A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója cink és paraquat tesztben és nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása

Szent István Egyetem GödöllĘ

A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója cink és paraquat tesztben és nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása

Doktori értekezés

Bittsánszky András

GödöllĘ 2005

A doktori iskola megnevezése:

SZIE Növénytudományi Doktori Iskola

tudományága:

Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok

vezetĘje:

Dr. Virányi Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Szent István Egyetem Növényvédelemtani Tanszék

doktori program:

Növénynemesítés Genetikai és Biotechnológiai Módszerekkel

programvezetĘ:

Dr. Heszky László egyetemi tanár, az MTA tagja Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék

témavezetĘ:

Dr. Gyulai Gábor egyetemi docens, a biológiai tudományok kandidátusa Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék

........................................................... Dr. Virányi Ferenc doktori iskola vezetĘje

........................................................... Dr. Gyulai Gábor témavezetĘ

3

Tartalomjegyzék

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés és célkitĦzés .........................................................................................5 1.1. A téma aktualitása, jelentĘsége ................................................................................5 1.2. A kutatás célkitĦzései ...............................................................................................8

2. Irodalmi áttekintés ...............................................................................................9 2.1. Az abiotikus stressz ..................................................................................................9 2.2. Nehézfémstressz .....................................................................................................10 2.3. A paraquat stressz...................................................................................................11 2.4. A stressz hatása a klorofill fluoreszcenciára...........................................................12 2.5. A glutation és szerepe a stressz elleni védekezésben .............................................14 2.6. A glutation S-transzferáz enzimrendszer................................................................17 2.7. A nyárfa biológiája és nemesítése ..........................................................................19 2.8. A nyár, mint biotechnológiai modellnövény ..........................................................21 2.9. A glutation anyagcsere módosítása nyárfában .......................................................26 2.10. Nyárfa alkalmazása a fitoremediációban................................................................28 2.11. Mikroszatellita (SSR) elemzés ...............................................................................30 2.12. Szomaklonális variabilitás nyár fajokban...............................................................32

3. Anyag és módszer...............................................................................................35 3.1. Táptalajok ...............................................................................................................35 3.2. Molekuláris biológiai módszerek ...........................................................................36 3.2.1 DNS-izolálás ............................................................................................................... 36 3.2.2 RNS izolálás, cDNS szintézis...................................................................................... 36

3.3. Növényanyag..........................................................................................................38 3.4. In vitro szaporítás és fenntartás ..............................................................................41 3.5. A transzgén stabilitásának kimutatása....................................................................42 3.6. A transzgén expressziójának kimutatása ................................................................44 3.7. Klónstabilitás tesztelése fAFLP módszerrel...........................................................45 3.8. Cink stressz in vitro ................................................................................................46 3.9. Paraquat stressz in vitro..........................................................................................47 3.10. Biokémiai vizsgálatok ............................................................................................47 3.11. Klorofill fluoreszcencia ..........................................................................................48 3.12. RT-PCR analízis.....................................................................................................48 3.13. Mikroszatellita diverzitás feketenyár szomaklónokban .........................................50

4. Eredmények és megvitatás ................................................................................53 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7.

A gsh1 transzgén jelenlétének és expressziójának bizonyítása ..............................53 A gsh1-transzgénikus szürkenyár klónok genetikai stabilitása ..............................54 A cink stressz gsh1-transzgénikus szürkenyárban..................................................56 Paraquat stressz gsh1-transzgénikus szürkenyárban ..............................................60 Génexpresszió vizsgálata paraquattal kezelt gsh1-transzgénikus szürkenyárban ..65 Nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása.......................................................66 Új tudományos eredmények ...................................................................................72

5. Következtetések és javaslatok ...........................................................................75 6. Összefoglalás.......................................................................................................77 7. Mellékletek..........................................................................................................83

Rövidítések jegyzéke

4 Rövidítések jegyzéke

AFLP:

amplifikált DNA fragmentum hossz polimorfizmus (Amplified DNA Fragment Length Polymorphism) ALF: automatizált lézer fluorométer (Automated Laser Fluorometer) AP-PCR: véletlenszerĦen kapcsolt PCR (Arbitrary Pimed PCR) BA: benzyl-adenin bp: bázispár CaMV: karfiolmozaik vírus (Cauliflower Mosaic Virus) CDNB 1-chloro-2,4-dinitrobenzén DAF: DNS amplifikációs ujjlenyomat (DNA Amplification Fingerprinting) EST: expresszálódó szekvencia részlet (Expressed Sequence Tag) fAFLP: fluoreszcensen jelölt amplifikált DNS fragmentum hossz polimorfizmus (Fluorescent Amplified DNA Fragment Length Polymorphism) GR: glutation reduktáz enzim GS: glutation szintáz enzim GSH: redukált glutation gsh1: a gamma-glutamilcisztein szintáz enzimet kódoló gén gsh2: a glutation szintáz enzimet kódoló gén GSSG: oxidált glutation diszulfid GST: glutation S-transzferáz enzim ICP: induktív csatolású plazma-spektrofotométer (Inductively Coupled Plasma Spectrophotometer) NAA: naftilecetsav (Naphthylacetic Acid) NADPH: redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát PIC: variabilitási index (Polymorphism Index Content) PC: fitokelatin PCR: polimeráz láncreakció, (Polymerase Chain Reaction) RAPD: véletlenszerĦen amplifikált polimorf DNS (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RFLP: restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus (Restriction Fragment Length Polymorphisms) ROS: reaktív oxigénfajták (Reactive Oxygen Species) RT-PCR: reverz transzkriptáz PCR RUBISCO: ribulóz-1,5-biszfoszfát karboxiláz/oxigenáz enzim SSR: mikroszatellit – egyszerĦ szekvencia ismétlĘdés (simple sequence repeat) SNP: egyszeri nukleotid polimorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism) SPAR egy primerrel amplifikáló reakció (Single Primer Amplification Reactions) Ȗ-EC: gamma-glutamilcisztein Ȗ-ECS: gamma-glutamilcisztein szintáz enzim

5

Bevezetés

1. Bevezetés és célkitĦzés 1.1. A téma aktualitása, jelentĘsége

A termesztett és vadon élĘ növények egyaránt ki vannak téve az idĘjárás szeszélyének, különbözĘ betegségeknek, a hajtást illetve a gyökeret pusztító kártevĘknek, emellett állandó versenyben vannak más egyedekkel az elérhetĘ tápanyagért és a fényért. Úgy is fogalmazhatunk, hogy a növényeknek alkalmazkodniuk kell a biotikus és abiotikus környezeti stresszhez. Ha a környezeti stressz elég nagy, akkor a területen a növénytársulás teljesen kipusztulhat, illetve csak a szélsĘséges körülményeket tolerálni képes növényfajok képesek a túlélésre. Újabban az emberi tevékenység egy jelentĘs stressztényezĘként játszik szerepet.

Napjainkban jelentĘs stressztényezĘként játszanak szerepet a szennyezett talajok. Évtizedekkel a modern mezĘgazdasági és ipari technológiák széleskörĦ elterjedése után a Föld jelentĘs területein halmozódott fel szennyezĘdés, fĘként nehézfémek és szerves szennyezĘanyagok. Azokon a területeken ahol ez a szennyezĘdés különösen nagy, ott nem jöhet létre talajtípusnak és éghajlatnak megfelelĘ természetes vagy mesterséges növénytársulás, ezért a talaj további pusztulása gyors ütemben

folytatódik.

További

veszélyt

jelent

hogy

a

talajban

lévĘ

szennyezĘanyagok továbbkerülhetnek a talajvízbe és a vízbázisokba. A vázolt környezeti problémák mérséklése napjaink egyik kiemelt környezetvédelmi feladata.

A talaj megtisztítására, remediálására (a latin remedium szó jelentése: gyógyszer) létezik számos fizikai, kémiai és biológiai módszer. A fizikai és kémiai módszerek a legtöbb eseteben alklamazhatóak, kielégítĘ eredményt adnak, viszont drágák és legtöbször durva beavatkozást jelentenek a környezeti struktúrákba. A biológiai módszerek ezzel szemben természetes körülmények között alkalmazhatóak és

Bevezetés

6

olcsók. A növényekkel végzett remediációt nevezzük fitoremediációnak. Nagy területek megtisztításánál a fitoremediáció lehet hosszú távon az egyetlen hatékony módszer.

A szennyezett talajra csak olyan növények telepíthetĘk, amelyek kiemelkedĘ stressztĦrĘképességgel rendelkeznek ezért a stressztolerancia a fitoremediációnak is kulcstulajdonsága. A megfelelĘ tulajdonságokkal rendelkezĘ növények felhasználhatóak fitoremediációra illetve talajvédĘ növénytársulások létrehozására az eddig a mezĘgazdaság és erdészet számára marginális területeken.

A Populus fajok kiválóan alkalmazhatóak a fent vázolt problémák megoldására. Gyökérzetük a talaj mélyebb rétegeit is eléri, nagy a növekedési erélyük, nagy mennyiségĦ biomasszát termelnek, könnyen szaporíthatóak és a világon széles körben elterjedtek. A nyár a biotechnológiai módszereknek is modellnövénye: könnyen mikroszaporítható, transzformációs rendszere kidolgozott, genetikai térképek rendelkezésre állnak és napjainkban a Populus trichocarpa teljes genomja is szekvenálásra került (TUSKAN et al. 2004).

Eddigi ismereteink a növények abiotikus stresszre és a környezet változásaira adott válaszairól fĘként egyéves lágyszárú növényeken végzett kutatásokból származnak. A növényi gének expressziójáról és regulációjáról való ismereteink legnagyobb részben a lúdfĦn (Arabidopsis thaliana) végzett kutatásokon alapulnak, amely köztudottan egy kicsi, lágyszárú, rövid életciklusú, egyéves növény. Ezekkel az eredményekkel nem tudjuk teljes mértékben megmagyarázni a fás növények komplex fejlĘdését és a környezeti hatásokra adott válaszait, ezért szükségesek a fás növényeken végzett ilyen irányú kutatások.

Genetikai módosítással a növények stressztoleranciája növelhetĘ. 1997-ben és 1998-ban nemzetközi együttmĦködés keretében transzgénikus szürkenyár (Populus

7

Bevezetés

u canescens) klónokat hoztak létre, amelyekben a glutation antioxidáns túltermeltetését érték el (ARISI et al. 1997; NOCTOR et al. 1998a). A transzformáns növényeken tanulmányozhatóak voltak a glutation kapcsolt folyamatok (NOCTOR et al. 1997; NOCTOR et al. 1999), illetve nagyobb stressztĦrĘképességgel rendelkeztek néhány ágenssel szemben (GULLNER et al. 2001; WILL et al. 2001; KOPRIVOVA et al. 2002; STROHM et al. 2002). A nagyobb

stressztĦrĘképességgel

rendelkezĘ

nyárak

fitoremediációra

is

alkalmasabbak lehetnek a vad típusú növényekhez képest, mert a stressztĦrés a fitoremediáció egyik kulcstulajdonsága. E képesség átfogó jellemzése, valamint a stresszfolyamatok hátterében álló molekuláris és élettani folyamatok jobb megismerése a jelen dolgozat fĘ célkitĦzése.

A speciális tulajdonságokkal rendelkezĘ és mikroszaporítással fenntartott nyárak szaporításakor fontos szempont hogy az utódok genetikailag teljesen azonosak legyenek. A nyár fajokban a mikroszaporítás során fellépĘ szomaklonális variabilitás révén az utódok között genetikai eltérések léphetnek föl. Lényeges tudnunk az utódnemzetdékben létrejött genetikai polimorfizmus mértékét. Az utódklónok közötti variabilitás mértékének megállapítására alkalmasnak tĦnnek azok a PCR alapú molekuláris markerek, amelyek a genom hipervariábilis régióit detektálják (pl. SSR).

A Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszékének kutatói Populus nigra klónokból szomaklónokat indukáltak amelyeket több mint tíz év szabadföldbe ültettek. Az állomány rendelkezésre áll és kiválóan alkalmas a nyárfában fellépĘ szomaklonális variabilitás molekuláris markerekkel történĘ detektálásának tesztelésére. Tekintettel arra hogy az irodalomban kevés adat található a nyár nemzetségben indukálódó szomaklonális variabilitás mértékérĘl (RAHMAN és RAJORA 2001) ezért célul tĦztük ki ennek meghatározását.

Bevezetés

8

1.2. A kutatás célkitĦzései A fent vázolt vázolt tudományos kérdések megválaszolásához célszerĦ az idĘ és költségek csökkentése érdekében a kísérletek jelentĘs részét laboratóriumban folytatni ahol a felvetĘdött kérdésekre döntĘ mértékben választ kaphatunk, illetve a molekuláris és élettani vizsgálatokkal a stressztoleranciában szerepet játszó folyamatok is jobban megismerhetĘek. A fentiek figyelemevételével az alábbi célokat tĦztem ki: 1. Igazolom a közel tíz éve in vitro kultúrában mikroszaporítással fenntartott nagy glutation tartalmú gsh1-transzformáns szürkenyár (Populus u canescens) klónokban a transzgén (Ȗ-glutamil-cisztein szintáz gén) stabil jelenlétét génspecifikus próbák tervezésével és alkalmazásával. 2. Meghatározom az évek óta mikroszaporítással fenntartott gsh1-transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll szürkenyár klónok genetikai azonosságának mértékét. 3. Kimutatom (génexpressziós analízisben RT-PCR elemzéssel), hogy a gsh1transzgénikus szürkenyár klónokban (11ggs, 6Lgl) a gsh1 transzgén expresszálódik. 4. Meghatározom a gsh1-transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll szürkenyár, valamint feketenyár (Populus nigra N-SL) klónok cink-toleranciáját (ZnSO4: 10-5 - 10-1 M), fitoextrakciós kapacitását, valamint a stressz-indikátor glutation S-transzferáz (GST) aktivitását. 5. Meghatározom a gsh1-transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll szürkenyár klónok in vitro paraquat-toleranciáját különbözĘ szacharóz ellátottság (0,2 – 1,0 – 2,0%) és eltérĘ fény-sötét inkubációs feltételek mellett. Funkcionális analízisben meghatározom a fotoszintetikus aktivitás (Fv/Fm) és a klorofilltartalom, valamint a glutation S-transzferáz enzim (GST) aktivitás változását a paraquattal kezelt klónokban. 6. Meghatározom a paraquat (4x10-7 M) stressz indukált transzgénikus (11ggs) szürkenyár stressz-függĘ gst (glutation S-transzferáz enzim) és rbcS (ribulóz1,5-biszfoszfát karboxiláz kis alegység) génjeinek expresszióját szemikvantitatív RT-PCR reakcióban. 7. Meghatározom a feketenyár (Populus nigra; N-309; N-SL) molekuláris nemesítési programjában a portok tenyészetben indukált gametoklónok molekuláris diverzitásának fokát ALF-SSR analízisben.

9

Irodalmi áttekintés

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Az abiotikus stressz A stressz definíciót biológiai, illetve biokémiai jelenségekre elĘször Selye János használta és ezzel együtt vezette be az „általános adaptációs szindróma” fogalmát is. Selye szerint, a környezetünkben gyakran elĘforduló stresszhatásokra az élĘ szervezetek hasonló módon reagálnak és rajtuk egy tipikus tünetcsoport (szindróma) jegyei figyelhetĘk meg függetlenül attól, hogy mi a stresszor (SELYE 1965). A stresszhatások a növényi sejten belül a redox állapotot olyan módon változtatják meg, hogy az anyagcserét oxidatív irányba tolják el, és ezáltal reaktív oxigénfajták halmozódnak fel. A molekuláris oxigénnek (O2) – szokatlan módon – két párosítatlan elektronja van azonos spinnel. Az alapállapotú oxigén energiaközlés hatására rendkívül reaktív szinglet oxigénné alakulhat át. Az oxigén sajátságos kémiai tulajdonsága miatt az univalens redukció (egy elektron fölvétele) lehetĘsége is fönnáll. A reakciók oxigén szabadgyököket, azaz olyan molekulákat eredményeznek, amelyek párosítatlan elektronnal rendelkeznek, ezért rendkívül reakciólépesek. Reaktív oxigénfajtáknak (reactive oxigen species, ROS) nevezzük az oxigéngyököket, mint pl. a szuperoxid anion gyök (O2x) vagy a hidroxilgyök (OHx), valamint ide tartozik még a nem gyökös formájú hidrogén peroxid (H2O2) és a szinglet oxigén. A reaktív oxigénformák fehérje oxidációt, lipid peroxidációt, nukleinsav és pigment károsodást okoznak. A sejtek a ROS toxikus hatásai ellen antioxidánsokkal védekeznek (KIRÁLY 2002). Az egészséges sejtben fennálló egyensúlyi helyzet a reaktív oxigéngyökök és az antioxidánsok között a növényi sejtben stressz hatására felbomlik, és a reaktív oxigénfajták túlsúlyba kerülve sejthalált indítanak be. A sejthalál kialakulásában fontos szerepet játszik az a tény, hogy a szabadgyökök jelenlétében a sejtmembránok

károsítása

(lipid

peroxidáció)

következik

be,

amely


10

visszafordíthatatlan membrán áteresztĘképesség-növekedéssel jár. Különösen fontos szerepet játszik a vakuólum sejtmembránjának (tonoplaszt) „lyukacsossá” válása. A vakuólum, mint a növényi sejt „szemetes ládája”, rengeteg mérgezĘ fenolvegyületet tartalmaz. Ezek a sejtmérgek a citoplazmába ömlenek, ahol további mérgezĘ anyagok keletkezése által a citoplazma gyors pusztulását okozzák. A reaktív oxigénformák ezen felül károsítják még a nukleinsavakat és a pigmenteket is (TAUSZ 2001). Biokémiai szempontból akkor beszélhetünk stresszrĘl, amikor a sejtekben az ionos reakciókat (két elektronos reakciók) fölváltják a gyökreakciók (egy elektronos reakciók). Miközben az ionos reakciók szigorú kontroll alatt állnak, addig a gyökreakciók könnyen kiszabadulnak a metabolikus kontroll alól. A növényi sejtben a legtöbb ROS a kloroplasztiszban termelĘdik, de fontos képzĘdési hely még a mitokondriális elektrontranszport lánc is habár az itt képzĘdött mennyiség nagyságrendekkel kisebb (FOYER és NOCTOR 2000; TAUSZ 2001).

2.2. Nehézfémstressz A növények növekedésük közben a talajban hozzáférnek az esszenciális mikroelemekhez, mint Cu és Zn és gyakran nem esszenciális elemekhez is mint Cd, Hg vagy Pb. Ezek a fémek jelen lehetnek nagy vagy kis koncentrációban is, ami függ a természetes élĘhelyek változékonyságától, illetve az emberi beavatkozástól. A növények növekedése és túlélése a változékony mikroelemellátottság mellett fokozottabb, amennyiben az esszenciális fémek koncentrációját megfelelĘ szinten tudják tartani miközben a nem esszenciális elemek koncentrációja a toxicitási küszöb alatt marad. Toxikusnak tekintjük azt az elemet, amely káros hatást fejt ki a növényre, habár a toxikusság relatív fogalom, hiszen nagyban függ az elem koncentrációjától, egy esszenciális elem is lehet toxikus, ha túl nagy mennyiségben van jelen.

11


Nehézfémeknek azokat az elemeket nevezzük, amelyeknek sĦrĦsége 5 g/cm3 rendszáma pedig 20 feletti. A nehézfémek között sok esszenciális mikroelem is van (Zn, Cu, Fe, stb.). Az átmeneti fémekhez hasonlóan a cink fontos peptid és enzim komponens, valamint számos, sejtben lejátszódó biokémiai folyamatban játszik fontos szerepet. Nagy koncentrációban azonban az egyik legelterjedtebb szennyezĘ elem a mezĘgazdasági ökoszisztémákban. (ROY és COUILLARD 1998; NAN et al. 2002) A cink és egyéb nehézfémek többfunkciós inhibitorok is lehetnek, számos biokémiai folyamatot gátolnak, ezért nagy koncentrációban fitotoxikus hatásúak (COBBETT 2000; SCHUTZENDUBEL et al. 2002). A növényeket melyek a külsĘ fémkoncentráció széles tartománya mellett is növekednek, fejlĘdnek fémtoleránsnak nevezik. Egy vag két gén okozza a növények eltérĘ fémtoleranciáit (As, Cd vagy Cu esetén) eygyéb gének módosító hatásaival, de ilyen géneket még nem lokalizáltak. (RAUSER 2001)

2.3. A paraquat stressz A paraquat (1,1’-Dimethyl-4,4’-bipyridinium vagy N,N’-dimethyl-L,L’dipyridylium; vagy methyl viologen): [C12H14N2]2+) egy totális (nem szelektív)-, kontakt-, elektronakceptor hatásmechanizmusú PS I-gyomirtószer. (2/1. ábra) Az emberre is rendkívül veszélyes, ennek ellenére – fĘleg alacsony ára miatt – széles körben elterjedt, több mint 130 országban használják, illetve használták. Hatását elsĘsorban a fotoszintetikus elektron-transzportlánc elektronjainak elfogásán keresztül fejti ki. A divalens paraquat kation a fotoszintetikus elektront fölveszi, majd az elektron a kloroplasztban nagy mennyiségben jelen lévĘ O2 molekulára kerül reaktív oxigénfajtákat képezve, miközben a paraquat visszaalakul eredeti állapotába. Ennek következtében hiába mĦködik az elektron átadó lánc, a NADPH redukció és a fotofoszforiláció nem tud végbemenni, a Calvin-ciklus enzimei gátlódnak (DODGE 1994). A reakció folyamatos ismétlĘdése oxidatív stresszt,


12

membrán-károsodást, klorofill degradációt és deszikkációt okoz. A paraquat fény hiányában is toxikus, de ennek mechanizmusa még nem ismert. A paraquat gyomirtó szer számos antioxidáns védekezĘ reakciót indít be. GSH jelenlétében a paraquat gerjesztette oxidatív stressz a GSH elektronátadásán keresztül, a GSH-GSSG redoxrendszeren keresztül (szabadgyökök redukciója) küszöbölĘdik ki.

2/1. ábra A paraquat (metilviologén) kémiai szerkezete

A paraquat által generált reaktív oxigénfajtákkal szembeni rezisztencia kialakítható in vitro szelekcióval. Ezeknek a növényeknek az ellenállósága a káros oxigénfajtákkal szemben korrelációt mutat olyan fertĘzésekkel, amelyek nekrotikus tüneteket idéznek elĘ a fogékony növényekben. A paraquat-rezisztens növényekrĘl bebizonyosodott, hogy ellenállóak többféle biotikus (pl. fertĘzések) és abiotikus stresszel szemben is, azaz multirezisztenciával rendelkeznek (BARNA et al. 1993; KIRÁLY 2002). Manapság a paraquatot széles körben alkalmazzák a kutatók laboratóriumi stressz-vizsgálatoknál, mert oxidatív stresszt lehet vele elĘidézni a növényben.

2.4. A stressz hatása a klorofill fluoreszcenciára A klorofill fluoreszcencia mérése széles körben alkalmazott módszer, amellyel mérhetĘ a növény stressz állapota. Segítségével külsĘ látható jelek nélkül is következtetni lehet stressztényezĘk jelenlétére. A mért fluoreszcencia mennyisége fordítottan arányos a fotoszintetikus aktivitással. Számos stressztényezĘ képes gátolni a fotoszintetikus aktivitást, ami által nĘ a kibocsátott fluoreszcencia, így a fluoreszcencia mérése információt szolgáltathat a növény fiziológiai állapotáról. Növényfajok fluoreszcencia-spektrumában két csúcsot lehet elkülöníteni 690 és

13


735 nm-en . A sötétben tárolt levelek fluoreszcenciájának idĘbeli változása (Kautsky-effektus) már régóta ismert. A sötétadaptáció során a fotokémiai folyamatok megszĦnnek, és ekkor kibocsátott fluoreszcencia sincs. Hirtelen megvilágítás hatására a fotoszintézis lassan indul be, a maximumát 3-5 percen belül éri el. Ez „ébredési” szakasz alatt a kibocsátott fluoreszcencia jellemzĘ lefutást mutat (2/2. ábra), amelyeken karakterisztikus pontok határozhatók meg (2/1. táblázat). 2/1. táblázat Fontosabb klorofill fluoreszcencia értékek jelölései megnevezései és magyarázatai (BARÓCSI et al. 2000) Jelölés F0 Fm Fv Fv/Fm Fs Fq Rfd F690/F735

Megnevezés mért érték mért érték Fm-F0 Fv/Fm mért érték Fm-Fs Fq/Fs F0, Fm, Fs

Leírás Kiindulás fluoreszcencia intenzitás A fluoreszcencia maximális értéke Változó fluoreszcencia A PS II rendszer fotokémiai hatékonysága Egyensúlyi fluoreszcencia Fluoreszcencia elnyelési kapacitás Fluoreszcencia csökkenés Fluoreszcencia arány különbözĘ pontokban

2/2. ábra A tipikus két hullámhosszú klorofill fluoreszcencia lefutási görbéje egészséges Populus u canescens-en CFM-636973 készülékkel mérve. A jelölések a görbe karakterisztikus pontjait jelölik: F0, Fm, T50, T90, és Fs.


14

A fluoreszcencia kinetikája a PSII rendszeren keresztül a külsĘ körülményektĘl függ, beleértve a stresszt, a károsodási folyamatokat melyeknek okozója lehet pl. a nehézfém felvétel (BARÓCSI et al. 2000).

2.5. A glutation és szerepe a stressz elleni védekezésben A glutationt (GSH) elsĘként a növényi sejtekben fedezték fel 1888-ban. De Rey Pailhade élesztĘben és más sejtekben azonosított egy vegyületet, amely spontán reakcióba lépett elemi kénnel hidrogén-szulfidot létrehozva. Az új vegyületet philotion-nak nevezte el. 1921-ben Hopkins arra a következtetésre jutott (tévesen), hogy ez a vegyület egy dipeptid, amely ciszteinbĘl és glutaminsavból áll és valószínĦleg J-glutamil-ciszteinrĘl van szó. Egy késĘbbi vizsgálata során 1929ben mutatta ki az új vegyületben a glicint, majd 1930-ban írta le a ma ismert szerkezetét. A glutation elnevezést is Hopkins használta elĘször, amely elnevezés az eredeti filotion névhez és az egyszerĦ peptideket jelzĘ pepton végzĘdéshez is kapcsolódott. Ma már ismert, hogy a GSH a legfontosabb és a legnagyobb mennyiségben elĘforduló tioltartalmú természetes vegyület növényi szövetekben (RENNENBERG 2001). A redukált glutation tripeptid (GSH, J-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin), a növényi antioxidáns rendszer egyik fontos eleme. Kimutatták, hogy a növények kémiai és biológiai stressztĦrĘképessége, valamint a glutation metabolizmusa, felhalmozódása és az ezt szabályozó enzimek aktivitása között összefüggés van (FODOR et al. 1997; KÖMÍVES et al. 1998). A glutation bioszintézise két, ATP-t igénylĘ lépésben megy végbe. Az elsĘ lépésben a Ȗ-glutamilcisztein (Ȗ-EC) jön létre a glutaminsav és a cisztein között kialalkuló

peptidkötéssel,

amelyben

a

glutaminsav

gamma

helyzetĦ

karboxilcsoportjával vesz részt. A második lépésben glicin kapcsolódik a Cterminális helyzetĦ ciszteinhez, igy létrejön a glutation tripeptid. Az elsĘ lépést a Ȗglutamilcisztein szintáz enzim(Ȗ-ECS), a másodikat a glutation szintáz enzim(GS) katalizálja. A reakció végbemehet a citoszolban és a kloroplasztban is (2/3. ábra).

15


A Ȗ-ECS enzimet a gsh1 (vagy gshA) gén kódolja, a GS enzimet pedig a gsh2 (vagy gshB). Viszonylag kevés információ áll rendelkezésre a gsh1 és gsh2 gének expressziójának szabályozásáról. A GSH és GSSG önmagában nincs hatással a gének expressziójára, és a H2O2 sem befolyásolja. Brassica juncea növényben kadmium és réz hatására megemelkedett a gsh1 és gsh2 transzkriptumok mennyisége. (SCHAFER et al. 1998; XIANG és OLIVER 1998) A transzkriptumok transzlációjához oxidatív stressz szükséges, ami azt sugallja hogy a GSH szintézis poszt-transzkripcionális szabályozás alatt áll és a H2O2 derepresszálja az mRNS-ek transzlációját. A Ȗ-ECS enzim poszt-transzlációs szabályozás alatt is állhat. Bizonyított tény, hogy patkányban a Ȗ-ECS enzim foszforilációval szabályozódik, bár ezt növényekben még nem sikerült igazolni.

2/3. ábra A glutation bioszintézisének két utolsó enzimatikus lépése a reakciót katalizáló enzimekkel (NOCTOR et al. 1998b).

A glutation többféle módon is részt vehet a stressz elleni védekezésben: 1.

Szulfhidril csoportjának köszönhetĘen a glutation jelentĘs antioxidáns kapacitással rendelkezik. Közvetlenül reakcióba léphet a ROS vagy azok


oxidált

szubsztrátjaival.

16 Eközben

a

glutation

(GSH)

két

tripeptid

összekapcsolódásából létrejövĘ oxidált formát vesz föl (GSSG). A GSSG visszaalakulását GSH-vá a glutation reduktáz enzim (GR) katalizálja és a reakcióhoz a fotoszintetikus elektrontranszport-láncban képzĘdött NADPH-t használja föl (2/4. ábra).

2/4. ábra A glutation redukálódása és oxidálódása. A redukált glutation (GSH) a glutation-peroxidáz enzim segítségével detoxifikálja a H2O2-t miközben oxidálódik, és glutation diszulfiddá alakul (GSSG). A glutation diszulfid a glutation reduktáz enzim segítségével redukálódik NADPH felhasználásával. A regenerált GSH újra képes detoxifikálni a H2O2-t. A H2O2 szabadgyökök enzimatikus detoxifikálásakor képzĘdik, amit a szuperoxid dizmutáz enzim (SOD) katalizál (www.ceri.com/redox.htm nyomán). 2.

A GSH fontos szerepet játszik a membránlipidek védelmében. ROS reakciók gyakori szubsztrátjai a membránlipidek. A lipid peroxidáció acyl peroxidokat eredményez, amit a GSH képes detoxifikálni. A GSH-hoz hasonlóan ezt a reakciót végzi a lipofil D-tokoferol antioxidáns is.

3.

A GSH fontos komponense a hidrogén-peroxid lebontásában döntĘ szerepet játszó aszkorbát-glutation ciklusnak. Ez az antioxidáns ciklus több reakciólépésben végzi el a hidrogén-peroxid redukcióját a fotoszintézisben termelt NADPH felhasználásával. Az aszkorbát regenerációja a GSH segítségével történik.

4.

A GSH képes a fehérjék diszulfid kötését redukálni és így semlegesíteni a ROS károsító hatásait (a protein diszulfidok képzĘdése az oxidatív stressz egyik folyománya). Azonkívül a tiol-diszulfid kötések cseréjének általános

17


jelentĘsége van az enzim aktivácóban, fehérjék védelmében és a sejtek regulációs folyamataiban. 5.

A glutationnak jelentĘs szerepe van a fémstressz elleni védekezésben. Többféle fém indukálja a Ȗ-EC peptidek (fitokelatinok) megjelenését a növényekben, melyek hossza és mennyisége a képzĘdést kiváltó fémtĘl függ. A fitokelatin képzĘdést leghatékonyabban a Cd indukálja. Azonban nem tapasztaltak fitokelatin képzĘdést Al, Ca, Cr, Cs, K, Mg, Mn, Na és V esetében. A fitokelatinok kiinduló molekulája a glutation. A bioszintézis a következĘképpen megy végbe: (ȖGluCys)nGly+ (ȖGluCys)nGly (ȖGluCys)n+1Gly + (ȖGluCys)n-1Gly n=1,2,3 vagy több A fitokelatin szintáz feltételezhetĘen a citoszolban mĦködik, mert itt könnyen oldható állapotú, és a glutation szintetáz is itt fejti ki tevékenységét. A Cu, Cd, Pb és a Zn különösen jól kötĘdnek a tiol csoportokhoz. Feltételezések szerint a ciszteinben gazdag peptidek vesznek részt a detoxifikációban és a sejtek homeosztázisának fenntartásában ValószínĦsíthetĘ, hogy a fémtoleráns típusokban többféle ȖGluCys peptid képzĘdik (RAUSER 2001).

6.

A glutation S-transzferáz enzim szubsztrátjaként a glutation a felelĘs a xenobiotikumok és egyéb káros szerves szennyezĘanyagok eltávolításáért a citoplazmából (BĘvebben a következĘ fejezetben).

2.6. A glutation S-transzferáz enzimrendszer Elektrofil xenobiotikumoknak az alacsony elektronsĦrĦségĦ centrummal rendelkezĘ kémiai szennyezĘanyagokat nevezzük, melyek spontán reakcióba lépnek nukleofil molekulákkal. Ezért az elektrofil xenobiotikumok rendkívül veszélyesek

lehetnek

az

élĘ

sejtekre,

reakcióba

léphetnek

fehérjékkel,

nukleinsavakkal így károsítva a sejt metabolizmusát. A glutation és más kéntartalmú peptidek a xenobiotikumok nagy csoportjával képesek reakcióba lépni,


18

ezért e molekuláknak kiemelkedĘ szerepe van a kémiai polarizáció elleni védelemben. A detoxifikáció GSH-val történĘ konjugáció során történik meg. A xenobiotikumok elektrofil része a glutation tiol csoportjához kapcsolódik, ami által létrejön a konjugáció. A detoxifikáció sikeressége majdnem teljes mértékben a glutation hozzáférhetĘségétĘl függ. A konjugátumoknak van hidrofil és hidrofób része is, ami által a komplex tulajdonsága megváltozik az összetevĘk tulajdonságaihoz képest és elvesztik a membránokon keresztüli mobilitásukat. A GSH-herbicid komplexumokat az ABC transzporterek (ATP binding casette) szállítják a vakuólumba. Az ABC transzporterek szelektivitással rendelkeznek a GSH konjugátumok felé (EDWARDS et al. 2000). Egyes xenobiotikumok GSH-val történĘ konjugációjához enzimatikus katalizációra van szükség, amelyet a glutation S-transzferáz (GST) és izoenzimei végeznek. A glutation S-transzferáz enzimek a növényekben nagy mennyiségben vannak jelen, a kukorica leveleiben a vízoldható fehérjék több mint 1%-át alkotják. Sok esetben a GST enzimek a felelĘsek a termesztett növényeink herbicid toleranciájáért illetve a gyomnövények rezisztenciájáért. Genetikai analízisek kimutatták, hogy a növényekben legalább 25 gén kódol különféle GST enzimeket, amelyek aminosav sorrendje kb. 10%-ban egyezik. A GST enzimek két alegységekbĘl épülnek fel, amelyek 23-30 kDa tömegĦek lehetnek. A két alegységet kódolhatja ugyanaz a gén (homodimer), illetve két különbözĘ gén (heterodimer). A GST izoenzimei különbözĘ herbicideket detoxifikálnak. Expressziójuk nagy változékonyságot mutat az egyedfejlĘdés során, valamint patogén fertĘzésekor, kémiai kezelésre illetve a környezeti változások hatására. A GST aktivitás növekedése a növényi stresszválasz markereként alkalmazható (MARRS 1996; EDWARDS et al. 2000; SCHRÖDER 2001).

19


2.7. A nyárfa biológiája és nemesítése A Populus fajok a zárvatermĘk (Angiospermatophita) tagozatába a kétszikĦek (Dicotyledonopsida) osztályába, a dilenia-alkatúak (Dilleniidae) alosztályába a fĦzfavirágúak (Salicales) rendjébe a fĦzfafélék (Salicaceae) családjába tartoznak. A Populus fajok széles körben elterjedtek az északi féltekén a 30. szélességi körtĘl északra. Lombhullató fák, hajtásrendszerük differenciált, kétlaki növények. Több mint 30 fajukat azonosították. A kis fajszám ellenére morfológiailag erĘsen differenciálódott nemzetség. Diploid jellegĦ, az egymáshoz közel álló fajok könnyen keresztezĘdnek egymással, számos természetes és mesterséges hibridjük ismert. A fajokat a következĘ botanikai szekciókba sorolták be (TAYLOR 2002): Leuce (Populus), Aigeiros, Tacamahaca, Leucoides, Turanga és Abaso. A legtöbb nemesített nyár az elsĘ három osztályba tartozik. A Leuce szekció két alcsoportra bomlik, a Trepidae és Albidae csoportokra. Az elsĘ csoportba tartozik a Populus grandidenata, Populus tremula és Populus tremuloides, az Albidae alcsoportnak egyetlen tagja van a Populus alba. Az Aigeros két legfontosabb tagja a Populus nigra és a Populus deltoides. Az európai feketenyár (P. nigra) az eurázsiai kontinens pionír fafaja és fĘként ártéri erdĘkben található. A P. deltoides természetes elĘfordulási helye ÉszakAmerika, közelebbrĘl a Mississippi-Missouri medence. A 18. sz-ban került Európába, ahol keresztezĘdött a P. nigra fajjal, létrehozva a széles körben termesztett Populus u euramericana hibridet. A Tacamahaca csoport fajai Észak-Amerikában és Ázsiában elterjedtek. A Populus trichocarpa és a Populus maximowiczii két legfontosabb Európában is termesztett faja.


20

A dolgozatban elĘforduló két faj részletes leírása: Szürkenyár (Populus u canescens). Európai-mediterrán flóraelem. Hazánkban az árterek jó vízgazdálkodású termĘhelyein és az Alföld homoktalajain növekszik megfelelĘen. Gyorsan nĘ az oldalárnyékolást is elbírja. Gyökérsarjról jól újul. A szürkenyár természetes keverékfaj a fehér nyár (P. alba) és a rezgĘnyár (P. tremula) között. Önálló fajként állandósult de a szülĘk között állandóan újból és újból is létrejön. Az erdészeti gyakorlat különbséget tesz fehérnyár jellegĦ szürkenyár (ún. fehér szürkenyár) és rezgĘ jellegĦ szürkenyár (ún rezgĘ szürkenyár) között. Koronája általában terebélyes, sátorozó, gyéren elágazó, az ágak vastagok, lombozata laza. Törzse általában egyenes és ágtiszta, gyenge termĘhelyeken alacsony és görbe. A kéreg sokáig sima, csak idĘs korban repedezett. Tömeges fatermesztési célkitĦzések elérésére kiválóan alkalmas. Feketenyár (Populus nigra). Eurázsiai flóraelem. Nálunk fĘleg az Alföldön található (fĦz-nyár ligeterdĘk). Homokvidékeken csak ültetve. Meleg- és fényigényes, elsĘrendĦ fa. Optimális termĘhelye az árterek tápanyagban gazdag, laza vagy közepesen kötött talajai. A szárazabb homoktalajokon is megél, de itt a törzse görbe, ágas-bogas, gyakran bokorszerĦ. Gyorsan nĘ, tuskórol is jól sarjad. Általában dugványról szaporítják. Törzse rendszerint alacsonyan elágazó vastag oldalágakra bomlók. Vannak azonban kiváló növésĦ egyenes, hengeres magasan elágazó törzsĦ egyedei is. Kérge egészen fiatalon világosszürke, rózsaszín árnyalatú, korán repedezik; a törzs ekkor sötétszürke, mélyen barázdált. A homokfásításban 100 év óta használják, újabban azonban a nemes nyárak hátérbe szorították. ErdĘgazdasági jelentĘsége ennek ellenére fĘként a nemesnyárak számára már túlságosan száraz homokon vagy túlságosan nedves árterületeken változatlan. A széleskörĦ földrajzi elterjedés, gyors növekedés, rövid generációs idĘ, talajjal szembeni igénytelenség, a könnyĦ vegetatív szaporíthatóság mind olyan tulajdonság, amely megnöveli a nyárfa gazdasági jelentĘségét. Felhasználható

21 csomagolóanyag-gyártásban,

papír-

és


bútorgyártásban,

rétegelt

lemez

elĘállításához és fĦtĘanyagként is. (LEPLE et al. 1999). A nyárfa nemesítésében a növekedési erély, a patogén rezisztencia és a fa minĘsége a jelentĘsebb szempontok. A magyarországi nyárnemesítési munka az Erdészeti Tudományos Intézetben (ERTI) folyik. Az eredményes nyárnemesítés megalapozói Koltay György és Kopeczky Ferenc az ERTI kiváló kutatói voltak. A nyárnemesítés az ERTI nyugat-magyarországi és kelet-magyarországi kísérleti állomásain folyik. Mindkét állomáson folyik szelekciós nemesítés és külföldi klónok honosítási vizsgálata (KISS 1999).

2.8. A nyár, mint biotechnológiai modellnövény A nyárfára egyre inkább úgy tekintenek mint az erdészeti biotechnológiai kutatások modellnövényére. Ezt annak köszönheti, hogy rendelkezik számos olyan – a többi fás növényekben együtt nem jelenlévĘ – tulajdonsággal, amelyek megkönnyítik a biotechnológiai és molekuláris biológiai kutatásokat, mint pl.: x KönnyĦ vegetatív szaporíthatóság – amely lehetĘvé teszi a kísérletek megismétlését eltérĘ idĘben és/vagy térben, valamint a genetikai anyag változatlanul fenntartható. x Gyors növekedés és termĘrefordulás – a kísérletek viszonylag gyorsan elvégezhetĘek x Kis méretĦ nukleáris genom - a haploid genom mérete kb 485±10 Mbp, hasonló a rizs genom méretéhez, csak 4 u nagyobb az Arabidopsisénál de 40 u kisebb, mint a fenyĘ genomja. x KönnyĦ mikroszaporíthatóság és transzformálhatóság – így transzgénikus fák állíthatók elĘ, amelyek lehetĘvé teszik a gének funkcióinak jellemzését.

Az elsĘ fás növények, amelyekrĘl EST könyvtárat állítottak össze a P. tremula x tremuloides, P. tremula és P. trichocarpa. voltak (www.populus.db.umu.se;

22


STERKY et al. 2004) Nyárfa RAPD, SSR és AFLP markereken alapuló genetikai térképek

szintén

rendelkezésre

állnak,

amelyeket

használták

kvantitatív

tulajdonságok térképezésére is. A nyárfa teljes genom szekvenálása is elkészült. A szekvenálásra a P. trichocarpa faj nĘnemĦ ’Nisqually-1’ nevĦ klónját választották ki, amelyet a nyugat-washingtoni Nisqually folyó mellĘl gyĦjtöttek be. A szekvenálást ’whole-genome shotgun’ módszerrel végezték. A szekvenciaadatok szabadon hozzáférhetĘek a http://www.jgi.doe.gov/poplar/ weboldalon. Nem meglepĘ, hogy az elsĘ transzgénikus fa szintén a nyár volt, amelyet 1987-ben állították elĘ, a bevitt tulajdonság a glifozát rezisztencia volt. Több különbözĘ nyártranszformációs eljárást írtak le. A mostanáig létrehozott transzgénikus nyárfákban a következĘ tulajdonságokat módosították:

Herbicidrezisztencia. Az elsĘ, gazdaságilag is hasznos tulajdonságban módosított transzgénikus nyárfák herbicidrezisztenciával rendelkeztek, mint pl. glifozát, foszfinotricin vagy klórszulfuron. A herbicidrezisztenciának az ültetést követĘ elsĘ évben van kiemelt szerepe, amikor a gyomok még komoly veszélyt jelenthetnek a növekedési tér leszĦkítése miatt.

Rovarrezisztencia. Az egyéves növényektĘl eltérĘen a fás növényeket hatékonyan hosszú idĘn keresztül kell védeni a rovarkár ellen, mert a rovarok nagyon komoly károkat okozhatnak a faállományban. A rovarrezisztencia kialakításához a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin génjét illetve növényi proteáz inhibitor géneket használnak.

Virágzás módosítása. A virágzás módosításának a célja a sterilitás elĘidézése. Az elsĘ megközelítésben tapétum-specifikus promóterrel alkalmaztak citotoxikus gént. Másik sikeres stratégia volt a virágfejlĘdésben szerepet játszó gének gátlása. ElképzelhetĘ, hogy a jövĘben a sterilitás a transzgénikus fáknál a szabadföldi

23


kiültetés elĘfeltétele lesz, de számos agronómiai elĘnye is van a sterilitásnak, továbbá így megszüntethetĘ az allergén pollenek szóródása.

Anyagcsere módosítása. Lignin metabolizmus A fák legfĘbb összetevĘi a cellulóz, hemicellulóz és a lignin. A cellulóz bioszintézis módosítása lehetĘvé tenné számos fontos tulajdonság javítását, mint pl. a biomassza növelését vagy a rost minĘségének javítását, azonban a cellulóz szintáz gén azonosítása egyenlĘre sikertelen. A második legfontosabb polimer a bioszférában a lignin, fontos szerepe van a sejtfal kialakításában, növeli annak ellenállóságát, biztosítja a kórokozókkal szembeni ellenállóságot, lehetĘvé teszi a xilémen keresztüli transzportot. A lignin, biológiai fontossága ellenére, gyakran nemkívánatos anyag az ipari termékek elĘállításakor. A lignin bioszintézis számos enzimét és kódoló génjeiket azonosították Transzgénikus nyárakban eddig a lignin összetételét sikerült módosítani a cinnamil alkohol dehidrogenáz enzim génjének gátlásával, ami által a lignin könnyebben kivonható lett. Sajnos azonban a lignin kismértékĦ szerkezeti átalakítása a szárszilárdság nagymértékĦ csökkenésével járt együtt, ami gyakorlatilag lehetetlenné tette e fák termesztését, ezért a lignin bioszintézis módósítására irányuló kísérletek intenzitása lecsökkent.

Hormon metabolizmus Eddig munkák az auxin és citokinin anyagcsere módosítására, bakteriális gének nyárfában történĘ kifejeztetésével történtek. A transzformáns növények általában abnormális fenotípust mutattak. E transzformáns növényekkel sikerült tisztázni az auxin hatását a kambium növekedésére.

Glutation metabolizmus A glutation metabolizmus módosításáról részletesen a következĘ 2.7 fejezetben lesz szó.

24


A transzgénikus nyárfákkal történĘ szabadföldi kísérletek száma egyre növekszik, kiváltképp az Egyesült Államokban, Európában és Kínában. (LEPLE et al. 1999) A transzgénikus fák szabadföldi alkalmazását meg kell elĘzze egy biológiai hatásvizsgálat, amiben benne foglaltatik az emberre és környezetre való hatás. A transzgénikus fák és az egyéb transzgénikus növények között két fontos különbséget tehetünk, amelyek hatással vannak a környezetbiztonságra: viszonylag hosszú élettartamúak, amely akár 100 év is lehet, valamint a fák többé-kevésbé vad növények, amelyek környezetében számos kompatibilis faj élhet. Ezen okok miatt a potenciális géntranszfer lehetĘsége megnövekszik az egyéves növényekhez képest. A mostanáig létrehozott transzgénikus fák pozitív hatással lehetnek a környezetre és hosszú távon az erdĘk megóvására mindazonáltal rizikót jelenthetnek a jelenlegi természetes erdĘtársulásokra. (MATHEWS és CAMPBELL 2000). A fontosabb transzgénikus nyárfákat a 2/2. táblázatban mutatjuk be.

2/2. táblázat: A fontosabb genetikailag módosított nyárak (A) Herbicid rezisztencia Faj/Hibrid P. alba u P. grandidentata P. tremula u P. alba

Transzgén* aroA bar

P. trichocarpa u P. deltoides

bar

P. tremula u P. alba

bar


crs1-1


crs1-1


bar

P. alba u P. grandidentata

aroA

Tulajdonság Glifozát rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Klórszulfuron rezistzencia Klórszulfuron rezistzencia Foszfinotricin rezisztencia Glifozát rezisztencia

Irodalom (FILLATTI et al. 1987) (DE BLOCK 1990) (DE BLOCK 1990) (DEVILLARD 1992) (BRASILEIRO et al. 1992) (CHUPEAU et al. 1994) (CHUPEAU et al. 1994) (DONAHUE et al. 1994)

25


(B) Rovarrezisztenca Faj/Hibrid P. alba u P. grandidentata

Transzgén* cryIA(a)

Tulajdonság Malacosoma disstria Lymantria dispar Lymantria dispar Apochemia cinerarius Chrysomela tremulae Chrysomela tremulae Lymantria dispar Plagiodera versicolora

P. nigra

cryIA(c)

P. tremula u P. tremuloides P. tremula u P. tremuloides P. alba u P. grandidentata P. tremula u P. grandidentata

cryIIIA ocI pinII pinII

[P. alba u (P. davidiana + P. simonii)] u P. tomentosa

cryIA(cI

Lymantria dispar Clostera anachoreta

[(P. tomentosa u P. bolleana) u P. tomentosa]

CpTI

Lymantria dispar Malacosoma disstria Stilpnotia candida

Faj/Hibrid P. alba P. tremula u P. alba

Transzgén* StSy ipt

Tulajdonság resveratrol 3-glükozid Citokinin tartalom

P. sieboldii u P. grandidentata P. tremula u P. tremuloides

ipt GA-20oxidáz iaaM, iaaH iaaM rolC rolC

Citokinin tartalom Hormon anyagcsere

Módosult gyökérzet Hormon anyagcsere Rendellenes fejlĘdés

P. tremula u P. alba P. tremula u P. alba

rolB+rolC phyA Homeobox OSH1 gor gshII


gshI

Glutation anyagcsere

P. tremula u P. alb P. tremula u P. alba

GS AS comt

Nitrogén hasznosítás Lignin anyagcsere

P. tremula u P. alba P. tremula u P. alba P. tremula u P. alba P. tomentosa

AS cad chs

Lignin anyagcsere chalkon szintáz stressztĦrés sósstressz

Irodalom (MCCOWN et al. 1991) (WANG et al. 1996) (CORNU et al. 1996) (LEPLE et al. 1995) (HEUCHELIN et al. 1997) (KLOPFENSTEIN et al. 1997) (YANG et al. 2003)

(ZHANG et al. 2005)

(C) Anyagcsere módosítás

P. tremula u P. tremuloides P. tremula u P. tremuloides P. tremula u P. tremuloides P. tremula u P. tremuloides P. tremula P. tremula u P. tremuloides P. nigra

FeSOD mtlD

Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere

Glutation anyagcsere Glutation anyagcsere

Irodalom (GIORCELLI et al. 2004) (V. SCHWARTZENBERG et al. 1994) (EBINUMA et al. 1997) (ERIKSSON et al. 2000) (TUOMINEN et al. 1995) (TUOMINEN et al. 2000) (NILSSON et al. 1996) (AHUJA és FLADUNG 1996) (TZFIRA et al. 1998) (OLSEN et al. 1997) (MOHRI et al. 1999) (FOYER et al. 1995) (FOYER et al. 1995; STROHM et al. 1995; ARISI et al. 1997) (ARISI et al. 1997; NOCTOR et al. 1998a) (GALLARDO et al. 1999) (VAN DOORSSELAERE et al. 1995) (BAUCHER et al. 1996) (NICOLESCU et al. 1996) (ARISI et al. 1998) (HU et al. 2005)

26


(D) Virágzás módosítása Faj/Hibrid P. tremuloides

Transzgén* leafy

Tulajdonság Korai virágzás

P. tremula u P. alba, P. tremula u P. tremuloides P. trichocarpa u P. deltoides P. tremula u P. alba, P. tremula u P. tremuloides P. trichocarpa u P. deltoides P. trichocarpa u P. deltoides

leafy

Korai virágzás

(WEIGEL és NILSSON 1995) (ROTTMANN et al. 2000)

Irodalom

ptlf

Korai virágzás

(ROTTMANN et al. 2000)

leafy

Korai virágzás

(SKINNER et al. 2003)

Faj/Hibrid P. tremula u P. alba

Transzgén* pcad/gus

P. tremula u P. tremuloides

prolC/gus


p-SAM/gus

Tulajdonság Xilém specifikus expresszió Évszak specifikus expresszió Szövet specifikus expresszió

(E) Promóter módosítások Irodalom (FEUILLET et al. 1995) (NILSSON et al. 1996) (VAN DER MIJNSBRUGGE et al. 1996) (NILSSON et al. 1996)

p35S/gus Konstitutív expresszió P. tremula u P. tremuloides *2/2. táblázat jelmagyarázata. aroA: mutáns EPSP szintáz, AS: antiszensz; bar: foszfinotricin acetyl transzferáz; cad: cinnamil alkohol dehidrogenáz; cat: kloramfenikol acetil transzferáz; comt: kávésav O-metil transzferáz; CpTI: tripszin inhibitor; crs1-1: mutáns acetolaktát szintáz; cryIA(c), cryIA(a), cryIIIA: Bacillus thuringiensis į-endotoxin gének; FeSOD: vas szuperoxid dizmutáz; GS: glutamin szintáz gshI: Ȗ-glutamilcisztein szintáz gshII: glutation szintáz gor: glutation reduktáz gus: ȕ-glükuronidáz; ipt: izopentenil transzferáz; iaaH: indol-3-acetamid hidroláz; iaaM: triptofán-2mono-oxigenáz; luxF2: luciferáz; mtlD: mannitol-1-foszfát dehidrogenáz; ocI: rizs cisztein proteináz inhibitor; p: promóter; phyA: fitokróm A; pinII: burgonya proteáz inhibitor II; StSy: stilben szintáz

2.9. A glutation anyagcsere módosítása nyárfában Az antioxidánsok génjeivel történĘ transzformáció célja az oxidatív stressztĦrĘképesség javítása. Az ilyen típusú transzformációknak a fás növényeknél különösen nagy a jelentĘsége mert évelĘ növények, ezért hosszú ideig ki vannak téve a környezeti stressztényezĘknek. Az ilyen jellegĦ, glutation anyagcserében történĘ genetikai módosításokhoz az INRA 717-1-B4 jelĦ Populus u canescens klónt használták fel, mert ez a klón fogékonynak bizonyult az Agrobacterium

27


tumefaciens-el történĘ fertĘzésre. A transzformációk célja minden esetben a GSH tartalom növelése volt. A transzformációhoz Agrobacterium tumefaciens-el történt az eljárást LEPLE et al. (1992) dolgozták ki. ElsĘként az E. coli baktérium glutation reduktáz (GR) enzim gor génjét építették be. A GR az oxidált glutation diszulfid kötésének redukcióját katalizálja. A transzformáns növények leveleiben a kivonható GR aktivitása 2-10u volt nagyobb a kontrollhoz képest de ezerszeresére növekedett, ha az enzimet a kloroplasztiszba szálíttatták be. A különbség azzal magyarázható, hogy a bakteriális enzim stabilabb a kloroplasztiszban, mint a citoszolban. A kloroplasztiszban lokalizált glutation reduktáz enzim nagyobb glutationtartalmat eredményezett, ami a citoszolban történĘ kifejeztetésnél nem volt tapasztalható. Ezek a transzgénikus növények kevésbé bizonyultak érzékenynek a paraquattal elĘidézett oxidatív stresszre (FOYER et al. 1995). Egy késĘbbi munka során a glutation bioszintézis utolsó lépését katalizáló glutation szintáz (GS) enzim gsh2 génjével transzformálták a P. u canescens klónt. A transzformánsokban az enzim a citoszolban halmozódott föl. A kivonható GS aktivitás egyes klónokban 300u-os növekedést mutatott a kontrollhoz képest. Az óriási aktivitásnövekedés ellenére a tiol tartalom a levelekben nem változott. A transzformáns levelekbĘl vágott korongok akkor halmoztak föl több glutationt, ha exogén Ȗ-EC-t adagoltak hozzájuk (STROHM et al. 1995). A GS enzimet a kloroplasztban is túltermeltették. Ezekben a növényekben a kivonható GS aktivitása akár 500u-osára is megnĘtt, viszont a GSH mennyiség ebben a konstrukcióban sem változott szignifikánsan (NOCTOR et al. 1998a; NOCTOR et al. 1998b). A glutation bioszintézisében a glutaminsav és cisztein kapcsolódását a Ȗglutamilcisztein szintáz enzim (Ȗ-ECS) katalizálja, így Ȗ-glutamilcisztein (Ȗ-EC) dipeptid jön létre. Öt transzformáns nyárfában sikerült az enzimet túltermeltetni (ggs típusok) amelyekben a bakteriális Ȗ-ECS a citoszolban termelĘdik (ARISI et al. 1997). Az öt vonalból négyben mutatott a transzgén jelentĘs expressziót. A


28

levélkivonatokban a bakteriális fehérje mennyisége összefüggésben volt a transzgén expressziójával. A transzformáns vonalakban a GS és GR aktivitás nem mutatott változást a kontroll vonalakhoz képest, viszont 2-4 u nagyobb GSH tartalom volt mérhetĘ a levelekben. A GSH tartalom növekedése együtt járt a GSSG növekedésével, ezért a glutation redox viszonyai nem különböztek a kontroll vonalakhoz képest. A Ȗ-EC tartalom is 5-15 u-ös mértékben nĘtt. A szabad aminosavak

mennyiségének

meghatározása

megmutatta,

hogy

a

levelek

glutaminsav- és glicintartalma nincs befolyással a Ȗ-ECS túltermeltetésére (ARISI et al. 1997; NOCTOR et al. 1998a). KésĘbbi munkákban a bakteriális Ȗ-ECS enzimet a kloroplasztiszban termeltették túl (Lgl vagy Lggs). Hét független vonalat állítottak elĘ, amelyekbĘl öt különösen nagy Ȗ-ECS aktivitást mutatott, amely korrelált a western hibridizációban kapott sáv intenzitásokkal. Kloroplaszt izolálás után végzett mérések megerĘsítették, hogy a transzgén fehérjeterméke az Lgl klónokban a kloroplasztiszban, a ggs klónokban pedig a citoszolban van jelen. Az Lgl klónokban 4-5u magasabb enzimaktivitás tapasztalható, ami a GR enzimhez hasonlóan a kloroplasztban lévĘ stabilabb állapottal magyarázható. Hasonlóan a ggs klónokhoz, az Lgl konstrukciókban is erĘsen nĘtt a tiol tartalom. A Ȗ-EC a levelekben még a ggs klónokénál is nagyobb mennyiségben volt jelen (a kontrollhoz képest 50u-es mennyiség). Ezek a transzgénikus növények bizonyítják, hogy a Ȗ-ECS túltermeltetésével a növényekben megemelhetĘ a GSH tartalom a növény növekedésének károsodása nélkül (NOCTOR et al. 1998a).

2.10. Nyárfa alkalmazása a fitoremediációban A fitoremediáció azon technológiák összefoglaló neve, amely növények felhasználásával végzi el a talajremediálást. Összehasonlítva a létezĘ fizikai és kémiai remediációs módszerekkel, a növények használata költséghatékony és kevésbé káros a környezetre. A mérgezés felszámolása történhet lebontással,

29


talajból történĘ kivonással (fitoextrakció), vagy a szennyezĘanyagok megkötésével, immobilizációjával (EPA 2000). A fitoextrakció során, a növények tápanyagfelvevĘ mechanizmusát használjuk fel a szennyezĘanyagok talajszint feletti szövetekben történĘ akkumulációjának megvalósításához (2/5. ábra). Néhány egymást követĘ növekedési periódus után a föld fölötti biomasszát begyĦjtve a szennyezés eltávolítható a területrĘl. A növényanyagból készült hamuban tovább koncentrálhatjuk a szennyezĘanyagokat, amelyeket

így

újrahasznosíthatunk,

vagy

speciális

hulladéktárolókban

helyezhetünk el. Az extrakcióra azok a növények alkalmasak, amelyek képesek a szennyezĘanyagok által okozott stressz tĦrésére, a szennyezĘanyagok nagy mennyiségben történĘ felvételére, és a föld fölötti szöveteikben történĘ akkumulációjára. A fitoremediáció egyik kritikus pontja a megfelelĘ növényfaj kiválasztása, amelyik képes tolerálni nagy mennyiségĦ szennyezĘanyagot a talajban. A fitoremediáció hatékonyságát lényegesen befolyásolja, hogy a növény mennyire képes a tolerálni a szennyezĘ anyagok toxikus formáinak nagy koncentrációját és az általuk generált aktív oxigénformákat. A Populus fajok alkalmassága a fitoremediációra nem vitatható. Ültetésük egyszerĦ, növekedésük gyors (4-5 m/év). Magas a transpirációs rátájuk, terebélyes gyökérzetük miatt elérik a talaj mélyebb rétegeit, könnyen adszorbeálják, lebontják és/vagy detoxifikálják a szennyezĘanyagokat, miközben gátolják a talajeróziót. Fajai világszerte elterjedtek fĘként az ártéri területeken, így nagy valószínĦséggel található a potenciális fitoremediációs területekre megfelelĘ Populus faj. A nyár vegetatív úton könnyen szaporítható. A nyár nem része az emberi tápláléknak, habár számos állatfaj hasznosítja a nyárfákat táplálékként, lakhelyként illetve párzási területként. A Populus fajok a fás növények közül a legjobban tanulmányozott genotípusok, számos módszert dolgoztak ki erdészeti, vegetatív szaporítási, nemesítési és betakarítási eljárásokra. Azon kívül szövettenyésztési technikák, genetikai módosítás és genetikai térképezés is könnyen elvégezhetĘ. Ezek alapján Populus ideális jelölt a genetikai transzformációra, valamint a


30

fitoremediációra történĘ nemesítésre (DIX et al. 1997). A legtöbb nyárfával végzett fitoremediációs feladatokat ez Egyesült Államokban végzik ahol már több olyan gazdasági társulás alakult amely fitoremediációs feladatok elvégzését vállalja.

2/5.ábra. A fitoextrakció folyamatának sematikus vázlata. A növény a talajból a gyökerein keresztül felveszi a szennyezĘdést (Pb), amelyeket a föld fölötti részeibe transzportál (EPA 2000).

2.11. Mikroszatellita (SSR) elemzés A genomelemzésnek, fajok/fajták/vonalak összehasonlításának módszerei jelentĘs bĘvülésen mentek keresztül napjainkban. A morfológiai (LINNÉ 1753, Species Plantarum) és biokémiai bélyegek (MARKERT és MOLLER 1959), majd az 1980-as évektĘl a molekuláris próbákon alapuló genetikai markereket (RFLP BOTSTEIN et al. 1980) követték a PCR (MULLIS és FALOONA 1987) alapú módszerek, elĘször a tetszĘleges bázissorrendĦ primereket alkalmazó RAPD analízis, majd a további módszerek (SSR-PCR, ISSR, AFLP, ALF-SSR stb) (GYULAI et al. 2005). Amikor PCR-fingerprintrĘl beszélünk, szükséges megemlíteni, hogy a módszer három, párhuzamosan kifejlesztett eljárásból (SPARs: single primer amplification reactions) született: RAPD (WILLIAMS et al. 1990), AP-PCR (WELSH és MCCLELLAND 1990) és DAF: (CAETANOANOLLES et al. 1991).

31


A két primert alkalmazó (primer-pár), faj-, és lókusz-specifikus módszerek közül munkánkban az SSR-PCR (simple sequence repeat) módszert alkalmaztam, amely során, a primerpár a genomban elĘforduló mikroszatellita ismétlĘdĘ szakaszok határoló szekvenciáihoz kapcsolódik (GUPTA et al. 1994; GYULAI et al. 2005; SZABÓ et al. 2005). Az eukarióta állati és növényi genom sajátsága, a kódoló DNS szakaszok melletti nagy mennyiségĦ (akár a totál genom 50-60%-áig), funkció nélküli, ismétlĘdĘ (repetitív) DNS szakaszok elĘfordulása. Öt nagy ismétlĘdĘ-DNS csoport ismert: szatellitek (mini-, és mikro-), általános ismétlĘdések, 'interspersed repeat'ek (rövid-, és hosszú-), retropozonok, pszeudogének, és a transzpozonok. A miniszatellitekben az alapszekvencia 10-15 bp hosszú, 3-4 szeres tandem ismétlĘdéssel (JEFFREYS et al. 1985). A mikroszatellitek gyakorisága eltér a növényekben és az állatokban. A növényi genomban ötször kevesebb SSR található, pl. egy közel 20 bp hosszú SSR, amely az emberi genomban 6 kb-ként fordul elĘ, a Brassica fajokban csak 19 kbként található (LAGERCRANTZ et al. 1993). Korábbi adatok átlagosan 1 SSR / 10 kb

DNS

gyakorisággal

számoltak

(TAUTZ

1989).

A

növényi

genom

legelterjedtebb dinukleotid SSR szekvenciája az AC/TG motívum, ennél kevesebbszer fordul elĘ az AT/TA és CT/GA motivumok. Ez a három dinukleotid SSR (átlag 1-6-szoros ismétlĘdéssel) teszi ki az összes növényi SSR közel 75%-át (LAGERCRANTZ et al. 1993). Az állati genom legelterjedtebb SSR szekvenciája a GT/CA motivum, 10–60 tandemszámmal, 50 000-100 000 kópia számban (HAMADA et al. 1982; WEBER 1990). A trinukleotidok közül a rizsre a [GGC]n SSR elĘfordulása a jellemzĘ n=13 tandem számmal (ZHAO és KOCHERT 1993). A genom SSR szakaszainak eredete, és eltérĘ hossza, amely a PCR polimorfizmust eredményezi, feltehetĘen a DNS replikáció, illetve reparáció (repair)

során

fellépĘ

csúszási

mutáció

(slippage

mutation)

eredménye

(SCHLÖTTERER és TAUTZ 1992). Ez a mechanizmus eltér a miniszatellitek variabilitásának feltételezhetĘ okától, amelynek eredményeként a váltakozó

32


purin/pirimidin bázisok, mint pl. a [GT]n és a [GC]n, a DNS Z-alakú térszerkezetének kialakítását eredményezi (Z-DNS), továbbá a génregulációban és a kromoszóma kondenzációjában játszhat szerepet (LAGERCRANTZ et al. 1993). A mikroszatellitek, szekvenciájuk alapján, három csoportba sorolhatók: tökéletes (perfect) SSR, pl. [ATG]10, a megszakított (imperfect) SSR, pl. [AT]10CACA[AT]10, valamint az összetett (compound) SSR, pl. [[AT]10[CA]]10. Munkánk során mindhárom csoportba tarozó SSR-t alkalmaztuk.

2.12. Szomaklonális variabilitás nyár fajokban A fás növények in vitro klonális szaporítása hatékony módszer az elit genotípusok fölszaporítására a létrehozható utódok nagy száma miatt. Azoknál a fajoknál, ahol a vegetatív szaporítás nehézségekbe ütközik, a mikroszaporítás lehet a megfelelĘ módszer a genotípusok változatlan fenntartására. A szövettenyésztés során a sejt szabályozási folyamatai károsodást szenvedhetnek (SÁGI és BARNABÁS, 1989), ami a genetikai anyag megváltozását is elĘidézheti a szövettenyésztés során létrejött utódnemzedékben, vagyis szomaklonális variabilitás jöhet létre. E variabilitás elĘfordulása potenciális nehézséget jelenthet egy elit növényanyag mikroszaporítással való fönntartása és fölszaporítása során. Azonban a stabil szomaklonális változatok felhasználhatóak a nemesítésben. A szomaklonális variabilitás eredményezhet különbözĘ morfológiai, fiziológiai változásokat illetve a növény betegség-ellenállósága is megváltozhat. A szomaklonális variabilitásnak az évelĘ és fás növényeknél különösen nagy a jelentĘsége, mert elĘfordulhat, hogy egy olyan tulajdonság változik meg amely fenotípusosan csak késĘi fejlĘdési stádiumban vagy csak az utódokban jelenik meg (HESZKY et al. 1989; GYULAI et al. 1992; GYULAI et al. 2003). A

Populus

nemzetségben

beszámoltak

már

számos

tulajdonság

megváltozásáról (morfológiai, fiziológiai, biokémiai, betegségrezisztencia, herbicid

33


tolerancia), amely szövettenyésztés során regenerált utódokban jelentkezett (FRY et al. 1997). Számos módszerrel lehet detektálni a szövettenyésztés során létrejött variabilitás növekedését, melybe beletartozik a fenotípus azonosítás, citológiai módszerek, biokémiai és molekuláris markerek. A molekuláris markereket a fás növények azonosításában és nemesítésében már széles körben alkalmaznak. AFLP és SSR markerekkel már több mint 25 nyárfaj és klónjaik filogenetikai kapcsolatát tanulmányozták (CERVERA et al. 2005; FOSSATI et al. 2005). Már rendelkezére állnak PCR alapú markerek amelyekkel a P. nigra megkülönböztethetĘ a közeli rokon P. deltoides-tĘl ill. a hibrid P. u canadensis-tĘl (HOLDEREGGER et al. 2005). Sikerrel alkalmaztak SSR markereket a P. tremula földrajzi elterjedésének monitorozására (GOMEZ et al. 2003). Nagyszabású európai együttmĦködés keretében 675 génbanki P. nigra klón genetikai diverzitását elemezték, a vizsgálatban a molekuláris markerek bizonyultak a leghatékonyabbnak (STORME et al. 2004). Szomatikus klónok genetikai variabilitásának molekuláris markerekkel történĘ vizsgálatát már több fás növényen végezték el mint pl. cukorsüvegfenyĘn (Picea glauca) (ISABEL et al. 1996), lucfenyĘn (Picea abies) (FOURRE et al. 1997), kocsányos tölgyön (Quercus robur) (WILHELM et al. 2005), pekándión (Carya illinoiensis) (VENDRAME et al. 1999), kivin (Actinidia deliciosa) (PALOMBI és DAMIANO 2002),valamint a Populus fajok közül transzgénikus feketenyáron (P. nigra) (WANG et al. 1996) és rezgĘnyáron (P. tremuloides) (RAHMAN és RAJORA 2001). A genetikai diverzitás kimutatására széleskörben alkalmazzák a mikroszatellita (SSR) markereket, aminek oka az egyszerĦ öröklĘdés, kodominancia, érzékenység és a jó reprodukálhatóság. A mikroszatellita lókuszokon elĘforduló genetikai variabilitás nem okoz fenotípusos változást, mert ezek a lókuszok a genom kódoló régióin kívül találhatóak, vagyis segítségükkel azok a variációk is detektálhatóak, amelyek fenotípusos manifesztálódása nem várható.

35

Anyag és módszer

3. Anyag és módszer 3.1. Táptalajok A nyárnövények in vitro fenntartásához, mikroszaporításához, valamint a stresszkísérletekhez WPM (Woody Plant Media) táptalajt (LLOYD és MCCOWN 1980) használtunk a 3/1. táblázat szerint.

3/1. táblázat A kísérletekben alkalmazott WPM táptalaj összetétele

ÖsszetevĘk NH4NO3 CaCl2 MgSO4 KH2PO4 Ca(NO3)2 K2SO4 FeNaEDTA MnSO4 x 2H2O ZnSO4 x 7H2O H3BO3 Na2MoO4 CuSO4 x 5H2O Inozit Thiamin Nikotinsav Piridoxin Glicin Szacharóz Agar

Koncentrációk mg/l 400 96 370 170 556 990 36,70 22,30 8,60 6,20 0,25 0,25 100 1 0,5 0,5 2 20 000 7 000

Hajtásregeneráláshoz valamint a levélkorong-tesztekhez a táptalajt a következĘ hormonokkal egészítettük ki: x

1 mg/l benziladenin,

x

0,2 mg/l naftilecetsav

A táptalajok pH értékét 5,6-5,8 közé állítottuk be, autoklávozással sterilizáltuk (KISS et al. 2001).

36

Anyag és módszer

3.2. Molekuláris biológiai módszerek 3.2.1 DNS-izolálás Genomikus

DNS

izolálást

0,1

g

friss

levélszövetbĘl

CTAB

(cetiltrimetilammónium bromid) extrakciós pufferrel végeztük (MURRAY és THOMPSON 1980; DOYLE és DOYLE 1990), az alábbiak szerint:

x

A leveleket (0,1 g) elĘhĦtött mozsárba helyeztük majd cseppfolyós nitrogént öntöttünk rá. A megfagyott levéldarabokat porrá dörzsöltük.

x

Az elporított mintát 2 ml-es eppendorf csĘbe tettük és 600 ml CTAB extrakciós pufferben homogenizáltuk.

x

A mintákat 60 percig 65ºC-on inkubáltuk.

x

A

keveréket

azonos

térfogatú

fenol-kloroform-izoamil

alkohol

(25:24:1) eleggyel 10 percig rázógépen rázattuk. A fázisokat centrifugálással választottuk el egymástól. (10 perc; 13 000 g; 4ºC) DNS a felsĘ színtelen fázisban különül el, amelyet új csĘbe pipettáztunk át. x

A DNS-t a vizes fázisból azonos térfogatú izopropanollal csaptuk ki.

x

A csapadékot centrifugálás után (10 perc; 13 000 g; 4ºC) 75%-os etil alkohollal mostuk, majd feloldottuk 200 ml TE pufferben.

x

A mintákat RNáz-A (Sigma, R-4875) oldattal kezeltük (100 μg/ml) 30 percig 37ºC-on

x

Az izolált minták minĘségét és koncentrációját horizontális agaróz gélen (1%) illetve Nanodrop spektrofotométerrel határoztuk meg.

3.2.2 RNS izolálás, cDNS szintézis Totál RNS izoláláshoz TRI reagenst (Sigma) használtunk. Az izolálás elĘtt RNáz mentes vizet készítettünk: vízben 0,01% dietil-pirokarbonátot oldottunk egy éjszakán át, majd autoklávoztuk. Az RNS izolálást a következĘképpen végeztük el:

37

Anyag és módszer

1. Homogenizálás x

ElĘhĦtött mozsárba 0,1 g levélszövetet helyeztünk, majd cseppfolyós nitrogént öntöttünk rá. A megfagyott levéldarabokat porrá dörzsöltük.

x

Az elporított mintát 2 ml-es Eppendorf csĘbe tettük és 1 ml TRI reagenst mértünk hozzá, rázással homogenizáltuk és 5 percig szobahĘmérsékleten tároltuk.

2. Fázisszeparálás x

200 μl kloroformot adtunk hozzá, 15 másodpercig erĘsen ráztuk majd 15 percig szobahĘmérsékleten állni hagytuk.

x

Centrifugálás: 13 000 g, 15 perc, 4qC.

x

RNS a felsĘ színtelen fázisban (kb. 600 μl), átpipettáztuk új csĘbe.

3. Kicsapás x

500 μl izopropanollal kicsaptuk az RNS-t.

x

A mintákat 10 percig szobahĘmérsékleten inkubáltuk.

x

Centrifugálás: 13 000 g, 8 perc, 4qC. Kicsapódott RNS a csĘ falán, errĘl leöntöttük az izopropanolt.

4. Mosás, szárítás x

1 ml RNáz mentes vízzel készített 75%-os etil-alkoholt mértünk a mintákra, majd vortexxel fölkevertük.

x

Centrifuga: 7 500 g, 5 perc, 4qC. Az alkoholt leöntöttük az RNS-rĘl.

Az elĘzĘ két lépést 3x végeztük el. x

A mintákat 5 percig szárítottuk.

5. Oldás x

50 μl RNáz mentes vízben oldottuk föl a mintákat.

x

10 percre 55qC-os vízfürdĘbe helyeztük.

x

Az RNS oldatokat -20qC-on tároltuk.

A totál RNS oldatok koncentrációját és minĘségét spektrofotométerrel határoztuk meg. A totál RNS-bĘl egyszálas cDNS-t szintetizáltunk RevertAid™

Anyag és módszer

38

First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) használatával. A reakciót 20 μl végtérfogatban végeztük, a reakcióelegy tartalma a következĘ volt: 3 μg totál RNS; 0,5 μg oligo(dT)18 primer; 1u puffer; 2 mM dNTP mix; 20 egység RiboLock ribonukleáz inhibitor; 200 egység RevertAid M-MuLV reverz transzkriptáz. A cDNS szintézist 42qC-on 60 percig végeztük, majd a reakciót 70qC-on 10 perces reakcióidĘvel állítottuk le. A mintákat jégen tároltuk vagy azonnal PCR reakciót indítottunk velük.

3.3. Növényanyag A vizsgálatokhoz a szürkenyárhibrid (Populus tremula × Populus alba = Populus × canescens) géntechnológiával módosított klónjait alkalmaztuk (INRA No.717-1-B4): x x x

11ggs (ARISI et al. 1997) 6Lgl (NOCTOR et al. 1998a) nem-transzformált kontroll

A növényeket az Escherichia coli baktériumból származó Ȗ-glutamil-cisztein szintáz (Ȗ-ECS) enzimet kódoló génnel (gsh1) transzformálták. Az enzim a glutation tripeptid bioszintézisének elsĘ lépését katalizálja. A gsh1 gén cDNSe klóntárból állt rendelkezésre (WATANABE et al. 1986). A gén eredeti start-kodonját (TTG) PCR technikával ATG szekvenciára módosították. Magát a kódoló szekvenciát (1,7 kb) tartalmazó HindIII/SmaI fragmentumot a pLBR19 plazmidba klónozták. A promóter a karfiol mozaik vírus (CaMV) konstitutív 35S promótere volt, dupla felerĘsítĘ (enhancer) szekvenciával (p70) és a CaMV poli-A szekvenciájával. Ezt a CaMV-35S promóter – gsh1 – poli-A gén-kazettát a pBIN19 (BEVAN 1984) bináris vektorba klónozták egy SstI/XbaI inszertben. Az így elkészített vektort építették be az Agrobacterium tumefaciens C58 (pMP90) törzsébe (KONCZ és

39

Anyag és módszer

SCHELL 1986), és ezzel végezték el a szürkenyár hibrid (P. × canescens) genetikai transzformációját (LEPLE et al. 1992). Kétféle gsh1-génnel transzformált nyárfa klóntípust állítottak elĘ. A 11ggs klónban a transzgén fehérjeterméke a citoszolban expresszálódik (ARISI et al. 1997) (3/1. ábra). A 6Lgl klónban a CaMV-35S promóter és a gsh1 gén közé beépítették a borsó RUBISCO gén kis alegységének tranzit peptidjét (pea rbcS), aminek következtében a gsh1 gén terméke beszállítódik a kloroplasztiszba (NOCTOR et al. 1998a) (3/1. ábra). A transzgénikus klónokban a GSH tartalom 24 u nagyobb, mint a kontroll klónokban.

3/1. ábra A) A transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a Ȗ-ECS citoszolban való túltermeltetéséhez. LB: bal oldali határoló régió; P-p70: karfiolmozaik-vírus 35S promótere dupla felerĘsítĘ (enhancer) szekvenciával; gsh1: a Ȗ-ECS enzimet kódoló gén szekvenciája; T-35S: karfiolmozaik-vírus poli(A) szekvenciája; T-nos: nopalin szintáz promótere; nptII: neomycin foszfotranszferázt kódoló gén szekvenciája; P-nos nopalin szintáz terminátor szekvenciája; RB: jobb oldali határoló régió (ARISI et al. 1997) nyomán). B) A transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a Ȗ-ECS kloroplasztiszban való túltermeltetéséhez. rbcS: borsó RUBISCO enzim kis alegységének tranzitpeptidjét kódoló része (NOCTOR et al. 1998a) nyomán).

A szürkenyár klónok (11ggs, 6Lgl, kontroll) steril hajtásai Németországból (Albert-Ludwigs-Universität, Institut für Forstbotanik und Baumphysiologie, Freiburg) érkeztek tanszékünkre (3/2. ábra).

Anyag és módszer

40

A negyedikként vizsgált fekete nyár N-SL klónját (Populus nigra, Sárvári Lovasiskola) az Erdészeti Kutató Intézet Sárvári Kutatóállomása gyĦjtötte be. In vitro tenyészetbe vonását tanszékünk kutatói végezték el rügykultúrából indított hajtástenyészetben (3/2. ábra) (KISS 1999).

3/2. ábra A Populus u canescens transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll klónjai, valamint a Populus nigra N-SL klónja.

Mikroszatellita elemzéshez portok eredetĦ, szabadföldön nevelt feketenyár (P. nigra) szomaklónokat (KISS et al. 2001) vontunk be a kísérletbe. Az általunk vizsgált összesen 37 szomatikus klón közül 29 (1.-29.) az N-SL (30.) klónról származik, 6 klón (31.-36.) pedig az N-309 (37.) klónról. A klónok fejlesztése a következĘ módon történt: duzzadt rügyekbĘl 4qC-os hidegkezelést és felületi sterilezést követĘen portokot izoláltak és hormonokkal és szacharózzal kiegészített MS táptalajon kalluszt indukáltak belĘlük 6-7 héten keresztül 25qC-on sötétben. A kifejlett kalluszokat hajtásregeneráló MS vagy WPM táptalajra helyezték, és 16 h fény/8 h sötét fotoperiódusban inkubálták.

41

Anyag és módszer

A regenerálódott hajtásokat gyökérindukáló táptalajra helyezték. A gyökeres növényeket cserépbe ültették, majd a megfelelĘ méret elérése után szabadföldre telepítették. A szabadföldi kiültetésre 1993-1996 között került sor (KISS et al. 2001) (3/3. ábra ).

3/3. ábra A Populus nigra N-SL és N-309 klónjaiból származó szabadföldön nevelt szomaklónok (GödöllĘ 2005).

3.4. In vitro szaporítás és fenntartás Ahhoz hogy a stresszvizsgálatokat elvégezhessük, biztosítani kell, hogy megfelelĘ idĘben rendelkezésre álljanak a megfelelĘ korú gyökeres hajtások. A mikroszaporítás lépései a 3/4. ábrán láthatók. A meggyökeresedett hajtásokból vágot nodális szegmenteket hormonnal kiegészített hajtásregeneráló WPM táptalajra (3.1 fejezet) helyezve újabb hajtások regenerálódnak. A megfelelĘ

Anyag és módszer

42

méretet elért hajtásokat hormonmentes WPM táptalajba helyezve gyökeres hajtások fejlĘdtek. A tenyészeteket 22±2°C-on neveltük fényszobában (40 W-os Tungsram fénycsövek) fluoreszcens fényben, 16 h fény / 8 h sötét fotoperiódusnál és 40 μEm2s-1 fényintenzitás mellett. Az állományt így évek óta sikerül fenntartani és szaporítani in vitro körülmények között.

3/4. ábra A P. x canescens in vitro mikroszaporításának lépései. A gyökeres hajtás (1) szárát földaraboljuk, és hajtásregeneráló táptalajra helyezzük (2). A táptalajon hajtáskezdemények (3) majd hajtások (4) fejlĘdnek. A hajtásokat gyökereztetĘ táptalajra helyezve (5) azok gyökeret fejlesztenek és létrejönnek a gyökeres hajtások. Így a nyár tenyészetek fenntarthatóak és szaporíthatóak (6) (BITTSÁNSZKY et al. 2005a).

3.5. A transzgén stabilitásának kimutatása A transzformált szürkenyár klónokba bevitt E. coli gsh1 transzgén (Genbank No. X03954) valamint a konstrukcióban szereplĘ karfiolmozaik vírus 35S promótere, és a 6Lgl klónba beépített borsó (Pisum sativum) RUBISCO kis alegységének tranzitpeptidje (pea rbcS, Genbank No. M25614) jelenlétének bizonyítására PCR reakciókat végeztünk

43

Anyag és módszer

A PCR reakcióhoz totál DNS-t izoláltunk a 3.2.1 fejezetben leírtak szerint. A kísérletekhez egyedeket vizsgáltunk, klónonként öt ismétlésben.

A következĘ primereket használtuk többféle kombinációban: x 35S a: 5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’ (a CaMV 35S promóter 154-172 bp pozíciójában) x gsh1 a: 5’-atc ccg gac gta tca cag g-3’ (a gsh1 gén 341-359 bp pozíciójában) x gsh1 b: 5’-gat gca cca aac aga taa gg-3’ (a gsh1 gén 939-920 bp pozíciójában) x pea rbcS a: 5’-cag aag tga gaa aaa tgg ct-3’ (pea rbcS gén 18-37 bp pozíciójában) x pea rbcS b: 5’-cat gca ctt tac tct tcc ac-3’ (pea rbcS gén 186-205 bp pozíciójában) A

primereket

a

szekvenciaadatokból

Primer3

(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi;

programmal

ROZEN

és

SKALETSKY 2000) terveztük. A reakciókat Perkin Elmer 9700 Thermocycler készülékben végeztük. A reakcióelegy összetétele 25 μl végtérfogatban: 1 u puffer (West Team); 1 μM MgCl2; 1,2 mM dNTP; 1 egység Taq polimeráz (West Team), 1-1 μM forwardreverse primer, 50-100 ng templát DNS. A ciklusidĘket és hĘmérsékleteket a 3/2. táblázat tartalmazza. 3/2. táblázat A gsh1 transzgén stabilitásának ellenĘrzésére alkalmazott PCR reakció hĘmérsékletei és ciklusideje Ciklus 1u 35 u

1u

HĘmérséklet

IdĘ

94ºC

120 s

94ºC

10 s

60ºC

30 s

72ºC

60 s

72ºC

120 s

4ºC

f

A kapott DNS fragmenteket az agaróz gélbĘl spin column készlettel (Sigma) visszaizoláltuk, majd a MezĘgazdasági Biotechnológiai Központ szekvenáló

44

Anyag és módszer

laboratóriumába küldtük szekvenálásra. A visszakapott szekvencia adatokat BioEdit Sequence Alignment Editor szoftverrel (HALL 1999) dolgoztuk föl. Hasonlósági adatokat BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programmal (ALTSCHUL et al. 1997) kerestünk az NCBI (National Center for Biotechnology Information) honlapján.

3.6. A transzgén expressziójának kimutatása A szürkenyár klónokba bevitt transzgén expressziójának bizonyítására RTPCR reakciót végeztünk. A klónokból (11ggs, 6Lgl, kontroll) totál RNS-t izoláltunk, abból cDNS-t készítettünk a 3.2.2 fejezetben leírtak szerint. A kísérletekhez egyedeket vizsgáltunk, klónonként három ismétlésben. A cDNS-t templátként használva PCR reakciókat indítottunk a gsh1 a és gsh1 b primerpárral (3.5 fejezet). A reakcióelegy összetétele 16 μl végtérfogatban a következĘ volt: 1 u AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems); 0,625 – 0,625 μM forward-reverse primer; 3 μl cDNS. A ciklusidĘket és hĘmérsékleteket a 3/3. táblázat tartalmazza. A reakciótermékek elválasztását horizontális agaróz gélen (1,5%) végeztük és etidium-bromidos festéssel tettük láthatóvá. 3/3. táblázat A gsh1 transzgén expressziójának ellenĘrzésére alkalmazott PCR reakció hĘmérsékletei és ciklusideje Ciklus 1u 35 u

1u

HĘmérséklet

IdĘ

95ºC

120 s

95ºC

10 s

60ºC

30 s

72ºC

60 s

72ºC

600 s

4ºC

f

45

Anyag és módszer

3.7. Klónstabilitás tesztelése fAFLP módszerrel A szürkenyár klónokból (11ggs, 6Lgl, kontroll) totál DNS-t izoláltunk, klónonként 10 egyedbĘl a 3.2.1 fejezetben leírtak szerint. A DNS mintákból klónonként 10 egyedbĘl bulk-okat hoztunk létre (MICHELMORE et al. 1991). A klónok stabilitását fAFLP (fluorescent amplified DNA fragment length polymorphism) eljárással vizsgáltuk VOS et al. (1995) módszere alapján módosításokkal (CRESSWELL et al. 2001; SKØT et al. 2002; GYULAI et al. 2005) a DNS mintákból létrehozott bulk-okon. Az emésztéshez és ligáláshoz az EcoRI-MseI restrikciós endonukleázokat használtuk (3/4 táblázat). 3/4. táblázat Az fAFLP-nél alkalmazott restrikciós enzimek (ritkán hasító EcoRI és gyakran hasító MseI), adapterek, a nem szelektív és a 12 aktív szelektív primer pár (a-l) szekvenciaadatai (GYULAI et al. 2005)

EcoRI Restrikciós helyek ź

MseI ź

5’-……gaattc……-3’ 3’-……cttaag……-5’ Ÿ

5’-……ttaa….-3’ 3’-….aatt….-5’ Ÿ

Adapter szekvenciák 5’-ctc gta gac tgc gta cc cat ctg acg cat ggt taa-5’

5’-gacg atg agt cct gag tac tca gga ctc AT-5’

Nem szelektív primerek EcoA: 5’-gac tgc gta cca attc-a

MseC: 5’-gat gag tcc tga gtaa-c

Szelektív primerek (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) (l).

5’-gac tgc gta cca attc-aat 5’-gac tgc gta cca attc-acc 5’-gac tgc gta cca attc-agt

5’-gac tgc gta cca attc-agt

5’-gat gag tcc tga gtaa-cac 5’-gat gag tcc tga gtaa-caa 5’-gat gag tcc tga gtaa-cag 5’-gat gag tcc tga gtaa-cat 5’-gat gag tcc tga gtaa-ccc 5’-gat gag tcc tga gtaa-cct 5’-gat gag tcc tga gtaa-cga 5’-gat gag tcc tga gtaa-cgc 5’-gat gag tcc tga gtaa-cta 5’-gat gag tcc tga gtaa-ctc

Anyag és módszer

46

Az elsĘ PCR reakciót a nem szelektív primerekkel (3/4. táblázat) 30 ciklusban végeztük a következĘ ciklusidĘkkel: 94ºC 30 s, 56ºC 30 s, 72ºC 1 perc. A terméket 0,1× TE-vel 5u hígításban templátként használtuk a szelektív PCR reakcióhoz. A szelektív amplifikációhoz 24 primer-kombinációt használtunk JOE fluoreszcens festékkel jelölt *Eco primerekkel. Az elsĘ tizenkét primer kombinációban az Mse-CAC primert párosítottuk a jelölt *Eco -aaa, -aac, -aag, aat, -aca, -acc, -agg, -act, -aga, -agc, -agg, -agt primerekkel. A második tizenkettĘ kombinációban a jelölt *Eco-AGT primert párosítottuk az Mse -caa, -cag, -cat, cca, -ccc, -ccg, -cct, -cga, -cgc, -cgg, -cgt, -cta primerekkel. Hot Start PCR-rel kombinált touchdown PCR reakciót alkalmaztunk a minták felszaporítására (DON et al. 1991; ERLICH et al. 1991). A reakcióelegy végtérfogata 10 μl amely tartalmazott 1 u AmpliTaq Gold PCR Master Mix-et, 20 pmolt mindkét primerbĘl, valamint 50 ng DNS templátot. A touchdown PCR-t PE 9700 Thermocycler készülékben (Applied Biosystem) következĘk szerint végeztük: 12 cikluson keresztül a 30 s hosszú kapcsolódási hĘmérsékletet (Tm) egyenletesen 66ºC- ról 56ºC-ra csökkentettük. További 25 ciklust 56ºC kapcsolódási hĘmérséklettel végeztünk majd az utolsó ciklus: 60ºC -on 45 s-ig tartott. Az AFLP termékeket 5 percig 98ºC-on denaturáltuk és 30 percig 60ºC-on tartottuk vagy közvetlenül ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) készülékkel fragment analízist végeztünk. Az eredményeket ABI PRISM Genotyper 3.7 NT szoftverrel dolgoztuk föl.

3.8. Cink stressz in vitro A Zn terhelési kísérleteket aszeptikus körülmények között levélkorongtenyészetekkel végeztük ZnSO4 oldat felhasználásával. Hormonokkal kiegészített (1 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) hajtásregeneráló WPM táptalajhoz (3.1 fejezet) ZnSO4 oldatot különbözĘ koncentrációkban adagoltuk.

47

Anyag és módszer

A táptalajok végkoncentrációit a következĘ értékre állítottuk be: 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 M és cinkmentes kontroll. Steril nyárfa hajtások fiatal leveleibĘl 8 mm átmérĘjĦ levélkorongokat vágtunk melyeket színükkel felfelé a táptalajra helyeztünk, kezelésenként 21-et (GYULAI et al. 1995). A tenyészeteket 21 napig inkubáltuk 22±2°C -on 8 h sötét / 16 h fény (40 μEm2s-1) fotoperiódusban.

3.9. Paraquat stressz in vitro Hormonokkal kiegészített (1 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) WPM táptalajhoz eltérĘ mennyiségĦ

paraquatot

(metil-viologén,

Sigma)

adagoltunk.

A

paraquat

végkoncentrációit a táptalajokban a következĘ értékekre állítottuk be: 4u10-3 M; 4u10-4 M; 4u10-5 M; 4u10-6 M; 4u10-7 M; 4u10-8 M; 4u10-9 M; 4u10-10 M illetve paraquat nélküli kontroll. A sterilre szĦrt paraquat oldatot az autoklávozott táptalajhoz szilárdulás elĘtt adagoltuk. A táptalajok szacharóz tartalma 0,2%, 1%, ill. 2% volt. Az elkészített, agarral szilárdított táptalajokat petricsészékbe öntöttük. Steril, két hónapos nyárfa hajtások fiatal leveleibĘl vágott levélkorongokat helyeztünk rájuk színükkel felfelé, kezelésenként 15-öt (GYULAI et al. 1995). A tenyészeteket 22±2°C -on, 24 h sötét ill. 16 h fény (40 μEm2s-1) / 8 h sötét fotoperiódusú fényszobában 8 napon keresztül inkubáltuk.

3.10. Biokémiai vizsgálatok Levélkorongok

nehézfémtartalmát

ICP

(inductively

coupled

plasma

spectrophotometer) készülékkel (ZARCINAS et al. 1987) mérettük meg az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutató Intézetében A glutation S-transzferáz enzim aktivitását spektrofotometriás módszerrel mértük meg CDNB-t alkalmazva szubsztrátként (HABIG et al. 1974). A méréseket az MTA Növényvédelmi Kutató Intézetében végeztettük el.

Anyag és módszer

48

Három független mérésbĘl kapott értékeket t-próbával hasonlítottuk össze a kontroll értékeivel. Az 5% fölötti eltéréseket szignifikánsnak fogadtuk el.

3.11. Klorofill fluoreszcencia A fotoszintetikus aktivitást és a stressz-kondíciót CFM-636973 típusú klorofill fluorométerrel jellemeztük (BARÓCSI et al. 2000). A készülékkel az Fv/Fm [(FmFo)/Fm] arányszámot 690 nm-en és az F690/F735 hányadost Fmax–nál mértük. A mérést megelĘzĘen a levélkorongokat 20 percig sötétben tároltuk. A mérések idĘtartama 4 perc volt. A méréseket három ismétlésben végeztük. Az eredményeket varianciaanalízissel hasonlítottuk össze 5%-os szignifikanciaszintnél, valamint post-hoc tesztet végeztünk LSD (least significant difference) módszerrel.

3.12. RT-PCR analízis Szubletális mennyiségĦ paraquatot tartalmazó (4u10-7 M) és paraquatot nem tartalmazó hajtásregeneráló WPM táptalajon tenyésztett ggs11 szürkenyár levélkorongokból (3.9 fejezet) totál RNS-t izoláltunk és cDNS-t szintetizáltunk a 3.2.2 fejezetben leírtak szerint. A génexpressziós vizsgálatokhoz génspecifikus primereket alkalmaztunk. Degenerált primereket terveztünk Primer3 program segítségével (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi; ROZEN és SKALETSKY 2000) a kukorica gst27 (X79515) szekvenciához BLAST program (ALTSCHUL et al. 1997) alapján leginkább hasonló 10 nyárfa EST szekvenciákra (Populus DB; STERKY et al. 2004): x x

5’– gca caa gaa aga gcc (a/g)tt cc –3’ 5’– agc tcc cag ttc agc ttt ga –3’

A kloroplasztban kódolt rbcS génre tervezett primereket alkalmaztunk a sejtek klorofilltartalmának kimutatására (GRAY-MITSUMUNE et al. 2004):

49

Anyag és módszer

x

5’-agc ttg taa gag atg gct tcc tc –3’

x

5’-cca cat agt cca gta gcg tcc at –3’

Kontrollként a 26S rRNS gént használtuk (GRAY-MITSUMUNE et al. 2004): x

5’-ttc cat ggt tcg atc ctt cc-3’

x

5’-gca ggg cga tcg tgt ttt tc –3’

Az RT-PCR reakciót MARONE et al. (2001) módszere alapján optimalizáltuk és a következĘ cikluskörülményeket találtuk a legoptimálisabbnak: a reakcióelegy összetétele 16 μl végtérfogatban a következĘ volt: 1 u AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems); 0,625 – 0,625 μM forward-reverse primer; 3 μl cDNS. Az optimalizált ciklusidĘket és hĘmérsékleteket a 3/5. táblázat tartalmazza. 3/5. táblázat Az RT-PCR reakciók hĘmérsékletei és ciklusideje Ciklus 1u 32 u

1u

HĘmérséklet

IdĘ

95ºC

120 s

95ºC

10 s

60ºC

30 s

72ºC

60 s

72ºC

600 s

4ºC

f

A reakciókat Perkin Elmer 9700 Thermocycler készülékkel végeztük a PCR termékeket

agaróz

(Chemilmager

TM

gélen

futtattuk

a

sávok

erĘsségét

denzitometráltuk

4400, Alpha Innotech Corporation, USA) és számítógéppel

elemeztük (Phoretix 1D Advanced, Nonlinear Dynamics, Ltd). A sávok intenzitásértékeibĘl számoltuk a kontrollként használt 26S rRNS génhez képest a relatív génexpressziót.

50

Anyag és módszer

3.13. Mikroszatellita diverzitás feketenyár szomaklónokban Vizsgálatainkat öt mikroszatellita primer párral végeztük. A primerek szekvenciáit a 3/6. táblázat tartalmazza. 3/6. táblázat A P. nigra mikroszatellita elemzéséhez alkalmazott primerek szekvenciái, az ismétlĘdĘ szekvenciamotívumokkal, irodalmi hivatkozással és NCBI hivatkozási számokkal SSR lókusz primer pár ismétlĘdĘ forrás (Accession No) szekvencia 1 WPMS-02 5’-aga aat acc cct gct aat c-3’ (GA)23 (VAN DER (AJ297270) 5’-aat gtt ttt gtt ccg tga at-3’ SCHOOT et al. 2000) 2 WPMS-04 5’-tac acg ggt ctt tta ttc tct-3’ (GT)25 (VAN DER (AJ297273) 5’-tgc cga cat cct gcg ttc c-3’ SCHOOT et al. 2000) 3 WPMS-06 5’-gta taa cga tga ccc cac gaa gac-3’ (GT)24 (VAN DER (AJ297275) 5’-tat aaa taa agg cat gac cag aca-3’ SCHOOT et al. 2000) 4 WPMS-20 5’-gtg cgc aca tct atg act atc g-3’ (TTCTGG)8 (SMULDERS et al. (AJ297293) 5’-atc ttg taa ttc tcc ggg cat ct-3’ 2001) 5 PTR-4 5’-aat gtc gag gcc ttt cta aat gtc t-3’ (TC)17 (DAYANANDAN et 5’-gct tga gca aca aac aca cca gat g-3’ al. 1998)

A reakcióelegy összetétele 25 μl végtérfogatban: 1 u puffer (West Team); 1 μM MgCl2; 1,2 mM dNTP; 1 U Taq polimeráz (West Team), 1-1 μM forward-reverse primer, 50-100 ng templát DNS. A mikroszatellita fragmentek felszaporítása touchdown PCR-rel történt (DON et al. 1991). A ciklusidĘket és hĘmérsékleteket a 3/7. táblázat tartalmazza.

3/7. táblázat A mikroszatellita elemzéshez használt PCR reakció hĘmérsékletei és ciklusideje Ciklus 1u 11 u

25 u 1u

HĘmérséklet 95ºC 95ºC 65ºC o 55ºC (ciklusonként -1ºC) 72ºC 95ºC 56ºC 72ºC 72ºC 4ºC

IdĘ 3 min 30 s 30 s 60 s 30 s 30 s 60 s 5 min f

Az SSR primer párok egyik tagját a fluoreszcens Cy5 molekulával jelöltük. A Cy5 abszorbanciája 643 nm-en emissziója 667 nm-en veszi föl a maximális értéket. Az

51

Anyag és módszer

SSR fragmentek szeparálását ALF Express II DNA Analyser (automated laser fluorometer) készülékkel ’ReproGel High Resolution’ PAGE gél (24%) (Amersham Bioscience) használatával rövid thermoplate-en végezetük. A futtatást 850 V-on, 50 mA-el, 50 W teljesítménnyel, 50qC-on 120 percen keresztül végeztük. Az adatok feldolgozása ALFwin Fragment Analyser 1.03 szoftverrel történt. A futtatásokhoz Cy5-el jelölt külsĘ és belsĘ molekulatömeg markereket alkalmaztunk standard-ként. A fragmentek léte és nem léte alapján SPSS 11 programmal klaszter analízis során dendrogrammot készítettünk Jaccard index használatával, csoporton belüli átlagos kapcsoltságok (Average Linkage, within group) figyelembevételével. Az egyes lókuszok variabilitását a PIC (Polymorphism Index Content) értékkel jellemeztük a következĘ képlet szerint (ANDERSON et al. 1993):

ahol pi az i-edik allél gyakoriságát jelenti. A WPMS 20 primerrel kapott DNS fragmenteket agaróz gélbĘl spin column készlettel (Sigma) visszaizoláltuk, majd a MezĘgazdasági Biotechnológiai Központ szekvenáló laboratóriumába küldtük Ęket. A visszakapott szekvencia adatokat BioEdit Sequence Alignment Editor szoftverrel (HALL 1999) dolgoztuk föl. Hasonlósági adatokat BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programmal (ALTSCHUL et al. 1997) kerestünk az NCBI (National Center for Biotechnology Information) honlapján.

53

Eredmények és megvitatás

4. Eredmények és megvitatás 4.1. A gsh1 transzgén jelenlétének és expressziójának bizonyítása A rekombináció alapvetĘ feltétele a kétszálas DNS törése, nemcsak a meiotikus hanem a szomatikus sejtekben is elĘfordulhat (PUCHTA 1999; FREWEN et al. 2000; ROHDE et al. 2002). Az évek során mikroszaporítással fenntartott transzgénikus nyártenyészetekben ez a transzgén törését is jelentheti, ezért szükséges a transzgén jelenlétének és expressziójának rendszeres ellenĘrzése. A 35S a és gsh1 b primerekkel sikerült fölszaporítani a várt fragmenteket (869 bp és 1208 bp) és ezzel a kombinációval el is különíthetĘ egymástól a két transzgénikus klón (4/1. A ábra). A 6Lgl klónban sikeresen kimutattuk a borsó rbcS gén tranzitpeptidjének jelenlétét a pea rbcS a/pea rbcS b primerpárral (4/1. B ábra).

A)

B)

4/1. ábra A) A transzgénikus nyárakba bevitt bináris vektor részleteinek kimutatása 35S a / gsh1 b primerpárral. szürkenyár (Populus u canescens) transzgénikus 11ggs és 6Lgl, valamint a nem transzformált kontroll klónjaiban, DNS nélküli kontrollal (-). B) A transzgénikus 6Lgl klónba beépített borsó rbcS gén jelenlétének bizonyítása pea rbcS a / pea rbcS b primerpárral.

A gsh1 a és gsh1 b primerekkel végzett PCR reakció során a transzgénikus klónokban sikerült fölszaporítani a várt 601 bp méretĦ DNS fragmentet, de azonos méretĦ terméket kaptunk a kontroll és N-SL mintákban, illetve a negatív kontrollban is (-) (4/2. ábra). A nem várt fragmenteket a Taq polimeráz enzimben lévĘ E. coli-ból származó DNS szennyezĘdés okozhatta (KOPONEN et al. 2002).

54


4/2. ábra A transzgén jelenlétének kimutatása az E. coli-ból származó gsh1 transzgén egy szakaszának PCR-rel történĘ felszaporításával a transzgénikus szürkenyár (Populus u canescens) 11ggs és 6Lgl klónjaiban, valamint a nem transzformás szürkenyár (kontroll) és feketenyár (P. nigra) N-SL klónokban, DNS nélküli kontrollal (-).

Az expresszió bizonyításához a gsh1 a/gsh1 b primerpárt alkalmaztuk, amivel megkaptuk a várt fragmentumokat, de halvány fragmentumokat kaptunk a kontroll nyárfaklónban illetve a negatív kontrollban is, aminek szintén az enzimben lévĘ E. coli DNS szennyezĘdés lehet az okozója. A kapott 601 bp hosszúságú fragmenteket megszekvenáltattuk. A gsh1 a / gsh1 b primerpárral, valamint a pea rbcS a / pea rbcS b primerpárral kapott fragmenteket megszekvenáltattuk. A BLASTn programmal kapott eredményeket a 4/1. táblázat tartalmazza.

4/1. táblázat A transzgénikus klónokból felszaporított és megszekvenált DNS fragmentek BLAST programmal kapott értékei klón

fragment

Accession No

11ggs

gsh 1

6Lgl 6Lgl

X03954

E érték (Expect) 1e-26

Azonosság (Identities) 80/87 (91%)

gsh 1

X03954

6e-22

88/100 (88%)

pea rbcS

M25614

5e-41

112/119 (94%)

A szekvencia azonossági értékére (Identities) 90% körüli értékeket kaptunk. A BLAST analízis eredménye alapján kijelenthetjük, hogy a nyárklónokba beépített konstrukció stabilan jelen van. Kísérleteiben hasonló eredményre jutott RENNENBERG és PEUKE (2005) is.

4.2. A gsh1-transzgénikus szürkenyár klónok genetikai stabilitása A mikroszaporítással fenntartott klónok genetikai azonosságát fAFLP módszerrel vizsgáltuk. A 24 szelektív primerkombinációból 12 adott éles és

55


reprodukálható AFLP mintázatot (4/3. ábra). Összesen 682 közös AFLP fragmentet detektáltunk (4/2. táblázat). A szelektív primer párok átlagosan 56,6 fragmentet szaporítottak föl, amely hasonló a feketenyárnál (P. nigra) megfigyelt fragmentum számhoz ahol két primer pár összesen 104 fragmentumot szaporított föl (SMULDERS et al. 2001). A leghatékonyabb primer kombinációnak az Eco-AGT / Mse-CAT bizonyult, klónonként 35 fragmentumot szaporított föl (4.2. táblázat) 4/2. táblázat Az fAFLP fragmentumok száma a gsh1 transzgénikus P. u canescens 11ggs és 6Lgl klónjaiban valamint a nem transzformált kontroll klónban. A szelektív primerkombinációkat következĘképpen alkalmaztuk: az Mse-CAC primert kombináltuk az Eco-AAT (a), Eco-ACC (b), és Eco-AGT (c) primerekkel; valamint az Eco-AGT primert kombináltuk az Mse-CAA (d), MseCAG (e), Mse-CAT (f), Mse-CCC (g), Mse-CCT (h), Mse-CGA (i), Mse-CGC (j), Mse-CTA (k) és Mse- CTC (l) primerekkel. (lásd még: 3/4. táblázat)

klónok a 11ggs 25 6Lgl 25 kontroll 25

Az fAFLP fragmentumok száma szelektív primerpáronként (a-l) b c d e f g h i j k l össz. 6 17 30 25 35 16 14 11 9 17 21 226 6 17 30 25 35 19 14 11 9 17 21 229 6 17 30 25 35 17 14 11 9 17 21 227

ValószínĦleg összefüggés lehet a genom mérete és az AFLP fragmentumok száma között. Egy korábbi, búzán (Triticum aestivum L.) végzett kísérletnél az Eco-AGT / Mse-CAC primer pár amplifikálta legtöbb fragmentet, összesen 47-et. A búza genom mérete igen nagy (2n = 6u = 42; 16 u 109 bp, ami 16,58 pg-nak felel meg a 965 Mbp =1 pg DNS egyenlĘség alapján számolva) a nyár genom méretéhez képest (2n = 4u = 38; 5,5 u 108 bp; 2C = 1,1 pg) (CERVERA et al. 2001; TAYLOR 2002). A 682 fragment közül 4 volt polimorf (99,4%), amelyek közül egy a nem transzformált

kontroll

nyárban,

három

a

6Lgl

transzgénikus

klónban

amplifikálódott az Eco-AGT / Mse-CCC primerpárral. A kísérlet szerint a 11ggs klón AFLP-vel detektált genetikai eltérése 0,4% a kontrollhoz képest, a 6Lgl klón eltérése 0,8 %. Az AFLP módszer nagyfokú érzékenysége miatt az itt kapott polimorfizmus mértékébĘl nem lehet következtetni

56


a teljes genomban fellelhetĘ különbségek szintjére. FOSSATI et al. (2005) Populus fajokkal végzet vizsgálatain két – azonos fajba tartozó – klón között AFLP fragmentekben 15 %-os eltérést kapott. (a) 150

160

170

180

1_43_AGT-CAT_C06_06.f sa

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

400

410

420

430

6 Green

11ggs

400 200

1_44_AGT-CAT_D06_08.f sa

6Lgl

8 Green

400 200

1_45_AGT-CAT_E06_10.f sa

10 Green

kontroll

600 400 200

(b) 150

160

170

180

1_54_AGT-CCC_F07_11.f sa

190

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

400

410

420

11 Green

11ggs

400 200

1_55_AGT-CCC_G07_13.f sa

13 Green

6Lgl 600 400 200

1_56_AGT-CCC_H07_15.f sa

15 Green

kontroll 600 400 200

4/3. ábra Példa a transzgénikus szürkenyár 11ggs és 6Lgl klónjainak és a nem transzformáns kontroll fAFLP fragment analízise során kapott monomorf (EcoAGT – MseCAT) (a) és polimorf (EcoAGT – MseCCC) mintázatára. (150 – 430 bp). A nyilak a polimorf fragmenteket jelölik (GYULAI, HUMPHREYS, BITTSÁNSZKY et al. 2005).

Eredményeink azt bizonyítják, hogy a kísérleteinkben alkalmazott P. u canescens klónok a transzgén konstrukciótól eltekintve genetikailag azonosnak tekinthetĘek (GYULAI et al. 2005).

4.3. A cink stressz gsh1-transzgénikus szürkenyárban A lombozat és a száraztömeg szignifikáns csökkenése figyelhetĘ meg nagy cink koncentrációval történĘ terhelés hatására Populus u euramericana I-214-es

57


klónjában. (DI BACCIO et al. 2003). Saját kísérletünkben a 10-1 M koncentrációjú Zn számos fitotoxikus és nekrotikus tüneteket okozott a kísérletben résztvevĘ összes klónon. A 10-2 M Zn koncentráció a levélkorongok fakulását okozta, mindazonáltal

minimális

növekedési

aktivitás

megfigyelhetĘ

volt.

Nem

tapasztaltunk toxikus hatást alacsonyabb cink koncentrációknál (10-3 – 10-5 M) sem a transzgénikus, sem a vad típusú P. canescens klónokban. A P. nigra klónok ettĘl némileg eltérĘ módon reagáltak a ZnSO4 adagolásra. A cinkkezelésre (10-2 – 10-5 M) a levélkorongok megbarnultak, növekedési aktivitásuk rendkívül alacsony volt. (4/4. ábra) Az eredményeink szerint a P. nigra N-SL klónja sokkal érzékenyebb a ZnSO4 kezelésre, mint a P. u canescens (BITTSÁNSZKY et al. 2005a).

4/4. ábra A Populus u canescens transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll klónjaiból valamint a Populus nigra N-SL klónjából vágott levélkorongok különbözĘ koncentrációjú (10-1 – 10-5M) ZnSO4-ot tartalmazó WPM táptalajon 21 nap tenyésztési idĘt követĘen (BITTSANSZKY et al. 2005) nyomán).

A levélkorongok nehézfémtartalmát a 4/5. ábra mutatja. Az endogén cink tartalom fokozatosan nĘtt a növekvĘ exogén cinkadagolással arányosan. A transzgénikus és a vad típusú klónok cinktartalma nem mutatott eltérést. Az exogén ZnSO4 adagolás serkentette a klónok Cu-felvételét a 11ggs klónban. A legnagyobb Cu-tartalmat 10-

Eredmények és megvitatás 2

58

M Zn-koncentráció mellett mértük. Ennél a Zn-koncentrációnál a 6Lgl klón

réztartalma 122,7%-os a 11ggs klóné 331,9%-os volt a kontroll szürkenyárhoz képest. A 11ggs klónban 10-1 M Zn-koncentráció mellett is 296,6%-os volt a réztartalom, míg a 6Lgl klónban közel megegyezett a kontrollal (BITTSÁNSZKY et al. 2005a). A 11ggs klón nagyobb nehézfém-felvevĘ képességet más kutatók is kimutatták (KOPRIVOVA et al. 2002). ElképzelhetĘ, hogy a nagyobb glutation tartalom nagyobb fitokelatin termelést eredményez, amint azt már egyéb nehézfémmel kezelt növényeknél is leírták (COBBETT 2000). A jelentĘs réz akkumuláció a 11ggs klón alkalmasságát jelzi in situ fitoremediációs célokra.

4/5. ábra A levélkorongok nehézfémtartalma (Zn, Cu), a transzgénikus P. u canescens 11ggs (-Ÿ-) és 6Lgl (-z-) valamint a nem transzformált kontroll (-{-) klónjaiban valamint a P. nigra N-SL (U-) klónjában, 21 napos ZnSO4-ot különbözĘ koncentrációban tartalmazó WPM táptalajon történĘ tenyésztést követĘen. Az átlagértékek és a szórás jelölve (n=3) (BITTSANSZKY et al. 2005).

Az irodalomban leírtak szerint a 11ggs , 6Lgl és a kontroll P.u canescens klónok levelekben mérhetĘ GST aktivitása között nincs különbség a stresszmentes körülmények mellett (GULLNER et al. 2001). A saját kísérletünkben ZnSO4 terhelés mellett viszont markánsan növekedett a nem transzformált klónokban és

59


kisebb mértékben a 6Lgl klón GST aktivitása, míg a 11ggs klónban nem változott az aktivitás. (4/6. ábra) A legnagyobb eltérés 0-3 M koncentrációnál jelentkezett, ahol a 11ggs klónban 20,6%-os a 6Lgl klónban 49,2% -os volt a GST aktivitás a kontroll szürkenyárhoz képest. Az enzimaktivitás növekedése a kisebb cink koncentrációnál jelentkezett (10-2 – 10-5 M), viszont a rendkívül fitotoxikus 10-1 M koncentrációnál a GST aktivitás teljesen lecsökkent az összes klónban. A transzgénikus klónokban mérhetĘ kisebb indukálhatóság azt mutatja, hogy a vad típusú klónokban a ZnSO4 kezelés nagyobb stresszt okozott (BITTSÁNSZKY et al. 2005a). Az Aspergillus nidulans egyik GST izoenzime szerepet játszik a kadmium és nikkel elleni rezisztenciában (RAI et al. 2003). Ezek szerint a nagyobb GST aktvitás összefüggésben van a megnövekedett detoxifikáló képességgel, mint ahogy ezt a Zn2+-el kezelt nyárfa levélkorongoknál is tapasztaltuk.

4/6. ábra A levélkorongok glutation S-transzferáz enzimaktivitása a transzgénikus P. u canescens 11ggs (-Ÿ-) és 6Lgl (-z-), a nem transzformált kontroll (-{-) klónjaiban valamint a P. nigra N-SL (-U-) klónjában, 21 napos ZnSO4-ot különbözĘ koncentrációban tartalmazó WPM táptalajon történĘ tenyésztést követĘen. Az átlagértékek és a szórás jelölve (n=3) (BITTSANSZKY et al. 2005).

A Populus u euramericana klónokban a cink hatására a biomassza csökkenését tapasztalták, miközben a fiatal levelekben a cinktartalom arányosan nĘtt az exogén cinktartalommal. NövekvĘ Zn koncentráció mellett az összes glutation tartalom


60

(GSH+GSSG) lecsökkent, viszont az oxidált glutation mennyisége nĘtt az összmennyiséghez képest, ami alátámasztja, hogy a cinktúlterhelés oxidatív stresszt okoz (DI BACCIO et al. 2005).

4.4. Paraquat stressz gsh1-transzgénikus szürkenyárban ElsĘ lépésben a paraquat szubletális koncentrációjának meghatározását végeztük el. A 4u10-3 M – 4u10-6 M koncentrációkon a levélkorongok 8 nap elteltével mind kifakultak. A 4u10-7 M paraquat koncentrációnál a levélkorongok részlegesen kifehéredtek, fehér foltok jelentkeztek a zöld levélen. Az összes többi alacsonyabb koncentrációnál vizuálisan nem tapasztaltunk eltérést a paraquat nélküli kontrollhoz képest, mindenhol zöldek maradtak a korongok. A fentiek alapján megállapítható, hogy a nyár levélkorongok számára a 4u10-6 M paraquat koncentráció letális, a 4u10-7 M szubletális, a 4u10-8 M pedig már vitális, ezért a vizsgálatokat ebben a tartományban célszerĦ elvégezni. A paraquat mĦködĘ fotoszintézis mellett hatékonyabban fejti ki hatását, viszont exogén szacharóz kiegészítés mellett a növény nincs rákényszerítve, hogy mĦködtesse fotoszintetikus rendszerét, energiát a táptalajból is nyerhet. Ezért a fotoszintézis stimulálása érdekében a táptalajok szacharóz tartalmát az eredeti 2%os tartalomról néhány esetben lecsökkentettük. A fény szerepének tisztázására a tenyészetek egy részét sötétben inkubáltuk. A fényen tárolt 1%-os és 2%-os szacharóz koncentrációjú táptalajon tenyésztett nyár levélkorongok között vizuálisan nem észleltünk különbséget, mindkét esetben a várt mintázatot kaptuk, vagyis a 4u10-6 M paraquat koncentráció mellett a korongok kifakultak, míg a 4u10-7 M koncentrációnál a levélkorongokon fehér foltok jelentkeztek, a többi esetben a kontrollhoz voltak hasonlóak. Ezzel ellentétben, a sötétben tárolt tenyészetek semelyik paraquat koncentrációnál sem fehéredtek ki. Tehát nem mĦködĘ fotoszintetikus rendszer mellett a paraquat nem volt képes károsítani a kloroplasztiszt.

61


4/7. ábra A Populus u canescens transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll klónjaiból vágott levélkorongok, melyeket különbözĘ koncentrációjú (1-3) paraquatot tartalmazó WPM táptalajon, eltérĘ környezeti körülmények mellett (A-D), 8 napig tenyésztettünk. 1: 0 M paraquat; 2: 4x10-7 M paraquat; 3: 4x10-6 M paraquat; A: 1 % szacharóz tartalom, 16 h fény / 8 h sötét fotoperiódus; B: 2 % szacharóz tartalom, 16 h fény / 8 h sötét fotoperiódusban; C: 1 % szacharóz tartalom, 24 h sötét; D: 2 % szacharóz tartalom, 24 h sötét


62

Az 1%-os és 2%-os szacharózon tenyésztett, sötétben tárolt levélkorong tenyészetek között nem volt vizuálisan észlelhetĘ a különbség (4/7. ábra). A korongok stresszállapotának jellemzésére lemértük a korongokban lévĘ GST enzimek aktivitását (4/8. ábra). 0,2%-os szacharóz tartalomnál a paraquat koncentráció emelkedése fokozatos csökkenést okozott a levélkorongok GST aktivitásában. Nagyobb szacharóz tartalom mellett a fényen tárolt tenyészeteknél a paraquat jelentĘs GST aktivitást indukált a 4u10-9 M - 4u10-7 M koncentráció tartományban. A GST indukció szignifikánsan nagyobb volt 2%-os szacharóz tartalom mellett. Ez az indukció jelentkezett a mind a két transzgénikus és a kontroll szürkenyárban, habár kiterjedése és mértéke genotípusonként eltérĘ volt. A sötétben tárolt tenyészeteknél sem 1%-os, sem 2%-os szacharóz tartalom mellett a paraquat nem okozott GST indukciót, tehát az enzimaktivitás növekedése fényfüggĘ (GULLNER, GYULAI, BITTSÁNSZKY et al. 2005).

4/8. ábra A glutation S-transzferáz (GST) enzim aktivitása a transzgénikus P. u canescens 11ggs és 6Lgl, valamint a nem transzformált kontroll klónjaiból vágott levélkorongokban különbözĘ koncentrációjú paraquat kezelés hatására. A tenyészeteket 16 h fény / 8 h sötét fotoperiódusban inkubáltuk három különbözĘ szacharóz-kiegészítés mellett. Jelölések: -z- 0,2% szacharóz fényben; -z- 1,0% szacharóz fényben; -Ÿ- 2,0% szacharóz fényben; -T- 1,0% szacharóz sötétben; -W2,0% szacharóz sötétben. Az átlagértékek és a szórás jelölve (n=3) (GULLNER, GYULAI, BITTSÁNSZKY et al. 2005).

A fotoszintetikus apparátus hatékonyságát klorofill fluoreszcencia mérésével jellemeztük. Az F690/F735 arányszám fordítottan arányos a klorofill (a+b)

63


tartalommal. Az itt kapott értékek az mutatják, hogy a paraquat magas koncentrációja csökkentette a levelek klorofill-tartalmát. (4/9. ábra) Az eredmény egybevág a vizuálisan is tapasztalható korong-fakulással. A PS II fotokémiai rendszer hatékonyságát mutatja az Fv/Fm arányszám. Magas paraquat koncentráció (4u10-6 M; 4u10-7 M) jelentĘsen csökkentette a nyárklónok fotoszintetikus aktivitását (4/10. ábra). A két szacharóz koncentráció között nem tapasztaltunk jelentĘs különbséget. Érdekes módon a sötétben tárolt tenyészetek hasonló értékeket mutattak a fényben tárolt tenyészetekhez képest, ami azt mutatja, hogy a paraquat nem csak megvilágítás hatására képes toxikus hatást kifejteni a növényre. A transzgénikus klónok stressztĦrĘ képességét összehasonlítva a két típus közül néhány esetben a 11ggs klón teljesített némileg jobban (9,1%) de a különbség

kevés

esetben

volt

szignifikáns

(GULLNER,

GYULAI,

BITTSÁNSZKY et al. 2005).

4/9. ábra A klorofill a és klorofill b tartalom változása a klorofill fluoreszcencia F690/F735 mérĘszámával jellemezve a különbözĘ koncentrációjú paraquatot tartalmazó WPM táptalajon tenyésztett P. u canescens 11ggs és 6Lgl, valamint a nem transzformált kontroll klónjaiból vágott levélkorongokban. A táptalajok 1% illetve 2% szacharózt tartalmaztak. Az inkubáció 16 h fény / 8 h sötét, illetve 24 h sötét fotoperiódusban történt. Az átlagértékek és a szórás jelölve (n=3) (GULLNER, GYULAI, BITTSÁNSZKY et al. 2005).


64

4/10.ábra A fotoszintetikus aktivitás változása a klorofill fluoreszcencia Fv/Fm mérĘszámával jellemezve a transzgénikus P. u canescens 11ggs és 6Lgl, valamint a nem transzformált kontroll klónjaiból vágott levélkorongokban különbözĘ koncentrációjú paraquatot tartalmazó WPM táptalajon. A táptalajok 1% illetve 2% szacharózt tartalmaztak. Az inkubáció 16 h fény / 8 h sötét, illetve 24 h sötét fotoperiódusban történt. Az átlagértékek és a szórás jelölve (n=3). (BITTSÁNSZKY et al. 2005b)

A paraquat kezelés számos antioxidáns védekezĘ reakciót indukál, beleértve a GST aktivitást is (GARRETON et al. 2002). A gyapotból származó GST gén túltermeltetése dohányban megnövelte a növény paraquat rezisztenciáját (YU et al. 2003). Egy korábbi beszámolóhoz hasonlóan (WILL et al. 2001) a saját eredményeink azt mutatják, hogy egyik GSH tartalmában megemelt transzgénikus nyárvonal sem mutatott nagyobb paraquat-rezisztenciát. A transzgénikus nyárakban a GSH szint a túltermeltetés ellenér sem elég nagy a paraquat okozta károsítás kivédésére. MegfelelĘ mennyiségĦ exogén GSH adagolásával ugyanis elĘidézhetĘ a paraquattal szembeni rezisztencia (WILL et al. 2001). Érdekes módon a paraquat jelentĘs GST aktivitásnövekedést generált, ha a táptalaj 1% vagy 2% szacharózt tartalmazott. Szacharóz indukálta rezisztenciát atrazin herbiciddel kezelt Arabidopsis-ban figyeltek meg (SULMON et al. 2004). Az exogén szacharóz hatása a GST indukcióra valószínĦleg nem a fotoszintézis gátlása miatt kiesett metabolikus szacharóz kompenzációja miatt történik alacsony

65


paraquat koncentrációnál. A védekezĘ mechanizmus valószínĦleg a több NADPH szintézisén alapul, amit a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz enzim aktivitásának növekedése eredményezett (HAUSCHILD és VON SCHAEWEN 2003). Másik magyarázat lehet, hogy a szacharóz adagolás beindítja a szénhidrát-kapcsolt folyamatokat (SULMON et al. 2004), amely nagyobb GST aktivitást eredményez. A nagyobb exogén szacharóz adagolás a GST aktivitás indukcióján keresztül eredményesebb paraquat detoxifikációhoz vezet a nyár levélkorongokban.

4.5. Génexpresszió vizsgálata paraquattal kezelt gsh1-transzgénikus szürkenyárban Génexpressziós vizsgálatokhoz szemikvantitatív RT-PCR-t alkalmaztunk. Templátként paraquattal kezelt nyár levélkorongokból kivont RNS-bĘl készített cDNS-t használtunk. A konstitutívan expresszálódó referencia génnek a riboszomális 26SrRNS gént alkalmaztuk, amely azonos mértékĦ expressziót mutatott a kezelt és kezeletlen mintákban (4/11. ábra). A paraquat kloroplasztiszra kifejtett hatását az rbcS gén expresszióján keresztül vizsgáltuk, mert ismert hogy az rbcS gén (RUBISCO kis alegység) expressziója a sejt kloroplaszttartalmától függ (GRAY-MITSUMUNE et al. 2004). Kísérletünkben az rbcS gén kissé alacsonyabb aktivitást mutatott a paraquattal kezelt mintákban (4/11. ábra). A stressz indukálható glutation S-transzferáz enzim gst génje nem mutatott változást a kezelt mintákban (4/11. ábra). Általánosságban a génexpresszió szabályozása történhet transzkripciós szinten, poszt-transzkripciós szinten, transzlációs és poszt-transzlációs szinten. E regulációs folyamatok kombinált hatása eredményezi a tényleges génexpresziót. Mert a poszt-transzkripcionális hatások jelentĘsen befolyásolják az mRNS stabilitását és a transzlációt, ezért a gének expressziós szintje nem közvetlenül függ az mRNS mennyiségétĘl (GYGI et al. 1999). Az eredményeinkben megfigyelhetĘ, hogy az expressziós szintek kevéssé eltérĘek, az értékeket számítógépes


66

denzitométerrel számoltuk (4/3. táblázat). A sávok mért relatív intenzitását normalizáltuk a 26SrRNS gén szintjéhez. Az így kiszámolt eredmények alapján sejtmagban kódolt rbcS gén expressziója 50%-os csökkenést mutatott a paraquat károsító hatásának következményeként, valamint 120%-os növekedést a gst gén expressziós szintjében. Az rbcS gén expressziójában bekövetkezett csökkenés megerĘsíti a klorofill fluorométerrel mért klorofill-tartalom csökkenést (4/9. ábra).

4/11. ábra A 26SrRNS (1.- 2 .), az rbcS (3. - 4.) és a stressz reszponzív gst (5. - 6.) gének szemikvantitatív génexpresszió-analízise RT-PCR-rel, Populus u canescens paraquattal kezelt (2;4;6) és kezeletlen (1;3;5) mintáiban.

4/3. táblázat Paraquattal kezelt (4x10-7 M) és kezeletlen szürkenyár mintákban (Populus x canescens, 6Lgl) mért génexpresszió relatív értékei

Paraquat cc. 0,0 M 4u10-7 M

Relatív génexpresszió 26S rRNS rbcS gst 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 1,2

4.6. Nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása A feketenyárnak számos különbözĘ klónja, szomatikus klónja és hibridje ismeretes, amelyek genetikai alapanyagként szolgálnak a nyárnemesítéshezA genetikai markereket a nyár nemesítésében már egyre szélesebb körben alkalmazzák. (VAN DER SCHOOT et al. 2000; KISS et al. 2001; SMULDERS et

67


al. 2001). A kísérletünk célja is az volt hogy antéra eredetĦ szomatikus klónok genetikai variabilitásának fokát meghatározzuk. Az N-SL és N-309 feketenyár szomaklónok elemzését öt SSR primerrel végeztük el: WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél), WPMS-06 (2 allél), WPMS20 (6 allél) és PTR-04 (1 allél). KettĘ primerpárral monomorf mintázatot kaptunk egy (194 bp; PTR-04), illetve két (168 és 174 bp, WPMS-06) alléllal. Az öt primerrel összesen 20 allélt detektáltunk (4/4. táblázat). A klónokon belüli variabilitás tesztelésére a kontroll NSL klónbol 8 DNS izolátumon végeztük el az SSR elemzést és mind a 8 esetben azonos mintázatot kaptunk, tehát egyeden belüli variabilitás a módszerrel nem detektálható. A módszer megbízhatóságának ellenĘrzésére az N-SL 24. klónnál a WPMS-20 lókuszon kapott 244 bp hosszúságú allélt agaróz gélbĘl visszaizoláltuk és két irányból megszekvenáltattuk. A visszakapott szekvencia 6 bázis kivételével megegyezett a Genbank AJ297293 számú szekvenciájának részletével leszámítva az ismétlĘdĘ szekvenciarészlet mennyiségét. Az ismétlĘdĘ szekvenciamotívum (TTCTGG)n a szekvenált mintában a 3× ismétlĘdik, míg az adatbázisban szereplĘ mintában 8u az alábbiakban a 108. bp pozíciótól kezdĘdĘen. (4/12. ábra) A báziseltérések SNP helyeket jelölnek. Négy esetben tranzícióval történt báziscsere (TlC vagy GlA) és két esetben transzverzióval, tehát purinbázis és pirimidinbázis cserélĘdött. Ezek a változások a genetikai polimorfizmus kialakulásának kezdeti lépéseit jelentik, amelyet jelen esetben fajon belül is sikerült detektálnunk. Egy következĘ munka részét képezhetné annak a kérdésnek a megválaszolása, hogy az egyes szomaklónok között mekkora mértékĦ SNP eltérés van. Az ALF Express futtatást (4/13. ábra) és értékelést követĘen fragmentek léte és nem léte alapján SPSS 11 programmal klaszter analízist és dendrogrammot készítettünk (4/14. ábra). Az SSR allélek elkülönítették egymástól a két nyárklónt (N-SL, N-309). Az N-SL klónon belül további öt, az N-309 klónon belül három alcsoport jött létre.


68

AJ297293 1 N-SL 24. klón

GTGCGCACAT CTATGACTAT CGAAGCCAGT GACCCAGTAT GTCGTGCTTC .......... .......... ........T. .......... ..........

AJ297293 51 N-SL 24. klón

AATGTGATAT GTTTCACAAC CAACATCGTC TTGCTCTGCG AAGAATGGTA .......... .......... ...T...... .........A ..........

AJ297293 101 ACCCTAGTTC TGGTTCTGGT TCTGGTTCTG GTTCTGGTTC TGGTTCTGGT N-SL 24. klón .....G.... .......... ........ AJ297293 151 TCTGGTTTGT ACTAGCCATA TTTCTTTTTC CATGCGCCAA CAAATTTTGG N-SL 24. klón .. .......... .G........ .......... .......... AJ297293 201 TAAATTAATT GATAACTTGA AAGAAGAGAG ATGCCCCGGA GAATTACAAG N-SL 24. klón .......... ....G..... .......... .......... .......... AJ297293 251 AT N-SL 24. klón ..AA

4/12. ábra Populus nigra WPMS-20 lókuszának szekvenciarészlete a Genbank-ban szereplĘ szekvenciából (AJ297293) és az általunk szekvenált fragment összehasonlítása. A szekvenált mintában az eltéréseket betĦvel az azonosságot ponttal jelöltük. Aláhúzással jelöltük az ismétlĘdĘ mikroszatellita régiót (TTCTGG)n.

A mikroszatelliták érzékeny markerek, amelyek megbízhatóan mutatják a nyárklónok genetikai azonosságát és szomaklonális variabilitását (RAHMAN és RAJORA 2001), valamint szelektív markerként is alkalmazhatóak fizikai térképezéskor (CERVERA et al. 2001). Az öt SSR marker közül három mutatott polimorfizmust (WPMS-02; WPMS-04; WPMS-20) a mikroszatellita lókuszon. A huszonkilenc N-SL szomaklón között 5 klóntípus különült el. Huszonhárom azonos genetikai mintázatot mutatott a kontroll klónnal, külön csoportba került a 17. és 24. valamint a 2. és 14., és egytagú csoportba kerültek a 10. és 15. klónok. A szomaklónoknak összesen 26%-a változott meg. A hat darab N-309 szomaklón között három klóntípus különült el, öt klón egy csoportba került a kontrollal és egytagú csoportot alkotnak a 35. és 36. klónok a változás 33%-os. Nem várt eredményt mutattak a PIC értékek (4/4. táblázat). A leginkább polimorf lókusznak a WPMS-20 bizonyult, ami azért érdekes mert itt hat nukleotid

69


ismétlĘdése adja a mikroszatellita régiót holott a dinukleotid ismétlĘdésĦ régiók (mint a többi öt lókusz) elméletileg sokkal változékonyabbak (BOWCOCK et al. 1994). A természetes módon fejlĘdött feketenyár klónok populáció szinten nagyobb variabilitást mutatnak valószínĦleg rügymutáció eredményeként (VAN DER SCHOOT et al. 2000). Szintén nagyfokú genetikai polimorfizmust detektálható P. cathayana klónjai között is (PENG et al. 2005). Az ALF-SSR egy jó megbízhatóságú

módszernek

bizonyul

a

feketenyár

szomatikus

klónok

mikroszatellita variációinak elkülönítésére.

4/13. ábra Példa P. nigra szomatikus klónjainak (1.-37.; 11. Táblázat) WPMS20 lókuszán lévĘ ALF-SSR mintázatra, külsĘ molekulatömeg marker és a 225, 231, 238, 244, 255 és 257 bp hosszú allélek feltüntetésével.


70

4/4. táblázat Az N-SL (1-29 és kontroll: 30) és N-309 (31-36 és kontroll: 37) feketenyár (P. nigra) egyedekrĘl származó szomaklónok SSR alléljeinek genetikai polimorfizmusa öt mikroszatellita lókuszon (WPMS-02, WPMS-04, WPMS-06, WPMS-20 és PTR4), a mikroszatellitek ismétlĘdĘ szekvenciegységei, az allélek pontos méretei és a PIC (polymorphism index content) értékek

71


4/14. ábra Relatív genetikai távolságok (Rel. G. T.) két feketenyár egyedbĘl (P. nigra N-SL: 1-30; N-309: 31-37) létrehozott szomatikus klónok között. A vizsgálatot klaszter analízissel végeztük SPSS 11 szoftverrel az SSR allélek léte ill. nemléte alapján Jaccard index használatával, csoporton belüli átlagos kapcsoltságok figyelembevételével.


72

4.7. Új tudományos eredmények Munkám célja a gsh1 (E. coli) génnel transzformált szürkenyár (Populus u canescens) két klóntípusának (11ggs és 6Lgl), valamint a nem transzformált kontroll klónjának in vitro génexpressziós (RT-PCR) elemzése volt in vitro abiotikus stressz körülmények között (paraquat, ZnSO4,), in situ fitoremediációs felhasználás végsĘ lehetĘségével. Célom volt továbbá, hogy a feketenyár (Populus nigra N-309, N-SL) sejt erdetĦ (1- 47) klónjaiban elemezzem a mikroszatellita lókuszok variabilitását, új feketenyár klóntípusok nemesítésének segítése céljából. Az alábbi eredményeket értem el:

1. Igazoltam gsh1 génspecifikus PCR próbák tervezésével és alkalmazásával (35S a: 5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’; gsh1 a: 5’-atc ccg gac gta tca cag g-3’; gsh1 b: 5’-gat gca cca aac aga taa gg-3’; pea rbcS a: 5’-cag aag tga gaa aaa tgg ct-3’; pea rbcS b: 5’-cat gca ctt tac tct tcc ac-3’), hogy a 7-8 éve in vitro kultúrában mikroszaporítással fenntartott gsh1-transzgénikus szürkenyár klónokban (11ggs, 6Lgl) a transzgén konstrukció stabilan jelen van, a transzgén nem szegregálódott.

2. Megállapítottam (AFLP), hogy az évek óta mikroszaporítással fenntartott gsh1-transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll szürkenyár klónok genetikailag azonosak, a szaporítás során a klónok átlagosan mindössze 0,6%-os mértékben különböztek AFLP fragmentumokban.

3. Kimutattam (génexpressziós analízisben cDNS-alapú RT-PCR elemzéssel), hogy a gsh1-transzgénikus szürkenyár klónokban (11ggs, 6Lgl) az E. coli eredetĦ gsh1 transzgén expresszálódik.

73


4. Meghatároztam a Zn2+ fajfüggĘ fitotoxikus koncentrációját a gsh1transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és nem transzgénikus kontroll szürkenyár (Populus u canescens) klónjaiban (10-2 – 10-1 M), valamint az érzékenyebbnek bizonyult feketenyár (P. nigra, N-SL) klónokban (10-3 M). Igazoltam a genetikailag módosított szürkenyár klónok (11ggs, 6Lgl) extrém fitoextrakciós kapacitását (11ggs – 331,9%-os Cu-felvétel; 6Lgl – 122,7% Cu felvétel 10-2 M ZnSO4 stresszben), kimutatva ezzel egy nagymértékĦ ZnSO4aktivált Cu akkumulációt nyár levélkorongok tenyészetben. Kimutattam továbbá,

hogy

Zn2+-stresszben,

stressztĦrĘképesség

a

következtében

megnövekedett

glutation-kapcsolt

gsh1-transzformánsokban

a

kisebb

mértékben aktiválódik a stressz-indikátor glutation S-transzferáz enzim (11ggs – 20,6%; 6Lgl – 49,2% a 10-3 M ZnSO4 stresszben). Bizonyítottam, hogy a 11ggs transzformáns szürkenyár a legígéretesebb fitoextrakciós célú felhasználásra cinkkel szennyezett talajok esetén.

5. Bizonyítottam,

hogy

az

elemzett

gsh1-transzgénikus

(11ggs,

6Lgl)

szürkenyár (Populus u canescens) klónok paraquat-toleranciája nem múlja felül a kontroll klónok toleranciáját, mert a 4-szeres (400%) glutationtartalom

növekedés

glutationtartalom

nem

biztosította

bizonyult

elegendĘnek

paraquat-tĦrĘképességhez.

az

5-6-szoros

Kimutattam

a

paraquat-stimulált glutation S-transzferáz enzim (GST) aktivitásának függését eltérĘ szacharóz ellátottság mellett: alacsony (0,2%) szacharóz tartalom mellett a GST aktivitása csökkent, viszont nagyobb (1%, 2%) szacharóz ellátottság mellett a paraquat jelentĘs GST enzimaktivitás növekedést okozott. Kimutattam, hogy GST csak fényben volt indukálható paraquat stresszben.


74

6. Meghatároztam (cDNS - RT-PCR) a paraquat (4x10-7 M) stressz-indukált transzgénikus (11ggs) szürkenyár (Populus u canescens) klón stressz-függĘ gst (glutation S-transzferáz enzim) és rbcS (ribulóz-1,5-biszfoszfát karboxiláz kis alegység) génjének expresszióját szemikvantitatív RT-PCR reakcióban. Bizonyítottam, hogy a rbcS gén expressziója paraquat hatására lecsökkent, míg a gst gén expressziója nem csökkent igazolva, hogy a GST nem transzkripcionális szinten szabályozódik.

7. Kimutattam, hogy a feketenyár (Populus nigra) nemesítési programjában a portok-tenyészet során új genotípusok indukálódnak, mert N-309 jelĦ klónok 33%-a, valamint az N-SL klónok 26%-a mutatott új mikroszatellita-típusú genom szervezĘdést.

75

Következtetések és javaslatok

5. Következtetések és javaslatok Az eredményeink és az irodalomban leírtak alapján levonhatjuk a következtetést, hogy a glutation túltermelĘ gsh1 transzgénikus növények stressztĦrĘképessége jobb, mint a vad típusú növényeké. Adódik a kérdés, hogy vajon érdemes-e ezeket a növényeket fitoremediációra alkalmazni. A kísérleteink alapján a 11ggs klón fitoextrakciós hatékonysága cinkstresszben 10-40% al volt jobb a kontrollhoz képest. Kadmium esetén 20-40% javulást írtak le. Viszont paraquat stressz esetében nincsen különbség, vagyis a klónok oxidatív stressztĦrĘképessége ezzel a transzgén konstrukcióval nem javítható. A jobb nehézfémtĦrĘ képességet a fitokelatinok magasabb szintje okozhatja. Szabadföldi fitoextrakciós eljárásokra a 11ggs klón felhasználása a fitokelatinképzĘdést indukáló és a fiatal levelekbe transzlokálódó nehézfémekkel szennyezett területeken

javasolható.

Gazdasági

és

környezetvédelmi

szempontok

figyelembevételével mérlegelendĘ a karfiolmozaik vírus 35S promóterének a cseréje. A kísérletek további irányaként a 11ggs klón szabadföldi kipróbálása jelölhetĘ meg cinkkel illetve nehézfémekkel szennyezett területeken. Gondot jelenthet a szabadföldön hogy a megtisztítani kívánt szennyezett talaj nem biztos hogy a nyárfa számára legideálisabb éghajlati viszonyok között helyezkedik el. A legkritikusabb tényezĘ a vízellátottság lehet mert a nyárfák vízigényes növények. Amennyiben nem áll rendelkezésre elegendĘ nedvesség akor az ültetvényt öntözni kell.

A

transzgénikus

klónok

kipróbálására

már

történnek

kísérletek

FĦzfögyártelepen egy vegyipari hulladéktelepen. A nyár stressztĦrĘképességének javítására a glutation túltermeltetésn kívül alternatív megközelítések is célravezetĘk lehetnek: 1. A glutation S-transzferáz enzim túltermeltetésével már több gazdasági növényben sikerült gyomirtószer-rezisztenciát kialakítani. Ez a megoldás nyárban is célravezetĘ lehet.

Következtetések és javaslatok

76

2. A szomaklonális variabilitás elemzésébĘl kitĦnik, hogy a nyár genomja szövettenyésztés során képes a megváltozásra. Erre a változékonyságra alapozva paraquat rezisztens nyárklónok szelektálhatóak. Az irodalmi adatok szerint a paraquat rezisztens klónok multirezisztenciával rendelkeznének. Ennek a megközelítésnek másik elĘnye, hogy a gyakorlati felhasználás szempontjából a szelekcióval létrehozott genotípusok elĘnyt élveznek a géntechnológiával módosított klónokkal szemben. Mindezek mellett meg kell jegyezni, hogy a jó stressztĦrĘképességbĘl nem következik automatikusan a jó fitoextrakciós képesség. Fontos hogy a növény képes legyen a szenyezĘanyagot transzlokálni, majd detoxifikálni vagy a sejten belüli folyamatokból kizárni. E tulajdonságok javításával vagy az ilyen gének transzformációjával is több növényen értek már el sikereket a fitoremediációs képesség javításában, amely megközelítések nyárfán való alkalmazásával szintén sikereket érhetünk el. Habár a sikeres fitoremediációban a növénytĘl független tényezĘk is szerepet játszanak, mint pl. éghajlati tényezĘk, mikorrhiza kapcsolat, agronómiai elĘkészítés és ápolás stb. amikre szintén tekintettel kell lennünk.

77

Összefoglalás - Summary

6. Összefoglalás Transzgénikus szürkenyár (Populus u canescens) klónok stressztĦrĘképességét jellemeztük in vitro körülmények között. A nyárklónokba a Ȗ-glutamil-cisztein szintáz (Ȗ-ECS) enzimet kódoló bakteriális gsh1 gént építették be, amely a glutation tripeptid (GSH) bioszintézisének a kulcsenzime. A transzgénikus nyárklónok több glutationt és Ȗ-glutamilciszteint (Ȗ-EC) termeltek, mint a vad típusúak. Munkánk során két típusú transzformánst jellemeztünk, a 11ggs klónban a transzgén fehérjeterméke a citoszolban (ARISI et al. 1997), a 6Lgl klónban pedig a kloroplasztban akkumulálódik (NOCTOR et al. 1998a). A glutationtartalom a transzgénikus klónokban 2-4 × volt nagyobb. Egyes kísérleteknél a feketenyár (P. nigra) N-SL klónját is a vizsgálatokba vontuk. Munkánk célja az volt, hogy a növények stressztĦrĘ képességét jellemezzük és a leginkább stressztoleráns klónt kiválasszuk, in situ fitoremediációs felhasználás végsĘ lehetĘségével. Célunk volt továbbá, hogy a feketenyár (Populus nigra N-309, N-SL) szomaklónjaiban (1- 47) elemezzem a mikroszatellita lókuszok variabilitását, új feketenyár klóntípusok nemesítése céljából. A klónok genetikai stabilitását fAFLP módszerrel (fluorescent amplified fragment length polymorphism) határoztuk meg. Összesen 682 AFLP fragmentet azonosítottunk, amelyet 12 szelektív primer párral szaporítottunk föl EcoRI / MseI emésztést követĘen. Összesen 4 fragment volt polimorf, amelyeket az Eco-AGT / Mse-CCC primerpárral szaporítottunk föl. Ez összesen 99,4%-os genetikai azonosságot jelent a P. u canescens klónok között, tehát a genetikai polimorfizmus alacsony. A klónok fitoextrakciós képességének jellemzésére 8 mm átmérĘjĦ levélkorongokat inkubáltunk steril körülmények között 21 napig ZnSO4 különbözĘ koncentrációival (10-1 M – 10-5 M) kiegészített WPM táptalajon. Cink csak magas koncentrációnál volt fitotoxikus (10-2 – 10-1 M) a P. u canescens vonalakban, a P. nigra klón érzékenyebbnek bizonyult. A transzgénikus nyárak nehézfémtartalma


78

magasabb volt a nem transzgénikus klónokhoz képest. A Zn2+ kezelés jelentĘsen indukálta a glutation S-transzferáz enzim aktivitását a nem transzformált klónokban míg a transzgénikus vonalakban az indukció jóval kisebb mértékĦ volt. Az eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy a transzgénikus nyárklónok stressztĦrĘképessége valamint cink-fitoextrakciós kapacitása jobb a vad típusú klónokénál. A klónok oxidatív stresszel szembeni érzékenységének tanulmányozására levélkorongokat vágtunk a vad típusú Populus u canescens klónból és a két transzgénikus vonalból, amelyeket paraquat különbözĘ koncentrációival terheltünk. A levélkorongokat WPM táptalajon tenyésztettük, amelyek 0,2% 1% illetve 2% szacharóz kiegészítést tartalmaztak. A paraquat 0,2% szacharóz kiegészítés mellett koncentrációfüggĘ csökkenést okozott a glutation S-transzferáz enzim (GST) aktivitásában. Magasabb szacharóz kiegészítés mellett a paraquat jelentĘs GST aktivitást indukált. A GST indukció fényfüggést mutatott. A fluoreszcencia mérések kimutatták, hogy magas paraquat koncentráció (4 x 10-7 - 4 x 10-6 M) gátolta a fotoszintetikus apparátus hatékonyságát az összes nyárklónban. Ez a gátlás nem bizonyult fényfüggĘnek, a fotoszintézis hatékonysága (Fv/Fm) a sötétben inkubált levélkorongoknál is azonos mértékĦ volt paraquat jelenlétében. A transzgénikus klónok nagyobb GSH tartalma nem okozott különbséget a paraquat okozta stressz tĦrésében. A kísérleteink és az irodalomban leírtak alapján megállapítható, hogy legjobb stressztĦrĘ és nehézfémakkumulációs képességgel a 11ggs klón rendelkezik, ezért ez a klón javasolható szabadföldi fitoextrakciós alkalmazásra nehézfémekkel szennyezett talajokon. Az N-SL és N-309 feketenyár klónokból származó szomaklónok genetikai polimorfizmusának elemzését végeztük el öt SSR primerrel. Összesen 20 allélt tudtunk detektálni. A primerenkénti allélszám 1 és 6 között volt: WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél), WPMS-06 (2 allél), WPMS-20 (6 allél) és PTR-04 (1 allél). Az elemzést ALF (automatic laser fluorometer) készülékkel végeztük. Az

79


SSR allélek léte illetve nemléte alapján dendrogramot készítünk SPSS 11 programmal, ami alapján elkülönültek az N-SL illetve N-309 klónokból származó szomaklónok. A szomaklónok között különbséget a polimorf WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél) és a WPMS-20 (6 allél) markerekkel detektáltunk. A hétt N309 klón között 3 klóntípus különült el, a 30 N-SL klón között 5 klóntípus. A huszonhárom N-SL szomaklón kontrollal való egyezĘsége a feketenyár genetikai stabilitására utal, de az új SSR klónok a variabilitási forrásként veendĘk számba.

Summary

Poplar plants have been shown to be excellent candidates for phytoremediation purposes.Transgenic grey poplar clones (Populus u canescens) were characterised in vitro. Poplar plants were transformed to overexpress the bacterial gsh1 gene encoding (Ȗ-ECS), which is the rate-limiting regulatory enzyme in the biosynthesis of glutathione tripeptide (GSH). The transformed poplars contained higher levels of glutathione and its precursor Ȗ-glutamylcysteine (Ȗ EC) than the wild-type. The glutathione levels in transgenic clones were 2-4 times higher. Two types of transgenic poplar were investigated overexpressing the gsh1 gene product Ȗglutamylcysteine synthetase in the cytosol: line 11ggs (ARISI et al. 1997), and in the chloroplast: line 6Lgl (NOCTOR et al. 1998a). In some experiments black poplar (P. nigra) N-SL clone was investigated as well. Our aim was to compare the stress tolerance of poplar clones and to select the best stress-tolerant clone with a final aim of selection for new clones with an improved phytoremediation capacity. Further aim was to study microsatellite variations of black poplar somaclones (P. nigra N-309, N-SL) of anther origin (KISS et al. 2001) with a final aim of selection for new stable SSR-types as new genetic sources for poplar breeding. Clone stability of gsh1-transgenic poplar was determined by fAFLP (fluorescent amplified fragment length polymorphism) analysis. In total, 682 AFLP


80

fragments were identified generated by twelve selective primer pairs after EcoRI – MseI digestion. Four fragments generated by EcoAGT – MseCCC were different (99.4% genetic similarity) which proves an unexpectedly low bud mutation frequency in P. u canescens. For the study of phytoextraction capacity leaf discs (8 mm) were exposed to a concentration series of ZnSO4 (10-1 M to 10-5 M) incubated for 21 days on aseptic tissue culture media WPM. Zinc(2+) was phytotoxic only at high concentrations (10-2 to 10-1 M) at all P. u canescens lines, but P. nigra was more sensitive. Transgenic poplars showed elevated heavy metal uptake as compared to the nontransformed clones. Treatments with zinc(2+) strongly induced the activity of glutathione S-transferase (GST) enzyme in untransformed poplar lines but to a lesser extent in the transgenic clones. These results suggest that the stress tolerance and phytoextraction capacity of transgenic poplars are improved compared to the nontransformed lines. Leaf discs of the wild type Populus u canescens and the two transgenic lines were exposed to the herbicide paraquat (4 u 10-9 to 4 u 10-6 M) for studying the sensitivity of the clones to oxidative stress Leaf discs were incubated on WPM tissue culture media containing 0.2, 1.0 or 2.0% sucrose. Exposure to paraquat led to a concentration-dependent decrease of GST activities at 0.2% sucrose. However, at higher external sucrose supplies, paraquat brought about marked inductions of GST activities in all poplar lines. The GST induction was light-dependent. Fluorescence measurements showed that the efficiency of the photosynthetic apparatus was inhibited by high paraquat concentrations (4 u 10-7 - 4 u 10-6 M) in all poplar clones. These inhibition was not light dependent, the photosynthetic efficiency (Fv/Fm) decreased also in leaf discs incubated in continuous darkness in the presence of paraquat. The elevated GSH content in transgenic clones was insufficient for better protection against paraquat stress. Our and previous results

81


described in literature reveal that the most suitable clone for phytoextraction is 11ggs in case of heavy metals contaminated soils. Genetic variation of somatic clones of black poplar developed from two trees N-SL and N-309 was determined by five SSR primer pairs. A total of 20 alleles were detected. The number of alleles per marker ranged from one to six, with such as WPMS-02 (5 alleles), WPMS-04 (6 alleles), WPMS-06 (2 alleles), WPMS-20 (6 alleles) and PTR-04 (1 allele) detected by ALF (automatic laser fluorometer). Dendrogram (SPSS 11) based on the presence versus absence of SSR alleles discriminated the groups of somatic clones of N-SL from somatic clones of N-309. The polymorphic markers of WPMS-02 (5 alleles), WPMS-04 (6 alleles) and WPMS-20 (6 alleles) distinguished three clone types among the 7 clones of N-309 tree and 5 clone types were revealed among the 30 N-SL clones. The 23 of the 29 N-SL somatic clones with uniform genetic similarity reflect a certain level of genetic stability of black poplar, nevertheless, the new SSR-clones can prove a source of variability.

83

Mellékletek – Irodalomjegyzék

7. Mellékletek M1: Felhasznált irodalmak jegyzéke AHUJA M. R., FLADUNG M. (1996) Stability and expression of chimeric genes of Populus. In Somatic Cell Genetics and Molecular Genetics of Trees, (Szerk: Ahuja M. R.,Boerjan W. és Neal D. B.), pp. 159-163. Dordrecht: Kluwer. ALTSCHUL S. F., MADDEN T. L., SCHAFFER A. A., ZHANG J. H., ZHANG Z., MILLER W., LIPMAN D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25, 33893402. ANDERSON J. A., CHURCHILL G. A., AUTRIQUE J. E., TANKSLEY S. D., SORRELLS M. E. (1993) Optimizing parental selection for genetic-linkage maps. Genome 36, 181-186. ARISI A. C. M., CORNIC G., JOUANIN L., FOYER C. H. (1998) Overexpression of iron superoxide dismutase in transformed poplar modifies the regulation of photosynthesis at low CO2 partial pressures of following exposure to the prooxidant herbicide methyl viologen. Plant Physiology 117, 565-574. ARISI A. C. M., NOCTOR G., FOYER C. H., JOUANIN L. (1997) Modification of thiol contents in poplars (Populus tremula x P. alba) overexpressing enzymes involved in glutathione synthesis. Planta 203, 362-372. BARNA B., ÁDÁM L., KIRÁLY Z. (1993) Juvenility and resistance of a superoxide-tolerant plant to diseases and other stresses. Naturwissenschaften 80, 420-422. BARÓCSI A., KOCSÁNYI L., VÁRKONYI S., RICHTER P., CSINTALAN Z., SZENTE K. (2000) Two-wavelength, multipurpose, truly portable chlorophyll fluorometer and its application in field monitoring of phytoremediation. Measurement Science and Technology 11, 717-729. BAUCHER M., CHABBERT B., PILATE G., VANDOORSSELAERE J., TOLLIER M. T., PETITCONIL M., CORNU D., MONTIES B., VAN MONTAGU M., INZE D., JOUANIN L., BOERJAN W. (1996) Red xylem and higher lignin extractability by down-regulating a cinnamyl alcohol dehydrogenase in poplar. Plant Physiology 112, 1479-1490.


84

BEVAN M. (1984) Binary agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research 12, 8711-8721. BITTSANSZKY A., KOMIVES T., GULLNER G., GYULAI G., KISS J., HESZKY L., RADIMSZKY L., RENNENBERG H. (2005a) Ability of transgenic poplars with elevated glutathione content to tolerate zinc(2+) stress. Environment International 31, 251-254. BITTSÁNSZKY A., GYULAI G., KISS J., GULLNER G., CSINTALAN Z., SZABÓ Z., LÁGLER R., KėMÍVES T. (2005b) Stress tolerance and in vitro phytoremediation of poplar (Populus sp.). Hungarian Agricultural Research 14, 13-15. BOTSTEIN D., HITE R. L., SKONIC M., DAVID R. W. (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics 32, 314-331. BOWCOCK A. M., RUIZ-LINARES A., TOMFOHRDE J., MINCH E., KIDD J. R., CAVALLI- SFORZA L. L. (1994) High resolution of human evolution with polymorphic microsatellites. Nature 368, 455-457. BRASILEIRO A. C. M., TOURNEUR C., LEPLE J. C., COMBES V., JOUANIN L. (1992) Expression of the mutatnt Arabidopsis thaliana acetolactate synthase gene confers chlorsulfuron resistance to transgenic poplar plants. Transgenic Research 1, 133-141. CAETANO-ANOLLES G., BASSAM B. J., GRESSHOFF P. M. (1991) DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9, 553-557. CERVERA M. T., STORME V., IVENS B., GUSMAO J., LIU B. H., HOSTYN V., VAN SLYCKEN J., VAN MONTAGU M., BOERJAN W. (2001) Dense genetic linkage maps of three Populus species (Populus deltoides, P. nigra and P. trichocarpa) based on AFLP and microsatellite markers. Genetics 158, 787-809. CERVERA M. T., STORME V., SOTO A., IVENS B., VAN MONTAGU M., RAJORA O. P., BOERJAN W. (2005) Intraspecific and interspecific genetic and phylogenetic relationships in the genus Populus based on AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 111, 1440-1456. CHUPEAU M. C., PAUTOT V., CHUPEAU Y. (1994) Recovery of transgenic trees after electroporation of poplar protoplasts. Transgenic Research 3, 13-19.

85


COBBETT C. S. (2000) Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. Plant Physiology 123, 825-832. CORNU D., LEPLE J. C., BONNADÉ-BOTTINO M., ROSS A., AUGUSTIN S., DELPLANQUE A., JOUANIN L., PILATE G. (1996) Expression of proteinase inhibitor and a Bacillus thuringiensis d-endotoxin in transgenic poplars. In Somatic Cell Genetics and Molecular Genetics of Trees, (Szerk: Ahuja M. R.,Boerjan W. és Neal D. B.), pp. 131-136. Dordrecht: Kluwer. CRESSWELL A., HAMILTON N. R. S., ROY A. K., VIEGAS B. M. F. (2001) Use of amplified fragment length polymorphism markers to assess genetic diversity of Lolium species from Portugal. Molecular Ecology 10, 229-241. DAYANANDAN S., RAJORA O. P., BAWA K. S. (1998) Isolation and characterization of microsatellites in trembling aspen (Populus tremuloides). Theoretical and Applied Genetics 96, 950-956. DE BLOCK M. (1990) Factors influencing the tissue culture and the Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of hybrid aspen and poplar clones. Plant Physiology 93, 1110-1116. DEVILLARD C. (1992) Genetic transformation of aspen (Populus tremula x Populus alba) by Agrobacterium rhizogenes and regeneration of plants tolerant to herbicide. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie III-Sciences De La Vie-Life Sciences 314, 291-298. DI BACCIO D., KOPRIVA S., SEBASTIANI L., RENNENBERG H. (2005) Does glutathione metabolism have a role in the defence of poplar against zinc excess? New Phytologist 167, 73-80. DI BACCIO D., TOGNETTI R., SEBASTIANI L., VITAGLIANO C. (2003) Responses of Populus deltoides x Populus nigra (Populus x euramericana) clone I214 to high zinc concentrations. New Phytologist 159, 443-452. DIX M. E., KLOPFENSTEIN N. B., ZHANG J.-W., WORKMAN S. W., KIM M.S. (1997) Potential use of Populus for phytoremediation of environmental pollution in riparian zones. In Micropropagation, genetic engineering, and molecular biology of Populus, (Szerk: Klopfenstein N. B.,Chun Y. W.,Kim M.-S. és Ahuja M. R.), pp. 206. Fort Collins, Colorado: Rocky Mountain Forest and Range Experiment Station.


86

DODGE A. D. (1994) Herbicide action and effects on detoxification processes. In Causes of photoactive stress and amelioration of defense system in plants, (Szerk: Foyer C. H. és Mullineaux P. M.), pp. 219-236: CRC Press. Boca Raton. DON R. H., COX P. T., WAINWRIGHT B. J., BAKER K., MATTICK J. S. (1991) Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research 19, 4008-4008. DONAHUE R. A., DAVIS T. D., MICHLER C. H., RIEMENSCHNEIDER D. E., CARTER D. R., MARQUARDT P. E., SANKHLA N., SANKHLA D., HAISSIG B. E., ISEBRANDS J. G. (1994) Growth, photosynthesis, and herbicide tolerance of genetically modified hybrid poplar. Canadian Journal Of Forest ResearchRevue Canadienne De Recherche Forestiere 24, 2377-2383. DOYLE J. J., DOYLE J. L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12, 13-15. EBINUMA H., SUGITA K., MATSUNAGA E., YAMAKADO M. (1997) Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 2117-2121. EDWARDS R., DIXON D. P., WALBOT V. (2000) Plant glutathione Stransferases: enzymes with multiple functions in sickness and in health. Trends in Plant Science 5, 193-198. EPA (Enivronmental Protection Agency). (2000) Introduction to phytoremediation. Cinncinati, Ohio: U.S. Environmental Protection Agency. www.cluin.org/download/remed/introphyto.pdf ERIKSSON M. E., ISRAELSSON M., OLSSON O., MORITZ T. (2000) Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length. Nature Biotechnology 18, 784-788. ERLICH H. A., GELFAND D., SNINSKY J. J. (1991) Recent advances in the polymerase chain reaction. Science 252, 1643-1651. FEUILLET C., LAUVERGEAT V., DESWARTE C., PILATE G., BOUDET A., GRIMAPETTENATI J. (1995) Tissue specific and cell specific expression of a cinnamyl alcohol-dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular Biology 27, 651-667.

87


FILLATTI J. J., SELLMER J., MCCOWN B., HAISSIG B., COMAI L. (1987) Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus. Molecular and General Genetics 206, 192-199. FODOR J., GULLNER G., ÁDÁM A. L., BARNA B., KėMÍVES T., KIRÁLY Z. (1997) Local and systemic responses of antioxidants to tobacco mosaic virus infection and to salicylic acid in tobacco - Role in systemic acquired resistance. Plant Physiology 114, 1443-1451. FOSSATI T., ZAPELLI I., BISOFFI S., MICHELETTI A., VIETTO L., SALA F., CASTIGLIONE S. (2005) Genetic relationships and clonal identity in a collection of commercially relevant poplar cultivars assessed by AFLP and SSR. Tree Genetics and Genomes 1, 11-19. FOURRE J. L., BERGER P., NIQUET L., ANDRE P. (1997) Somatic embryogenesis and somaclonal variation in Norway spruce: Morphogenetic, cytogenetic and molecular approaches. Theoretical and Applied Genetics 94, 159169. FOYER C. H., NOCTOR G. (2000) Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signalling. New Phytologist 146, 359-388. FOYER C. H., SOURIAU N., PERRET S., LELANDAIS M., KUNERT K. J., PRUVOST C., JOUANIN L. (1995) Overexpression of glutathione-reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees. Plant Physiology 109, 1047-1057. FREWEN B. E., CHEN T. H. H., HOWE G. T., DAVIS J., ROHDE A., BOERJAN W., BRADSHAW H. D. (2000) Quantitative trait loci and candidate gene mapping of bud set and bud flush in Populus. Genetics 154, 837-845. FRY D. J., DOUGLAS G. C., SAIEED N. T. (1997) Somaclonal variation in Populus: an evaluation. In Micropropagation, genetic engineering, and molecular biology of Populus, (Szerk: Klopfenstein N. B.,Chun Y. W.,Kim M.-S. és Ahuja M. R.), pp. 326. Fort Collins, Colorado: Rocky Mountain Forest and Range Experiment Station. GALLARDO F., FU J. M., CANTON F. R., GARCIA-GUTIERREZ A., CANOVAS F. M., KIRBY E. G. (1999) Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar. Planta 210, 19-26.


88

GARRETON V., CARPINELLI J., JORDANA X., HOLUIGUE L. (2002) The as1 promoter element is an oxidative stress-responsive element and salicylic acid activates it via oxidative species. Plant Physiology 130, 1516-1526. GIORCELLI A., SPARVOLI F., FULVIO M. Y., TAVA A., BALESTRAZZI A., VRHOVSEK U., CALLIGARI P., BOLLINI R., CONFALONIERI M. (2004) Expression of the stilbene synthase (StSy) gene from grapevine in transgenic white poplar results in high accumulation of the antioxidant resveratrol glucosides. Transgenic Research 13, 203-214. GOMEZ A., MANZANERA J. A., AGUIRIANO E., GRAU J. M., BUENO M. A. (2003) SSR markers for monitoring an in vitro core collection of Populus tremula. Silvae Genetica 52, 224-220. GRAY-MITSUMUNE M., ABE H., TAKAHASHI J., SUNDBERG B., MELLEROWICZ E. J. (2004) Liquid phase fluorescence in situ RT-PCR analysis for gene expression analysis in woody stems. Plant Biology 6, 47-54. GULLNER G., GYULAI G., BITTSÁNSZKY A., KISS J., HESZKY L., KėMÍVES T. (2005) Enhanced inducibility of glutathione S-transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of sucrose. Phyton - Annales Rei Botanicae 45, 39-44. GULLNER G., KėMÍVES T., RENNENBERG H. (2001) Enhanced tolerance of transgenic poplar plants overexpressing gamma-glutamylcysteine synthetase towards chloroacetanilide herbicides. Journal of Experimental Botany 52, 971-979. GUPTA M., CHYI Y. S., SEVERSON J. R., OWEN J. L. (1994) Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics 89, 998-1006. GYGI S. P., ROCHON Y., FRANZA B. R., AEBERSOLD R. (1999) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Molecular and Cellular Biology 19, 1720-1730. GYULAI G., HUMPHREYS M., BITTSÁNSZKY A., SKØT K., KISS J., SKØT L., GULLNER G., HEYWOOD S., SZABÓ Z., LOVATT A., RADIMSZKY L., RODERICK H., RENNENBERG H., ABBERTON M., KėMÍVES T., HESZKY L. (2005) AFLP analysis and improved phytoextraction capacity of transgenic gshI-poplar clones (Populus x canescens L.) for copper in vitro. Zeitschrift für Naturforschung C 60, 300-306.

89


GYULAI G., JANOVSZKY J., KISS E., LELIK L., CSILLAG A., HESZKY L. E. (1992) Callus initiation and plant-regeneration from inflorescence primordia of the intergeneric hybrid Agropyron repens (L) Beauv X Bromus inermis Leyss Cv Nanus on a modified nutritive medium. Plant Cell Reports 11, 266-269. GYULAI G., KISS J., JEKKEL Z., KISS E., HESZKY L. E. (1995) A selective auxin and cytokinin bioassay based on root and shoot formation in vitro. Journal of Plant Physiology 145, 379-382. GYULAI G., MESTER Z., KISS J., SZEMÁN L., IDNURM A., HESZKY L. (2003) Somaclonal breeding of reed canarygrass (Phalaris arundinacea L.). Grass and Forage Science 58, 210-214. HABIG W. H., PABST M. J., JAKOBY W. B. (1974) Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry 249, 7130-9. HALL T. A. (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41, 95-98. HAMADA H., PETRINO M. G., KAKUNAGA T. (1982) A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 79, 6465-6469. HAUSCHILD R., VON SCHAEWEN A. (2003) Differential regulation of glucose6-phosphate dehydrogenase isoenzyme activities in potato. Plant Physiology 133, 47-62. HESZKY L. E., BINH D. Q., KISS E., GYULAI G. (1989) Increase of green plantregeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa (Schur) Holmbg. Plant Cell Reports 8, 174-177. HEUCHELIN S. A., JOUANIN L., KLOPFENSTEIN N. B. (1997) Potential of proteinase inhibitors for enhanced resistance to Populus arthropod and pathogen pests. In Micropropagation, genetic engineering, and molecular biology of Populus, (Szerk: Klopfenstein N. B.,Chun Y. W.,Kim M.-S. és Ahuja M. R.), pp. 173-177. Fort Collins, Colorado: Rocky Mountain Forest and Range Experiment Station. HOLDEREGGER R., ANGELONE S., BRODBECK S., CSENCSICS D., GUGERLI F., HOEBEE S., FINKELDEY R. (2005) Application of genetic


90

markers to the discrimination of European Black Poplar (Populus nigra) from American Black Poplar (P. deltoides) and Hybrid Poplars (P. x canadensis) in Switzerland. Trees Structure and Function 19, 742-747. HU L., LU H., LIU Q. L., CHEN X. M., JIANG X. N. (2005) Overexpression of mtlD gene in transgenic Populus tomentosa improves salt tolerance through accumulation of mannitol. Tree Physiology 25, 1273-1281. ISABEL N., BOIVIN R., LEVASSEUR C., CHAREST P. M., BOUSQUET J., TREMBLAY F. M. (1996) Occurrence of somaclonal variation among somatic embryo-derived white spruces (Picea glauca, Pinaceae). American Journal of Botany 83, 1121-1130. JEFFREYS A. J., WILSON V., THEIN S. L. (1985) Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature 314, 67-73. KIRÁLY Z. (2002) Az oxidatív stressz és az antioxidánsok szerepe a növény/patogén kapcsolatokban. Debreceni Egyetem Agrártudományi Közlemények - Acta Agraria Debreceniensis 9, www.date.hu/acta-agraria/200209/kiraly.pdf. KISS J. (1999) Biotechnológiai mĘdszerek fejlesztése és alkalmazása a hazai nyárfanemesítésben PhD dolgozat. GödöllĘ: GödöllĘi Agrártudományi Egyetem. KISS J., KONDRÁK M., TÖRJÉK O., KISS E., GYULAI G., MÁZIK-TėKEI K., HESZKY L. E. (2001) Morphological and RAPD analysis of poplar trees of anther culture origin. Euphytica 118, 213-221. KLOPFENSTEIN N. B., ALLEN K. K., AVILA F. J., HEUCHELIN S. A., MARTINEZ J., CARMAN R. C., HALL R. B., HART E. R., MCNABB H. S. (1997) Proteinase inhibitor II gene in transgenic poplar: Chemical and biological assays. Biomass and Bioenergy 12, 299-311. KONCZ C., SCHELL J. (1986) The promoter of Tl-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Molecular and General Genetics 204, 383-396. KOPONEN J. K., TURUNEN A. M., YLA-HERTTUALA S. (2002) Escherichia coli DNA contamination in AmpliTaq gold polymerase interferes with TaqMan analysis of lacZ. Molecular Therapy 5, 220-222. KOPRIVOVA A., KOPRIVA S., JAGER D., WILL B., JOUANIN L., RENNENBERG H. (2002) Evaluation of transgenic poplars over-expressing

91


enzymes of glutathione synthesis for phytoremediation of cadmium. Plant Biology 4, 664-670. KÖMÍVES T., GULLNER G., KIRÁLY Z. (1998) Role of glutathione and glutathione-related enzymes in response of plants to environmental stress. In Stress of Life. From Molecules to Man, vol. 851 (Szerk: Csermely P.), pp. 251-258. New York, USA: The New York Academy of Sciences. LAGERCRANTZ U., ELLEGREN H., ANDERSSON L. (1993) The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Research 21, 1111-1115. LEPLE J. C., BONADEBOTTINO M., AUGUSTIN S., PILATE G., LETAN V. D., DELPLANQUE A., CORNU D., JOUANIN L. (1995) Toxicity to Chrysomela tremulae (Coleoptera, Chrysomelidae) of transgenic poplars expressing a cysteine proteinase inhibitor. Molecular Breeding 1, 319-328. LEPLE J. C., BRASILEIRO A. C. M., MICHEL M. F., DELMOTTE F., JOUANIN L. (1992) Transgenic Poplars - Expression Of Chimeric Genes Using 4 Different Constructs. Plant Cell Reports 11, 137-141. LEPLE J. C., PILATE G., JOUANIN L. (1999) Transgenic poplar trees (Populus species). In Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. Transgenic Trees (Szerk: Bajaj Y. P. S.), pp. 221-244. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. LLOYD G., MCCOWN B. H. (1980) Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proc Int Plant Prop Soc, 421-427. MARKERT C. L., MOLLER F. (1959) Multiple forms of enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 45, 753-63. MARONE M., MOZZETTI S., RITIS D. D., PIERELLI L., SCAMBIA G. (2001) Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample. Biological Procedures Online 3, 19-25. MARRS K. A. (1996) The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants. Annual Review of Plant Physiology And Plant Molecular Biology 47, 127158. MATHEWS J. H., CAMPBELL M. M. (2000) The advantages and disadvantages of the application of genetic engineering to forest trees: a discussion. Forestry 73, 371-380.


92

MCCOWN B. H., MCCABE D. E., RUSSELL D. R., ROBISON D. J., BARTON K. A., RAFFA K. F. (1991) Stable transformation of Populus and incorporation of pest resistance by electric-discharge particle-acceleration. Plant Cell Reports 9, 590-594. MICHELMORE R. W., PARAN I., KESSELI R. V. (1991) Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88, 9828-9832. MOHRI T., IGASAKI T., FUTAMURA N., SHINOHARA K. (1999) Morphological changes in transgenic poplar induced by expression of the rice homeobox gene OSH1. Plant Cell Reports 18, 816-819. MULLIS K. B., FALOONA F. A. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155, 335-350. MURRAY M. G., THOMPSON W. F. (1980) Rapid isolation of high molecularweight plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321-4325. NAN Z. R., LI J. J., ZHANG J. M., CHENG G. D. (2002) Cadmium and zinc interactions and their transfer in soil-crop system under actual field conditions. Science of the Total Environment 285, 187-195. NICOLESCU C., SANDRE C., JOUANIN L., CHRIQUI D. (1996) Genetic engineering of phenolic metabolism in poplar in relation with resistance against pathogens. Acta Botanica Gallica 143, 539-546. NILSSON O., MORITZ T., SUNDBERG B., SANDBERG G., OLSSON O. (1996) Expression of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene in a deciduous forest tree alters growth and development and leads to stem fasciation. Plant Physiology 112, 493-502. NOCTOR G., ARISI A. C. M., JOUANIN L., FOYER C. H. (1998a) Manipulation of glutathione and amino acid biosynthesis in the chloroplast. Plant Physiology 118, 471-482. NOCTOR G., ARISI A. C. M., JOUANIN L., FOYER C. H. (1999) Photorespiratory glycine enhances glutathione accumulation in both the chloroplastic and cytosolic compartments. Journal of Experimental Botany 50, 1157-1167.

93


NOCTOR G., ARISI A. C. M., JOUANIN L., KUNERT K. J., RENNENBERG H., FOYER C. H. (1998b) Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants. Journal of Experimental Botany 49, 623-647. NOCTOR G., ARISI A. C. M., JOUANIN L., VALADIER M. H., ROUX Y., FOYER C. H. (1997) Light-dependent modulation of foliar glutathione synthesis and associated amino acid metabolism in poplar overexpressing gammaglutamylcysteine synthetase. Planta 202, 357-369. OLSEN J. E., JUNTTILA O., NILSEN J., ERIKSSON M. E., MARTINUSSEN I., OLSSON O., SANDBERG G., MORITZ T. (1997) Ectopic expression of oat phytochrome A in hybrid aspen changes critical daylength for growth and prevents cold acclimatization. Plant Journal 12, 1339-1350. PALOMBI M. A., DAMIANO C. (2002) Comparison between RAPD and SSR molecular markers in detecting genetic variation in kiwifruit (Actinidia deliciosa A. Chev). Plant Cell Reports 20, 1061-1066. PENG Y. H., LU Z. X., CHEN K., LUUKKANEN O., KORPELAINEN H., LI C. Y. (2005) Population genetic survey of Populus cathayana originating from Southeastern Qinghai-Tibetan plateau of China based on SSR markers. Silvae Genetica 54, 116-122. PUCHTA H. (1999) Dobule-strand break-induced recombination between ectopic homologous sequences in somatic plant cells. Genetics 152, 1173-1181. RAHMAN M. H., RAJORA O. P. (2001) Microsatellite DNA somaclonal variation in micropropagated trembling aspen (Populus tremuloides). Plant Cell Reports 20, 531-536. RAI R., TATE J. J., COOPER T. G. (2003) Ure2, a prion precursor with homology to glutathione S-transferase, protects Saccharomyces cerevisiae cells from heavy metal ion and oxidant toxicity. Journal of Biological Chemistry 278, 12826-12833. RAUSER W. E. (2001) The role of glutathione in plant reaction and adaptation to excess metals. In Significance of Glutathione to Plant Adaptation to the Environment, (Szerk: Grill D.,Tausz M. és De Kok L. J.). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.


94

RENNENBERG H. (2001) Glutathione - an ancient metabolite with modern tasks. In Significance of Glutathione to Plant Adaptation to the Environment, (Szerk: Grill D.,Tausz M. és De Kok L. J.). Dordrecht. RENNENBERG H., PEUKE A. D. (2005) Phytoremediation with transgenic trees. Zeitschrift für Naturforschung C 60, 199-207. ROHDE A., PRINSEN E., DE RYCKE R., ENGLER G., VAN MONTAGU M., BOERJAN W. (2002) PtABI3 impinges on the growth and differentiation of embryonic leaves during bud set in poplar. Plant Cell 14, 1885-1901. ROTTMANN W. H., MEILAN R., SHEPPARD L. A., BRUNNER A. M., SKINNER J. S., MA C. P., CHENG S. P., JOUANIN L., PILATE G., STRAUSS S. H. (2000) Diverse effects of overexpression of LEAFY and PTLF, a poplar (Populus) homolog of LEAFY/FLORICAULA, in transgenic poplar and Arabidopsis. Plant Journal 22, 235-245. ROY M., COUILLARD D. (1998) Metal leaching following sludge application to a deciduous forest soil. Water Research 32, 1642-1652. ROZEN S., SKALETSKY H. J. (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, (Szerk: Krawetz S. és Misener S.), pp. 365-386. Totowa, NJ: Humana Press. SÁGI L., BARNABÁS B. (1989) Evidence for cytoplasmic control of in vitro microspore embryogenesis in the anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) Theoretical and Applied Genetics 78, 867-872. SCHAFER H. J., HAAG-KERWER A., RAUSCH T. (1998) cDNA cloning and expression analysis of genes encoding GSH synthesis in roots of the heavy-metal accumulator Brassica juncea L.: evidence for Cd-induction of a putative mitochondrial gamma-glutamylcysteine synthetase isoform. Plant Molecular Biology 37, 87-97. SCHLÖTTERER C., TAUTZ D. (1992) Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Research 20, 211-215. SCHRÖDER P. (2001) The role of glutathione and glutathione S-transferases in plant reaction and adaptation to xenobiotics. In Significance of Glutathione to Plant Adaptation to the Environment, (Szerk: Grill D.,Tausz M. és De Kok L. J.). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.

95


SCHUTZENDUBEL A., NIKOLOVA P., RUDOLF C., POLLE A. (2002) Cadmium and H2O2-induced oxidative stress in Populus x canescens roots. Plant Physiology And Biochemistry 40, 577-584. SELYE J. (1965) Életünk és a stress. Budapest: Akadémiai Kiadó. SKINNER J. S., MEILAN R., MA C., STRAUSS S. H. (2003) The Populus PTD promoter imparts floral-predominant expression and enables high levels of floralorgan ablation in Populus, Nicotiana and Arabidopsis. Molecular Breeding 12, 119-132. SKØT L., HAMILTON N. R. S., MIZEN S., CHORLTON K. H., THOMAS I. D. (2002) Molecular genecology of temperature response in Lolium perenne: 2. association of AFLP markers with ecogeography. Molecular Ecology 11, 18651876. SMULDERS M. J. M., VAN DER SCHOOT J., ARENS P., VOSMAN B. (2001) Trinucleotide repeat microsatellite markers for black poplar (Populus nigra L.). Molecular Ecology Notes 1, 188-190. STERKY F., BHALERAO R. R., UNNEBERG P., SEGERMAN B., NILSSON P., BRUNNER A. M., CHARBONNEL-CAMPAA L., LINDVALL J. J., TANDRE K., STRAUSS S. H., SUNDBERG B., GUSTAFSSON P., UHLEN M., BHALERAO R. P., NILSSON O., SANDBERG G., KARLSSON J., LUNDEBERG J., JANSSON S. (2004) A Populus EST resource for plant functional genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 13951-13956. STORME V., A. BROECK, B. IVENS, D. HALFMAERTEN, J. SLYCKEN, S. CASTIGLIONE, F. GRASSI, T. FOSSATI, J.E. COTTRELL, H.E. TABBENER, F. LEFÈVRE, C. SAINTAGNE, S. FLUCH, V. KRYSTUFEK, K. BURG, S. BORDÁCS, A. BOROVICS, K. GEBHARDT, B. VORNAM, A. POHL, N. ALBA, D. AGÚNDEZ, C. MAESTRO, E. NOTIVOL, J. BOVENSCHEN, B.C. DAM, J. SCHOOT, B. VOSMAN, W. BOERJAN, SMULDERS M. J. M. (2004) Ex-situ conservation of Black poplar in Europe: genetic diversity in nine gene bank collections and their value for nature development. Theoretical and Applied Genetics 108, 969-981. STROHM M., EIBLMEIER M., LANGEBARTELS C., JOUANIN L., POLLE A., SANDERMANN H., RENNENBERG H. (2002) Responses of antioxidative systems to acute ozone stress in transgenic poplar (Populus tremula x P. alba) over-expressing glutathione synthetase or glutathione reductase. Trees-Structure and Function 16, 262-273.


96

STROHM M., JOUANIN L., KUNERT K. J., PRUVOST C., POLLE A., FOYER C. H., RENNENBERG H. (1995) Regulation of glutathione synthesis in leaves of transgenic poplar (Populus tremula X Populus alba) overexpressing glutathione synthetase. Plant Journal 7, 141-145. SULMON C., GOUESBET G., COUEE I., EL AMRANI A. (2004) Sugar-induced tolerance to atrazine in Arabidopsis seedlings: interacting effects of atrazine and soluble sugars on psbA mRNA and D1 protein levels. Plant Science 167, 913-923. SZABÓ Z., GYULAI G., HUMPHREYS M., HORVÁTH L., BITTSÁNSZKY A., LÁGLER R., HESZKY L. (2005) Genetic variation of melon (C. melo) compared to an extinct landrace from the Middle Ages (Hungary) I. rDNA, SSR and SNP analysis of 47 cultivars. Euphytica 146, 87-94. TAUSZ M. (2001) The role of glutathione in plant response and adaptation to natural stress. In Significance of Glutathione to Plant Adaptation to the Environment, (Szerk: Grill D.,Tausz M. és De Kok L. J.). Dordrecht. TAUTZ D. (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 17, 6463-6471. TAYLOR G. (2002) Populus: Arabidopsis for forestry. Do we need a model tree? Annals of Botany 90, 681-689. TUOMINEN H., PUECH L., REGAN S., FINK S., OLSSON O., SUNDBERG B. (2000) Cambial-region-specific expression of the Agrobacterium iaa genes in transgenic aspen visualized by a linked uidA reporter gene. Plant Physiology 123, 531-541. TUOMINEN H., SITBON F., JACOBSSON C., SANDBERG G., OLSSON O., SUNDBERG B. (1995) Altered growth and wood characteristics in transgenic hybrid aspen expressing Agrobacterium tumefaciens T-DNA indoleacetic acid biosynthetic genes. Plant Physiology 109, 1179-1189. TUSKAN G. A., DIFAZIO S. P., TEICHMANN T. (2004) Poplar genomics is getting popular: The impact of the poplar genome project on tree research. Plant Biology 6, 2-4. TZFIRA T., VINOCUR B., ALTMAN A., VAINSTEIN A. (1998) rol-transgenic Populus tremula: root development, root-borne bud regeneration and in vitro propagation efficiency. Trees-Structure And Function 12, 464-471.

97


VAN DER MIJNSBRUGGE K., VANMONTAGU M., INZE D., BOERJAN W. (1996) Tissue-specific expression conferred by the S-adenosyl-L-methionine synthetase promoter of Arabidopsis thaliana in transgenic poplar. Plant and Cell Physiology 37, 1108-1115. VAN DER SCHOOT J., POSPISKOVA M., VOSMAN B., SMULDERS M. J. M. (2000) Development and characterization of microsatellite markers in black poplar (Populus nigra L.). Theoretical and Applied Genetics 101, 317-322. VAN DOORSSELAERE J., BAUCHER M., CHOGNOT E., CHABBERT B., TOLLIER M. T., PETITCONIL M., LEPLE J. C., PILATE G., CORNU D., MONTIES B., VANMONTAGU M., INZE D., BOERJAN W., JOUANIN L. (1995) A novel lignin in poplar trees with a reduced caffeic acid 5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase activity. Plant Journal 8, 855-864. VENDRAME W. A., KOCHERT G., WETZSTEIN H. Y. (1999) AFLP analysis of variation in pecan somatic embryos. Plant Cell Reports 18, 853-857. VON SCHWARTZENBERG K., DOUMAS P., JOUANIN L., PILATE G. (1994) Enhancement of the endogenous cytokinin concentration in poplar by transformation with Agrobacterium T-DNA gene ipt. Tree Physiology 14, 27-35. VOS P., HOGERS R., BLEEKER M., REIJANS M., VANDELEE T., HORNES M., FRIJTERS A., POT J., PELEMAN J., KUIPER M., ZABEAU M. (1995) AFLP - A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23, 4407-4414. WANG G. J., CASTIGLIONE S., CHEN Y., LI L., HAN Y. F., TIAN Y. C., GABRIEL D. W., HAN Y. N., MANG K. Q., SALA F. (1996) Poplar (Populus nigra L) plants transformed with a Bacillus thuringiensis toxin gene: Insecticidal activity and genomic analysis. Transgenic Research 5, 289-301. WATANABE K., YAMANO Y., MURATA K., KIMURA A. (1986) The nucleotide sequence of the gene for gamma-glutamylcysteine synthetase of Escherichia coli. Nucleic Acids Research 14, 4393-4400. WEBER J. L. (1990) Informativeness polymorphisms. Genomics 7, 524-530.

of

human

(dC-dA)n·(dG-dT)n

WEIGEL D., NILSSON O. (1995) A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants. Nature 377, 495-500.


98

WELSH J., MCCLELLAND M. (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research 18, 7213-7218. WILHELM E., HRISTOFOROGLU K., FLUCH S., BURG K. (2005) Detection of microsatellite instability during somatic embryogenesis of oak (Quercus robur L.). Plant Cell Reports 23, 790-795. WILL B., JOUANIN L., RENNENBERG H. (2001) Protection from paraquatmediated photo-oxidative stress by glutathione in poplar (Populus tremula x P. alba) plants. Plant Biology 3, 272-278. WILLIAMS J. G. K., KUBELIK A. R., RAFALSKI K. J., TINGEY S. V. (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18, 6531-6535. XIANG C. B., OLIVER D. J. (1998) Glutathione metabolic genes coordinately respond to heavy metals and jasmonic acid in Arabidopsis. Plant Cell 10, 15391550. YANG M. S., LANG H. Y., GAO B. J., WANG J. M., ZHENG J. B. (2003) Insecticidal activity and transgene expression stability of transgenic hybrid poplar clone 741 carrying two insect- resistant genes. Silvae Genetica 52, 197-201. YU T., LI Y. S., CHEN X. F., HU J., CHANG X., ZHU Y. G. (2003) Transgenic tobacco plants overexpressing cotton glutathione S-transferase (GST) show enhanced resistance to methyl viologen. Journal of Plant Physiology 160, 13051311. ZARCINAS B. A., CARTWRIGHT B., SPOUNCER L. R. (1987) Nitric-acid digestion and multielement analysis of plant-material by inductively coupled plasma spectrometry. Communications in Soil Science and Plant Analysis 18, 131146. ZHANG Q., ZHANG Z. Y., LIN S. Z., LIN Y. Z. (2005) Resistance of transgenic hybrid triploids in Populus tomentosa Carr. against 3 species of Lepidopterans following two winter dormancies Conferred by high level expression of cowpea trypsin inhibitor gene. Silvae Genetica 54, 108-116. ZHAO X. P., KOCHERT G. (1993) Phylogenetic distribution and genetic mapping of a (GGC)n microsatellite from rice (Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 21, 607-614.

99

Köszönetnyilvánítás

Köszönetnyilvánítás Ezúton mondok köszönetet konzulensemnek Dr. Gyulai Gábor tanár úrnak (SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszék) folyamatos támogatásáért, gondolatai és ösztönzése nélkül ez a dolgozat bizonyosan nem születik meg. Külön köszönettel tartozom Prof. Dr. Heszky László tanszékvezetĘ úrnak, aki lehetĘvé tette, hogy a szükséges kísérleteket a Genetika és Növénynemesítés Tanszéken elvégezhessem, és emellett biztosította a folyamatos szakmai ellenĘrzést is. Köszönöm Prof. Dr. Kömíves Tamásnak és Dr. Gullner Gábornak (MTA, Növényvédelmi Kutató Intézet) a kutatócsoportjaink közötti jó kapcsolatért, közös munkáink rendkívül eredményességéért, amelyek számos publikációban ölthettek testet. Köszönetemet fejezem ki Szabó Zoltán és Lágler Richárd PhD hallgatóknak a mindennapi munkákban nyújtott segítségükért, támogatásukért. Ki kell emelnem Bakos Györgynét, aki a kísérletek indításában, ellenĘrzésében és a tenyészetek fenntartásában pótolhatatlan szerepet játszott. A kísérletekben komoly segítséget kaptam Csepelényi Mariann, Márta Péter, Lehoczky Péter és Bock István MSc hallgatóktól. Köszönöm a nyugodt, baráti és inspiratív munkahelyi légkör megteremtését és mindig áldozatkész segítségét a tanszék minden dolgozójának: Dr. Bálint Andornak, Dr. Kiss Erzsébetnek, Dr. Kiss Józsefnek, Dr. Galli Zsoltnak, Dr. Hajósné Novák Mártának, Dr. Mázikné TĘkei Katalinnak, Bellusné Daniek Ágnesnek, Katona Melindának, Tóth Péternének, Ádám Zoltánnének, Ócsai Sándornének, Veres Anikónak, Balogh Andreának, SzĘke Antalnak, Füle Lórántnak, Koncz Tímeának Halász Gábornak, Tisza Viktóriának, Molnár Stellának és Galbács Zsuzsannának.

A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója cink és paraquat tesztben és nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása

Recommend Documents