Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/19061 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Egorova, Anastasia Dmitrievna Title: Ciliary regulation of endothelial response to shear stress : consequences for Tgfbeta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition Date: 2012-06-07
K l f 2 Kl f 2 Pai1 Pai1 Klf4 Klf4 Alk5 Alk5 Pa Pa mu mu Tgfβ Tgfβ EPC EPC OFT OFT Id1 Id1 Hh Hh Gli1 Gli1 AVC AVC ORPK ORPK Ift88 Ift88 EndoMT EndoMT EC EC ApoE ApoE CD31 CD31 eNOS eNOS gg gg Mapk Mapk dyn/cm2 dyn/cm2 Mef2C Mef2C Mek5 Mek5 Smad Smad PIV vWF Snail vWF PIV
List of Abbreviations
List of Abbreviations
A A atrium Ach acetylcholine ACTB
β-actin
ADPKD
autosomal dominant polycystic kidney disease
Alk1
Tgfβ type I receptor activin receptor-like kinase 1
Alk5
Tgfβ type I receptor activin receptor-like kinase 5
Ao aorta ApoE
apolipoprotein E
ARPKD
autosomal recessive polycystic kidney disease
αSMA
α-smooth muscle actin
α-Tgfβ
pan-Tgfβ neutralizing antibodies
AV atrioventricular AVC
atrioventricular canal
B BACT
β-actin
BB
basal body
BBS
Bardet-Biedl syndrome
BMP
bone morphogenic protein
BSA
bovine serum albumin
C ca
constitutively active
CDH5
vascular endothelial-cadherin, VE-Cadherin
cDNA
complementary DNA
CD31
Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1, PECAM-1
CD105 endoglin CD144
vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin
CEC
chicken embryonic endothelial cells
CEF
chicken embryonic fibroblasts
CMV cytomegalovirus CTT
C-terminal tail
D DAB
3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochloride
DAPI
4',6-diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride
DLL4
delta-like protein 4
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
216
DMSO
dimethyl sulfoxide
DNA
deoxyribonucleic acid
dyn/cm2
dyne/cm2, 10 dyne/cm2=1Pa
E E
embryonic day
EC
endothelial cell
ECFC
endothelial colony-forming cells
ECL
enhanced chemiluminescent
ECM
extracellular matrix
eGFP
enhanced green fluorescent protein
EMT
Epitheial to Mesenchymal Transition
EndoMT
Endothelial to Mesenchymal Transition
ENG
endoglin, CD105
eNOS
endothelial nitric oxide synthase-3, NOS-3
EphrinB2
aphrin B2 ligand
EphB4
ephrin type-B receptor 4
EPC
endothelial progenitor cell
Erk
extracellular-signal-regulated kinase
ET-1 endothelin-1
F
forward primer
FESEM
field emission scanning electron microscopy
FITC
fluorescein isothiocyanate
Flk-1
fetal liver kinase-1
Abbreviations
F
G GAPDH
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, G3PDH
gg
gallus gallus
Gli1/2/3
GLI-Krüppel family member 1/2/3, glioma-associated oncogene 1/2/3
Grem1
gremlin 1
H HAoEC
human aortic endothelial cells
HDAC6
histone deacetylase 6
HEF1
human enhancer of filamentation 1
HEY2
HES-related repressor protein 2
HH
Hamburger and Hamilton stage
217
List of Abbreviations
Hh
Hedgehog
hu human HUAEC
human umbilical arterial endothelial cells
HUVEC
human umbilical venous endothelia cells
I IAV
inferior atriventricular cushion
Id1
inhibitor of differentiation 1
Ift
Intraflagellar transport
Ift88/Tg737
Intraflagellar transport protein 88
IFT88Tg737RPW
ORPK mouse, Tg737orpk/orpk
J J
cardiac jelly
JNK
c-Jun N-terminal kinase
K KDR
kinase insert domain receptor
Kif
kinesin family member
Klf2
Krüppel-like Factor 2
Klf4
Krüppel-like Factor 4
L L lumen L lung LacZ
β-galactosidase
LOV-1
location of vulva defective-1
LV
left ventricle
M Mapk
mitogen activated protein kinase
MDCK
Madin-Darby canine kidney
MEEC
mouse embryonic endothelial cells
MEF
mouse embryonic fibroblasts
Mef2C
myocyte enhancer binding factor 2C
Mek5
Mapk kinase 5
MKK
mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK
MKKK
mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MEKK
mRNA
messenger RNA
218
MTOC
microtubule organizing center
mu
mus musculus
MV
mitral valve
N NADPH
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
Ncad N-cadherin NF-κB
nuclear factor kappa B
NGS
normal goat serum
NO
nitric oxide
NOS-3
endothelial nitric oxide synthase-3, eNOS
NOTCH4
neurogenic locus notch homolog protein 4
ns
not significant
O Oe oesophagus OFT
outflow tract
ORPK
Oak Ridge Polycystic Kidney
OTC
outflow tract
P Pa pascal Pai1
plasminogen activator inhibitor-1, Serpine1
PBS
phosphate buffered saline
PBST PBS-Tween PCM
pericentriolar material
PCP
planar cell polarity
PCR
polymerase chain reaction
PD
small molecular compound PD0325901
PDGF
platelet-derived growth factor
PECAM-1
Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1, CD31
Phaco
phase contrast image
Abbreviations
PC polycystin
Phospho phosphorylated PIV
particle image velocimetry
PKD
Polycystic Kidney Disease
Ptch1
patched 1
P*
phosphorylated
219
List of Abbreviations
Q Q-PCR
quantitative polymerase chain reaction
R R
reverse primer
Re
Reynolds number
RNA
ribonucleic acid
RV
right ventricle
RVL
right vitelline vein
R-Smad receptor-Smad RT-PCR
reverse transcriptase polymerase chain reaction
RV
right ventricle
S SB
small molecular compound SB431542
SDS
sodium dodecyl sulfate
SEM
standard error of the mean
Serpine1
plasminogen activator inhibitor-1, Pai1
sh
short hairpin construct
Shh
Sonic Hedgehog
Slug
Snail homolog 2, Snail2
SMC
smooth muscle cells
Snai1
Snail homolog 1
SPSS
statistical package for the social sciences
T T trachea TβR-II
Tgfβ type II serine/threonine kinase receptor
TgfβR3
Tgfβ receptor type III, betaglycan
Tgfβ
Transforming growth factor-β
Tg737/Ift88
Intraflagellar transport protein 88
Thr threonine TR
ventricular trabeculations
TV
tricuspid valve
Tyr tyrosine
V V ventricle VCAM1
220
vascular cell adhesion molecule 1
VE-cadherin
vascular endothelial-cadherin, CD144
VEGF
vascular endothelial growth factor
VEGFR
vascular endothelial growth factor receptor
VI
ventricular inlet segment
VO
ventricular outlet segment
VS
ventricular septum
v/v
volume/volume
vWF
von Willebrand factor
WT
wild type
w/v
weight/volume
Abbreviations
W
221
Dankwoord Acknowledgements Слова Благодарности
Dankwoord / Acknowledgements / Слова Благодарности
Dit werk kon alleen tot stand komen dankzij de steun en hulp van vele mensen. Bijzondere dank gaat uit naar mijn promotoren, Prof. Dr. Rob E. Poelmann en Prof. Dr. Peter ten Dijke en co-promotor Dr. Beerend P. Hierck. Beste Rob en Peter – onze gedachtewisselingen hebben vaak tot spannende discussies geleid. Beste Beerend, dank je voor het aanreiken van het onderwerp en je creatieve begeleiding.
Mijn dank gaat uit naar alle collega's van de Afdeling Anatomie en Embryologie. Met veel plezier
kijk ik terug naar mijn tijd op de afdeling. Het team van analisten en in het bijzonder Bert Wisse en Simone van de Pas wil ik bedanken voor hun ondersteuning bij de experimenten en het uitleggen van vele labtechnieken. De inzet en tijdsefficiëntie van Bas Blankevoort en Jan Lens bij
het voorbreiden van de figuren verdient een speciale vermelding. Prof. Dr. Adri C. Gittenberger-de
Groot wil ik bedanken voor de eerste kennismakig met de afdeling, zij heeft mij de kans gegeven om bij Anatomie onderzoek te komen doen. Prof. Dr. Marco C. de Ruiter was in de aanvangsfase
van dit werk nauw betrokken als stage medebegeleider. Ik apprecieer de vruchtbare discussies
met Prof. Dr. Christine L. Mummery. Met de mede-AIOs (Appie, Brigit, Cathelijne, Cheryl, Denise,
Fanneke, Hans, Harsha, Liesbeth, Lida, Lucas, Nathan, Noortje, Nynke, Piet, Rebecca, Regina, Roderick, Stefan, Willemijn, Yolanda, en Yvonne) heb ik interessante wetenschappelijke gesprekken
en goede tijden buiten het lab gehad. Ik waardeer de harde werk van mijn stage studenten Mahmoud Mohammadi en Padmini Khedoe. Daniël Jansma en Paul Gobée zijn onmisbaar geweest bij het oplossen van alle computergerelateerde problemen. Het secretariaat moet genoemd worden in verband met geleverde praktische ondersteuning. Margot Bartelings bedank ik voor de goede zorg en mooie gesprekken over de afgelopen jaren.
Dit boekje is mede tot stand gekomen door een nauwe samenwerking met collega's van de afdeling
Moleculaire Celbiologie. Speciale dank gaat uit naar Prof. Dr. Marie-José T.H. Goumans voor haar creatieve input. Ik apprecieer de prettige samenwerking met en de praktische ondersteuning van Maarten van Dinther en Midori Thorikay.
De samenwerking met de groepen van Prof. Dr. Anton Jan van Zonneveld (LUMC Afdeling Nierziekten en Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine), Prof. Dr. Gijs R. van den
Brink (AMC, Afdeling Maag- Darm- Leverziekten en Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research)
en Prof. Dr. Jerry Westerweel (TU Delft, Laboratory for Aero- and Hydrodynamics) heeft spannende wendingen gegeven aan mijn onderzoek. De betrokkenheid van Sanne L. Rosekrans, Dr. Hetty C. de Boer, Dr. Peter Vennemann en Dr. Christian Poelma verdient een speciale vermelding. Dr. Kim van der Heiden (Erasmus MC, Afdeling Biomedische Engineering) wil ik bedanken voor haar
deskundige input. I acknowledge the fruitful collaborations with Dr. Surya M. Nauli (University of Toledo, College of Pharmacy and Medicine, USA) and Prof. Dr. Bradley K. Yoder (University of Alabama at Birmingham, Department of Cell Biology, USA).
224
Linda en Edris, het is een eer om jullie als mijn paranimfen te hebben. Linda, onze vriendschap gaat terug naar mijn eerste jaren in Nederland en wij hebben elkaar zien opgroeien. Jouw nuchtere
instelling en innerlijke kracht zijn een ware inspiratie. Edris, jouw onvoorwaardelijke steun de
afgelopen jaren en ‘opdringerige’ hulp in de tijd voor mijn promotie is veel waard. Ik bewonder jouw doorzetingsvermogen in het leven en kijk uit naar een mooie toekomst.
De familie Mahtab Faiz wil ik bedanken voor de immer warme en lieve ontvangst. Een woord van dank aan mijn vrienden. My dear global friends from the Rijnlands, it is great to still
have strong ties with many of you. De groep van ‘Leidse Geneeskunde vrienden’ wil ik bedanken
voor de geweldige tijden, jullie waren een mooie afleiding en goede steun de afgelopen 8 jaar in het LUMC. IFMSA en KEIHAN bestuursleden hebben mij geïnspireerd met hun energie en idealisme. Kambiz Radjabzade bedank ik voor de mooie matreshka design en voor zijn hulp met de lay-out. Paul, ik heb veel waardering voor je goede zorg. Я благодарю мою маму, бабушку Майю Дмитриевну и дедушку Анатолия Павловича за любовь и заботу, за 100% вклад их энергии в моё воспитание, чрезмерное баловство, и
проявление высоких требований. Мамa, я тобой горжусь. [I am grateful to my mother and my grandparents Mayya Dmitrievna and Anatoliy Pavlovich for giving me all the love and care in the world, for investing 100% of their energy into my upbringing, totally spoiling me, and having the high
Acknowledgements
expectations they have. Mom, I am very proud of you.]
225
Curriculum Vitae
Curriculum Vitae
Anastasia Dmitrievna Egorova was born on December the 31st 1987 in Moscow, Soviet Union.
She started her secondary school in Naro-Fominsk, Russia and, when mother came to work at the Leiden University as a postdoc in 1997, moved to the Netherlands. Anastasia went to the Rijnlands Lyceum in Oegstgeest where she graduated (cum laude) from the International Baccalaureate at the age of 16. In September 2004 she enrolled at the Leiden University to study both, Medicine and
Life Science and Technology in a combined program with Delft University of Technology. During her study, she performed research as a part of the Excellent Student Trajectory entitled ‘The response
of endothelial progenitor cells to shear stress’ at the Department of Anatomy and Embryology at
the Leiden University Medical Center under the supervision of Dr. B. P. Hierck and Prof. Dr. M. C. de Ruiter. This was followed by her doctoral scientific research project on ‘The role of transforming
growth factor-β signaling in shear stress response of embryonic endothelial cells’ performed in the same group. After graduation in December 2008 (doctoraalexamen) she continued her research in the form of an MD/PhD project focusing on the role of primary cilia and transforming growth factor-β signaling in shear stress modulated endothelial function in the context of cardiac valve development.
This work was performed under the supervision of Dr. B.P. Hierck, Prof. Dr. R.E. Poelmann (both from the Department of Anatomy and Embryology) and Prof. Dr. P. ten Dijke (Department of Molecular Cell Biology). The results of this project are presented in this thesis. In January 2011 she started
her clinical rotations. In the future, she aspires to pursue a clinical and scientific career in the field of (experimental) Cardiology.
228
Scientific Awards Excellent Student Trajectory (Leiden, The Netherlands, September 2006) MD/PhD Excellent Student Trajectory two year research grant (Leiden, The Netherlands, December 2008)
Harvard University MD/PhD travel scholarship, Days of Molecular Medicine: The future of personalized medicine (Boston, USA, May 2009)
First price in recognition of best poster presentation, Leiden Vascular Medicine Scientific Day (Amsterdam, The Netherlands, November 2009)
First price in recognition of best oral presentation, Cardiovascular Conference, Dutch Endothelial Biology Society, (Noordwijkerhout, The Netherlands, March 2011)
Travel grant for Frontiers in CardioVascular Biology, European Society of Cardiology Working Group on Development, Anatomy and Pathology (London, United Kingdom, March-April 2012)
Van Walree Fonds of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), Frontiers in CardioVascular Biology, European Society of Cardiology Working Group on Development, Anatomy and Pathology (London, United Kingdom, March-April 2012)
Dr. Catharine van Tussenbroek Fonds, Frontiers in CardioVascular Biology, European Society of Cardiology Working Group on Development, Anatomy and Pathology (London, United Kingdom,
Curriculum Vitae
March-April 2012)
229
Curriculum Vitae
List of publications Anastasia D. Egorova, Padmini P.S.J. Khedoe, Marie-José T.H. Goumans, Bradley K. Yoder, Surya M. Nauli, Peter ten Dijke, Robert E. Poelmann, Beerend P. Hierck. Lack of primary cilia primes shearinduced endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation Research, 108(9): 1093-1101 (2011)
• •
Previewed in Circulation Research 'In This Issue', 108: 1037 (2011)
Discussed in Kidney International 'Journal Club' , 80: 129–130 (2011)
Anastasia D. Egorova, Kim Van der Heiden, Simone Van de Pas, Peter Vennemann, Christian
Poelma, Marco C. DeRuiter, Marie-José T.H. Goumans, Adriana C. Gittenberger-de Groot, Peter
ten Dijke, Robert E. Poelmann, Beerend P. Hierck. Tgfβ/Alk5 signaling is required for shear stress induced Klf2 expression in embryonic endothelial cells. Developmental Dynamics, 240: 1670–1680 (2011)
•
Highlighted in Developmental Dynamics 'Highlights' , 240: vi (2011)
Kim Van der Heiden, Anastasia D. Egorova, Robert E. Poelmann, Jolanda J. Wentzel, Beerend P.
Hierck. Role for primary cilia as flow detectors in the cardiovascular system. International Review of Cell and Molecular Biology, 290: 87-119 (2011)
Anastasia D. Egorova, Marco C. DeRuiter, Hetty C. de Boer, Simone Van de Pas, Adriana C.
Gittenberger-de Groot, Anton J. van Zonneveld, Robert E. Poelmann, Beerend P. Hierck. Endothelial
Colony Forming Cells show a mature transcriptional response to shear stress. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 48(1): 21-9 (2012)
Anastasia D. Egorova, Kim Van der Heiden, Robert E. Poelmann, Beerend P. Hierck. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation, 83(2):S56-61 (2012)
Peter ten Dijke, Anastasia D. Egorova, Marie-José T.H. Goumans, Robert E. Poelmann, Beerend P. Hierck, Tgfβ signaling in endothelial to mesenchymal transition. Role of shear stress and primary cilia. Science Signaling, 21; 5(212): pt2 (2012)
Anastasia D. Egorova, Sanne L. Rosekrans, Marie-José T.H. Goumans, Bradley K. Yoder, Gijs R. van den Brink, Robert E. Poelmann, Beerend P. Hierck, Shear stress-induced endothelial-to-
mesenchymal transition depends on cilium-related Hedgehog and Tgfβ2 signaling. Manuscript in preparation.
230
