25. A kultúrákat 100 ml-es Erlenmeyer-lombikokban tartottam fenn. A magvetést követően a lombikokat sötétben, szobahőmérsékleten tartottam a csíranövények hajtáscsúcsának megjelenéséig (10. ábra). 10. ábra: Tömegesen csírázó L. loeselii magok DEB táptalajon

27

A második aszimbiotikus csíráztatási kísérlet beállításának helye és időpontja: ELTE Növényélettani Tanszék, 2002. november 19. A kultúrákat Petri-csészében tartottam fenn. Három

csíráztatási

körülményt

állítottam

be.

A

magok

egy

része

sötétbe

és

szobahőmérsékletre került, egy másik része fényre, szobahőmérsékletre, a harmadik csoport pedig egy hónap időtartamra sötétbe és hűtőszekrénybe (4-6 oC) került. A hidegkezelést követően ezeket a magokat is szobahőmérsékletre tettem és továbbra is sötétben tartottam. A szimbiotikus előkísérlet beállításának helye és időpontja: ELTE Növényélettani Tanszék, 2002. december 16. A Pfeffer agarra oltott gombatörzsek sötétbe és szobahőmérsékletre kerültek. A kultúrákat Petri-csészében tartottam fenn. Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben Debergh táptalajon előnevelt Liparis magoncokat a már gombával átszőtt Pfeffer agarra oltása után a fényre tettem (2003. január 23.). A szimbiotikus csíráztatási kísérlet beállításának időpontja és helyszíne: 2003. január 2., ELTE Növényélettani Tanszék. A Petri-csészében Pfeffer agarra vetett magok sötétbe és szobahőmérsékletre kerültek. A gomba táptalajra oltását követően is tart a sötétkezelés a növények jövőbeni hajtásképzéséig.

A csíráztatási kísérletek kiértékelésének módszerei Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben a magok csírázásának időpontját rendszeres sztereómikroszkópos vizsgálattal állapítottam meg. A hajtásképzés megindulásakor lombikonként megállapítottam a protokormok és hajtásos csíranövények együttes százalékos arányát, valamint a csírázás folyamán elhalt protokormok százalékos arányát. Párhuzamos minták kialakítása nem történhetett meg a 2001-ben gyűjtött magtokok kis száma miatt. A második csíráztatási kísérletben a Petri-csészékben indított kultúrák rendszeres vizsgálatával a csírázás megindulását pontosan detektáltam, majd a csírázási folyamatot két

28

időpontban csírázási százalékok számolásával követtem nyomon. A Petri-csészénkénti protokormok számát a Petri-csészék 1 cm2-es szektorokra bontásával és ezek szisztematikus vizsgálatával pontosan meg tudtam állapítani, az összmagszámmal együtt.

29

Eredmények ismertetése

A szekvenciaanalízis eredményei A szekvenciák elemzését a három Liparis loeselii és egy Dactylorhiza incarnata gyökeréről izolált szimbionta gombatörzs felszaporított tenyészetből származó minta esetén végeztem el. Minden gombatörzsből két „nyers” szekvenciát kaptam, mivel mindkét DNS szálat megszekvenáltam. Erre azért volt szükség, mert a szekvelálási reakció során a Taq polimeráz aktivitásának csökkenésével a bázisok leolvasásának megbízhatósága folyamatosan romlik. Az ITS régió két irányból megkezdett feltárása viszont kiküszöböli ezt a problémát, mivel a két komplementer szekvencia egymással kiegészíthető. A szekvenátor által adott kromatogramokat a Chromas kiértékelő program segítségével vizsgáltam. A számítógép által meghatározott bázissorrendet néhol szükséges volt felülbírálni (11. ábra). Előfordultak a szekvenciában nem determinált, hiányzó, vagy éppen megkettőzött bázisok. Ezek kijavítása és a revertált komplementer szállal való kiegészítés után már a szekvenciák alkalmasak lettek a további analízisre. Az egyes gombatörzsek adatait a 4. táblázatban foglaltam össze.

11. ábra: A Chromas program által meghatározott bázissorrend javítása

4. táblázat: Gombatörzs O-318 O-36 X/9a VII/17d

Izolátum eredete Liparis loeselii Liparis loeselii Liparis loeselii Dactylorhiza incarnata

Izolátum származási helye Csehország Csehország Magyarország, Velencei-tó Magyarország, Szabadszállás

Hivatkozási szám AJ549128 AJ549129 AJ549124 AJ549123

30

A O-318 és O-36 törzsek ITS régiójának szekvenciája 100 %-ban megegyezett. Meghatároztam az ITS1, az 5,8S rRNS gén, valamint az ITS2 szakaszok kezdetét és végét az EMBL adatbázisból vett Saccharomyces cerevisiae (AJ229057) szekvenciája alapján (a félkövéren írt adatok az 5,8S rRNS gént jelölik):

GTAATCGTCTTTGACGTTCTATCTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGCGCTCTGGTCGAG GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTTGCCAGTCTGTGTTACCTCCTCGGAGG CACACGTTAAAGATCGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGTAAACTTTACAACCGG CAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGCAAATTGCGATAAAGTGA TGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTGTTGAACGCATTGCACCG CGCCCTAAACCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATTGTATTCCTTCGGGAGTCTTT CCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTGGATCGTGTTCTCTCAGATGC GTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCGTGGAGTCCCTTCGAGTTTGA GACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTCGCGTCACCAAGTCCGCGTCCTCTTGGACGTCGGT ACTACAACGCA ITS1:

1

-

165

(165 bp hosszú)

5,8S:

166

-

340

(175 bp hosszú)

ITS2:

341

-

551

(211 bp hosszú)

A X/9a törzs ITS régiójának szekvenciája az ITS1, 5,8S és ITS2 régiók határaival: GTAATCGTCTTTGACGTTCTATTTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGTGCTCTGGTCGAG GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTCGCTTTGCCTGTGTTACCTCCTTGGAG GCACACGTTAAAGATTGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGTAAACTTTCTACAAC CGGCAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGCAAATTGCGATAAAG TGATGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTGTTGAACGCATTGCA CCGCGCCCTAATCCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATTGTATTCCTTCGGGAGTC TTTCCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTGGATCGTGTTCTCTCAGA TGCGTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCGTGGAGTCCCTTTGAGCT TGAGACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTTGCGTCACCAAGTCCGCGTCCTTCTGGACGTC GGTACTACAACGCA ITS1:

1

-

166

(166 bp hosszú)

5,8S:

167

-

343

(177 bp hosszú)

ITS2:

344

-

554

(211 bp hosszú)

31

A VII/17d törzs ITS régiójának szekvenciája az ITS1, 5,8S és ITS2 régiók határaival: TGAATAAATTTAGAGTTGGTTGTTGCTGGCTTTAATACCTGAAGCATGTGCACACCTTCT CTTTAATCCACACACCCCTGTGAACTTGTGAGGCAGTAAGGGAGAGAGGTCTTTAACCGG GCCTGATCCTTTGCTGCCTGCTTAATTACACAAACTCATTTTATTTTAAACTGAATGTAA ATTGATGTAACGCATCATTTAATTACAAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC GAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATC ATGAAATTCTCAAAGTAAAATCTTTTTGTTAATTCAATTGGTTTGACTTTGGACTTGGAG GTCTTTGCAGATTTAATTATCTGCTCCTCTTAAATTTATTAGCTGGATCTCAGTATATGC TTGGTTCCACTCGGCGTGATAAGTTATCACTCGCTGAGGACACTTGTAATAAAGTGGCCA GGAAATGCAGATGAACCGCTTCTAATGGTCTATTAAATTAGACAAAATTTAATTTCAAGA ITS1:

1

-

206

(206 bp hosszú)

5,8S:

207

-

362

(156 bp hosszú)

ITS2:

363

-

600

(238 bp hosszú)

32

A Liparis loeselii gyökeréről izolált két különböző ITS szekvenciájú gombatörzs igen nagy hasonlóságot mutat (12. ábra). 12. ábra: Az O-36 és a X/9a gombatörzsek ITS régiójának összehasonlítása ClustalW program segítségével. A pontok azonos bázisokat jelölnek ITS1 O-36 X/9a

GTAATCGTCTTTGACGTTCTATCTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGCGCTCTGGTCGAG 60 ......................T........................T............ 60

O-36 X/9a

GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTTGCCA-GTCTGTGTTACCTCCTCGGAG 119 .................................C..TTT.C..............T.... 120

O-36 X/9a

GCACACGTTAAAGATCGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGT ...............T..............................

165 166

5,8S O-36 X/9a

AAACTTT--ACAACCGGCAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGC 58 .......CT................................................... 60

O-36 X/9a

AAATTGCGATAAAGTGATGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTG 118 ............................................................ 120

O-36 X/9a

TTGAACGCATTGCACCGCGCCCTAAACCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATT .........................T...............................

175 177

ITS2 O-36 X/9a

GTATTCCTTCGGGAGTCTTTCCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTG 60 ............................................................ 60

O-36 X/9a

GATCGTGTTCTCTCAGATGCGTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCG 120 ............................................................ 120

O-36 X/9a

TGGAGTCCCTTCGAGTTTGAGACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTCGCGTCACCAAGTCC 180 ...........T...C.............................T.............. 180

O-36 X/9a

GCGTCCTCTTGGACGTCGGTACTACAACGCA .......TC......................

211 211

A két szekvencia közti különbséget alábbi táblázatban részletezem: O-36 ~ X/9a ITS1 5,8S ITS2 összesen

transzverzió (bázis) 1 1 2

tranzíció (bázis) 7 5 12 17

inzerció/deléció (bázis) 1 2 3

eltérés 5,4 % 1,7 % 2,4 % 3,1 %

33

A X/9a ITS régiójának szekvenciájához hasonló, már leközölt adatokat a nemzetközi adatbázisokban (GenBank, EMBL) a BlastN program segítségével kerestem, majd a leghasonlóbb szekvenciával ClustalW program segítségével illesztést hajtottam végre. Egy Epulorhiza (AJ313446) faj (EPU) szekvenciája csupán 1,4 %-ban tért el (13. ábra). Ezt a gombát pedig Szingapúrban egy Diplocaulobium enosmum nevű trópusi orchidea gyökeréről izolálták.

13. ábra: A X/9a gombatörzs és az AJ313446 hivatkozási számú Epulorhiza faj (EPU) ITS régiójának összehasonlítása ClustalW program segítségével. A pontok azonos bázisokat jelölnek ITS1 X/9a EPU

GTAATCGTCTTTGACGTTCTATTTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGTGCTCTGGTCGAG 60 ............................................................ 60

X/9a EPU

GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTCGCTTTGCCTGTGTTACCTCCTTG-GA 119 ........................C............................T..TC.. 120

X/9a EPU

GGCACACGTTAAAGATTGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGT ................C..............................

166 167

5,8S X/9a EPU

AAACTTTCTACAACCGGCAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGC 60 ............................................................ 60

X/9a EPU

AAATTGCGATAAAGTGATGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTG 120 ............................................................ 120

X/9a EPU

TTGAACGCATTGCACCGCGCCCTAATCCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATT ......................C..................................

177 177

ITS2 X/9a EPU

GTATTCCTTCGGGAGTCTTTCCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTG 60 .......................................T.................... 60

X/9a EPU

GATCGTGTTCTCTCAGATGCGTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCG 120 ............................................................ 120

X/9a EPU

TGGAGTCCCTTTGAGCTTGAGACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTTGCGTCACCAAGTCC 180 .............................................C.............. 180

X/9a EPU

GCGTCCTTCTGGACGTCGGTACTACAACGCA ...............................

211 211

34

A két szekvencia közti különbséget alábbi táblázatban részletezem: X/9a ~ EPU ITS1 5,8S ITS2 összesen

transzverzió (bázis) 1 1

tranzíció (bázis) 3 1 2 6 8

inzerció/deléció (bázis) 1 1

eltérés 3,0 % 0,6 % 0,9 % 1,4 %

A VII/17d jelű törzs rokonsági viszonyának kiderítését is a BlastN program segítségével végeztem el. Egy Ceratobasidium (AF472285) faj (CER) bizonyult a leghasonlóbbnak, melynek anamorf alakja egy Rhizoctonia faj (14. ábra). Szekvenciája 10,4 %-ban tért el az általam izolált gomba ITS régiójának szekvenciájától (Az ITS1 régió első 16 bázisa, valamint az ITS2 régió utolsó 9 bázisa hiányzik a Ceratobasidium sp. esetében). Ezt a gombát pedig Puerto Ricoban egy epifiton Psychilis monensis nevű trópusi orchidea gyökeréről izolálták.

14. ábra: A VII/17d gombatörzs és az AF472285 hivatkozási számú Ceratobasidium faj (CER) ITS régiójának összehasonlítása ClustalW program segítségével. A pontok azonos bázisokat jelölnek ITS1 VII/17d CER

TGAATAAATTTAGAGTTGGTTGTTGCTGGCTTTAATACCTGAAGCATGTGCACACCTTCT 60 ----------------.......A......C.CCT.G--..GG................. 42

VII/17d CER

CTTTAATCCACACACCCCTGTGAACTTGTGAGGCAGTAAGGGAGAGAGGTCTTTAACCGG 120 ....C..........A................A...----...A..G..G.C....TT.. 98

VII/17d CER

GCCTGATCCTTTGCTGCCTGCTTAATT-ACACAAACTCATTTTATTTTAAACTGAATGTA 179 CTT.T..TT..CC...T..A.......T..............-................. 157

VII/17d CER

AATTGATGTAACGCATCATTTAATTAC .-......................-..

206 182

35

5,8S VII/17d CER

AAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 60 T........................................................... 60

VII/17d CER

AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 120 .................................................T.......... 120

VII/17d CER

TTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCAT ....C...............................

156 156

ITS2 VII/17d CER

GAAATTCTCAAAGTAAAATCTTTTTGTTAATTCAATTGGTTTGACTTTGGACTTGGAGGT 60 .................--TC.................AC..T................. 58

VII/17d CER

CTTTGCAGATTTAATTATCTGCTCCTCTTAAATTTATTAGCTGGATCTCAGTATATGCTT 120 ......G....A.--............................................. 116

VII/17d CER

GGTTCCACTCGGCGTGATAAGTTATCACTCGCTGAGGACACTTGTAATAAAGTGGCCAGG 180 .........................................C-....-..G......... 174

VII/17d CER

AAATGCAGATGAACCGCTTCTAATGGTCTATTAAATTAGACAAAATTTAATTTCAAGA ....A...................A..................---...---------

238 220

A két szekvencia közti különbséget alábbi táblázatban részletezem: VII/17d ~ CER ITS1 5,8S ITS2 összesen

transzverzió (bázis) 9 1 2 12

tranzíció (bázis) 18 2 9 29 60

inzerció/deléció (bázis) 10 9 19

eltérés 19,4 % 1,9 % 8,7 % 10,4 %

A X/9a és a VII/17d jelölésű gombatörzsek szekvenciái több mint 50 %-os eltérést mutatnak, ami már a ClustalW programmal való kiértékelést is megkérdőjelezi szekvencia illesztési problémák miatt.

36

Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérlet eredményei A L. loeselii magok csírázását megelőző nyugalmi periódus ideje jóval meghaladta a terresztris orchideák többségénél tapasztalható egy hónapos időtartamot, ugyanis csak két hónappal a magvetést követően indult meg a csírázás folyamata és ekkor is csak a DEB és F táptalajokon. ZAK és DK táptalajokon pedig csak a vetést követő ötödik hónapban kezdtek csírázni a magok és ekkor is nagyon kis arányban. Fél évvel a vetést követően, mikor további csírázást már nem tapasztaltam, állapítottam meg a csírázási arányokat és a csírázás folyamán elhalt protokormok százalékos arányait (16. ábra).

15. ábra: F táptalajon növő Liparis loeselii magonc

37

16. ábra: Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérlet eredménye

100 90 80

csírázási %

70 60 50 40 30 20 10 0 M

M

- 20°C

M

M

- 20°C F

elhalt protokorm

DEB

M

M

- 20°C DK

összes csírázott mag

M

M

- 20°C ZAK

M = mosás

A sterilizálását követően desztillált vízzel mosott magvaknál (M) F táptalajon a magvak csírázása igen magas, 72-81 %-os volt, akár alkalmaztam –20 oC-os két hetes hidegperiódust magvetés előtt, akár nem. A csírázás folyamán elhalt protokormok aránya pedig mindkét kezelési körülmény között 28-30 %-os volt. Ezzel szemben ugyancsak F táptalajon a vetés előtt mélyhűtött, de a sterilizálást követően nem mosott magvak csak 16 %-ban csíráztak és nagy részük el is halt. F táptalajra vetett nem mélyhűtött és nem mosott magvaknál a csírázási arány közel 90 %-os volt, de a fejlődő protokormok 50 %-a elhalt. A táptalajjal érintkező

38

életben

maradt

protokormok

mindegyike differenciálódott (15. ábra), azonban a lombik falára tapadt magok csak a protokorm állapotig jutottak el a fejlődésükben (17. ábra).

17. ábra: Az üveg falára tapadt csírázó magok

DEB táptalajon a sterilizálást követően közvetlenül elvetett magok csíráztak jobban: a vetés előtt két hétig mélyhűtött magok 73 %-a, míg a hideg előkezelés nélkül vetett magok 83 %-a csírázott. A sterilizálást követően mosott magvak lényegesen kisebb csírázást mutattak: a 20oC-os előkezelést kapott magvak 39 %-a, míg a nem mélyhűtött magvak 24 %-a csírázott. A protokormok elhalása DEB táptalajon lényegesen kisebb volt, mint F táptalajon, 4 % körüli, a nem mélyhűtött és nem mosott magoknál

17

differenciálódása

%-os.

A

minden

protokormok esetben

bekövetkezett, azonban a magoncok fényre kerülve is sokáig etioláltak maradtak és fejlődésük az F táptalajon növő növénykékhez képest elmaradt (18. ábra). 18. ábra: DEB táptalajon növő L. loeselii protokormok

39

A két kókusztejet tartalmazó táptalajon (DK, ZAK) csak a mélyhűtéssel előkezelt magoknál volt megfigyelhető alacsony arányú csírázás, a nem mélyhűtött magok pedig egyáltalán nem csíráztak. DK táptalajon csak a mélyhűtött, nem mosott magvak 19 %-a képzett protokormot és 2 %-os volt az elhalás. ZAK táptalajon 7-9 %-os volt a mélyhűtött magok csírázása és a protokormok elhalása szinte elhanyagolható volt. A magvetés után egy évvel a tíz hónapos magoncok spontán gyökerezése is elindult F táptalajon. A fejlődő gyökér az aktív hajtáseredetű tápanyag-raktározó szerv, az álgumó (pseudobulbus) elődjének tekinthető gömbszerű képlet alapi részén jelent meg (19. ábra).

19. ábra: Tíz hónapos gyökerező L. loeselii magonc

40

A második aszimbiotikus csíráztatási kísérlet eredményei A L. loeselii magok sötétben és szobahőmérsékleten levő tenyészetekben Fast és Debergh táptalajokon a vetést követő ötödik héten kezdtek csírázni. MS, MS1/2 táptalajokon a csírázás folyamata a hatodik héten, míg a citokinin tartalmú MS1/2+BA táptalajon a tizedik héten kezdődött (21. ábra). A protokormok minden esetben rhizoidszőröket növesztettek (20. ábra). A sötétben és a vetést követően egy hónapig hűtőszekrényben (4-6 oC) tartott tenyészetekben a hidegkezelést követő hatodik héten, tehát a vetést követő tizedik héten indult meg a csírázás folyamata (22. ábra). A fényen és szobahőmérsékleten levő magok ugyancsak a vetést követő tizedik héten kezdtek csírázni, kivéve az F táptalajon levő magokat, ahol egy hetes késéssel, azaz csak a tizenegyedik héten indult a protokorm képzés (23. ábra).

20. ábra: Rhizoidos protokorm DEB táptalajon

41

21. ábra: Csírázás sötétben és szobahőmérsékleten, ötféle táptalajon

22. ábra: Csírázás sötétben, egy hónapos hidegkezelést követően, ötféle táptalajon

42

23. ábra: Csírázás fényen, szobahőmérsékleten, ötféle táptalajon

5. táblázat: Csírázási paraméterek a vetés utáni 120. napon Kezelés

Táptalajok

Fast Debergh Sötét + o MS1/2 24 C MS1/2+BA MS Fast Debergh Sötét + 4-6oC MS1/2 (1hónapig) MS1/2+BA MS Fast Debergh Fény + o MS1/2 24 C MS1/2+BA MS

Párhuzamos minták száma 4 4 4 4 3 3 3 2 3 3 3 1 3 3 3

Csírázási %ok átlaga 40,5 29,4 23,3 10,8 3,4 32,7 27,6 8,1 1,0 4,2 0,6 19,3 5,1 5,1 2,4

Std. hiba 13,92 3,02 6,14 2,10 0,36 18,05 1,02 1,38 0,24 2,16 0,26 0,00 2,02 4,14 0,18

A csírázás folyamatának lecsengését követően, a magvetés utáni 120. napon tapasztalt csírázási arányokat a 5. táblázatban foglaltam össze. Sötétkezelés (szobahőmérséklet és egy hónapos hidegkezelés) során Fast táptalajon kaptam a legnagyobb csírázási arányokat (40,5

43

%, 32,7 %). Debergh táptalajon valamivel kisebb, de mindkét esetben 25 % feletti csírázást tapasztaltam. MS1/2 táptalajon a 24 oC-on tapasztalt 23,3 %-os csírázáshoz képest a hidegkezelés visszavetette a csírázást 8,1 %-ra. A citokinin tartalmú táptalajon is hasonló csökkenés volt megfigyelhető a magvak csírázási arányaiban, de ezek mindkét esetben alatta maradtak az MS1/2 táptalajon tapasztalt arányoknak (23,3 % - 8,1 %). MS táptalajon mindkét esetben 5 % alatti csírázási százalékot kaptam. Fényen való csírázást Fast táptalajon alig tapasztaltam (0,6 %). A legnagyobb mértékű csírázás Debergh táptalajon történt (19,3 %), ami azonban jóval a sötétben tapasztalt csírázás alatt maradt. MS1/2 táptalajokon citokinin tartalomtól függetlenül kismértékű csírázás volt tapasztalható (5,1 %). A sötétben tapasztalt 5 % alatti (2,4 %) csírázási százalékot kaptam MS táptalajon. magokkal

A

sötétben

ellentétben

a

csírázó fejlődő

protokormok nagy része zöld az egyes tartalmú

táptalajokon, táptalajon

a

citokinin

(MS1/2+BA)

pedig már a magok nagy része is megzöldült (24. ábra). 24. ábra: MS1/2+BA megzöldült magok

táptalajra

vetett

fényen

A desztillált vízbe vetett magok nem csíráztak se fényen, se sötétben, szobahőmérsékleten és hidegkezelés hatására sem.

44

A szimbiotikus előkísérlet eredményei A P (Pfeffer) táptalajra helyezett szűrőpapírra oltott szimbionta gombák jóval lassabban növekedtek, mint a fenntartó PDA táptalajon. A VII/17d jelzésű Ceratobasidium sp. gyorsabban nőtt és sűrűbben szőtte át a táptalaj felszínét, mint a X/9a jelzésű Epulorhiza sp. A gomba hifák 3-4 hét alatt szőtték be a táptalajok felszínét. Öt héttel a gombák P táptalajra oltása után, az első aszimbiotikus kísérletben DEB táptalajon csíráztatott sok rhizoiddal rendelkező csíranövényeket helyeztem el az átszövetett táptalajok felszínére. Már egy héttel a növények P táptalajra helyezése után megfigyelhető volt, hogy a gombák intenzíven átszőtték a csíranövényeket.

A

VII/17d

jelzésű

Ceratobasidium sp. fokozott légmicélium képzése főleg a L. loeselii csíranövények átoltásakor a táptalaj felszínére került DEB táptalajdarabok környékén volt megfigyelhető, valamint jól láthatóvá vált cellulózbontó aktivitásuk (25. ábra).

25. ábra: A Ceratobasidium sp. a szénforrásául szolgáló szűrőpapírt (balra fent) intenzíven bontotta Egy hónappal az aszimbiotikusan előnevelt L. loeselii magoncok szimbionta gombával átszövetett P táptalajra helyezése után hajtásuk alapi részén egy sötétzöld osztódási zóna alakult ki, csúcsukon levél primordiumokkal (26. és 27. ábra).

45

26. és 27. ábra: Intenzíven osztódó zóna a hajtás alapi részén, melybe gombafonalak futnak. A filcszerű gombaszövedéken átnövő hajtás levélprimordiumokkal

A szimbiotikus csíráztatási kísérlet eredményei A P táptalajok egy részére a magvetést követően szimbionta gombát (VII/17d, X/9a) oltottam, bár a magok ekkor még nem kezdtek el csírázni. A szimbionta gombák két héttel a magokat tartalmazó P táptalajra oltásuk után körbenőtték a magok nagy részét. A csírázás csak három hónappal a vetést követően indult meg csak a szimbionta gombát tartalmazó táptalajon és ekkor is csak nagyon kis mértékben. A gomba hifái sugárirányból nőttek a csírázó magokhoz (28. ábra).

46

28. ábra: A csírázó L. loeselii maghoz sugárirányból futó gombahifák

47

Eredmények értékelése

A szekvenciaanalízis eredményeinek értékelése A Liparis loeselii gyökeréről két különböző szekvenciájú gomba izolátummal rendelkezünk. A csehországi egyedről izolált O-318 és O-36 jelölésű, szekvenciájukban teljesen megegyező gombatörzsek 3,1 %-os eltérése a velencei-tavi egyedről izolált gomba (X/9a) ITS régiójának szekvenciájától azonos nemzetségbe tartozó két különböző fajú gombára utal. Az azonos nemzetséghez tartozást támasztja alá az 5,8S rRNS szekvenciájának nagyfokú egyezése, ugyanis csak egy darab 2 bp hosszú szakasz inzerciója és egy A-T csere a két szekvencia közti különbség. A X/9a rendszertani besorolását célzó vizsgálat érdekes eredményt hozott. Kisebb szekvenciabeli különbséget (1,4 %) találtam egy trópusi orchidea, Diplocaulobium enosmum gyökerérő izolált Epulorhiza faj és a X/9a jelű L. loeselii gyökeréről izolált gomba között, mint a L. loeselii gyökeréről izolált különböző szekvenciájú szimbionta gombák között, ahol a fent említett 3,1 %-os eltérést kaptam. Ez az eredmény egyértelműen bizonyítja a L. loeselii gyökeréről izolált gombák Epulorhiza nemzetséghez való tartozását és szoros rokonsági viszony meglétére utal mérsékelt övi és trópusi orchideák szimbionta gombái között. A szimbiotikus csíráztatási kísérleteimben alkalmazott Dactylorhiza incarnata gyökeréről izolált, VII/17d jelölésű szimbionta gombatörzs már morfológiájában is kissé eltért a X/9a, O318, O-36 jelölésű gomba törzsektől, jobban mutatva az elsőként orchidea szimbiontákként leírt Rhizoctonia fajok morfológiai jegyeit. Ezen morfológiai bélyegeken alapuló feltételezést támasztotta alá a szekvenciaanalízis is, melynek eredményeképpen a Rhizoctoniák teleomorfjaiként azonosított Ceratobasidium nemzetség egyik faja áll közeli rokonságban a vizsgált gombatörzzsel.

48

Az aszimbiotikus csíráztatási kísérletek eredményeinek értékelése A csírázási folyamat leglényegesebb pontja a papírszerű maghéj, a teszta víz által átjárhatóvá tétele. Az ún. száraz vetés, mikor a még fel nem nyílt magtokból a steril magokat közvetlenül a táptalaj felszínére vetjük a korábbi tapasztalatok szerint, mint sok más orchidea fajnál, a L. loeselii-nél sem alkalmazható, ugyanis a magok nem képesek felvenni a csírázásukhoz elegendő vizet. Ezért alkalmaztam a klórmeszes sterilizálási módszert, melynél nem csak a magok felülete sterilizálódik, hanem roncsolódik a külső maghéj és így víz által átjárhatóvá válik. Ennek a hatásnak a növelésére alkalmaztam a magok egy részénél a vetést megelőző kéthetes mélyhűtést az első csíráztatási kísérletben, kihasználva a fagyással járó mechanikai roncsolódást. Szignifikáns különbség azonban nem volt kimutatható a mélyhűtéssel előkezelt és a kezelést nem kapó magvak csírázásában. A sterilizáló klórmész oldat magok felületéről való desztillált vizes lemosása az első csíráztatási kísérletben eltérő eredményt hozott az egyes táptalajokon. F táptalajon a magok mosása jótékony hatásúnak bizonyult, ugyanis a mosott magvak csírázási aránya magas volt (72-81 %), míg a nem mosott (+mélyhűtött) magoké alacsonyabb (16 %), ezek nagy része el is halt, csakúgy mint a nem mosott és nem mélyhűtött magok esetében, ahol bár nagy arányú csírázást tapasztaltam, a protokormok fele elpusztult. DEB táptalajon viszont a nem mosott magok csíráztak jobban, a protokormok elhalásában pedig nem volt számottevő különbség. A két táptalajon tapasztalt eltérő eredményeket okozhatta a táptalajok eltérő összetétele, vagyis a magok felszínén a táptalajra jutó klórmész oldat különböző módon kötődhetett le vagy diffundálhatott el a magok környezetéből. Az egyenetlen csírázást azonban okozhatta többek között a Stephan (1988) által leírt tény is, hogy a belső burok magvanként eltérően alakul ki. A lombik falára tapadt és F táptalajjal nem is érintkező magok kis méretű protokormmá fejlődése Eiberg (1969) megállapításait látszott igazolni, aki szerint néhány orchideafaj magjai kizárólag vizet igényelnek a csírázáshoz. A második csíráztatási kísérletemben a

49

desztillált vízbe vetett magok csírázásának elmaradása azonban nem támasztotta alá Eiberg (1969) állítását a L. loeselii esetében. Az első csíráztatási kísérletben kapott protokorm képzés pedig azzal magyarázható, hogy az üveg falán levő vízcseppek feltételezhetően a táptalaj sterilizálása során kerültek a lombik falára, így tartalmazzák a táptalaj komponenseit. A kókusztej egyértelműen gátló hatásúnak bizonyult, ugyanis nemcsak a ZAK táptalajon nem következett be számottevő csírázás, hanem a DK táptalajon sem, amely csak a kókusztej hozzáadásában tért el a DEB táptalajtól, melyen jelentős számú mag csírázott ki. A második csíráztatási kísérletben a citokinin adása gátolta hasonlóképpen a csírázást, ezért lehetséges, hogy a kókusztej citokinin aktivitású komponensei miatt alakult ki a gátlás. Ez ellentmond Steele (1995) közlésének, mely szerint a táptalajban levő citokinin elengedhetetlen az érett magok megfelelő csírázásához. A DEB és F táptalajokon tapasztalt igen magas csírázási arányok feltételezhetően összefüggésben vannak a szervetlen nitrogénforrás helyett alkalmazott kazeinnel, peptonnal és élesztőkivonattal, melynek pozitív hatásáról Hansel-Hintner (1996) is beszámol. A második csíráztatási kísérlet is ezt a feltételezést támasztja alá, ahol ugyancsak markáns különbség volt megfigyelhető a csak szervetlen nitrogént tartalmazó MS és MS1/2 valamint a DEB és F táptalajokon tapasztalt csírázási százalékokban. A protokormok elhalási aránya eltérő volt az F és DEB táptalajokon, ennek egyik oka lehet, hogy a sterilizáló oldat a magok környezetében marad, de magyarázni lehet a két táptalaj eltérő makroelem szintjével. Az F táptalaj komplexebb és nagyobb mennyiségű makroelemet tartalmaz, mint a DEB táptalaj. A második csíráztatási kísérletben pedig a csírázásra kifejtett jótékony hatása figyelhető meg a makroelem szint csökkentésének, ezen belül pedig a szervetlen nitrogénforrásnak, mely Hansel-Hintner (1996) szerint gátolja az európai orchideák csírázását. MS1/2 táptalajon egy nagyságrenddel nagyobb csírázást tapasztaltam, mint MS táptalajon.

50

A második csíráztatási kísérletben a magok egy részénél alkalmazott egy hónapos hidegkezelés a csírázást megelőző nyugalmi periódust megnyújtotta, de a vetés utáni 120. napra ez a csírázási arányban mutatkozó különbség szinte teljesen eltűnt, vagyis szinkronizálódott a magok csírázása. A fényen bekövetkezett csírázás, valamint a protokormok azonnali megzöldülése fény hatására

(29.

orchideafajoknál

ábra) eddig

európai

nem

tapasztalt

jelenség. Fast (1978) szerint a legtöbb európai csíráznak,

orchideafaj a

magjai

sötétben

protokormok

klorofillmentesek, fényen sem zöldülnek meg, ily módon a növények akkor lesznek autotróffá, mikor az első lomblevelük kifejlődik (30. ábra). 29. ábra: Liparis loeselii protokorm

Trópusi orchideáknál azonban a fényen való csírázás és fény hatására bekövetkező azonnali protokorm

zöldülés

általános

jelenség.

További párhuzam a L. loeselii és trópusi rokonai között a protokorm kis mérete és a kevés rhizoidszőr kialakulása.

30. ábra: Orchis laxiflora ssp. palustris protokorm

51

A szimbiotikus kísérletek eredményeinek értékelése A két gombatörzzsel átszövetett P táptalajra helyezett Liparis loeselii magoncok bár az átoltás következtében legyengültek, megálltak fejlődésükben, de a gomba általi parazitáltság csak néhány esetben volt tapasztalható. Egy hónapos nyugalmi periódus után pedig újra növekedésnek indultak. Ekkor a magoncok még egészen világoszöldek voltak, fotoszintézisük még nem szolgálhatott a továbbnövekedéshez szükséges szénforrásul, a táptalaj pedig egészen minimális mennyiségű (1 g/l) glükózon kívül nem tartalmazott szerves komponenseket, így a gombapartner cellulóz bontásából származó szerves vegyületek voltak a L. loeselii magoncok egyetlen szénforrása. A X/9a és a VII/17d jelölésű gombatörzs esetében is újraindult a L. loeselii magoncok fejlődése, tehát mindkét gomba alkalmasnak bizonyult a szimbiotikus kapcsolat kialakítására. Ahogyan a desztillált vízben való csíráztatási kísérlet negatív kimenetele, úgy a szimbiotikus csíráztatási kísérletben tapasztalható csírázás elmaradása is azt bizonyítja, hogy milyen nagy szerepe van a csíráztató tápközegnek a L. loeselii esetében. Ezt a negatív hatást ellensúlyozta a szimbionta gomba, amely így nemcsak a protokorm állapoton való továbblendülést segítette, hanem már a csírázás kezdeti lépéseiben is elengedhetetlennek bizonyult P táptalajon. Az orchidea és a szimbiontája között kialakult kapcsolat mikroszkópos morfológiai vizsgálata folyamatban van.

52

Összefoglalás

A hagymaburok (Liparis loeselii (L.) Rich) fokozottan védett lápi orchideánk. Három hazai előfordulása ismert: a kis-tómalmi láprét (Sopron), a Soroksári-Duna úszólápjai, valamint a Velencei-tavi úszólápok. A faj aktív védelemre szorul, melyet ex situ (élőhelyen kívüli) kultúra létrehozásával valósíthatunk meg. Orchideák generatív szaporítását kétféle módon végezhetjük el. Az aszimbiotikus szaporítás a szimbionta gomba felhasználása nélkül történik. Szimbiotikus növényneveléskor pedig a csírázó orchidea és a szimbionta gomba (Rhizoctonia) közös kultúrába kerül. A kiültetés szempontjából a szimbiotikus nevelés az előnyösebb, a tapasztalatok szerint ugyanis ekkor több növény marad életben.

Az

aszimbiotikus csíráztatási kísérletekben a magok sterilizálásának körülményeit, a makroelem szintet, szerves nitrogénforrás és citokinin hatását, valamint a csírázás fény- és hőmérsékletigényét vizsgáltam. A vizsgálatban alkalmazott nyolcféle táptalaj: MS, MS1/2, MS1/2+BA, Fast, Debergh, módosított Debergh, ZAK. A magas makroelem szint és a citokinin gátolta a csírázást, míg a szerves nitrogénforrás serkentően hatott rá. Az aszimbiotikusan előnevelt Liparis loeselii csíranövényeket két szimbionta gombával közös kultúrába vittem. A szimbionta gombatörzsek nemzetségi szintű azonosítását PCR technikán alapuló szekvenciaanalízissel végeztem el, melyben a genomiális ITS régiót vizsgáltam. Az egyszerű cukrokban gazdag aszimbiotikus táptalajok helyett a gomba szénforrását cellulóz biztosította, ennek köszönhetően alakult ki köztük a szimbiózis. A szimbiotikus csíráztatás folyamán a gomba serkentően hatott a csírázásra, de a csírázás mértéke így is alulmaradt az aszimbiotikus kísérletekben tapasztaltakhoz képest. A Liparis loeselii aszimbiotikusan és szimbiotikusan fejlődő protokormjainak kis mérete, fény hatására egészen korai zöldülésük és a protokormok kevés rhizoidszőre is a faj szoros trópusi rokonságára utal. Az említett jelenségek talán jobban érthetők, ha figyelembe vesszük, hogy a

53

L. loeselii É-Amerikai rokonával, a L. liliifolia-val egyedüli mérsékelt övi fajai a több mint 200 fajt számláló Liparis nemzetségnek, melyek trópusi, szubtrópusi talajlakó és epifiton orchideák. Lehetséges, hogy a vizsgált faj hatékony tenyésztésének kidolgozását a trópusi orchideák szaporításánál szerzett tapasztalatok jobban elősegítik majd.

Summary

Asymbiotic and symbiotic germination of rare and protected terrestrial orchid Liparis loeselii were studied. Germination array was tested on different asymbiotic media in dark and light and effect of cold-treatment was also investigated. Presence of cytokinin and high macroelement levels in media inhibited the protocorm development, while presence of organic nitrogen resources stimulated it. On the symbiotic medium Pfeffer agar germination was not detected without the symbiotic fungal partner, which is obligatory for germination. Followed the infection of asymbiotically-germinated seedlings by symbiotic fungi, parasitism was not experienced, the seedlings showed further growing. Fungal partners were identified by the DNA-based method ITS sequence analysis. Germination in light and early greening of protocorms refer to close relationship with tropical species, which are the greatest part of genus Liparis. My results pointed out that the experiences of breeding of tropical orchids might help the development of effective growing of Liparis loeselii.

54

Irodalomjegyzék Altschul S. F., Madden T. L., Schäffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D. J. 1997: Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 3389-3402. Andersen T. F., Stalpers J. A. 1994: A checklist of Rhizoctonia epithets. Mycotaxon. 51: 437457. Arditti J., Michaud J. D., Healey P. L. 1979: Morphometry of orchid seeds. I. Native California and related species of Cypripedium. Am. J. Bot. 60: 1129-1139. Arditti J., Ernst R. 1984: Physiology of germinating orchid seeds. In: Arditti, J. (ed.): Orchid Biology: reviews and perspectives, III. Cornell University Press, Ithaca pp. 177-222. Balogh M., Bratek Z., Illyés Z., Zöld-Balogh Á. 2002: A Liparis loeselii (L.) Rich. tömeges előfordulása a Velencei-tavon. Kitaibelia 7: 247. Beyrle H., Penningsfield F., Hock B. 1991: The role of nitrogen concentration in determining the outcome of the interaction between Dactylorhiza incarnata (L.) Soó and Rhizoctonia sp. New Phytol. 117: 665-672. Borris 1969: Samenvermehrung und Anzucht europaischer Erdorchideen. In Proceeding of the 2nd European Orchid Congress, Paris pp. 74-80. Bruns T. D., White T. J., Taylor J. W. 1991: Fungal molecular systematics. Annu. Rev. Ecol. Syst. 22: 525-564. Clements M. A. 1988: Orchid mycorrhizal associations. Lindleyana 3: 73-86. Currah R. S., Smreciu E. A., Hambleton S. 1989: Mycorrhizae and mycorrhizal fungi of boreal species of Platanthera and Coeloglossum (Orchidaceae). Can. J. Bot. 68: 11711181. Currah R. S., Zettler L. W., Mcinnis T. M. 1997: Epulorhiza inquilina sp. nov. from Platanthera (Orchidaceae) and a key to Epulorhiza species. Mycotaxon LXI, pp. 335342. Eiberg H. 1969: Keimung europaischer Orchideen. Die Orchidee 20: 266-270. Eszéki E. 1996: Trópusi orchideák aszimbiotikus mikroszaporítása az ELTE Botanikus Kert laboratóriumában. Orchidea 1996: 24-27. Eszéki E., Györváry A. 2000: A Knudson C táptalaj optimalizálására az orchidea mikroszaporításban. Lippai János & Vas Károly Tudományos Ülésszak 2000. november 6-7. Dízsnövénytermesztés II. Üvegházi Termesztés Szekció. p. 130.

55

Fast G. 1976: Möglichkeiten zur Massenvermehrung von Cypripedium calceolus und anderen europaischen Wildorchideen. Proc. 8th World Orchid Conf., Frankfurt, pp. 359-363. Fast G. 1978: Über das Keimverhalten europaischer Erdorchideen bei asymbiotischer Aussaat. Die Orchidee 29: 270-274. Gardes M., White T. J., Fortin J. A., Bruns T. D., Taylor J. W. 1991: Identification of indigenous and introduced symbiotic fungi in ectomycorrhizae by amplification of nuclear and mitochondrial ribosomal DNA. Can. J. Bot. 69: 180-190. Gonzalez D., Carling D. E., Kuninaga S., Vilgalys R., Cubeta M. A. 2001: Ribosomal DNA systematics of Ceratobasidium and Thanatephorus with Rhizoctonia anamorphs. Mycologia 93: 1138-1150 Hadley G., Williamson B. 1971: Analysis of the post-infection growth stimulus in orchid mycorrhiza. New Phytol. 70: 445-455. Hall I. R. 1976: Vezicular arbuscular mycorrhizas in the orchid Corybus macranthus. Trans. Brit. mycol. Soc. 66: 160. Hansel-Hintner A. 1996: In vitro Kultur von Cypripedium calceolus L. und Dactylorhiza majalis (Rchb.). Die Orchidee 47:197-203. Harley J. L., Smith S. E. 1983: Orchid mycorrhizas. In: Mycorrhizal Symbiosis. pp. 268-295. Academic Press. London, New York Hibbett D. S. 1992: Ribosomal RNA and fungal systematics. Trans. mycol. Soc. Japan 33: 533-556. Jámborné B. E. (szerk.) 1993: Dísznövények mikroszaporítása. Jegyzet. Kertészeti- és Élelmiszeripari Egyetem. Budapest. Kårén O., Högberg N., Dahlberg A., Jonsson L., Nylund J.-E. 1997: Inter- and intra-specific variation in the ITS region of rDNA of ectomycorrhizal fungi in fennoscandia as detected by endonuclease analysis. New Phytol. 136: 313-325. Kishi F., Takagi K. 1997: Analysis of medium components used for orchid tissue culture. Lindleyana 12: 158-161. Knudson L. 1946: A new nutrient solution for the germination of orchid seed. Am. Orch. Soc. Bull. 15: 214-217. Kuninaga S., Natsuaki T., Takeuch T., Yokosawa R. 1997: Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Curr. Genet. 32: 237-243.

56

Mándy A. 1987: Természetes növekedésserkentők hatása orchideák és más dísznövények szövettenyészeteire. Kandidátusi értekezés. Kertészeti- és Élelmiszeripari Egyetem. Budapest. Mante S., Scorza R., Cordts J. M. 1989: Plant regeneration from cotyledons of Prunus persica, Prunus domestica and Prunus cerasus. Pl. Cell Tissue Org. Cult. 19: 1-11. Maróti M. 1976: A növényi szövettenyésztés alapjai. Bp. Akadémiai Kiadó. Masuhara G., Katsuya K., Yamaguchi K. 1993: Potential for symbiosis of Rhizoctonia solani and binucleate Rhizoctonia with seed of Spiranthes sinensis var. amoena in vitro. Myc. Res. 97: 746-752. Mitchell J. I., Roberts P. J., Moss S. T. 1995: Sequence or Structure? A short review on the application of nucleic acid sequence information to fungal taxonomy. Mycologist, Vol. 9, Part 2, May 1995. Moore R. T. 1987: The genera of Rhizoctonia-like fungi: Ascorhizoctonia, Ceratorhiza gen. nov., Epulorhiza gen. nov., Moniliopsis, and Rhizoctonia. Mycotaxon 29: 91-99. Murashige T., Skoog F. 1962: A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 155: 473-497. Niewieczerzalowna B. 1932: Studja morfologiczne nad mykorrhiza storczykow krajowych. Compt. Rend. Soc. Sci. Varsovie 25: 86-115. Overbeek van J., Conklin M. E., Blakeslee A. F. 1941: Factors in coconut milk essential for growth and development of very young Datura embryos. Science 94: 350-351. Pearson W. R., Lipman D. J. 1988: Improved tools for bio-logical sequence comparison. Proceedings of Natural Academy of Sciences USA 85: 2444–2448. Peterson R. L., Currah R. S. 1990: Synthesis of mycorrhizae between protocorms of Goodyera repens (Orchidaceae) and Ceratobasidium cereale. Can. J. Bot. 68: 1117-1125. Purves S., Hadley G. 1976: The physiology of symbiosis in Goodyera repens. New Phytol. 77: 689-696. Rasmussen H. N. 1990: Cell differentiation and mycorrhizal infection in Dactylorhiza majalis (Rchb.) Hunt & Summerh. (Orchidaceae) during germination in vitro. New Phytol. 116: 137-147. Rasmussen H. N., Andersen T. F., Johansen B. 1990: Temperature sensitivity of in vitro germination and seedling development of Dactylorhiza majalis (Orhidaceae) with and without a mycorrhizal fungus. Plant Cell Environ. 13: 171-177. Richter W. 1982: Orchideen: Pflegen, Vermehren, Züchten. Neumann, Radebeul.

57

Rygiewicz P. T., Armstrong J. L. 1992: Ectomycorrhizal DNA: Isolation, RFLPs and probe hybridization. In: Methods in Microbiology. Vol. 23, Norris, Read, Varma (eds.): Techniques for the Study of Mycorrhiza. Academic Press, London, pp. 253-280. Smith S. E. 1967: Carbohydrate translocation in orchid mycorrhizas. New Phytol. 66: 371378. Sneh B., Burpee L., Ogoshi A. 1991: Identification of Rhizoctonia species. Am. Phytopath. Soc. USA. pp. 59-87. Steele W. K. 1995. Growing Cypripedium reginae from seed. Amer. Orch. Soc. Bull. 64: 382391. Stephan G. 1988: Ergebnisse der asymbiotischen Samenvermehrung von Spiranthes spiralis (L. C. Rich. 1818) und eonige darüber hinausgehende Betrachtungen. Die Orchidee 39: 19-25. Stenberg M. L., Kane M. E. 1998: In vitro seed germination and greenhouse cultivation of Encyclia boothiana var. erythronioides, an endangered Florida orchid. Lindleyana 13: 101-112. Sweetingham M. W., Cruickshank R. H., Wong D. H. 1986: Pectic zymograms and taxonomy and pathogenicity of the Ceratobasidiaceae. Trans. Brit. mycol. Soc. 86: 305-311. Szendrák E., Eszéki R. E. 1993: Hazai szabadföldi kosborfélék (Orchidaceae) aszimbiotikus in vitro szaporítása. Publ. Univ. Horticult. et Ind. Aliment. 53 (Suppl): 66-70. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. 1994: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-4680. Thompson P. A. 1977: Orchids from seed. Royal Botanic Gardens, Kew, England. Van Waes J. M., Debergh P. C. 1986: In vitro germination of some Western European orchids. Physiol. Plant. 67: 253-261. Vértényi G., Bratek Z. 1996: Talajlakó orchideák mikorrhizaképző gombáinak izolálása és annak nehézségei. Mikol. Közl. 35: 31-36. Vilgalys R., Gonzalez D. 1990: Ribosomal DNA restriction fragment length polymorphism in Rhizoctonia solani. Phytopathol. 80: 151-158. Vilgalys R. 1998: Conserved primer sequences for PCR amplification and sequencing from nuclear ribosomal RNA. Vilgalys lab, Duke University http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm

Warcup J. H., Talbot P. H. B. 1980: Perfect states of Rhizoctonias associated with orchids. III. New Phytol. 86: 267-272.

58

Warcup J. H. 1988: Mycorrhizal associations of isolates of Sebacina vermifera. New Phytol. 110: 227-231. Weber Roland W. S., Webster J. 2001: Teaching techniques for mycology: 14. Mycorrhizal infection of orchid seedlings in the laboratory. Mycologist 15: 55-59. White T. J., Bruns T. D., Lee S., Taylor J. W. 1990: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols—A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc. Part 3, Chapter 38, pp. 315-322. Williamson B. 1970: Induced DNA synthesis in orchid mycorrhiza. Planta 92: 347-354. Williamson B. 1973: Acid phosphatase and esterase activity in orchid mycorrhiza. Planta 112: 149-158. Yam T. W., Weatherhead M. A. 1988: Germination and seedling development of some Hong Kong orchids. I. Lindleyana 3: 156-160. Zel J., Goala N., Camloh M. 1988: Micropropagation of Pinus sylvestris. Pl. Cell Tissue Org. Cult. 14: 169-175. Zengming Y., Zhong H. 1990: A preliminary study on the chitinase and 1,3-glucanase in corms of Gastrodia elata. Acta Bot. Yunnanica 12: 421-426.

59

Tartalomjegyzék Bevezetés............................................................................................................3 Irodalmi áttekintés ...........................................................................................5 Az Orchidea-típusú mikorrhiza .................................................................................... 5 A gombapartner morfológiája és rendszertani helyzete............................................. 6 Molekuláris biológiai módszerek az orchidea-típusú mikorrhiza kutatásában ....... 8 Az orchideák aszimbiotikus szaporításának lehetőségei .......................................... 11 Az orchideák szimbiotikus szaporításának lehetőségei ............................................ 12 Orchideák magvetésénél alkalmazott táptalajok ...................................................... 13 Orchidea magok sterilizálásának módjai................................................................... 16

Anyag és módszer ...........................................................................................18 Liparis loeselii................................................................................................................ 18 Alkalmazott szimbionta gombatörzsek ...................................................................... 18 A mikorrhizaképző gomba izolálása és az izolátumok fenntartása......................... 19 A gombatörzsek azonosítása molekuláris módszerrel .............................................. 19 DNS kivonás a gombatörzsekből ............................................................................. 19 PCR reakció és gélelektroforézis ............................................................................. 20 PCR termékek tisztítása, szekvenálás ...................................................................... 23 A szekvenciák ellenőrzése és adatbázisba helyezése ............................................... 24 Az aszimbiotikus csíráztatási kísérletekben felhasznált táptalajok......................... 25 A szimbiotikus csíráztatási kísérletben alkalmazott táptalaj................................... 25 A magok sterilizálása és vetése.................................................................................... 27 Tenyésztési körülmények............................................................................................. 27 A csíráztatási kísérletek kiértékelésének módszerei ................................................. 28

Eredmények ismertetése ................................................................................30 A szekvenciaanalízis eredményei ................................................................................ 30 Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérlet eredményei ............................................ 37 A második aszimbiotikus csíráztatási kísérlet eredményei ...................................... 41 A szimbiotikus előkísérlet eredményei ....................................................................... 45 A szimbiotikus csíráztatási kísérlet eredményei........................................................ 46

Eredmények értékelése ..................................................................................48 A szekvenciaanalízis eredményeinek értékelése ........................................................ 48 60

Az aszimbiotikus csíráztatási kísérletek eredményeinek értékelése........................ 49 A szimbiotikus kísérletek eddigi eredményeinek értékelése..................................... 52

Összefoglalás ...................................................................................................53 Angol nyelvű összefoglalás (Summary)........................................................54 Irodalomjegyzék .............................................................................................55 Tartalomjegyzék.............................................................................................60 Köszönetnyilvánítás ...................................................................................62

61

Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt köszönöm Dr. Szigeti Zoltán tanszékvezető professzor úrnak, aki lehetővé tette, hogy az ELTE TTK Növényélettani Tanszékén végezhessem munkámat, valamint Dr. Isépy Istvánnak, aki az ELTE Botanikus Kert Orchidea Laboratóriumában végzett munkámat tette lehetővé. Köszönetet mondok Dr. Bratek Zoltánnak, témavezetőmnek, aki szakmai és gyakorlati tanácsaival irányított. Szeretném megköszönni Dr. Balogh Mártonnak terepi munkámban való segítségét és terepi tapasztalatainak átadását. Hálával tartozom Tóth Attilánénak a laboratóriumi feladatok végzéséért, valamint segítőkész kedvességéért. Szakdolgozó és doktorandusz társaimnak, Szegő Dórának, Halász Krisztiánnak és Rudnóy Szabolcsnak köszönöm sokrétű és nélkülözhetetlen segítségüket. Végezetül köszönetemet fejezem ki Eszéki Eszternek, aki az orchideák szaporításának számos laboratóriumi technikájára tanított meg.

62