Cytogenetika chromosom
jádro
telomera centomera
telomera buňka
histony
dvoušroubovice DNA
páry bazí
Typy chromosomů
Karyotyp člověka • 46 chromosomů • 22 párů autosomů (1-22 od největšího po nejmenší)
• 1 pár gonosomů (X a Y) 7 skupin - dle velikosti a morfologie (A-G) 46,XX nebo 46,XY
Cytogenetické vyšetření • Preimplantační - vyšetření embrya před implantací do těla matky (při umělém oplodnění) • Prenatální – vyšetření plodu • Postnatální
Materiál pro cytogenetické vyšetření • Periferní krev • Fibroblasty z kožní biopsie
• Kostní dřeň • Nádor
• Sekční materiál (v případě úmrtí pacienta)
Kultivace periferní krve • Fytohemaglutinin – vysoce imunogenní látka – působí proliferaci lymfocytů kolcemid
Vzorek krve
Kultivace
Hypotonizace
Fixace
Barvení chromosomů • Klasické barvení (Giemsovo barvivo)
G - pruhování
46,XX
46,XY
Základní morfologické skupiny chromozomů
A
B 4–5
C 6 – 12
D 13 – 15
F
19 – 20
E
G 21 – 22
Karyotyp člověka Skupina
Chromosomy
Tvar a velikost
A
1–3
veliký metacentrický
B
4–5
veliký submetacentrický
C
6 – 12 (+X)
stř. submetacentrický
D
13 – 15
stř. akrocentrický
E
16 – 18
malý submetacentrický
F
19 – 20
malý metacentrický
G
21, 22, Y
malý akrocentický
velké metacentry malé metacentry velké akrocentry malé akrocentry zbytek submetacentry
Každý G-pruh má své číslo Chromozom X s očíslovanými G-pruhy
Syndrom fragilního X
Xq27.3
Další metody barvení chromozomů • R-pruhování – reverse banding
• C-pruhování – constitutive heterochromatin • Ag-NOR – nucleolar organizers (barvení stříbrem) • Q-pruhování – quinacrine (chinakrin)
Chromosomální aberace • numerické (změny v počtu chromosomů) polyploidie - změna v počtu celých chromosomových sad – triploidie – tetraploidie aneuploidie - změna v počtu jednotlivých chromosomů – monosomie – trisomie
• strukturální (přestavby částí chromosomů) nebalancované balancované
Chromosomální aberace • strukturální (přestavby částí chromosomů) nebalancované balancované
DELECE - del INTERSTICIÁLNÍ
DELECE TERMINÁLNÍ
RING CHROMOSOM
ISOCHROMOSOM
INVERZE
paracentrická
pericentrická
Inverze paracentrická
Nosiči - snížená plodnost - riziko narození postiženého dítěte nízká
Inverze pericentrická
Nosiči – riziko narození postiženého dítěte 1-10% v závislosti na velikosti inverze
TRANSLOKACE RECIPROKÁ
TRANSLOKACE ROBERTSONOVA
Metoda FISH (fluoresceční in situ hybridizace)
FISH (fluorescenční in situ hybridizace ) kombinace cytogenetické a molekulární metody ● bez nutnosti izolace DNA ● pomocí značených DNA sond umožňuje vizualizaci úseků DNA v chromozomech, buňkách nebo tkáních přímo na mikroskopickém preparátu (= in situ) ● cíl DNA sondy - gen, celý chromozom či jeho část ●
Metoda FISH - spojení postupů klasické cytogenetiky a technologie molekulární genetiky Založena na schopnosti jednovláknové (denaturované) sondy DNA vázat se k cílové sekvenci (princip komplementarity) Použití pro vyšetření chromosomů v mitóze nebo v interfázi DNA sonda je předem označena některým fluorochromem (př. Texas Red, FITC, atd.) Je možné použít několik typů sond – centromerické, lokus-specifické, malovací, konkrétní sondu volíme podle indikace vyšetření Centromerické sondy: tvořeny -satelitními sekvencemi repetitivní DNA přítomné v oblasti centromery rychlá detekce numerických aberací, zejména v nedělících se buňkách Lokus-specifické sondy: váží se specificky na vybrané místo (lokus) na chromosomu stanovení některých strukturálních změn (mikrodeleční syndromy, specifické translokace u některých malignit atp.)
Hybridizace
cílová DNA
denaturace
hybridizace
sonda
FISH
Délka sondy pro FISH • cca 300 – 600 bp. • pokud je cílový úsek delší, musí být sonda před použitím naštěpena.
NE !
Mnohobarevná malovací sonda – karyotyp nádor hyperdiploidní počet chromosomů + přestavby
Typy sond
telomerická
centromerická
centromerická
Typy sond malovací – 1, 4 a 8
X- a Y-centromerická
lokus - specifická
Barvení chromosomů Mnohobarevné pruhování (M-BAND) nejnovější modifikace metody mnohobarevné FISH (M-FISH zpřesnění cytogenetické diagnostiky CA v jedné reakci analyzuje celý genom použitím mixu 24 rozdílných DNA sond každý chromosomový pár jinou barva tzv. parciálních malovacích sond specifické pro určitou oblast vyšetřovaného chromozomu 5 spektrálně odlišnými fluorochromy a jejich vzájemnou kombinací.
G-pruhy
FISH
M-BAND
parciální karyotyp: duplikace krátkého ramena chromosomu 9 ● výsledný obraz ● nasnímané jednotlivé fluorochromy ● intenzity jednotlivých fluorochromů ● ideogram chromosomu ● pseudo G-pruhy
Lokus specifické sondy vyšetření amplifikace onkogenu HER2/NEU
Normální nález
Amplifikace prokázána
