9. Szilárdfázisú szintézisek
oligopeptidek, oligonukleotidok
Peptidszintézis • Amidkötés kialakítása O R
OH
+
H2 N Q
O R
O R
OH
+
H2 N Q
sav-bázis reakció
N H
Q
+
H2O
O R
O
+
H 3N Q
már nem nukleofil
Amidkötés kialakítása A karbonsavat aktiválni kell
O R
X
+
H2N Q
X = jó távozó csoport X = klorid, anhidrid, aktív észter
O R
N H
Q
+
HX
Dipeptid szintézis
Védőcsoportok N-terminális és amino-védőcsoportok (a teljesség igénye nélkül)
Védőcsoportok C-terminális és karboxil-védőcsoportok OH
tercier-butil-észter (tBu)
savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA)
benzil-észter (Bn)
H2 / Pd / C
OH
Védőcsoportok Egyéb, oldallánc-védőcsoportok (Cys, Tyr, Ser, Thr, Lys)
-COOH aktiválás • Aktív észterré alakítás (in situ)
-COOH aktiválás • Aktív észterré alakítás (in situ) • Átészterezés hidroxibenztriazolokkal (kevesebb racemizáció)
Aktiválás a gyakorlatban • karbodiimid + triazol együtt
DCC
DIC
EDC (EDAC)
Szilárd hordozók (gyanták) • Két fő technika (Fmoc/tBu; Boc/Bn) • Boc/Bn : Merrifield gyanta (polisztirol / divinil benzol)
• Fmoc/tBu : Wang gyanta (p-hidroxibenzil alkohol / polisztirol)
• egyéb gyanták : amid végű, hasíthatóság stb.
Szilárd hordozók (gyanták) • Stabil legyen, kémiailag ellenálló • Duzzadóképesség, jól átjárható legyen • Az első aminosavat rá lehessen kapcsolni • A szintézis végén le lehessen hasítani
Az első aminosav kapcsolása • Eltér a többitől • A COOH-csoporton keresztül történik
• A szilárdfázisú peptidszintézis során C felé haladunk! • A szintézis végén le lehessen hasítani
N
Szintézis – első aminosav felkapcsolása N-védett elsõ aminosav gyanta
O BocHN
CH2 C
OH
HO
KF
O BocHN
CH2 C
O
Szilárd-fázisú szintézis
Védőcsoport eltolítás (Nterminális) O BocHN
CH2 C
O
1. védõcsoport eltávolítás (TFA)
O H 2N
CH2 C
szabaddá váló N-terminális
O
Második aminosav felkapcsolása Gly-gyanta
O H2N
CH2 C
O
O BocHN
CH C
OH
CH3
2. Második, N-terminálisán védett aminosav (Boc-Ala)+ aktiválószer (DIC / HOBt)
O
O BocHN
CH C CH3
H N
CH2 C
Boc-Ala-Gly-gyanta
O
Lánchosszabítás 1. Védőcsoport eltávolítás BocHN
2. Boc-aminosav kapcsolása 3. Egy-egy kapcsolás hatékonysága ~99% 4. Csak 20 aminosav után nő meg a „rövidebb” peptidek száma jelentősen 5. Kapcsolások hatákonysága színreakcióval ellenőrizhető
Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Val
BocHN
Val Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Lys
BocHN
Gly Lys Val Ala 1. TFA 2. Boc-Asp
BocHN
Gly Asp Lys Val Ala
Kaiser teszt – kapcsolás ellenőrzése Primer amino csoport (a-NH2) Ha van szabad amino csoport (kék), meg kell ismételni a kapcsolást Prolinhoz izatin teszt
Kész peptid a gyantán • Boc/Bn stratégia a kész peptid lehasítása a gyantáról és az összes védőcsoport eltávolítása (TFMSA, HF speciális berendezés) • Fmoc/tBu stratégia: N-terminális Fmoc lehasítása utána a peptid és a többi oldallánc védőcsoport lehasítása egyben TFA-val • Gyökfogók használata (víz, szilil, fenol stb) • A kész peptid tisztítása HPLC-vel, (HPLC-MS) • Hosszabb peptidek szintézise fragmeskondenzációval (rövidebb szakaszok szilárd fázison, majd ezeket oldatban kapcsolják össze – megfelelő védőcsoportok kombinációja szükséges)
Oldatfázisú vs. Szilárdfázisú szintézis oldat
szilárd
• Olcsóbb
• Drága, pazarló
• Homogén
• Heterogén
• Nagyobb mennyiségekre, rövidebb peptidekre
• Kisebb mennyiségre, hosszabb szekvenciákra
• Lassú
• Könnyű tisztítás
• Nem automatizálható
• automatizálható
• Gyors
Nem természetes aminosavak
22
Oligopeptidek módosításai • Zsírsavakat kapcsolhatunk hozzá (lipoproteinek, lipopeptidek) • Biotint kapcsolhatunk hozzá • Gyógyszerhatóanyagot • Szerves csoportokat pl. fémionokat komplexáló ligandumokat (PET jelzés) • Ciklizálás (akár gyantán is, cRGD-k) • Automatizálás
Peptidek felhasználása • Membránfehérjék modellezése (lipopeptidekkel) • Assay készítés (biotinilált peptidek)
• Szállítópeptidek (gyógyszerek irányított célbajuttatása) • Gyógyszerhatóanyagok szintézise (epitópok)
• Kombinatorikus szintézis • poliHis tag, microArray
Kombinatorikus peptidszintézis
Furka Árpád (ELTE)
Kombinatorikus peptidszintézis
3 ciklus
4 ciklus
Furka Árpád (ELTE)
Oligonukleotidok szintézise • A nukleozid 3’ / 5’ foszfátok nem eléggé reaktívak • 3’-O-foszforamidit származékok
• A többi funkciós csoportot inaktiválni kell (védőcsoportok) • A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők
Védőcsoportok • 5’-hidroxil csoport dimetoxi tritil (DMT) savérzékeny • T (U) nem igényel védőcsoportot
• A, dA aminocsoportját Bz védőcsoporttal • C, dC aminocsoportját Bz, vagy Ac védőcsoporttal • G, dG, aminocsoportját izobutiril csoporttal védik • A foszfit csoportot cianoetillel védik • A DMT kivételével bázisra érzékenyek
• A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők
Védőcsoportok
Védőcsoportok
Szintetikus ciklus • 5’-véghez kapcsolódik a következő nukleotid • 5’-DMT csoport eltávolítása, az 5’ OH szabaddá válik • A következő, 5’ O-DMT nukleotid kapcsolása (tetrazol reagenssel)
• A kevés (<1%) elreagálatlan 5-OH –t deaktiválják (capping) Ac2O-val • Az új foszfit-triésztert (P(III)) oxidálni kell (nem stabil), meg nem is ez van a nukleinsavakban pl. I2/víz • Hordozó: polisztirol (makropórusos), vagy üveg (controlled pore glass, CPG)
Nukleotidok összekapcsolása
Szintetikus ciklus
OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE Védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - Liofilizálás, sómentesítés - Tisztítás: HPLC (méret szerint, ioncsere)
OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK
- primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - géndarabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.
Oligonukleotid módosítások - primer, FISH-próba - azid / acetilén linkert tartalmazó (klikk-kémia) - tiol-linker (pl. arany felszínhez)
- biotin linker - fluoreszcens módosítások (pl. molecular beaconhez) - géndarabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb. - nem természetes nukleotidok beépítése
Energiatranszfer (FRET) rendszerek • Két fluorofór (Donor, akceptor) • A donort gerjesztve az akceptor világít F1* +
F2
F1 +
F2*
F1* +
Q
F1 +
Q
• A donor emissziós spektruma átfed az akceptor gerjesztési spektrumával
Energiatranszfer (FRET) rendszerek •Távolságfüggő (10-100 Å) •Képalkotó technikák (időbeli követés) •Stokes-eltolódás változás •Kinetikai mérések, konformációs változások, komplexálás stb…
Molecular Beacon
Enzimhidrolízis - FRET
Membránfúzió
Alkímia Ma, 2009. január 8.
Oligonukleotid módosítások
14 DNA1-9 20°C 40°C 60°C 65°C 70°C 80°C 90°C
12
I / a.u.
10 8 6 4 2 0 500
550
600
650
700
/ nm
750
800
850
Oligonukleotid módosítások
exc = 430 nm
Kettősen jelölt primer. (zöld-piros) – RT-PCR
