DETERS1 ZAT ANTI SKIZON PLASMODIUM FALCIPARUM DENGAN ELISA * (Suatu Penelitian Pendahuluan) Inge Sutanto, Rudi Muljono, Lisawati Susanto, Hendri Astuty, Wita Pribadi dan Rochida Uasidi*"
ABSTRACT A preliminary study based on ELISA was done to evaluate anti-malarial antibodies on 35 persons living in a hkpoendemic area, Wonosobo, Central Java. Schizonts o f Plasmodium falciparum strain Flores cultured in vitro were extracted and used as antigen. As negative controls, 27 sera were' drawn f m m British persons who had never been visiting endemic area. The result showed that 20% (7/35) o f the sample contained anti-malaria antibodies, however, by using chi-square test and Yate's correction it was shown that there was no significant difference between group of persons with parasite and/or splenomegaly compared to group o f persons without parasite and without splenomegaly (z, i 0.05). Key Words : Schizont, Plasmodium falciparum, Elisa
PENDAHULUAN Kekebalan alamiah yang diperoleh penduduk daerah endemik malaria telah dilaporkan oleh Cohen d k k l . Di daerah ini bayi dan anak-anak akan lebih banyak menderita penyakit malaria akut dan malaria berat dibandingkan orang dewasa yang sudah memiliki kekebalan akibat infeksi malaria yang terus-menerus sejak lahir. Reaksi kekebalan yang memberikan perlindungan terhadap hospesnya ini dapat dideteksi dengan mengukur zat anti yang spesifik dengan IFA2 13 f 4 . Tetapi kekurangankekurangan IFA seperti hasil pemeriksaan yang subyektif dan penggunaan mikroskop fluoresensi yang canggih menyebabkan keterbatasan penggunaan tes ini dalam melakukan skrinning zat anti * **
suatu populasi, terutama pada evaluasi suatu program vaksinasi malaria.
ELISA yang dikembangkan oleh Voller dkk5 telah diketahui kepekaan dan kespesifikannya dalam mendeteksi zat dari beberapa penyakit parasit, lagi pula pembacaan hasil yang obyektif dengan menggunakan ELISA reader, menempatkan ELISA sebagai suatu uji serologi yang lebih disukai dibandingkan dengan IFA. Pada penelitian ini ELISA dengan menggunakan skizon sebagai antigen dievaluasi untuk mengetahui sampai seberapa jauh tes ini dapat mendeteksi zat anti pada penduduk di daerah endemik malaria dalam kaitannya dengan parameter umur, parasitemia dan splenomegali.
Penelitian ini dibiayai ole11 SEAMEO PROJECT dengan judul "Seroepidemiologica1 Studies on Malaria in Tropmed Centre Countries". Bagian Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Salemba Ray a 6, Jakarta .
10
Bul. Penelit. Kesehat. 18 (2) 1990
Deteksi zat anti skizon.
.. .... . .. ..... . . . ....
BAHAN DAN CARA KERJA Antigen dibuat dari Plasmodium falciparum strain Flores yang dibiak secara in vitro sesuai dengan metode Trager dan Jensen6. Pada biakan dilakukan sinkronisasi dengan 5% sorbitol sehingga hanya diperoleh satu stadium saja7. Skizon yang matang dikonsentrasikan dengan Percoll gradient berdasarkan metoda Saul dkk8., kemudan sel darah merah yang terinfeksi dihemolisis dengan larutan saponin 0.1% dan endapan merozoit yang diperoleh disimpan pada suhu - 20°C dengan "protease inhibitors" yaitu TPCK, TLCK dan PMSF sesuai dengan metode Muljonog . Setelah dikumpulkan skizon kemudian dipecah dengan Sonicator MSE 150 (suatu ultrasonic desintegrator t selama 3 menit dengan interval 30 detik dan amplitudo 4 mikron dalam PBS 7,2 pada suhu 4°C. Kemudian diputar dengan kecepatan 9.000 g selama 30 menit pada suhu 4°C. Pellet yang terbentuk kemudian dibuang dan supernatannya digunakan sebagai antigen. Kandungan protein diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm dengan BSA (Bovine Serum Albumine) sebagai protein standar. Lebih kurang 1 mg protein diieroleh dalam 1 ml antigen dan selanjutnya antigen disimpan pada suhu - 20" C. ELISA dilakukan terhadap 35 serum penduduk daerah hipoendemik malaria, Wonosobo, Jawa Tengah untuk mendeteksi adanya zat anti terhadap Plasmodium falciparum. Serum berasal dari penduduk dengan distribusi umur berkisar antara 4 tahun - 81 tahun, dengan perincian
Bul. Penelit. Kesehat. 18 (2) 1990
. Inge Sutahto et. al.
sebagai berikut: 19 orang bemsia < 15 tahun dan 16 orang bemsia > 15 tahun. Pada pemeriksaan parasitologis, terdapat 8 orang yang mengandung parasit Plasmodium falciparum dalam darahnya baik stadium cincin dan/atau gametosit, 5 diantaranya berusia < 15 tahun, sedangkan 3 orang lainnya berusia > 15 tahun (tabel 1). Diantara ke 8 penderita tersebut di atas, 3 di antaranya juga menunjukkan adanya splenomegali (tabel 1). Penderita dengan splenomegali saja ada 3 orang, 2 di antaranya berusia < 15 tahun sedangkan yang satu berusia > 15 tahun. Jadi dari 35 orang penduduk yang diteliti zat antinya hanya 11 orang (3 1%) mempunyai tanda-tanda terinfeksi malaria yaitu mengandung parasit dan/ atau splenomegali, sedangkan sisanya yaitu 24 orang (69%0) tanpa parasitemia dan tanpa splenomegali (tabel 1). Sebagai kontrol negatif digunakan 27 serum orang Inggris yang belum pernah ke daerah endemik malaria. ELISA dilakukan sesuai dengan metode Vo!ler dkkS yang dimodifikasi dengan menggunakan blok buffer (PBS pH 7,2 yarlg berisi Tween-20 0,05%, BSA 0,5% dan Skim Milik 5%) untuk menghambat reaksi yang tidak spesifik sebelum serum ditambahkan ke sumur ELISA yang telah disensitisasi dengan antigen. Lempeng ELISA yang dipakai adalah LinbroITitertek cat no. 76 381-04, Flow Laboratories. Antigen diencerkan dengan 0,06 M buffer carbonat pH 9,6 dengan pengenceran 10 mikrogram per milimeter atau 1 mikrogram per sumur ELISA. Serum diencerkan mulai dari 1/40 dan dilakukan secara duplikat. Sedangkan konjugat yang dipakai adalah
Deteksi zat anti ~kizon.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inge Sutanto et. a~ '
,
Tabel 1. Distribusi parasitemia dan splenomegali dan hasil ELISA positif pada 35 orang penduduk hipoendemi malaria, Wonosobo, Jawa Tengah, sesuai dengan umur. Umur 4 5 Thn.
Umur > 15 Thn.
JUMLAH
Parasitemia + Splenomegali -
21 1
311
512
Parasitemia Splenomegali +
211
1614
3517
Klasifikasi Parasitemia + Splenornegali +
Parasitemia Splenomegali JUMLAH
1913 --
*
Jumlah penderitalELISA positif
Goat anti Human Ig G perozidase (Sigma A-6029) yang diencerkan 11800. Hasil dikatakan positif bila pada pengenceran serum 1/40 diperoleh nilai O.D. pada 490 nm (Optical Density) lebih besar atau sama dengan nilai tengah atau nilai rata-rata 27 serum kontrol negatif ditambah 2 S.D. (Standar Deviasi). Analisis statistik dilakukan dengan "chisquare" serta "Yate's correction"
.
Dari 35 serum yang diperiksa hanya ada 7 serum (20%) yang menunjukkan hasil positif, dengan perincian sebagai berikut; pada kelompok usia (1 5 tahun : 1 orang dengan parasitemia dan splenomegali, 1 orang dengan parasitemia saja dan 1 orang dengan splenomegali saja. Sedangkan pada kelompok usia > 15
tahun ada 4 orang dengan hasil positif yaitu 1 orang dengan parasitemia tanpa splenomegali sedangkan 3 orang lainnya tidak mengandung parasit dan tidak menunjukkan splenomegali (tabel 1).
PEMBAHASAN Penduduk suatu daerah endemik malaria dikatakan terpapar terhadap parasit malaria sejak lahir. Kontak antara parasit dan hospes yang terns-menerns ini akan menyebabkan hospes membentuk zat anti yang akan meningkat jumlahnya sesuai dengan umur. Selain itu pada saat terjadi reinfeksi yang tercermin dengan adanya parasit dalam darah jumlah zat anti juga akan bertambah. Splenomegali adalah suatu fenomena imunologi dengan terjadinya hiperaktifasi limpa yang juga akan menyebabkan
Bul. Penelit. Kesehat. 18 (2) 1990
Deteksi zat anti skizon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inge Sutanto et. al.
peningkatan jumlah zat anti. Sehingga dapat dikatakan dalam melakukan suatu studi seroepidemiologi malaria di suatu daerah endemik, parameter umur, parasitemia dan splenomegali mempunyai peranan yang penting dalam menentukan keadaan zat anti malaria penduduk daerah tersebut. Pada penelitian yang dilakukan terhadap 3 5 orang penduduk di daerah hipoendemik, Wonosobo, Jawa Tengah ternyata tidak sama semua orang dengan parasitemia memperlihatkan adanya zat anti skizon dalam serumnya (318 = 37,5%). Hal ini berbeda dengan laporan beberapa peneliti lain yang pada umumnya memperlihatkan hampir semua penderita parasitemia memberikan hasil ELISA yang posidengan persentasi sekitar tif1 3 80% - 100%. l1
Splenomegali mungkin terjadi akibat penyakit malaria yang menahun; dan ini ditunjukkan oleh adanya trofozoit dan/ atau gametosit pada 3 orang (50%) diantara semua (6 orang) dengan splenomegali. Pada orang-orang dengan splenomegali hanya ada 33% (216) yang memberikan hasil ELISA positif, walaupun pemeriksaan IFA dengan menggunakan stadium skizon sebagai antigen memberikan hasil positif pada semua orang dengan splenomegali ini (L. Susanto, unpublished observation). Selain itu, hasil uji statistik juga menunjukkan tidak adanya perbedaan hasil ELISA yang bermakna antara kelompok dengan parasit dan/atau splenomegali dengan kelompok tanpa parasit dan tanpa splenomegali (tabel 2).
Tabel 2. Hasil pemeriksaan ELISA penduduk hipoendemik malaria, Wonosobo, Jawa Tengah, yang berkaitan dengan perasitemia dan splenomegali. Klasifikasi
ELISA positif
ELISA negatif
JUMLAH
Tanpa parasit dan tanp a Splenomegali
3/21,5
21/87,5
241100
JUMLAH
7/20,0
29/80
351100
Parasit dan/atau splenomegali
*
Jumlah/persentase
Dengan chi-square dan Yate's correction didapatkan p
Hal ini mungkin disebabkan karena adanya perbedaan antigenitas strain Flores dan strain Wonosobo, walaupun untuk kebenarannya masih hams dilaku-
Bul. Penelit. Kesehat. 18 (2) 1990.
> 0.05 kan beberapa penelitian lainnya, misalnya dengan melakukan ELISA yang menggunakan 2 macam strain (Flores & Wonosobo) sebagai antigen atau dapat
'
13
Deteksi zat anti &on
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inge Sutanto et. al.
juga dengan melakukan karakterisasi antigen dengan teknik SDS-PAGE dan mereaksikannya dengan serum sesuai dengan teknik Western-blot. Adanya perbedaan antigenitas beberapa strain Plasmodium falciparum yang mempengaruhi hasil ELISA telah dilaporkan oleh Tharavanij dkk13, sedangkan McBride dkk14 melaporkan adanya "antigenic diversity" stadium merozoit pada beberapa isolat.
Pada hasil penelitian Spencer dkkl' zat anti malaria lebih banyak ditemukan pada orang-orang di atas 15 tahun, karena populasi ini lebih lama terpapar terhadap parasit dibandingkan dengan anak-anak. Walaupun hasil uji statistik memberikan perbedaan yang tidak bermakna antara kedua kelompok tersebut di atas (tabel 3) tetapi ha1 ini masih belum dapat dievaluasi pada penelitian pendahuluan ini karena belum seluruh serum diperiksa zat antinya.
Hasil pemeriksaan ELISA penduduk hipoendemik malaria, Wonosobo, Jawa Tengah, sesuai dengan golongan wnur.
*
Klasifikasi
ELISA positif
ELISA negatif
JUMLAH
Umur < 15 Tahun
3/16*
16/84
191100
Umur 2 15 Tahun
4/25
12/75
16/100
JUMLAH
7/20
28/80
35/100
Jumlah/persentase
Dengan chi-square dan Yate's corection didapatkan p
> 0,05
KESIMPULAN
DAFTAR RUJUKAN
Penggunaan strain antigen yang tidak sesuai mungkin akan mempengaruhi hasil penelitian, karena itu hasil yang diperoleh dengan ELISA sebaiknya djbandingkan dengan metode IFA yang sudah standar.
1. Cohen, S., Mc Gregor, I. A. and Carrington, S. (1961). Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192 : 733 - 737. ~. 2. Ambroise - Thomas, P., Wernsdofer, W.H., Grab, B., Cullen, J. & Bertagna, P. (1976).
14
Bul. Penelit. Kesehat. 18 (2) 1990
Deteksi zat anti &on
I.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Inge Sutanto et. al.
A sereopidemiological study of malaria in Tunisia. Bull. W.H.O. 54 : 355367.
zoites of Plasmodium falciparum; A thesis of Master Medicine, Mahidol University, Bangkok : 40-47.
3. Manawadu, B. R. & Voller, A. (1978). Standardization of the indirect fluorescent antibody test for malaria Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 72 : 456 - 462.
10. Voller, A., Huldt, G., Thors, C., Engvall, E. (1975). New Serological Test for Malaria antibodies. Br. Med. J. 1 : 659-66 1. 11. Spencer, H. C., Collins, W. E., Warren, M., Jeffery, G. M., Mason, J., Huong, A. Y., StanfiU, P. S., and Skinner, J. C. (1981). The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Malaria 111. Antibody response in doumented Plasmodium falc@arum infections. Am. T. Trop. Med. Hyg. 30 : 747 750. 12. Lee, M. & Lambros, C. (1988); The EWSA - U : an enzyme-linked immunosorbent assay using urease as the enzyme marker for rapid detection of Plasmodium falciparum antibody in human serum; Am. J. Trop. Med. Hyg 3 9 : 421-426.
4. Manawadu, B. R. & Voller, A. (1978).
Detection and measurement of species spesific malarial antibodies by immunofluorescence test; Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 72; 463-466. 5. Voller, A., Bartlett. A. and Bidwell, D. E. (1976). Enzyme immunoassays for parasitic diseases Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 70 : 98-106. 6. Trager, W. & Jensen, J.R. (1976). Human malaria parasites in continuous culture. Science. 1983 : 673-675. 7. Lambros, C. & Vandenberg, J. P. (1979). Synchoronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65 : 418-420. 8. Soul, A., Myler, P., Elliott, T., and Kidson, C. (1982). Purification of mature schizonts of Plasmodium falcipaium on colloidal silica gradient. Bull. W.H.O., 6 0 : 755-759. 9. Muljono, R. (1987). Comparison of antigenicity of intraschizont merozoites and extra-cellularly developed mero-
Bul. Penelit. Kesehat. 18 (2) 1990
13. Tharavanij, S., Tantivanich, S., Chongsanguan, M., and Prasertsiriroj, V. (1982); Comparison of various serological test results using antigen from different stains of Plasmodium falcipaium; Southeast Asia J . Trop. Med. Pub. Hlth; 13 : 174-180. 14. McBride, J., Walllker, D., and Morgan, G. (1982); Antigenic diversity in the human malaria parasite Plasmodium fa& cipmum; Science. 217 : 254-257.
