Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/35942 holds various files of this Leiden University dissertation Author: Ent, Wietske van der Title: In vivo modelling of Ewing sarcoma in zebrafish Issue Date: 2015-10-22
&KDSWHU
Nederlandse samenvatting
6DPHQYDWWLQJHQDIVOXLWHQGHFRPPHQWDUHQ
10
(ZLQJVDUFRRP (:6 LVHHQ]LHNWHZDDUYRRUHUJURWHEHKRHIWHLVDDQ QLHXZHWKHUDSHXWLVFKHVWUDWHJLHsQ+HWLVKHWWZHHGHPHHVWYRRUNRPHQGH bot- en weke delen sarcoom wat kinderen en jongvolwassenen aangrijpt, en een kwart van patiënten presenteert met metastasen op het moment YDQ GLDJQRVH :DQQHHU PHWDVWDVHQ DDQZH]LJ ]LMQ LV KHW YRRUXLW]LFKW van de patiënt slecht: waar er met lokale ziekte een 60-70% kans van overleven zonder terugval is, neemt dit af naar slechts 20-30% in het JHYDOYDQDDQZH]LJHPHWDVWDVHQ,QGLWSURHIVFKULIWZRUGWGH]HEUDYLV naar voren gebracht als een innovatief model organisme voor EWS RQGHU]RHN 'H ]HEUDYLV LV JHGXUHQGH GH ODDWVWH GHFHQQLD PHHU HQ PHHU JHEUXLNW LQ KHW YHOG YDQ NDQNHURQGHU]RHN (U LV HHQ KRJH PDWH van conservatie van tumor suppressie genen en oncogenen tussen mens en zebravis, wat de translationele waarde van transgene zebravis NDQNHUPRGHOOHQRQGHUVWHXQW0HWEHWUHNNLQJWRW[HQRJUDIWPRGHOOHQLV de scheiding in tijd tussen ontwikkeling van het aangeboren en adaptief LPPXXQV\VWHHPHHQDDQWUHNNHOLMNNHQPHUNYDQGH]HEUDYLV7RWZHNHQ na fertilisatie is er geen volledig ontwikkeld adaptief immuunsysteem, wat toelaat humane kanker cellen te implanteren zonder additionele LPPXQRVXSSUHVVLYDWRWGLWWLMGVSXQW +HW]HEUDYLVLPSODQWDWLHPRGHO WRHJHSDVWLQ+RRIGVWXNHQ +RRIGVWXN), waarbij EWS cellen worden geïmplanteerd in de dooier van 2 dagen oude zebravis embryo’s, is een nuttige nieuwe techniek in KHWYHOGYDQ(:6RQGHU]RHN+HWELHGWHHQVQHOOHPHWKRGHRPWHNLMNHQ naar deling en migratie van kanker cellen in vivo, en de veranderingen van deze eigenschappen wanneer behandeling met chemische stoffen RI JHQHWLVFKH LQJUHSHQ ZRUGHQ WRHJHSDVW (HQ ZDDUGHYRO NHQPHUN van dit model is diens buitengewone bekwaamheid voor het uitvoeren van niet-invasieve, live microscopie in vivo.+RHZHOVOHFKWVLQFLGHQWHHO toegepast in dit proefschrift, kunnen zebravis embryo’s gebruikt worden voor het maken van timelapse-videos door ze in te bedden in agarose PHW HHQ ODDJ VPHOWSXQW PHW GH MXLVWH RSVWHOOLQJ NXQQHQ GH]H ]HOIV RYHU HHQ SHULRGH YDQ PHHUGHUH GDJHQ ZRUGHQ XLWJHYRHUG (U LV HHQ batterij aan transgene en mutante zebravis lijnen beschikbaar, wat uitkomst biedt bij het onderzoek naar interactie tussen tumor cellen en het bloedvatenstelsel, het immuunsysteem, en andere componenten YDQ GH WXPRU PLFURRPJHYLQJ LQ GH JDVWKHHU )OXRUHVFHQWH UHSRUWHU OLMQHQ YRRU VSHFL¿HNH VLJQDOOHULQJVURXWHV ]RDOV GH TG(EPV.Tp1-Mmu. +EE QOVP&KHUU\ ia7 vis voor de Notch signalleringsroute, gebruikt in +RRIGVWXN) maken het mogelijk de activiteit van signaaltransductie in OHYHQGHHPEU\R¶VWHYROJHQ0HWGHRQWZLNNHOLQJYDQKHW&5,635&DV systeem is het produceren van mutante zebravislijnen en relatief snel HQ PDNNHOLMN SURFHV JHZRUGHQ +LHUQDDVW LV WHYHQV GH YHHOJHEUXLNWH morpholino technologie beschikbaar, waarmee transiënte verlaging van JHQH[SUHVVLH ZRUGW EHZHUNVWHOOLJG GRRU LQMHFWLH YDQ ROLJRQXFOHRWLGHQ Al deze beschikbare technologieën samen maken de zebravis een zeer 174
ÀH[LEHO PRGHO RP KHW SURFHV YDQ (:6 YRRUWJDQJ LQ WH EHVWXGHUHQ Echter, geen enkele techniek is zonder haar beperkingen: dit model is ontworpen met vooral de eerste stadia van tumor progressie in JHGDFKWH%HJLQQHQGPHWFLUFDFHOOHQLQGHGRRLHUNDQPLJUDWLHZHJ van de plek van implantatie waargenomen worden, evenals proliferatie YDQGH]HFHOOHQ'RRUKHWWLMGVEHVWHNYDQGH]HH[SHULPHQWHQKHEEHQ we de verdere ontwikkeling van cellen gevestigd op secundaire locaties QLHWJHYROJG'H]HPLFURPHWDVWDVHQZHUGHQVRPVZDDUJHQRPHQRS GDJHQSRVWLQMHFWLH GSL PDDUPHHVWDORSGSLZDWVDPHQYDOWPHWGH laatste dag van het merendeel van zebravis experimenten als gevolg YDQJHOGHQGHSURHIGLHUUHJHOJHYLQJ+RHZHOKHWPRJHOLMNLVWRHVWHPPLQJ aan te vragen om de tumor ontwikkeling na dit tijdspunt in het implantatie PRGHO ]XOOHQ DQGHUH IDFWRUHQ LQ ]XONH H[SHULPHQWHQ HHQ URO VSHOHQ Bijvoorbeeld de noodzaak van immunosuppressiva, naarmate het LPPXXQV\VWHHP]LFKYHUGHURQWZLNNHOW*H]LHQGHWXPRUPDVVDUHODWLHI groot is voor de embryo’s, vooral op de plek van implantatie, is het goed PRJHOLMN GDW VWHUIWH VLJQL¿FDQW WRHQHHPW LQ GH HPEU\R¶V ZDQQHHU ]LM YRRU HHQ ODQJHUH WLMG DDQJHKRXGHQ ZRUGHQ$OV ]RGDQLJ ]DO GH JURWH aantrekkingskracht van het gepresenteerde implantatie model zijn voor snel onderzoek naar vroege processen in de ontwikkeling van EWS WXPRUHQ =RDOVLVDDQJHWRRQGLQ+RRIGVWXN, zijn er veel ontwikkelingen gaande om het volledige potentieel van het embryonale zebravis model organisme te benutten voor hoge-doorvoer screenings met als GRHO KHW RQWGHNNHQ YDQ QLHXZH PHGLFLMQHQ :LM SUHVHQWHUHQ KHW ZHUN gedaan met dit doel in ogen in +RRIGVWXN, en laten de dynamiek van EWS cel gedrag zien na geautomatiseerde implantatie in embryo’s op EODVWXODVWDGLXP,PSODQWDWLHLQEODVWXODVWDGLXPHPEU\R¶VYHUVFKLOGHLQ HQNHOHDVSHFWHQYDQLPSODQWDWLHLQGDJHQRXGHHPEU\R¶V$OOHUHHUVW zijn de embryo’s op blastula stadium kwetsbaarder, en tolereren geen groot aantal cellen, gezien dit een hogere mate van letaliteit als gevolg KHHIW 'DDUQDDVW YHUWRQHQ (:6 FHOOHQ JHwPSODQWHHUG RS GLW VWDGLXP QLHWYHHOPLJUDWLH'LWLVPRJHOLMNHHQJHYROJYDQKHUSURJUDPPHULQJYDQ GHFHOOHQGRRUGHHPEU\RQDOHRPJHYLQJ+RHZHOGH]HFHOOHQQRJDOWLMG positief waren voor de EWS marker CD99, zou verdere karakterisering van deze cellen interessant zijn, om te zien hoe zij beïnvloed worden GRRUGHHPEU\RQDOHPLFURRPJHYLQJ(HQDQGHUHPRJHOLMNHYHUNODULQJ voor het gebrek aan migratie kan zijn dat er simpelweg te weinig cellen DDQZH]LJ ]LMQ YRRU KHW SODDWVYLQGHQ YDQ PLJUDWLH 6OHFKWV HHQ GHHO van de cellen kunnen migreren, wat ook geobserveerd werd in het KDQGPDWLJH LPSODQWDWLH PRGHO LQ GDJHQ RXGH HPEU\R¶V 2RN ZRUGW deze deelverzameling van cellen mogelijk tot migratie gestimuleerd door DQGHUHFHOOHQLQGHPLFURRPJHYLQJ*H]LHQKHWEODVWXODPRGHOWRW keer minder cellen geïmplanteerd in de dooier heeft dan het handmatige injectiemodel, kan het zijn dat de cellen niet gestimuleerd worden om XLWKXQKXLGLJHPLFURRPJHYLQJWHPLJUHUHQ2QGDQNVKHWJHEUHNDDQ migratie, is dit model echter nog altijd nuttig voor het screenen van 175
10
10
UHVSRQVRSEHKDQGHOLQJPHWSRWHQWLHOHJHQHHVPLGGHOHQ,Q+RRIGVWXN laten we zien dat het effect van medicijnen in vitro niet altijd overeenkomt met dezelfde condities in vivo +RHZHO GH PHHVWH (:6 FHOOLMQ geneesmiddel behandeling combinaties dezelfde resultaten gaven tussen de verschillende experimenten, vertoonde EW7 geen respons QDEHKDQGHOLQJPHW 6 <. LQGLWPRGHO2SPHUNHOLMNJHQRHJZDV HHQUDFHPLVFKHPL[YDQ<. LQKHWKDQGPDWLJHLPSODQWDWLHPRGHO in 2 dagen oude vissen wel in staat tot het verminderen van deling van deze cellijn in vivo. Een groot deel van ontwikkelde geneesmiddelen halen het niet van werkbank naar de kliniek, deels door ontoereikende effecten in vivo +HW LV EHODQJULMN GH]H PHGLFDWLH ]R VQHO PRJHOLMN XLW de pijplijn te verwijderen, zodat er zo min mogelijk tijd en geld in hun RQWZLNNHOLQJ ZRUGW JHVWRNHQ +HW LQ GLW KRRIGVWXN YRRUJHVWHOGH PRGHO staat toe geneesmiddelen in vivo te testen, terwijl het tegelijk een snelle VFUHHQLQJPHWKRGHLVPHWUHODWLHIODJHNRVWHQ'DDUQDDVWNXQQHQ]RZHO GH LPSODQWDWLH PRGHOOHQ JHSUHVHQWHHUG LQ +RRIGVWXN DOV +RRIGVWXN 3 verder ontwikkeld worden voor implantatie van patiënt-afgeleide [HQRJUDIWV 3'; 'H]HH[SHULPHQWHQ]RXGHQVQHO]LMQHQUHODWLHIZHLQLJ cellen gebruiken, wat voordelig is wanneer er weinig tumor materiaal EHVFKLNEDDULV Naast het implantatie model, beschrijft dit proefschrift een nieuw transgeen zebravis model voor EWS in +RRIGVWXN'DDUGHFHOYDQ oorsprong onbekend is voor EWS, is het maken van een transgeen GLHUPRGHO PRHLOLMN JHEOHNHQ YRRU GH]H ]LHNWH 'H GH¿QLsUHQGH moleculaire afwijking, een EWSR1-ETS translocatie gen, is zeer toxisch wanneer geïntroduceerd in cellen, en veroorzaakt embryonale OHWDOLWHLW ZDQQHHU WRW H[SUHVVLH JHEUDFKW LQ PXL]HQ (HQ YRRUJDDQGH poging om het EWSR1-FLI1 gen in zebravis met p53 mutaties te introduceren, leidde tot tumor ontwikkeling in een deel van de vissen die KHWYROZDVVHQVWDGLXPEHUHLNWHQ(FKWHUKHWPHUHQGHHOZDUHQPDOLJQH perifere zenuwschedetumoren, die ontstonden als gevolg van de p53JHPXWHHUGH DFKWHUJURQG 2QJHYHHU YDQ GH YLVVHQ SUHVHQWHHUGHQ PHW VROLGH WXPRUHQ EHVWDDQGH XLW NOHLQH URQGH FHOOHQ (QJHOV VPDOO URXQGEOXHFHOOWXPRXUVDIJHNRUWDOV65%&7V 9HUGHURQWZLNNHOGH YDQGHYLVVHQXLWGH]HOIGHJURHSPHHUGLIIXVHOHXNHPLHDFKWLJH65%&7V Mogelijk is het lage aantal vissen met SRBCTs te verklaren door de FHOOXODLUH FRQWH[W ZDDULQ (:65)/, WRW H[SUHVVLH ZHUG JHEUDFKW +LHURP KHEEHQ ZLM LQ RQV WUDQVJHQH ]HEUDYLV PRGHO JHDQWLFLSHHUG RS HHQ EHKRHIWH DDQ ÀH[LELOLWHLW YDQ H[SUHVVLH HQ JHEUXLN JHPDDNW YDQ HHQ ELQDLU H[SUHVVLH V\VWHHP 'RRU EWSR1-FLI1 en EWSR1-ERG onder controle van een UAS promotor te plaatsen, vindt expressie alleen plaats wanneer er ook GAL4 aanwezig is om de UAS promotor te DFWLYHUHQ*HEUXLNPDNHQGYDQYHUVFKLOOHQGH*$/OLMQHQNDQ(:65 (76 H[SUHVVLH LQ YHUVFKHLGHQHQ ZHHIVHOV HQ RS VSHFL¿HNH WLMGHQ WRW H[SUHVVLHJHEUDFKWZRUGHQ(HQWHJHQVODJLQGH]HH[SHULPHQWHQZDV dat wij niet in staat waren de EWSR1-FLI1 transgene lijn te genereren, GLHGHPHHVWYRRUNRPHQGHWUDQVORFDWLHUHSUHVHQWHHUW0RJHOLMNNRPWGLW 176
GRRU KHW ³OHNNHQ´ YDQ GH SURPRWRU ZDQQHHU HU RQGDQNV DIZH]LJKHLG van GAL4 toch expressie is van EWSR1-ETS in vroege stadia van RQWZLNNHOLQJ NXQQHQ GH YLVVHQ VWHUYHQ LQ KHW HPEU\RQDOH VWDGLXP In the geval van de EWSR1-ERG transgene lijn is er, uit circa de 150 JHwQMHFWHHUGH HPEU\R¶V GLH YROJURHLG ]LMQ WRW YROZDVVHQ VOHFKWV ppQ µIRXQGHU¶YLVJHYRQGHQ HHQYLVPHWKHWEHRRJGHWUDQVJHQJHwQWHJUHHUG LQ GH NLHPOLMQ +HW YHUZDFKWH SHUFHQWDJH IRXQGHUV ZDQQHHU JHEUXLN ZRUGW JHPDDNW YDQ KHW 7RO WUDQVSRVDVH V\VWHHP OLJW URQG GH +HW JHYRQGHQ SHUFHQWDJH LV GXV UHODWLHI ODDJ HQ ]RX HYHQHHQV GRRU KHWOHNNHQYDQGHSURPRWRUYHUNODDUGNXQQHQZRUGHQ'HVDOQLHWWHPLQ met het nageslacht van de gevonden EWSR1-ERG founder konden we onderzoeken welke GAL4 lijnen geschikt waren om op expressie van KHWJHQDDQWHGULMYHQ1HXURQDOHH[SUHVVLHYDQ(:65(5*WRRQGH DDQ]LHQOLMNHHIIHFWHQRSGHHPEU\RQDOHRQWZLNNHOLQJ'HH[SUHVVLHYDQ EWSR1-ERG werd door deze embryo’s in stand gehouden, waar het verloren ging in embryo’s die het gen in andere weefsels tot expressie EUDFKWHQ9HUGLHSLQJLQKHWWUDQVFULSWRRPOLHW]LHQGDWHUHHQRYHUODSZDV tussen de genen tot expressie gebracht in de embryo’s met neuronale (:65(5*HQHHQVHWDDQJHQHQJHGH¿QLHHUGDOVGHNHUQVHWYDQ gereguleerde genen in EWS aan de hand van andere modellen voor de ]LHNWH'LWVXJJHUHHUWGDWGHH[SUHVVLHYDQKHWKXPDQHJHQGDW(:6 aanstuurt, in zebravis embryonale cellen een gedeeltelijke transformatie EHZHUNVWHOOLJGHQYDQWUDQVODWLRQHOHZDDUGHLV'H]HEHYLQGLQJHQ]LMQ een veelbelovend uitgangspunt, en verder onderzoek met dit model in combinatie met andere GAL4 lijnen zou interessante inzichten in de mechanismes van werking van het EWSR1-ERG oncogen op kunnen OHYHUHQ Verdere karakterisatie van het transgene model is gedaan door HHQDQDO\VHRSHLZLWQLYHDX SURWHRPLFV YDQGULHGDJHQRXGHHPEU\R¶V GLH (:65(5* QHXURQDDO WRW H[SUHVVLH EUDFKWHQ +RRIGVWXN Gebruik makend van LC-MS/MS met spectral counting, konden wij VLJQL¿FDQW JHUHJXOHHUGH HLZLWWHQ LGHQWL¿FHUHQ ZDDUYDQ YDQ PHHUGHUH UHHGVEHNHQGZDVGDW]LMEHWURNNHQ]LMQELM(:6SDWKRJHQHVH(HQYDQ GH RPKRRJ JHUHJXOHHUGH HLZLWWHQ JHLGHQWL¿FHHUG GRRU SURWHRPLFV LQ +RRIGVWXNZDVQHFGLQ'LWHLZLWLVLQWHUHVVDQWRPGDWLQYRRUJDDQGH studies in een muismodel de inductie van Necdin binding tussen Sirt1 en p53 stimuleerde, als mechanisme op post-mitotische neuronale apoptose WHUHJXOHUHQ,Q+RRIGVWXNLV6,57RRNEHWURNNHQELM(:6PDOLJQLWHLW +HWLVDDQJHWRRQGGDWKHUVWHOYDQ1RWFKVLJQDOOHULQJLQKXPDQHFHOOHQ 6,57 RQGHUGUXNW YLD +(< ZDW RS ]LMQ EHXUW UHDFWLYDWLH YDQ S VLJQDOOHULQJDOVJHYROJKHHIW,QGHSURWHRPLFVVWXGLHYDQ+RRIGVWXN LV QRWFK HHQ YDQ GH JHUHGXFHHUGH HLZLWWHQ 'RRU JHEUXLN WH PDNHQ van vislijnen die signallering activiteit aan kunnen tonen middels aanRI DIZH]LJKHLG YDQ ÀXRUHVFHQWH VLJQDOHQ NRQ GH]H YHUPLQGHULQJ YDQ Notch signalering activiteit in de embryo’s bevestigd worden in vivo 7HUFRQFOXVLH HU]LMQLQGLWSURHIVFKLIWGULHQLHXZHin vivo modellen YRRU (:6 RQGHU]RHN JHSUHVHQWHHUG +HW KDQGPDWLJH [HQRJUDIW 177
10
model in twee-dagen-oude embryo’s en het geautomatiseerde model in blastula-stadium embryo’s voor hoge-doorvoer doeleinden bieden WZHHVQHOOHPHWKRQGHQRPGHHI¿FLHQWLHYDQJHQHWLVFKHRIFKHPLVFKH LQKLELWLH RS (:6 YRRUWJDQJ YDVW WH VWHOOHQ +HW WUDQVJHQH PRGHO NDQ een meer fundamenteel inzicht bieden in het effect van exogene (:65(5* H[SUHVVLH LQ YHUVFKLOOHQGH ZHHIVHOV RI FHOW\SHQ *H]LHQ het gemak waarmee het zebravisgenoom gemanipuleerd kan worden, kunnen de modellen aangepast worden naarmate verdere inzichten in (:6RQWZLNNHOLQJYHUNUHJHQZRUGHQ+LHUPHHELHGHQ]LMHHQEOLMYHQGH waardevolle contributie aan het veld van EWS onderzoek en de ]RHNWRFKWQDDUQLHXZHSDWLHQWEHKDQGHOPHWKRGHV
10
178
10
179
