3/5/2011
LECTURE 3: CHARACTERISTICS OF ENZYME CATALYSIS
Isoenzyme
Enzymes that perform the same catalytic function in different body tissues or different organisms, but which have different sequences of amino acids in various portions of their polypeptide chain are called isoenzymes.. Isoenzymes can be separated isoenzymes from one another by electrophoresis. electrophoresis.
Proenzyme or zymogen Proenzyme (or zymogen zymogen) ) is the name given to
the inactive form of an enzyme. Enzymes (especially digestive enzymes) are often secreted in their inactive form, transported to the place where activity is desired, and then converted to their active forms.
Enzim monomerik monomerik;; yang memiliki hanya satu rantai polipeptida dimana terdapat tempat aktif aktif.. Enzim oligomerik oligomerik;; yang memiliki paling sedikit 2 dan sebanyak 60 atau lebih subunit yang terikat kuat dalam pembentukan protein enzim aktif aktif.. Kompleks multienzim multienzim;; yang terdiri dari sejumlah enzim yang terikat kuat
Enzyme--Substrate Interaction Enzyme Lock and Key" Hypothesis The "Induced Fit" Hypothesis
"Lock and Key" Hypothesis
Emil Fischer in 1890 proposed "Lock and Key" Hypothesis The shape, or configuration, of the active site is especially designed for the specific substrate involved.
1
3/5/2011
Lock & Key Model
Because the configuration is determined by the amino acid sequence of the enzyme, the native configuration of the entire enzyme molecule must be intact for the active site to have the correct configuration. In such a case, the substrate then fits into the active site of the enzyme in much the same way as a key fits into a lock. En z im
The "Induced Fit" Hypothesis Enzymes are highly flexible, conformationally dynamic molecules, and many of their remarkable properties, including substrate binding and catalysis, are due to their structural pliancy. Realization of the conformational flexibility of proteins led Daniel Koshland to hypothesize that the binding of a substrate (S) by an enzyme is an interactive process. That is, the shape of the enzyme's active site is actually modified upon binding S, in a process of dynamic recognition between enzyme and substrate aptly called induced fit.
S u b str a t
In essence, substrate binding alters the conformation of the protein, so that the protein and the substrate "fit" each other more precisely. The process is truly interactive in that the conformation of the substrate also changes as it adapts to the conformation of the enzyme.
Enzim
Substrat
2
3/5/2011
Enzyme Kinetics
Enzymes follow zero order kinetics when substrate concentrations are high. Zero order means there is no increase in the rate of the reaction when more substrate is added. Given the following breakdown of sucrose to glucose and fructose Sucrose + H20 Glucose + Fructose
→
H
H
H O HO
OH
OH
H
H OH
H OH
H H
HO
H
O
HO HO
H H
Induced Fit Model
Reaksi bersifat dapat balik yaitu sebagian senyawa dapat disintesis kembali dari zat yang terdapat dalam reaksi Jika faktor lingkungan tetap,, kecepatan tetap pembentukan produk (kecepatan reaksi reaksi)) ditentukan oleh konsentrasi enzim dan substrat • • •
V = kecepatan reaksi reaksi,, [E] = konsentrasi enzim & [S] = konsentrasi substrat
H
OH OH
Apabila [S] tetap, kecepatan reaksi me-ningkat sebanding dengan peningkatan [E]
V
V
[E] 1 2 3 4
[E]
W aktu
Gambar 6. Hubungan antara kecepatan reaksi (V) dengan konsentrasi enzim (kiri), dan dengan waktu pada [E] yang berbeda (kanan)
3
3/5/2011
Apabila konsentrasi enzim tetap dan substrat meningkat,, V akan meningkat mula meningkat mula--mula dan proporsional dengan peningkatan [S], tapi pada [S] yang lebih tinggi tinggi,, laju peningkatan V menurun secara perlahan perlahan--lahan hingga kemudian V hampir tidak tergantung pada [S]. V
Vmax Gambar 2.2. Hubungan antara kecepatan reaksi (V) dengan konsentrasi substrat ([S]) pada reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim KM
E+S
k1 k2
MICHAELIS--MENTEN MODEL MICHAELIS
Leonor Michaelis dan Maud Menten pada tahun 1913 mengusulkan suatu model untuk menjelaskan kinetik reaksi enzimatis untuk satu substrat dan satu enzim (Uni Uni--Uni reaction)
Hipotesisnya adalah bahwa Enzim (E), yang bertindak sebagai reaktan tapi tidak digunakan dalam reaksi,, menyatu dengan substrat (S) reaksi dalam suatu kompleks ES dalam pembentukan produk
[S]
ES
k3 k4
E+P
E = Enzyme, S = Substrate, P = Product ES = Enzyme-Substrate complex k1, k2, k3 & k4 = rate constants
When the substrate concentration becomes large enough to force the equilibrium to form completely all ES the second step in the reaction becomes rate limiting because no more ES can be made and the enzyme-substrate complex is at its maximum value.
v
d P k 2 ES dt
[ES] is the difference between the rates of ES formation minus the rates of its disappearance. 1
d ES k1 E S k 1 ES k 2 ES dt
4
3/5/2011
Assumption of steady state
Assumption of equilibrium k-1>>k2 (k2>>k3) the formation of product is so much slower than the formation of the ES complex. That we can assume:
E+S
k1
ES
k2
KS
k3
Transient phase where in the course of a reaction the concentration of ES does not change
E+P
k4
K 2 [E ][S] K1 [ES]
Ks is the dissociation constant for the ES complex.
d ES 0 dt
Michaelis-Menten Model
E T E ES
V
Vmax[S] KM [S]
The Km is the substrate concentration where vo equals one-half Vmax
There are a wide range of KM, Vmax , and efficiency seen in enzymes
But how do we analyze kinetic data?
5
3/5/2011
Penetuan KM dan Vmax
Tabel 2.1 Parameter beberapa enzim
Harga KM bervariasi sangat besar besar,, tapi dari kebanyakan enzim berkisar diantara 10-1 - 10-6 M (Tabel (Tabel 2.1) tergantung substrat dan lingkungan seperti suhu dan kuantitas ion Untuk mendapatkan harga KM dan Vmax Vmax,, analisis langsung persamaan diatas dapat dilakukan dilakukan,, tapi cara ini membutuhkan waktu yang lama, dan bantuan komputer sangat penting untuk mengoptimasi harga parameter persamaan dengan cepat cepat.. *“C = Competitive, NC = Non-competitive & UC = Uncompetitive”
Persamaan “double “double--reciprocal” atau “Lineweaver Lineweaver--Burk”
PENDEKATAN LAIN
Linierisasi persamaan Modifikasi persamaan ke bentuk linier sehingga dapat dianalisis dengan mudah 1. Persamaan “double “double--reciprocal” atau “Lineweaver Lineweaver--Burk” 2. Persamaan “Eadie Eadie--Hofstee Hofstee”” 3. Persamaan “Hanes “Hanes--Woolf”
Vmax[S] KM [S] Jika ruas kiri dibalik dan demikian juga ruas kanan kanan,, maka V
1 KM 1 1 . V Vmax [S] Vmax
Sekarang persamaan ini akan mudah dianalisis dengan metode linier sedehana
6
3/5/2011
Sekarang y = 1/V ; x = 1/[S] a = 1/Vmax 1/Vmax ; b = KM/Vmax dapat dianalisis dengan y = a + bx
Jika 1/V dihubungkan dengan 1/[S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada 1/Vmax 1/ Vmax dan sumbu x pada -1/KM serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar KM/Vmax Vmax..
Persamaan “Eadie Eadie--Hofstee Hofstee”” V
-1/KM 1/Vmax 1/[S]
Sekarang y = V ; x = V/[S] a = Vmax ; b = -K M dapat dianalisis dengan y = a + bx
Jika V dihubungkan dengan V/[S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada Vmax dan sumbu x pada Vmax/KM serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar K M
Vmax[S] KM [S]
V ( K M [ S ]) V max [ S ] V [ S ] VK M V max [ S ] V
KM/Vmax
VK M V max [ S ] [S ]
V K M
V Vmax [S]
7
3/5/2011
Persamaan “Hanes “Hanes--Woolf”
V Vmax
V
Persamaan Eadie-Hofstee
Vmax[S] KM [S]
V (K
M
[ S ]) V max [ S ]
[S ] K M [S ] V V max Vmax/KM
V/[S]
[S ] K M V V max
1 V max
.[ S ]
[S ] K M 1 .[S] V Vmax Vmax
Sekarang y = [S]/V ; x = [S] a = K M/Vmax ; b = 1/Vmax dapat dianalisis dengan y = a + bx Jika [S]/V dihubungkan dengan [S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada K M/Vmax dan sumbu x pada K M serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar 1/Vmax.
[S]/V
Persam aan H an es-W oolf
-K M
K M /V max [S]
8
3/5/2011
9
3/5/2011
STEPS OF MODEL DERIVATION 1.
STEPS OF MODEL DERIVATION
Pembentukan ES adalah inti dari hipotesis tersebut
E+S 1. 2.
k1 k2
ES
k3 k4
E+P
(1)
Reaksi E dengan S terjadi dengan kecepatan k1 dan menghasilkan kompleks ES (enzim (enzim--substrat substrat)) Kompleks ES dapat berubah menjadi E dan S bebas kembali dengan kecepatan k2, atau menjadi E dan P dengan kecepatan k3.
10
3/5/2011
4.
5.
6.
10.
11.
12.
Jika k3 k4 , maka reaksi bersifat “irreversible”, sehingga produk P tidak ada yang diubah kembali menjadi substrat asal dan k4 dapat diabaikan. Suatu hal penting yang perlu diingat adalah bahwa konstanta k1, k2, k3 dan k4 proporsional dengan G aktivasi substrat dari reaksi yang bersangkutan Pada [S] yang rendah, kebanyakan enzim berada dalam bentuk bebas, sehingga penambahan S akan langsung terikat dengan E dan diubah menjadi P dengan demikian kecepatan awal proporsional dengan peningkatan [S]
Penurunan persamaan MichaelisMichaelis-Menten tergantung pada asumsi yang disebut ”Briggs--Haldane Steady”Briggs Steady-State” Keadaan "steady state" adalah suatu keadaan dimana konsentrasi intermediat (perantara) ES tetap konstan, sementara konsentrasi substrat dan produk berubah Keadaan demikian terjadi apabila kecepatan pembentukan ES sama dengan kecepatan peruraian ES
7.
8.
9.
Pada [S] yang lebih tinggi tinggi,, kecepatan reaksi bervariasi dengan peningkatan [S] karena enzim mulai mengalami kejenuhan Pada [S] yang tinggi tinggi,, semua enzim dijenuhi oleh substrat dan karenanya berada dalam bentuk kompleks ES Jadi enzim dalam suatu reaksi dapat berada dalam keadaan bebas dan terikat dengan substrat substrat,, sehingga total enzim secara matematis adalah
[E]0 = [E]+[ES]
13.
(2)
Keadaan “steady” dapat dinyatakan secara matematis seperti dengan persamaan berikut
[ES]/ [ES]/t = 0
(3)
dimana t = waktu ( menit menit)) 14.
Pernyataan [ES]/ [ES]/t dapat ditulis dari sudut konstanta dan konsentrasi pers (1) yaitu Kecepatan pembentukan ES
ES = k1 [E][S]
(4a)
11
3/5/2011
Kecepatan peruraian ES 16.
ES = (k2 + k3) (ES) 15.
(4b)
Dalam keadaan "steady state" kedua persaman (4a) dan (4b) adalah sama sama,, sehingga
Subsitusi E dari pers (2) kedalam pers (5) menghasilkan k1 [S][E]0 –[ES](k1[S]+k2+k3)=0 (6)
17.
Pengaturan persamaan lebih lanjut
[ES]/ [ES]/t = k1 [E][S] [E][S]--(k2+k3)(ES) = 0 (5)
18.
Persamaan ini dapat dimodifikasi dengan cara ruas kanan dibagi dengan k1 [S],
[ES] 19.
[E]0 1 (k 2 k3 ) / k1[S]
(8)
Karena k1 , k2 , dan k3 adalah konstanta konstanta,, maka ketiga konstanta ini dapat dijadikan satu konstanta yaitu (k2 + k3 )/k1 = K M yang dikenal sebagai konstanta Michaelis Michaelis--Menten
(7)
20.
Untuk kebanyakan enzim k3 k2, sehingga KM akan mendekati (k2 + k1), sedang (k2 + k3 )/ k1 adalah Ks (konstanta (konstanta dissosiasi kompleks enzim--substrat enzim substrat). ).
21.
Jika KM, yang merupakan ukuran affinitas enzim akan substrat substrat,, disubsitusikan kedalam pers (8), maka
[ ES ]
[ E ]0 1 ( K M /[ S ])
(10)
12
3/5/2011
22.
Kecepatan reaksi katalisis dapat dinyatakan dengan jumlah produk yang tebentuk per satuan waktu yaitu produk dari konsentrasi kompleks ES dengan kapasitas katalisis enzim k3 (turnover number). number).
V 23.
k 3 [ E ]0 1 ( K M /[S ])
Pada keadaan E dijenuhi S yang berarti semua enzim terikat dengan substrat dalam kompleks ES, maka V = Vmax = k3[E]0. Kemudian persamaan diatas dapat ditulis dalam bentuk berikut berikut..
(11)
V
Subsitusi [ES] dari pers. (11) kedalam pers (10) memberikan
V
26.
[ P ] k 3 [ ES ] t
24.
25.
(12)
Vmax[S] Vmax atau V KM [S] 1 (KM /[S])
(13)
Persamaan terakhir ini ad. persamaan Michaelis Michaelis-Menten yang secara luas digunakan utk analisis reaksi enzim enzim..
Stoikiometri pers (13) adalah S P yaitu satu substrat dan satu produk (uni uni--uni uni), ), sementara banyak reaksi yang dikatalisis enzim melibatkan stoikiometri yang lebih kompleks seperti berikut berikut;;
S P1 + P2 (Ui-Bi) S1 + S2 P (Bi-Uni) S1 + S2 P1 + P2 (Bi-Bi) 27.
Untungnya, persamaan Michaelis Untungnya, Michaelis--Menten kira kira--kira berlaku untuk reaksi yang lebih kompleks sekalipun dengan mekanisme yang berbeda berbeda..
13
3/5/2011
MATURNUWN THANK YOU SHUKRAN XIÈXIE
14
