DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS. Készítette: Fráter Tamás okl. környezetmérnök. Témavezető: Dr. Gubicza László tudományos főmunkatárs

Pannon Egyetem Vegyészmérnöki Tudományok Doktori Iskola

IONOS FOLYADÉKOK ALKALMAZÁSA KATALITIKUS REAKCIÓK KÖZEGEKÉNT DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS Készítette: Fráter Tamás okl. környezetmérnök Témavezető: Dr. Gubicza László tudományos főmunkatárs

Pannon Egyetem Műszaki Kémiai Kutatóintézet 2007

1

IONOS FOLYADÉKOK ALKALMAZÁSA KATALITIKUS REAKCIÓK KÖZEGEKÉNT Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Fráter Tamás, okleveles környezetmérnök

Készült a Pannon Egyetem Vegyészmérnöki Tudományok Doktori Iskolája keretében

Témavezető: Dr. Gubicza László, tudományos főmunkatárs Elfogadásra javaslom (igen / nem) …………………………… (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton………. % -ot ért el

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: ………………………. ………………………. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: ………………………. ………………………. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: ………………………. ………………………. igen /nem ………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján………% - ot ért el Veszprém, …………………………. a Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke

2

TARTALOMJEGYZÉK Kivonat ............................................................................................................................................................. 5 Abstract............................................................................................................................................................. 6 Auszug .............................................................................................................................................................. 7 Bevezetés .......................................................................................................................................................... 8 1. Irodalmi összefoglaló.................................................................................................................................... 9 1.1. Ionos folyadékok .................................................................................................................................... 9 1.1.1. Az ionos folyadékok jelentősége, szerkezete................................................................................... 9 1.1.2. Az ionos folyadékok kifejlesztésének rövid története ..................................................................... 10 1.1.3. Az ionos folyadékok fizikai-kémiai tulajdonságai........................................................................... 12 1.1.4. Az ionos folyadékok környezeti kockázata ..................................................................................... 15 1.2. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban ............................................................................. 20 1.2.1. Az enantioszelektív hidrogénezés jelentősége, katalizátorai ........................................................... 20 1.2.2. Az enantioszelektív hidrogénezés mechanizmusa ........................................................................... 22 1.2.3. Ionos folyadékokban végzett enantioszelektív hidrogénezés........................................................... 23 1.3. Enzimkatalitikus folyamatok ionos folyadékokban................................................................................ 34 1.3.1. A biokatalízis és az enzimek ipari alkalmazása ............................................................................... 34 1.3.2 Enzimes reakciók ionos folyadékokban............................................................................................ 34 1.3.3. Az enzimek aktivitása és stabilitása ionos folyadékokban .............................................................. 43 1.3.4. Az etil-acetát enzimes előállítása..................................................................................................... 46 1.3.5. A 2-klór propionsav enzimes észterezése n-butanollal .................................................................... 47 2. Anyagok és módszerek ................................................................................................................................. 49 2.1. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban ............................................................................. 49 2.1.1. Anyagok........................................................................................................................................... 49 2.1.2. Módszerek ....................................................................................................................................... 50 2.2. Etil-acetát előállítása szakaszos rendszerben ......................................................................................... 52 2.2.1. Anyagok........................................................................................................................................... 52 2.2.2. Módszerek ...................................................................................................................................... 53 2.3. Etil-acetát előállítása folyamatos rendszerben ....................................................................................... 57 2.3.1. Anyagok........................................................................................................................................... 57 2.3.2. Módszerek ....................................................................................................................................... 57 2.4. 2-Cl propionsav észterezése n-butanollal ............................................................................................... 62 2.4.1. Anyagok........................................................................................................................................... 62 2.4.2. Módszerek ....................................................................................................................................... 62 2.5. A mérések pontossága ............................................................................................................................ 68 2.5.1. Enantioszelektív hidrogénezés......................................................................................................... 68 2.5.2. Etil-acetát enzimes előállítása szakaszos rendszerben ..................................................................... 68 2.5.3. Etil-acetát enzimes előállítása folyamatos rendszerben ................................................................... 70 2.5.4. 2-klór-propionav enzimes észterezése n-butanollal ......................................................................... 71

3

3. Eredmények .................................................................................................................................................. 73 3.1. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban ............................................................................. 73 3.1.1. Az AFSAV hidrogénezése [Rh(NBD)((S,S)-DiMe-BDPP)]PF6 (K1) katalizátorral [bmim]BF4/izopropanol kétfázisú rendszerben ................................................................... 73 3.1.2. Az AFSAV és az AFME hidrogénezése [Rh(COD)((R,R)-DiPamp))]BF4 (K2) katalizátorral ionos folyadék/izopropanol kétfázisú rendszerben ...................................................... 74 3.1.3. A [Rh(COD)((R,R)-DiPamp))]BF4 (K2) katalizátor újrahasznosításának vizsgálata az AFSAV hidrogénezése esetén [bmim]BF4/izopropanol kétfázisú rendszerben .................................... 78 3.1.4. A kísérleti eredmények összehasonlítása az irodalmi adatokkal ..................................................... 80 3.2. Az etil-acetát enzimes előállítása ionos folyadékokban ......................................................................... 82 3.2.1. A reakcióközeg hatása ..................................................................................................................... 82 3.2.2. Az enzimkoncentráció hatása .......................................................................................................... 84 3.2.3. Az alkohol- és a savfelesleg hatása.................................................................................................. 86 3.2.4. A hőmérséklet hatása ....................................................................................................................... 88 3.2.5. A víztartalom hatása ........................................................................................................................ 90 3.3. Az etil-acetát előállítása [bmim]PF6 ionos folyadékban, folyamatos rendszerben ................................ 93 3.3.1. Membránok fluxusának és szelektivitásának mérése „vak” modellelegyekkel ............................... 93 3.3.2. Szakaszos kísérletek pervaporációval.............................................................................................. 95 3.3.3. Folyamatos rendszer kiépítése ......................................................................................................... 96 3.4. 2-Cl-propionsav enzimes észterezése n-butanollal ionos folyadékokban .............................................. 100 3.4.1. Reakcióközeg hatása........................................................................................................................ 100 3.4.2. Konverzió növelése pervaporációs vízeltávolítással........................................................................ 103 4. Definíciók és rövidítések .............................................................................................................................. 110 5. Irodalomjegyzék ........................................................................................................................................... 114 Tézisek.............................................................................................................................................................. 120 Theses ............................................................................................................................................................... 123 Publikációk és proceedingek............................................................................................................................. 126 Publikációkra való hivatkozások ...................................................................................................................... 130 Köszönetnyilvánítás.......................................................................................................................................... 133

4

KIVONAT Az ionos folyadékok szobahőmérsékleten folyékony, rendkívül alacsony gőznyomású sószerű vegyületek. Mivel gyakorlatilag nem párolognak, ígéretes környezetbarát reakcióközegnek bizonyulnak az illékony –emiatt tűzveszélyes és egészségkárosító– hagyományos szerves oldószerek kiváltására. Doktori munkám során az ionos folyadékok alkalmazását kétféle enzimes észterezési, valamint egy fém-organikus katalitikus hidrogénezési reakcióban vizsgáltam. Az egyik enzimes észterezési reakció egy aromaészter, az etil-acetát előállítása volt. Ezt a reakciót ionos folyadékban eddig még nem vizsgálták. Kísérleteim során a reakció optimális paramétereit vizsgáltam rázatott lombikos kísérletekben, majd egy laboratóriumi méretű, pervaporációval integrált berendezésben az észter előállítását folyamatossá tettem. A másik vizsgált enzimes észterezés egy enantioszelektív reakció, a 2-klór-propionsav n-butanollal való észterezése volt. Kísérleteim során az enzimaktivitás csökkenését hasonlítottam össze hagyományos szerves oldószerben (n-hexánban) valamint egy ionos folyadékban. Az optimális víztartalom fenntartására egy pervaporációval integrált berendezésben távolítottam el a reakcióban keletkező vizet. Enantioszelektív reakciókat nemcsak enzimek, hanem fém-organikus katalizátorok is képesek katalizálni. Kísérleteim során prokirális olefinek hidrogénezését végeztem. A reakciót kétfázisú rendszerben hajtottam végre, melyben az egyik fázist az ionos folyadék alkotta (ez tartalmazta a katalizátort), míg a másik fázis izopropanol volt, mely mint ko-szolvens a szubsztrátumokat tartalmazta oldott állapotban. Ez a kétfázisú rendszer az ionos folyadék révén lehetővé tette a költséges katalizátor visszanyerését, amit homogénkatalitikus eljárással csak rendkívül bonyolult módon lehet megvalósítani.

5

ABSTRACT The use of ionic liquids were investigated in two enzymatic esterifications and a metalcatalyzed asymmetric hydrogenation. The optimal reaction parameters of ethyl acetate synthesis were determined by shakeflask experiments, then a laboratory-scale setup integrated with a pervaporation unit was built for the continuous synthesis of the ester. The decrease of enzyme activity was studied in enzymatic synthesis of butyl 2chloropropionate using [bmim]PF6 ionic liquid as reaction media. An experimental setup integrated with pervaporation was used for the removal of the excess water from the reaction mixture. Enantioselective hydrogenation of enamides catalyzed by rhodium complexes were investigated in an ionic liquid containing biphasic system. This system - due to the ionic liquid- allowed the reuse of the catalyst, which can be hardly achieved by homogenous catalysis.

6

AUSZUG

Die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten wurde in zwei enzymkatalytischen Reaktionen und in einer metallkatalysierten Reaktion untersucht. Die optimalen Reaktionsparameter der Herstellung von Ethylazetat wurden in einem Schüttelinkubator bestimmt, dann wurde eine Anlage im Labormassstab verkoppelt mit einer Pervaporationsanlage zur kontinuierlichen Produktion des Esters ausgebildet. Die Verminderung der Enzymaktivität wurde während der enzymatischen Synthese von Butyl-2-chlorpropionat

in

[bmim]PF6

ionischer

Flüssigkeit

als

Lösungsmittel

untersucht. Ein integriertes System bestehend aus einem Bioreaktor und einer Pervaporationsanlage wurde zur Entfernung des gebildeten Wassers aus dem Reaktionsgemisch verwendet. Die enantioselektive Hydrierung von Enamiden durch Rhodium-Komplexe wurde in einem ionische Flüssigkeit enthaltende Zweiphasensystem studiert. Dieses System – infolge der Verwendung der ionischen Flüssigkeit – ermöglichte die Wiederverwendung des Katalysators, was in homogener Katalyse kaum möglich war.

7

Bevezetés

Napjainkban a vegyipar mind a hatóságok, mind a közvélemény részéről erős nyomás alá került, hogy tisztább alternatívákat keressen az illékony, mérgező és gyúlékony szerves oldószerek (ún. VOC = Volatile Organic Compounds, azaz illékony szerves vegyületek) használata helyett. Az 1970-es években új, környezettudatos szemlélet alakult ki, mely mára ahhoz vezetett, hogy új ipari technológiák jöttek létre, melyek környezetterhelése jóval kisebb, mint a hagyományos technológiáké. Kialakult a „zöld kémiá”-nak („green chemistry”) nevezett kutatási irány. A zöld kémiai kutatások egyik kiemelt területe a szerves oldószerek kiváltása a légkört kevésbé szennyező, könnyen

visszaforgatható,

kevésbé

toxikus

anyagokkal.

Alternatívaként

az

oldószermentes szintézisek elterjesztése, oldószerként víz vagy szuperkritikus folyadékok használata és –nem utolsó sorban– az ionos folyadékok alkalmazásba vétele kínálkozott. Az

ionos

folyadékok

szobahőmérsékleten

folyékony,

rendkívül

alacsony

gőznyomású sószerű vegyületek, melyek a szerves oldószerekhez hasonlóan oldják a szerves anyagok jelentős részét. A párolgás hiánya miatt azonban ezek az anyagok nem jutnak a légkörbe, így nem szennyezik a levegőt, és robbanásveszéllyel sem kell számolni.

Az eddig megjelent szakirodalom alapján az ionos folyadékok számos

szerves kémiai reakciókban (hidrogénezés hidroformilezés, epoxidáció, Heck reakció stb.) alkalmasak a szerves oldószer reakcióközeg kiváltására. Ezeken túlmenően kiderült, hogy a biokatalizátorok (enzimek), sőt sejtkultúrák is jól tolerálják az ionos folyadékokat, így biokatalitikus reakciók közegeként is alkalmasak. Kutatásaim során az ionos folyadékok többféle alkalmazási lehetőségét is vizsgáltam. Prokirális olefinek aszimmetrikus hidrogénezése során tanulmányoztam a reakció lejátszódását olyan kétfázisú rendszerekben, melyekben az ionos folyadék segítségével újra felhasználható a fémkomplex katalizátor. Ezen túlmenően kétféle enzimes észterezési reakciót, köztük egy enantioszelektív észterezést vizsgáltam ionos folyadékokban különböző reakcióparaméterek mellett. Az enzimes reakció termékeinek in situ kinyerésére elsőként alkalmaztam integrált rendszert, mellyel folyamatos eljárást alakítottam ki.

8

1. Irodalmi összefoglaló 1.1. Ionos folyadékok 1.1.1. Az ionos folyadékok jelentősége, szerkezete

Az ionos folyadékok („ionic liquids; ILs”) szerves kationból és szerves vagy szervetlen anionból álló szintetikus sószerű vegyületek, melyek szobahőmérsékleten (vagy annak közelében) közepes viszkozitású folyadékok. A hagyományos értelemben vett „sók” magas olvadáspontjával szemben (pl. NaCl esetében 800 °C) az ionos folyadékok lényegesen alacsonyabb hőmérsékleten is folyékonyak (Wilkes, 2002). Ennek oka az, hogy a kation és az anion nagy méretéből eredően az ionok közötti elektrosztatikus kölcsönhatás olyan kicsi, hogy szobahőmérsékleten nem alakul ki kristályszerkezet. Az ionos folyadékokban leggyakrabban előforduló kationokat és anionokat az 1.1.1. ábra mutatja. Elnevezésük, rövidítésük a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található. KATIONOK:

R2

N + N

ANIONOK:

PF6

+ R1

BF4

N

-

CF3SO3

-

-

R

Imidazolium

Piridinium

R

NO3

SO3

R

+ R N R R

+ P R R R

Ammónium

Foszfónium

O CF3

S O

O N

S

-

CF3

O

1.1.1. ábra: Az ionos folyadékokat felépítő legfontosabb ionok

Az elmúlt kb. tíz évben az ionos folyadékok egyre inkább felkeltették a figyelmet mint korszerű, környezetbarát oldószerek, illetve reakcióközegek. Ennek a legfőbb oka az, hogy gőznyomásuk igen alacsony, melynek köszönhetően gyakorlatilag kizárhatók a párolgásból eredő környezeti és biztonságtechnikai problémák és veszteségek (Welton, 1999). Szintén előnyük, hogy a kation és az anion megfelelő módosításával széles körben variálhatók, „hangolhatók” bizonyos tulajdonságaik, mint polaritás, hidrofób jelleg valamint más oldószerekkel való elegyedés („designer solvents”, Freemantle, 9

1998). Ez igen kedvező, mivel kísérleti tapasztalatok és/vagy molekulamodellező szoftverek segítségével meghatározható, hogy egy adott célra (pl. extrakció, szerves katalitikus reakció stb.) milyen típusú ionos folyadékok felelhetnek meg. Ezek után pedig (pl. az alkil lánc változtatásával) tovább finomítható az optimalizálás (Huddleston, 2001; Anderson, 2002; Dzyuba, 2002). Az ionos folyadékok főbb tulajdonságai ma már internetes adatbázisokban is fellelhetők (1.1.5. fejezet). Az ionos folyadék oldószerek jól alkalmazhatók számos szerves reakcióban (pl. Heck reakció, hidroformilezés, hidrogénezés, Diels-Alder és Friedel-Crafts reakciók, epoxidáció, aminok szintézise stb.) (Borbigou, 2002; Jain, 2005). Ionos folyadékokat alkalmaznak az elektrokémiában is (de Souza, 2003), valamint az analitikán belül a folyadékkromatográfiában (Poole, 1986), a gázkromatográfiában (Armstrong, 1999), a kapillár-elektroforézisben (Yanes, 2001) valamint folyadék-folyadék extrakcióknál (Carda-Broch, 2003). Végül, de nem utolsó sorban az ionos folyadékok enzimes reakciók oldószereként is alkalmasak (részletesen az 1.3-1.4. fejezetekben). Ma már több gyártónál is (pl. Solvent Innovation GmbH, www.solventinnovation.com) komplett ionos folyadék készleteket, „kiteket” szerezhetünk be, melyeket egy adott célnak megfelelően állítanak össze (pl. „elektrokémiai kit” vagy „biotechnológiai kit” stb.).

1.1.2. Az ionos folyadékok rövid története

Az ionos folyadékok felfedezésének története még a 19. századba nyúlik vissza. A benzol klór-metánnal történő Friedel-Crafts alkilezése során a reakcióelegyben a toluol termék mellett egy „vörös olaj”-nak nevezett mellékterméket is találtak, ami külön fázist alkotott. Ennek összetételét csak jóval később, az NMR spektroszkópia megjelenésével tudták meghatározni. Ekkor kiderült, hogy

az

„olaj”

egy

olyan

folyékony

halmazállapotú só, melynek anionja a heptakloro-

+

aluminát, kationja pedig a Friedel-Crafts reakció 1.1.2.

ábra:

A

konstitúciós képlete

10

-

H

során átmeneti termékként keletkező σ-komplex (1.1.2. ábra) (Wilkes, 2002).

R

Al2Cl7

„vörös

olaj”

A 20. század elején publikálták elsőként, hogy bizonyos szerves sók –mint például az etil-ammónium-nitrát– szobahőmérsékleten is folyékonyak (Walden, 1914) Az első, mai ionos folyadékok „ősének” számító ionos folyadékokat, a klór-aluminátokat az 1940-es években fedezte fel Hurley és Wier (Hurley és Wier, 1951). Ők az alkil-piridinkloridot és az alumínium-kloridot elegyítették, melynek során tiszta, színtelen folyadékot kaptak, melyben ionok voltak: alkil-piridinium kation és tetrakloro-aluminát anion. Felfedezésük kémiai kuriózumnak számított, de évtizedekre feledésbe merült. Az 1980-as években Wilkes, Seddon és Hussey kutatócsoportja számos alkilpiridinium- és alkil-imidazolium kationt és tetrakloro-aluminát aniont tartalmazó ionos folyadékot állított elő (Fannin, 1984; Hitchcock, 1986). Az 1980-as évek közepétől kísérletek

kezdődtek

ezen

ionos

folyadékok

Friedel-Crafts

reakcióban

való

alkalmazására. A kutatóknak nem kellett csalódniuk: ionos folyadék közegben a Friedel-Crafts acilezés a hagyományos oldószerekhez képest nagyobb sebességgel és jobb szelektivitással ment végbe (Boon, 1986). A klór-aluminátok legnagyobb hátránya, hogy a nedvesség hatására reakcióba lépnek, melynek során korrózív sósav is keletkezik. 1992-ben Wilkes és Zaworotko nedvességre érzéketlen ionos folyadékokat fejlesztett ki tetrafluoro-borát, a hexafluorofoszfát, szulfát, nitrát és acetát anionokkal (Wilkes és Zaworotko, 1992). A környezetvédelem előtérbe helyeződésével az utóbbi években az ionos folyadékok a gyúlékony és egészségkárosító szerves oldószerek alternatívájaként igen jelentős érdeklődésre tettek szert a szerves- és elektrokémia területén. A publikációk száma 1998-1999 óta rohamosan nő (1.1.3. ábra). Az ionos folyadékok ipari alkalmazása szempontjából azonban ma még nagy hátrányt jelent a költség, az oldószerek viszonylag magas ára. Szerencsére azonban az utóbbi 10 évben az ionos folyadékok ára a forgalmazó cégeknél (Solvent Innovation GmbH, Io-Li-Tech, Merck stb.) jelentősen, kb. 1/5-ére csökkent. Az ionos folyadékok árában megfigyelhető csökkenő tendencia fennmaradni látszik, így könnyen elképzelhető, hogy néhány éven belül a finomvegyipar több ága számára is gazdaságos lehet az ionos folyadékok alkalmazása. Ionos folyadékokat pari méretben először a BASF alkalmazott a Német Innovációs Nagydíjjal kitüntetett BASIL® (BASIL = Biphasic Acid Scavenging utilizing Ionic Liquids) eljárásban (Freemantle, 2003).

11

1200

Publikációk száma

1000

800

600

400

200

0 1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

Év

1.1.3. ábra: Az „ionos folyadék” kifejezést tartalmazó publikációk száma az elmúlt években (Forrás: Web of Science, www.eisz.hu)

1.1.3. Az ionos folyadékok fizikai-kémiai tulajdonságai

Az ionos folyadékok elegyedési (oldószer-) tulajdonságai az iparban alkalmazott illékony szerves oldószerekéhez hasonlóak, azonban számos tulajdonságuk (pl. oktanol/víz megoszlás) ettől jelentősen eltér. Amennyiben egy adott kémiai reakcióhoz oldószert szeretnénk választani, a legfontosabb paraméterek közé tartozik, hogy milyen hőmérsékleti határok között stabilak (lehet velük dolgozni), valamint mekkora a komponensek oldhatósága az oldószerben. Ezen oldószer tulajdonságokról mindezidáig az egyik legjobb összefoglaló Reichard kézikönyvében jelent meg (Reichard, 2003, bővített kiadás). Az ionos folyadékok egyéb tulajdonságairól, mint sűrűség, viszkozitás, hőkapacitás szintén nagy mennyiségű irodalom áll rendelkezésre, ezek összefoglalóan Wilkes tanulmányában találhatók meg (Wilkes, 2004). Mindezen túlmenően CardaBroch és Poole publikált igen részletesen az ionos folyadékok paramétereiről (CardaBroch, 2003; Poole, 2004), de mivel ezek döntően csak adatok, részletes ismertetésükről itt (helyszűke miatt) eltekintek, helyette csak igen röviden, és összefoglalóan ismertetem az ionos folyadékok legfontosabb tulajdonságait. Néhány ionos folyadék jellemző adatát az 1.1.1-1.1.2. táblázatban tüntettem fel.

12

1.1.1. táblázat: [bmim]+ kationt tartalmazó ionos folyadékok néhány fizikai-kémiai tulajdonsága (Carda-Broch, 2003) Anion

Olvadáspont

Sűrűség

(°C)

(kg/dm3)

BF4-

-82

1,17

PF6-

-8

Cl-

Törésmutató Viszkozitás Vezetőképesség (cP, 20 °C)

(S/m)

1,429

233

0,17

1,36

1,411

312

0,14

65

1,10

szilárd

szilárd

szilárd

CF3COO-

-40

1,21

1,449

73

0,32

CF3SO3-

16

1,29

1,438

90

0,37

(CF3SO2)N-

-4

1,43

1,427

52

0,39

C3F7COO-

-40

1,33

1,414

182

0,10

C4F9CO3-

20

1,47

1,405

373

0,045

1.1.2. táblázat: Néhány Tf2N- aniont tartalmazó ionos folyadékok néhány fizikai-kémiai tulajdonsága (Carda-Broch, 2003) Kation

Olvadás-

ρ

Törés-

Viszkozitás

Λ

pont (°C)

(kg/dm3)

mutató

(cP, 20 °C)

(S/m)

1,3-dimetil-imidazolium+

22

1,56

1,422

44

0,84

1-etil-3-metil-imidazolium+

-3

1,52

1,423

34

0,88

1,3-dietil-imidazolium+

14

1,45

1,426

35

0,85

1-butil-3-metil-imidazolium+

-4

1,43

1,427

52

0,39

1-metoxietil-3-metil-

30

1,50

1,429

54

0,42

20

1,51

1,430

88

0,32

-22

1,43

1,430

36

0,62

+

imidazolium

1-metil-2-metil-3-etilimidazolium+ 1-etil-3-etil-4-metil+

imidazolium

Olvadáspont Az ionos folyadékok olvadáspontja tág határok között mozog. Definíció szerint olyan sók esetében beszélhetünk „ionos folyadék”-ról, melynek olvadáspontja 100 °C alatt van, míg az alsó határ kb. -100 °C, ennél alacsonyabb olvadásponttal csak kivételes esetben találkozhatunk.

13

Sűrűség A legtöbb ionos folyadék sűrűsége a víznél nagyobb, többnyire 1,1-1,5 kg/dm3 között változik. Bizonyos esetekben a sűrűség 1-nél kisebb, pl. néhány tetraalkilammónium só esetében. Azonos anion mellett az alkil szubsztituensek méretével arányosan kissé csökken a sűrűség (1.1.1-1.1.2. táblázat)

Viszkozitás A legtöbb ionos folyadék viszkozitása 50 és 500 cP közé esik (1 cP = 1 mPa × s), ami a víz viszkozitásának (0,89 cP) kb. 60-600-szorosa. A viszkozitás erősen függ a hőmérséklettől. A [bmim]oktil-szulfát viszkozitása például 20 °C-on még 900 Cp körül van, 100 °C-on viszont már csak 25 körüli érték, (1.1.4. ábra). A függvény alakján látszik, hogy a vizsgált hőmérséklet-tartományban az ionos folyadék viszkozitása jól követi a newtoni folyadékokra vonatkozó szabályt (lnη = A + B/RT). Viszkozitás (mPa×s)

1000

100

10 20

30

40

50

60

70

80

90

100

T (°C)

1.1.4.

ábra:

A

[bmim]oktil-szulfát

viszkozitásának

változása

a

hőmérséklet

függvényében 20-100 °C között (Wasserscheid, 2002)

Hőmérsékleti stabilitás A legtöbb ionos folyadék 250-300 °C-ig stabil, azonban a hexafluoro-foszfát illetve tetrafluoro-borát anionok jelenléte jelentősen limitálhatja az alkalmazott hőmérsékletet: itt már 70-80 °C-on káros HF bomlástermék keletkezhet az anionokból (Swatloski, 2003).

Polaritás Az ionos folyadékok általában erősen poláros oldószerek. Az oldószer polaritást a szolvatokromikus festék (olyan festékanyag, melynek látható tartományban mért

14

elnyelési maximuma az oldószer polaritásától függ) abszorpciós maximuma alapján definiálják. (Deye, 1990; Reichard, 1994). Az ionos folyadékok polaritása kb. 0,6-0,7 azon a normál polaritás skálán, melyen a tetrametil-szilán polaritása 0, a vízé pedig 1,0. Így az ionos folyadékok polaritása a kis móltömegű alkoholok illetve a formamid tartományába esik. Az imidazolium-gyűrűn lévő alkil csoport (C4-C8), illetve az anion csak kis mértékben befolyásolja a polaritást (Carmichael, 2000; Aki, 2001).

Elegyedés szerves oldószerekkel és vízzel Az ionos folyadékok az apoláros, kis dielektromos állandójú oldószerekkel (hexán, éterek) általában nem, a polárosakkal (aceton, metanol, THF) jól elegyednek (Poole, 2004). Néhány ionos folyadék leggyakoribb oldószerekkel való elegyedését az 1.1.3. táblázat mutatja. 1.1.3. táblázat: Néhány oldószer elegyedése ionos folyadékokkal (Poole, 2004) [bmim]

[bmim]

[bmim]

[bmim]

Oktil-metil-

BF4

PF6

Tf2N

oktil-szulfát

ammónium Tf2N

Víz

+

-

-

p

+

Etil-acetát

p

+

+

p

+

Toluol

p

p

p

p

+

Acetonitril

+

+

+

+

+

n-Hexán

-

-

-

p

p

1-Oktanol

p

p

p

+

+

Kloroform

+

p

+

+

+

+ = elegyedik; - = nem elegyedik; p = parciálisan elegyedik

Az ionos folyadékok vízzel való elegyedésének mértéke nagymértékben függ az aniontól (1.1.5. ábra, Visser, 2002; Kragl, 2003).

Teljes elegyedés

Nincs elegyedés

1.1.5. ábra: Az ionos folyadékok anionjának hatása a vízzel való elegyedésre (Kragl, 2003)

15

A szuperkritikus szén-dioxid (sc.CO2) nem elegyedik pl. a [bmim]PF6 ionos folyadékokkal, de igen nagy mennyiségben elnyelődik az ionos folyadék fázisban (akár 0,7 móltörtig is). Ionos folyadék nem kerül be a CO2 fázisba. Ennek akkor van nagy jelentősége, amikor a terméket sc.CO2-dal extrahálják ki az ionos folyadékból (Blanchard, 2001).

Analízis Az ionos folyadékok hagyományos kromatográfiás módszerekkel csak nehezen elemezhetők, UV-spektroszkópiával viszont nagy érzékenységgel kimutathatók; az imidazolium-bázisú ionos folyadékok elnyelési maximuma például a 240-250 nm-es tartományban van (Koel, 2000). Az ionos folyadékok jól elemezhetők IR spektroszkópiával is, amivel elsősorban tisztaságuk határozható meg (Koel, 2000, Csihony, 2001). Az ionos folyadékok tisztasága, hőstabilitása termikus analízissel (DT, DTA, DTG) is meghatározható. Mindezen túlmenően az ionos folyadékok NMR spektroszkópiával is jól vizsgálhatók (Durazo és Abu-Omar, 2002).

1.1.4. Az ionos folyadékok környezeti kockázata

Az ionos folyadékok legfontosabb környezeti előnye a többi oldószerrel szemben egyértelműen a rendkívül alacsony gőznyomás. A párolgás hiánya miatt az ionos folyadékok alkalmazása egészség- és tűzvédelmi szempontból egyértelműen előnyös lehet, azonban nem szabad megfeledkezni egyéb úton történő expozícióról (orális, dermális) sem, illetve arról, hogy az ionos folyadékok alkalmazása során keletkezhet-e mellékreakcióban környezetre káros anyag. Emiatt alapvető az ionos folyadékok toxicitásának valamint biztonságtechnikai szabályainak (pl. milyen védőruházatra van szükség, mi a teendő bőrfelületre fröccsenés vagy lenyelés esetén stb.) ismerete. Egy másik nagyon fontos kérdés, hogy a hulladékba kerülő ionos folyadékok hogyan semmisíthetők meg, lehetséges-e biológiai degradációjuk. Az anionokkal kapcsolatban jelentős probléma lehet, hogy számos anion halogéntartalmú komplex, ami viszont magában hordozza a bomlás veszélyét. A tetrakloro-aluminát ion például vizes közegben hidrolizál, melynek során korrózív és egészségkárosító HCl keletkezik. A fluortartalmú komplexekről sokáig úgy tartották, hogy teljesen stabilak, ennek ellenére később bebizonyosodott, hogy például a hexafluoro-foszfát anionból (főleg magasabb hőmérsékleten) lassú folyamatban HF 16

szabadul fel (Wasserscheid, 2002, Swatloski, 2003). A probléma kiküszöbölhető olyan anionok alkalmazásával, melyek nem tartalmaznak fluort (pl. szulfát, metil-szulfonát, toloul-szulfonát,

acetát,

laktát…).

Wasserscheid

kutatócsoportja

foglalkozott

fluormentes ionos folyadékok kifejlesztésével, 2002-ben például egy ígéretes fluormentes ionos folyadék, a [bmim]oktil-szulfát kifejlesztéséről számoltak be. A [bmim]oktil-szulfát olcsó alapanyagokból előállítható, hőmérsékletileg igen stabil (csak 340 °C-on kezd el bomlani), emellett a hidrolízisnek is ellenáll. A szerzők az általuk kifejlesztett ionos folyadékot sikeresen alkalmazták az 1-oktén hidroformilezése során (Wasserscheid, 2002). Mint az 1.1.1. fejezetben is említettem, az ionos folyadékokban sokféle kation és anion fordulhat elő, melyekből csak néhány kiragadott példa látható az 1.1.1. ábrán. Az ionokból így igen nagy számú kombináció lehetséges, ami igen fontos előny a felhasználásnál, mivel egy adott célra „testre szabható” az ionos folyadék tulajdonsága, azonban minden egyes ionos folyadéknak „külön-külön” történő (öko)toxikológiai vizsgálata igen nehézkes vállalkozás. Ehelyett a vizsgálatok nemcsak az egyes ionos folyadék-típusok toxikológiai elemzésére irányulnak, sokkal inkább az egyes ionok szerkezete és biológiai hatása között keresnek összefüggéseket, melyek alapján képet kaphatunk arról, hogy egy ionstruktúra mennyire előnyös vagy hátrányos az élő szervezetre („structure-activity relation” = SAR, Jastroff, 2003). Az ionos folyadékok toxicitásának SAR vizsgálatáról Jastroff kutatócsoportja már 2003-ban kiadott egy tanulmányt, 2005-ben pedig további eredményeket ismertetett. Ezen SAR vizsgálatok során ionos folyadékok négy fő paraméterét vizsgálták (Jastroff, 2005), melyeket az alábbiakban mutatok be.

1. A kation mag típusának (pl. imidazolium v. piridinium) és biológiai hatásának összefüggése A különböző kationokat tartalmazó ionos folyadékok biológiai hatásait – természetesen azonos anion mellett– patkánysejteken (Promyleocytic leukemia sejtek túlélése) és az acetilkolin észteráz aktivitásának változása alapján vizsgálták. A sejteket olyan környezetbe helyezték, melyben különböző ionos folyadék koncentrációknak voltak kitéve, majd vizsgálták a sejtek túlélését (WST-analízis). A túlélést a koncentráció logaritmusának függvényében ábrázolták, melyek során szigmoid típusú görbéket kaptak. Az eredmények alapján azt a következtetést vonták le, hogy az

17

imidazolium kation mag kevésbé toxikus az adott sejtre ill. enzimre, mint a pirrolidium, illetve piridinium.

2. A kation magon található alkil láncok hatása A kation magján található alkil láncok hatását már 2004-ben is vizsgálta Swatloski kutatócsoportja, melyben a Caenorhabditis elegans hengeresféreg (nematóda) mortalitását vizsgálta különböző hosszúságú alkil-láncot tartalmazó ionos folyadékban ([bmim]Cl: 4 szénatom, [omim]Cl: 8 szénatom, tertadecil-metil-imidazolium-klorid: 14 szénatom) (Swatloski, 2004). A toxicitásvizsgálat során egyértelmű összefüggést állapítottak meg az alkil lánc hossza és a nematódák pusztulása között: minél hosszabb az imidazolium-gyűrűn lévő alkil lánc, annál toxikusabb az ionos folyadék. A 14 szénatomos alkil lánc esetében már 1 g/dm3 esetén 99%-os volt a mortalitás a nematódák között, addig a [bmim]Cl esetében még 5 g/dm3 IL koncentrációnál sem volt számottevő a pusztulás. Az eredmények alapján a [bmim]Cl és az [omim]Cl nem bizonyult akut toxikusnak, a tertadecil-metil-imidazolium-klorid viszont enyhén toxikusnak bizonyult (10 mg/dm3 < LC501< 100 mg/ dm3). Jastroff és munkatársai hasonló összefüggést állapítottak meg a [bmim]BF4 és az [omim]BF4 toxicitásának összehasonlítása során. A Lemna minor mikroorganizmus tenyésztése során [omim]BF4 expozíció esetén már 10 mg/dm3 IL koncentrációnál 87%os

telepszám-csökkenést

figyeltek

meg,

míg

[bmim]BF4

esetében

ennél

a

koncentrációnál még nem volt szignifikáns a csökkenés. A kerti zsázsa (Lepidium sativum) [omim]BF4 expozíciója során már 100 mg/kg koncentrációnál teljesen kipusztult a növény, míg [bmim]BF4 esetén a teljes pusztulást csak 1000 mg/kg expozíció esetén figyelték meg.

3. Anion hatása Jastroff kutatócsoportja több mint 20 anion hatását vizsgálta azonos kation ([bmim]) mellett. Az anion variálásával az LC50 kb. 1 nagyságrenden belül változott. 4. Metabolitok hatása A szerzők azt az esetet is modellezték, melyben az ionos folyadék lebomlása megkezdődik, és különböző bomlástermékek, metabolitok jönnek létre, melyek

1

LC50 = „félhalálos koncentráció”, a pontos definíció a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található

18

toxicitása fokozatosan csökken. Az 1.1.6. ábra az [omim] kation feltételezett metabolitjait, és ezek hatását (EC501) mutatja be. Az ionos folyadékok biológiai hatásairól (pl. szem-és bőrizgató hatás) további irodalmi adatok találhatók a 2004-ben Masten által kiadott tanulmányban (Masten, 2004). Az ionos folyadékok toxicitásáról a jelenlegi legfrissebb adatbázis 2006-ban jelent meg Chiappe kutatócsoportjától (Pretti, 2006). A szerzők többféle imidazolium-, piridinium-, pirrolidium- és ammóniumion kationt tartalmazó ionos folyadék ökotoxicitását vizsgálták zebrahalon (Danio rerio). A vizsgált ionos folyadékok többsége nem bizonyult akut toxikusnak (LC50 > 100 mg/dm3), azonban két, ammóniumbázisú kationt tartalmazó ionos folyadék esetében az LC50 értéke 1 és 10 mg/dm3 között volt (közepesen toxikus kategória). N + N EC 50 = 62 × 10 -3 mM

N + N

OH N

N

N

EC 50 > 2 mM

N

EC 50 = 158 × 10 -3 mM

O

N + N

O

-

EC 50 > 3 mM

1.1.6. ábra: Az [omim]+ kation feltételezett metabolizmusa, és a metabolitok citotoxicitása (Jastroff et. al., 2005)

1.1.5. Adatbázisok

Az igényt, hogy az ionos folyadékokkal kapcsolatban létrejöjjön egy jól áttekinthető, gyors internetes adatbázis, már 2000-ben megfogalmazták (Rogers, 2000). Ebben felvetette, hogy egy olyan adatbázisra van szükség, melyben az ionos folyadékok fizikai és fizikai-kémiai adatai mellett a biztonságtechnikai, toxikológiai, és környezeti

1

A pontos meghatározás a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található

19

hatásai (bioakkumuláció, biodegradáció stb.) is elérhetők legyenek, valamint hogy gazdaságossági és életciklus-elemzéseket is készítsenek az ionos folyadékok alkalmazásáról. A világhálón jelenleg (2007 tavaszán) föllelhető ionos folyadék adatbázisok közül kettőt mutatok be részletesebben: a IUPAC Ionic Liquids IL-Thermo-t valamint a Merck világcég adatbázisát. Mindkét weblap szabadon elérhető.

IUPAC Ionic Liquids IL Thermo (http://ilthermo.boulder.nist.gov/ILThermo/mainmenu.uix)

Az IL Thermo adatbázis a NIST kémiai adatbázisra épül. A NIST adatbázisban a vegyületek fizikai és kémiai tulajdonságai találhatók, melyet a világszerte megjelent irodalmi adatok alapján táplálnak be és frissítenek. Az igen felhasználóbarát adatbázis nyitólapja az 1.1.7. ábrán látható. A nyitólapról linkes kapcsolatban elérhetők a IUPAC ionos folyadék adatbázis projekt, a Temodinamics Research Center valamint a National Institute of Standards and Technology weblapjai. Ezen kívül feltüntették a legutóbbi frissítés időpontját is. A nyitólapról tiszta ionos folyadékok, valamint ionos folyadékokat tartalmazó biner és terner rendszerek adataira kereshetünk rá. Mind az ionos folyadékok, mint a többkomponensű rendszerek a következőképpen azonosíthatók a keresés során:
Az ionos folyadék alapján (összegképlet, CAS szám, molekulatömeg, elnevezés, szerkezet) A keresőt úgy alkották meg, hogy amennyiben csak az egyik ion (anion vagy kation) kerül megadásra, a rendszer automatikusan felkínálja az adatbázisban található valamennyi ionos folyadékot, amiben megtalálható az adott ion.
Az ionos folyadék alapján (összegképlet, CAS szám, molekulatömeg, elnevezés, szerkezet)
Tulajdonságok alapján (Pl. olvadáspont < 10°C stb.)
Irodalmi hivatkozások alapján (Publikáció címe, megjelenés vagy szerzők) Mindegyik ionos folyadék esetén fel van tüntetve, hogy az adott ionos folyadék milyen forrásból, milyen kiszerelés mellett szerezhető be, illetve ha kereskedelmi úton még nem került forgalomba, elnavigálhatunk ahhoz a publikációhoz, ahol a szerzők ismertetik az ionos folyadék szintézisét, esetleg a kereskedelemben beszerzett ionos

20

folyadék

további

tisztításának

módszerét,

illetve

az

analitikai

módszereket

(kalorimetria, NMR stb.)

1.1.7. ábra: Az „IL Thermo” internetes adatbázis nyitólapja

Biner rendszerek esetén az ionos folyadékok más komponensekkel (víz, alkoholok, alifás, ciklusos és aromás szénhidrogének, CO2 stb.) való elegyedéséről kapunk információt, míg terner rendszer választásakor megtalálható pl. a [bmim]PF6/víz/etanol rendszer vezetőképessége vagy viszkozitása, vagy például a policiklusos aromás szénhidrogének megoszlása különböző kétfázisú, ionos folyadék/víz rendszerekben. Az adatbázisban a megadott numerikus adatok mellett ismertetik a forrást, a rendelkezésekre álló adatpontok számát valamint az adat szórását (megbízhatóságát) is.

Merck adatbázis (http://ildb.merck.de/ionicliquids/en/startpage.htm)

A Merck adatbázis struktúrája hasonlít az IL Thermo adatbáziséhoz, a nyitólapról lehetőségünk van egy gyors és egy kibővített keresés indítására. Ez utóbbiban –az IL Thermo-hoz

hasonlóan–

kiválasztható

az

ionos

folyadék

tulajdonsága

(pl.

molekulatömeg < 300 g), és a találati listán csak ezen ionos folyadékok jelennek meg.

21

Természetesen beállítható az is, hogy a teljes ionos folyadék lista megjelenjen egy listán, melyekből a kiválasztottakra kattintva adatlap jelenik meg (1.1.8. ábra) Az adatbázis igen jól áttekinthető, felhasználóbarát, hátránya azonban, hogy a fellelhető ionos folyadékok száma jóval kisebb, mint az IL Thermo-ban föllelhetőké, valamint számos ionos folyadék adatlapja nem teljes. A Merck adatbázis szintén számos további publikáció elérhetőségét kínálja fel, melyek segítségével a felhasználó további információhoz juthat.

1.1.8. ábra: A Merck ionos folyadék adatbázisa

22

1.2. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban

1.2.1. Az enantioszelektív hidrogénezés jelentősége, katalizátorai

Az enantioszelektív szintézisek egyik leghatékonyabb és legelterjedtebb módja az enantioszelektív hidrogénezés, melynek alkalmazásával nagy tisztasággal állíthatók elő gyógyszerek (vagy gyógyszer prekurzorok), mint például a β-laktám alapú antibiotikumokat felépítő β-aminosavak (Tang, 1999) vagy a Naproxen® (Monterio, 1997), illetve előállíthatók illatanyagok is (Scrivanti, 2006). Az enantioszelektív hidrogénezés első, gyógyszeripari jelentőségű alkalmazása az L-DOPA szívgyógyszer egyik intermedierének előállítása volt, melyet Knowles kutatócsoportja dolgozott ki 1977-ben (1.2.1. ábra) (Vineyard, 1977). OMe OAc

HOOC

NHCOMe

OMe

Rh(COD)2BF4 (R,R)-DIPAMP H2, MeOH 3 bar, 50°C S/C > 10.000 96% ee HOOC

OAc

NH2

HO

COOH

HO NHCOMe

L-DOPA

1.2.1. ábra: L-DOPA előállítása

Az enantioszelektív hidrogénezés során egy prokirális olefin enantioszelektív hidrogén-addíciója játszódik le. A prokirális olefinek olyan alkének, melyekben a szénszén kettős kötés hidrogén-addíciója (hidrogénezése) során egy királis vegyület keletkezik. Az

enantioszelektív

hidrogénezés

során

a

katalizátor

a

hidrogénezés

reakciósebességét irányítottan növeli: a termék valamelyik enantiomere a másikhoz képest nagyobb mennyiségben keletkezik. A prokirális olefinek hagyományos kémiai módszerekkel jól előállíthatók, ezek aszimmetrikus hidrogénezésével pedig optikailag többé-kevésbé tiszta terméket nyerünk. Ma már számos nagy stabilitású és szelektivitású hidrogénező katalizátor áll rendelkezésre, melyekből kiválasztható, melyik a legalkalmasabb egy adott feladatra. Az aszimmetrikus hidrogénezés katalizátorai királis átmenetifém (többnyire Rh-, vagy Ru-)-komplexek, melyekben a királis ligandum legtöbbször egy vagy több aszimmetrikus foszfin (mono vagy difoszfin), ritkábban szulfin. A történeti szempontból legfontosabb hidrogénező katalizátorokat az 1.2.2. ábrán, a jelenleg alkalmazottakat az 1.2.3. ábrán mutatom be. 23

H

* P

Ph

Pr

Me

H3 C

O

H3 C

O

(S)-(+)-MPPP (Horner)

OMe

*

*

*

*H

A

B

H3 C CH3 H H * * P P

P

C

D (R,R)-DIPAMP (Knowles)

R1

CH2PPh2

(R,R)-(-)-DIOP (Kagan)

OMe P

CH2PPh2

* P R2

R3

P R2 * R1 R2 P *

P

P * R *

P

(S,S)-CHIRAPHOS (Bosnich)

1.2.2. ábra: Az enantioszelektív hidrogénezés legjelentősebb korai foszfinligandumai és az aszimmetrikus (di)foszfinok fő csoportjai (a vegyületek elnevezése a „Definíciók és Rövidítések” c. fejezetben található)

P

PPh 2

P

PPh2

(R,R) Et-DUPHOS

(R,R) BINAP

1.2.3. ábra: Az enantioszelektív hidrogénezés korszerű foszfinligandumai (a vegyületek pontos elnevezése a Definíciók és Rövidítések c. fejezetben található)

Mint az 1.2.2. ábrán is látható, a foszfin ligandumoknak sokféle változata létezik, a rendszerezés megkönnyítésére ezeket négy csoportba sorolják (1.2.2. ábra, jobb oldal). Az „A” csoportba tartoznak azok a királis foszfinok, melyekben a kiralitáscentrum maga a foszforatom. Ilyenek a legkorábban felfedezett foszfin ligandumok, melyeket sikeresen alkalmaztak enantioszelektív hidrogénezésre, mint például a Horner által kifejlesztett (S)-(+)-metil-fenil-propil-foszfin (MPPP) (Horner, 1968), ami csak szerény (15%) enantioszelektivitást produkált, mégis nagy áttörést jelentett, mivel ez volt az első királis foszfin ligandum. A „B” csoportba az olyan foszfinvegyületek tartoznak, melyekben a foszforhoz kapcsolódó valamelyik csoport királis, így az egész foszfin is az. A „C” és „D” csoportba olyan difoszfinvegyületek tartoznak, melyekben a kiralitáscentrum szintén vagy a foszforatomon (C típus) vagy a két foszfint összekötő hídon (D típus) található. Előbbiekhez a Knowles kutatócsoportja által kifejlesztett

24

(R,R)-1,2 bisz(2-metoxifenil-fenil-foszfino)etán (DIPAMP) tartozik (Vineyard, 1977), míg utóbbiakra az (R,R)-2,2 dimetil-4,5 bisz(difenil-foszfino)1,3-dioxolán (DIOP) (Kagan és Dang, 1971) vagy az (S,S)-2,3 bisz(difenil-foszfino)bután (CHIRAPHOS) (Fryzuck és Bosnich, 1977) nevezhető meg példának. A jelenleg alkalmazott foszfin ligandumok közül két család terjedt el széles körben. Az 1,2 bisz(2,5-dietil-foszfoláno)benzolt (DUPHOS) Burk kutatócsoportja fejlesztette ki (Burk, 1995), származékai Rh-komplexek elterjedt hidrogénező ligandumai (1.2.3. ábra, bal oldal). A 3,5 bisz(difenil-foszfino)1,1-binaftil (BINAP) alapvázát Noyori kutatócsoportja

állította

elő

(Takaya,

1987),

származékait

Ru-komplexekben

alkalmazzák (1.2.3. ábra, jobb oldal).

1.2.2. Az enantioszelektív hidrogénezés mechanizmusa

Az enantioszelektív hidrogénezés mechanizmusát egy példán mutatom be, ahol a hidrogénezésre kerülő prokirális olefin a Z-α-acetamido-fahéjsav (AFSAV). A hidrogénező katalizátor egy királis komplex (az ábrán a két foszfort összekötő hídhoz csillag

jelölést

tettem).

A

komplex

összegképlete

jelen

esetben

[Rh(DIPAMP)COD]BF4. Ennek központi atomja egy Rh(I) atom, amelynek egyik oldalához a „DIPAMP” királis difoszfin ligandum (1.2.2. ábra) két foszforatomja, másik oldalról pedig ciklooktadién (COD) kapcsolódik koordinative a ródium(I) atomhoz. A katalízis szempontjából lényeges az oldószer is (S’), jelen esetben a folyamat izopropanol (S’= IPA) közegben játszódik le (1.2.4. ábra). Az enantioszelektivitás szempontjából a sebességmeghatározó második lépés, azaz a hidrogén oxidatív addíciója a legfontosabb. Halpern 31P[1H]NMR segítségével vizsgálta a 2. lépésben keletkező diasztereomerek mennyiségét a reakcióelegyben, és azt tapasztalta, hogy azon diasztereomer koncentrációja, amiből a nagyobb mennyiségű enantiomer

keletkezne,

lényegesen

alacsonyabb

(„nem

kedvezményezett

diasztereomer”), mint a másiké („kedvezményezett diasztereomer”). A kinetikai vizsgálatok ugyanakkor kimutatták, hogy habár a “nem kedvezményezett” (S) diasztereomer van jelen kisebb koncentrációban ([(S)diaszt]<[(R)diaszt]), ez viszont lényegesen nagyobb reakciósebességgel is alakul át, mint a “kedvezményezett”, azaz k(S)>>k(R). Mivel az (S) diasztereomer koncentrációja lényegesen gyorsabban csökken, mint a másiké, a tömeghatás értelmében az első lépésben az egyensúlyok úgy tolódnak el, hogy több “nem kedvező” (S) diasztereomer keletkezzen, azaz (S) termék képződjön 25

nagyobb arányban. Ennek következtében alakulhat ki a termékelegyben, hogy túlnyomórészt az (S) konfigurációjú telített vegyületet tartalmazza. Az ábrán a szemléletesség kedvéért a nagyobb reakciósebességet vastagabb nyíllal, a magasabb koncentrációban jelen lévő komplexet nagyobb mérettel jelöltem. +

1. Rh

P P

S'

IPA (S') + 2 H2

*

Rh

S'

P P

*

+

P

P *

H2C

=

MeO H 2 C

P

2.

+

HN Ph

Rh

O

H3C

+

H OOC

+

C OOH

O Me P

P * P

Ph

N H C OC H 3

Ph

Rh

CH 3

O

P

C OOH

H

NH

P *

Nem kedvezm ényezett diasztereom er

Kedvezm ényezett diasztereom er [H 2 ] [H 2 ] +

C OOH P HN Ph O

H3C

Rh

+

H OOC

H *

+ S'

P H

Rh

S'

*

P P

P

*

NH

P

H

Rh

Ph

H

O

CH 3

S' S'

HN S' HOOC Ph

O Rh P

O

+

CH 3

+

CH 3

S'

S'

NH S'

P Rh

COO H

H

P

P

*

*

H

Ph

CH 2 Ph

O

CH 2 Ph O

H3C

C O OH N H H

HO O C

H

(S)

N H

CH 3

(R)

Fõterm ék

M ellékterm ék

1.2.4. ábra: Az enantioszelektivitás eredete Halpern szerint (Halpern, 1982)

Újabb kutatások kimutatták, hogy a Halpern-féle mechanizmus csak a hidrogénezési reakciók egy részére igaz, ma már több eset is ismert, melyben a reakció eltérő mechanizmus alapján játszódik le (Gridnev, 2000).

1.2.3. Ionos folyadékokban végzett enantioszelektív hidrogénezés

Az enantioszelektív hidrogénezés környezetbarátabbá tétele szempontjából is igen fontos lépés az illékony oldószerek (legalább részbeni) helyettesítése más, kevésbé

26

párolgó vagy veszélyes oldószerekkel. Az enantioszelektív hidrogénezésben az illékony szerves oldószerek kiváltásának egyik irányvonala különböző vízoldható katalizátorok kifejlesztése,

melynek

köszönhetően

vizes

oldatban

is

végre

lehet

hajtani

enantioszelektív hidrogénezést (Amrani, 1989; Ahlquist, in press). A vízoldhatóság szempontjából a legnehezebb kérdés, hogy a nagyméretű foszfin ligandumok is vízoldhatók legyenek, ennek egyik módja, ha a ligandum nagyszámú hidrofil (pl. – SO3H

vagy

–OH

csoportot)

tartalmaz.

A

víz,

mint

oldószer

a

lehető

„legkörnyezetbarátabb” és legolcsóbb, azonban a vizes közegű hidrogénezés esetében ma még jelentős hátrány a vízoldható foszfinligandumok magas ára (Zhao, 2002). Megfelelő alternatívát jelenthet az ionos folyadék közegű katalízis (Baudequin, 2003). A legelterjedtebben alkalmazott Rh-és Ru- bázisú hidrogénező katalizátorok (Rh-DIOP, Rh-DUPHOS, Ru-BINAP…) ionos jellegüknél fogva kiválóan oldódnak az ionos folyadékokban. Az ionos folyadék közegű katalízisnek egy másik fontos előnye is van. A katalízis során igen fontos követelmény a költséges katalizátor visszanyerése, ez viszont homogén rendszerben csak igen bonyolult módon valósítható meg (pl. nanoszűréssel). Ionos folyadékkal kétfázisú katalitikus rendszer hozható létre, ami lényegesen egyszerűsíti a katalizátor visszanyerését (1.2.5. ábra).

1.2.5. ábra: Kétfázisú rendszer ionos folyadék felhasználásával (IL = ionos folyadék, KSZ = koszolvens, S = szubsztrátum, T = termék, K = katalizátor, il = koszolvensbe átoldódott ionos folyadék, k = koszolvensbe átoldódott katalizátor, t = ionos folyadékba átoldódott termék, ksz = ionos folyadékba átoldódott koszolvens) (Wolfson, 2005/b)

A kétfázisú rendszer lényege, hogy a rendszerben az ionos folyadék (IL) mellett egy másik (az ionos folyadékkal nem elegyedő) oldószer, koszolvens (KSZ) is jelen van.

27

Míg az ionos folyadék jó oldószere a szintén ionos jellegű katalizátorkomplexnek (K), addig a koszolvens a szubsztrátumot (S) oldja jól. A reakció indításakor homogenizálni kell a rendszert (keverés, rázatás). A reakció lejátszódása után a kevertetést megszüntetik, ekkor a két fázis magától szétválik. Ekkor a koszolvens az extrakciós oldószer szerepét is betölti, azaz a termék (T) a koszolvens fázisban foglal helyet, ami így dekantálással könnyen kinyerhető. Ezzel szemben a katalizátor az IL fázisban marad, ami a teljes ionos folyadék fázissal együtt újabb reakcióciklusban ismét felhasználhatóvá válik. A reális rendszerekben természetesen az ionos folyadék tartalmaz(hat) valamennyi terméket (t) illetve átoldódott ko-szolvenst (ksz), a koszolvens dekantálásával pedig az ionos folyadék egy része (il), valamint a katalizátor egy része (k) is elveszik („katalizátor átoldódás; catalyst leaching”). Az optimális koszolvens csak nagyon kis mértékben oldja az ionos folyadékot (il), és nagyon jól a terméket (T). Az egyik legáltalánosabban alkalmazott koszolvens az izopropanol. (Wolfson, 2005/b). Az ionos folyadék közegben végzett aszimmetrikus hidrogénezés szakterületén eddig megjelent irodalomból a legjelentősebbeket összefoglalóan az 1.2.1. táblázat mutatja be. A legelső ionos folyadékban végzett aszimmetrikus hidrogénezést 1995-ben közölte Chauvin (Chauvin, 1995). Ennek során α-acetamido-fahéjsavat hidrogéneztek [bmim]SbF6/IPA (3:8) összetételű kétfázisú rendszerben [Rh-(COD)(-)DIOP]PF6 katalizátorral. Az aszimmetrikus hidrogénezés során 64% ee (S)1 enantioszelektivitást tapasztaltak. A kétfázisú rendszer lehetővé tette a termékek és a katalizátor egyszerű és kvantitatív szétválasztását és így a katalizátor (és az ionos folyadék) visszanyerését. 1997-ben Monterio és munkatársai a 2-fenil-akrilsav aszimmetrikus hidrogénezését vizsgálták különböző konfigurációjú Ru-BINAP komplexekkel (Monterio, 1997). A hidrogénezési reakciót 25-100 bar (2,5 × 106 – 107 Pa) hidrogénnyomás mellett, szobahőmérsékleten hajtották végre, az S/C arány2 20 és 80 között változott. A kísérleteket tiszta alkoholokban (metanol, IPA) valamint [bmim]BF4/IPA kétfázisú rendszerben is elvégezve azt tapasztalták, hogy a 20 óra reakcióidő alatt a konverzió minden esetben elérte a 99-100%-ot, az enantioszelektivitás azonban az ionos folyadékot is tartalmazó kétfázisú rendszerekben magasabb volt, mint tiszta alkoholokban. Az ionos folyadék fázist –a benne oldott katalizátorral együtt– további 3 cikluson keresztül újra 1 2

ee = „enantiomeric excess” (enantiomerfelesleg). Részletesen a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben S/C arány = szubsztrátum/katalizátor mólarány

28

2

1

a/1)[bmim]PF6/IPA (1:3), RT, 5-100 bar,

a) Rh-komplex

b) Ru-BINAP

a) Z-α-acetamido-fahéjsav

eszh.,

b) [bmim]BF4/IPA(3:5), 20-50 bar [bmim]PF6/víz (3:2), RT, 5 bar, termék kinyerése

Ru-BINAP

Ru-BINAP

Ru-BINAP

metilén-butanoát rezolválás

2-acetamido-akrilsav eszh.

Aromás ketonok eszh.

Etil-acetoacetát eszh.

c) 100

c) víz,

c) 95 (R)

b) 0,

a) 86 (R),

függően)

rátumtól

(S) (szubszt-

89,3-98,5

85 (S)

b) 98 (R)

a/2) 93 (R),

a/1) 90 (R),

b) 80 (S)

a) 86 (S),

64 (S)

ee (%)

29

eá. = előállítás, eszh.= enantioszelektív hidrogénezése Az ionos folyadékok rövidítése és az egyéb rövidítések valamint a definíciók a „Rövidítések és definíciók” fejezetben találhatók

S/C = 1000, 50 °C, 40 bar.

b) 80,

b) foszfónium iont tartalmazó IL-k (l. szöveg),

[bmmim]BF4)

[bmmim]BF4, S/C =1000-10.000

a) 100,

([pmmim]Tf2N,

IL: [bmim]BF4, [bmim]PF6, [pmmim]Tf2N,

a) [bmim]BF4/PF6/Tf2N, [bpy]Tf2N,

>99

99

b) n.a.

a/2) 73,

a/1) 41,

IL/IPA (1:1)

scCO2-dal

S/C=100, RT, 24 h,

b) (±)-metil-3-hidroxi-2-

a/2)[bmim]BF4/IPA (1:3), RT, 50 bar,

b) [bmim]BF4/IPA, 75 bar, RT

b) 100

[bmim]BF4/MeOH,

eá.

b )Ru-BINAP

b) Naproxen® ((S)-2-(6-

a) 100,

n.a.

Konv. (%)

a) [bmim]BF4/IPA S/C=20-80, 25-100 bar,

a) Ru-BINAP,

a) 2-fenil-akrilsav eszh.,

[bmim]SbF6/IPA (3:8)

Reakcióközeg, reakciókörülmények2

metoxi-2-naftil)propánsav)

Rh-DIOP

Katalizátor

α-acetamido-fahéjsav eszh.

Reakció1

1.2.1. táblázat: Az ionos folyadék közegű aszimmetrikus hidrogénezés területén 2006-ig megjelent irodalmak

c) n.a.

b) n.a.,

a) 1×,

min.1×

5×

b) n.a.

a) 4×,

b) n.a.

a) 3×,

min.1×

Új ciklusok

Berthod, 2004

Ngo, 2004

Jessop, 2003

Berger, 2001

1997.

Monterio,

Chauvin, 1995

Irodalom

2

1

S/C=100, 25°C, 1bar

100

n.a.

a/5) 68, b/5) 26,

b) 88 (R)

a) 94 (R),

b/5) 93/100, b/6) 95/93,

98, b/4) 97/83,

a/2) –a/5) l. előző sor, a/6)

a/1), b/1)-b/3) 0,

a) ee(S), b) ee(R) /regiosz.

a/5) 96, b/5) 90

a/4) 95, b/4) n.a.,

a/3) 96, b/3) 100,

30

eszh.= enantioszelektív hidrogénezése h. = hidrogénezése Az ionos folyadékok rövidítése és az egyéb rövidítések valamint a definíciók a „Rövidítések és definíciók” fejezetben találhatók

transz (b) eszh.

butanoát cisz (a) és

[bmim]SbF6/IPA (1:2)

Etil-3-acetamido-

Rh-BDPMI

20°C 5 bar, S/C=500

acetoacetát eszh.

1) [bmim]BF4, [bmim]PF6,

5) [bmim]PF6/víz, 6) [bmim]PF6/etanol,

Rh-DUPHOS

a) Metil-2-

20°C 5 bar, S/C=500

5) [bmim]PF6/víz ,

b) Metil-

komplex

on h.

a/4) 31, b/4) n.a.,

4) [bmim]PF6/IPA,

3) [bmim]PF6/dietil-éter, 4) [bmim]PF6/IPA,

Wilkinson

b) 2-ciklohexén-1-

a/2) 0, b/2 100,

a/3) 12, b/3) 4,

3) [bmim]PF6/dietil-éter,

eszh.,

b) Rh-

esz.h.,

a/1) 0, b/1) n.a.,

a/2) 0, b/2) 7,

2) [bmim]PF6/hexán,

2) [bmim]PF6/hexán

DUPHOS,

acetamido-akrilát

[bmim]ToS)

b) 2×

a) 3×,

esetben 1×

más

minden

nincs,

b/6):

1×

oS)

([bmim]T

9×

ciklusok

szelektivitás (%) 80,6 (R) (propiofenon,

Új

ee (%), regio-

a) ee(S), b) regiosz.

100 (ToS anion esetén)

Konv. (%)

a/1) 0, b/1) n.a.,

1) [bmim]PF6,

acetamido-akrilát

a)Rh-

S/C=112, 50 °C, 50 bar

KOH

a) Metil-2-

[domim]ToS, [bmim]BF4, [bmim]PF6

DPENDS–

eszh.

[emim]ToS, [bmim]ToS, [omim]ToS,

Ru-TPPTS-

Aromás ketonok

Reakcióközeg, reakciókörülmények2

Katalizátor

Reakció1

1.2.1. táblázat (folyt.): Az ionos folyadék közegű aszimmetrikus hidrogénezés területén 2006-ig megjelent irodalmak

Zhang, 2005

2005/b

Wolfson,

2005/a

Wolfson,

Xiong, 2005

Irodalom

felhasználták, melynek során a konverzió és az enantioszelektivitás csak kis mértékben csökkent. Mindezek mellett a kutatócsoport a [bmim]BF4/IPA rendszerben, Ru-(S)BINAP katalizátorral történő aszimmetrikus hidrogénezéssel 80%-os optikai tisztaságú Naproxen® -t (2-(6-metoxi-2-naftil)propánsav) szintetizált. Berger és munkatársai 2001-ben szintén az α-acetamido-fahéjsav hidrogénezéséről számoltak

be

(Berger,

2001).

Kísérleteiket

IL/IPA

(1:3)

rendszerben,

szobahőmérsékleten, 5-100 bar (5×105-107 Pa) hidrogén nyomás mellett végezték. A [bmim]SbF6 ionos folyadék felhasználásával elért 64%-os enantioszelektivitásához (Chauvin, 1995) képest már jobb, 66-90% ee(R) –t tapasztaltak [bmim]PF6-ban, és még magasabb, 93% ee(R)-t sikerült elérniük [bmim]BF4 ionos folyadék felhasználásával (Berger, 2001). Az elért konverzió azonban viszonylag alacsony volt: [bmim]PF6 esetén S/C=100 mellett és 24 óra reakcióidő alatt 7-41% konverziót produkált a rendszerük (a hidrogénnyomás függvényében), míg [bmim]BF4 felhasználásával 73%-os konverziót értek el. Ugyanakkor az IL fázist négy új ciklusban sikerült recirkulálni, mely során az enantioszelektivitás nem változott, a konverzió azonban 73%-ról 35%-ra csökkent. Ugyanebben a publikációban Berger és munkatársai beszámolnak a racém metil-3hidroxi-2-metilén-butanoát

kinetikus

rezolválásáról

is

(Ru-BINAP

komplex

katalizátorral, 1.2.6. ábra), melynek során 98%-os enantioszelektivitást tapasztaltak [bmim]BF4/IPA (3:5 cm3) rendszerben, ami alig maradt el a homogén metanolban tapasztalt értéktől. OH

O

OH

[R u(BIN A P )]/H 2

OMe

OH

O OMe

IL/k oszolvens

+

O OMe

1.2.6. ábra: A (±)-metil-3-hidroxi-2-metilén-butanoát kinetikus rezolválása (Berger, 2001)

A katalizátor újrahasznosítás területén Jessop kutatócsoportja ért el kimagasló eredményt: az ionos folyadékban „immobilizált” katalizátor öt cikluson keresztül újrahasznosítható volt, melynek során az enantioszelektivitás (ee(S)) nemhogy nem csökkent, hanem –meglepő módon– még emelkedett is 85%-ról 91%-ra (Jessop, 2003). A közölt cikkben külön kuriózum, hogy az ionos folyadékot igen környezetbarát koszolvenssel, nevezetesen vízzel együtt alkalmazták, a terméket pedig –szintén környezetkímélő módon– szuperkritikus CO2-dal extrahálták ki a reakció lejátszódása után. 31

Az aszimmetrikus hidrogénezés egy kiemelten fontos területe az aromás ketonok (pl. acetofenon) hidrogénezése (Ngo, 2004, Xiong, 2005). Ngo és munkatársai IL/IPA (1:1) elegyekben Ru(BINAP)(DPEN)Cl2 katalizátorral különböző aromás ketonok hidrogénezését végezték többféle ionos folyadék felhasználásával (1.2.7. ábra). A S/C arány a korábbi publikációkhoz képest magas volt: 103 és 104 között változott.

O Ar

OH

Ru(BINAP)(DPEN)Cl2

R

Ar

KOtBu, IL

R

1.2.7. ábra: Aromás ketonok aszimmetrikus hidrogénezése (Ngo, 2004)

Ngo kutatócsoportja korábban erre a célra nem alkalmazott három alkil-szubsztituenst tartalmazó imidazolium alapú ionos folyadékokat is vizsgált (1.2.8. ábra). Az elért konverzió, illetve enantioszelektivitás-értékek az ionos folyadék típusától erősen függtek. Míg a már hagyományosnak tekinthető [bmim]BF4 és [bmim]PF6 ionos folyadékokkal nem minden arilcsoport esetén értek el jó termékhozamot (például Ar = Ph, R = ciklopropil esetében 10-20% volt a konverzió), addig a trialkil-szubsztituált ionos folyadékokkal minden keton esetén >99% hozamot tapasztaltak. A legjobb enantioszelektivitást [pmmim]Tf2N-ben tapasztalták, ahol (ee(S)) 89,3-98,5% körül változott, szubsztrátumtól függően (Ngo, 2004).

N + N

N + N

1-propil-2,3-dim etil im idazolium [pm m im ]

1-butil-2,3-dim etil im idazolium [bm m im ]

1.2.8. ábra: A Ngo által alkalmazott trialkil-imidazolium kationok (Ngo, 2004)

A [bmim]BF4 és [bmim]PF6 ionos folyadékokban tapasztalt gyengébb, a [pmmim]Tf2N és a [bmmim]BF4-ban viszont stabilan magas hozamot Ngo kutatócsoportja azzal magyarázta, hogy az erősen bázikus BF4 és PF6 ionok deprotonálják az imidazoliumgyűrű 2-es helyzetű szénatomját (itt ui. lazán kötött hidrogén található), melynek következtében ún. Arduango-féle karbokation keletkezik, ami katalizátorméreg. [pmmim]Tf2N esetén nincs savas proton és bázikus anion, így nem keletkezik Arduango-karbokation és magasabb a katalitikus aktivitás (magasabb az időegység alatt tapasztalt konverzió), míg [bmmim]BF4 esetén van ugyan bázikus

32

anion, de nincs lazán kötött proton az imidazoliumgyűrűn, így ebben az esetben is magasabb a hozam. Szintén

aromás

ketonok

ionos

folyadékokban

végzett

enantioszelektív

hidrogénezését vizsgálta egy kínai kutatócsoport (Xiong, 2005), azonban az általuk publikált enantioszelektivitás-értékek alulmaradtak a Ngo kutatócsoportja által publikált eredményekkel szemben. A legmagasabb enantioszelektivitást [bmim]ToS-ban, 50 °Con tapasztalták a propiofenon hidrogénezésekor (80,6% ee(R)). Egyedülálló viszont, hogy a katalizátort a termék extrakciója után összesen kilenc egymást követő ciklusban recirkulálták, ami az irodalomban általam föllelt legmagasabb érték. Gyógyszergyártási szempontból igen nagy jelentősége van a β-aminosavak előállításának, mivel ezek a β-peptid és β-laktám alapú antibiotikumok alapegységei. Az optikailag

tiszta

β-aminosavak

nagy

mennyiségben

történő

szintézisének

a

legegyszerűbb és ígéretes módja az előállítandó β-aminosav telítetlen prekurzorának, azaz a megfelelő prokirális olefinnek az enantioszelektív hidrogénezése. Zhang kutatócsoportja a 3-acetamido-buténsav-etilészter cisz és transz módosulatának enantioszelektív hidrogénezését is vizsgálta különböző szerves oldószer (diklór-metán, metanol, IPA) és IL/IPA reakcióközegekben (1.2.9. ábra) O NH

O Rh-(S,S)-Me-bdpmi

O

+ H2 OEt

[bmim]SbF 6/IPA 1 bar

NH

O OEt

1.2.9. ábra: A 3-acetamido-buténsav-etilészter aszimmetrikus hidrogénezése ionos folyadék/IPA kétfázisú rendszerben (Zhang, 2005)

A reakciót viszonylag enyhe körülmények között végezték; a hidrogén nyomása atmoszférikus, a hőmérséklet pedig 25 °C volt. Az S/C arányt 100-ra állították be. A szerves oldószerek közül a polárosabb alkoholokban a cisz módosulat, míg a kevésbé poláros diklór-metánban a transz módosulat alakult át nagyobb reakciósebességgel. A kétféle módosulat hidrogénezésének a sebessége izopropanol közegben illetve a [bmim]SbF6/IPA rendszerben tért el legkevésbé egymástól, itt 30 perc reakcióidő alatt mindkét módosulat esetén teljes konverziót figyeltek meg. A cisz módosulat hidrogénezésének enantioszelektivitása izopropanolban volt a legmagasabb (ee(S) = 96%), ehhez képest alig maradt el a kétfázisú rendszerben tapasztalt 94%. A transz módosulat hidrogénezése során a legmagasabb enantioszelektivitást (95%-os ee(S)) 33

diklór-metánban tapasztalták, ehhez képest viszont kissé alacsonyabb, 88%-os értéket mértek az ionos folyadékos kétfázisú rendszerben. Az ionos folyadék fázist transz módosulat hidrogénezése esetén két, cisz szubsztrátum esetén három újabb ciklusban használták fel, melynek során a konverzió csökkent, az enantioszelektivitás csak kis mértékben változott. A β-ketoészterek ionos folyadék közegben végzett szelektív hidrogénezését többen is vizsgálták (Berthod, 2004, Wolfson, 2005). Berthod és munkatársai etil-acetoacetátot hidrogéneztek (1.2.10. ábra).

O

O

Ru-BINAP

OEt

+ H2

OH

IL 40 bar, 50 °C, 15 h

O

OEt

1.2.10. ábra: Etil-acetoacetát regio- és enantioszelektív hidrogénezése módosított RuBINAP katalizátorral ionos folyadék reakcióközegben (Berthod, 2004)

A kísérleteket S/C = 1000 szubsztrátum/katalizátor mólarány mellett, 50 °C-on 40 bar (4×106 Pa) hidrogénnyomás mellett hajtották végre. A reakciót tiszta ionos folyadékokban (koszolvens nélkül) játszatták le, azonban –mivel a folyékony halmazállapotú keto-észter nem elegyedik ionos folyadékkal– indításkor a reakcióelegy kétfázisú volt, így intenzív keverésre volt szükség. A reakció lejátszódása után a rendszer homogén lett, amiből n-pentánnal extrahálták ki a termékeket. A reakciót többféle ionos folyadékban és vízben (a katalizátor vízoldhatóságának köszönhetően) is végrehajtották. Imidazolium ill. piridinium kationt tartalmazó ionos folyadékokban teljes konverzió mellett 75-86%-os ee(R) enantioszelektivitást tapasztaltak, míg foszfónium kationt tartalmazó ionos folyadékokban a konverzió alacsonyabb volt (3080%), és a termékelegyben a két enantiomer gyakorlatilag egyforma arányban volt jelen (ee ≈ 0%). A víz reakcióközeg kitűnőnek bizonyult (100% konverzió, 95% ee(R)). Az IL/víz kombináció már lényegesen gyengébb eredményre vezetett (ee(R) = 13%). Így ebben az esetben egyszerű vizes közegben (a víz a „legzöldebb oldószer”) jobb eredményt is kaptak, mit ionos folyadékok alkalmazásával. Más esetekben viszont az IL/víz rendszer bizonyult jobbnak a tiszta ionos folyadékoknál, illetve ionos folyadék/szerves oldószer rendszereknél. Wolfson és munkatársai 2005-ben több publikációt is megjelentettek a homogén és a kétfázisú (enantio)szelektív hidrogénezéssel kapcsolatban, melyekben többek között a 2acetamido-akrilsav (Wolfson, 2005/a, Wolfson, 2005/b) enantioszelektív, a metil34

acetoacetát enantio- és sztereoszelektív (Wolfson, 2005/b), valamint a 2-ciklohexén-1on sztereoszelektív hidrogénezéséről (Wolfson, 2005/a) számoltak be. A 2-acetamido-akrilsav hidrogénezését S/C=500 mellett 20°C-on, 5 bar hidrogén nyomás alatt hajtották végre. A szerves oldószerek közül metanolban ment végbe legnagyobb sebességgel a reakció. Meglepő módon, [bmim]PF6-ban koszolvens nélkül nem ment végbe a hidrogénezés. A kétfázisú rendszerek közül az [bmim]PF6/hexán rendszeren kívül minden esetben tapasztaltak reakciót: a [bmim]PF6/dietil-éter és a [bmim]PF6/IPA rendszerekben a konverzió rendre 12%, illetve 31% volt 95-96% ee (S) mellett, a reakciósebesség pedig 1 nagyságrenddel kisebb volt, mint metanolban. [bmim]PF6/víz rendszerben már lényegesen jobb, 68%-os konverziót tapasztaltak (ez még a metanolban elért 54%-nál is magasabb), a reakciósebesség pedig kb. harmadannyi volt, mint metanolban (Wolfson, 2005/b). Minden esetben az IL fázist új ciklusban felhasználták: változatlan reakciósebesség, ill. csak enyhe (3-4%) aktivitáscsökkenés és hasonló ee (S) mellett. Az elért eredmények alapján látható, hogy a kétfázisú rendszerek közül a [bmim]PF6/víz összeállítás több esetben nemcsak környezetkímélő, hanem egyúttal a legmegfelelőbb oldószer-kombináció. A magas reakciósebességet azzal magyarázták, hogy a kétfázisú rendszerekben a víz és az ionos folyadék alkotja a legfinomabb diszperz rendszert, tehát itt a legjobb az anyagátadás (Wolfson, 2005/a). Wolfson kutatócsoportja más reakciók esetében is lényegesen

magasabb

reakciósebességet tapasztalt [bmim]PF6/víz rendszerben. A 2-ciklohexén-1-on szelektív hidrogénezését

Wilkinson-katalizátorral

végezte

(1.2.11.

ábra).

A

reakció

[bmim]PF6/éter, illetve [bmim]PF6/hexán rendszerekben nagy szelektivitással (100%), de csak kis reakciósebességgel ment végbe, míg a víz koszolvens esetén a reakciósebesség jelentősen nőtt, igaz a szelektivitás 90%-ra csökkent (Wolfson, 2005/a).

O

O Rh(PPh3)3Cl

+ H2

IL/koszolvens

1.2.11. ábra: A 2-ciklohexén-1-on hidrogénezése (Wolfson, 2005/a)

Wolfson és munkatársai a metil-acetoacetát hidrogénezése során sem figyeltek meg reakciót tiszta ionos folyadékban (Wolfson, 2005/b). Kis szénatomszámú alkoholokban 35

a reakció 99%-os enantio-, valamint 85-93%-os regioszelektivitás mellett ment végbe, a legnagyobb reakciósebességet metanolban tapasztalták. [bmim]PF6/IPA rendszerben a szelektivitás hasonló, a reakciósebesség pedig kb. ötödakkora volt, mint metanol reakcióközegben. [bmim]PF6/víz rendszerben a regioszelektivitás elérte a 100%-ot, azonban a reakciósebesség igen alacsony volt. Ugyanebben a publikációban egy másik érdekes rendszert is bemutatnak. Az etanol és a [bmim]PF6 parciálisan elegyedő folyadékok, az elegyedés mértéke azonban jelentősen függ a hőmérséklettől. Míg 60 °C-on a [bmim]PF6 35 tömeg% etanolt képes „oldani”, addig 20 °C-on csak 17%-ot. Erre alapozva [bmim]PF6 -ból és az etanolból olyan rendszer állítható össze, ami a reakció hőmérsékletén homogén, azonban hűtésre vagy etanolfelesleg hozzáadására két fázisra válik szét, melyben az etanol fázis nagy mennyiségben tartalmazza a terméket. Ezután az etanolos fázis dekantálásával a termék egy része azonnal kinyerhető, a maradék pedig további etanolos extrakciós lépésekkel oldható ki. Az ionos folyadék/etanol rendszer újabb ciklusban felhasználható, igen kis mértékű (< 2%) katalizátor átoldódás („leaching”) mellett. Ezen „reverzibilis kétfázisú” rendszerek fontos előnye, hogy egyesítik a homogén és a kétfázisú rendszer előnyeit: a reakció homogén rendszerben játszódik le (lényegesen nagyobb reakciósebesség mellett), míg a termék szeparációja során olyan körülmények hozhatók létre, melyben a rendszer kétfázisú, így mind a termék kinyerése, mind a katalizátor recirkulációja egyszerűen megoldható (Wolfson, 2005/b).

36

1.3. Enzimkatalitikus folyamatok ionos folyadékokban 1.3.1. A biokatalízis és az enzimek ipari alkalmazása

A biokatalízis ipari alkalmazása ígéretes jövő előtt áll. Ahogy egyszerűsödik a biokatalízis alkalmazása a vegyipari szintézisekben, úgy számos vegyipari vállalat egyre többet és fejlettebb technológiával alkalmazza a biokatalitikus módszereket (Bornscheuer, 1995, Schmid, 2001, Klaus, 2005). A biokatalízis során egész sejteket (mikroorganizmus tenyészeteket), vagy az ezekből kivont enzimeket alkalmaznak egy kémiai reakció gyorsítására, illetve szelektívvé tételére. Ennek alapján a biokatalízis két fő területe az egész sejtes katalízis és az enzimkatalízis. Egész sejtek alkalmazásának olyan esetekben van nagy előnye, ahol az enzimműködéshez kofaktorok szükségesek, melyeket tiszta enzimkatalízis esetén igen bonyolultan és drágán lehetne csak regenerálni, egész sejtekben viszont –a sejtműködés során– ezek a kofaktorok in vitro regenerálódnak, ami alapjában egyszerűsíti az alkalmazást (Schmid, 2001). Az enzimeket ipari méretben jelenleg elsősorban különböző hidrolitikus és izomerizációs reakciókban alkalmazzák (Schmid, 2001; Klaus, 2005). A hagyományos szerves kémiai szintézisek során számos esetben a nemkívánatos reakciót védőcsoportok felvitelével akadályozzák meg, ami bonyolítja az eljárást és növeli a melléktermék, illetve a hulladék mennyiségét. Tekintettel arra, hogy enzimes reakciók

alacsony

(enantioszelektivitás,

hőmérsékleten

alkalmazhatók

regioszelektivitás),

így

és

ugyanakkor

alkalmazásuk

szelektívek

energiatakarékos

és

hulladékszegény, azaz környezetkímélő (Bornscheuer, 1995, Schmid, 2001).

1.3.2 Enzimes reakciók ionos folyadékokban

Az 1980-as évek közepén Klibanov és Zaks korszakalkotó kísérletei alapján világossá vált, hogy az enzimek szerves oldószer reakcióközegekben is alkalmazhatók (Zaks és Klibanov, 1984), mellyel számos előnyre lehet szert tenni; pl. szerves oldószerben jobban oldódnak bizonyos szubsztrátumok, visszaszorulnak bizonyos mellékreakciók stb.. Ez alapján az enzimeket ma már számos ipari jelentőséggel bíró reakciókban is sikeresen alkalmazzák (1.3.1. táblázat).

37

1.3.1. táblázat: Az enzimek főbb alkalmazási területei az iparban 2005-ben (Buchholz, 2005) Termelés

Termék

Enzim

Gyártók

>106 t/év

Fruktóz

amiláz

több

glükoamiláz glükóz izomeráz Etanol

amiláz

több

glükoamiláz >104 t/év

Akril-amid

nitriláz

Nitto, DSM

6-amino-penicillinsav

penicillin amidáz

több

Kakaóvaj

lipáz

Fuji Oil, Unilever

>1000 t/év

Izo-maltóz

szukróz mutáz

Südzucker

Laktózmentes tej és tejsavó

β-galaktozidáz

több

7-amino-cefalo-szporánsav

amino oxidáz

több

7-amino-dezacetoxi-cefalo-

glutaril amidáz

DSM

(S)-aszparaginsav

aszpartáz

Tanabe

Aszpartám

termolizin

Toso, DSM

(S)-metoxi-izopropil-amin

lipáz

BASF

(R)-pantoténsav

aldolaktonáz

Fuji che. Ind.

(R)-fenil-glicin

hidantionáz

több

karbamoiláz

több

aminoaciláz

Degussa,

szporánsav

(S)-aminosavak

Tanabe 1000>10

Amoxicillin

penicillin amidáz

DSM

t/év

Cefalexin

penicillin amidáz

DSM

(S)-DOPA

β-tirozináz

Ajinomoto

Humán inzulin

karboxipeptidáz A

Aventis

lizil endopeptidáz

több

tripszin

BASF

1000>10

Királis alkoholok és aminok

lipáz

BASF

t/év

(R)-Mandulasav

nitriláz

BASF

38

A szigorodó környezet- és munkavédelmi követelmények következtében kialakuló „zöld kémia” hatására az illékony szerves oldószerek (VOC-k) visszaszorítása egyre fontosabb feladattá vált. Emiatt a kutatók oldószermentes („solvent-free” vagy „solventless”) rendszerekben is vizsgálni kezdték az enzimes reakciókat, elsősorban glicerin és más alkoholok nagyméretű acilcsoporttal (pl. olajsavval történő észterezés, foszfatidok előállítása stb.) történő észterezése során (Ming, 1998; Virto, 1999; BélafiBakó, 2003; Dörmő, 2004). Az „oldószermentes” rendszerek alkalmazása során nem alkalmaznak külön hozzáadott szolvenst, hanem valamelyik folyékony halmazállapotú szubsztrátum tölti be az „oldószer” szerepét. Ennek értelmében –„the best solvent is no solvent”– az oldószermentes szintézis látszólag a legjobb megoldást jelentheti a szennyezés

megelőzésére,

azonban

alkalmazása

számos

területen

–így

a

biotechnológiában is– nehézségekbe ütközik. Az oldószermentes rendszerek túlságosan „tömények” az enzimek számára, így az esetleges szubsztrát- és termékinhibíciós jelenségek itt fokozottan jelentkeznek, ami az enzimaktivitás csökkenésében nyilvánul meg, így a reakciósebesség ezekben a rendszerekben alacsony (Bélafi-Bakó, 2003). Ez a tény arra ösztönözte a kutatókat, hogy az enzimeket más, környezetkímélőbb reakcióközegekben, például szuperkritikus fluidumokban, ionos folyadékokban, illetve ezek kombinációjában is vizsgálják (Russell, 1994; Garcia, 2004). Már az 1980-as évek derekán megjelent egy publikáció, mely beszámol arról, hogy egy E.coli-ból származó alkálikus foszfatáz aktivitást mutatott az [C2H5NH3]NO3 ionos folyadék és víz elegyében (Magunson, 1984). Az enzimaktivitás 1,1 M (10% v/v) IL koncentrációnál érte el az optimumát, nagyobb koncentrációnál az aktivitás fokozatosan csökkent, de 1,1 M koncentrációra visszahígítva a rendszert, visszaállt az eredeti értékére. 80% IL tartalomnál azonban az aktivitás irreverzibilisen megszűnt, ami hasonló a denaturáló sók és szerves oldószerek esetén várható hatáshoz. Az első ionos folyadékban végzett biokatalitikus transzformációt 2000-ben Erbeldinger és munkatársai hajtották végre (Erbeldinger, 2000). Ők Z-aszpartámot állítottak elő, amit egy igen stabil szerkezetű enzim, a termolizin katalizált. Reakcióközegként [bmim]PF6-ot alkalmaztak 5 vol % víztartalom mellett (1.3.1. ábra). A kísérletek során kapott hozam a szerves oldószerben tapasztaltakhoz hasonló, kb. 95% volt. Annak bizonyítására, hogy az ionos folyadékok ténylegesen alkalmazható alternatív oldószerek, az ionos folyadékot több, egymást követő reakcióciklusban is újrahasznosították. Ezt úgy végezték, hogy a reakcióelegyből vízzel extrahálták az el nem reagált anyagokat, majd az ionos folyadékban visszamaradó vizet a vizes fázis 39

dekantálása után vákuumbepárlással eltávolították, ami a termék kicsapódásához vezetett. A termék kristályainak leszűrése után az ionos folyadék már csak nyomokban tartalmazott szubsztrát-maradványokat valamint terméket. Az így visszanyert ionos folyadékot újabb reakcióciklusban felhasználták, melynek során kiderült, hogy az ionos folyadék újbóli felhasználása nincs hatással a konverzióra.

O

H N

O

OH

O

+

O O

[bmim]PF 6

O

COOH

H N

Termolizin

OMe

H2N

O N H COOH

OMe

+

H 2O

O

1.3.1. ábra: Az első vizsgált enzimes reakció ionos folyadék ([bmim]PF6) reakcióközegben: a Z-aszpartám enzimes előállítása (Erbeldinger, 2000)

Nem sokkal később bebizonyosodott, hogy számos más enzim is mutat katalitikus aktivitást ionos folyadékokban, illetve víz-ionos folyadék kétfázisú rendszerekben. Különösen a lipázok mutatnak jó aktivitást, enantio- ill. regioszelektivitásuk, stabilitásuk számos esetben ionos folyadék közegekben jobb, mint szerves oldószerekben (Rantwijk, 2003; Ulbert, 2004). Érdekes, hogy míg a mikrobiális eredetű lipázok (pl. Candida antarctica, Pseudomonas cepacita) aktívnak bizonyultak számos ionos folyadékban, ugyanakkor a sertés hasnyálmirigyéből nyert enzim inaktív maradt (Schöfer, 2001) 2000-ben Sheldon és munkatársai az oktánsav lipázos ammonolízise során azt tapasztalták, hogy a reakció lényegesen (kb. négyszer) gyorsabban játszódik le [bmim]BF4 ionos folyadékban, mint szerves oldószerben (1.3.2. ábra). A Candida antarctica lipázzal katalizált reakciót korábban ammónium-karbamáttal, metil-izobutil keton reakcióközegben végezték extrém hosszú, 17 napos reakcióidő mellett (Litjens, 1999). Ionos folyadékban, ammóniával végezve a reakciót az ammonolízis már 4 nap alatt 90-100%-os konverzióval lejátszódott (Lau, 2000).

40

OH

CaLB + NH3

O

NH2

[bmim]BF4

+ H2O

O

4 nap

1.3.2. ábra: Oktánsav ammonolízise Candida antarctica lipáz jelenlétében (Lau, 2000)

Ugyanebben a publikációban Sheldon kutatócsoportja egy ionos folyadékban végzett enzimes epoxidációról is beszámol. A szerves kémiai szintézisek elterjedten alkalmazott oxidálószerei a perkarbonsavak. Az egyre szigorodó biztonságtechnikai követelmények miatt ezen anyagok alkalmazása mára erősen visszaszorult. A robbanásveszélyes anyag veszélyessége azonban jelentősen csökkenthető azáltal, hogy a reakcióelegybe nem közvetlenül adagolják, hanem in situ állítják elő.

Sheldon és

munkatársai a ciklohexén peroktánsavval végzett epoxidációja során a peroktánsavat hidrogén-peroxidból állították elő enzimmel (CaLB) in situ (1.3.3. ábra). A reakciót [bmim]BF4-ben végezték, 83%-os ciklohexén-oxid hozamot tapasztaltak, ami csak kissé maradt el az acetonitrilben mért hozamtól (Lau, 2000). [b m im ]B F 4 O

O

O R

R

OH

OOH

H 2O

8 3% h o zam

C an d id a a n ta rctic a (N ovo zym e 4 3 5 )

H 2O 2

1.3.3. ábra: Ciklohexén epoxidációja in situ előállított perkarbonsavval (Lau, 2000)

Számos publikációban számolnak be ionos folyadékokban végzett enzimes átészterezési (alkoholitikus) reakciókról. Lozano és munkatársai többféle reakciót is vizsgáltak ionos folyadékokban: vinil-butirátot észtereztek át butanollal (Candida antarctica lipázzal), valamint N-acetil-(L)-tirozin-etil-észtert észtereztek át propanollal α-Chymotrypsin enzim jelenlétében (1.3.4. ábra) (Lozano, 2003). A vinil-butirát átészterezését oldószermentes rendszerben (1-butanol), szerves oldószerben (n-hexán) valamint négyféle ionos folyadékban ([emim]BF4, [emim]Tf2N, [emim]PF6 és [bmim]Tf2N) is elvégezték. A reakciósebességeket összehasonlítva azt tapasztalták, hogy az enzimaktivitás az ionos folyadékokban kb. 50-100%-kal magasabb volt, mint oldószermentes rendszerben, és 200-300%-kal volt magasabb a hexánban mért értéknél. 41

Az

N-acetil-(L)-tirozin-etilészter

átészterezését

oldószermentes

(n-propanol)

rendszerben, és ionos folyadékokban vizsgálták A legjobb reakciósebességet npropanolban tapasztalták, ennél kb. 40%-kal alacsonyabb értéket találtak [bmim]Tf2Nben; [bmim]BF4-ben a reakciósebesség a propanolban mértnek mintegy 1/5-e volt. Az enzim stabilitása azonban mindegyik vizsgált ionos folyadékban lényegesen magasabb volt, mint n-propanolban (részletesen l. 1.3.3. fejezet) (Lozano, 2003). O

O C4H9OH

CaLB

+

O

C4H9

C4H9

O

IL

C4H9

O

+

H3CCHO

O

HN OC2H5

+ C3H7OH

HN

Chymotrypsin

OC3H7

IL

O

+ C2H5OH

O

1.3.4. ábra: Átészterezési reakciók ionos folyadékokban (Lozano, 2003)

Az enzimes reakciók egyik legfőbb előnye az enzimek királis szerkezetéből adódó enantioszelektivitás.

Az

enantioszelektivitás

nagymértékben

függ

a

reakciókörülményektől, és természetesen magától a reakcióközegtől is. Ionos folyadékokban az enzimek enantioszelektivitása jelentős mértékben megnőhet (Schöfer, 2001; Itoh, 2001; Kim, 2001). A kutatók közül legtöbben királis szekunder alkoholokat rezolváltak különböző lipázokkal, acil donorként vinil-acetátot alkalmazva (1.3.5. ábra). O OH R'

O

Lipáz R'

R"

O

OH R"

+

R'

R"

O

O

H

1.3.5. ábra: Királis szekunder alkoholok lipázzal történő enantioszelektív észterezése (dinamikus rezolválása) vinil-acetáttal (Schöfer, 2001; Itoh, 2001; Kim, 2001)

Kragl és munkatársai az 1-feniletanol (R’ = Ph, R” = Me) enantioszelektív acilezését vizsgálták többféle lipázzal. (Schöfer, 2001). A kísérleteket metil-terc-butiléterben (MTBE) és több imidazolium-bázisú ionos folyadékban is elvégezték. Candida

42

antarctica lipáz (Novozyme 435) esetén kiváló (> 98%) enantioszelektivitást tapasztaltak mind MTBE-ben, mind az ionos folyadékok egy részében. Érdekes, hogy míg [bmim]PF6-ban és [bmim]BF4-ben igen alacsony konverziót figyeltek meg, addig [bmim]CF3SO3-ban és [bmim]Tf2N-ben a konverzió elérte az 50%-ot (a dinamikus rezolválási reakciók során elérhető maximum), ami meghaladta a MTBE-ben elért 43%ot. Pseudomonas cepacia sp. lipáz alkalmazásával [bmim]CF3SO3-ban és [bmim]Tf2Nben, Alcaligens sp. lipáz esetén pedig [omim]BF4-ben tapasztaltak MTBE-ben mért értéket lényegesen meghaladó, kiváló (> 98%) enantioszelektivitást. Itoh és munkatársai egy hasonló, telítetlen szekunder alkohol dinamikus rezolválását végezték ionos folyadékokban (Itoh, 2001). Esetükben R’ = -C2H5Ph, R” = -CH=CH2, a biokatalizátor Candida antarctica lipáz (Novozyme 435) volt. Az ionos folyadékok közül a legmagasabb hozamot (49%) [bmim]PF6-ban tapasztalták. A [bmim]BF4-ben mért hozam (44%) gyakorlatilag megegyezett a di-izopropil-éterben mért értékkel. Az enantioszelektivitás az ionos folyadékokban kiváló (ee(R) > 99%) volt. Az enzimet tartalmazó ionos folyadékot további reakcióciklusokban sikeresen újra felhasználták, habár az újrahasznosítás során az enzim aktivitása kismértékben csökkent. Kim és munkatársai számos szekunder alkohol rezolválását elvégezték szerves oldószerekben (tetrahidro-furán = THF, toluol) és ionos folyadékokban (Kim, 2001). Ennek során ionos folyadék reakcióközegben lényegesen jobb enantioszelektivitást tapasztaltak minden szubsztrátum esetében (1.3.2. táblázat). Lipázokkal

nemcsak

szén,

hanem

foszfor

kiralitáscentrummal

rendelkező

vegyületek is jó enantioszelektivitással rezolválhatók. Kiełbasiński és munkatársai racém P-királis hidroximetanofoszfinátok és hidroximetilfoszfin-oxidok kinetikus rezolválását vizsgálták [bmim]BF4-ben illetve [bmim]PF6-ban (1.3.6. ábra). CH2OH

RO

OR

HOH2C

P

P

Lipáz

O

RO

CH2OH P

O

O +

(R)

R = CH3 C2H5 i-C3H7

O

(S)

O

O

H

1.3.6. ábra: P-királis vegyületek lipázos rezolválása vinil-acetáttal ionos folyadékban (Kiełbasiński, 2002)

43

A reakció mindkét ionos folyadékban lejátszódott, és a [bmim]PF6-ban tapasztalt enantioszelektivitás az összes vizsgált szubsztrátum esetben meghaladta a szerves oldószerben mért értéket (Kiełbasiński, 2002).

1.3.2. táblázat: Különböző szekunder alkoholok rezolválása ionos folyadékokban és szerves oldószerekben (Kim, 2001) R’

R”

CH3

O

CH3

Lipáz

Oldószer

E1

CaLB

THF

141

Toluol

207

[emim]BF4

648

[bmim]PF6

>967

THF

26

Toluol

187

[emim]BF4

651

[bmim]PF6

155

THF

56

Toluol

158

[emim]BF4

183

[bmim]PF6

> 450

THF

150

Toluol

85

[emim]BF4

172

[bmim]PF6

>1000

CaLB

O

PcL

CH2Cl

CH2Cl

O

PcL

Az enzimeknek nemcsak az enantio-, hanem regioszelektivitása is jelentősen növekedhet, ha a hagyományos szerves oldószer helyett ionos folyadék reakcióközeget alkalmazunk. Park és Kazlauskas a glükóz acilezése során (1.3.7. ábra) 1-metoxietil-3metilimidazolium

tetrafluoro-borát

([moemim]BF4)

ionos

folyadékban

93%-os

szelektivitást tapasztalt, míg THF-ben a szelektivitás és a reakciósebesség is igen alacsony volt (Park és Kazlauskas, 2001). A hozam mindkét oldószer esetén elérte a 99%-ot. A jobb szelektivitás oka valószínűleg az, hogy a glükóz THF-ben lényegesen kevésbé oldódik, mint a monoacilezett termék, ennél fogva ez utóbbi jelentős része 1

„E” érték definíciója a „Definíciók és rövidítések” fejezetben található

44

további acilezésen megy keresztül. A [moemim]BF4-ben viszont a glükóz is jól oldódik, ennek következtében a reakció gyorsabban és lényegesen szelektívebben játszódik le. A szerzők hasonlóan sikeresen acilezték a diszacharid maltózt is [moemim]BF4-ben (Park és Kazlauskas, 2001). CaLB 55 °C 36 h 99% konv.

OH HO

O

O

HO

OH

HO

OAc

OAc +

HO

OH

OH O

OH

O

HO HO

OAc

OH

O

O THF [moemim]BF4

1

2

53%

47%

93%

7%

1.3.7. ábra: D-glükóz szelektív acilezése ionos folyadékban (Park és Kazlauskas, 2001)

Nemcsak a cukrokhoz hasonló hidrofil, hanem erősen hidrofób anyagok, például zsírok is jól oldódnak megfelelő ionos folyadékokban. Zsírok és olajok glicerolízisével monogliceridek állíthatók elő (1.3.8. ábra, A), melyek fontos adalékanyagok az élelmiszer-, a gyógyszer- illetve a kozmetikai iparban. Már korábban leírták, hogy a hagyományos, ipari méretekben végzett glicerolízis során a szelektivitás igen alacsony (40-60% MG hozam a glicerinfeleslegtől függően, di-és triglicerid melléktermékek mellett), az erélyes reakciókörülmények (220-250 °C, alkálikus katalizátor…) miatt, így további energiaigényes tisztítási lépésre (pl. vákuumdesztilláció) van szükség (Sonntag, 1982).

Nem-konvencionális

közegben

végzett

enzimes

glicerolízis

enyhébb

körülmények mellett (40-50 °C), lényegesen magasabb szelektivitással (90%) kivitelezhető (Bornscheuer, 1995), ami többek közt a glicerin-monosztearát enzimes szintézisére is igaz (Fráter, 2005). Az enzimes reakciók során ideálisnak bizonyult oldószerek (aceton, terc-butanol) azonban erősen illékony, környezetkárosító anyagok. Elsőként Guo és Xu találtak olyan ionos folyadékot, ami alkalmas mind a zsírok/olajok, mind a glicerin és a monogliceridek egyidejű oldatban tartására (Guo és Xu, 2005). A trigliceridek ugyanis nem elegyednek a „hagyományosan” alkalmazott [bmim]PF6 [bmim]BF4 vagy [bmim]Tf2N ionos folyadékokkal, azonban egy speciális, extra hosszú oldalláncokat tartalmazó ammóniumbázisú ionos folyadékkal igen. Guo és Xu tetradecil-di-pentaetoxi-metil-ammónium metil-szulfát ([tppmN]MeSO4, 1.3.8. ábra, B) ionos folyadékban sikeresen hajtotta végre különböző olajok glicerolízisét különböző lipázokkal (Novozyme 435, Lipozyme IM). A két enzim közül a Novozyme 435-ben 45

(Candida antarctica lipáz) tapasztaltak magasabb konverziót. Az alkalmazott ionos folyadékban mind a triglicerid, mind a glicerin, mind a monoglicerid jól oldódott: a triglicerid a hosszú, apoláros oldalláncok miatt („hasonló a hasonlóban oldódik” elv szerint), míg a glicerin és a monogliceridek a glicerin szabad –OH csoportja és a polietoxilánc oxigénje között létrejövő hidrogénhíd következtében (1.3.8. ábra, C). Az ionos folyadékban végzett glicerolízis során mintegy 90% monoglicerid hozamot értek el, ami meghaladta az aceton reakcióközegben tapasztalt értékeket. Ennek a szerzők szerinti magyarázata az, hogy a monoglicerid láncvégi „szabad” –OH csoportjának hidrogénkötéssel való „lekötése” csökkenti a monoglicerid di-illetve trigliceriddé történő visszaalakulását, azaz az 1.3.8. ábra A részén látható 1. egyenletben az egyensúlyt a monoglicerid képződése felé tolja el (Guo és Xu, 2005). B

A 1. TG + 2 Gly

3 MG

2. TG + Gly

DG + MG

3. DG + Gly

2 MG

C

+ O H29C14

m

OH

N

H3C

O

n

OH

O CH3O S O O

-

OH

OCOR O H O H29C14 H3C

m

OH

N O

n

OH

1.3.8. ábra: Trigliceridek glicerolízise (A), a [tppmN]MeSO4 szerkezete (B), és a kation oxigén és monoglicerid (glicerin) közötti hidrogénhíd (C). Rövidítések: TG = triglicerid, DG = diglicerid, MG = monoglicerid, Gly = glicerin (Guo és Xu, 2005)

1.3.3. Az enzimek aktivitása és stabilitása ionos folyadékokban

Már a legelső ionos folyadék közegű enzimkatalitikus reakciók vizsgálata során azt tapasztalták, hogy bizonyos enzimek szelektivitása ionos folyadékokban jelentősen megnőhet (l. 1.3.2. fejezet), ugyanakkor az enzim dezaktiválódása számos esetben lassabban megy végbe ebben a közegben. Erbeldinger és munkatársai a termolizint [bmim]PF6-ban és etil-acetátban inkubálva azt tapasztalták, hogy az ionos folyadékban (ahol az enzim aktivitása már eredetileg is kb. 40%-kal magasabb, mint etil-acetátban)

46

az aktivitás az inkubációs idő növelésével kismértékben még nőtt is, míg etil-acetátban lassan csökkent (Erbeldinger, 2000). Presson és Bornscheuer a Bacillus stearotermophilus észteráz aktivitását vizsgálta különböző reakcióközegekben (Presson és Bornscheuer, 2003). Azt tapasztalták – hasonlóan Park és Kazlauskas tapasztalataihoz (Park és Kazlauskas, 2003)– hogy a szabad enzim ionos folyadékban nem vagy alig mutat aktivitást, azonban a hordozóra rögzített enzim magasabb enantioszelektivitást mutatott [bmim]PF6, [bmim]BF4 és [bmim]Tf2N ionos folyadékokban, mint hexánban, MTBE-ben vagy vinil-acetátban. Az enzim aktivitásának felezési ideje (az az időtartam, ami alatt az enzim aktivitása a felére csökken) [bmim]BF4-ben és [bmim]PF6-ban kb. háromszor nagyobb volt, mint MTBE közegben, és közel harmincszor annyi, mint hexánban (Presson és Bornscheuer, 2003). Lozano kutatócsoportja egy Candida antarctica lipázzal és egy α-Chymotrypsin enzimmel végzett átészterezést vizsgált oldószermentes (n-propanol) rendszerben, valamint ionos folyadékokban (l. 1.3.2. fejezet) (Lozano, 2003). Az enzim stabilitásának vizsgálata során megállapították, hogy a Candida antarctica lipáz aktivitásának felezési ideje [emim]BF4 ionos folyadékban közel háromszor akkora, mint n-butanolban (oldószermentes rendszer) vagy n-hexánban (e két utóbbi érték közel azonos). Az α-Chymotrypsin aktivitásának felezési ideje több ionos folyadékban ([moooN]Tf2N, [bmim]BF4) átlagosan 1 nagyságrenddel volt magasabb, mint propanolban. Egy későbbi tanulmányukban (2005) Lozano és munkatársai az αchymotripsint vízben, 1-propanolban és [emim]Tf2N-ben 30 °C-on inkubálták, és különböző időpontokban vizsgálták az enzim aktivitását (Lozano, 2005). Ennek során azt tapasztalták, hogy az aktivitás 1-propanolban csökken a leggyorsabban (20 perc alatt kb. 75%-kal), míg vízben közel egyenletes ütemben csökkent az aktivitás (1 óra alatt kb. 30%-kal). Az ionos folyadékban az enzim aktivitása 20 perc alatt közel 30%-ot csökkent, azonban ezután az enzim aktivitása egy közel állandó értéken stabilizálódott. Hasonló eredményeket tapasztaltak Candida antarctica lipáz B esetében is: míg a hexánban történő inkubálás során az aktivitás 120 óra alatt az eredeti értékének kb. 20%-ára csökkent (és továbbra is csökkenő tendenciát mutatott), addig [emim]Tf2N és [bmmmN]Tf2N ionos folyadékokban csak az inkubáció első 30 órájában csökkent az aktivitás (az eredeti érték 70-80%-ára), ezt követően pedig egy közel állandó értékre állt be.

47

Az eltérő polaritású szerves oldószerekhez hasonlóan különböző ionos folyadékok hidrofil, illetve hidrofób jellegüknél fogva eltérő hatást fejthetnek ki az enzimekre. Míg szerves oldószerekben elsősorban a polaritás (Gubicza, 1992), ionos folyadékokban elsősorban az anion határozza meg az enzim aktivitását (Sheldon, 2002; Garcia, 2004; Lau, 2004). Sheldon és munkatársai ugyanazon enzimes reakció többféle ionos folyadékban történő vizsgálta során azt tapasztalták, hogy a koordinációra erősebben hajlamos, nukleofil jellegű anionokat (NO3-, laktát, EtSO4-) tartalmazó ionos folyadékokban

az

enzimaktivitás

lényegesen

alacsonyabb,

mint

más

ionos

folyadékokban, illetve szerves oldószerben (Sheldon, 2002). A 2002-ben közölt publikációban azt feltételezték, hogy az aktivitáscsökkenés annak tudható be, hogy a nukleofil jellegű anionok az enzim konformációját kedvezőtlenül változtatják meg. Elméletüket 2004-ben FT-IR vizsgálatokkal igazolták (Lau, 2004). Ez utóbbi publikációban azt is kifejtik, hogy a koordinációra erősen hajlamos laktát anion hidrogénkötéseket alakít ki az enzimfehérje polipeptid-láncával, ezáltal megváltoztatja a koordinációját („protein unfolding”). Az ionos folyadékokban az enzimek hőtűrő képessége is jelentősen megnőhet (Sheldon, 2002; Ulbert, 2005), ami abból a szempontból előnyös, hogy magasabb hőmérsékleten a reakciók is gyorsabban játszódnak le, ezen kívül a reakcióelegy viszkozitása is csökken, ami tökéletesebbé teszi az átkeverést. Ulbert-tel végzett kísérleteink során a Candida rugosa lipáz aktivitását, illetve az aktivitás felezési idejét hasonlítottuk össze szerves oldószerekben illetve ionos folyadékokban, különböző hőmérsékleteken (1.3.9. ábra; Ulbert, 2005). 100

100

o

Maradék aktivitás (%)

Maradék aktivitás (%)

o

30 C

80 60 40 20

50 C

80 60 40 20 0

0 0

5

10

15

20

25

0

30

t (h)

5

10

15 t (h)

20

25

30

1.3.9. ábra: A Candida rugosa enzim aktivitáscsökkenése különböző közegekben (Ulbert, 2005, ▲dibutil-éter, ■benzol, ♦n-hexán, * [bmim]PF6 + [omim]PF6)

48

Az 1.3.9. ábrán látható, hogy alacsonyabb hőmérsékleten (30 °C), [bmim]PF6-ban és [omim]PF6-ban kb. kétszer akkora a felezési idő, mint hexánban, 50 °C-on a felezési idő ionos folyadékban már kb. egy nagyságrenddel nagyobb volt, mint a szerves oldószerekben.

1.3.4. A természetes aromák jelentősége és az etil-acetát enzimes előállítása

A kereskedelemben növekszik az illatosított illetve ízesített termékek iránti kereslet (illatosítók, gyümölcsitalok, joghurtok, fagylaltok, szeszes italok, rágógumi stb.). Amennyiben mindezeket 100%-ban valódi gyümölcsökből állítanák elő, az igen nagy termőterületet és hatalmas költségeket (termesztés, betakarítás, feldolgozás) igényelne. Emiatt terjedtek el a szintetikusan előállított aromák. A legtöbb íz és illat néhány száz egyedi komponensből tevődik össze, de ez a komplexitás csökkenthető, ha csak néhány kulcskomponenst, főképp szerves savakat, alkoholokat és különösen az észtereket vesszük figyelembe (Berger, 1995). Néhány gyümölcs illatának legfontosabb észter komponensei az 1.3.3. táblázatban láthatók. Ezen komponensek szintézise enzimes észterezéssel is lehetséges (Leblanc, 1998; Krishna, 2001). Fontos előny, hogy az Európai Unió előírásai szerint a természetes alapanyagokból (pl. növényekből előállított alkoholok, szeszipari melléktermékek, erjesztett ecetsav stb.) biotechnológiai úton előállított aromák „természetes aroma” címen forgalmazhatók.

1.3.3. táblázat: Kis szénatomszámú észterek előfordulása különböző gyümölcsökben Komponensek

Eper

Banán

Ananász

etil-acetát

+

+

+

+

+

propil-acetát butil-acetát

+

izoamil-acetát

+

etil-butanoát

+

+

butil-butanoát

+

+

+

+

Kísérleteim során az egyik vizsgált reakció egy fontos aromaészter, az etil-acetát ionos folyadék reakcióközegben történő enzimes előállítása volt. Az etil-acetát nem-

49

konvencionális közegben történő előállítását már 1986-ban vizsgálta Armstrong és Yamazaki (Armstrong és Yamazaki, 1986). Ők n-hexán reakcióközegben tapasztalták a legjobb hozamot. Gubicza és munkatársai szintén n-hexánban, illetve n-heptánban és npentánban, (Gubicza és Szakács-Schmidt, 1995/a; Gubicza, 2000; Bélafi-Bakó, 2003) később

pedig

–az

oberhauseni

(Németország)

UMSICHT

kutatóintézettel

együttműködve– oldószermentes rendszerben is vizsgálták az etil-acetát enzimes előállítást (Ehrenstein, 2003; Bélafi-Bakó, 2003). Ennek során n-pentánban 93,2% észter hozamot tapasztaltak, azonban ezzel az oldószerrel legfeljebb 36°C-on tudtak dolgozni a pentán alacsony forráspontja miatt. Heptánban és oldószermentes rendszerben meghatározták a reakció kinetikáját (Bélafi-Bakó, 2003), melyben egy módosított Michaelis-Menten kinetikát állapítottak meg:

v0 =

KM

v max S + S + S 2 / K1

(1)

A képletben v0 a kezdeti reakciósebesség, vmax a legnagyobb reakciósebesség, S a szubsztrátum koncentrációja, KM a Michaelis-Menten állandó, KI pedig az inhibíciós állandó. A kísérletek során mindezen kinetikai konstansok meghatározásra kerültek (Bélafi-Bakó, 2003). Az inhibíciót elsősorban az ecetsav okozza, így a reakciónak az alkoholfelesleg kedvez. Ugyanakkor az etanol is okoz kisebb mértékű gátlást, ami a nagyobb alkoholfelesleg, illetve az etanol fölöslegében végrehajtott oldószermentes észterezés során csökkenő tendenciát mutató kezdeti reakciósebességeken tűnik szembe (BélafiBakó, 2003). Ennek megfelelően az oldószer jelenléte az enzim stabilitása szempontjából fontos (a rendszer nem lesz túl tömény a szubsztrátumra nézve), ugyanakkor a hagyományos szerves oldószerek illékonyak és ennek következtében számos hátránnyal bírnak. Kézenfekvő tehát az etil-acetát ionos folyadékban történő enzimes előállításának tanulmányozása, amit –az irodalom áttanulmányozása alapján– korábban még nem vizsgáltak.

1.3.5. A 2-klór propionsav enzimes észterezése n-butanollal

Kísérleteim során az etil-acetát mellett a butil-2-klór-propionát enzimes előállítását is vizsgáltam ionos folyadékokban.

50

A királis alkoholok és karbonsavak dinamikus rezolválására már régóta alkalmazzák az enzimes észterezést (Marshek, 1973). Az enzimes észterezés szempontjából –mint az 1.3.1. fejezetben kifejtettem– fontos áttörést jelentett Zaks és Klibanov felfedezése, hogy az enzimek szerves oldószerben is aktivitást mutatnak (Zaks és Klibanov, 1984). Klibanov kutatócsoportja 1985-ben a 2-szubsztituált királis karbonsavak (többek közt a 2-klór-propionsav) észterezését vizsgálta (Kirchner, 1985). A kísérletek során az (R,S) 2-klór-propionsavat n-butanollal észterezték Candida cylindracea lipáz jelenlétében. A kísérleteket n-hexán oldószerben elvégezve 42%-os konverziót és ee (R) = 95%-os enantioszelektivitást tapasztaltak. Ugyanezt az észterezési reakciót –ugyancsak Candida cylindracea lipázzal– Gubicza a n-hexánon kívül más, különböző polaritású szerves oldószerekben (THF, kloroform, benzol, toluol, metil-ciklohexán, n-oktán) is vizsgálta (Gubicza, 1992/a). Ennek során azt tapasztalta, hogy az oldószer polaritásának csökkenésével

nő

a

kezdeti

reakciósebesség,

egyúttal

viszont

csökken

az

enantioszelektivitás. A jelenséget Gubicza azzal magyarázta, hogy a polárosabb oldószerek (THF, kloroform) az enzim számára nélkülözhetetlen vizet „elvonják”, melynek következtében az enzim konformációja lényegesen merevebb lesz, aktivitása lecsökken. Másrészről viszont, ez a merev szerkezet sokkal kevésbé teszi lehetővé, hogy a sztérikusan gátolt „kedvezőtlen” enantiomer az enzim aktív centrumába kapcsolódjon, így az enantioszelektivitás nő (Gubicza, 1992/a). A szerves oldószerek után a reakciót ionos folyadékokban többen is kutattuk, melynek során a reakció enantioszelektivitását Ulbert vizsgálta. [bmim]PF6-ban és [onim]PF6-ban lényegesen magasabb enantioszelektivitást tapasztaltunk, mint szerves oldószerekben (THF, toluol és hexán). Különböző 2-szubsztituált propionsavak észterezése esetén [bmim]PF6-ban hasonló vagy kissé alacsonyabb hozamot tapasztaltunk, mint n-hexán reakcióközegben, azonban az enantioszelektivitás mindegyik szubsztrátum esetén lényegesen magasabb volt az ionos folyadékban (Ulbert, 2004).

51

2. Anyagok és módszerek

2.1. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban

2.1.1. Anyagok

A felhasznált anyagokat (név, eredet, tisztaság) a 2.1.1. táblázat mutatja be.

2.1.1. táblázat: Az enantioszelektív hidrogénezés során felhasznált anyagok Anyag neve

Tisztaság

Forrás

1-butil-3-metil-imidazolium tetrafluoro-

>98 %

Solvent Innovation

borát1 [bmim]BF4

GmbH, Köln, Németo.

1-butil-3-metil-imidazolium hexafluoro-

>98 %

1

foszfát [bmim]PF6

Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.

1 butil-3-metil-piridinium tetrafluoro-borát1

>98 %

[bmpy]BF4

Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.

Izopropanol

>99 %

Spektrum 3D, Debrecen

Diklór-metán

>99,9 %

Spektrum 3D, Debrecen

Diazo-metán (Diazald®)

99 %

Sigma-Aldrich Co.

(Z)-α-acetamido-fahéjsav (AFSAV)

>99 %

Sigma-Aldrich Co.

(Z)-α-acetamido-fahéjsav-metilészter

>99 %

Saját preparátum2

[Rh(NBD)((S,S)-DiMe-BDPP)]PF6 (K1)

>99 %

Saját preparátum3

[Rh(COD)((R,R)-DiPamp))]BF4 (K2)

>99 %

Saját preparátum4

(AFME)

Kísérleteim során kétféle szubsztrátum (AFSAV, ill. AFME) hidrogénezését vizsgáltam kétféle Rh-komplex katalizátorral (K1 és K2). A szubsztrátumok és a katalizátorok szerkezetét a 2.1.1. ábra mutatja. Mindkét komplex egy Rh(I) központi atomot tartalmaz, melyhez koordinative kapcsolódik egy ciklikus dién (ciklooktadién = COD vagy norbornadién = NBD), illetve a királis difoszfin ligandum. A komplex 1

Valamennyi ionos folyadék elnevezése és képlete a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található Standard eljárás szerint készítve (King, 1979) 3 Részletesen: Herseczki, 2004 4 Vineyard, 1977 alapján 2

52

egyszeresen pozitív töltését tetrafluoro-borát (BF4¯) illetőleg hexafluoro-foszfát (PF6¯) ellenion semlegesíti. N H C OC H3

Ph H

AFSAV: R = H AFM E: R = CH3

COOR

K1 *

P

P

+

*

P

Rh

PF6

P

-

*

=

*

P

P

(S ,S )-D iM e -B D P P

[R h (N B D )((S ,S )-D iM e -B D P P )]P F 6

K2 P *

+ Rh

P

P

BF4

-

*

=

P

[R h (C O D )((R ,R )-D iP a m p ))]B F 4

P H2C MeO H2C

OMe P

(R ,R )-D iP a m p

2.1.1. ábra: A kísérletek során használt szubsztrátumok és hidrogénező katalizátorok

2.1.2. Módszerek

Bemérés és a reakció végrehajtása A Rh-komplex oxigénre való érzékenysége miatt minden műveletet inert (argon) atmoszféra alatt végeztem. Egy Schlenk-csőbe bemértem 6,1×10-6 mol Rh komplex katalizátort (K1 vagy K2), majd ezt feloldottam 3 cm3 ionos folyadékban. Egy másik Schlenk-csőbe 1,2 mmol szubsztrátumot (AFSAV vagy AFME) mértem be. 9 cm3 izopropanol hozzáadása után a kristályok feloldódásáig kevertettem a rendszert. A két homogén oldatot fecskendővel egy hidrogén gázzal előzőleg átöblített (szekurált), 50 cm3 űrtartalmú autoklávba juttattam. Ezután az autoklávot hidrogénnel adott nyomásra töltöttem, termosztáló vízfürdőbe helyeztem, és a reakcióelegyet 950 1/perc intenzitással kevertettem. A reakció lejátszódása alatt az autoklávban lévő nyomást figyelemmel kísértem. 53

Mintavétel és előkészítés A reakcióidő lejárta után a reakcióelegyet argon atmoszféra alatt egy másik Schlenk-csőbe szívattam át (inert kivétel). Az emulzió lassan (kb. fél óra alatt) vált ketté, a felső izopropanolos fázis tartalmazta a terméket, míg az alsó, ionos folyadékos fázis a katalizátort. A felső fázisból osztott pipettával kb. 0,2 cm3 mintát vettem egy kisméretű csiszolatos kémcsőbe, ehhez diazo-metánt fejlesztő vegyületet (Diazald) adtam, majd termosztáló fürdőben (kb. 40 °C) vákuum segítségével (vízsugárszivattyú, 2700 Pa, kb. 20 Hgmm) eltávolítottam a maradék diazo-metánt és az oldószert. A diazometán a szabad karboxilcsoportokat metilezte, erre a gyorsabb gázkromatográfiás elemzés (kisebb retenciós idők) miatt volt szükség. A metilezett termékeket ezután diklór-metánban feloldottam és gázkromatográfiásan elemeztem.

Analízis Az elemzést HP 4890 típusú gázkromatográffal (GC) végeztem. A kolonna Chirasil L-Val királis oszlop (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) volt. A vivőgáz nitrogén, a detektor lángionizációs (FID) típusú volt. A metilezett termékek retenciós idői: 28 perc (R) és 30 perc (S). Egy jellemző kromatogramot mutat be a 2.1.1. ábra. Az enantioszelektivitás vizsgálata során az enantiomer fölösleget (enantiomeric excess; ee) határoztam meg. Az ee számítását részletesen a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben ismertetem. A mérések statisztikai értékelését és szórását „A mérések pontossága” c. fejezetben részleteztem.

2.1.2. ábra: A hidrogénezett termékből vett minta GC kromatogramja

54

2.2. Etil-acetát előállítása szakaszos rendszerben 2.2.1. Anyagok

A felhasznált anyagokat (név, eredet, tisztaság) a 2.2.1. táblázat mutatja be.

2.2.1. táblázat: A mérések során felhasznált anyagok Anyag neve

Tisztaság

Forrás

Candida antarctica lipáz B enzim

-

Novozymes, Bagsvaerd, Dánia

1-butil-3-metil-imidazolium

>98%

Solvent Innovation GmbH, Köln,

tetrafluoro-borát1; [bmim]BF4

Németo.

1-butil-3-metil-imidazolium

>98%

hexafluoro-foszfát1; [bmim]PF6 1-butil-3-metil piridinium

Solvent Innovation GmbH, Köln, Németo.

>98%

tetrafluoro-borát1; [bmpy]BF4

Solvent Innovation GmbH, Köln, Németország

1-etil-3-metil-imidazolium toloul-

>99%

szulfonát1; [emim]ToS

Ionic Liquid Technologies GmbH & Co KG, Denzlingen, Németo.

N-butil-N-metil-pirrolidium

>99% 1

bisz(trifluorometilszulfonil)imid ;

Ionic Liquid Technologies GmbH & Co KG, Denzlingen, Németo.

[bmpyr]Tf2N 1-butil-3-metil-imidazolium

>99%

metilén-szulfát1; [bmim]MeSO4 Butil-trimetil-ammónium

Ionic Liquid Technologies GmbH & Co KG, Denzlingen, Németo.

>99%

bisz(trifluorometilszulfonil)imid1;

Ionic Liquid Technologies GmbH & Co KG, Denzlingen, Németo.

[(bmmm)N]Tf2N

1

Ecetsav

99-100%

Spektrum 3D, Debrecen

Etanol

>99,7%

Spektrum 3D, Debrecen

n-Hexán

>96%

Scharlau GmbH, Köln

Desztillált víz

Λ < 10µS

MÜKKI

Valamennyi ionos folyadék elnevezése és képlete a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben található

55

2.2.2. Módszerek

A reakcióelegy összeállítása A reakcióelegy összeállításánál fontos szempont volt, hogy az oldat ne legyen túl tömény (korrozív), így az ecetsav koncentrációját alacsonyra, 0,786 mol/dm3-re állítottam be. Az etanolt fölöslegben (az egyensúly eltolása céljából), különböző mólarányokban adagoltam. A reakcióelegyhez a szubsztrátokon kívül kis mennyiségben vizet is adtam (0,5-5 térfogat% víztartalomig). A

bemérést

analitikai

mérlegen

végeztem,

0,1

mg

pontossággal.

Egy

méréssorozathoz 5 cm3 reakcióelegyre volt szükség, melyet mérőlombikokba mértem be. A bemérendő ecetsav mennyiségét ennek alapján számítottam ki (2.2.2. táblázat):

2.2.2. táblázat: Az etil-acetát enzimes előállítása során bemért anyagok Komponens

koncentráció

n (mmol)

m (mg)

Ecetsav

0,786 (mol/dm3)

3,93

236

Etanol

n×0,786 (mol/dm3)

n × 3,93

n × 181

Víz

0,5-5 vol%

1,39-13,9

25-250

Ezen komponensek bemérése után a mérőlombikot ionos folyadékkal jelre töltöttem, és négy-ötszöri átbuktatással homogenizáltam az elegyet. Tekintettel arra, hogy a rendelkezésre álló ionos folyadékok igen drágák, csak kis mennyiségű reakcióelegyekkel dolgoztam. Emiatt a reakciót kisméretű, 1,5 cm3 űrtartalmú műanyag csövecskékben (Eppendorf-csövekben) hajtottam végre. Az Eppendorf-csövekbe automata pipettával 800-800 µl reakcióelegyet mértem be. 5 cm3 reakcióelegy esetén így 6 adag (6×0,8 = 4,8 cm3) elkészítésére volt lehetőség, azaz hat különböző időpontban vizsgáltam a konverziót.

Inkubálás rázógépben Az enzimet mindegyik Eppendorf-csőbe közvetlenül csak az inkubálás előtt mértem be. A kis edényeket ezután (egy tartóban elhelyezve) rázógépbe tettem (NEW BURNSWICK SCIENTIFIC G24), ahol adott hőmérsékleten inkubáltam. A rázatás intenzitását 150 1/perc értékre állítottam be, ami még nem teszi ki túl erős nyíróhatásoknak az enzimet, ugyanakkor már elegendő a rendszer megfelelő homogenizálásához. Ezt a rázatási intenzitást úgy határoztam meg, hogy különböző

56

rázatási sebességek (0, 50, 100, 150, 200, 250 és 300 1/perc) mellett végeztem enzimes észterezéseket ugyanazon kezdeti reakcióelegyekkel, és összehasonlítottam a kezdeti reakciósebességeket. 0 és 150 1/perc intenzitás között a reakciósebesség monoton nőtt, ugyanakkor a 150 és 200 1/perc rázatási sebesség között nem tapasztaltam szignifikáns különbséget. 250 1/perc fordulatszámon (és e fölött) az enzimkészítmény szemcséi viszont már szemmel láthatóan károsodtak (az enzimtöredékektől a reakcióelegy színe opálos lett). Az analízis céljából meghatározott időtartamok elteltével (0,5; 1; 2; 3,5; 5 és 24 óra után) 1-1 Eppendorf-csövet kivettem a rázógépből, és meghatároztam a konverzió mértékét.

A minta előkészítése analízisre Az inkubátorból kivett minta etil-acetát tartalmát gázkromatográffal határoztam meg; az etil-acetát tartalomból pedig meghatároztam a konverzió mértékét. Mivel az ionos folyadékoknak gyakorlatilag nincs gőznyomása, a minta közvetlenül nem elemezhető gázkromatográfiásan, az etil-acetátot először ki kell extrahálni az ionos folyadék fázisból, és az extraktumot lehet elemezni. Irodalmi adatok alapján megfelelő extrahálószerek az apoláris oldószerek, például az éterek, a toluol vagy a hexán. Ezek közül választásom a n-hexánra esett, mivel 1. nem elegyedik az ionos folyadékokkal, ugyanakkor jó oldószere az etilacetátnak; 2. kevésbé káros az egészségre, és mérsékeltebben robbanásveszélyes, mint az éterek vagy a toluol; 3. a GC retenciója igen kicsi, így elsőnek távozik az oszlopról és a csúcs nem zavarja más komponensek elemzését; 4. tisztasága kifogástalan (>99%), olcsó (kb. 3000 Ft/liter) és nagy mennyiségben rendelkezésre áll. Az extrakció műveletét a következőképpen hajtottam végre: az Eppendorf-cső tartalmát egy kb. 20 cm3-es űrtartalmú, csavaros kupakkal lezárható centrifugacsőbe töltöttem át és 3 cm3 hexánt adagoltam hozzá pipettából úgy, hogy közben a hexánnal az Eppendorf-csövet is átmostam. Ezután lezártam a centrifugacsövet, és kb. 1 percen keresztül intenzíven ráztam (kézzel), majd a centrifugacsövet szerves fogóval függőleges helyzetben rögzítettem. A fázisok egy-két perc alatt tökéletesen kettéváltak: minden esetben az ionos folyadék volt az alsó fázis, és az enzimszemcsék vagy az ionos 57

folyadék fázis belsejében, vagy a fázishatáron helyezkedtek el. A felső (extraktum) fázist pipettával óvatosan felszívtam és egy 10 cm3-es mérőlombikba gyűjtöttem. A műveletet háromszor ismételtem meg, így kb. 3 × 3 = 9 cm3 hexános extraktumot gyűjtöttem a mérőlombikba, melyet a művelet végén hexánnal jelre töltöttem.

Gázkromatográfiás analízis Egy elemzés alkalmával 0,5 µl hexános extraktumot injektáltam a GC-re Hamilton fecskendővel. Mivel mind a hexán, mind az etil-acetát igen illékony, a megfelelő szétválasztáshoz alacsony értékre, 45 °C-ra állítottam be a kolonnatér kezdeti hőmérsékletét. A következő hőmérsékleti programozást alkalmaztam: 3 perc elteltével a kolonnatér hőmérsékletét fokozatosan növeltem (10 °C/min értékkel), egészen 200 °Cig, mely értéken 5 percig maradt. A kolonna hőmérséklete csak ezután állt vissza a kezdeti, 45 °C-os hőmérsékletre. Erre a hőmérsékleti programozásra azért volt szükség, hogy a mintában lévő kevésbé illékony komponensek (ecetsav, esetleges szennyező anyagok) is biztosan távozzanak az oszlopról. A GC beállításai a 2.2.2. táblázatban láthatók. A gázkromatográfiás elemzés során a gázok térfogatáramát buborékos mérővel határoztam meg (2.2.3 táblázat). Az egyes komponensek retenciós idői a 2.2.4. táblázatban láthatók, a 2.2.1. ábrán pedig az egyik jellemző minta kromatogramját mutatom be.

2.2.2. táblázat: A GC beállításai és programozása etil-acetát elemzése során Kolonna fejnyomás

80 kPa

Injektor hőmérséklet

250 °C

FID detektor hőmérséklet

250 °C

Range (érzékenység)

7

2.2.3. táblázat: A GC-re kerülő gázáramok Vivőgáz (N2)

11 ml/min

Éghető gáz (H2)

26 ml/min

Égést tápláló gáz (levegő)

263 ml/min

58

2.2.4. táblázat: Az egyes komponensek retenciós idői Retenciós idő (min)

Komponens

1,11

n-Hexán

1,75

Etil-acetát

2,10

Etanol

10,22

Ecetsav

2.2.1. ábra: Az etil-acetát enzimes előállítása során kapott kromatogramok egyike

59

2.3. Etil-acetát előállítása folyamatos rendszerben 2.3.1. Anyagok

A felhasznált anyagok megegyeztek az előző fejezetben megadottakkal. A víztartalom meghatározását Karl Fischer (KF) titrálással végeztem, az ehhez szükséges reagenst 99%-os tisztaságban a Spektrum 3D Kft.-től (Debrecen) szereztem be. Az ecetsavtartalom meghatározásához 0,1 M-os alkoholos KOH oldatot használtam (minden mérés előtt faktorozva), amit Spektrum 3D KOH-ból (> 99%) és Spektrum 3D etanolból (> 99,7%) készítettem.

2.3.2. Módszerek

Integrált bioreaktor-pervaporációs berendezés A berendezés sémája a 2.3.1. ábrán, fényképe a 2.3.2. ábrán látható.

2.3.1. ábra: Enzim-membrán bioreaktor az etil-acetát enzimes észterezésének vizsgálatára. Jelmagyarázat: 1-reakcióedény mágneskeverővel, 2-intenzív hűtő, 3-perisztaltikus pumpa, 4-hidrofób membrán, 5-hidrofil membrán, 6,7-hűtött csapdák, 8-kifagyasztó, 9,10-szilikonolajos csapdák, 11-zeolitos adszorber, 12-vákuumszivattyú, 13-manométer, 14-szubsztrátum adagoló büretták, 15termosztát.

60

2.3.2. ábra: A pervaporációs berendezés fényképe

A modulokat és a bioreaktort 4 mm belső átmérőjű és 1 mm falvastagságú tygon csővezetékkel, a termosztált egységeket a termosztáttal 4 mm belső átmérőjű és 1 mm falvastagságú szilikoncsővel kötöttem össze. A vákuumozott egységeket 5 mm belső átmérőjű és 5 mm falvastagságú vákuum-gumicsővel és üvegeszközökkel (könyökcső, csap) csatlakoztattam egymáshoz. A reakcióedény (1) egy kb. 140 cm3 űrtartalmú, ötnyakú, mágneses kevertetésű, termosztálható edény volt, melybe 100,0 cm3 reakcióelegyet töltöttem. Az egyik csiszolatba a keringetés során kimenő, egy másikba a bemenő folyadékáram csatlakozását illesztettem. Két további csiszolatba illesztettem a rátápláló pipetták (14) csatlakozásait. Az ötödik csiszolatba egy csapvízzel hűtött intenzív hűtőt (2) helyeztem, melynek falán a reakció hőmérsékletén elpárolgó komponensek kondenzálódtak, és így visszakerültek a rendszerbe. Így a rendszerben nem alakulhatott ki veszélyes túlnyomás, ugyanakkor a párolgási veszteség is minimális volt. A reakcióelegyet tygon csővezetéken át, egy perisztaltikus pumpával (3) emeltem át a membrán modulokra. A keringetési sebesség 50 cm3/perc volt. A keringetett elegy először egy 12 cm2 felületű Sulzer gyártmányú „Pervap 2255-50” típusú hidrofób (4), majd egy 200 cm2 felületű szintén Sulzer gyártmányú és „Pervap 2201” típusú hidrofil 61

membránra (5) került. A saválló acélból készült membrán modulokat vízzel termosztáltam (15). A membránmodulokról a reakcióelegyet egy tygon csővezetéken át visszavezettem a reakcióedénybe. A membrán szekunder oldalán kb. 10 Hgmm (1315 Pa) vákuumot alkalmaztam, melyet vákuumszivattyú (12) állított elő. A (6) csapdát –melyben a reakcióelegyből kivont etil-acetát kondenzálódott– acetonos szárazjéggel (-70°C), míg a (7) csapdát – melyben a víz kondenzálódott– sós jéggel (-14 °C) hűtöttem. Biztonsági okokból, az illékony anyagok abszolút eltávolítására egy további kifagyasztót (8), valamint két szilikonolajos csapdát (9,10) illesztettem be a vákuumszivattyú elé. A szivattyú további védelmére egy zeolitos adszorber (11) szolgált. A rendszerben lévő vákuumot (13) higanyos manométerrel követtem nyomon. A folyamatos rendszer vizsgálatánál a szubsztrátum (etanol és ecetsav) rátáplálását bürettákból (14) hajtottam végre. A reakcióedény és a membránmodulok hőmérsékletét termosztát (15) által keringetett vízzel állítottam be.

A mérések kivitelezése A mérések során alkalmazott reakcióelegy összetételét a 2.3.1. táblázat mutatja.

2.3.1. táblázat: A reakcióelegy összetétele pervaporációs mérések során Komponens

c

m

n (mmol) (g)

tömeg %

Ecetsav

0,786 (mmol/cm3)

78,6

4,72

3,9

Etanol

3×0,786 =2,258 (mmol/cm3)

225,8

10,40

8,7

Víz

2% vol. = 20 mg/cm3

111,1

2,00

1,7

Ionos folyadék

maradék

362,0

102,88

85,7

Az ecetsavat, etanolt és a vizet analitikai mérlegen egy 100 cm3-es mérőlombikba töltöttem. Ezután ionos folyadékkal jelre töltöttem a lombikot. A lombikot négy-ötszöri átbuktatással homogenizáltam, majd a reakcióedénybe töltöttem. A rektoredényt ezután csatlakoztattam a rendszerhez, beindítottam a keverést, a keringetést valamint a termosztálást. 15 perc eltelte után a reakcióelegy hőmérséklete már beállt az egyensúlyi értékre, így a reakcióelegybe az enzimet is bemértem. Mivel minden mérésem során 20 g/dm3 enzimtartalmat állítottam be, így a bemért enzim mennyisége 2,00 g volt, melyet

62

bemérőcsónakból, egy tölcséren keresztül juttattam a reaktoredénybe. Az enzim bemérése után számítottam a reakcióidőt.

Etil-acetát, etanol és víztartalom elemzése A minták előkészítése és a gázkromatográfiás analízis megegyezett a szakaszos kísérletek során leírtakkal (2.2. fejezet). A víztartalmat egy METTLER DL 35 típusú Karl Fischer titrátorral határoztam meg. A hidrofób membránhoz tartozó csapdában (6. csapda) összegyűlt permeátumot egy 10 cm3-es mérőlombikba töltöttem, a maradékot 3×2 cm3 hexánnal belemostam. A lombik tartalmát hexánnal jelre töltöttem, majd GC-n elemeztem. Korábbi vizsgálataim kimutatták, hogy az etil-acetát a hidrofil membránon, a víz pedig a hidrofób membránon nem jut át kimutatható mértékben.

Ecetsavtartalom meghatározása Az ecetsav mennyiségét mind a reakcióelegyben, mind pedig a hidrofil membrán permeátumában

(7.

csapda)

figyelemmel

követtem.

A

hidrofób

membrán

permeátumának ecetsav tartalmát tömegmérleggel határoztam meg. Ez alapján határoztam meg a membránok ecetsavra vonatkozó szelektivitását. A reakcióelegyből vett minta ecetsav tartalmát 0,1 M-os alkoholos káliumhidroxiddal titráltam. Egy kisméretű (25 ml-es) Erlenmeyer-lombikba gáztömör fecskendővel 200 µl mintát vettem. A bemért tömeget analitikai mérlegen határoztam meg. A mintát kb. 5 cm3 etanollal hígítottam, és a homogén oldatot mikrobürettába (0,01 cm3 pontosság) töltött KOH mérőoldattal fenolftalein indikátor mellett rózsaszínű átcsapásig titráltam. A hidrofil membrán permeátumának teljes mennyiségét egy Erlenmeyer-lombikba töltöttem, a csapda falához tapadó maradékot kb. 3 × 3 cm3 vízzel mostam. A vizes oldatot 0,1 M-os vizes KOH-oldattal titráltam. A mérőoldatok faktorát napi frissítéssel, sósavas titrálással határoztam meg.

Szelektivitási tényező meghatározása A membránok szelektivitása többféleképpen is megadható. Méréseim során a szelektivitási tényezőt számítottam ki az egyes komponensekre, páronként.

63

Szelektivitási tényező (α):

α A/B =

yA / yB xA / xB

(2)

yA, yB: A és B komponens tömegtörtje a permeátumban xA, xB: A és B komponens tömegtörtje a betáplálási oldalon Összefoglalás Az analitika összefoglalása a 2.3.2. táblázatban látható.

2.3.2. táblázat: Analitikai módszerek összefoglalása Komponens

Reakcióelegy

Hidrofil membrán

Hidrofób membrán

permeátuma

permeátuma

Etanol

GC

Tömegmérleg alapján

GC

Ecetsav

KOH titrálás

KOH titrálás

Tömegmérleg alapján

Víz

KF titrálás

Tömegmérleg alapján

gyakorlatilag nem jut át

Etil-acetát

GC

gyakorlatilag nem jut át

64

GC

2.4. 2-Cl propionsav észterezése n-butanollal 2.4.1. Anyagok

A felhasznált anyagokat (név, eredet, tisztaság) a 2.4.1. táblázat mutatja be.

2.4.1. táblázat: A butil-2-klór-propionát enzimes előállítása során felhasznált anyagok: Anyag neve

Tisztaság

Forrás

(R,S)-2-klór-propionsav

>95%

Merck, Darmstadt, Németország

n-Butanol

>99,5%

Spektrum 3D, Debrecen

(R,S)-Butil-2-klór-propionát

>95%

Sigma-Aldrich Co.

Candida rugosa enzim

-

Sigma-Aldrich Co.

1-butil-3-metil-imidazolium

>98%

Solvent Innovation GmbH,

14

tetrafluoro-borát ; [bmim]BF4 1-butil-3-metil-imidazolium

Köln, Németország >98%

hexafluoro-foszfát1; [bmim]PF6 1-nonil-3-metil-imidazolium

Solvent Innovation GmbH, Köln, Németország

>98%

1

hexafluoro-foszfát ; [nmim]PF6

Solvent Innovation GmbH, Köln, Németország

Toluol

>99,7%

Spektrum 3D, Debrecen

Tetrahidro-furán (THF)

>99,9%

Spektrum 3D, Debrecen

n-Hexán

>96%

Spektrum 3D, Debrecen

n-Heptán

>99,2%

Spektrum 3D, Debrecen

Karl Fischer reagens

99%

Spektrum 3D, Debrecen

Desztillált víz

Λ < 10 µS

MÜKKI

2.4.2. Módszerek

Rázatott lombikos kísérletek Kísérleteim során a racém 2-klór-propionsav koncentrációját 0,5 mol/dm3-re állítottam be. A butanolt fölöslegben (az egyensúly eltolása céljából), különböző

14

Valamennyi ionos folyadék szerkezeti képlete és jelölése a „Definíciók és rövidítések” fejezetben található

65

mólarányokban adagoltam. A reakcióelegyhez a szubsztrátokon kívül kis mennyiségben vizet is adtam (0,1-0,5 térfogat% víztartalomig). A

bemérést

analitikai

mérlegen

végeztem,

0,1

mg

pontossággal.

Egy

méréssorozathoz 5 cm3 reakcióelegyre volt szükség, melyet mérőlombikba mértem be. A bemérendő 2-klór-propionsav mennyiségét ennek alapján számítottam ki (2.4.2. táblázat):

2.4.2. táblázat: A 2-klór-propionsav enzimes észterezése során bemért anyagok Komponens

Koncentráció

n (mmol)

(R,S)-2-klór-propionsav

0,5 (mol/dm3)

2,5

Butanol

6×0,5 (mol/dm3)

15

Víz

N × 0,1 vol.% (n = 1-6)

n × 0,28

A komponensek bemérése után a mérőlombikot ionos folyadékkal jelre töltöttem, és négy-ötszöri átbuktatással homogenizáltam az elegyet. A kísérleteket rázó inkubátorba helyezett Eppendorf-csövekben hajtottam végre. A rázatás intenzitását a korábbi tapasztalatok alapján 150 1/perc-re állítottam be. Az inkubálás ideje alatt a reakcióelegyben a következő enantioszelektív észterezési reakció játszódott le (2.4.1. ábra): Cl

Cl

Cl O OH

Candida rugosa

+ H O C4 H9 - H2 O

O OC4H9

O

+

OH

2.4.1. ábra: 2-klór-propionsav enzimes enantioszelektív észterezése n-butanollal

A mintavételi és extrakciós módszerek megegyeztek az etil-acetát előállításánál leírt módszerekkel (2.2.2. fejezet), azonban itt az extrahálószer n-heptán volt, mivel ez az oldószer a butil-2-klór-propionát észtert és az n-butanolt jobban oldotta, mint a hexán. Az analízist HP5890 Series II gázkromatográffal végeztem. Az enantiomerek elemzésére a következő királis kolonnát alkalmaztam: FS-LIPODEX E (MachereyNagel, Düren, Németország). A kolonna hossza 25 m, belső átmérője 0,25 mm, filmvastagsága 0,2 µm volt. A GC készüléken beállított paraméterek a 2.4.3. táblázatban láthatók.. A következő hőmérsékleti programozást alkalmaztam: A kolonnatér kezdeti hőmérséklete 100 °C volt, melyet 5 perc elteltével lineárisan növeltem (10 °C/min 66

értékkel), egészen 180 °C-ig, mely értéken 10 percig maradt. A kolonna hőmérséklete csak visszaállt a kezdeti, 100 °C-os hőmérsékletre. A gázkromatográfiás oszlopon a vivőgáz nitrogéngáz (99,5%-os tisztaságú) volt. A lángionizációs (FID) detektorra kerülő éghető gáz hidrogén (99%-os), az égést tápláló gáz pedig sűrített levegő volt. Az oszlopra kerülő a gáz térfogatáramát buborékos mérővel határoztam meg. Az így mért gázáramokat a 2.4.4. táblázat mutatja.

2.4.3. táblázat: A GC beállításai a 2-klór propionsav észterezésének elemzése során Kolonna fejnyomás

80 kPa

Injektor hőmérséklet

250 °C

FID detektor hőmérséklet

250 °C

Range (érzékenység)

8

2.4.4. táblázat: Kolonna-gázáramok a 2-klór propionsav észterezésének elemzése során Vivőgáz (N2)

30 ml/min = 5,00 × 10-1 cm3/s

Éghető gáz (H2)

25 ml/min = 4,17 × 10-1 cm3/s

Égést tápláló gáz (levegő)

230 ml/min = 3,83 cm3/s

Egy-egy mérés alkalmával 0,5 µl mintát injektáltam a GC-re Hamilton fecskendővel. A kolonnatér kezdeti hőmérsékletét 50 °C-ra állítottam be. A hőmérsékleti programozás hasonló volt az etil-acetát analízisénél alkalmazotthoz: 3 perc elteltével a kolonnatér hőmérsékletét fokozatosan növeltem (10 °C/min értékkel), egészen 180 °C-ig, mely értéken 10 percig maradt. Az egyes komponensek retenciós idői a 2.4.5. táblázatban láthatók.

2.4.5. táblázat: Az egyes kromatográfiás csúcsokhoz tartozó komponensek Retenciós idő (min)

Komponens

1,35

n-Heptán

1,53

n-Butanol

3,67

(S)-Butil-2-klór-propionát

3,89

(R)-Butil-2-klór-propionát

9,91

(S)-2-klór-propionsav

10,07

(R)-2-klór-propionsav

67

A különböző időpontokban vett minták elemzése során a kalibrációs egyenes segítségével meghatároztam a konverziót és az enantioszelektivitást, melyet az idő függvényében ábrázoltam. Az enzim stabilitásának mérése során az biokatalizátort egymást követő reakcióciklusokban újra felhasználtam. Ennek során az enzimszemcséket redős szűrőn leszűrtem az ionos folyadékból, 3 × 3 cm3 n-hexánnal mostam, majd a Petri-csészébe helyezett enzimet szobahőmérsékleten kb. 1 órát szárítottam. Ezután az enzimet hűtőszekrénybe (kb. +5 °C) helyeztem, és a következő felhasználásig egy óraüveggel lefedve tároltam. A leszűrt ionos folyadékból rotációs vákuumdesztillációval eltávolítottam az oldott komponenseket, melynek során az eredetivel azonos tisztaságú ionos folyadékot nyertem vissza. A tömegveszteség (nagyrészt szűrőpapírra, edény falára tapadó ionos folyadék) kb. 10% volt.

Mérések laboratóriumi méretű integrált enzim-membrán bioreaktorral A pervaporációs vízeltávolítás vizsgálatához kis változtatással ugyanazt a berendezést alkalmaztam, mint az etil-acetát vizsgálata esetén is (részletesen az előző fejezetben). A berendezés vázlata a 2.4.2. ábrán látható.

2.4.2. ábra: Integrált enzim-membrán bioreaktor a 2-klór-propionsav észterezésére Jelmagyarázat: R-reakcióedény, K-intenzív hűtő, T-hőmérő, P-perisztaltikus pumpa, M-termosztált membránmodul, C1,C2-jéggel hűtött csapdák, S1,S2-szilikonolajos csapdák, Z-zeolitos adszorber, Bmanométer, VP-vákuumszivattyú, 1,2,3, csapok.

A modulokat és a bioreaktort 4 mm belső átmérőjű és 1 mm falvastagságú tygon csővezetékkel, a termosztált egységeket a termosztáttal 4 mm belső átmérőjű és 1 mm

68

falvastagságú szilikoncsővel kötöttem össze. A vákuumozott egységeket 5 mm belső átmérőjű és 5 mm falvastagságú vákuum-gumicsővel és üvegeszközökkel (könyökcső, csap) csatlakoztattam egymáshoz. A reakcióedény (R) egy kb. 140 cm3-es, ötnyakú, termosztálható üvegedény volt. A reakcióelegy térfogata 100 cm3 volt. A párolgási veszteség csökkentésére egy intenzív hűtőt (K) alkalmaztam. A reakcióelegyet tygon csővezetéken át, perisztaltikus pumpával (P) emeltem át a membrán modulra (M), melyben egy 200 cm2 felületű, kör alakú hidrofil membrán (Sulzer Pervap 2201; ugyanaz a típus, amit az etil-acetát folyamatos előállítása során is alkalmaztam) helyezkedett el. A membránmodulról a reakcióelegyet tygon csővezetéken át visszavezettem a reakcióedénybe. A keringetési sebesség 0,75 cm3/s (45 cm3/min) volt. A membrán szekunder oldalán kb. 10 Hgmm (1315 Pa) vákuumot alkalmaztam. A bemérés során a racém 2-klór-propionsavat, az ötszörös feleslegben lévő butanolt és a vizet analitikai mérlegen mértem be egy 100 cm3-es normállombikba, amit utána ionos folyadékkal jelre töltöttem. A bemért anyagok mennyiségét a 2.4.6. táblázat mutatja.

2.4.6. táblázat: A pervaporációs mérések során bemért komponensek Komponens

c

n (mmol)

(R,S)-2-klór-propionsav

0,5 (mol/dm3)

50

Butanol

6×0,5 (mol/dm3)

300

Víz

0,1-0,6 vol. %

5,56-33,3

Enzim

10 mg/cm3

-

A bemérés után többszöri átbuktatással homogenizáltam az elegyet, majd a reakcióedénybe

töltöttem.

A

reakcióedényt

csatlakoztattam

a

berendezéshez,

elindítottam a kevertetést, a keringetést és a termosztálást. 15 perc inkubálás után hozzáadtam az enzimet (1000 mg), és ettől kezdve számítottam a reakcióidőt. A minta előkészítését és elemzését a korábban leírtakkal azonos módon végeztem. A reakcióelegyből pipettával 800 µl mintát vettem, amit 3 × 3 cm3 n-heptánnal extraháltam, majd a 10,0 cm3-re feltöltött extraktumot GC-n elemeztem.

69

2.5. A mérések pontossága 2.5.1. Enantioszelektív hidrogénezés

Az enantioszelektív hidrogénezés vizsgálata során minden mérést kétszer végeztem el. Kísérleti eredményként a két mérés számtani átlagát fogadtam el. A mérések ismétlése során a mért értékek szórása igen alacsonynak bizonyult, ami elsősorban a bemérések hibájából, illetve egyéb tényezőkből fakadt (pl. a reakcióelegy hőmérséklete 1-2 °C-kal eltért vagy a kezdeti hidrogén nyomás néhány %-kal magasabb/alacsonyabb volt stb.). Az eredmények nagyobb szórását (< 4,1%) a katalizátor recirkulációja során tapasztaltam, ahol az (R+S) hozam már 100% alatt maradt, így a csúcsok méretének csökkenésével arányosan nőtt a mérési hiba is. Amennyiben a katalizátort csak egy ciklusban alkalmaztam az eredmények szórása minden esetben 1,6% alatt volt.

2.5.2. Etil-acetát enzimes előállítása szakaszos rendszerben

Tekintettel arra, hogy az etil-acetát megoszlása az ionos folyadék és a hexán között különböző típusú ionos folyadékok alkalmazásánál különböző lehet, mindegyik alkalmazott ionos folyadék esetében kimértem az extrahálás etil-acetátra vonatkozó hatásfokát, valamint hibáját. A hatásfok számításához először etil-acetát valamint etanol bemérésével modelloldatokat készítettem n-hexánban. A modelloldatokból három párhuzamos analízist végeztem a GC-n, majd a kapott impulzusszámokat átlagoltam és a hozam függvényében ábrázoltam (hibasávokkal együtt), és a kapott pontokra origóból kiinduló egyenest illesztettem. A szórással a GC elemzés hibájára következtettem. Ezután ionos folyadék oldószerben, analitikai mérlegen történő beméréssel többféle etil-acetát-tartalmú modellelegyet készítettem, minden ionos folyadék esetén külön-külön. Ezeket a modellelegyeket a minták elemzésével megegyező módon extraháltam (úgy, hogy három párhuzamos extrakciót végeztem minden oldatból), majd a GC analízis során kapott értékek átlagát és szórását határoztam meg, amiből az extrakció és a GC analízis együttes hibájára következtettem. A kapott átlagértékeket a hibasávokkal együtt a koncentráció függvényében ábrázoltam,

70

és ezekre is egy origóból induló egyenest illesztettem. A hatásfokot a két egyenes meredekségének aránya alapján számítottam ki. Az egyik ilyen mérés (melyben az extrakció [bmim]PF6 ionos folyadékból történik) során kapott diagram a 4.2.1. ábrán látható. A többi ionos folyadék esetén kapott adatok a 2.5.1. táblázatban láthatók. 160000

[bmim]PF6

140000

Impulzus (n)

120000 y = 1978x R2 = 0,99953

100000 80000

y = 1795x R2 = 0,99998

60000 40000

Lineáris (Modelloldat) 20000

Lineáris (Extraktumok)

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

[EtAc] (mmol/dm3)

2.5.1. ábra: Etil-acetát modellelegyek alapján készített GC kalibráló egyenes („elméleti egyenes”) és a [bmim]PF6 ionos folyadékból kapott extraktumok GC analízise során kapott impulzusszámok alapján illesztett egyenes A 2.5.1. ábrán látható, hogy a mérési pontokra illesztett egyenes R2>0,999 pontosságú. Ez elfogadható érték. A 2.5.1. táblázatban látható, hogy a módszer és az analitika kellően pontos, mivel
az extrakció hatásfoka az ionos folyadék típusától függően 90,3% és 93,5% között változott, azaz megfelelő (η > 90%) volt,
A GC analízis során kapott eredmények szórása 2,3% volt, az extrakció és a GC együttes szórása pedig 3,6% és 4,1% között volt. Mivel a mintaelőkészítés és az analízis szórás értéke minden esetben jóval kisebb, mint 5%, így az enzimes mérések esetén minden elemzés együttes hibájára (mintavétel, mintaelőkészítés, analízis) szintén feltételeztem, hogy értéke 5%-nál kisebb. A mérés hibája megfelelő az enzimes reakciók nyomon követésére, ezért az enzimes kísérletek során elegendőnek tartottam a kísérlet egyszeri végrehajtását. 71

2.5.1. táblázat: Az etil-acetát hexános extrakciójának hatásfoka, valamint az analízis során kapott eredmények szórása a mintaelőkészítés reprodukálása után (3 reprodukció, 3 párhuzamos GC analízis minden esetben) Ionos

Az etil-acetát extrakciós

Szórás (%)

folyadék

hatásfoka hexánnal (%)

[bmim]BF4

92,1

3,8

[bmim]PF6

90,7

3,9

[bmim]MeSO4

92,7

4,1

[emim]ToS

90,3

4,0

[bpy]BF4

90,4

3,8

[bmpyr]Tf2N

91,0

3,6

[bmmmN]Tf2N

93,5

4,1

2.5.3. Etil-acetát enzimes előállítása folyamatos rendszerben

A

folyamatos

rendszer

vizsgálatánál

az

etil-acetát

mellett

az

etanol

koncentrációváltozását is nyomon követtem. Az etanolt szintén gázkromatográfiásan elemeztem. A GC analízis kalibrációját, egyúttal a hiba számítását az etil-acetátéhoz hasonlóan végeztem, így csak az eredményeket közlöm:
Extrakció hatásfoka [bmim]PF6 ionos folyadékból: 91,3%
GC analízis szórása < 2,4%
Extrakció + analízis szórása < 4,3% A folyamatos rendszer vizsgálata során a 4.2. pontban tárgyalt analitikai módszer mellett két titrimetriás módszert is alkalmaztam: a savtartalom meghatározására egy sav-bázis titrálást, a víztartalom analízisére pedig Karl Fischer titrálást. A kálium hidroxidos titrálás hibáját a következőképpen számítottam ki: három különböző összetételű ionos folyadék/ecetsav modellelegyek kálium-hidroxidos titrálása során a szórás < 1,8%-nak adódott (három különböző ecetsav-koncentrációnál, minden koncentrációnál három párhuzamos mérés esetén). Ennek alapján a sav-bázis titrálást minden mintavétel esetén elegendőnek tartottam egyszer elvégezni. A Karl-Fischer titrálás hibáját hasonlóképpen, ionos folyadék/víz modellelegyek segítségével határoztam meg. Ennek során három különböző víztartalomnál, minden

72

elegynél három párhuzamos mérés esetén a hiba <2,5%-nak adódott. Ennek alapján a Karl-Fischer titrálást minden mintavétel esetén elegendőnek tartottam egyszer elvégezni.

2.5.4. 2-klór-propionav enzimes észterezése n-butanollal

A gázkromatográfiás mérések kalibrációját hasonlóan végeztem, mint az etil-acetát elemzése során (4.2. pont). A beméréssel készített modellelegyek analízisénél megállapítottam a GC analízis szórását, ami 2,6% volt. Az észter extrakcióját minden ionos folyadékban vizsgáltam, amiben később reakciót játszattam le; a tapasztalt extrakciós hatásfokokat, illetve a mérések szórásaiból számított hibahatárokat a 2.5.2. táblázat mutatja.

2.5.2. táblázat: Az (R,S)-BUKP hexános extrakciójának hatásfoka, valamint az analízis során kapott eredmények szórása Ionos

A (R,S)-BuKP extrakciós hatásfoka

folyadék

heptánnal (%)

Szórás (%)

[bmim]BF4

95,3

3,7

[bmim]PF6

94,7

3,9

[nmim]PF6

94,9

3,6

Az enantioszelektivitás meghatározását a két enantiomerre kapott impulzus összegéből és arányából számítottam ki (ee számítását részletesen a „Definíciók és rövidítések” c. fejezetben írtam le). A modellelegyek extrakciója során nem tapasztaltam szignifikáns különbséget a két enantiomer extrakciója között. A folyamatos rendszer alkalmazása során nemcsak az észter, hanem a butanol és a 2-klór-propionsav mennyiségét is nyomon követtem. Az egyes komponensek [bmim]PF6-ból heptánnal történő extrakciója során tapasztalt

hatásfokok és

mintaelőkészítés és analízis együttes szórása összefoglalóan a 2.5.3. táblázatban láthatók.

73

2.5.3. táblázat: Különböző komponensek extrakciója során tapasztalt hatásfokok, illetve a mért pontok szórása Komponens

Extrakciós hatásfok

GC szórása

Extrakció + analízis

[bmim]PF6-ból heptánnal

(%)

szórása (%)

(%) (R,S)-BuKP

94,7

2,6

3,7

Butanol

93,8

2,8

3,9

(R,S)-KPS

92,6

2,5

3,4

A víztartalom nyomon követésére használt Karl Fischer titrálás hibáját az előző pontban írtam le. Mivel a mérések egyesített szórása minden esetben jóval 5% alatt volt, feltételeztem, hogy ez a szórás az enzimes reakcióelegyek analízise esetén is fennállt, ennek alapján elegendőnek tartottam a kísérleteket egyszer elvégezni.

74

3. Eredmények 3.1. Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban Méréseim során a (Z)-α-acetamido-fahéjsav (AFSAV) és a (Z)-α-acetamidofahéjsav-metilészter (AFME) enantioszelektív hidrogénezését vizsgáltam kétféle katalizátorral (K1 és K2), ionos folyadék/izopropanol kétfázisú rendszerekben. A szubsztrátumok és a katalizátorok szerkezeti képlete a 2.1.1. ábrán látható.

3.1.1.

Az

AFSAV

hidrogénezése

[Rh(NBD)((S,S)-DiMe-BDPP)]PF6

(K1)

katalizátorral [bmim]BF4/izopropanol kétfázisú rendszerben Az élénkpiros színű, porszerű katalizátorkristályok a [bmim]BF4 ionos folyadékban könnyen feloldódtak; a homogén elegy kálium-dikromátra emlékeztető színű volt.. A reakciót szobahőmérsékleten (22 °C) hajtottam végre. A mérési eredményeket a 3.1.1. táblázat mutatja.

3.1.1. táblázat: AFSAV hidrogénezése [Rh(NBD)((S,S)-DiMe-BDPP]PF6 katalizátorral [bmim]BF4/izopropanol kétfázisú rendszerben Ciklus pH2 (bar) T (°C)

Reakcióidő (h)

Hozam (R+S, %)

ee (R, %)

1

50

22

2

2,5

27

1

20

22

6

51

47

1

10

22

1

98

90

2

10

22

1

80

80

3

10

22

1

25

77

Első méréseim során viszonylag magas, 50 bar (5×106 Pa) kezdeti hidrogén nyomást alkalmaztam, ami még 24 óra reakcióidő mellett is csekély hozamot (2,5%) valamint enantioszelektivitást (27% ee) eredményezett. A továbbiakban a kezdeti nyomást csökkentettem (először 20, majd 10 bar-ra, azaz 2×106, illetve 106 Pa-ra), melynek következtében mind a hozam, mind az enantioszelektivitás jelentősen megnőtt. 10 bar (106 Pa) kezdeti nyomás esetén kisebb nyomáshatárú manométert alkalmazva a nyomáscsökkenést is pontosabban figyelemmel lehetett követni, így a reakció lefutását pontosan meg tudtam határozni. A nyomásgörbe a 3.1.1. ábrán látható Ez 75

alapján megfigyelhető, hogy a reakció kb. 60 perc alatt látszódott le. A reakció lejátszódása

után

98%

egyesített

(R+S)

termékhozamot,

valamint

90%

enantioszelektivitást mértem. A katalizátort ezen reakciókörülmények mellett további két ciklusban sikerült újra felhasználnom (3.1.1. táblázat). 10,1

Hidrogénnyomás (bar)

10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Reakcióidő (min)

3.1.1.

ábra:

A hidrogénnyomás

változása

az

AFSAV hidrogénezése során

([bmim]BF4/IPA rendszer, K1 katalizátor, 22 °C, 10,0 bar kezdeti hidrogén nyomás)

3.1.2 Az AFSAV és az AFME hidrogénezése [Rh(COD)((R,R)-DiPamp))]BF4 (K2) katalizátorral ionos folyadék/izopropanol kétfázisú rendszerben

A hidrogénezést háromféle ionos folyadékban vizsgáltam: [bmim]BF4-ben, [bmim]PF6-ban, valamint [mbpy]BF4-ben. A korábbi tapasztalatok szerint mindkét imidazolium-kationt tartalmazó IL megfelelő az enantioszelektív hidrogénezési reakció kivitelezésére (l. 1.2. fejezet), míg piridinium-kationt tartalmazó ionos folyadékban ilyen reakciót tudomásom szerint ez idáig nem vizsgáltak. Kísérleteim során először az optimális reakciókörülményeket határoztam meg, majd ezen optimális körülmények mellett vizsgáltam a katalizátor újrahasznosíthatóságát. Első kísérleteim alkalmával itt is magas (50 bar) kezdeti hidrogénnyomást alkalmaztam szobahőmérsékleten. 17 óra reakcióidő alatt a hozam elérte a 100%-ot, de az enantioszelektivitás igen alacsony, 58% volt. A kezdeti nyomás csökkentése K2 katalizátor esetén is jelentősen javította az enantioszelektivitást. Kisebb kezdeti nyomást alkalmazva azonban a reakciósebesség is csökkent, ennek ellensúlyozására magasabb

76

hőmérsékleten (60 °C) játszattam le a reakciót. A nyomásgörbe alapján (3.1.2. ábra) megállapítottam, hogy a reakció 1 óra alatt teljesen lejátszódott. 5,9

Hidrogénnyomás (bar)

5,8 5,7 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2 5,1 5 4,9 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Reakcióidő (min)

3.1.2. ábra: A hidrogén nyomás változása az AFSAV hidrogénezése során ([bmim]BF4/IPA rendszer, K2 katalizátor, 55 °C, 5,8 bar kezdeti hidrogén nyomás) Az eredményeket a 3.1.2. táblázat foglalja össze. A konverzió minden esetben teljes, az enantioszelektivitás értékek AFSAV esetén 88 illetve 91%-nak adódtak, míg AFME esetében alacsonyabb, 71, illetve 87%-os enantioszelektivitást mértem az ionos folyadék típusától függően. [mbpy]BF4-ben a reakció nem játszódott le; inert kivétel után a reakcióelegyben és az autokláv falán fémes ródiumkiválást tapasztaltam. Ennek valószínűleg az lehetett az oka, hogy az ionos folyadék piridinium-bázisú kationja az átmenetifém-komplex katalizátor komplex szerkezetét megbontotta, így a fém ródium kivált az oldatból.

3.1.2. táblázat: Hozam és enantioszelektivitás az AFSAV és az AFME hidrogénezése során (VIL/Vizopropanol = 1:3; K2 katalizátor; 5 bar hidrogén nyomás) Szubsztrátum

IL

T (°C)

Hozam (%)

ee (S,%)

AFSAV

[bmim]BF4

55

100

91

AFSAV

[bmim]PF6

55

97

88

AFME

[bmim]BF4

70

100

87

AFME

[bmim]PF6

50

100

71

AFSAV

[bmpy]BF4

55

0

0

77

Az eredményekből látható, hogy [bmim]BF4 ionos folyadékban mindkét szubsztrátum esetén jobb enantioszelektivitás érhető el. Ez korrelál Dupont eredményeivel is, ahol a [bmim]BF4 ionos folyadék hasonlóan jobbnak bizonyult (Berger, 2001) További

kísérleteimben

az

AFSAV

[bmim]BF4/IPA

rendszerben

történő

hidrogénezésének optimális reakciókörülményeit határoztam meg. Méréseim során 60 °C bizonyult az enantioszelektivitás szempontjából optimális hőmérsékletnek (3.1.3. ábra).

94 92

ee (%)

90 88 86 2,5 bar 84

5,0 bar 7,5 bar

82 80 45

50

55

60

65

70

75

T (°C)

3.1.3. ábra: A hőmérséklet hatása az enantioszelektivitásra az AFSAV aszimmetrikus hidrogénezése során ([bmim]BF4/IPA rendszer, K2 katalizátor) Az irodalmi részben tárgyalt Halpern-féle reakciómechanizmus (1.2.2. fejezet, 1.2.7. ábra) az enantioszelektív hidrogénezési reakciók nagy részére igaz, ma már azonban több eset is ismert, melyben a reakció eltérő mechanizmus alapján játszódik le (Gridnev, 2000). A reakció mechanizmusát a katalizátor, a szubsztrátum, illetve az oldószer típusa is befolyásolja. Az enantioszelektivitás eredetére méréseim során az ee hőmérsékleti függéséből következtettem. A halperni mechanizmus alapján azt lehet jósolni, hogy a hőmérséklet növelése mindkét diasztereomer esetében azonos arányban gyorsítja a sebességmeghatározó reakciósebességeket,

azaz

a

hidrogén

oxidatív

addícióját.

Mivel

a

„nem

kedvezményezett” diasztereomer (dmin) hidrogénaddíciójának reakciósebessége (k(dmin)) lényegesen nagyobb, mint a „kedvezményezett” diasztereomer (dmaj), hidrogénezési sebessége (k(dmaj)) így a reakciósebesség növekmény is nagyobb k(dmin)-re, mint 78

k(dmaj)-ra. Így a dmin fogyása még gyorsabb lesz, aminek következtében az egyensúly még inkább az (S) termék keletkezése irányába tolódik el, azaz nő az enantioszelektivitás. Létezik azonban egy határhőmérséklet, melynél k(dmin) annyira begyorsul, hogy további hőmérséklet-emelésre az egyensúly már „nem bírja” kompenzálni dmin fogyását, azaz hiába magas a reakciósebesség, “nincs minek fogynia”, a dmin keletkezése limitáló tényező lesz, ami behatárolja a szelektivitást. A határhőmérsékleten az enantioszelektivitásnak maximuma van, azaz a hőmérséklet további növelésére az enantioszelektivitás csökkenni kezd. Méréseim során az enantioszelektivitásnak 60 °C-on maximuma volt. Ez valószínűsíti, hogy a vizsgált hidrogénezési reakció ionos folyadékokban is a Halpern által leírt mechanizmus alapján játszódott le. A hozam szempontjából a hőmérsékletnek kisebb jelentősége van. A hőmérséklet emelésével, 70 °C-on már csökkenni kezd a hozam (90% 2,5 bar nyomás mellett), ami valószínűleg a Rh-komplex katalizátor hő általi károsodásának következménye. (3.1.4. ábra). A nyomás hatását vizsgálva megállapítottam, hogy a nyomás csökkentésével nő az enantioszelektivitás. A legmagasabb (92%) enantioszelektivitást 2,5 bar kezdeti hidrogén nyomás esetén tapasztaltam (3.1.4. ábra). 105

Hozam (R+S ) (%)

100

95

90

2,5 bar 5,0 bar 7,5 bar

85

80

75 45

50

55

60

65

70

75

Hőmérséklet (°C)

3.1.4. ábra: A hőmérséklet hatása a hozamra az AFSAV aszimmetrikus hidrogénezése során K2 katalizátor alkalmazásával

79

Összefoglalásképpen, a hőmérséklet és a nyomás együttes hatását a hozamra valamint az enantioszelektivitásra háromdimenziós diagramon is bemutatom (3.1.5.

95

100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50

90 ee (%)

Hozam (%)

ábra)

85 80

70 60 55 2,5

5

p (bar )

75 70

T (°C)

50

2,5 p (bar)

7,5

60

5 7,5

55 50

T (°C)

3.1.5. ábra: A nyomás és a hőmérséklet együttes hatása a hozamra (balra) és az enantioszelektivitásra (jobbra) az AFSAV K2-vel történő hidrogénezése során

3.1.3. A [Rh(COD)((R,R)-DiPamp))]BF4 (K2) katalizátor újrahasznosításának vizsgálata az AFSAV hidrogénezése esetén [bmim]BF4/izopropanol kétfázisú rendszerben

A katalizátor ionos folyadékban történő recirkuláltathatóságának vizsgálatát AFSAV

hidrogénezése

esetén

[bmim]BF4/izopropanol

katalitikus

rendszerben

vizsgáltam különböző reakciókörülmények (55 és 60 °C; 2,5 és 5 bar hidrogén nyomás) mellett. A recirkuláció során az egyes reakció ciklusokban kapott hozamokat a 3.1.6. ábrán, az enantioszelektivitás változását pedig a 3.1.7. ábrán mutatom be. Az eredményekből látható, hogy a recirkuláció során 55 °C-on és 5 bar hidrogénnyomás mellett csökken leglassabban a katalizátor aktivitása. Ezen körülmények mellett a katalizátor három további cikluson keresztül változatlanul megtartja az aktivitását, s csak a 4. ciklusban kezd csökkenni a konverzió. Az enantioszelektivitás a recirkuláció során gyakorlatilag állandó értéken maradt, amiből arra következtettem, hogy a katalizátor szerkezete az újrahasznosítás további ciklusaiban sem károsodott.

80

100

Hozam (R+S; %)

80

60

20 °C, 50 bar

40

55 °C, 5 bar 55 °C, 2,5 bar

20

60 °C,2,5 bar 0 1

2

3

4

5

Ciklus (-)

3.1.6. ábra: A hozam változása K2 katalizátor újrahasznosítása során

93 92

ee (S, %)

91 90 89

55 °C, 5 bar 60 °C, 2,5 bar 55 °C, 2,5 bar

88 87 86 1

2

3 Ciklus (-)

4

5

3.1.7. ábra: Az enantioszelektivitás változása K2 katalizátor újrahasznosítása során A 4. ciklusban beinduló aktivitáscsökkenés annak tudható be, hogy az ionos folyadék és a ródium komplex is –kismértékben ugyan, de– oldódik az izopropanolban, ezt λ = 240 nm hullámhosszon végzett atomabszorpciós mérésekkel is igazoltam. További mérések során meghatároztam, hogy a reakció hőmérsékletén 100 g izopropanol 7 g [bmim]PF6 ionos folyadékot „old fel”, így egy reakcióciklus alatt 9 cm3 koszolvens kb. 0,5 cm3 ionos folyadékkal elegyedik, emiatt a 4. ciklus után az IL fázis mennyisége csak fele (1,5 cm3) lett a kiindulási 3 cm3-nek. Ez egyúttal a

81

katalizátorkomplex

mennyiségének

50%-os

csökkenését

is

jelenti.

Az

enantioszelektivitás állandó értéken maradásából viszont arra következtettem, hogy katalizátor minősége nem változott (csak a mennyisége csökkent kismértékben), azaz az ionos folyadék nem károsította a katalizátort.

3.1.4. A kísérleti eredmények összehasonlítása az irodalmi adatokkal

A mérési eredményeket az irodalomban fellelt adatokkal is összehasonlítottam. Az irodalmi részben részletesen kifejtettem, mely kutatók/kutatócsoportok milyen eredményeket értek el különböző prokirális olefinek és ketonok (enantio)szelektív hidrogénezése során (1.2. fejezet). Ezen irodalmi adatok közül a prokirális cisz acetamido-akrilsav-származékok (acetamido-fahéjsav, acetamido-akrilsav, valamint ezek metil-észterei; 3.1.8. ábra) hidrogénezésére

vonatkozó adatokat hasonlítottam

össze a saját méréseimmel (3.1.2. táblázat). R' H

NHCOOCH 3 COOR"

1 2 3 4

R' R' R' R'

= = = =

H, R" = H H, R" = Me Ph, R" = H Ph, R" = Me

3.1.8. ábra: A 3.1.2. táblázatban számmal jelölt szubsztrátumok képlete

Az AFSAV hidrogénezése során [bmim]PF6/IPA kétfázisú rendszerben 5 bar hidrogén nyomás és S/C = 200 mellett 1 óra reakcióidő alatt 97%-os hozamot és 88%os enantioszelektivitást sikerült elérnem. Ez lényegesen jobb, mint a Berger kutatócsoportja által erélyesebb reakciókörülmények (50, illetve 100 bar hidrogén nyomás) és nagyobb katalizátor koncentráció (S/C = 100) mellett 24 órás reakcióidő alatt elért 26, illetve 41%-os hozam, illetve az 50 baron általuk tapasztalt 81%-os enantioszelektivitás. A 100 baros nyomás mellett tapasztalt 90%-os enantioszelektivitás ugyanakkor csak kis mértékben haladja meg az általam tapasztalt értéket. [bmim]BF4/IPA rendszerben 5 bar hidrogén nyomás mellett és S/C = 200 mellett 1 óra reakcióidő alatt 100% hozamot és 91% ee-t sikerült elérnem. Berger kutatócsoportja ugyanebben a reakcióközegben 50 bar hidrogén nyomás és nagyobb katalizátor koncentráció (S/C = 100) mellett 24 órás reakcióidő alatt alacsonyabb, 73%-os hozamot ért el 93%-os ee mellett.. Kísérletei eredményeim a katalizátor recirkuláció terén szintén meghaladják a Berger kutatócsoportja által publikált eredményeket.

82

Az irodalomban tapasztalt eredményekkel összevetve tehát megállapítható, hogy méréseim során igen jó konverzió (több esetben 100%) mellett megfelelő enantioszelektivitású volt a hidrogénezési reakció, mindez viszonylag enyhe reakciókörülmények mellett, amit az egyik 2005-ös publikációmra való hivatkozás is alátámaszt (Durand, In Press). A katalizátort sikeresen használtam fel újabb reakcióciklusokban; ennek során csak a negyedik ciklusban kezdett kismértékben csökkenni a konverzió. Ez az arány az irodalmi adatokkal összevetve megfelelőnek tekinthető.

83

1

Szubsztrátum/Katalizátor mólarány

2005 500

2

[bmim]PF6/víz

84

500

2

500

2

[bmim]PF6/IPA

[bmim]PF6/dietil-éter

Wolfson,

n.a.

100

100

100

200

200

200

200

1

3

[bmim]BF4/IPA (1:3)

[bmim]PF6/víz (3:2)

3

4

[bmim]BF4/IPA (1:3)

[bmim]PF6/IPA (1:3)

3

[bmim]PF6/IPA (1:3)

3

3

[bmim]BF4/IPA (1:3)

[bmim]PF6/IPA (1:3)

3

[bmim]BF4/IPA (1:3)

200

(mol/mol)

-tum 3

S/C1

Szubsztrá

[bmim]BF4/IPA (1:3)

Reakcióközeg

Jessop 2003

Berger, 2001

Saját eredmények

hidrogénezése során

5

5

5

5

50

100

50

5

5

2,5

5

10

(bar)

pH2

20

20

20

20

20

20

20

70

55

55

55

22

T (°C)

0,3

0,3

0,3

n.a.

24

24

24

1

1

1

1

1

idő (h)

Reakc.

68 (66)

31 (30)

12 (12)

99

73 (35)

41

26

100

97

100 (37)

100 (78)

98

(rec.), %

Konverzió

96 (97)

95 (94)

96 (96)

85 (91)

93

90

81

87

88

92 (87)

91 (89)

90

(%)

ee (rec.)

2

2

2

6

5

1

1

1

1

5

5

1

száma

Ciklusok

3.1.2. táblázat: Mérési eredmények összehasonlítása az irodalomban közölt adatokkal különböző 2-szubsztituált akrilsav-származékok

Irodalmi adatok

3.2. Az etil-acetát enzimes előállítása ionos folyadékokban 3.2.1. A reakcióközeg hatása

A rendelkezésre

álló

hét

ionos

folyadékból

1

vol.% vizet

tartalmazó

reakcióelegyeket készítettem a 2.2. részben leírtak szerint, majd 20 g/dm3 enzimtartalmat beállítva, a reakcióedényeket 40 °C-on, 24 órán keresztül 150 1/perc sebességgel rázattam. A méréseket enzim hozzáadása nélkül is elvégeztem („vakpróba”). Az eredményeket a 3.2.1. ábrán mutatom be. 100 90

Etil-acetát hozam (%)

80 70

[bmim]PF6

[emim]ToS

60

[bmpyr]Tf2N

[bmim]MeSO4

[bmmmN]Tf2N 50 40 30 20 10 0 0

5

10

15

20

25

Reakcióidő (h)

3.2.1. ábra: Az etil-acetát hozam változása különböző ionos folyadékokban (40 °C, 1:5 sav/alkohol mólarány, 20 g/dm3 enzim, 1 vol% kezdeti víztartalom)

A reakcióidő-észterhozam diagramokon látható, hogy az enzim bizonyos ionos folyadékokban jól katalizálta a reakciót, míg más ionos folyadékokat „kevésbé tolerált”. [bmim]PF6-ban és a [bmpyr]Tf2N-ben a reakció nagy sebességgel és hozammal lejátszódott, ugyanakkor [bmim]BF4 és [bmpy]BF4 alkalmazása esetén nem keletkezett kimutatható mennyiségű észter. [emim]ToS-ban (és csak abban) a reakció enzim hozzáadása nélkül is hasonló sebességgel végbement (autokatalízis), ami jelen esetben nem jelent problémát, de szelektív észterezési reakciókban már nem előnyös, mivel a reakciót a szelektív enzim mellett maga az oldószer katalizálja, ami ronthatja a szelektivitást.

85

A reakciósebességben lévő eltérés magyarázata –legalábbis részben– az ionos folyadékok hidrofil/hidrofób jellegében rejlik. Mivel a tetrafluoro-borát anion jól elegyedik vízzel, az enzim hidratáltsága jóval kisebb mértékű, mint vízzel kevésbé elegyedő (pl. hexafluoro-foszfát aniont tartalmazó) ionos folyadékokban (a víz „jobban kedveli” az ionos folyadékot, mint az enzim felületét). Mivel az enzim így nincs megfelelően hidratálva, nem alakulhat ki aktív konformációja, így nem képes a reakciót katalizálni. Az enzimes reakcióban nemcsak az anionnak, hanem a kationnak is jelentős szerepe van: a [bmpyr]Tf2N-ben a reakció lényegesen nagyobb sebességgel játszódott le,

mint

az

ugyancsak

bisz(trifluoro-metil)szulfonil-imid

aniont

tartalmazó

[bmmmN]Tf2N-ben. Az

ionos

folyadékokban

elért

etil-acetát

hozamot

összehasonlítottam

az

irodalomban (Gubicza, 1992/b) fellelt, n-hexán oldószerben kapott eredménnyel (3.2.2. ábra). Az összehasonlításból látszik, hogy [bmim]PF6 ionos folyadékban magasabb hozam (93%) érhető el, mint a szerves oldószerek közül legjobbnak bizonyult nhexánban. [bmpyr]Tf2N alkalmazásával kissé alacsonyabb (81%) etil-acetát hozam érhető el, mint hexánban.

100 Észter hozam (24 h, %)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 F6 ]P m i m [b

n-

n* xá e h m [b

f2 r ]T y p

N [

im em

o ]T

S

N O4 f2 ]T eS N ]M m im m m m [b [b

3.2.2. ábra: Az etil-acetát hozamok összehasonlítása különböző oldószerekben a hozam szempontjából optimális reakciókörülmények mellett. (*irodalmi adat: Gubicza, 1992/b)

Az 1 óra reakcióidő utáni észter hozamokat (ekkor a reakció lefutása még a kezdeti, lineáris szakaszban van) összehasonlítva azt tapasztaltam, hogy ez [emim]ToSban a legmagasabb (30% körüli), azonban az ebben az esetben az autokatalízis is

86

szerepet játszott. [bmim]PF6-ban az 1 óra alatt tapasztalt észter hozam kb. 10%-kal volt alacsonyabb, mint n-hexánban, ugyanakkor a vizsgált ionos folyadékok közül háromban is magasabb volt az 1 óra alatt elért észter hozam, mint oldószermentes rendszerekben. Az 1 óra alatt elért észter hozamok közötti eltérés egy lehetséges magyarázata az, hogy az ionos folyadékok viszkozitása magasabb, mint a hagyományos szerves oldószereké (pl. hexán), így az oldószer fő tömegében végbemenő diffúzió is lassúbb, ami így behatárolja a reakciósebességet. Ezt a magyarázatot más kutatók is alátámasztják (Garcia, 2004). Oldószermentes rendszerben viszont a szubsztrátum-és termékgátlás csökkenti a reakciósebességet, ebben az esetben az ionos folyadék „hígítja” a rendszert, így növeli a reakciósebességet. 30

Észter hozam 1h (%)

25 20 15 10 5

m N ]T f

2N

4 [b m m

eS O

[2 ]

[b m im ]M

ol dó sz er m

en te s

f2 N

6

[b m py r]T

[b m im ]P F

[1 ] nhe xá n

[e m im ]T oS

0

3.2.3. ábra: A kezdeti reakciósebességek összehasonlítása különböző oldószerekben reakciósebesség szempontjából optimális reakciókörülmények mellett (irodalmi adatok: [1] Gubicza, 2000, [2] Bélafi-Bakó, 2003)

3.2.2. Az enzimkoncentráció hatása

Első kísérleteim során az észterezési reakció lefutását vizsgáltam különböző enzimtartalmak mellett [bmim]PF6 ionos folyadékban. A mérések célja elsősorban az volt, hogy megállapítsam, melyik az az enzimkoncentráció, illetve enzim/szubsztrátum arány, mely mellett a reakció jól követhető sebességgel lejátszódik. Túl alacsony enzimkoncentráció esetén ugyanis a reakciósebesség igen alacsony lehet, így 24 óra reakcióidő alatt nem is biztos, hogy a reakció eljut az egyensúlyi („steady state”)

87

állapotba. Ugyanakkor túlságosan magas enzimkoncentráció esetén csökken az elemzés pontossága, hiszen az első mintavétel során a konverzió már igen magas lehet. Ennek alapján négyféle, 10 g/dm3 és 50 g/dm3 közötti enzim koncentrációt állítottam be. A méréseket 40 °C-on 1:3 sav/alkohol mólarány és 2 vol% víztartalom mellett hajtottam végre. A mintavételek 1; 2; 3,5; 5; 10 és 24 h reakcióidő után történtek. A reakciók lefutási görbéi a 3.2.4. ábrán láthatók. 90 80 Etil-acetát hozam (%)

70 60 50 40

10 g/dm3

30

20 g/dm3 30 g/dm3

20

50 g/dm3 10 0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

Reakcióidő (h)

3.2.4. ábra: Az enzimkoncentráció hatása az etil-acetát hozamra (40 °C, 1:3 sav/alkohol mólarány, 2 vol% kezdeti víztartalom)

A lefutási görbéken látható, hogy az elért etil-acetát hozam minden esetben 84-86% közötti volt, ugyanakkor a reakciósebességet jelentősen befolyásolta az enzim koncentrációja. Ugyanakkor az is látható, hogy 10 g/dm3 enzim koncentrációnál az észter hozamának növekedése az első három órában lineáris, míg 50 g/dm3 enzim koncentrációknál csak az első 30 perc reakcióidő alatt tekinthető lineárisnak a reakció lefutása. Az első két mintavétel során kapott pontra origót metsző egyenest illesztettem, ezt extrapoláltam és meghatároztam a meredekségét. A meredekségből a kezdeti reakciósebességeket számítottam, melyeket az enzimkoncentráció függvényében ábrázoltam (3.2.5. ábra). Jól látható, hogy míg alacsonyabb enzimtartalomnál (10-30 g/dm3) a kezdeti sebesség-értékek egy origót metsző egyenesre illeszkednek, ennél nagyobb enzimtartalmaknál azonban a reakciósebesség növekedése a biokatalizátor koncentrációjával már nem lineáris. Ennek elsősorban az lehet az oka, hogy ezekben a tartományokban az enzimkoncentráció már olyan magas, hogy a „szabad” katalitikus

88

kötőhelyek száma a „foglaltakéhoz” képest jelentősen magasabb, így a szubsztrátum könnyebben talál szabad enzimet (egyre kevésbé alakul ki „verseny” a szabad helyekért), tehát a reakciósebesség egyre kevésbé függ az enzimkoncentrációtól. 10

8

(mmol(dm3min)-1)

Kezdeti reakciósebesség

9

7 6 5 4 3 2 1 0 0

10

20

30

40

50

60

3

Enzimkoncentráció (g/dm )

3.2.5. ábra: A kezdeti reakciósebesség az enzimkoncentráció függvényében ([bmim]PF6 reakcióközeg, 40 °C, 1:3 sav/alkohol mólarány, 2 vol% kezdeti víztartalom)

Érdekes jelenség, hogy az enzimkoncentráció növelésével az egyensúlyban elért hozam enyhe (2-3%-os) csökkenést mutatott. Ennek valószínűleg az lehetett az oka, hogy az enzim hordozója kismértékben ugyan, de adszorbeálta a terméket, ilyen módon csökkentette a koncentrációját az oldatban. Az értékekből azonban az is látszik, hogy ez a csökkenés annyira kis mértékű (összemérhető a hibahatárral), hogy a reakció lefutási görbéinek alakját szignifikánsan nem befolyásolta. Összegezve: az enzimkoncentráció vizsgálatánál azt állapítottam meg, hogy a reakció mind 10 g/dm3 és 20 g/dm3 enzimkoncentráció esetén jól követhető sebességgel játszódik le. Nagyobb enzimkoncentrációknál a követhetőség romlik, illetve az etilacetát adszorpciója miatt csökken a pontosság, emellett a reakcióelegy állaga (túlságosan nagy koncentrációban jelen lévő, duzzadt enzimszemcsék) miatt kevésbé előnyös az alkalmazása. A lehetséges későbbi technológiai alkalmazás során a gazdasági

érdek

is

egyértelműen

megkívánja

a

lehető

legalacsonyabb

enzimkoncentrációt, mely mellett még megfelelő sebességgel játszódik le a reakció. Mindezek miatt további méréseim során 10 g/dm3 enzimkoncentrációt alkalmaztam.

89

3.2.3 Az alkohol- és a savfelesleg hatása

Mivel az észterezés egyensúlyi reakció, az egyik szubsztrátum feleslegben való alkalmazása a Le Chatelier-Brown elv értelmében növeli a hozamot. A savak azonban általában erősen gátló hatásúak az enzimekre nézve. Méréseim során a minden reakcióelegyben ugyanakkora savkoncentrációt (0,786 mol/dm3) alkalmaztam. Ehhez képest különböző etanol mennyiségek hozzáadásával vizsgáltam, hogy 6:1, 3:1, 1:1, 1:2 és 1:4 alkohol/sav mólarány (A/S arány) esetén hogyan változik a reakció lefutása. A különböző összetételű elegyekben lejátszódó reakció lefutását mutatja a 3.2.6. ábra. 100 90

Etil-acetát hozam (%)

80 70 60 50 40 30 20 10

1:2

1:4

3:1

6:1

1:1

0 0

5

10

15

20

25

Reakcióidő (h)

3.2.6. ábra: A reakció lefutása különböző A/S mólarányok mellett ([bmim]PF6 reakcióközeg 40 °C, 10 g/dm3 enzim, 2 vol% víz)

Amennyiben az ecetsav koncentrációja magasabb volt, mint az etanolé, az észter hozam 65% alatt volt; a legmagasabb hozam 1:2 A/S arány esetén volt (65%). Ez egyértelműen alátámasztja, hogy az ecetsavnak ionos folyadék reakcióközegben is jelentős enzimgátló hatása van. Alkoholfelesleg esetén, az alkoholfelesleg növelésével (A/S arány növelésével) az észter hozama monoton növekedést mutatott, azonban az 1 óra reakcióidő alatti észter hozamnak 3:1 A/S aránynál maximuma volt (3.2.7. ábra). Ez annak tudható be, hogy az etanol szintén szubsztrátum-inhibíciót okoz, azonban ez a gátló hatás közel sem annyira

90

erőteljes, mint az ecetsavé. Ez korrelál az irodalomban fellelt adatokkal (Gubicza, 1992, Nemestóthy, 2004, Kabiri Badr, 2005) is. Kísérleteim során tehát megállapítottam, hogy az etanolt érdemes fölöslegben alkalmazni az egyensúly eltolása céljából, mivel így érhető el magas, 85-90%-os hozam. A legnagyobb reakciósebességet 3:1 A/S arány esetében tapasztaltam, ennél nagyobb alkoholfelesleg esetén az etanol gátló hatása is érvényesül, ami csökkenti a reakciósebességet. Ennek alapján az optimális A/S arányt 3:1-nek állapítottam meg, és további méréseim során is ezt az alkoholfölösleget alkalmaztam. 100 90

Etil-acetát hozam (%)

80 70 60

24 h

50

1h

40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

7

A/S arány (m ol/m ol)

3.2.7. ábra: Az A/S arány hatása az 1, valamint 24 óra reakcióidő után mérhető észter hozamra ([bmim]PF6 reakcióközeg, 40 °C, 10 g/dm3 enzim, 2 vol% víz)

3.2.4. A hőmérséklet hatása

A mérések során a továbbiakban azt vizsgáltam, hogy a hőmérséklet hogyan befolyásolja a reakció lefutását. A reakcióelegyben az A/S arány 3:1 volt, a víztartalmat 2 vol. %-ra állítottam be. Négy különböző hőmérsékleten (30, 40, 50 és 60 °C) vizsgáltam az enzimes észterezés lejátszódását (3.2.8. ábra).

91

100 90

Etil-acetát hozam (%)

80 70 60 50 40

30 °C

40 °C

50 °C

60 °C

30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Reakcióidő (h)

3.2.8. ábra: A reakció lefutása különböző hőmérsékleteken ([bmim]PF6 reakcióközeg, 3:1 A/S arány, 2 vol% kezdeti víztartalom)

A különböző hőmérsékleteken mért kezdeti reakciósebességek alapján a reakció aktiválási energiája az Arrhenius-egyenlettel számítható1. Az 1 óra után tapasztalt észter hozam természetes logaritmusát a Kelvinben mért hőmérséklet reciprokának a függvényében ábrázoltam és a kapott pontokra egyenest illesztettem. (3.2.9. ábra). 3,7

ln (észter hozam 1h (%))

3,6

y = -2044,5x + 9,6717

3,5

R2 = 0,9959

3,4 3,3 3,2 3,1 3 2,9 2,8 2,7 0,0030

0,0030

0,0031

0,0031

0,0032

0,0032

0,0033

0,0033

0,0034

1/T (1/K)

3.2.9. ábra: A kezdeti reakciósebesség logaritmusának változása a hőmérséklet reciprokának függvényében 1

A számítás menete a „Definíciók és rövidítések” fejezetben található

92

Az egyenes meredekségéből az aktiválási energiát a következőképpen számítottam:

Ea J = −2606,9 → E a = 2606,9 K × 8,314 = 21,7 kJ / mol R molK

(3)

Ugyanezen enzimes észterezési reakció aktiválási energiáját korábban n-hexán reakcióközeg valamint oldószermentes szintézis esetén is meghatározták (Gubicza, 1992; Badr, 2005). A három reakcióközeget összehasonlítva (3.2.1. táblázat) látható, hogy a reakció aktiválási energiája ionos folyadékban a legalacsonyabb.

3.2.1. táblázat: Az etanol ecetsavval történő enzimes észterezésének keletkezésének aktiválási energiája különböző reakcióközegekben (irodalmi adatok: [1] Gubicza, 1992, [2] Badr, 2005) Reakcióközeg

Aktiválási energia (kJ/mol)

[bmim]PF6 ionos folyadék

21,7

n-Hexán [1]

30,6

Oldószermentes (alkoholfelesleg) [2]

52,8

3.2.5. A víztartalom hatása

Az enzimkatalitikus reakciók lejátszódásához rendszerint víz kell. Nemkonvencionális, azaz nem vizes közegben kis mennyiségű, mindösszesen néhány térfogat %-os vagy néhány tized térfogat%-os víztartalomra van szükség az enzim megfelelő hidratáltságához. Az optimális víztartalom értéke függ az enzim típusától, koncentrációjától, a szubsztrátumok koncentrációjától és természetesen az oldószer típusától, annak hidrofil vagy hidrofób jellegétől. Méréseim során azt vizsgáltam, hogy a víztartalom hogyan befolyásolja a reakció lefutását, azaz a kezdeti reakciósebességet és az egyensúlyi konverzió értékét. Itt hangsúlyozom, hogy méréseim során természetesen csak a kezdeti víztartalmat tudtam beállítani, mivel a reakcióelegy víztartalma az észterezési reakció lejátszódása során folyamatosan növekszik. A víztartalom állandó értéken tartásával (pl. pervaporáció útján) a reakciókörülmények tovább optimalizálhatók (l. következő fejezet). A méréseket 40 °C-on, 10 mg/ml enzimkoncentráció és 3:1 A/S arány mellett végeztem. A mérések eredményei 3.2.10. ábrán láthatók.

93

100 90

Etil-acetát hozam (%)

80 70 60 50 0,5 vol.% 1 vol.%

40

2 vol.% 30

3 vol.% 5 vol.%

20 10 0 0

5

10

15

20

25

Reakcióidő (h)

3.2.10. ábra: A kiindulási víztartalom hatása az etil-acetát hozamra ([bmim]PF6 reakcióközeg, 10 g/dm3 enzim, 1:3 S/A arány, 40 °C)

A víztartalom változtatásával egyidejűleg két ellentétes hatás érvényesül (3.2.11. ábra). Ha a víztartalmat növelem, nő az enzim hidratáltságának a mértéke, illetve a 100 90

Etil-acetát hozam (%)

80 70 60 50

1h

40

24h

30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

Víztartalom (vol.%)

3.2.11. ábra: A kiindulási víztartalom hatása az 1 óra alatt elért észter hozamra ([bmim]PF6 reakcióközeg, 10 g/dm3 enzim, 40 °C, 1:3 sav/alkohol mólarány)

94

hidratált (aktív állapotban lévő) enzim koncentrációja. Ez –egy bizonyos víztartalomértékig– növeli a reakciósebességet. Másrészt viszont, a víztartalom növelése az egyensúlyt a hidrolízis irányába tolja el, ami a szubsztrátumok konverzióját, azaz az etil-acetát hozamot csökkenti. Amennyiben tehát az enzim teljes mennyisége kellőképpen hidratálódott, további víz hozzáadása már mind a reakciósebességet, mind a hozamot is csökkenti. Így a kezdeti sebességet ábrázoló diagram haranggörbe alakú, melynek optimuma ebben az esetben 2 vol.% víztartalomnál van (3.2.11. ábra). A továbbiakban azt vizsgáltam, hogy hogyan lehet ezt az enzim számára kedvező víztartalmat a reakció során fenntartani. Erre egy kíméletes, alacsony hőmérsékleten is jól alkalmazható módszert, a pervaporációt alkalmaztam. Megfelelő membrán alkalmazásával nemcsak a víz, hanem az észter is eltávolítható a rendszerből, azaz lehetőség van egy folyamatos rendszer kialakítására.

95

3.3. Az etil-acetát előállítása [bmim]PF6 ionos folyadékban, folyamatos rendszerben Észterek enzimes előállításának folyamatossá tétele során a termékek elvételét, valamint a kétféle szubsztrátum adagolását úgy kell megvalósítani, hogy a szubsztrátumok koncentrációja közel állandó, azaz időben kvázi-stacionárius legyen. A termékek eltávolítására több módszer is létezik, (pl. desztilláció, adszorpció, membrán eljárások), melyek közül egy kíméletes és hulladékszegény módszert, a pervaporációt választottam. A vizet hidrofil, az etil-acetátot hidrofób membránnal távolítottam el. A berendezés vázlata a 2.3.1. ábrán látható. Kísérleteim során először a membránok szelektivitását, illetve a membránon átjutó komponensek fluxusát mértem ki különböző hőmérsékleten. A mérésekhez enzim nélküli „vak” reakcióelegyeket alkalmaztam, így –mivel észter nem keletkezhetett– a reakcióelegy és a permeátumok analízisével, anyagmérleg segítségével minden tömegáramot meghatározhattam. Ezt követően került sor az enzimes mérésekre.

3.3.1. Membránok fluxusának és szelektivitásának mérése „vak” modellelegyekkel

A membránok vizsgálatához olyan modellelegyet készítettem, mely a reakcióelegy minden komponensét tartalmazta, kivéve az enzimet, így az észterezési reakció nem, vagy csak nagyon kis (elhanyagolható) mértékben játszódhatott le. A mérési eredmények értékelése során a következőket feltételeztem: 1. A reakció lejátszódása elhanyagolható 2. A hidrofil membránon az etil-acetát fluxusa elhanyagolható (mérések alapján igazoltam) 3. A hidrofób membránon a víz fluxusa elhanyagolható (mérések alapján igazoltam) A modellelegy térfogata 100 cm3, összetétele a 60%-os konverziónak megfelelő reakcióelegy volt (3.3.1. táblázat). A pervaporáció során 2 óránként vizsgáltam a keringetett elegy összetételét, a permeátumokat pedig 8 óra után elemeztem.

A

komponensek koncentrációváltozását az idő függvényében ábrázoltam (3.3.1. ábra). Látható, hogy a pontokat összekötő görbék egyenessel közelíthetők, így az egyenes meredekségéből a fluxus számítható volt.

96

3.3.1. táblázat: A fluxus meghatározásához használt modell reakcióelegy összetétele Komponens

c

n (mmol)

m (g)

Tömeg %

Ecetsav

0,4×0,786 (mmol/cm3)

31,4

1,89

1,6

Etanol

2,4×0,786 (mmol/cm3)

188,6

8,69

7,2

2% vol. = 20 mg/cm3

158,3

2,85

2,4

Etil-acetát

0,6×0,786 (mmol/cm3)

47,2

4,16

3,5

[bmim]PF6

maradék

360,4

102,42

85,4

Víz

A grafikonokon az is látszik, hogy a membránok eltávolították a vizet és az etilacetátot, ugyanakkor az etanol és az ecetsav koncentrációcsökkenése elhanyagolható volt. Ez azt jelenti, hogy a membránok jó szelektivitással távolították el a reakció termékeit. 2,0

Koncentráció (mol/dm 3)

1,8 y = -0,0084x + 1,8823 R2 = 0,9625

1,6 1,4

Etanol

Ecetsav

Víz

Etil-acetát

y = -0,0895x + 1,5851 R2 = 0,9950

1,2 1,0 0,8

y = -0,0515x + 0,4644 R2 = 0,9962

0,6

y = -0,0020x + 0,3206 R2 = 1,0000

0,4 0,2 0,0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

idő (h)

3.3.1. ábra: A komponensek koncentrációváltozása a pervaporáció során

A hűtött csapdákban összegyűlt permeátum elemzésével, valamint tömegmérleg felállításával

meghatároztam

a komponensek

fluxusát, illetve a membránok

szelektivitását.

Hidrofil membrán fluxusa és szelektivitása A 8 h pervaporációs időtartam alatt összegyűlt permeátum összetételét, a víz fluxusát és a szelektivitást a 3.3.2. táblázat mutatja. Megállapítható, hogy a

97

permeátumba kerülő 42 mg ecetsav és 71 mg etanol mennyisége a teljes reakcióelegy mennyiségéhez képest elhanyagolható, ugyanakkor víz fluxusa két nagyságrenddel nagyobb, mint az ecetsavé, illetve az etanolé, tehát a membrán szelektivitása céljainkra jól megfelel.

3.3.2. táblázat: A komponensek fluxusa (F) a hidrofil membránon és a membrán szelektivitása αvíz/komp.1

Kom-

n

Tömeg

Tömeg

dn/dt

F

ponens

(mmol)

(mg)

%

(mmol/h)

(mmol/m2×h)

Víz

71,99

1295,8

91,9

9,00

447,7

-

Ecetsav

0,71

42,3

3,0

0,09

4,4

20,4

Etanol

1,55

71,3

5,1

0,19

9,6

54,5

Hidrofób membrán vizsgálata A hidrofób membrán permeátumának összetétele; az etil-acetát és a többi komponens fluxusa, valamint a membrán szelektivitása a 3.3.3 táblázatban látható. Itt is csak csekély mennyiségű (kb. 55 mg) ecetsav jutott át a szekunder oldalra. Az etanolból kissé nagyobb mennyiség jutott át (permeátum 6,5 tömeg%-a etanol), de a tervezett élelmiszeripari felhasználás (gyümölcsaroma előállítás szeszes italok ízesítésére) szempontjából ez nem jelent nagyobb problémát.

3.3.3. táblázat: A komponensek fluxusa a hidrofób membránon és a membrán szelektivitása αetac/komp.1

Kom-

n

Tömeg

Tömeg

dn/dt

F

ponens

(mmol)

(mg)

%

(mmol/h)

(mmol/m2×h)

acetát

40,83

3597,2

92,08

5,10

4289,0

-

Etanol

5,54

255,0

6,53

0,69

581,4

29,3

Ecetsav

0,91

54,5

1,40

0,11

95,4

30,4

Etil-

1

Szelektivitási tényező (l. 2.3.2. fejezet)

98

3.3.2. Szakaszos kísérletek pervaporációval

A kísérletek során a keringetett elegyből már pervaporációval eltávolítottam az etilacetátot valamint a vizet, ugyanakkor szubsztrátum rátáplálás nem történt. A mérések során a következőket feltételeztem: 1. Az ecetsav és az etanol nyelője a reakció, a mebránokon átjutó anyagmennyiség elhanyagolható, 2. az etil-acetát és a víz forrása a reakció, 3. az etil-acetát és a víz nyelői a membránok. A kísérleteket 50 °C-on hajtottam végre. A reakció lefutását a 3.3.2. ábra szemlélteti. Látható, hogy az etanol és az ecetsav koncentrációja csökkent, mivel a reakció során a szubsztrátumok fogytak, betáplálás pedig nem volt. A termékek közül az etil-acetát koncentrációja kezdetben nőtt, majd kb. 5 óra reakcióidő után (kb. 70% ecetsav konverziónál) maximumot ért el, ezután enyhe csökkenésnek indult.

A

víztartalom ezzel szemben szinte folyamatosan csökkent (csak az első 2 óra során tapasztaltam enyhe növekedést), ami azt mutatja, hogy kb. 40% ecetsav konverziót elérve a víz eltávolítása nagyobb anyagárammal ment végbe, mint ahogy az a reakció során keletkezett. 2,5

Koncentráció (mol/dm3)

2,0

Etanol

Ecetsav

Víz

Etil-acetát

1,5

1,0

0,5

0,0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

idő (h)

3.3.2. ábra: A koncentrációk változása az idő függvényében a pervaporáció ideje alatt

99

3.3.3. Folyamatos rendszer kiépítése

A folyamatos rendszer kiépítésének legutolsó lépcsője a szubsztrátumok adagolásának (betáplálásának) megvalósítása. Ezzel egy olyan rendszer hozható létre, melyben a következők érvényesülnek: 1. Az etanol és ecetsav nyelője a reakció, melynek sebességei: d [ Et ] d [ ES ] ; v rES = − . A reakcióegyenlet alapján: v rEt = v rES dt dt

v rEt = −

(4)

2. Az etanol és az ecetsav forrása a betáplálás, melynek a dimenziója szintén (mol/s): d [ Et ] d [ ES ] ; R ES = dt dt

R Et =

(5)

3. Az etil-acetát és a víz forrása a reakció: v rTtAc =

d [ EtAc] d [víz ] ; v rvíz = . A reakcióegyenlet alapján v rEtAc = v rvíz dt dt

(6)

4. Az etil-acetát és a víz nyelői a membránok: v Et p =

d [ EtAc] d [víz ] = FEtAc × Amhidrofób ; v víz = Fvíz × Amhidrofil , p dt dt

(7)

ahol vp a pervaporáció sebességét jelöli, FEtAc és Fvíz az etil-acetát és a víz fluxusai (mol/m2×s), Am a membrán felülete (m2). A folyamatos rendszer fenntartásának három kritériuma van: 1. A szubsztrátumok rátáplálását (R) a fogyásuk ütemében kell végezni, azaz: v rEt = R Et ; v rES = R ES

(8)

2. A termékeket a keletkezésüknek megfelelően kell elvonni a rendszerből:

v rEtAc = −v EtAc ; v rvíz = −v víz p p

(9)

3. Ne változzon az enzim aktivitása (ill. dezaktiválódás esetén gondoskodni kell friss enzim betáplálásáról) A három kritérium teljesülése esetén a rendszerben a komponensek koncentrációja időben állandó (illetve legfeljebb csak kis mértékben ingadozik, azaz kvázistacionárius). Hogy az említett egyensúlyi kritériumok teljesüljenek, adott összetételű elegyet kellett fenntartani a reakcióedényben. Ezen egyensúlyi koncentrációk meghatározásához a 3.3.2. ábrát használtam fel. Első lépés a „szűk keresztmetszet” meghatározása volt. Mint korábban megállapítottam, a pervaporáció során a víz anyagárama 9,00 mmol/h, az etil-acetáté

100

pedig 5,10 mmol/h (3.3.2. ábra). Ennek alapján –mivel a reakcióegyenlet szerint a víz keletkezésének sebessége megegyezik az etil-acetát keletkezésének sebességével– a rendszer szűk keresztmetszete a hidrofób membrán. A legjobb etil-acetát kinyerés melletti folyamatos rendszer tehát úgy valósítható meg, ha a hidrofób membrán folyamatosan vákuum alatt van, a hidrofil membránt a víz keletkezésének megfelelően szakaszosan üzemeltetem. (A membrán felülete adott volt.) A munkaponton az etil-acetát keletkezése ugyanolyan sebességű, mint az elvétele. A 3.3.2. ábrán látható, hogy ez akkor teljesül, ha az etil-acetát koncentrációját jelző görbéhez húzott érintő vízszintes, azaz deriváltja (dn/dt)=0. Ez t = 4,95 h ≈ 5h reakcióidő után következik be. A munkaponthoz tartozó egyensúlyi koncentrációkat és móláramokat a 3.3.4. táblázat mutatja.

3.3.4. táblázat: Az egyensúlyi pontban mért koncentrációk és a koncentrációk deriváltjai

Komponens

n (mmol)

c (mol/dm3)

dn/dt (mmol/h)

Etanol

153

1,53

-4,5

Ecetsav

16

0,16

-4,5

Víz

114

1,14

-5,0

Etil-acetát

45

0,45

0,0

Mivel az egyensúlyi ponton a víz koncentrációjának csökkenése d[víz]/dt = -5,0 mmol/h

(pervaporáció

+

keletkezés

reakcióban),

a

pervaporáció

során

az

anyagtranszport pedig d[víz]/dt = -9,0 mmol/h volt, a pervaporáció időtartama a következőképpen számítható:

tp =

9,0 − 5,0 ≈ 0,44 9,0

(10)

Ez alapján a teljes membránfelület 44%-ra van csak szükségem, de mivel a membrán modul (így a membrán felülete is) adott volt, a kvázi-stacionárius állapot úgy valósítható meg, ha a teljes reakcióidő 44%-ában nyitom csak a hidrofil membránra a vákuumot. Ezt a gyakorlatban úgy valósítottam meg, hogy 4,5 percig vákuumoztam a rendszert, 5,5 percig pedig elzárva tartottam a csapot. A kísérlet során ugyanazt a kezdeti elegyet mértem be, mint a többi esetben (2.3.2. táblázat), a koncentrációkat 2 óránként mértem, a kapott eredményeket a 3.3.3. ábra mutatja.

101

Korábbi kísérletek bizonyítják, hogy a Candida antarctica aktivitáscsökkenése ionos folyadékokban igen lassú (Lozano, 2005), így feltételeztem, hogy a kísérlet ideje alatt az enzim dezaktiválódása elhanyagolható.

Koncentráció (mol/dm 3)

2,5

2,0

Etanol

Etanol szint

Ecetsav

Ecetsav szint

Víz

Víz szint

Etil-acetát

EtAc szint

1,5

1,0

0,5

0,0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

idő (h)

3.3.3. ábra: A komponensek koncentrációváltozása az etil-acetát folyamatos üzemű enzimes előállítása során

A 3.3.3. ábrán látható, hogy a rendszerben a rátáplálás és a termék elvétel következtében a 6 és 20 óra üzemidő közötti időszakban valóban kvázi-stacionáriusan változtak a koncentrációk. Ehhez hasonló integrált rendszerben történő enzimes etil-acetát szintézist ionos folyadék reakcióközegben korábban –az irodalom áttanulmányozása alapján– eddig még senki sem valósított meg. Megfelelő méretezéssel (itt elsősorban nagyobb méretű membránokra gondolok) nagyobb mennyiségű termék nyerhető ki, ami esetleg későbbi ipari alkalmazást is lehetővé tehet.

102

3.4.

2-Cl-propionsav

enzimes

észterezése

n-butanollal

ionos

folyadékokban Az etil-acetát enzimes előállításának tanulmányozása után egy királis karbonsav, a 2-klór-propionsav n-butanollal való enzimatikus észterezését vizsgáltam ionos folyadék reakcióközegben. Ennek során elsősorban a következőkre terjedt ki a figyelmem: 1. A reakció lefutásának vizsgálata különböző ionos folyadékokban, az eredmények összevetése hagyományos szerves oldószer reakcióközeg és oldószermentes rendszerben tapasztalt eredményekkel. 2. Az enzim recirkulációjának (új reakcióciklusban való felhasználásának) lehetősége és az aktivitáscsökkenés vizsgálata ionos folyadékban és szerves oldószerekben; az eredmények összehasonlítása. 3. A kezdeti víztartalom hatása a hozamra és a reakciósebességre, optimális kezdeti víztartalom meghatározása rázatott lombikos kísérletekben. 4. A

pervaporációval

történő

víztartalom-szabályozás

vizsgálata,

mérések

különböző konstans víztartalmak mellett, ennek alapján az optimális konstans víztartalom meghatározása. A vizsgálatnak tehát nem volt tárgya az enantioszelektivitás vizsgálata, ez egy másik disszertáció (Ulbert, 2007) témája.

3.4.1. Reakcióközeg hatása

A kísérleteket minden esetben 40 °C reakcióhőmérsékleten, 0,3 vol.% kezdeti víztartalom, 6:1 alkohol/sav mólarány (A/S arány) és 10 g/dm3 enzimkoncentráció mellett végeztem el. A reakcióközeg hatását háromféle ionos folyadékban ([bmim]BF4, [bmim]PF6 és [onim]PF6) és háromféle szerves oldószerben (hexán, toluol, tetrahidrofurán) teszteltem. A bemérések a 2.4.2. táblázatban találhatók. A reakció lefutását az idő függvényében a 3.4.1. ábra mutatja. A szerves oldószerek közül toluolban és n-hexánban tapasztaltam nagy hozamot. Az ionos folyadékok közül [bmim]PF6-ban játszódott le leggyorsabban és legnagyobb hozammal az észterezés. [onim]PF6-ban alacsonyabb reakciósebességet tapasztaltam, míg [bmim]BF4-ben a hozam 24 óra alatt sem érte el a 10%-ot.

103

60

(R,S )-észter hozam (%)

50

40

30

20

n-Hexán

Toluol

Dibutil-éter

[bmim]PF6

[onim]PF6

[bmim]BF4

10

0 0

5

10

15

20

25

Reakcióidő (h)

3.4.1. ábra: (R,S)- butil-2-klór-propionát hozam az reakcióidő függvényében különböző szerves oldószerekben és ionos folyadékokban (40 °C, 10 g/dm3 enzim, 6:1 A/S arány, 0,3 vol% víztartalom)

Mint látható, a reakció sebességét az ionos folyadék típusa erősen befolyásolta. A hosszabb alkil-oldalláncokat tartalmazó [onim]PF6-ban a reakció lassabban játszódott le, mint [bmim]PF6-ban és 24 óra reakcióidő alatt 42% észter hozamot tapasztaltam. Ez valószínűleg annak köszönhető, hogy az oktil- és a nonilcsoport nagy mérete miatt a transzportfolyamatok (szubsztrátum vándorlása az enzimhez, illetve a termékek transzportja az oldat fő tömegébe) lassabbak. Ezt az indoklást mások megfigyelései is alátámasztják (Garcia, 2004). Az ionos folyadékok közül [bmim]BF4-ben 10% alatt maradt az észter hozam, hasonlóan az etil-acetát előállítása során tapasztaltakkal. Így a Candida antarctica lipázhoz hasonlóan (3.2. fejezet) a Candida rugosa is csak olyan ionos folyadékokban képes fölvenni a natív konformációját, melyekben a vizet kevésbé megkötő negatív ion (pl. hexafluoro-foszfát) található a pozitív ion mellett. Ennél „hidrofilebb” jellegű ionos folyadékokban (pl. acetát, nitrát vagy tetrafluoro-borát aniont tartalmazóknál) azonban az ionos folyadék elszívja a vizet az enzim környezetéből, azaz a víz nagyobb koncentrációban van jelen az oldat fő tömegében, mint az enzim közvetlen környezetében. (Lau, 2004, részletesen l. az 1.3. fejezetben).

104

A különböző reakcióközegekben tapasztalt enantioszelektivitást (a kedvezményezett észter (R) konfigurációjú) és a hozamot a 3.4.1. táblázat mutatja. Az eredményeken látható, hogy [onim]PF6 és [bmim]PF6 ionos folyadékokban az enzim lényegesen szelektívebb, mint a szerves oldószerekben (Ulbert, 2004).

3.4.1. táblázat: Az 1 és 24 h reakcióidő alatti észter hozam valamint az enantioszelektivitás változása különböző reakcióközegekben a 2-klór-propionsav nbutanollal való észterezése során (40 °C, 10 g/dm3 enzim, 6:1 A/S arány, 0,3 vol% víz)

Reakcióközeg Észter hozam (1 h, %)

Észter hozam (24 h, %)

E*(-)

[omim]PF6

6

41

25

[bmim]PF6

16

51

20

[bmim]BF4

<1

10

6

n-Hexán

21

52

10

Toluol

9

49

5

Dibutil-éter

<1

12

5

*irodalmi adat (Ulbert, 2004) Az 1 óra reakcióidő alatt elért hozamokat összehasonlítva az látható, hogy a [bmim]PF6-ban a reakció kb. 25%-kal lassabban játszódik le, mint a szerves oldószerek közül „legjobbnak” bizonyult n-hexánban. Mindazonáltal az erősen hidrofil jellegű [bmim]BF4-ben a reakciósebesség igen csekély, közel 2 nagyságrenddel kisebb, mint nhexánban. Ionos folyadékokban már az etil-acetát észterezésének vizsgálata során is kisebb reakciósebességet tapasztaltam, mint n-hexánban (l. 3.2. fejezet); a jelenség az ionos folyadékok magasabb viszkozitása következtében lassuló anyagtranszportfolyamatoknak tudható be (Garcia, 2004). Biotechnológiai alkalmazásokban az enzim stabilitása fontos kérdés. Kísérleteim során az enzim stabilitását (visszaforgathatóságát) hasonlítottam össze [bmim]PF6 és nhexán reakcióközegekben. Az aktivitáscsökkenés mérése során az enzimet a reakció lejátszódása után leszűrtem, majd friss reakcióelegyhez adagoltam (részletesen a 2.4. fejezetben). Az enzim recirkulációja során egy, az enzimaktivitással egyenes arányban álló paramétert, az 1 h reakcióidő alatt elért észter hozamot hasonlítottam össze minden esetben a kiindulási értékekkel. Az értékelés során relatív értékekkel számoltam, az 1. ciklusban az aktivitást tekintettem 100%-nak, és a kezdeti sebességeket minden esetben

105

az 1. ciklusban kapott értékekkel hasonlítottam össze, így kaptam meg az újrahasznosítás utáni relatív, „megmaradó” aktivitást („residual activity”). A mérési eredményeket a 3.4.3. ábra mutatja. Látható, hogy az enzim 6 ciklus (5 újrahasznosítás) után [bmim]PF6 ionos folyadékban mindösszesen kb. 7%-ot veszített aktivitásából, míg a hagyományos szerves oldószerben az aktivitáscsökkenés elérte a 40%-ot, ami azt jelenti, hogy ciklusonként közel 10%-ot veszített aktivitásából. Ennek alapján megállapítható, hogy a Candida rugosa enzim aktivitáscsökkenése ionos folyadékban lényegesen lassabb, mint szerves oldószerekben, Hasonló eredményeket publikált 2005-ben Ulbert is (Ulbert, 2005). 100

Relatív aktivitás (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

[bmim]PF6 Hexán

1

2

3

4

5

6

Ciklus (-)

3.4.3. ábra: Az enzimaktivitás csökkenése a visszaforgatás során az egyes ciklusokban (1. ciklus = 100%, [bmim]PF6, 40 °C, 10 g/dm3 enzim, 6:1 A/S arány, 0,3 vol% víz)

3.4.2. Konverzió növelése pervaporációs vízeltávolítással

Mint az etil-acetát enzimes előállításánál is látható volt, a reakciósebesség egy optimális enzim hidratáltságnál, így egy meghatározott víztartalom (vízaktivitás) mellett a legnagyobb. Az észterezési reakció során azonban a víztartalom változik (víz keletkezik), ami az észterezés egyensúlyát kedvezőtlen irányba tolja el, így az optimális hidratáltság fenntartásához a keletkező vizet el kell távolítani. Ugyanezt a módszert korábban az etil-acetát folyamatos előállításánál (3.3. fejezet) is ismertettem, igaz, akkor mindkét terméket kivontam a rendszerből. Tekintettel arra, hogy olyan pervaporációra alkalmas membrán, ami a butil-2-klór-propionátot szelektíven eltávolítaná, még nem áll rendelkezésre, itt csak a vizet távolíthattam el a rendszerből. Folyamatos rendszer

106

kialakítására (mindkét termék eltávolítása) desztillációs termékeltávolítással van lehetőség (Gubicza, 1992). A konstans víztartalom fenntartása ugyanakkor jelentősen növeli a hozamot és a reakciósebességet, így mindenképpen fontosnak tartom megemlíteni az így elért eredményeket. A kísérletek üteme a következő volt: 1. Reakció vizsgálata pervaporáció nélkül különböző kezdeti víztartalmak mellett 2. Membrán

fluxusának

és

szelektivitásának

mérése

enzim

nélküli

modellelegyekkel 3. Reakció vizsgálata különböző konstans víztartalmak mellett A víztartalom hatását a korábbi irodalmi adatok (Gubicza és Szakács-Schmidt, 1995/b) alapján 0,1-0,6 vol.% intervallumban vizsgáltam. A kísérletek során vizsgáltam a víztartalom észter hozamra valamint a kezdeti reakciósebességre gyakorolt hatását. Az enantioszelektivitás (ee%) változását ezen kísérleteim során nem vizsgáltam.

Reakció vizsgálata pervaporáció nélkül A reakciót minden esetben úgy hajtottam végre, hogy a membrán szekunder oldala nem volt vákuum alatt, és a csapdákat sem hűtöttem. Hajtóerő híján így anyagtranszport sem játszódhatott le a membránon, azonban a mérések jól összehasonlíthatók a későbbi pervaporációs mérések során kapott eredményekkel. A különböző víztartalmak mellett kapott lefutási görbéket a 3.4.4. ábra mutatja. 60

Észter hozam (%)

50

40

30

0,10% 0,20% 0,30%

20

0,40% 0,50% 10

0,60%

0 0

5

10

15

20

25

Reakcióidő (h)

3.4.4. ábra: A reakció lefutása különböző kezdeti víztartalmak mellett (40 °C, 10 g/dm3 enzim, 6:1 A/S arány)

107

Membrán tesztelése enzim nélküli modell-eleggyel A modellelegy segítségével meghatároztam a membránon keresztüli víztranszport fluxusát és a membrán szelektivitását a vízre nézve. A modellelegy 40% konverziónak megfelelő reakcióelegy volt, természetesen enzim nélkül. A hozamot és a szelektivitást a permeátum kis mennyisége miatt a reakcióelegy elemzése alapján határoztam meg. A méréseim során kapott eredmények a 3.4.5. ábrán, illetve a 3.4.2. táblázatban láthatók .

c (mol/dm3)

2,5

2,0

y = -0,0030x + 2,2999 R2 = 0,9458

1,5

y = -0,0009x + 0,3045 R2 = 0,9758

Butanol KPS Víz

y = -0,0913x + 0,4817 R2 = 0,9969

BuKP

1,0 y = -0,0005x + 0,1929 R2 = 0,8068 0,5

0,0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

idő (h)

3.4.5. ábra: A koncentrációk változása az enzimmentes, „vak” modellelegyben (40 °C, 10 g/dm3 enzim, 6:1 A/S arány)

3.4.2. táblázat: A membránon keresztüli anyagtranszport 4 óra pervaporáció után; az ebből számított fluxus- és szelektivitás értékek

Komponens

Tömeg

dn/dt

F

αvíz/komponens1

mg

%

(mmol/h)

(mmol/m2×h)

Víz

753,3

85,4

10,46

520,5

-

Butanol

68,1

7,7

0,23

11,4

259,5

Butil-2-Cl-propionát

23,0

2,6

0,04

1,7

117,4

2-Cl-propionsav

37,3

4,2

0,09

4,3

75,4

A 3.4.2. táblázatban látható, hogy a víz fluxusa 2 nagyságrenddel nagyobb, mint az észteré, illetve a 2-klór-propionsavé, és kb. 50-szer akkora, mint a butanolé. Tekintettel arra, hogy a membránon csak igen kis mennyiségű (néhányszor 10 mg) butanol, 2-klór1

Szelektivitási tényező, a 2.3.2 fejezetben leírtak szerint számítva

108

propionsav, valamint a butil-2-klór-propionát permeált át (ami a reakcióelegy mennyiségéhez

képest

elhanyagolható),

a

membrán

szelektivitását

céljaimra

megfelelőnek találtam.

Mérések konstans víztartalom mellett A vízeltávolítás fluxusa és a reakció lefutása során keletkező víz mennyisége alapján minden esetben kiszámítottam, hogy a kvázi-stacionárius víztartalom fenntartásához milyen időközönként kell a vákuumra kapcsolni a pervaporációs modult. A kezdeti magas reakciósebesség során folyamatosan vákuum alatt hagytam a rendszert, a későbbiekben viszont –ahogy a reakcióelegy a kémiai egyensúlyhoz közeledett– csökkent a víz keletkezésének sebessége, emiatt a pervaporációra csak meghatározott időközönként volt erre szükség. A víztartalmat 30 percenként elemeztem. A kísérleteim során a víztartalom a csak ±5%-kal ingadozott, tehát kvázi-stacionáriusnak volt tekinthető (3.4.6. ábra). 0,6

észter

0,5 Koncentráció (mol/dm3)

KPS víz

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Reakcióidő (h)

3.4.6. ábra: A 2-klór-propionsav (KPS), az észter valamint a víz koncentrációjának változása a reakcióelegyben a pervaporáció során (40 °C, 10 g/dm3 Candida rugosa enzim, A/S = 6, 0,5 vol% konstans víztartalom)

Pervaporációs vízeltávolítással 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 és 0,6 vol% konstans víztartalom mellett végeztem észterezési reakciót. A konstans víztartalom mellett kapott eredményeket összehasonlítottam a pervaporáció nélküli eredményekkel (3.4.3.

109

táblázat), és azt tapasztaltam, hogy alacsonyabb (0,1-0,3 vol.%) konstans víztartalom esetén a pervaporáció alkalmazása nem előnyös. Magasabb (0,4-0,6 vol.%) kezdeti ill. konstans víztartalom alkalmazásával viszont kb. 30%-kal lehet növelni a reakció sebességét. Pervaporáció nélküli kísérleteknél a legmagasabb hozam 2 óra reakcióidő után 28,6% volt (0,2 vol.% kezdeti víztartalomnál), míg pervaporáció alkalmazásával optimális víztartalomnál már 36,6% észter hozam érhető el, ami csaknem 30%-os növekedés (3.4.3. táblázat). Az irodalmi adatok szerint ez volt az első alkalom, hogy enzimes észterezési reakcióban a keletkező vizet pervaporációval távolították el és így sikerült növelni a kezdeti reakciósebességet. Crespo és munkatársai 2004-ben egy paratoluol-szulfonsavval katalizált észterezési reakcióban alkalmaztak ugyan pervaporációs vízeltávolítást (Izák, 2004), de míg ők a reakcióelegyből teljesen eltávolították a vizet, addig esetemben a pervaporációt szakaszosan kellett alkalmazni, mivel az enzim hidratáltságához szükséges konstans víztartalmat kellett fenntartanom.

3.4.3. táblázat: Észter hozam (2 h) vízeltávolítás nélkül és pervaporációs vízeltávolítással

Vízeltávolítás nélkül

Vízeltávolítással

Víztartalom (vol

Észter hozam

Víztartalom (vol

Észter hozam

%)

(%)

%)

(%)

0,1

8,1

0,1

6,3

0,2

28,6

0,2

11,9

0,3

26,3

0,3

19,6

0,4

20,2

0,4

30,7

0,5

17,6

0,5

36,6

0,6

12,9

0,6

25,4

A pervaporációval integrált enzimes észterezési reakciót magasabb (50; 60 és 70 °C) reakcióhőmérsékleten

is

vizsgáltam,

melyekből

az

enzim

hőstabilitására

is

következtettem. Minden esetben a 40 °C reakcióhőmérsékleten optimális 0,5 vol.% víztartalmat tartottam fenn a rendszerekben. Az eredményeket a 3.4.7. ábra mutatja be. A 3.4.7. ábrán látható, hogy a Candida rugosa lipáz enzim a [bmim]PF6 ionos folyadékban 40-60°C között alkalmas az észterezési reakció lejátszására, ugyanakkor 70°C-on, illetve e fölött már kissé csökken az elérhető hozam. A kísérletek eredményeit szerves oldószerben végzett kísérletekkel összehasonlítva látható, hogy az enzim

110

termostabilitása

ionos

folyadékokban

lényegesen

magasabb,

mint

szerves

oldószerekben (Ulbert, 2004). 60

Észter hozam (%)

50

40

30 40 °C 50 °C

20

60 °C 70 °C 10

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Reakcióidő (h)

3.4.7. ábra: A reakció lefutása különböző hőmérsékleteken pervaporációval fenntartott 0,5 vol%-os víztartalom mellett (10 g/dm3 Candida rugosa, S/A = 6)

Mivel a biotechnológiai folyamatok rendszerint lassúak, a hőmérséklet emelése, így a reakció gyorsítása fontos gazdasági kérdés. Méréseim azt mutatják, hogy [bmim]PF6 ionos folyadékot alkalmazva reakcióközegként, a hőmérséklet növelésére jelentősen nő a reakciósebesség, azaz 40 °C helyett 60 °C-ot alkalmazva a kezdeti sebesség nagyjából másfélszeresére nő. A mérések azt is mutatják, hogy az elérhető maximális hozam 60 °C-ig nem csökken. A szerves oldószerekben ez a határhőmérséklet alacsonyabb (általában 30-40 °C), mivel az enzim a hőmérséklet növelésére egyre erősebb mértékben károsodik. Magasabb hőmérsékleteken egy másik lényeges akadály is felmerül: a n-hexán és egyéb illékony szerves oldószerekben a magas hőmérséklet miatt megnövekvő gőznyomás komoly biztonságtechnikai és környezetvédelmi problémákat vet fel. Mindezzel szemben az ionos folyadékokban az enzimek magasabb hőmérsékleten is stabilak maradnak, és a kis illékonyság miatt a gőznyomás növekedése nem jelent számottevő problémát.

111

4. Definíciók és rövidítések

Az ionos folyadékok elnevezése Az ionos folyadékok kationból és anionból állnak. A kation szinte minden esetben egy nagyméretű szerves ion, pl. alkilszubsztituált imidazolium-, piridinium- vagy éppen ammóniumion, az anion pedig általában szintén nagyméretű szerves vagy szervetlen komplex molekulaion. Az ionos folyadékok jelölése a következőképp történik:

[kation]Anion Például az alkilszubsztituált imidazolium-kationt tartalmazó ionos folyadékok egyike az 1-butil-3-metil-imidazolium hexafluoro-foszfát. Ennek jelölése a következőképpen történik:

[bmim]PF 6

1-szubsztituált csoport Pl.: m=metil, e=etil...b=butil... vagy C 3 = propil, C 5 = pentil, 3-szubstztituált C 6 = hexil, C 7 = heptil... csoport

kation alapváza Pl.: im=imidazolium py=piridinium pyr=pirrolidium N=ammóniumion

Anion

-

F

R'

N + N R"

F F

P

F F

F Az ionos folyadékokban előforduló legfontosabb ionok típusát, rövidítését az 5.1. táblázat mutatja.

112

5.1. táblázat: Az ionos folyadékok lehetséges kationjainak képlete és rövidítése

Kationok Elnevezés,

Anionok

Szerkezeti képlet

Elnevezés és

(rövidítés), példa

rövidítés

Imidazolium (im)

Tetrafluoro-borát

Pl.: 1-butil-3metil-imidazolium:

R1

N + N

[bmim]

BF4

R3

B

F

F

R2

+ N R2

R1

F

F

PF6

P

F

F F

F

[bpy] Pirrolidinium (pyr)

Toluol-szulfonát

pirrolidium:

+

Pl.: N-oktil-

R4

ammónium:

SO3

ToS

R1

Ammónium (N)

-

(tozilát)

+ N

Pl.: N-etil-N-metil

N,N,N-trietil-

F

Hexafluoro-foszfát

piridinium:

[empyr]

-

F

Piridinium (py) Pl.: N-butil-

Szerkezeti képlet

R2 R1

Metil-szulfát

N

MeSO4

R2 R3

O

O S

H3C

O

[eeeoN] Foszfónium (P) Pl.: Tetra-n-butilfoszfónium: [bbbbP] Szulfínium (S)

R1 P R2 R4 R3 + R2 S R3

CF3

S

Tf2N

O

O

Bisz(2,4,4-trimetilpentil)-foszfinát BTMPF

113

O

O

szulfonil-imid

+

R1

-

Bisz(trifluoro-metil)-

-

O

P

N

S O

CF3

Rövidítések

AFME

Z-α-acetamido-fahéjsav metil-észter

AFSAV

Z-α-acetamido-fahéjsav

BDPP

2,4 bisz(difenil-foszfino)pentán

BINAP

3,5 bisz(difenil-foszfino)1,1-binaftil

BuKP

Butil-2-kloro-propionát

CaLB

Candida antrctica lipáz B (Novozyme 435® enzimkészítmény)

CHIRAPHOS

2,3 bisz(difenil-foszfino)bután

COD

Ciklooktadién

DIOP

2,2 dimetil-4,5 bisz(difenil-foszfino)1,3-dioxolán

DIPAMP

1,2 bisz(2-metoxifenil-fenil-foszfino)etán

DuPhos

1,2 bisz(2,5-dietil-foszfoláno)benzol

IL

Ionos folyadék

IPA

Izopropil-alkohol

KPS

2-klór propionsav

MTBE

Metil-terc-butil éter

MPPP

Metil-fenil-propil-foszfin

NBD

Norbornadién

VOC

Volatile Organic Compounds = Illékony szerves vegyületek

Enantioszelektivitás Az elegyben nagyobb mennyiségben jelen lévő konformáció koncentrációja az [enantiomer(1)], míg az alacsonyabb koncentrációban lévő konformáció koncentrációja [enantiomer (2)], így enantiomer (1) fölöslege, azaz ee(1) a következőképpen számolható:

ee(1) =

[enantiomer(1)] − [enantiomer(2)] × 100 (%) [enantiomer(1)] + [enantiomer(2)]

(10)

Egy bonyolultabb összefüggés az „E-érték”, ami figyelembe veszi a szubsztrátum kezdeti és reakció utáni enantiomer-arányait is:

E=

 S − SS  PS − PR ln(1 − c(1 + eeP)  ; c = 1 − R0 ; eeP = 0  ln(1 − c(1 − eeP) PS + PR  SR + SS  114

(11)

Az egyenletben eeP kifejezés a termék (PS és PR) enantiomer-fölöslege (jelen esetben eeP > 0, azaz, (S)- konfigurációjú termék van túlsúlyban). A c kifejezés figyelembe veszi a szubsztrátum kezdeti koncentrációját (SR0 + SS0), illetve a reakció utáni szubsztrátum-enantiomerek koncentrációját (SR és SS). Aktiválási energia számítása Arrhenius-egyenlet segítségével Az Arrhenius-egyenlet szerint a reakciósebesség a következőképpen függ a hőmérséklettől:

 E  v = A ⋅ exp − a   RT 

(12)

Jelölések: v = reakciósebesség; A = Arrhenius-állandó; Ea = aktiválási energia (J/mol); R = egyetemes gázállandó (8,314 J × mol-1K-1); T = hőmérséklet (K)

Logaritmizálva az összefüggést:

ln v = ln A −

Ea RT

(13)

Ennek alapján a reakciósebesség logaritmusát a hőmérséklet reciprokának a függvényében ábrázolva a kapott egyenes meredeksége (– Ea/R) lesz, innen Ea kiszámítható.

Toxikológiai fogalmak •

LD50 (Lethal Dose 50%): Az LD50 érték azt mutatja meg, hogy az adott vegyületből mekkora mennyiség okozza a kísérleti állatok (általában patkány) 50%-ának pusztulását. Mértékegysége általában mg/testsúly kg.

•

LC50 (Lethal Concentration 50%): Az LC50 érték azt mutatja meg, hogy az adott vegyületből mekkora koncentráció okozza egy populáció 50%-ának pusztulását. Mértékegysége általában mg/dm3.

•

EC50: (Effective Concentration 50%): Az EC50 érték azt mutatja meg, hogy az adott vegyületből mekkora koncentráció okoz mérhető hatást, változást egy populáció 50%-ában. Mértékegysége általában mg/dm3.

115

5. Irodalomjegyzék

Ahlquist, M.; Gustaffson, M; Karlsson, M.; Thanning, M.; Axelsson, O.; Wendt, O. F., Inorg. Chim. Acta , 2006, in press Aki, S. N. V. K., Chem. Commun., 2001, 413-414. Amrani, Y.; Lecomte, L.; Sinou, D.; Bakos, J.;Toth, I.; Heil, B., Organometallics, 1989, 8, 542-546. Anderson, J. L.; Ding, J.; Welton, T.; Armstrong, D. W., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 14247-14254. Armstrong, D. W.; He, L.; Liu, Y. S.Anal. Chem., 1999, 71, 3873-3876. Armstrong, D. W.; Yamazaki, H., TIBTECH,1986, 10, 264-268. Baudequin, C.; Baudoux, J.; Levillain, J.; Cahard, D.; Gaumont, A. C.; Plaquevent, J. C., Tetrahedron-Asymmetr., 2003, 14, 3081-3093. Bélafi-Bakó, K.; Kabiri Badr, A.; Nemestóthy, N.; Ehrenstein, U.; Gubicza, L., Chem. Papers, 2003, 57, 277-280. Berger, R. G.: Aroma Biotechnology, Springer Verlag, Heidelberg, 1995 Berger, A.; de Souza, R. F.; Delago, M. R.; Dupont, J., Tetrahedron-Asymmetr., 2001, 12, 1825-1828. Berthod, A.; He, L.; Armstrong, D. W., Chromatographia, 2001, 53, 63-68. Berthod, M.; Joerger, J. M.; Mignani, G.; Vaultier, M.; Lemaire, M., TetrahedronAsymmetr., 2004, 15, 2219-2221. Blanchard, A. L., J. Phys. Chem., 2001, 105, 2437-2444. Boon, J. A.; Levisky, J. A.; Pflug, J. L.; Wilkes, J. S., J. Org. Chem., 1986, 51, 480-487. Borbigou, H. O.; Magna, L., J. Mol. Catal. A-Chem., 2002, 182-183, 419-437. Bornscheuer, U. T., Enzyme Microb. Tech., 1995, 17, 578-586. Buchholz, K.; Kasche, V.; Bornscheuer, U. T.: Biocatalysis and Enzyme Technology, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005. Burk, M. J.; Gross, M. F.; Martinez, J. P., J. Am. Chem. Soc.,1995,117, 9375-9381.

116

Caemichael, A J., Seddon, K. R., J. Phys. Org. Chem., 2000, 13, 591-595. Carda-Broch, S.; Berthod, A.; Armstrong, D. W., Anal. Bioanal. Chem., 2003, 375, 191-199. Chauvin, Y.; Mussmann, L.; Olivier, H., Angew. Chem. Int. Edit. Engl., 1995, 34, 26982700. Csihony, S.; Mehdi, H.; Horváth, I.T., Green Chem. 2001, 3, 307-308. Davis, B. G.; Boyer, V., Nat. Prod. Rep., 2001, 18, 618-640. de Souza, R. F.; Padilha, J. C.; Gonçalves, R. S; Dupont, J., Electrochem. Commun., 2003, 5, 728-731. Deye, J. F. et al., Anal. Chem., 1990, 62, 614-622. Dordick, J. S., Enzyme Microb. Tech., 1989, 41, 566-571. Dörmő, N.; Bélafi-Bakó, K.; Bartha, L.; Ehrenstein, U.; Gubicza, L., Biochem. Eng. J., 2004, 21, 229-234. Durand, J.; Teuma, E.; Gómez, M.; Comptes Rendus Chimie, In Press Durazo, A.; Abu-Omar, M. M., Chem. Commun., 2002, 66-70. Dzyuba, S.; Bartsch, A., Chem. Phys. Chem., 2002, 3, 161-164. Ehrenstein, U.; Kabasci, S.; Kümmel, R.; Dörmő, N.; Bélafi-Bakó, K.; Gubicza, L., Chem-Ing-Techn., 2003, 75, 291-294. Erbeldinger, M.; Mesiano, M.; Russell, A. J., Biotechnol. Progr., 2000, 16, 1129-1131. Fannin, A. A. Jr.; Floreani, D. A.; King, L. A.; Landers, J. S.;Piersma, B. J.; Stech, D. J.; Vaughn,R. L.; Wilkes, J. S.; Williams, J. L., J. Phys. Chem., 1984, 88, 26142620. Fráter, T.; Kiss, K.; Bélafi-Bakó, K.; Gubicza, L., Enzymatic synthesis of Monoglycerides, Forum for Applied Biotechnology, 2005, Gent (Belgium), poszter, 2005, 78. Freemantle, M., Chem. Eng. News, 1998, 32-36. Freemantle, M., Industrial Chemistry, 2003, 81, 9-16. Fryzuck, M. D.; Bosnich, B., J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 6262-6267.

117

Garcia, S.; Lourenço, N. M. T.; Lousa, D.; Sequeira, A. F.; Mimonso, P.; Carbal, J. M. S.; Afonso, C. A. M.; Barreiros, S., Green Chem., 2004, 6, 466-470. Gridnev, I. D.; Higashi, N.; Asakura, K.; Imamoto, T., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 7183-? Gubicza, L., In: J. Tramper, M. M. Vermüe and M. M. Beeftink (eds.) Biocatalysis in Non-Conventional Media, Elsevier, Amsterdam (1992), 1992/a, 496-502. Gubicza, L., Eljárás kidolgozása természetes gyümölcsaroma komponensek előállítására szerves oldószerekben lejátszódó enzimkatalitikus reakcióval Zárójelentés, Magyar Tudományos Akadémia Műszaki Kémiai Kutatóintézet, Veszprém, 1992, iktatószám 00159/1991, 03, 19, 1992/b Gubicza, L.; Szakács-Schmidt, A., Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent, 1995/a, 60/4a, 1977-1982. Gubicza, L.; Szakács-Schmidt, A., Biotechnol. Techn., 1995/b, 9, 687-690. Gubicza, L.; Kabiri Badr, A.; Keöves, E., Bélafi-Bakó, K., J. Biotechnol., 2000, 84, 193-196. Guo, Z.; Xu, X., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 2615-2619. Halpern, J., Science, 1982, 217, 401-407. Heintz, A. et al., J. Chem. Eng. Data, 2001, 46, 1526-1529. Herseczki, Zs.; Gergely, I.; Hegedűs, Cs.; Szöllősy, Á.; Bakos, J., TetrahedronAsymmetr., 2004, 15, 1673-1678. Hitchcock, P. B.; Mohammed, T. J.; Seddon, K. R.; Zora, J. A.; Hussey, C. L.; Ward, E. H., Inorg. Chim. Acta , 1986, 113, 125-134. Horner, L.; Siegel, H.; Buthe, H., Angew. Chem. Int. Ed., 1968, 7, 942-957. Huddleston, J.G.; Visser, A.; Reichert, M.; Willauer, H.; Broker, G.; Rogers R., Green Chem., 2001, 3, 156-161. Hurley, F. H.; Wier, T. P., J. Electrochem. Soc., 1951, 98, 203-206. Itoh, T.; Akasaki, E.; Kudo, K.; Shirakami, S., Chem. Lett., 2001, 262-263. Izák, P.; Mateus, N. M. M.; Afonso, C. A. M.; Crespo, J. G., Sep. Purif. Technol., 2005, 41, 141-145.

118

Jain, N.; Kumar, A.; Cauchan, S.; Cauchan, S. M. S., Tetrahedron, 2005, 61, 10151060. Jastroff, B.; Mölter, K.; Behrend, P.; Bottin-Weber, U.; Filser, J.; Heimers, A.; Ondruschka, B.; Ranke, J.; Schaefer, M.; Schröder, H.; Stark, A.; Stepnowski, P.; Stock, F.; Störmann, R.; Stolte, S.; Welz-Biermann, U.; Ziegert, S.; Thöming, J., Green Chem., 2005, 7, 362-372. Jastroff, B.; Störmann, R.; Ranke, J.; Mölter, K.; Stock, F.; Oberheitmann, B.; Hoffmann, W.; Hoffmann, J.; Nüchter, M.; Ondruschka, B.; Filser, J., Green Chem., 2003, 5, 136-142. Jessop, P. G.; Stanley, R. R.; Brown, R. A.; Eckert, C. A.; Liotta, C. L.; Ngo, T. T.; Pollet, P., Green Chem., 2003, 5, 3-8. Kabiri Badr, A., Studies on enzymatic synthesis of natural ethyl acetate in nonconventional media, Ph. D. doktori értekezés, 2005, 36. Kagan, H. B.; Dang, T. P., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1971, 481-489. Kiełbasinski, P.; Albrycht, M.; Luczak, J.; Mikolajczyk, M., Tetrahedron-Asymmetr., 2002, 13, 735-738. Kim, K. W.; Song, B.; Choi, M. Y.; Kim, M. J., Org. Lett., 2001, 10, 1507-1510. King, R. B.; Bakos, J.; Hoff, C. D.; Markó, L. J. Org. Chem, 1979, 44, 1729-1732. Kirchner, G.; Scollar, M. P.; Klibanov, A. M., J. Am. Chem. Soc., 1985, 107, 70727076. Koel, M., Proc. Estonian Acad. Sci. Chem., 2000, 49, 145–155. Kragl, U., Biocatalysis In Ionic Liquids, Biotrans'03, előadás, 2003. Krishna, S. H.; Divakar, S.; Prapulla, S. G.; Karanth, N. G., J. Biotechnol., 2001, 87, 193-201. Lau, R. M.; Rantwijk, F. van; Seddon, K. R. Sheldon, R. A., Org. Lett., 2000, 26, 41894191. Lau, R. M.; Sorgedrager, M. J.; Carrea, G.; Rantwijk, F. van; Secundo, F.; Sheldon, R. A., Green Chem., 2004, 6, 483-487.

119

Leblanc, D.; Morin, A.; Gu, D.; Zhang, X. M.; Bisaillon, J. G.; Paquet, M.; Dubeau, H., Biotechnol. Lett., 1998, 20, 1127-1131. Litjens, M. J.; Straathof, A. J. J.; Jongejan, J. A.; Heijnen, J. J., Chem. Commun., 1999, 1255-1256. Lozano, P.; de Diego, T.; Carrié, D.; Vaultier, M.; Iborra, J. L., J. Mol. Catal. B-Enzym., 2003, 21, 9-13. Lozano, P.; de Diego, T.; Gmouh, S.; Vaultier, M.; Iborra, J. L., Biocatal. Biotrans., 2005, 23, 169-176. Magunson, D. K., J. Solution Chem., 1984, 13, 583-587. Marshek, W. J.; Miyano, M., Biochim. Biophys. Acta, 1973, 316, 363-365. Masten, S. A., Toxicological Summary for Ionic Liquids, Prepared by Integrated Laboratory Systems, Inc. Research Triangle Park, North Carolina, (http://preprint.chemweb.com/biochem/0303001), 2004, 1-56. Ming, L. O., Ghazali, H. M., Let, C. C., Food Chem., 1998, 63, 155-159. Monteiro, A. L.; Zinn, F. K.; de Souza, R. F.; Dupont, J., Tetrahedron-Asymmetr., 1997, 2, 177-179. Ngo, H. L.; Hu, A.; Lin, W., Tetrahedron Lett., 2004, 595-597. Park, S; Kazlauskas, R., Curr. Opin. Biotech.; 2003, 14, 432-437. Park, S; Kazlauskas, R., J. Org. Chem., 2001, 66, 8395-8401. Poole, C. F., J. Chromatogr. A, 2004, 1037, 49-82. Poole, C. F.; Kersten, B. R.; Ho, S.S.J.; Coddens, M. E.; Furton, K. J., J. Chromatogr., 1986, 352, 407-425. Presson, M.; Bornscheuer, U. T., J. Mol. Catal. B-Enzym., 2003, 22, 21-27. Pretti, C.; Chiappe, C.; Pieraccini, D.; Gregori, M.; Abramo, F.; Monni, G.; Intorre, L., Green Chem., 2006, 8, 238-240. Rantwijk, F van; Lau, R. M.; Sheldon, R. A., Trends. Biotechnol., 2003, 21, 131-138. Reichardt, C., Chem. Rev., 1994, 94, 2319-2358.

120

Reichardt, C., Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry, third ed., Wiley-VCH, Verlag, Weinheim, 2003, 419. Rogers, R. D., NATO Advanced Research Workshop (Green Industrial applications of Ionic Liquids), 2000 Russell, A. J.; Beckman, E. J.; Chaudhary, A. K., Chemtech., 1994, 3, 33-37. Schmid, A.; Dordick, J. S.; Hauer, B.; Kiener, A.; Wubbolts, M.; Witholt, B., Nature, 2001, 409, 258-268. Schöfer, S. H.; Kaftzik, N.; Wasserscheid, P.; Kragl, U., Chem. Commun., 2001, 425426. Scrivanti, A.; Bovo, S.; Ciappa, A.; Matteoli, U., Tetrahedron Lett, 2006, 47, 9261– 9265. Sheldon, R. A.; Lau, R. M.; Sorgedrager, M. J.; Rantwijk, F. van; Seddon, K. R., Green Chem., 2002, 4, 147-151. Sonntag, N. O. V., J. Am. Oil Chem. Soc., 1982, 59, 795-802. Swatloski, R. P.; Holbrey, J. D.; Rogers, R. D., Green Chem., 2003, 5, 361-365. Swatloski, R. P.; Holbrey, J. D.; Memon, S. B.; Caldwell, G. A.; Caldwell, K. A.; Rogers, R. D., Chem. Commun., 2004, 668-669. Takaya, H.; Ohta, T.; Sayo, N.; Kumobayashi, H.; Akutagawa, S.; Inoue, S.;Kasahara, I.; Noyori, R., J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 596-602. Tang, T., Ellman, J. A, J. Org. Chem., 1999, 64, 12-14. Ulbert, O.; Bélafi-Bakó, K; Tonova, K.; Gubicza, L., Biocat. Biotrans., 2005, 23, 177183. Ulbert, O.; Fráter, T.; Bélafi-Bakó, K.; Gubicza, L., J. Mol. Catal. B-Enzym., 2004, 31, 39-45. Vineyard, B. D.; Knowles, W. S.; Sabacky, M. J.; Bachman, G. L.; Weinkauff, D. J., J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 5946-5951. Virto, C.; Svensson, I.; Adlercreutz, P., Enzyme Microb. Tech., 1999, 24, 651-655. Visser, A. E. In: Ionic liquids. Industrial Applications to Green Chemistry ACS Symposium (Series 818, Rogers, R. D., Seddon K. R. eds.), 2002, 289-308.

121

Walden, P., Bull. Acad. Imper. Sci. (St. Petersburg), 1914, 1800-1803. Wasserscheid, P.; Hal, R.; Bösmann, A., Green Chem., 2002, 4, 400-404. Welton, T., Chem. Rev., 1999, 99, 2071-2083. Wilkes, J. S., Green Chem., 2002, 4, 73-80. Wilkes, J. S., J. Mol. Catal. A: Chem., 2004, 214, 11-17. Wilkes, J. S.; Zaworotko, M. J., J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1992, 965-? Wolfson, A.; Vankelecom, I. F. J.; Jacobs, P. A., J. Organomet. Chem., 2005/a, 690, 3558–3566. Wolfson, A.; Vankelecom, I. F. J.; Jacobs, P. A., Tetrahedron Lett. 2005/b, 46, 25132516. Xiong, W.; Lin, Q.; Ma, H.; Zheng, H.; Chena, H.; Li, X., Tetrahedron-Asymmetr., 2005, 16, 1959-1962. Yanes, E. G.; Gratz, S. R.; Baldwin, M. J.; Robinson, S. E.; Stalcup, A. M., Anal. Chem., 2001, 73, 3838-3844. Zaks, A.; Klibanov, A. M., Science, 1984, 224, 1249-1251. Zhao, D.; Wu, M.; Kou, Y.; Min, E., Catal. Today, 2002, 74, 157-189.

Internetes hivatkozások: http://ilthermo.boulder.nist.gov/ILThermo/mainmenu.uix http://ildb.merck.de/ionicliquids/en/startpage.htm

122

Tézisek 1. Tézis Megállapítottam, hogy a (Z)-α-acetamido-fahéjsav és a (Z)-α-acetamido-fahéjsavmetilészter enantioszelektív hidrogénezése ionos folyadék/izopropanol kétfázisú rendszerben [bmim]BF4 és [bmim]PF6 ionos folyadékokat alkalmazva 100%-os hozam mellett végbemegy. [bpy]BF4 ionos folyadékot alkalmazva oldószerként nem keletkezik kimutatható

mennyiségű

termék.

A

magasabb

enantioszelektivitást

[bmim]BF4/izopropanol kétfázisú rendszerben tapasztaltam: − (Z)-α-acetamido-fahéjsav esetén ee(S) = 92% (55 °C-on 2,5 bar hidrogén nyomás mellett) − (Z)-α-acetamido-fahéjsav-metilészter esetén ee(S) = 87% (70 °C-on, 5 bar hidrogén nyomás esetén) A hozam mindkét esetben meghaladta az irodalomban eddig közölt értékeket. A reakciót több hőmérsékleten kivitelezve, az enantioszelektivitás hőmérsékletfüggéséből megállapítottam, hogy az a Halpern által leírt reakciómechanizmus szerint megy végbe. Homogén katalitikus reakciókban a katalizátor csak egyszer használható fel, és csak igen bonyolult módon nyerhető vissza az elegyből. Az ionos folyadék/izopropanol kétfázisú rendszerrel megoldottam az értékes katalizátor recirkulációját: a katalizátort három

további

ciklusban

újra

felhasználtam

miközben

a

hozam

és

az

enantioszelektivitás csak kis mértékben csökkent.

2. Tézis Az etanol ecetsavval történő észterezését Candida antarctica lipáz B (Novozyme 435) enzimmel többféle ionos folyadékban vizsgáltam. Megállapítottam, hogy az észterezési reakció magas hozammal (> 80%) végbemegy [bmim]PF6 és [bmpyr]Tf2N ionos folyadékokban. Az erősen hidrofil karakterű anionnal rendelkező [bmim]BF4-ben nem keletkezett kimutatható mennyiségű etil-acetát. Az optimális reakciókörülmények [bmim]PF6 ionos folyadékban a következők voltak: − 40 °C hőmérséklet − 5:1 alkohol/sav mólarány − 1 vol% víztartalom

123

Az etil-acetát etanolból és ecetsavból történő enzimes előállítása során mindkét kiindulási anyag inhibitorként viselkedik. Méréseim alapján a reakció aktiválási energiája [bmim]PF6 reakcióközegben 21,7 kJ/mol -nak adódott. Ez az irodalomban fellelt, más reakcióközegekben (n-hexán, oldószermentes) tapasztalt értékeknél alacsonyabb, ami azt jelenti, hogy az enzimgátló tényezők ebben a reakcióközegben érvényesülnek legkevésbé, tehát az ionos folyadék stabilizálja az enzimet.

3. Tézis Az etil-acetát enzimes előállításának folyamatossá tételére egy laboratóriumi méretű, pervaporációval integrált berendezést állítottam össze, melyben a reakcióelegy keringetésével a vizet egy 200 cm2 felületű hidrofil, az etil-acetátot pedig egy 12 cm2 felületű hidrofób membránnal távolítottam el. A szubsztrátum koncentrációjának fenntartására ecetsav- és etanol rátáplálást alkalmaztam. Az irodalom áttanulmányozása alapján ilyen folyamatos rendszert ionos folyadék közegű enzimes észterezésnél korábban még nem alkalmaztak. Korábbi kísérletek bizonyítják, hogy a Candida antarctica lipáz aktivitáscsökkenése ionos folyadékokban igen lassú, így feltételeztem, hogy a kísérlet ideje alatt az enzim dezaktiválódása elhanyagolható. A fluxus meghatározása után, a membránok üzemelésének és a szubsztrátum betáplálásnak megfelelő összehangolásával a reakcióelegyben a komponensek koncentrációi kvázistacionáriusak maradtak. Megállapítottam, hogy a pervaporáció során kapott permeátum 94% észtert és 5% etanolt

tartalmaz,

ami

további

tisztítás

után

alkalmas

lehet

élelmiszeripari

aromakomponensnek.

4. Tézis A 2-klór propionsav n-butanollal történő észterezését Candida rugosa lipázzal végeztem

különböző

nem-konvencionális

reakcióközegekben.

Ennek

során

megállapítottam, hogy a reakció n-hexánban és kétféle ionos folyadékban játszódik le magas hozammal: [bmim]PF6-ban és [onim]PF6-ban. A hidrofil karakterű [bmim]BF4ben a reakció csak igen lassan játszódik le. Megállapítottam, hogy az enzim visszanyerése és új reakcióciklusban történő felhasználása során az enzim aktivitása [bmim]PF6 ionos folyadékban lényegesen kisebb mértékben csökkent, mint szerves oldószerekben. Így azt a következtetést vontam le, hogy az ionos folyadék stabilizálja az enzimet, amit az is alátámaszt, hogy 124

irodalmi adatok alapján az enzim enantioszelektivitása ionos folyadékban lényegesen magasabb, mint szerves oldószerekben.

5. Tézis A 2-klór propionsav enzimes észterezése során (és más enzimes észterezési reakciókban is) döntő jelentőségű paraméter a reakcióelegy víztartalma. Túl alacsony víztartalom esetén az enzim hidratáltsága nem megfelelő, míg túl magas víztartalom esetén a reakció a hidrolízis irányába tolódik el. Mivel a reakció maga is termel vizet, a legnagyobb reakciósebesség akkor érhető el, ha a reakció során keletkező víz folyamatosan eltávolításra kerül, ugyanakkor biztosítva van az enzim működéséhez szükséges víztartalom is. A víztartalom szabályozására egy pervaporációval integrált laboratóriumi méretű fél-folyamatos rendszert alakítottam ki. A fluxus meghatározása után, a membrán szakaszos üzemeltetésével a víztartalmat kvázi-stacionárius értéken tartottam. Megállapítottam, hogy az optimális víztartalom [bmim]PF6 ionos folyadék közegben 0,5 vol%, melynek fenntartásával (a keletkező víz folyamatos elvonásával) a reakciósebesség növelhető. Az irodalmi adatok alapján pervaporációs vízeltávolítást ionos folyadék közegben, nem-enzimes észterezési reakcióban már alkalmaztak ugyan, de míg ott a reakcióelegyből teljesen eltávolították a vizet, addig esetemben a pervaporációt szakaszosan kellett alkalmazni, mivel az enzim hidratáltságához szükséges konstans víztartalmat kellett fenntartanom, melyre tudomásom szerint ez volt az első alkalom.

125

Theses These 1 The enantioselective hydrogenation of the (Z)- )-α-acetamidocinnamic acid and its methyl ester have been carried out with 100% yield in ionic liquid/isopropanol biphasic system using [bmim]BF4 and [bmim]PF6 ionic liquids. Using [bpy]BF4 ionic liquid as catalyst solvent, no traceable product was found. The higher enantioselectivity was achieved in [bmim]BF4/izopropanol system: − In case of (Z)-α-acetamidocinnamic acid, ee(S) was 92% (Reaction conditions: T = 55 °C 2,5 bar hydrogen pressure) − In case of (Z)-α-acetamidocinnamic acid methyl ester, ee(S) was 87% (Reaction conditions: T = 70 °C, 5 bar hydrogen pressure) The yields were higher than the data found in the literature. According to the temperature dependence of the enantioselectivity, the reaction took place by the mechanism described by Halpern. Using this biphasic system, the recycling of the expensive catalyst was possible: the catalyst was reused in three further reaction cycles without significant loss of yield and enantioselectivity.

These 2 The esterification of ethanol with acetic acid in the presence of Candida antarctica lipase B (Novozyme 435) was investigated in different ionic liquids. High ester yield (> 80%) was obtained in [bmim]PF6 and [bmim]Tf2N ionic liquids. No traceable ethyl acetate yield was found in [bmim]BF4, an ionic liquid possessing a hydrophilic anion. The optimal reaction conditions were determined as follows: − 40 °C reaction temperature − 5:1 alcohol/acid molar ratio − 1 vol% initial water content If the ethyl acetate arises from the enzymatic reaction of ethanol and acetic acid, both substrates cause inhibition. The activation energy of the reaction in [bmim]PF6 media was found as 21,7 kJ/mol, which is lower than the values obtained in other reaction media (e.g. n-hexane or solvent-free system). This means that the substrate inhibition effects are lower in ionic liquids, thus the enzyme is stabilized by the ionic liquid.

126

These 3 A laboratory-scale experimental set-up was composed for investigating the continuous esterification. The water was removed from the reaction mixture by a 200 cm2 hydrophilic membrane, while the ethyl acetate was removed by a 12 cm2 hydrophobic one. To sustain the quasi stationary concentrations in the reaction vessel, ethanol and acetic acid feed was used. According to the literature review, no reference has been found yet for using similar system for continuous enzymatic esterification in ionic liquid. I assumed only negligible enzyme deactivation in ionic liquids according to observations found in the literature. After the determination of the flux, the operation of the membranes and the feed were harmonized. This way, the concentrations of the components were quasi stationary in the reaction vessel.

These 4 The esterification of 2-chloropropanoic acid with n-butanol was performed by Candida rugosa lipase in different non-conventional media. The reaction took place with high ester yields in n-hexane and two ionic liquids: [bmim]PF6 and [onim]PF6. However, using the hydrophilic [bmim]BF4 as reaction media, only low reaction rate was observed. The lipase was reused in consecutive reaction cycles. After several reuse, the enzyme activity decreased only slightly in ionic liquid media, while it was remarkable in n-hexane. I concluded that the ionic liquid enhances the enzyme stability, which is also confirmed by the enantioselectivity enhancement reported by the literature.

These 5 In the enzymatic esterification of 2-chloropropanoic acid (and in other enzymatic esterifications as well), the water content of the reaction mixture is a very important parameter. Too low water content hydrates the enzyme insufficiently, too high water content shifts the equilibrium towards the hydrolysis. Due to the water production of the reaction, the highest reaction rate can be achieved by a continuous removal of the water performed by the reaction, while the water necessary for the enzyme is guaranteed. To control the water content of the reaction mixture, a laboratory scale, semicontinuous set up integrated with pervaporation for water removal was built. After the determination of the flux, the water content was set to a quasi stationary level. 127

Maintaining the optimal water content (0,5 vol% in [bmim]PF6) the reaction rate was enhanced. Water removal by pervaporation has already been investigated in esterification reactions by other researchers, however, in these cases the whole water content was removed continuously. In this case, a minimal water content was necessary for the enzyme hydration, thus, constant water content was maintained by pervaporation, and, to the best of my knowledge, it was the first time for using such a system.

128

Publikációk és proceedingek Publikációk: 1. Bélafiné Bakó K., Ulbert O., Fráter T., Gubicza L.: Enzimatikus észterezés ionos

folyadékban:

a

keletkező

víz

eltávolítása

pervaporációval

Membrántechnika VI./2 2002, 42-47. 2. László Gubicza, Nándor Nemestóthy, Tamás Fráter and Katalin Bélafi-Bakó: Enzymatic esterification in ionic liquids integrated with pervaporation for water removal Green Chem., 2003, 5, 236-239. 3. Fráter, T., Ulbert, O., Bélafi-Bakó, K., Gubicza, L.: Thermal stability enhancement of Candida rugosa lipase in ionic liquids, Comm. Agricult. Appl. Biol. Sci., 2003, 68/2a, 293-296. 4. Olga Ulbert, Tamás Fráter, Katalin Bélafi-Bakó, László Gubicza: Enhanced enantioselectivity of Candida rugosa lipase in ionic liquids as compared to organic solvents J. Mol. Catal. B-Enzym. 2004, 31, 39-45. 5. T. Fráter, L. Gubicza, K. Bélafi-Bakó: Enhancement of operation and storage stability of glucoamylase from Aspergillus awamori by a protease inhibititor preparation, Biocatal. Biotransfor., 2005, 23, 281-284. 6. T. Fráter, L. Gubicza, Á. Szöllősy, J. Bakos: Enantioselective hydrogenation in ionic liquids: Recyclability of the [Rh(COD)(DIPAMP)]BF4 catalyst in [bmim][BF4], Inorg. Chim. Acta, 2006, 359, 2756-2759. Proceedingek: 1. L. Gubicza, N. Nemestóthy, T. Fráter, K. Bélafi-Bakó: Enzymatic Esterification in Ionic Liquids Integrated with Pervaporation for Water Removal, Green Solvents for Catalysis (DECHEMA), Bruchsal (Németország), 2002. október 1316., poszter, pp. 73. 2. O. Ulbert, T. Fráter, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Enzymatic esterification in green solvents: Application of ionic liquids in bioconversions, The First International Conference on Green & Sustainable Chemistry, Tokio (Japán), 2003. március 13-15., poszter, A1-13.

129

3. Fráter Tamás, Bélafiné Bakó Katalin, Gubicza László: Enzimkatalitikus észterezés ionos folyadékokban, Műszaki Kémiai Napok’03, Veszprém, 2003. április 8-10., előadás, pp. 300-304. 4. L. Gubicza, N. Nemestóthy, T. Fráter, K. Bélafi-Bakó: Enzymatic Esterification in Ionic Liquids at Constant Water Activity, 27th International ExhibitionCongress

on

Chemical

Engineering,

Environmental

Protection

and

Biotechnology (ACHEMA), Frankfurt (Németország), 2003. május 19-24., poszter, pp. 65. 5. T. Fráter, O. Ulbert, K. Bélafi-Bakó and L. Gubicza: Thermal Stability Enhancements of Candida rugosa Lipase in Ionic Liquids, 17th Forum for Applied Biotechnology (FAB), Gent (Belgium), 2003. szeptember 18-19., poszter, Proceedings Part 1, pp. 293-296. 6. Búcsú Dénes, Fráter Tamás, Fülöp Tamás: Tejipari szennyvíz derítése ipari folyadék hulladékárammal, Műszaki Kémiai Napok’04, Veszprém, 2004. április 20-22., poszter, pp. 166-169. 7. T. Fráter, N. Nemestóthy, L. Gubicza K. Bélafi-Bakó: Stabilization of Glucoamylase from Aspergillus awamori Treated by Protease Inhibitors, 6th International Conference on Protein Stabilization (ProtStab), Pozsony (Szlovákia), 2004. szeptember 26-29., poszter, pp. 30. 8. L. Gubicza, T. Fráter, N. Nemestóthy, K. Bélafi-Bakó: Enzymatic Production of Short Chain Alkyl Esters in Solvent-free System and Ionic Liquids, Green Solvents for Synthesis (DECHEMA), Bruchsal (Németország), 2004. október 36., poszter, pp. 85. 9. Fráter Tamás, Viszlay Renáta, Bélafiné Bakó Katalin, Gubicza László: Enzimkatalitikus észterezés ionos folyadékokban – a keletkező víz eltávolítása pervaporációval, A Magyar Mikrobiológiai Társaság 2004. évi Nagygyűlése és a X. Fermentációs Kollokvium, Keszthely, 2004. október 7-9., előadás, pp. 38. 10. Fráter Tamás, Kiss Katalin, Kelemenné Horváth Ilona, Zenon Koszorz, Gubicza László: Glicerin-monosztearát előállítása enzimkatalitikus úton, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2005. április 26-28., előadás, pp. 119.

130

11. Gubicza László, Fráter Tamás, Kelemenné Horváth Ilona, Bélafiné Bakó Katalin:

Rövid

szénláncú

észterek

enzimatikus

előállítása

szerves

oldószerekben, oldószermentes közegben és ionos folyadékokban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2005. április 26-28., előadás, pp. 282-285. 12. Fráter Tamás, Gubicza László, Szöllősy Áron, Bakos József: Enantioszelektív hidrogénezés ionos folyadékokban: a Rh(COD)(DIPAMP)BF4 katalizátor visszaforgathatósága [bmim]BF4 ionos folyadékban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2005. április 26-28., előadás, pp. 286-289. 13. L. Gubicza, T. Fráter, K. Bélafi-Bakó: Recyclability of Enzymes in Ionic Liquid Solvents, 1st International Congress on Ionic Liquisa (COIL), Salzburg (Ausztria), 2005. június 19-22., előadás, pp. 174. 14. T. Fráter, K. Kiss, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Enzymatic Synthesis of Monoglycerides, Renewable Resources and Biorefineries (FAB), Gent (Belgium), poszter, 2005. szeptember 19-21., pp. 78. 15. Fráter Tamás., Fehér Erika, Kelemenné Horváth Ilona, Bélafiné Bakó Katalin, Gubicza László: Aromaészterek előállítása ionos folyadékokban, Műszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2006. április 25-27., előadás, pp. 79-82. 16. L. Gubicza, T. Fráter, K. Bélafi-Bakó: Reuse of Lipase Enzymes in Ionic Liquid

Solvents,

28th

International

Exhibition-Congress

on

Chemical

Engineering, Environmental Protection and Biotechnology (ACHEMA), Frankfurt (Németország), 2006. május 15-19., poszter, pp. 111. 17. T. Fráter, K. Kiss, K. Bélafi-Bakó, Z. Zibrowski, L. Gubicza: Enzymatic syntesis of monoglycerides, 33rd International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare (Szlovákia), 2006. május 22-26., előadás, pp. 132. 18. E. Fehér, T. Fráter, L. Gubicza: Enzymatic Production of Short Chain Alkyl Esters in Ionic Liquids, 33rd International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare (Szlovákia), 2006. május 22-26., előadás, pp. 209. 19. L. Gubicza, E. Fehér, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, T. Fráter: Enzymatic Flavour Ester Production in Organic Solvents, Solvent-free System and Ionic

131

Liquids, 6th European Symposium on Biochemical Engineering Science (ESBES), Salzburg (Ausztria), 2006. augusztus 27-30., poszter, pp.277. 20. L. Gubicza, E. Fehér, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, T. Fráter: Continuous Enzymatic Esterification in an Integrated System Using Ionic Liquids as Solvent, Green Solvents for Processes (DECHEMA), Lake Constance Friedrichshafen (Németország), 2006. október 8-11., poszter, pp.110.

132

Publikációkra való SCI hivatkozások Publikáció: Gubicza, L.; Nemestóthy, N. Fráter, T.; Bélafi-Bakó, K.: Enzymatic esterification in ionic liquids integrated with pervaporation for water removal, Green Chem., 2003, 5, 236-239.

Hivatkozások: 1.

Nara S. J.; Naik P. U.; Harjani, J. R.; Salunkhe, M. M.: Potential of ionic liquids in greener methodologies involving biocatalysis and other synthetically important transformations, Indian Journal of Chemistry Selection B-Organic Chemistry including medicinal chemistry, 2006, 45, 2257-2269.

2.

Barahona, D.; Pfromm, P. H.; Rezac, M. E.: Effect of water activity on the lipase catalyzed esterification of geraniol in ionic liquid [bmim]PF6, Biotechnol. Bioeng., 2006, 93, 318-322.

3.

Buzzeo, M. C.; Hardacre, C.; Compton, R. G.: Extended electrochemical windows made accessible by room temperature ionic liquid/organic solvent electrolyte systems, Chemphyschem, 2006, 7, 176-180.

4.

Won, K.; Hong, J. K.; Kim, K. J.; Moon, S. J.: Lipase-catalyzed enantioselective esterification of racemic ibuprofen coupled with pervaporation, Process Biochem., 2006, 41, 264-269.

5.

Petersson, A. E. V.; Gustafsson, L. M.; Norbald, M.; Börjesson, P.; Mattiasson, B.; Adlercreutz, P., Wax esters produced by solvent-free energy-efficient enzymatic synthesis and their applicability as wood coatings, Green Chem., 2005, 7, 837-840.

6.

Tseng, M. C.; Liang, Y. M.; Chu, Y. H.: Synthesis of fused tetrahydro-betacarbolinequinoxalinones sulfonyl)imide

in

1-n-butyl-2,3-dimethylimidazolium

([bdmim][Tf2N])

and

bis(trifluoromethyl-

1-n-butyl-2,3-dimethylimidazolium

perfluoro-

butylsulfonate ([bdmim][PFBuSO3]) ionic liquids, Tetrahedron Lett., 2005, 46, 6131-6136. 7.

Pernak, A.; Iwanik, K.; Majewski, P.; Grzymislawski, M.; Pernak, J.: Ionic liquids as an alternative to formalin in histopathological diagnosis, Acta Histochem., 2005, 107, 149-156.

8.

Guo, Z.; Xu, X.: New opportunity for enzymatic modification of fats and oils with industrial potentials, Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 2615-2619.

9.

Schafer, T.; Branco, L. C.; Fortunato, R.; Izak, P.; Rodrigues, C. M.; Afonso, C. A. M.; Crespo, J. G.: Opportunities for membrane separation processes using ionic liquids, Ionic liquids IIIb: Fundamentals, progress, challenges, and opportunities: transformations and processes acs symposium series, 2005, 902 97-110.

133

10. Yung, K. K. L.; Perera, J. M.; Smith, C. D.; Stevens, G. W.: The partitioning behavior of tyramine and 2-methoxyphenethylamine in a room temperature ionic liquid-water system compared to traditional organic-water system, Sep. Sci. Technol., 2005, 40, 1555-1566. 11. Izak, P.; Mateus, N. M. M.; Afonso, C. A. M.; Crespo, J. G.: Enhanced esterification conversion in a room temperature ionic liquid by integrated water removal with pervaporation, Sep. Purif. Technol., 2005, 41, 141-145. 12. Chen, I. H.; Young, J. N.; Yu, S. J.: Recyclable organotungsten Lewis acid and microwave assisted Diels-Alder reactions in water and in ionic liquids, Tetrahedron, 2004, 60, 1190311909. 13. Nara, S. J.; Harjani, J. R.; Salunkhe, M. M.: Ionic liquids: the new generation solvents, J. Indian Chem. Soc., 2003, 80, 1153-1161. 14. Mohile, S. S.; Potdar, M. K.; Harjani, J. R.; Nara, S. J., Salunkhe, M. M.: Ionic liquids: efficient additives for Candida rugosa lipase-catalysed enantio selective hydrolysis of butyl 2-(4chlorophenoxy)propionate, J. Mol Catal. B-Enzym., 2004, 30, 185-188. 15. Branco, L. C.; Afonso, C. A. M.: Ionic liquids as a convenient new medium for the catalytic asymmetric dihydroxylation of olefins using a recoverable and reusable osmium/ligand, J. Org. Chem., 2004, 69, 4381-4389. 16. Baker, S. N.; McCleskey, T. M.; Pandey, S.; Baker, G. A., Fluorescence studies of protein thermostability in ionic liquids, Chem. Commun., 2004, 940-942. 17. Swatloski, R. P.; Holbrey, J. D.; Rogers, R. D.: Ionic liquids are not always green: hydrolysis of 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate, Green Chem., 2003, 5, 361-365.

Publikáció: Fráter, T.; Ulbert, O.; Bélafi-Bakó, K.; Gubicza, L.: Thermal stability enhancement of Candida rugosa lipase ion ionic liquids, Comm. Agricult. Appl. Biol. Sci., 2003, 68/2a, 293-296.

Hivatkozások: 1.

Yang, Z.; Pan, W. B.: Ionic liquids: Green solvents for non-aqueous biocatalysis, Enzyme Microb. Tech., 205, 37, 19-28.

2.

Baker, G. A.; Baker, S. N.: A simple colorimetric assay of ionic liquid hydrolytic stability, Aust. J. Chem., 2005, 58, 174-177.

134

Publikáció: Ulbert, O.; Fráter, T.; Bélafi-Bakó, K.; Gubicza, L.: Enhanced enantioselectivity of Candida rugosa lipase in ionic liquids as compared to organic solvents, J. Mol. Catal. B- Enzym, 2004, 31, 39-45. Hivatkozások: 1.

Durand, J.; Teuma, E.; Gómez, M., Ionic liquids as a medium for enantioselective catalysis, Comptes Rendus Chimie, In Press

2.

Xia, Y. M.; Wu, H. P.; Zhang, Y.; Fang, Y.; Sun, S. Y.; Shi, Y. G.: Synthesis and application of ionic liquids in enzymatic catalysis, Prog. Chem., 2006, 18, 1660-1667.

3.

Itoh, T.; Matsushita, Y.; Abe, Y.; Han, S. H.; Wada, S.; Hayase, S.; Kawatsura, M.; Takai, S.; Morimoto, M.; Hirose, Y.: Increased enantioselectivity and remarkable acceleration of lipasecatalyzed transesterification by using an imidazolium PEG-alkyl sulphate ionic liquid, Chemistry-A European Journal, 2006, 36, 9228-9237.

4.

Illanes, A.; Wilson, L.; Caballero, E.; Fernandez-Lafuente, R.; Guisan, J. M.: Crosslinked penicillin acylase aggregates for synthesis of beta-lactam antibiotics in organic medium, Appl. Biochem. Biotech., 2006, 133, 189-202.

5.

Moon, Y. H.; Lee, S. M.; Ha, S. H.; Koo, Y. M..: Enzyme-catalyzed reactions in ionic liquids, Korean J. Chem. Eng., 2006, 23, 247-263.

6.

Tsukada, Y.; Iwamoto, K.; Furutani, H.; Matsushita, Y.; Abe, Y.; Matsumoto, K.; Monda, K.; Hayase, S.; Kawatsura, M.; Itoh, T.: Preparation of novel hydrophobic fluorine-substituted-alkyl sulfate ionic liquids and application as an efficient reaction medium for lipase-catalyzed reaction, Tetrahedron Lett., 2006, 47, 1801-1804.

7.

de María, P. D.; Sánches-Montero, J. M.; Sinisterra, J. V.; Alcantara, A. R.: Understanding Candida rugosa lipases: An overview, Biotechnol. Adv., 2006, 24, 178-194.

8.

Zheng, L.; Zhang, S.; Yu, X.; Zhao, L.; Gao, G.; Yang, X.; Duan, H.; Cao, S.: Enhancement of enantioselectivity in lipase-catalyzed resolution of N-(2-ethyl-6-methylphenyl)alanine by additives, J. Mol. Catal. B-Enzym., 2006, 38, 17-23.

9.

Zhao, H.: Effect of ions and other compatible solutes on enzyme activity, and its implication for biocatalysis using ionic liquids, J. Mol. Catal. B-Enzym., 2005, 37, 16-25.

10. Lee, S. M.; Chang, W. J.; Choi, A. R.; Koo, Y.M.: Influence of ionic liquids on the growth of Esherichia coli, Korean J. Chem. Eng., 2005, 22, 687-690. 11. Yu, X. W.; Li, Y. Q.: Microencapsulated mycelium-bound tannase from Aspergillus niger, Appl. Biochem. Biotech., 2005, 126, 177-187. 12. Kamal, A.; Chouhan, G.: Chemoenzymatic synthesis of calcilytic agent NPS-2143 employing a lipase-mediated resolution protocol, Tetrahedron-Asymmetr., 2005, 16, 2784-2789.

135

13. Mori, M.; Garcia, R. G.; Belleville, M. P.; Paolucci-Jeanjean, D.; Sanches, J.; Lozano, P.; Vaultier, M.; Rios, G.: A new way to conduct enzymatic synthesis in an active membrane using ionic liquids as catalyst support, Catal. Today, 2005, 104, 313-317. 14. De Diego, T.; Lozano, P.; Gmouh, S.; Vaultier, M.; Iborra, J. L.: Understanding structure Stability relationships of Candida antarctica lipase B in ionic liquids, Biomacromolecules, 2005, 6, 1457-1464. 15. Guo, H. M.; Cun, L. F.; Gong, L. Z.; Mi, A. Q.; Jiang, Y. Z.: Asymmetric direct aldol reaction catalyzed by an L-prolinamide derivative: considerable improvement of the catalytic efficiency in the ionic liquid, Chem. Commun., 2005, 11, 1450-1452. 16. Krieger, N.; Bhatnagar, T.; Baratti, J. C.; Baron, A. M.; de Lima, V. M.; Mitchell, D.: Nonaqueous biocatalysis in heterogeneous solvent systems, Food Technol. Biotech., 2004, 42, 279286.

Publikáció: Fráter, T.; Gubicza, L.; Szöllősy, Á.; Bakos, J.: Enantioselective hydrogenation in ionic liquids: Recyclability of the [Rh(COD)(DIPAMP)]BF4 catalyst in [bmim][BF4], Inorg. Chim. Acta, 2006, 359, 2756-2759.

Hivatkozások: 1.

Durand, J.; Teuma, E.; Gómez, M.: Ionic liquids as a medium for enantioselective catalysis, Comptes Rendus Chimie, In Press

2.

Liu, S.; Xiao, J.: Toward green catalytic synthesis—Transition metal-catalyzed reactions in nonconventional media, J. Mol. Catal. A-Chem., In Press

136

Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Gubicza Lászlónak, hogy elvállalta munkám irányítását, valamint ellátott hasznos szakmai tanácsokkal. Tisztelettel megköszönöm Dr. Gyenis János és Dr. Nagy Endre igazgató uraknak, hogy Ph.D. tanulmányaimat a Műszaki Kémiai Kutatóintézetben lehetővé tették, és ahhoz minden szakmai és anyagi segítséget biztosítottak. Köszönet illeti a Műszaki Kémiai Kutatóintézet valamennyi dolgozóját is. Molnár Ferencné a műszerek és berendezések beállításánál segített önzetlenül, Kelemenné Horváth Ilona a gáz- és folyadékkromatográfiás analízisbe avatott be, Nemestóthy Nándor a számítástechnikai és szakmai téren nyújtott segítséget. Kiemelten megköszönöm Bélafiné Bakó Katalinnak a biokémia, Kovács Sándornak a kémia és laboratóriumi

technológia

területén

nyújtott

segítséget.

Mindezen

túlmenően

segítségemre volt Ulbert Olga, Fehér Erika valamint Koroknai Balázs. Viszlay Renáta és Kiss Katalin diplomázók segítsége szintén felbecsülhetetlen értékű volt. A hidrogénezési reakciók végrehajtása során Dr. Bakos József látott el szakmai tanácsokkal, de feltétlenül meg kell említeni Édes Béla, Gulyás Henrik valamint Hegedűs Csaba nevét is, akik a laboratóriumi munka menetében segítettek. Köszönet illeti Dr. Tőrös Szilárdot is, aki tanszékvezetőként lehetővé tette számomra a hidrogénezési kísérletek végrehajtását a Szerves Kémia Tanszéken. Nélkülük valószínűleg nem készülhetett volna el ez a disszertáció. Nagy tisztelettel köszönöm a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítványnak, hogy tanulmányaimat (6 hónap ösztöndíj) és konferenciákra történő utazásaimat (két külföldi út) nagylelkűen támogatták. Ezúton is megköszönöm az OTKA T 31760 és T 37628 számokon nyújtott támogatását, amely kísérleteimhez megfelelő anyagi hátteret biztosított.

137