Csecsemı és gyermekkori fertızések diagnosztikája
Kenesei Éva Bókay délután 2011. február 3.
Diagnosztika ciklusa Betegvizsgálat, presumptiv dg. laboratóriumi kérés, mintavétel, mintaszállítás 0-6 óra
Hagyományos Dg. Biokémiai vizsgálat
Molekuláris Dg. Humán genetika, pharmakogenetika
1ó
Gyors POCT Dg. Mikroszkópos
1ó Mikrobiológia
Molekuláris mikrobiológia
Immun dg.
1ó
POC molekuláris dg. készülékek
Hematológia
12ó.
12ó.
Gyors multiparaméteres
Eredmény Tenyészet id.
Pozitív HK
>24ó Identifikálás, antibiogramm (24 órás laboratórimban) Eredmény átadás, interpretálás, terápiás beavatkozás: Órák-napok
Azonnali döntés
Bakteriológiai vizsgálatok gyorsítása: 24 órás rendelkezésre állás: 12-18 órával elıbb adható eredmény! pl.: pozitív hemokultúra azonnali feldolgozása A kitenyészett kórokozó identifikálása, érzékenység vizsgálata: Félautomata rendszerekkel 6-12 óra Molekuláris módszerek POCT módszer 1-2 órán belül eredmény, de a vizsgálható mikroorganizmusok száma nagyon korlátozott.
A világon az 56 millió haláleset 25%-át infekciós megbetegedés okozza. Infekciós megbetegedések mortalitása: • 1900 elıtt • 1900és 1980 között • 1995
797/100 000 36/ 100 000 63/100 000
Növekedés oka: AIDS, multidrog rezisztens kórokozók kiszelektálódása, régi baktériumok új szerepben-megbetegedést okoznak.
Cél: a mikrobiológiai diagnosztika gyorsítása Mikrobiológiai gyorsdiagnosztikai technikai fejlıdése: jelentısen elmaradt a klinikai kémiai vizsgálatokhoz képest Klinikai kémia: 1990-es évektıl automatizálás Mikrobiológia /bakteriológia: autómata rendszer a 2000-es évektıl Jelenleg rutinszerően alkalmazott „gyors” módszerek- a mikrobiológia szők területén alkalmazhatók: specificitás, szenzitivitás nem elégséges, csak részleges diagnosztikára alkalmasak: • Mikroszkópos technikák • Immunoassay • Immunkromatográfia • Immunfiltráció • (Nuklein sav kimutatás)
Gyorsdiagnosztikai módszerek Mikroszkópos vizsgálatok
1676
• • • • • • •
Leeuwenhoek's microscope consisted simply of: A) a screw for adjusting the height of the object being examined B) a metal plate serving as the body C) a skewer to impale the object and rotate it D) the lens itself, which was spherical
Fénymikrosztkóp Natív és festett készitmények
Fénymikroszkóp elınye: gyors, olcsó, pozitív esetben informatív Hátrányai: alacsony szenzitivitás és specificitás, gyakorlott szakembert igényel Elektronmikroszkóp: rutinban nem használjuk
Direct antigen kimutatás IF technikával RSV
Légúti és oppurtunista mikróbák kimutatása: Respiratory Syncycial Vírus, Influenza A és B, Para-influenza 1, 2, és 3., Adenovírus CMV , Legionella pneumopila (monoklonalis antitestet használ, minden szerotípus kimutatható) Pneumocystis jirovecii (carinii)
CMV
Legionella spp.
Pneumocystis sp.
Latex agglutinációs tesztek Szolubilis antigén kimutatás A leggyakoribb meningitist okozó baktériumok polysaccharid sejtfal antigén kimutatása immunológiai módszerrel (latex agglutináció) Kimutatható kórokozók: Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae Neisseria meningitidis B csoport/ E. coli K1 Neisseria meningitidis A Neisseria meningitidis C Neisseria meningitidis A, C, Y, W135
A liquor üledék mikroszkópos vizsgálata és CSF tesz együttes szenzitivitása és specificitása 90-97%-os. CSF teszt elınye: gyors elızetes diagnózis antibiotikus elıkezelés után is pozitív eredményt ad. Eredmény: 1 órán belül
MSSA/MRSA kimutatása latex agglutinációval (tenyészetbıl)
MRSA azonosítása (MecA gén, PBP2) latex agglutinációs teszt tenyészetbıl).
Immunkromatográfia Minta helye
Nitrocellulóz
Abszorpciós réteg
Konjugáló réteg
Teszt vonal(ak) és kontroll
monoklonális anti XY mikróba Ab
Színreakció
Gyakorlatban használt immunkromatográfiás gyorstesztek
Teszt Minta Szenzitivitás specificitás % megjegyzés ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Group A Strepto. Torokváladék 53-99 62-100 Negatív eredmény konfirmálás tenyésztéssel Pneumococcus Ag Vizelet, pleurélis foly, CSF 66-70 90-100 Bacteriaemiával járó pneumóniában jobb szenzitivitás Legionella Ag. Vizelet 76 99 Csak az 1-es szerotípust mutatja ki Group B Strepto. Hüvelyváladék 94-97 96-100 Clostridium difficile széklet 49-80 95-96 kevésbé érzékeny, mint a tenyésztés toxin RSV Ag nasopharingealis minta 59-97 75-100 gyermekeknél maga vírusszám miatt jobb érzékenység Influenza Ag nasopharingealis minta 20-55 99 Felnıtteknél alacsonyabb szenzitivitás Rotavírus Ag széklet 75-99 95 Adenovírus Ag széklet 22 84 Giardia lamblia széklet 58-98 97-98 Mikroszkópos vizsgálattal együtt (HIV gyorsteszt) vér 99-100 99-100 Megerısítı vizsgálat kell. (Malária teszt) vér 87-100 52-100 Plasmodium falciparum-ra jobb érzékenység
Streptococcus pyogenes antigén kimutatás garatváladékból
Streptococcus A csoport Streptococcus pyogenes Megbetegedés: Streptococcus A pharingitis pharyngotonsillitis kórokozója.
-
Diagnosztika: Vattapálcás garatváladék mintavétel Immunkromatográfiás antigén kimutatás
Strepto A
Streptococcus pneumoniae
Gram pozitív diplococcus A alsó és felsı légúti infekciók, pneumónia gyakori kórokozója. Bakteriális meningitis egyik gyakori kórokozója
S. pneumoniae solubilis antigén kimutatása: • •
Immunkromatográfiás teszt Latex agglutinációs teszt
Pneumónia diagnózisához használható minták: Vizelet Pleura punctatum 24 órás antibiotikum terápia után a teszt még pozitív eredményt ad S. pneumoniae vaccináció után 48 órával a vizelet teszt pozitív eredményt ad. A vaccináció hatása a CSF vizsgálatot nem befolyásolja
Gastrointestinalis megbetegedések
Vírusos hasmenés Leggyakoribb kórokozói: • • • •
Rota vírus (A csoport) Enterális adenovírus (40 és 41 szerocsoport) Calicivírus és Norwalk ágens Astrovírus
immunkromatográfia
Nitrocellulóz
Minta helye
Konjugáló réteg monoklonális anti
Teszt vonal 1.
Teszt vonal 2.
Kontroll vonal
Monoklonális Anti Adeno Ab
Monoklonális Anti Rota Ab
Birka anti-nyúl Ab
-Adeno Ab( piros latex)anti -Rota Ab (kék latex)
Abszorpciós réteg
negatív
Adenopozitív
Adenopozitív
Rota-, Adenopozitív
Clostridium difficile toxin kimutatás Gram pozitív anaerob spórás pálca – tenyésztése idıigényes Kórházban szerzett hasmenés kórokozója ( antibiotikum szedés után) Fontos nosocomialis pathogén Súlyosabb esetben pseudomembranosus colitis – toxin mediálta súlyos vastagbél károsodás A megbetegedésért a baktérium toxinja a felelıs • Toxin A: szövetkárosító enterotoxin • Toxin B: citopathogen hatás Gyors kóroki diagnózis – toxin kimutatása székletbıl Immunkromatográfiás gyorsteszt A toxinok bomlékonyak! Mintatárolás 2-8 ºC-on!
Toxin A kimutatása az elterjedt, de lehet toxin A negatív, toxin B pozitív törzs is kórokozó Ál pozítív: • véres széklet Ál negatív: • a betegség kezdeti szakaszában toxintermelés a kimutathatósági határ alatti - a vizsgálat ismétlése indokolt. • A toxin elbomlott Fontos tudni, hogy csak Toxin A-t vagy mindkét toxint kimutatja-e a teszt !
Modern diagnosztikai eljárások súlyos infekciók diagnosztikájában Molekuláris vizsgálatok a rutin gyakorlatban: PCR alapú technikák (real-time PCR, Multiplex PCR, nested PCR, stb, Molekuláris amplifikáció In vitro gyorstesztek (MRSA, Strepto B, Clostridium difficile toxinok, Mycobacterium spp.) Szepszis laboratóriumi diagnosztikája: Jelentısége: Az esetek 90%-ba 30 különbözı lehet a kórokozó, közülük néhány multidrog rezisztens törzs. Hagyományos módszer lassú. Diagnosztika lépései: Korokozó tenyésztése – identikálás antibiotikum/antimikotikum érzékenység meghatározása.
Hagyományos diagnosztikát gyorsító módszerek: Szelektív, differenciáló táptalajok Kitenyészett kórokozó gyors identifikálása: • Nukleinsav alapú meghatározás 16SrRNS gén szekvenálás
• „fehérje” alapú meghatározás: MALDI-TOF MS (Matrix assisted leser desorption-ionisation time of flight mass specrometry)
Gyors érzékenység meghatározás, rezisztencia típusok, gének kimutatása.
Bacteroides fragilis
DiversiLab –izolált baktériumok automata genotipizálása Mikróbiális fertızések forrásának, terjedésének, kolonizációjának kontaminációjának vizsgálatára
DNA LabChip
Dendrogram-minták közti hasonlóság
Szepszis kórokozóinak kimutatása direkt vérmintából (SeptiFast) Valós idejő PCR zárt rendszer, DNS –tisztítástól az amplifikáción át a detektációs lépésig autómata. Kontaminációra kevésbé érzékeny. Magas specifisitás és szenzitivitás Eredmény 2-3 órán belül.
Szepszis kórokozóinak kimutatása direkt vérmintából (SeptiFast)
Szepszis kórokozóinak kimutatása direkt vérmintából (SeptiFast) Real –time, multiplex PCR 21 baktérium species/baktériumcsoport és gombák kimutatására (összesen 40 patogén) Szükséges minta: 3 ml vér Gram (-)
Gram (+)
Gomba
E. Coli Staph. aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) Koag. neg. staph. Candida tropicalis Serratia marcescens Str. pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloaceae/aerog.) Streptococcus spp. Candida krusei Proteus miarabilis Enterococcus faecium Candida glabrata Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumanii mecA antigén (Staph. aureus) Stenotrophomonas maltophilia Kórokozó kimutatás 6 óra, de nincs érzékenységi vizsgálat, és drága.
A jövı diagnosztikája MAZER (nanométer nagyságú mágneses részecskék, mágneses erı és nagy érzékenységő mágneses szenzor detektálás.) Alkalmazása: kórokozók kimutatása vérbıl 1 órán belül. Bankkártya mérető eszközbe kell injektálni a vizsgálandó mintát (vér), amely tartalmazza a reagenseket és a detektáló modult, majd az analizátorba helyezni a kártyát.
Molekuláris technika
Mágneses technika
Összegzés: • Mikrobiológia területén a 2000-es évek végétıl indult az • automatizáció. • POCT tesztek a kórokozók szők spektrumára alkalmazhatók. • Laboratóriumok számára PCR technikák elérhetık, drága és célzott vizsgálatra alkalmas. • Hagyományos tenyésztéses eljárás az antibiotikum érzékenységi vizsgálat fontossága miatt nem nélkülözhetı. Új módszerek kombinálásával, a vizsgálati idı lerövidíthetı.
Köszönöm a figyelmet!
