CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR 2007

CELOSTÁTNÍ PŐEHLÍDKY SÝRŢ 2007 Výsledky pĆehlídek a sborník pĆednášek semináĆe

Mléko a sýry

Praha – leden 2007

Editor:

ŠtČtina J., ýurda L.

Vydavatel:

Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5; 166 28 Praha 6

Rok vydání:

2007

ISBN 978-80-7080-661-6

OBSAH Výsledky 11. roþníku Celostátních pĜehlídek sýrĤ ýurda Ladislav, ŠtČtina JiĜí................................................................................................................ 13 Mikrobiologické kritériá pre hodnotenie kvality surového kravského mlieka Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ............................................................................................. 21 Vliv ranního a veþerního nádoje na vybrané mléþné ukazatele. Skýpala Martin, Chládek Gustav ....................................................................................................... 26 Protektivní kultury pro výrobu polotvrdých sýrĤ TĤma ŠtČpán, Plocková Milada ......................................................................................................... 31 Vliv doby a teploty skladování na konzistenci sterilovaných tavených sýrĤ BuĖka František, ŠtČtina JiĜí, HrabČ Jan ............................................................................................ 37 PĜíprava enzymových hydrolyzátĤ v membránovém reaktoru ýurda Ladislav, Vaverková Ivana, Mišún Daniel.............................................................................. 43 Dynamika mikrobiálnych interakcií poþas kysnutia mlieka Valík ďubomír, Medvećová Alžbeta, Bajúsová Barbora, Liptáková Denisa.................................... 48 Utilizácia glukózy a laktózy rôznymi kmeĖmi laktobacilov Greif Gabriel, Greifová Mária, Karoviþová Jolana, Kohajdová Zlatica, Krajþová Eva .................... 53 Aplikace pĜímé a nepĜímé impedanþní metody pĜi studiu vlastností ýMK a kontaminující mikroflóry mléka ýerný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, VyletČlová Marcela ..................................... 59 Žinþica ako probiotická biodiverzifikovaná potravina Keresteš Jan........................................................................................................................................ 64 Protektivné vlastnosti vybraných kmeĖov rodu Lactobacillus Hudáþek Jaroslav, Zalán Zsolt, Chumchalová Jana, Halász Anna .................................................... 67

Plakátová sdČlení: Základní charakteristika a bunČþná lyse kmenĤ Lactococcus lactis Abrlová Magdaléna, Šviráková Eva, Hlavsová Barbora, Plocková Milada ...................................... 77 Charakteristika rastu Lactobacillus rhamnosus GG v mlieku Medvećová Alžbeta, Valík ďubomír, Liptáková Denisa, Bajúsová Barbora.................................... 81 VýbČr jogurtové kultury pro sójové výrobky Pavlasová Marcela, DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Chumchalová Jana ......................................... 86 Skríning vybraných startovacích kultur na pĜítomnost DNA sekvencí kódujících dekarboxylázy úþastnící se tvorby biogenních aminĤ Burdychová Radka, Komprda Tomáš ............................................................................................... 91 Vplyv baktérií mlieþneho kysnutia na rast Staphylococcus aureus v mlieku Bajúsová Barbora, Valík ďubomír, Liptáková Denisa, Medvećová Alžbeta.................................... 95 Vliv kombinace lysozymu a laktokokĤ produkujících nisin na rĤst Bacillus cereus DMF 2001 v modelovém systému mléka UHT Šviráková Eva, Ostapþuk Radek, Plocková Milada........................................................................... 99 Vplyv Lactobacillus rhamnosus GG na rast Candida maltosa v mlieku Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Bajúsová Barbora, Medvećová Alžbeta.................................. 104 3

Extrakce bakteriocinu kmene Enterococcus mundtii EN3 organickým rozpouštČdlem a pomocí adsorpce bakteriocinu na bunČþnou stČnu Miller Petr, Bakir Hatice Eda, Kuþerová KateĜina, Chumchalová Jana, Míková Kamila............... 108 Výskyt Bacillus cereus a Bacillus licheniformis v prĤbČhu výroby sterilované smetany a termizovaného dezertu NČmeþková Irena, Roubal Petr, Pechaþová Marta, VyletČlová Marcela, Nejeschlebová Ludmila . 113 Mikrobiologická a molekulárnČ-biologická detekce bakterie Clostridium tyrobutyricum v polotvrdých sýrech Sládková Pavla, Burdychová Radka ............................................................................................... 118 Izolácia a PCR-typizácia kmeĖov baktérií mlieþneho kysnutia z bryndze Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Valík ďubomír, Pangallo Domenico ....................................... 122 Monitoring a identifikácia potenciálnych bakteriálnych kontaminantov ovþiarskych výrobkov vo výrobnom procese Kostolníková Mária, KoreĖová Janka, Lopašovská Janka .............................................................. 126 Sledování zmČn kyselosti mléka bČhem výroby kozích sýrĤ KouĜimská Lenka, KováĜová Eva, Dragounová Hedvika, Babiþka Luboš ..................................... 131 Vliv poĜadí laktace na chemické složení ovþího mléka Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Zajícová Pavlína............................................................................... 134 Obsah a složení syrovátkových bílkovin kozího a ovþího mléka Jansová Blanka, Hejtmánková Alena, Dragounová Hedvika ......................................................... 139 Vliv stadia laktace na mléþnou užitkovost holštýnského skotu Skýpala Martin, Chládek Gustav ..................................................................................................... 144 Variabilita dusíkatých látek v mléce Šustová KvČtoslava, Kopunecz Pavel.............................................................................................. 149 Vliv koncentrace moþoviny na sýraĜské vlastnosti kravského mléka ýejna Vladimír, Chládek Gustav ..................................................................................................... 155 Mlieko so zvýšeným obsahom selénu, ako surovina pre výrobu funkþných potravín v prevencii proti nádorovým ochoreniam Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Bobþek Rastislav.............................................................. 159 Vliv dotace krmné dávky dojnic chránČnými esenciálními aminokyselinami na technologické vlastnosti mléka ýerný Vladimír, TĜináctý JiĜí, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, Hadrová Sylvie..................... 164 Obsah hydroxymethylfurfuralu a pĜíbuzných látek v mléce Bartáková Klára, Borkovcová Ivana, Vorlová Lenka, Krþková Lucie, Chocholáþová Markéta .... 170 HPLC analýza sacharidov a organických kyselín v mlieþnych produktoch Greifová Mária, Greif Gabriel, Krajþová Eva, Karoviþová Jolana, Schmidt Štefan ...................... 175 Hodnocení fyzikálnČ-chemických vlastností sýrĤ s nízkodohĜívanou sýĜeninou pomocí FT-NIR Draþková Michaela, ěeĜuchová Mirka, Hadra Luboš, PĜidalová Hana, Navrátilová Pavlína, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka................................................................................................. 180 Využití NIR spektroskopie pĜi sledování prĤbČhu zrání eidamských sýrĤ rĤzných výrobcĤ Králíková Marcela, Lužová TáĖa, Mlþek JiĜí, Šustová KvČtoslava................................................. 185 Využití NIR spektroskopie pĜi analýze sušeného mléka RĤžiþková Jana, Šustová KvČtoslava............................................................................................... 190 4

Stanovení jakostních ukazatelĤ þerstvých kozích sýrĤ pomocí NIR spektroskopie. Lužová TáĖa, Šustová KvČtoslava, Horáková Ruth ........................................................................ 195 Sledování jakosti jedlých roztíratelných a smČsných roztíratelných tukĤ Panovská ZdeĖka, Dostálová Jana, Doležal Marek, Culková Jana, Šedivá Alena .......................... 198 Senzorické hodnocení mražených krémĤ Jarošová Alžbeta, Šulcerová Hana, ýoþková Dana ......................................................................... 202 Sledování zmČn senzorických vlastností bílých jogurtĤ po dobu jejich minimální trvanlivosti Šulcerová Hana, Šustová KvČtoslava, Vaculínová Hana................................................................. 208 Virtuální realita v elektronických potravináĜských databázích Uvíra Roman, Pudil František, Maryška Martin.............................................................................. 213 Houbové aroma v tavených sýrech Pudil František, Uvíra Roman, Janda Václav .................................................................................. 217 Vliv genetických variant kaseinu na výtČžnost pĜi výrobČ sýrĤ Legarová Veronika, KouĜimská Lenka............................................................................................ 221 Varianty sýrĤ s mletou sýĜeninou a jejich poloprovozní výroba Mrázek Josef, Tykvartová Dagmar, Vráblíková Eva....................................................................... 227 Využití plísnČ Penicillium nalgiovense k výrobČ plísĖového sýra Mrázek Josef, Pospíšil Michal, Korbelová Marie, Heraltová Veronika .......................................... 232 Vliv pĜídavku kappa- a iota-karagenanu na viskoelastické a organoleptické vlastnosti tavených sýrĤ ýerníková Michaela, BuĖka František, Pavlínek Vladimír, ýechová Leona, BĜezina Pavel, HrabČ Jan.......................................................................................................................................... 237 Vliv vybraných hydrokoloidĤ na mechanické vlastnosti gelu kapa-karagenanu v mléce Šilhavá Jaroslava, ŠtČtina JiĜí, Loužecký Tomáš ............................................................................ 243 Texturní vlastnosti gelĤ ț-karagenanu s vybranými hydrokoloidy v mléþných a sójových substrátech Loužecký Tomáš, DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Šilhavá Jaroslava, ŠtČtina JiĜí ......................... 249 Antifungální vlastnosti acylglykosidĤ a jejich využití Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ..................................................... 255 Mikrobiologické a reologické vlastnosti vybraných probiotických sójových výrobkĤ DvoĜáková Eva, DvoĜák Milan, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela, Chumchalová Jana, ŠtČtina JiĜí ....................................................................................................... 259 PĜíprava galaktooligosacharidĤ a jejich aplikace do mléþných a sójových médií DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Hinková Andrea, Chumchalová Jana, ýurda Ladislav, Hellerová Klára, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela .................................................................. 263

5

CONTENS Results of 11th National Quality Competition for Cheese. ýurda Ladislav, ŠtČtina JiĜí................................................................................................................ 13 Microbilogical paramaters for evaluation of raw cow milk. Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ............................................................................................. 21 The influence of morning and evening milking on chosen milk parameters. Skýpala Martin, Chládek Gustav ....................................................................................................... 26 Protective cultures for semi-hard cheese production. TĤma ŠtČpán, Plocková Milada ......................................................................................................... 31 Effect of storage time and temperature on consistency of sterilized processed cheese. BuĖka František, ŠtČtina JiĜí, HrabČ Jan ............................................................................................ 37 Preparation of enzyme hydrolysates in membrane reactor. ýurda Ladislav, Vaverková Ivana, Mišún Daniel.............................................................................. 43 Dynamics of microbial interactions during fermentation of milk. Valík ďubomír, Medvećová Alžbeta, Bajúsová Barbora, Liptáková Denisa.................................... 48 Utilization of glucose and lactose by some strains of lactobacilli. Greif Gabriel, Greifová Mária, Karoviþová Jolana, Kohajdová Zlatica, Krajþová Eva .................... 53 Application of direct and indirect impedance method for studying a pure dairy culture and milk contaminated culture. ýerný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, VyletČlová Marcela ..................................... 59 Žinþica – probiotic biological diversified food. Keresteš Jan........................................................................................................................................ 64 Protective properties of selected Lactobacillus strains. Hudáþek Jaroslav, Zalán Zsolt, Chumchalová Jana, Halász Anna .................................................... 67

Posters: Basic characterization and cell lysis of Lactococcus lactis strains. Abrlová Magdaléna, Šviráková Eva, Hlavsová Barbora, Plocková Milada ...................................... 77 Characterization of growth of the Lactobacillus rhamnosus GG in milk. Medvećová Alžbeta, Valík ďubomír, Liptáková Denisa, Bajúsová Barbora.................................... 81 Selection of a yoghurt culture for soy products. Pavlasová Marcela, DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Chumchalová Jana ......................................... 86 Screening of selected starter cultures for the presence of DNA sequences coding for decarboxylases causing biogenic amine production. Burdychová Radka, Komprda Tomáš ............................................................................................... 91 Effect of lactic acid bacteria on growth of Staphylococcus aureus in milk. Bajúsová Barbora, Valík ďubomír, Liptáková Denisa, Medvećová Alžbeta.................................... 95 Influence of combination of lysozyme and nisin-producing lactococci on the growth of Bacillus cereus DMF 2001 in the model UHT milk system. Šviráková Eva, Ostapþuk Radek, Plocková Milada........................................................................... 99

7

Effect of Lactobacillus rhamnosus GG on the growth dynamics of Candida maltosa in milk. Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Bajúsová Barbora, Medvećová Alžbeta.................................. 104 Purification of bacteriocin produced by Enterococcus mundtii EN3 using a organic solvent and the adsorption on the cell surface method. Miller Petr, Bakir Hatice Eda, Kuþerová KateĜina, Chumchalová Jana, Míková Kamila............... 108 Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis during the manufacturing of sterilized cream and thermized dessert. NČmeþková Irena, Roubal Petr, Pechaþová Marta, VyletČlová Marcela, Nejeschlebová Ludmila . 113 Detection of Clostridium tyrobutyricum in semi-hard cheeses using microbiological and PCR methods. Sládková Pavla, Burdychová Radka ............................................................................................... 118 Isolation and PCR-typing of lactic acid bacteria from bryndza cheese. Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Valík ďubomír, Pangallo Domenico ....................................... 122 Monitoring and identification of bacterial contaminants in production process of sheep products. Kostolníková Mária, KoreĖová Janka, Lopašovská Janka .............................................................. 126 Monitoring of milk acidity changes during goat cheesemaking. KouĜimská Lenka, KováĜová Eva, Dragounová Hedvika, Babiþka Luboš ..................................... 131 Influence of parity on the chemical composition of sheep milk. Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Zajícová Pavlína............................................................................... 134 Content and constituion of goat and sheep whey proteins. Jansová Blanka, Hejtmánková Alena, Dragounová Hedvika ......................................................... 139 The influence of stage of lactation on milk efficiency of holstein cattle. Skýpala Martin, Chládek Gustav ..................................................................................................... 144 Variability of nitrogenous matter in milk. Šustová KvČtoslava, Kopunecz Pavel.............................................................................................. 149 Effect of milk urea level on cheese-making properties of cow’s milk. ýejna Vladimír, Chládek Gustav ..................................................................................................... 155 Milk with higher Selenium content as the raw material for functional food production in the prevention of tumour disease. Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Bobþek Rastislav.............................................................. 159 The influence of milk cow feeding ration with protected essential amino acids on the technological properties of milk. ýerný Vladimír, TĜináctý JiĜí, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, Hadrová Sylvie..................... 164 Content of hydroxymethylfurfural and related compounds in milk. Bartáková Klára, Borkovcová Ivana, Vorlová Lenka, Krþková Lucie, Chocholáþová Markéta .... 170 HPLC estimation of saccharides and organic acids in milk products. Greifová Mária, Greif Gabriel, Krajþová Eva, Karoviþová Jolana, Schmidt Štefan ...................... 175 Determination of physical and chemical properties in low scalded cheese by FT-NIR. Draþková Michaela, ěeĜuchová Mirka, Hadra Luboš, PĜidalová Hana, Navrátilová Pavlína, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka................................................................................................. 180

8

The use of NIR spectroscopy by monitoring rippening eidamcs cheeses from different producers. Králíková Marcela, Lužová TáĖa, Mlþek JiĜí, Šustová KvČtoslava................................................. 185 Application of the FT NIR spectroscopy for analysis of milk powder. RĤžiþková Jana, Šustová KvČtoslava............................................................................................... 190 The determination of quality indexes fresh goatcs cheeses with used NIR spectroscopy. Lužová TáĖa, Šustová KvČtoslava, Horáková Ruth ........................................................................ 195 Monitoring of quality of margarines and spreads. Panovská ZdeĖka, Dostálová Jana, Doležal Marek, Culková Jana, Šedivá Alena .......................... 198 Sensorial assessment of frozen creams. Jarošová Alžbeta, Šulcerová Hana, ýoþková Dana ......................................................................... 202 Changes monitoring of white yoghurts sensorial characteristics during their minimal endurance time. Šulcerová Hana, Šustová KvČtoslava, Vaculínová Hana................................................................. 208 Virtual reality in electronic food databases. Uvíra Roman, Pudil František, Maryška Martin.............................................................................. 213 Mushroom flavour in processed cheese. Pudil František, Uvíra Roman, Janda Václav .................................................................................. 217 The effect of casein genetic varieties on the yield during cheesemaking. Legarová Veronika, KouĜimská Lenka............................................................................................ 221 Variaties of milled curd cheese and their pilot plant production. Mrázek Josef, Tykvartová Dagmar, Vráblíková Eva....................................................................... 227 Use of Penicillium nalgiovense for production of cheese covered by white mould. Mrázek Josef, Pospíšil Michal, Korbelová Marie, Heraltová Veronika .......................................... 232 The effect of addition of kappa- and iota-carrageenans on viscoelastic and organoleptic properties of processed cheeses. ýerníková Michaela, BuĖka František, Pavlínek Vladimír, ýechová Leona, BĜezina Pavel, HrabČ Jan.......................................................................................................................................... 237 Influence of selected hydrocoloids on mechanical properties of kappa-carrageenan gel in milk. Šilhavá Jaroslava, ŠtČtina JiĜí, Loužecký Tomáš ............................................................................ 243 Textural properties of ț-carrageenan gels with chosen hydrocolloids in milk and soya mixtures. Loužecký Tomáš, DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Šilhavá Jaroslava, ŠtČtina JiĜí ......................... 249 Antifungal properties of acylglycosides and their usage. Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ..................................................... 255 Microbial and rheological properties of probiotic soy products. DvoĜáková Eva, DvoĜák Milan, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela, Chumchalová Jana, ŠtČtina JiĜí ....................................................................................................... 259 Preparation of galactooligosaccharides and their application into milk and soy media. DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Hinková Andrea, Chumchalová Jana, ýurda Ladislav, Hellerová Klára, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela .................................................................. 263

9

Celostátní pĜehlídky sýrĤ

VÝSLEDKY 11. ROýNÍKU CELOSTÁTNÍCH PěEHLÍDEK SÝRģ ýurda Ladislav, ŠtČtina JiĜí Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Results of 11th National Quality Competition for Cheese Summary: The 11th National Quality Competition for Cheese was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 18 and 24 of January 2007 in Prague. 67 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 18 producers competed in this year’s show. Competitive samples of cheeses were divided into 10 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three members assessed each cheese. Altogether 110 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (including Slovakian cheeses) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the show. The National Cheese Show was accompanied by a seminar called „Milk and Cheeses“ with a scientific programme involving 13 lectures and 40 poster presentations.

Tradiþní pĜehlídky sýrĤ, které se konají každoroþnČ koncem ledna, dospČly letos již ke svému jedenáctému roþníku. PodobnČ jako pĜedchozí roþníky i ten letošní byl organizován Ústavem technologie mléka a tukĤ Vysoké školy chemicko-technologické v Praze ve spolupráci s ýeskomoravským svazem mlékárenským a Odbornou skupinou pro potravináĜskou a agrikulturní chemii ýeské spoleþnosti chemické. PĜejímka vzorkĤ a odborné hodnocení se konalo 18. ledna. Do hodnocení bylo zaĜazeno 67 vzorkĤ od 18 tuzemských výrobcĤ a 11 vzorkĤ zahraniþních, které poskytlo 6 dovozcĤ sýrĤ. Sýry byly rozdČleny do 10 kategorií. PĜehled zúþastnČných výrobcĤ a rozdČlení vzorkĤ do kategorií je uvedeno v tabulce I. NejsilnČji byla obsazena kategorie eidamských sýrĤ se 40 – 50 % tuku v sušinČ (10 vzorkĤ), 9 vzorkĤ pak bylo hodnoceno ve specialitách (vedle sýrĤ s mazem na povrchu pĜedevším ochucené sýry a bílé sýry) a v kategorii neochucených tavených sýrĤ. NovČ vyhlášenými kategoriemi byly sýry s mazem na povrchu a þerstvé a termizované sýry ochucené. Sýry s mazem na povrchu byly ovšem nakonec zaĜazeny do specialit pro nedostateþný poþet pĜihlášených vzorkĤ. DĜíve samostatné kategorie sýrĤ s tvorbou ok a sýrĤ typu moravský bochník musely být rovnČž slouþeny do jedné kategorie. PĜi odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní komise expertĤ, každá má nezávislého pĜedsedu a tĜi zástupce výrobcĤ. V pĜípadČ kategorií þerstvých a termizovaných neochucených sýrĤ a tavených neochucených sýrĤ, které se hodnotí neanonymnČ, je posílena þást komise z nezávislých odborníkĤ, komise je tedy celkem pČtiþlenná. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvoĜí 40 %) a chuĢ a vĤnČ (60 %). Výsledné hodnocení je dáno aritmetickým prĤmČrem hodnocení všech þlenĤ obou komisí. VeĜejné hodnocení se konalo 24. ledna poprvé v dĤstojném prostĜedí kongresového sálu Masarykovy koleje. PĜehlídky osobnČ zahájil rektor VŠCHT Prof. Ing. Vlastimil RĤžiþka, CSc., pod jehož záštitou se pĜehlídky konají. Zaþátek pĜehlídek byl poznamenán nepĜízní poþasí, kvĤli které se þást hodnotitelĤ nemohla dostavit. Sýry tak posuzovalo celkem 110 hodnotitelĤ. ZpĤsob hodnocení je podobný jako v pĜedchozím pĜípadČ, ale neuplatĖuje se zde podmínka shody v rámci komise ani mezi komisemi. PoĜadí sýrĤ v jednotlivých kategoriích je pak získáno neparametrickým poĜadovým testem. Ve výsledcích se uvádí i prĤmČrné hodnoty, které však poskytují shodné poĜadím.Výsledky z obou hodnocení jsou uvedeny v tabulkách II a III. Tuzemským sýrĤm bylo na základČ odborného hodnocení udČleno celkem 19 diplomĤ. Poþet diplomĤ v jednotlivých kategoriích závisí na poþtu pĜihlášených vzorkĤ (jeden diplom pĜipadne minimálnČ na 3 vzorky). Nejvíce diplomĤ (celkem 4) získala MADETA a. s., která mČla také nevyšší poþet pĜihlášených vzorkĤ (17). K nejúspČšnČjším sýrárnám na letošních pĜehlídkách patĜí Mlékárna Polná, s. r. o. - za þtyĜi pĜihlášené sýry obdržela tĜi diplomy. StejnČ úspČšná byla i JaromČĜická mlékárna, pokud se slouþí výsledky z jejích tĜí samostatnČ pĜihlašovaných stĜedisek. 13

Tabulka I PĜehled pĜihlašovatelĤ sýrĤ a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích.

10. Tavené sýry neochucené

9. ýerstvé a termizované sýry ochucené

8. ýerstvé a termizované sýry neochucené

7. Speciality

6. Sýry s plísní v tČstČ

5. Sýry s plísní na povrchu

4. Uzené sýry

3. Sýry s tvorbou ok a Moravský blok

Poþet sýrĤ

2. Eidamské sýry 40 - 50% t.v.s.

PĜihlašovatel

1. Eidamské sýry 30% t.v.s.

Kategorie

ýeská republika BEL Sýry ýesko, a.s., Želetava

3

JaromČĜická mlékárna, a.s.

4

KROMILK, s.r.o., KromČĜíž

1

Lactalis KS, s.r.o.

2

MADETA, a.s.

17

MILTRA B, s.r.o., MČsteþko Trnávka

3 1

2

1 1

1

1

2

1

2

4

1

1

1

1

Mlékárna Klatovy, a.s.

4

1

1

1

1

Mlékárna Otínoves, s.r.o.

1

Mlékárna Polná, s.r.o.

4

Mlékárna Varnsdorf, s.r.o.

1

Moravia Lacto, a.s.

5

Niva, s.r.o., Dolní PĜím

1

PLASTCOM, a.s., mlékárna PĜíšovice

5

Povltavské mlékárny, a.s., Sedlþany

8

3

Pribina, s.r.o., PĜibyslav

1

1

Sýrárna BratĜí BrunnerĤ s.r.o.

1

TANY, s.r.o., Nýrsko

3

3

TPK, s.r.o., Hodonín

2

2

Vzorky z ýR celkem

67

5

Bongrain

1

Fruit´s de France

1

IMCO s.r.o.

1

Lactalis CZ, s.r.o.

2

SEAFOOD s.r.o.

1

Sýry z dovozu celkem

11

3

3

1

3

2

2

1

1 1

1

1

1

1

2

1 2

1 1

2

1

1 1 1

7

Dovozce zahraniþních sýrĤ NIKA s.r.o.

1

14

10

8

5

5

5

9

4

5

9

Prĥmčrné hodnocení

Interval spolehlivosti

Neparametrické hodnocení



Veĝejné hodnocení

Poĝadí veĝejného hodnocení

1

Odborné hodnocení

Poĝadí odborného hodnocení

Kategorie

Tabulka II Výsledky Celostátních pĜehlídek sýrĤ (kategorie 1 – 5)

1

3

Eidamský salámový polotvrdý sýr

MILTRA B s.r.o.

30

50

88,75

2,96

18,00

70,48

5,19

2

2

Eidamský sýr

Mlékárna Polná, spol. s.r.o.

30

52

78,75

3,31

19,03

72,48

4,36

3

7

Eidamská cihla I

MADETA a.s.

30

50

76,75

6,54

13,10

65,15

4,18

4

4

Eidamská cihla

MADETA a.s.

30

50

74,00

8,58

17,39

70,30

3,99

5

1

Sýr eidam

Mlékárna Klatovy a.s.

30

50

70,50

7,25

19,76

73,58

3,39

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜedisko M. BudČjovice

30

50

69,00

*

14,86

66,48

4,97

Sýr

Výrobce (pĝihlašovatel)

tvs

suš

[%]

[%]

6

5

Eidamský sýr

7

6

Eidamská cihla

PLASTCOM a.s., Mlékárna PĜíšovice

30

50

66,75

2,86

13,86

66,73

3,48

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜedisko JaromČĜice

45

55

86,75

3,77

24,22

76,88

3,80

1

1

Eidamský blok 45%

2

4

Eidamský salámový polotvrdý sýr

MILTRA B s.r.o.

40

53

83,00

4,44

20,44

72,35

4,35

45

55

78,75

2,45

19,12

71,12

3,15

3

5

Eidamský sýr 45% t.v.s.

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜedisko M. BudČjovice

4

6

Gouda

MADETA a.s.

48

57

72,75

6,79

17,85

69,59

4,32

5

2

Eidamský sýr 45%


45

57

72,50

3,37

22,39

75,12

3,35

6

3

Sýr Jasan 50%


50

60

72,00

11,38

20,68

73,59

3,76

7

10

Eidamská cihla


40

54

67,75

3,59

9,19

56,59

5,31

8

9

Mandava - Bio sýr

Mlékárna Varnsdorf s.r.o.

40

54

58,50

3,03

9,49

59,65

2,97

9

7

Krkonošský eidam 45% t.vs.

Lactalis KS s.r.o.

45

55

56,75

3,47

16,16

67,65

3,87

10

8

Eidamská cihla


45

56

54,00

6,54

10,97

60,06

4,19

45

59

87,50

*

8,95

69,25

5,84

2

1

8

Zámecký sýr 45%

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜedisko Želetava

2

5

Goldenburg

Lactalis KS s.r.o.

45

62

85,50

6,82

12,30

76,75

4,63

3

6

Madeland light

MADETA a.s.

30

53

84,00

1,81

10,76

73,33

4,84

4

4

Moravský blok

Moravia Lacto a.s.

45

60

82,00

3,92

13,00

77,25

5,04

5

7

Montana

Moravia Lacto a.s.

45

60

81,75

4,94

9,47

70,33

5,96

6

1

Sýr Moravský blok 45%


45

62

80,75

3,77

14,82

80,67

5,12

7

2

Madeland

MADETA a.s.

45

57

66,75

3,77

14,16

80,83

4,70

8

3

Artuš - pĜírodní salámový polotvrdý sýr tvorbou ok

MILTRA B s.r.o.

40

53

57,00

2,22

13,04

78,25

4,66

1

4

Eidam uzený 45%


45

57

82,00

2,57

7,69

67,83

5,06

2

2

Uzený sýr eidam 40%


40

55

75,75

5,76

11,90

77,83

6,14

3

5

Uzený sýr eidamský blok


45

56

71,25

6,28

**

67,13

5,59

4

3

Eidamský salámový polotvrdý sýr uzený

MILTRA B s.r.o.

40

53

68,75

5,97

11,34

76,09

5,78

5

1

Excelent s þesnekem uzený

Moravia Lacto a.s.

45

55

63,50

2,06

15,23

84,96

3,99

1

4

Sedlþanský hermelín smetanový 100g

Povltavské mlékárny a.s.

64

50

79,50

5,68

11,68

78,42

5,50

2

1

Sedlþanský vltavín 120g


57

53

78,25

2,91

15,32

85,42

4,28

3

5

Král sýrĤ Camembert Grand Caractere

PRIBINA spol. s r.o.

45

45

76,75

3,92

8,14

69,33

6,83

4

2

Sedlþanský hermelín 100g


53

47

75,50

1,92

12,98

79,75

6,23

5

3

Kamadet Královský sýr

MADETA a.s.

48

51

73,00

4,69

12,38

80,25

4,41

3

4

5

s

TuþnČ oznaþené vzorky splnily kritéria pro udČlení diplomu. Kategorie: 1. Eidamské sýry 30% t.v.s. 2. Eidamské sýry 40 - 50% t.v.s. 3. Sýry s tvorbou ok a sýry typu Moravský blok 4. Uzené sýry 5. Sýry s plísní na povrchu

Poznámky:

15

* **

hodnoceno departážní komisí nebylo možno vyhodnotit neparametrickým testem (neúplné výsledky)

Sýr



Neparametrické hodnocení



Veĝejné hodnocení

Poĝadí veĝejného hodnocení

Odborné hodnocení

Poĝadí odborného hodnocení

Kategorie

Tabulka III Výsledky Celostátních pĜehlídek sýrĤ (kategorie 6 – 10)

1

2

Niva

MADETA a.s.

50

52

74,75

5,08

13,37

82,75

4,52

2

3

Caesar Bleu

MADETA a.s.

50

52

70,50

4,61

12,60

79,50

6,67

3

1

Niva Premium

MADETA a.s.

60

52

69,75

2,15

17,60

90,33

3,05

4

5

Sýr Niva

Mlékárna Otínoves s.r.o.

52

53

52,50

5,82

6,75

69,17

4,69

5

4

Niva - sýr s plísní uvnitĜ hmoty

Niva s.r.o.

50

52

49,25

3,92

10,17

75,83

6,02

Jarošovský dezertní pivní sýr

Sýrárna BratĜí BrunnerĤ s.r.o.

40

40

51,75

2,91

71,42

6,51

Excelent s kmínem

Moravia Lacto a.s.

45

55

80,75

5,97

81,42

6,28

BlaĢácké Zlato s pepĜem

MADETA a.s.

48

51

70,50

9,68

81,75

5,36

Sedlþanský Pepin


53

45

67,00

3,39

74,33

6,16

Monastére

MADETA a.s.

48

51

80,50

6,23

84,17

5,02

Excelent mix

Moravia Lacto a.s.

45

55

71,00

9,01

79,17

4,22

Romadur

MADETA a.s.

40

44

64,00

6,11

82,50

4,62

Balkánský sýr


50

42

80,50

0,98

80,08

4,78

Gaston


50

60

74,50

0,64

78,67

4,78

6

*

7

*

Výrobce (pĝihlašovatel)

tvs

suš

[%]

[%]

**

1

2

Krajanka - termizovaný smetanový sýr

KROMILK s.r.o.

50

29

83,40

5,82

15,27

77,93

3,88

2

1

Cottage

MADETA a.s.

23

21

82,00

4,85

15,65

78,36

5,70

3

4

Luþina -Biaktiv 100g


46

28

80,40

2,79

11,96

73,00

4,04

4

3

Luþina sametová 100g


70

37

71,00

2,28

13,62

76,00

4,24

1

1

Tartare - chuĢ Francie 80g


71

34

80,00

4,05

15,59

79,36

4,37

2

4

Cottage jahoda

MADETA a.s.

19

22

78,00

3,25

13,45

76,57

3,57

3

2

Cottage borĤvka

MADETA a.s.

19

22

73,80

6,09

14,28

77,07

4,16

4

3

Luþina svČží zelenina 100g


67

35

73,80

2,64

13,79

76,93

2,82

5

5

Cottage pažitka

MADETA a.s.

23

21

73,00

5,14

13,39

75,64

5,49

1

1

Jihoþeské Lipno - tavený lahĤdkový sýr

MADETA a.s.

64

44

87,40

2,92

19,83

86,36

2,79

2

5

Matador smetanový

BEL Sýry ýesko a.s.

50

38

86,40

1,92

15,47

80,57

3,21

3

2

Smetanito - smetanové


65

47

85,80

1,80

18,09

84,00

3,37

4

3

TANY smetanový, 150g

TANY, spol. s.r.o., Nýrsko

65

45

84,80

3,56

16,81

82,57

3,60

5

4

TANY Delicato, 150g


70

48

80,20

4,03

15,90

81,00

3,09

6

7

TANY nový smetanový, 140g


50

40

79,60

4,21

12,57

76,86

3,41

7

6

Smetanito active


28

31

79,20

4,46

13,63

78,29

3,24

8

9

Apetito SuperCremo

TPK spol. s r.o., Mlékárna Hodonín

60

40

73,60

3,08

5,65

62,71

4,99

9

8

Maratonec

TPK spol. s r.o., Mlékárna Hodonín

53

41

70,40

4,63

8,57

68,50

4,99

8

9

10

TuþnČ oznaþené vzorky splnily kritéria pro udČlení diplomu. Katego 6. Sýry s plísní v tČstČ 7. 8. 9. 10.

Poznámky:

Speciality (ochucené, bílé a sýry zrající pod mazem) ýerstvé a termizované sýry neochucené ýerstvé a termizované sýry ochucené Tavené sýry neochucené

16

* **

v kategorii se nehodnotí poĜadí nebylo možno vyhodnotit neparametrickým testem (v kategorii se nehodnotí poĜadí)

Shoda mezi odborným a veĜejným hodnocením je pomČrnČ dobrá, ve vČtšinČ kategorií sýry s diplomem z odborného hodnocení se umístily v první polovinČ poĜadí veĜejného hodnocení. NejvČtší rozdíly byly zaznamenány v kategorii sýrĤ s tvorbou ok a typu moravský blok. Na rozdíl od loĖského roþníku nebyl žádný sýr hodnocen jako výborný, t. j. v rozmezí 90 až 100 bodĤ (tabulka IV). Nejblíže k této kvalitČ mČl „Eidamský salámový polotvrdý sýr 30 % t. v s.“ (MILTRA B s. r. o.). Pouze jeden sýr byl hodnocen jako podprĤmČrný. Porovnání þetností hodnocení je uvedeno na obr. 1. PodobnČ jako v loĖském roce se v obou komisích nejþastČji objevilo hodnocení 75-80 body. PrĤmČrné hodnocení se lišilo nepatrnČ (74,6 a 74,9 bodu), bylo tak cca o 1,5 bodu nižší než loni. ŠíĜka distribuce hodnocení je však u veĜejného hodnocení širší. OjedinČle se zde vyskytovaly hodnocení podprĤmČrné i nevyhovující a souþasnČ se zde více objevovalo hodnocení nad 80 bodĤ.

Tabulka IV RozdČlení hodnocených sýrĤ do kvalitativních kategorií VeĜejné hodnocení

Kvalitativní kategorie

Odborné hodnocení

Bodové hodnocení poþet vzorkĤ

%

poþet vzorkĤ

%

90 - 100

1

1,5

0

0

Velmi dobrý

75 - 89

39

58,2

33

49,3

PrĤmČrný (standardní kvalita)

50 - 74

27

40,3

33

49,3

PodprĤmČrný

30 - 49

0

0

1

1,5

< 30

0

0

0

0

Výborný (ideální typ)

(min. 30 bodĤ od každé komise)

Nevyhovující

25 Hodnocení expertĤ VeĜejné hodnocení

Relativní þetnost [%]

20

15

10

5

Bodové hodnocení

Obr. 1. Porovnání relativních þetností hodnocení expertĤ a pĜi veĜejném hodnocení.

17

95 10 0

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

0

Také v letošním roþníku bylo hodnocení tuzemských sýrĤ, pĜedevším zásluhou pana Liklera, doplnČno zajímavými sýry z dovozu. KromČ šesti pĜevážnČ francouzských sýrĤ bylo hodnoceno také pČt výrobkĤ ze Slovenska spoleþnosti NIKA. Tyto sýry jsou posuzovány oddČlenČ, hodnotí je všichni þlenové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr zaĜazuje do kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V. JednoznaþnČ nejlépe byl hodnocen dvouplísĖový sýr „Bluetta“ spoleþnosti Lactalis CZ s.r.o., který získal 31 návrhĤ na diplom ze 44 možných. Diplomem byl dále ocenČn sýr „Tete de Moine“ (SEAFOOD s. r. o.) a ovþí sýr „Etorki“ (Bongrain). Ze slovenských sýrĤ byla ocenČna „Tradiþná slovenská bryndza“.

Tabulka V Výsledky Celostátních pĜehlídek sýrĤ – zahraniþní vzorky Popis

Dovozce

tvs

suš.

Medián

Sýr

Modus

Kvalitativní kategorie

Návrhy na diplomy

Tradiþná slovenská bryndza

Ovþí sýr ze syrového mléka

NIKA spol. s r.o.

48%

44%

2

2

Bryndziarka

Brynzová pomazánka

NIKA spol. s r.o.

48%

45%

4

3

1

Koziarka

Pomazánka s obsahem kozího mléka

NIKA spol. s r.o.

48%

45%

4

4

0

Bryndzauer

Tavený sýrový výrobek

NIKA spol. s r.o.

3

3

0

Goatauer

Tavený sýrový výrobek

NIKA spol. s r.o.

3

3

0

Etorki

Ovþí sýr z pasterovaného mléka

Bongrain

1

1

23 18

50%

12

Explorateur

Smetanový mČkký sýr

Fruit´s de France

75%

2

2

Saint Albray

MČkký sýr s mazem a plísní na povrchu

IMCO s.r.o.

50%

52%

2

2

16

Bluetta

DouplísĖový sýr

Lactalis CZ, s.r.o.

50%

50%

1

1

31

Camembert Président

Sýr s plísní na povrchu

Lactalis CZ, s.r.o.

45%

45%

2

2

3

Tete de Moine

Polotvrdý A.O.C. sýr ze syrového mléka

SEAFOOD s.r.o.

51%

60%

1

1

23

Kvalitativní kategorie: 1. Vynikající

TuþnČ oznaþené vzorky splnily kritéria pro udČlení diplomu.

2. Výborný 3. Velmi dobrý 4. PrĤmČrný 5. PodprĤmČrný

Jako v pĜedchozích roþnících i letos byl program pĜehlídek byl doplnČn pĜednáškami. Bohužel se nemohla uskuteþnit pĜednáška Ing. J. Kopáþka, CSc. (ýeskomoravský svaz mlékárenský) s informacemi z posledního Mezinárodního mlékárenského kongresu. PohotovČ ho v improvizované pĜednášce zastoupil prof. P. Jelen (University of Alberta, Kanada). O perspektivČ potravináĜského výzkumu v 7. rámcovém programu hovoĜil dr. Ch. Patermann z European Commission, DG Research. Na navazujícím semináĜi bylo prezentováno 13 pĜednášek a trojnásobný poþet posterĤ. Obou akcí se dále úþastnilo 16 firem, jejichž þinnost se dotýká laboratorního vybavení a potĜeb pro zpracování mléka.

Kontaktní adresa: Doc. Ing. Ladislav ýurda, CSc., Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko technologická v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected]

18

MLÉKO a SÝRY PĜednášky

MIKROBIOLOGICKÉ KRITÉRIÁ PRE HODNOTENIE KVALITY SUROVÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živoþíšnej výroby, Nitra Microbilogical paramaters for evaluation of raw cow milk Summary: This study deals with characteristics of microbiological contamination in milk within the year round inquiry aiming at supplementary traits of mesophilic and psychrotrophic spore-forming aerobic microflora. It evaluates relations to technologically important groups of microorganisms, proposes limit criterion and a method of cultivation as a means to decrease riskness and prolong the durability of milk foodstuffs. During the time of one year we took samples of raw tank milk 21 times from 14 milk farms (294 samples completely). There were 90,8 % samples with convenient total count of microoganisms, however, after the supplementary traits of mesophilic, psychrotrophic, coliform and spore forming contamination of milk were evaluated, remained only 43,9 % samples, that confirm with limits of the standard STN 57 0529. Introduction of supplementary traits for the selection of raw material would improve the quality and prolong time of durability in milk products. With none of these parameters were observed significant influence of seasons. The proposed limit 200 CFU/ml for mesophilic and psychrotrophic aerobe spore-forming bacteria count (MPAS) is realisable in the studied sphere. We observed 3,1 % cases exceeding this value.

Úvod Nariadenie vlády Slovenskej republiky z 9. júla 2003 þ. 312/2003 o zdravotných požiadavkách na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mlieþnych výrobkov vychádza zo smernice Európskeho spoloþenstva þ. 92/46 Hygienické predpisy pre výrobu a predaj mlieka a mlieþnych výrobkov. PodĐa neho je pri kontrole akosti surového kravského mlieka hlavným mikrobiologickým kritériom celkový poþet mezofilných mikroorganizmov (CPM). Ćalšie mikrobiologické požiadavky (Tab. I) nie sú pre mliekarne záväzné a uplatĖujú ich iba výnimoþne. Psychrotrofné mikroorganizmy produkujú zväþša termostabilné lipolytické a proteolytické extracelulárne enzýmy, ktoré prechádzajú pasterizáciou v aktívnej forme a spôsobujú senzorické chyby mlieka (lipolýza má za následok mydlovitú vôĖu a horkastú chuĢ, proteolýza spôsobuje šedú farbu a horkú chuĢ) a technologické škody tým, že zhoršujú jeho syrárske vlastnosti [12]. Koliformné baktérie sú indikátorom fekálneho zneþistenia a možným zdrojom zoonóz. Ich prienik do mlieka sa zamedzuje sanitáciou pri dojení [3]. VzhĐadom na najvyššiu schopnosĢ prežiĢ pasterizáciu mlieka a následne sa pomnožovaĢ vo finálnych výrobkoch, majú zvláštne postavenie v celkovej mikroflóre mlieka spórotvorné mikroorganizmy. Nedajú sa odstrániĢ šetrnou ani vysokou pasterizáciou, prenikajú technológiou UHT [14] i HTST [8]. Prežívajú i 15 sekúnd trvajúci var [1]. Spórotvorné mikroorganizmy sú jednak striktne anaeróbne (SPAN), - prevažne rod Clostridium, najþastejšie Cl. butyricum, Cl. sporogenes, Cl. botulinum, ktoré spôsobujú pri dlhodobom zrení syrov tzv. neskoré nadúvanie tvorbou plynu. Pre výrobu konzumného mlieka a mlieþnych výrobkov majú význam baktérie rodu Bacillus, najþastejšie B. cereus, B. licheniformis, B. subtilis, ktorý sa množí v anaeróbnom, aj v aeróbnom prostredí, a je charakteristický širokým okruhom fyziologických variantov, þo sa odráža v rozmanitosti mezofilných, termofilných a psychrofilných druhov (MPAS). Rod Bacillus je rizikový potravný patogén so schopnosĢou znehodnotiĢ lipo- a proteolytickou enzymatickou aktivitou konzumné mlieko a produkovaĢ termolabilný diarhogénny a termostabilný emetický toxín. Tvorba toxínov nie je vždy spojená so známkami pokazenia potraviny, þo je nebezpeþné pre spotrebiteĐa [2, 10]. Pri prvovýrobe mlieka môžu spórotvorné mikroorganizmy pochádzaĢ zo siláže, pôdy a vody. Z tráviaceho traktu dojníc, kde sú schopné sa pomnožiĢ až 10 násobne, sa výkalmi dostávajú na podstielku, na plochy stojiska, výbehu, a na telo dojnice [13]. Štúdium výskytu aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov ukázalo, že najvyšší poþet bacilov sa nachádzal vo výkaloch a v siláži, kde hodnoty presahovali 106.g-1. V mlieku bol zistený zvýšený poþet sporulátov pri zmene krmiva, keć sa u dojníc prejavovali hnaþky [10]. Významné korelácie medzi výskytom 21

spórotvorných baktérií rodu Bacillus v surovom mlieku a výkaloch (r = 0,28, P = 0,05), resp. v krmive a výkaloch (r = 0,35, P = 0,01) sa zistili pri hĐadaní spôsobov redukcie ich prieniku do mlieka [11]. Štatistická korelaþná analýza celkového poþtu mikroorganizmov a poþtu spór v surovom mlieku od 5882 belgických dodávateĐov mlieka ukázala signifikantnú (P 0,01) pozitívnu, avšak slabú (r = 0,3) koreláciu, priþom priemerný CPM bol 104.5 a priemerný poþet spórotvorných mikroorganizmov (PSM) bol 102.7 v 1ml mlieka. To znamená, že pre zabezpeþenie nízkeho poþtu spór v dodávanom mlieku sú okrem bežných hygienických postupov potrebné i ćalšie špecifické hĐadiská a opatrenia v prvovýrobe [9]. StarostlivosĢ o mikrobiologickú kvalitu kravského mlieka ako suroviny pre výrobu mliekarskych produktov za posledných 15 rokov, odkedy sa zisĢuje priamymi mikrobiologickými metódami, umožnila významné zlepšenie kvality mlieka - pokles limitu celkového poþtu mezofilných mikroorganizmov z 20 000 tis. ml-1 na 50 - 100 tis. ml-1 (trieda kvality Q a I.). Niektorým mliekarĖam to umožnilo prejsĢ na nároþné technologické zameranie v oblasti výroby syrov, ako aj v oblasti predlžovania trvanlivosti þerstvých mliekarskych produktov. Požiadavky spotrebiteĐov na þerstvú chuĢ mlieka a jeho trvanlivosĢ sa snaží skĎbiĢ nová technológia PURE-LAC [5]. Ide o ošetrenie mlieka ohrevom na 135°C trvajúce 0,2 sekundy, ktoré zlikviduje 99,9 % kontaminujúcej mikroflóry. Pre dodávateĐov suroviny na takéto spracovanie bol zavedený nový ukazovateĐ kvality surového mlieka – poþet mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulátov (MPAS), ku ktorému sa uvádza nasledovná definícia a vymedzenie pojmu: Požiadavky na kvalitu surového kravského mlieka zahrĖujú jednak pojem spórotvorné anaeróbne mikroorganizmy, ktoré sa po inaktivácii vzoriek pri 85°C po dobu 10 min. kultivujú v anaeróbnych podmienkach, þo zahrĖuje prevažne anaeróbny rod Clostridium. Skúška na ich prítomnosĢ v 0.1ml mlieka musí byĢ negatívna. Druhý ukazovateĐ, ktorý sa urþuje po tepelnej inaktivácii vzoriek mlieka, avšak pri 72 °C po dobu 20 min., je poþet termorezistentných mikroorganizmov, ktoré sa kultivujú v aeróbnych podmienkach, a ich prípustný poþet je najviac 2000 v 1 ml mlieka. Pri tomto spôsobe tepelnej inaktivácie prežívajú i niektoré termofilné druhy mikroorganizmov, ktoré však pri pasterizácii odumierajú a ich vitálne formy sa nedostávajú do mlieþnych výrobkov. Tepelná inaktivácia pri stanovení MPAS, a to 82°C poþas 30 min., a kultivácia pri aeróbnych podmienkach umožĖuje užšie sa zameraĢ na pasterizáciu prežívajúce spóry spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov, prevažne rod Bacillus. Použitím dvoch inkubaþných teplôt, 30°C a 7°C, zistíme poþet mezofilných i psychrofilných druhov. Zúženie pojmu oproti termorezistentným mikroorganizmom umožĖuje i sprísnenie tohto kritéria na navrhovaný poþet max. 200 KTJ v 1 ml mlieka. [6]. Predpokladáme, že lokalizácia zdrojov mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulátov a zavedenie tohto kritéria do výberu suroviny by mohlo priniesĢ efekt stability v trvanlivosti a skladovateĐnosti a zvýšenie bezpeþnosti mlieþnych potravín, hlavne všetkých typov konzumného mlieka, mlieka a smotany s predĎženou trvanlivosĢou a þerstvých mlieþnych výrobkov. CieĐom práce bol celoroþný monitoring bakteriálnej kontaminácie mlieka so zameraním na hodnotenie doplnkových ukazovateĐov mezofilnej, psychrotrofnej, a spórotvornej mikrobiálnej kontaminácie mlieka ako suroviny pre zníženie rizikovosti mlieþnych potravín. Materiál a metódy V priebehu jedného roka sme na 14 poĐnohospodárskych podnikoch vykonali 21 odberov bazénových vzoriek (celkom 294 vzoriek) surového kravského mlieka v zmysle Metodických pokynov skúšania kvality nakupovaného mlieka MP SR, na konzerváciu bolo použité Heeschenovo þinidlo [7]. Vo vzorkách sme stanovili CPM podĐa STN ISO 48 33 (1997), PKB podĐa STN ISO 48 32 (1997), CPP podĐa STN ISO 67 30 (2000). SPAN naoþkovaním 1 ml mlieka inaktivovaného pri 85 °C po dobu 10 minút do skúmavky so živnou pôdou mäsopeptónový agar s glukózou (MPAG), a po zaliatí parafínom anaeróbnou kultiváciou pri teplote 37 °C 7 dní. MPAS podĐa predpisu TEI 118; Methods in food science microbiology; Psychrotrophic and mesophilic aerobic bacterial spores in milk, ktorý bol dodaný a zavedený v súvislosti so zavedením technológie PURE-LAC v mliekárni PMV ZábĜeh [6]. Základom postupu je inaktivácia vzorky mlieka pri teplote 80-82 °C 22

po dobu 30 min., naoþkovanie 1 ml na kultivaþnú Petriho misku a zaliatie živnou pôdou agar s glukózou, tryptónom a kvasniþným extraktom (GTK), obohatenou o 0,1 % škrobu a inkubácia pri 30 °C 72 hod. a následne pri 7 °C 10 dní. Výsledky a diskusia Celkový poþet mezofilných mikroorganizmov (CPM) v sledovaných vzorkách v priemere za celé roþné obdobie bol 38 170 KTJ.ml-1, v rozmedzí od 500 do 500 tis. KTJ.ml-1 (Tab I). 90,8 % vzoriek bolo v kategóriách do 100 tis. KTJ.ml-1 (Tab II). TabuĐka I Kritériá STN 57 0529 a výsledky mikrobiologickej charakteristiky saledovaných vzoriek mlieka Maximálna ZáväznosĢ Priemer Štand. povolená hodnota ukazovateĐa (KTJ/ml) odchylka Celkový poþet mezofilných 100 tis. KTJ/ml povinný 38170 7,66.104 mikroorganizmov CPM Celkový poþet psychrotrofných 50 tis. KTJ/ml doplnkový 12536 6,42.108 mikroorg. CPP Poþet koliformných baktérií 1000 KTJ/ml doplnkový 698 2,60.106 PKB Spórotvorné anaeróbne baktérie neg. v 0.1 ml doplnkový 6.3 22 SPAN Mezofilné a psychrotrofné 200 KTJ/ml navrhovaný 59.4 3052 aeróbne sporuláty MPAS TabuĐka II Relatívna poþetnosĢ výsledkov v jednotlivých kategóriách poþtu KTJ.ml-1 [%] KTJ.ml-1 (a) a<=1 1
a>105 9,18 -

Poþet koliformných baktérií (PKB) mal v sledovanom súbore najvyšší variaþný koeficient Vk = 231 %. Výsledky jednotlivých vzoriek boli v rozpätí 5 – 13 000 KTJ.ml-1. Priemerná hodnota celého súboru - 698 KTJ.ml-1, ako aj geometrický priemer - 219 KTJ.ml-1, svedþia o dobrej úrovni v sledovaných chovoch. Zavádzaný systém HACCP a s tým spojené nároky na školených pracovníkov v prvovýrobe zrejme prináša potrebný efekt. 83,7 % vzoriek je v kategóriách do 1000 KTJ.ml-1. Avšak práve tento, prevažne dobre zvládnutý ukazovateĐ môže pri nedostatoþnej pozornosti obsluhy pri získavaní mlieka zaznamenaĢ prudké výnimoþné zvýšenie až na hodnoty vo vyšších kategóriách, kde sa zaznamenalo 16,3 % vzoriek. Znižovanie poþtu mezofilných mikroorganizmov v nadojenom mlieku a skladovanie chladeného mlieka dáva priestor pre rozmnožovanie psychrotrofných mikroorganizmov (CPP). Zistený rozsah od 25 až do 150 tis. KTJ.ml-1 poukazuje na nevyrovnanosĢ hodnôt tohto ukazovateĐa. Predpísaný limit do 50 tis. KTJ ml-1 nesplnilo 5,8 % vzoriek. Celkový poþet mezofilných a psychrotrofných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (MPAS) sa pohyboval v rozpätí 2,5 - 340 KTJ.ml-1. Priemerná hodnota bola 59,4 KTJ/ml. 55,4 % vzoriek bolo s poþtom do 50 KTJ.ml-1, 85 % nemalo hodnotu vyššiu ako 100, a iba 3,1 % vzoriek malo poþet MPAS väþší ako 200. VzhĐadom na to, že táto skupina mikroorganizmov sa tepelným ošetrením mlieka pred spracovaním na mlieþne potraviny neeliminuje, majú aj zdanlivo nízke poþty závažné negatívne dôsledky pre kvalitu a skladovateĐnosĢ mlieþnych potravín. [4, 15]. 23

Zavedenie sledovania tohto ukazovateĐa do kritérií pre nákup mlieka na spracovanie na þerstvé mlieþne potraviny s predĎženou trvanlivosĢou by pomohlo zvýšiĢ kvalitu týchto potravín, podobne ako v mliekarni PMV ZábĜeh na Morave [6]. Na základe týchto výsledkov môžeme skonštatovaĢ, že poþiatoþný navrhovaný limit pre poþet mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulujúcich baktérií (MPAS) maximálne 200 KTJ.ml-1 je pre sledovanú oblasĢ splniteĐný. Spórotvorné anaeróbne mikroorganizmy (SPAN), ktoré sú nežiaduce najmä v mlieku na trvanlivé výrobky a dlhozrejúce syry, boli v rozmedzí 0 - 23, v priemere 6,3 KTJ.ml-1. 49 % vzoriek bolo v kategórii do 5 KTJ.ml-1, þo s poloviþnou pravdepodobnosĢou (P = 0,5) znamená negatívny výsledok pri oþkovaní 0,1 ml vzorky mlieka pri zisĢovaní splnenia limitu STN. Pri žiadnom zo sledovaných ukazovateĐov sa nepozorovali významné sezónne vplyvy. Analýzou rozptylu sme zistili nízku pravdepodobnosĢ (P < 0,001) zhodnosti priemerov za jednotlivé odbery. Testovaním výsledkov za celé roþné obdobie sme však nezistili štatisticky významný vplyv na stredné hodnoty jednotlivých mikrobiologických ukazovateĐov. To znamená, že sa nepreukázal vplyv roþného obdobia. Hygiena dojenia je zrejme už na takej úrovni, že dokáže eliminovaĢ prirodzený vplyv rozdielnej teploty v roþných obdobiach na schopnosĢ rozmnožovania mikroorganizmov v prostredí maštale. Jednotlivé pozorované zvýšenia niektorých parametrov sa javia skôr ako sporadicky sa vyskytujúce chyby v hygiene dojenia. Variabilita hodnôt mikrobiologických ukazovateĐov u jednotlivých dodávateĐov surového kravského mlieka vyjadruje prevádzkovú istotu chovateĐa z hĐadiska speĖažovania mlieka [13]. Medzi priemernými hodnotami za sledované farmy a ich štandardnou odchýlkou sme zaznamenali tesné korelaþné závislosti (pre CPM r = 0,92, pre CPP r = 0,96, pre PKB r = 0,91, pre MPAS r = 0,83). Vyššia štandardná odchýlka pri farmách s vyšším priemerom daného ukazovateĐa svedþí o nevyrovnanosti výsledkov týchto producentov, a o tom, že dosahujú aj nízke hodnoty. Každý zo sledovaných producentov je schopný dosiahnuĢ dobré výsledky, musí sa ale zameraĢ na sústavnosĢ v precíznosti hygieny dojenia.

TabuĐka III Poþet vzoriek, ktoré v jednotlivých ukazovateĐoch nesplnili požiadavky kvality. CPM PKB CPP MPAS -1 Limit [KTJ.ml ] >100 tis >1 tis. >50 tis. >200 celkovo 27 47 17 9 Poþet nové prípady nevyhovujúcich 29 5 4 (v predošlých uk. vyhovujúce) vzoriek Poþet vyhovujúcich vzoriek. 267 238 233 229 % z pôvodného poþtu 294 vzoriek 90,8 81,0 79,3 77,9

SPAN >5 140 100 129 43,9

V tabuĐke III vidíme poþet prípadov, keć neboli splnené požiadavky na kvalitu surového kravského mlieka. 267 vzoriek, t.j. 90,8 % z celkového poþtu vyhovovalo po stránke CPM. Keć odpoþítame vzorky ktoré pri vyhovujúcom CPM nesplnili limit pre PKB, þo je 29 vzoriek, ostáva nám 238, t.j. 81 % vzoriek. Nesplnenie požiadavky na CPP vyradí ćalších 5 vzoriek a limit pre MPAS vyradí ešte 4 vzorky, takže z pôvodného poþtu zostáva 229, t.j. 77,9 % vzoriek. SPAN je ukazovateĐ oþividne nesúvisiaci s predošlými požiadavkami, pretože vyraćuje ćalších 100 vzoriek, takže po vyhodnotení všetkých ukazovateĐov ostáva 129, t.j. 43,9 % vzoriek, ktoré sú podĐa mikrobiologických ukazovateĐov bezchybné.

24

Záver: Takýto súhrnný pohĐad na nakupované surové mlieko by bol žiadúci z hĐadiska zachovania pôvodných vlastností, mlieþnej chuti a trvanlivosti výrobkov. Doplnkové ukazovatele mikrobiologickej kvality tak môžu maĢ významnú úlohu pri zvyšovaní kvality surového kravského mlieka a tým i bezpeþnosti a funkþnosti mlieþnych potravín, zvlášĢ pre mliekárne so spracovaním mlieka na nároþné produkty z hĐadiska trvanlivosti, alebo použitia špecifických kultúr, prípadne pre detskú výživu. V nadväznosti na nové kritériá a požiadavky na kvalitu surového kravského mlieka je potrebné prispôsobiĢ im hygienický program v prvovýrobe. Použitá literatura: 1. Abo-Elnaga, H.I. – Hegazi, F.Z. – Abo-Elnaga, I.G.: Spore-forming rods surviving boiling the raw milk and implicated in later spoilage of the product. In: Arch. Lebensm. - Hyg., 53, 2002, s. 86–89. 2. Beattie, S.H. – Williams, A.G: Growth and diarhoeagenic enterotoxin formation by strains of Bacillus cereus in vitro in controlled fermentations and in situ in food products and a model food system. In: Food Microbiol., 19, 2002, s. 329–340. 3. Binderová, E. – Ryšánek, D.: Microbial contaminants of milk processed by high-temperature short-time pasteurization. In: Vet. Med. – Czech, 44, 1999, s. 301–307. 4. Greifová, M. – Valík, ď. – Görner, F. – Petríková, J.: Predikcia trvanlivosti pasterizovaného mlieka z hĐadiska rastu Bacillus cereus pri (5±1)°C. Bull. potrav. Výsk., 38, 1999, s. 243–250. 5. Hanuš, O. – KoláĜ, A. – VyletČlová, M. – Pur, I.: ýerstvé konzumní mléko s prodlouženou trvanlivostí – nová kvalitní potravina pro lidskou výživu. In: Nové trendy v organizaþních, technologických a hygienických postupech nákupu syrového mléka v kontextu podmínek EU (zbor. z medzinár. konf.). Šumperk, Okresní agrární komora, 2001, s. 81–104. 6. Hanuš, O. – KoláĜ, A. – Pur, I. – VyletČlová, M.: RozšíĜení spotĜebního potravinového mléþného sortimentu v ýR a lokální kvalita suroviny. In: Den mléka 2002 (zbor. z medzinár. konf.). Praha, ýZU, 2002, s. 44–48. ISBN 80-213-0900-8 7. Heeschen, W. – Reichmuth, J. – Tolle, A. – Ziedler, H.: Preservation of milk samples for bacteriologic and cytologic examinations and examinations for inhibitors. Milchwissenschaft, 24, 1969, s. 729–734. 8. Mayr, R. – Eppert, I. – Scherer, S.: Incidence and identification of psychrotrophic Bacillus spp. in German HTST pasteurized milk. Milchwissenschaft, 54, 1999, s. 29-30. 9. Rombaut, R. – Dewettinck, K. – de Mangelaere, G. – van Vooren, L. – Huyghebaert, A.: Raw milk microbial quality and production scale of Belgian dairy farms. Milchwissenschaft, 57, 2002, s. 625–628. 10. Lukášová, J. – Vyhnálková, J. – Páþová, Z.: Bacillus species in raw milk and in the farm environment. In: Milchwissenschaft, 56, 2001, s. 609–611. 11. VyletČlová, M.: Potravní patogeny rodu Bacillus v mléce, metoda odhadu a redukce jejich prĤniku do potravního ĜetČzce. Výzk. Chovu Skotu, 2002, þ. 1, s. 24–27. 12. VyletČlová, M. – Hanuš, O. – Urbanová, E. – Kopunecz, P.: Výskyt a identifikace psychrotrofních bakterií s proteolytickou a lipolytickou aktivitou v bazénových vzorcích mléka v podmínkách technologií prvovýrobního uskladnČní. Czech J. Anim. Sci., 45, 2000, s. 373–383. 13. VyletČlová, M. – Hanuš, O. – Páþová, Z. – Roubal, P. – Kopunecz, P.: Výskyt bakterií rodu Bacillus v syrovém kravském mléce a jejich vztah k ostatním hygienickým ukazatelĤm. Czech J. Anim. Sci., 46, 2001, s. 260–267. 14. VyletČlová, M. – Švec, P. – Páþová, Z. – Sedláþek, I. – Roubal, P.: Výskyt kmenĤ Bacillus cereus a Bacillus licheniformis v procesu výroby UHT mléka. Czech J. Anim. Sci., 47, 2002, s. 200–205 15. Valík, ď. – Lauková, D. – Görner, F.: Obsah Bacillus cereus a celkový poþet mikroorganizmov v pasterizovanej smotane. In: Bull. potrav. Výsk., roþ. 40, 2001, þ. 3, s. 209–219.

Kontaktná adresa: Ing. Katarína Kirchnerová, PhD., Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, [email protected] 25

VLIV RANNÍHO A VEýERNÍHO NÁDOJE NA VYBRANÉ MLÉýNÉ UKAZATELE Skýpala Martin, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtČní zvíĜat, AF, MZLU Brno The influence of morning and evening milking on chosen milk parameters Summary: The aim of this study was efficient influence of morning and evening milking on chosen milk parameters. The samples of milk from Holstein cattle (n = 12) on the first lactation breed on the school farm Žabþice, were analyzed. The dairy cows were bred in the same conditions, i.e. they were in the same stable and they were fed with the same feeding ration. The samples of morning and evening milking were obtained from June to October 2006. The interval between morning and evening milking was (12 + 12 h ± 15 min). We evaluated milk yield (kg), milk protein yield (kg), milk fat yield (kg), milk protein content (%), milk fat content (%), somatic cell count (tis./ml), titratable acidity (SH), rennet coagulation time (s), quality of curd (class). We found high significantly influence (P<0,01) in milk yield (morning 14.2 kg; evening 12.5 kg), milk protein yield (morning 0.46 kg; evening 0.40 kg) and significantly influence (P<0,05) in milk fat yield (morning 0.56 kg; evening 0.52 kg). No significant influence was found in milk protein content, milk fat content, somatic cell count, titratable acidity, rennet coagulation time and quality of curd.

Úvod Mléko pĜedstavuje složitý biologický systém, ve kterém se nacházejí jednotlivé složky rĤzném pomČru a vzájemné vazbČ (CHLÁDEK, 1993). Jak uvádí ŽIŽLAVSKÝ a MIKŠÍK (2005) lze z vemene získat jednak i sáním teletem a jednak dojením. Moderní strojní dojení vyžaduje úplné a rychlé vydojení mléka za optimálních hygienických podmínek k udržení vysoké mléþné užitkovosti, kvalitního produktu a zdraví zvíĜat za nízkou cenu (BRUCKMAIER, 2001). Produkce mléka se mČní v prĤbČhu laktace a je znázorĖována laktaþní kĜivkou (LANDETE-CASTILLEJOS a GALLEGO, 2000). Produkce mléka a obsah jeho složek vykazuje v prĤbČhu laktace avšak i v prĤbČhu dne urþité zmČny (ŽIŽLAVSKÝ a MIKŠÍK, 1988). TEPLÝ et al. (1979) uvádí pĜi stabilních podmínkách chovu denní kolísání u množství mléka ± 1,10 kg, u obsahu tuku ±0,75 %, u obsahu bílkovin ± 0,20 %. Materiál a metodika V našem pokuse byly analyzovány vzorky mléka dojnic holštýnského plemene (n = 12) na první laktaci chovaných na ŠZP Žabþice. Dojnice byly chovány ve stejných podmínkách, tj. ve stejné stáji a krmeny shodnou krmnou dávkou. Vzorky z ranního a veþerního dojení byly odebírány pomocí Tru-testu v mČsíþních intervalech od þervna do Ĝíjna 2006. Interval mezi ranním a veþerním dojením þinil (12 + 12 h. ± 15 min). Nádoj byl zjišĢován na dojírnČ pĜi odbČru vzorkĤ, obsah tuku a bílkovin a poþet somatických bunČk byl stanoven ve Výzkumném ústavu pro chov skotu v RapotínČ, bílkovina a tuk na pĜístroji Milko-scan 133 B a somatické buĖky na SB fossomatic 90. Ostatní ukazatele byly zjištČny v laboratoĜi Ústavu chovu a šlechtČní zvíĜat MZLU v BrnČ. SýĜitelnost mléka byla stanovena pomocí "Nefelo-turbidimetrického snímaþe koagulace mléka" mČĜící principem popsaným v ýEJNA a CHLÁDEK (2005). Bylo použito syĜidlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po zĜedČní syĜidla 1:4. Kvalita byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasýĜeného mléka pĜi 35 0C a posouzena dle známé tabulky (GAJDģŠEK, 1999) hodnotící vzhled sýĜeniny a syrovátky (tĜída 1 = nejlepší, tĜída 5 = nejhorší). Titraþní kyselost byla provádČna dle ýSN 57 0530 þl. 58. Výsledky a diskuze Množství mléka u dojených krav je ovlivĖováno Ĝadou faktorĤ jako genetika, životní prostĜedí, hormonální hladina, úroveĖ výživy a frekvence dojení (LOLLIVIER a MARNET, 2005). Mléþná výtČžnost krav mĤže být vyjádĜena mnoha odlišnými zpĤsoby, napĜíklad v kilogramech za laktaci nebo v kilogramech za den. V praxi je realizována mléþná produkce za dojení. Celková produkce za laktaci je souþet všech produkcí v prĤbČhu laktace (OUWELTJES, 1998). U ranního vzorku jsme zjistili 14,2 kg mléka, což je množství vysoce statisticky prĤkaznČ vyšší (P<0,01) 26

než u nádoje veþerního (12,5 kg). ŽIŽLAVKÝ a MIKŠÍK (1988) uvádí o 0,8 kg vyšší nádoj ráno než veþer. NeprĤkaznČ nižší množství mléka veþer než ráno uvádí také BRAUNER a HANUŠ (1984). I OUWELTJES (1998) zjistil vČtší množství ráno než veþer. SEMJAN et al. (1987) tvrdí, že pĜi stejném intervalu dojení (12 + 12 hodin) je nádoj mléka stejný. Dojící interval je definován jako þas od zaþátku jednoho dojení do zaþátku dojení dalšího (LEE et al., 1995). Pokud krávy jsou dojeny v nestejných intervalech, obvykle delší noþní a kratší denní, je pak menší množství mléka (HARGROVE, 1994). Mléþné bílkoviny jsou z nutriþního hlediska považovány za nejvýznamnČjší složku mléka (CHLÁDEK, 1993). Podle HANUŠE (2001) jsou významné i pro zpracovatelskou technologii a také pro možnost kontroly výživy dojnic a tím i zdravotního stavu. Našli jsme vysoce statisticky prĤkazný rozdíl (P<0,01) mezi produkcí ráno (0,46 kg) a veþer (0,40 kg). Naopak KLOPýIý et al. (2003) zjistil obČ hodnoty stejné. Co se týþe obsahu bílkovin byla ranní i veþerní hodnota stejná (3,24 %). ŽIŽLAVSKÝ a MIKŠÍK (1988) zjistili ranní obsah bílkovin nepatrnČ vyšší. Jelikož obsah bílkovin byl statisticky neprĤkazný narozdíl od produkce bílkovin, mĤžeme z toho usoudit, že produkce bílkovin byla ovlivnČna nádojem. Tuk se v mléce vyskytuje v kulovitých globulích v prĤmČru od 0,1 ȝm do 15 ȝm. Jejich poþet je od 1010 do 1011a ze 100 g mléka by zaujímaly plochu 5 - 11 m2 (GOUDÉDRANCHE et al., 2000). Jak uvádí KLOPýIý et al. (2003) obsah tuku je nejvíce promČnlivou složkou mléka a závisí na výživČ, stádiu laktace, vČku zvíĜete, roþním období, klimatických podmínkách, systému dojení, dobČ dojení, zdraví mléþné žlázy, atd. Zjistili jsme statisticky prĤkaznČ vyšší (P<0,05) množství tuku ráno (0,56) kg než veþer (0,52) kg. Obsah tuku byl neprĤkaznČ vyšší u veþerního dojení (4,18 %) oproti rannímu (4,02 %), což je ve shodČ se SEDLÁKOVOU (1969) i MIKŠÍKEM (1980). Naopak KLOPýIý et al. (2003) uvádí obČ hodnoty shodné. StejnČ jako u bílkovin byla i produkce tuku ovlivnČna nádojem. Poþet somatických bunČk (PSB) v mléce je pĜedevším zdravotním ukazatelem vemene, neboĢ se zvyšuje s výskytem a vzrĤstem intenzity pĜedevším infekþního zánČtlivého procesu (mastitidy) (GAJDģŠEK, 2003). Obsah somatických bunČk v mléce má své fyziologické opodstatnČní. Jedná se o kolostrální a epiteliální tČlíska, buĖky z krve a mléþné žlázy (ŽIŽLAVSKÝ et al., 1992). Ve zdravé mléþné žláze pĜevládajícím typem jsou mikrofágy (35-79 %), následují lymfocyty (16-28 %), polymorfonukleární neutrolily (3-26 %) a epiteliální buĖky (2-15 %) (LINDMARK-MÅNSSON et al., 2006). V mnoha zemích je poþet somatických bunČk používán jako indikátor hygienické kvality mléka a zpenČžování syrového mléka (SURIYASATHAPORN et al., 2006). Nalezli jsme statisticky neprĤkaznČ vyšší poþet somatických bunČk u veþerního nádoje (170 tis./ml), oproti rannímu (147 tis./ml), což je ve shodČ s HARGROVE (1994). PĜirozená kyselost mléka je dána obsahem organických kyselin (pĜevážnČ kyselina mléþná a kyselina citrónová), obsahem a složením minerálních látek a bílkovin (fosforeþnany, kasein). Kyselost vyjadĜujeme jako celkovou - titraþní (TK), nebo aktivní - aktuální (POLAHÁR, et al., 1991). Princip mČĜení je jednotný a je k pĜídavku mléka se pĜidává nezbytné množství alkalického roztoku (hydroxid sodný) o pĜesné koncentraci až k dosažení bodu ekvivalence, který je urþen pomocí indikátoru, vČtšinou fenolftaleinu, který mČní zabarvení roztoku na rĤžovou pĜi pH 8,4 (FABRO et al., 2006). Podle ýSN 57 0529 se u nás považuje za normální mléko o titraþní kyselosti v rozmezí 6,2 až 7,8 (GAJDģŠEK, 2003). V našem sledování vyšla veþerní hodnota neprĤkaznČ vyšší (7,67 SH) oproti ranní hodnotČ (7,43 SH). Naopak BRAUNER a HANUŠ (1984) uvádí vysoce prĤkazné hodnoty u ranního výdojku. SyĜitelnost mléka je základním krokem pĜi výrobČ sýrĤ (LÓPEZ et al., 1998). Jsou tĜi dĤležité fáze u rychlosti enzymatického srážení mléka: 1. destabilizace koloidního mléþného systému pomocí enzymatické hydrolýzy ț-kaseinu; 2. agregace parakaseinových micel, pozorovaných jako vloþkování a 3. tvorba a rozvoj síĢového gelu, zahajující koagulaci (LAGAUDE et al., 2004). Naše výsledky ukazují témČĜ totožné hodnoty sýĜitelnosti u veþerního vzorku (249 s.) a u ranního (246 s.). Naopak BRAUNER a HANUŠ (1984) uvádí vysoce prĤkazné ranní hodnoty oproti veþerním. 27

Kvalita sýĜeniny byla hodnocena dle tabulky, kterou uvádí GAJDģŠEK (1999). Z našich výsledkĤ vyplývá, že sýĜenina z mléka odebraného ráno byla kvalitnČjší (tĜ. 1,60), oproti veþerní (tĜ. 1,73). KvĤli chybČjící literatuĜe uvádíme pouze námi zjištČné hodnoty. Tabulka I PrĤmČrné hodnoty, jejich smČrodatné odchylky a variaþní koeficienty u ukazatelĤ produkce Ráno Veþer Ukazatel x min. max. Sx Vx x min. max. Sx Vx nádoj (kg) 14,2 6,3 19,7 2,36 16,65 12,5 1,6 17,6 2,47 19,75 bílkoviny (kg) 0,46 0,19 0,63 0,08 16,67 0,40 0,05 0,57 0,08 19,67 tuk (kg) 0,56 0,3 0,81 0,1 18,21 0,52 0,08 0,82 0,11 20,97

SP ** ** *

**vysoce statisticky prĤkazný vliv (P<0,01), *statisticky prĤkazný vliv (P<0,05), NS - statisticky neprĤkazný vliv

Tabulka II PrĤmČrné hodnoty, jejich smČrodatné ukazatele zdravotního stavu Ráno Ukazatel x min. max. bílkoviny (%) 3,24 2,83 3,99 tuk (%) 4,02 2,63 5,30 PSB (tis./ml) 147 24,0 676

odchylky a variaþní koeficienty u obsahových složek a

Sx Vx 0,22 6,93 0,63 15,71 127,4 86,37

x 3,24 4,18 170

Veþer min. max. Sx Vx 2,81 4,00 0,23 7,16 3,00 5,78 0,60 14,36 26,00 791 149,3 87,62

SP NS NS NS


Tabulka III PrĤmČrné hodnoty, jejich smČrodatné odchylky a variaþní koeficienty u technologických ukazatelĤ Ráno Veþer SP Ukazatel titr. kyselost (SH) syĜitelnost (s) tĜída sýĜeniny

x 7,43 246 1,60

min. 5,5 122 1,00

max. 9,42 688 3,00

Sx 0,79 105,7 0,66

Vx 10,68 43,05 41,46

x 7,67 249 1,73

min. 5,72 89 1,00

max. Sx 12,04 1,12 495 85,52 3,00 0,81

Vx 14,66 34,32 46,95


16

nádoj (kg)

15 14 13 12 11 10 þerven

þervenec

srpen

ranní nádoj (kg)

záĜí

veþerní nádoj (kg)

Graf 1. ZmČna množství mléka (kg) u ranního a veþerního nádoje

28

Ĝíjen

NS NS NS

bílkoviny (kg)

0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 þerven

þervenec

srpen

bílkoviny ráno (kg)

záĜí

Ĝíjen

bílkoviny veþer (kg)

Graf 2. ZmČna produkce bílkovin (kg) u ranního a veþerního nádoje

0,50

tuk (kg)

0,45 0,40 0,35 0,30 þerven

þervenec

srpen

tuk ráno (kg)

záĜí

Ĝíjen

tuk veþer (kg)

Graf 3. ZmČna produkce tuku (kg) u ranního a veþerního nádoje

ZávČr Zjistili jsme, že produkce mléka se liší nejen v prĤbČhu laktace, ale i v prĤbČhu dne. Z našeho experimentu vyplývá, že více byly ovlivnČny parametry týkající se produkce, oproti ostatním ukazatelĤm mléka, které jsme sledovali. Vysoce statisticky prĤkazný rozdíl jsme nalezli u ranní a veþerní produkce mléka a u produkce mléþných bílkovin, statisticky prĤkazný rozdíl u produkce tuku. Statisticky neprĤkazné byly rozdíly u obsahu bílkovin a tuku, poþtu somatických bunČk, titraþní kyselosti, syĜitelnosti a tĜídy sýĜeniny. PodČkování: PĜíspČvek byl vypracován s podporou projektu QF 4005. Použitá literatura: BRAUNER, J., HANUŠ, O.: Technologické vlastnosti mléka a jeho chemické složky u veþerního, ranního a celkového výdojku. Výzkum v chovu skotu, 1984, 3:5-9 BRUCKMAIER, R. M.: Milk ejection during machine milking in dairy cows. Livestock Production Science, 2001, 70:121-124 ýEJNA, V., CHLÁDEK, G.: A coagulation time of individua milk symplex and its relationship with a number and phase of lactation in Holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: ýeská spoleþnost chemická, 2005, s. 3

29

FABRO, M. A., MILANESIO, H. V., ROBERT, L. M., SPERANZA, J. L., MURPHY, M., RODRÍGUEZ, G., CASTAÑEDA, R.: Technical Note: Determination oj acidity in Whole Raw Milk: Comparison of Results Obtained by Two Different Analytical Methods. J. Dairy Sci., 2006, 89:859-861 GAJDģŠEK, S.: MlékaĜství II (cviþení). Brno: MZLU. 1999, 92 s. GAJDģŠEK, S.: Laktologie. Brno: MZLU. 2003, 84 s. GOUDÉDRANCHE, H., FAQUANT, J., MAUBOIS, J-L.: Fractionation of glibular milk fat by membrane microfiltration. Lait, 2000, 80:93-98 HANUŠ, O.: variabilita a vlivy pĤsobící na kompozici a relace dusíkatých složek kravského mléka. Sborník: Den mléka 2001, 2001, s. 16-20 HARGROVE, G. L.: Bias in composite milk sampleswith unequal milking intervals. J. Dairy Sci., 1994, 77:1917-1921 CHLÁDEK, G.: Milk yield and level of individual constituents in the milk from dairy cows in the south moravia region. [in Czech] Acta univ. Agric. (Brno), fac.agron., XXXXI, 1993 (3-4), s. 305-311 KLOPýIý, M., MALOVRH, Š., GORJANC, G., KOVÁý, M., OSTERC, J.: Prediction of daily milk fat and protein cotent using alternating (AT) recordin - g scheme. Czech. J. Anim. Sci., 48, 2003, (11):449-458 LAGAUDE, A., FERNANDEZ, L., CUQ, J-L., MARCHESSEAU, S.: Characterization of curd formation during the renet coagulation of milk by an optical microscopic metod. Inernational Dairy Journal, 2004, 14:1033-1039 LANDETE-CASTILLEJOS, T., GALLEGO, L.: Technical note: The ability of mathematical models to describe the shape of lactation curves. J. Anim. Sci. 2000, 78:3010-3013 LEE, C., POLLAK, E.J., EVERETT, R.W.: Multiplicative factors for estimation of daily milk and component yields from single morning or afternoon tests. J. Dairy Sci., 1995, 78:221-235 LINDMARK-MÅNSSON, H., BRÄNNING, C., ALDÉN, G., PAULSSON, M.: Relatioship between somatic cell count, individua leukocyte populations and milk components in bovine udder quarter milk. International Dairy Journal, 2006, 16:717-727 LOLLIVIER, V., MARNET, P-G.: Galactopoietic effect of milking in lactating Holstein cows: Role of physiological doses of oxytocin. Livestock Production Science, 2005, 95:131-142 LÓPEZ, M. B., LOMHOLT, S. B., QVIST, K. B.: Rheological Properties and Cutting Time of Rennet Gels. Fffects of pH and Enzyme Concentration. International Dairy Journal, 1998, 8: 289-293 MIKŠÍK, J.: Posouzení pĜesnosti alternativní kontroly mléþné užitkovosti. Acta Universitasis Agriculrirae, 28, 1980, 2:175-181 MIKŠÍK, J., ŽIŽLAVSKÝ, J.: Chov skotu - pĜednášky. Brno: MZLU, 2005, 162 s. OUWELTJES, W.: The relationship between milk yield and milking interval in dairy cows. Livestoíck Production Science, 1998, 56:193-201 POLAHÁR, P., BESEDA, I., ĆURIŠOVÁ, E., ŠMIDRIAKOVÁ, M., STANKO, P., VÁL´KA, J.: Hodnotenie niektorých parametrov mlieka pii jeho zníženej a nrmálnej titraþnej kyselosti viacrozmernou štatistickou analýzou. Živoþ. Výr., 36, 1991, 4:329-335 SEDLÁKOVÁ, L.: Kvalita a množství ranního a veþerního mléka u dojnic pĜi stejném intervalu dojení v souvislosti se systémy krmení. Živoþ. Výr., 14, 1969, (62):573-582 SEMJAN, Š. et al.: Výroba kvalitného mlieka. Bratislava: Príroda, 1987, 304 s SURYIASATHAPORN, W., VINITKETKUMNUEN, U., CHEWONARIN, T., BOONYAYATRA, S., KREAUSUKON, K., SCHUKKEN, Y.H.: Higher somatic cell counts resulted in higher malondialdehyde concentrations in raw cows' milk. International Dairy Journal, 2006, 16: 1088-1091 TEPLÝ, M. et al.: Mléko a jeho produkce k prĤmyslovému zpracování. Praha: SNTL, 1979, 376 s. ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J.: Variabilita složek kravského mléka ve veþerním a ranním nádoji pĜi rozdílné technologii dojení. Živoþ. Výr., 1988, 33(61):1079-1085 ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJDģŠEK, S., KUCHTÍK, J.: Somatické buĖky v mléce krav v prvních 100 dnech laktace. Živoþ. Výr., 34, 1992, 1:359-363

Kontaktní adresa: [email protected], [email protected] 30

PROTEKTIVNÍ KULTURY PRO VÝROBU POLOTVRDÝCH SÝRģ TĤma ŠtČpán, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Protective cultures for semi-hard cheese production Summary: In order to suppress the undesirable microorganisms in cheese, different protective techniques can be used. The promising possibility would be the use of lactic acid bacteria, especially lactobacilli as protective cultures. Non-starter lactobacilli constitute the majority of the NSLAB population in semi-hard cheese varieties during ripening and many strains are able to inhibit food spoiling bacteria, moulds, pathogens due to the production of antimicrobial compounds (lactic acid, carbon dioxide, bacteriocin, diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol, organic acid, etc.). In past some of lactobacilli strains isolated from different origin were proved to inhibit broad spectrum of bacteria (E. coli, Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium spp., Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Helicobacter pylori, Salmonella spp., Listeria monocytogenes). The application of protective lactobacilli as adjunct cultures in semi-hard cheese production is however often limited due to its narrow activity spectrum and its inactivation due to the interaction with cheese ingredients. The inhibition activity can be also limited by the occurrence and resistance of the other NSLAB. Investigation the growth-rate, antimicrobial, proteolytic, enzymatic and acidification activities of protective cultures in milk and cheese, as well as production of biogenic amines, production of flavour compounds and the reduction of allergenic milk proteins, is necessary for successful implementation in semi-hard cheese production.

Úvod V sýrech se mohou vyskytovat nejen žádoucí mikroorganismy, které pozitivnČ ovlivĖují vlastnosti sýra a hrají významnou roli pĜi výrobČ a zrání, ale i nežádoucí mikroorganismy, které mohou negativnČ ovlivnit vlastnosti sýra popĜípadČ ho naprosto znehodnotit. (4). Mezi žádoucí mikroorganismy patĜí bakterie mléþného kvašení (BMK), tvoĜící dominantní mikroflóru u všech typĤ sýrĤ a hrající významnou roli pĜi vytváĜení požadovaných vlastností sýra. Zvláštní skupinu BMK tvoĜí tzv. NSLAB (non-starter lactic acid bacteria = nezákysové bakterie mléþného kvašení), které se do sýra dostávají z jiných zdrojĤ než ze zákysových kultur (13). NejþastČjšími nežádoucími mikroorganismy vyskytujícími se v sýrech jsou koliformní bakterie, sporulující bakterie zvláštČ Clostridium spp., nČkteré kvasinky, plísnČ a NSLAB (32). Bakterie mléþného kvašení uplatĖující se pĜi výrobČ a zrání sýrĤ s nízkodohĜívanou sýĜeninou lze rozdČlit do tĜí skupin na zákysové kultury, doplĖkové nebo též pĜídatné kultury a na NSLAB. Role zákysových kultur spoþívá pĜedevším v produkci kyseliny mléþné, þímž se zajišĢuje vhodné pH pro srážení mléka. Dále se tyto bakterie úþastní proteolýzy a lipolýzy bČhem zrání sýra a v neposlední ĜadČ chrání sýr pĜed rĤznými patogeny (pomocí snižování pH a pĜípadné produkce bakteriocinĤ a dalších metabolitĤ s antimikrobiálními úþinky) (5). V sýrech jsou z této skupiny zastoupeny nejþastČji druhy z rodu Lactococcus (1) DoplĖkové kultury se pĜidávají do rĤzných druhĤ sýrĤ pro dosažení jejich specifických vlastností. Tato skupina se též mĤže úþastnit procesu zrání nebo mĤže pĤsobit bioprotektivnČ. Jako doplĖkové kultury se u polotvrdých sýrĤ þasto používají druhy z rodu Lactobacillus (2). NSLAB mohou negativnČ i pozitivnČ ovlivnit kvalitu sýra a vyskytují se pĜirozenČ v mléce a okolí. PĜispívají pĜedevším k rozvoji chutČ a v mnoha pĜípadech jsou považovány za žádoucí složku mléka a sýra. Mezi NSLAB patĜí napĜ. Lb casei, Lb. paracasei, Lb. curvatus, Lb. plantarum (1, 2). V sýraĜství se používají laktobacily jako startovací i doplĖkové kultury velmi þasto a jejich role je rozmanitá (produkce kys. mléþné, protektivní a probiotický úþinek) (17). Využití NSLAB jako doplĖkových kultur v sýraĜství musí splĖovat dva základní pĜedpoklady. Použitý kmen nebo smČs kmenĤ (11) nesmČjí negativnČ ovlivĖovat proces zrání a reakce související s proteolýzou bílkovin (2). Za druhé doplĖková kultura by mČla inhibovat rĤst a úþinky ostatních NSLAB a po celou dobu zrání by mČla zĤstat dominantní kulturou v sýru. 31

KromČ tČchto dvou základních pĜedpokladĤ, by se NSLAB nemČly podílet bČhem výroby na fermentaci laktosy, mČly by rychle dosáhnout poþtĤ (cca 107 KTJ.g-1) na poþátku zrání, tento poþet by se nemČl v prĤbČhu zrání mČnit (11). MČly by disponovat vhodnými proteolytickými enzymy, produkovat volné aminokyseliny se žádanými organoleptickými vlastnostmi (2) a neprodukovat biogenní aminy (7) a pokud možno vykazovat antimikrobiální (antifungální a antiklostridiální vlastnosti) (9 26). VýbČr vhodného kmene je velmi nároþný a vyžaduje mnoho testování, než se mĤže použít pro výrobu sýrĤ (4). Antimikrobiální vlastnosti laktobacilĤ BMK používané v potravináĜství jsou schopny inhibovat rĤst nežádoucích mikroorganismĤ (21, 28) vþetnČ, patogenĤ a mikroorganismĤ zpĤsobujících kažení potravin, produkcí rĤzných druhĤ antimikrobiálních látek a tím zvýšit mikrobiální bezpeþnost potravin (15, 28). Antimikrobiální vlastnosti mohou mít kromČ zákysových kultur též laktobacily a další BMK, které jsou souþástí NSLAB, nebo laktobacily, které se pĜidávají jako doplĖkové kultury (19). KromČ produkce kys. mléþné a CO2, jsou nČkteré BMK (8, 21) schopny produkovat i jiné antimikrobiální látky (bakteriociny, diacetyl, peroxid vodíku, ethanol, organické kys.) (3, 8, 19, 20). BMK mají pĜesto rĤznou schopnost inhibovat rĤznou škálu mikroorganismĤ (3, 20). Jejich úþinek závisí, na pĜítomnosti ostatních mikroorganismĤ (27) a na stavu v kterém se nacházejí (14). Míra rĤstu a kompetitivita kultury je dále dána adaptací na substrát a Ĝadou vnČjších i vnitĜních faktorĤ vþetnČ redox potenciálu, aktivity vody, pH a teploty. Inhibice jiného mikroorganismu je zpĤsobená buć soutČžením mikroorganismĤ o živiny nebo produkcí antimikrobiálních metabolitĤ (19). V minulosti byla již identifikována celá Ĝada laktobacilĤ (Lb. acidophilus, Lb. curvatus, Lb. delbrueckii, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus a Lb. sake) produkujících bakteriociny, které inhibovaly široké spektrum mikroorganismĤ (E. coli, Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Helicobacter pylori, Salmonella, Listeria monocytogenes) (8). Kysací schopnosti laktobacilĤ PĜi výrobČ sýrĤ se þasto kromČ zákysových bakterií používají doplĖkové kultury Lactobacillus spp.. Použití dané doplĖkové kultury závisí zejména na kysací schopnosti, rĤstu v mléce, proteolytické aktivitČ a odolnosti vĤþi bakteriofágĤm (16). Schopnost rĤst a pĜežívat v médiu nebo mléce je dĤležitá pĜedevším u zákysových bakterií. PĜesto i u doplĖkových kultur je tĜeba znát, do jaké míry jsou schopny rĤst v mléce a fermentovat laktosu a další sacharidy vyskytující se v mléce, a jak se tedy mohou podílet na procesu fermentace spoleþnČ se zákysovými bakteriemi (17). Je tĜeba i vylouþit riziko nežádoucího pĜekysávání bČhem výroby sýra a zpracování mléka (23). Druhy Lb. casei a Lb. paracasei rostou dobĜe nejen v mléce, ale i v sýru kde je zvýšená koncentrace NaCl, nízké pH. Díky svým vlastnostem jsou schopny pĜevážit nad ostatními nežádoucími NSLAB (10). DoplĖkové kultury by mČly co nejrychleji rĤst v sýru již bČhem prvních týdnĤ a dosáhnout max. poþtĤ, aby se zabránilo rĤstu nežádoucích NSLAB (11). Proteolytické vlastnosti laktobacilĤ Proteolytický systém laktobacilĤ a NSLAB se skládá ze dvou skupin proteolytických enzymĤ: proteas, které jsou schopny hydrolyzovat bílkoviny a peptidas štČpících peptidy vzniklé z bílkovin (31). Proteolytické enzymy hrají významnou roli pĜi rozkladu kaseinu a peptidĤ za vzniku volných aminokyselin. NČkteré enzymy mají schopnost hydrolyzovat peptidy zodpovČdné za hoĜkou chut sýrĤ (6). 32

Bylo zjištČno, že mnoho laktobacilĤ má lepší proteolytické schopnosti (25) než laktokoky, zejména aminopeptidasovou aktivitu, a tvoĜí tak lépe volné aminokyseliny. PĜedpokládá se, že aminopeptidasy jsou zodpovČdné za redukci hoĜkosti v sýrech, neboĢ štČpí tzv. hoĜké peptidy (12). Produkce biogenních aminĤ u laktobacilĤ Proteolytická aktivita u laktobacilĤ používaných jako doplĖkové kultury mĤže být doprovázena i zvýšenou tvorbou aminĤ (22). Biogenní aminy jsou organické slouþeniny vyskytující se v mnoha potravinách a mohou mít toxický úþinek na organismus (7). Biogenní aminy vznikají dekarboxylací aminokyselin pomocí enzymĤ produkovaných BMK. NejþastČji byl sledován výskyt histaminu, tyraminu a diaminĤ jako prekurzorĤ karcinogenních nitrosaminĤ (22). Negativní produkce biogenních aminĤ je jedním z dĤležitých kritérií pĜi rozhodování, zda daný kmen mĤže být využit pro aplikace pĜi výrobČ sýrĤ. V sýru typu Gouda se mohou vyskytovat laktobacily se zvýšenou proteolytickou aktivitou a produkující biogenní aminy, až v koncentracích 107 KTJ.g-1. Tato koncentrace pĜesto nemusí zpĤsobovat zdravotní rizika (22). Z testovaných BMK (Lactococcus, Enterococcus, Lactobacillus) izolovaných z potravin byla u mnoha kmenĤ prokázána tvorba aminĤ, taktéž u Lactobacillus spp. (7). Vliv vybraných laktobacilĤ na snižování alergenicity mléþných bílkovin Bílkoviny mléka, zejména ȕ-laktoglobulin (24) a imunoglobuliny, patĜí mezi nejþastČjší alergeny v kravském mléce. PĜestože jejich koncentrace není pĜíliš vysoká, mohou zpĤsobovat alergické reakce pĜedevším u malých dČtí (29). KromČ samotných bílkovin mohou vyvolávat alergii i nČkteré peptidy. Zejména u peptidĤ o molekulové hmotnosti nižší než 3000 byla prokázána alergenicita (30). Schopnost snižovat alergenicitu mléþných bílkovin byla prokázána i u laktobacilĤ. Probiotický kmene Lb. casei 911 snižoval alergenicitu u ovalbumin – specifických IgE, IgA a IgG1. Schopnost snižovat alergenicitu bílkovin je významná a patĜí mezi kriteria pro oznaþování BMK jako probiotické kultury (29). Protektivní kmen Lb. paracasei ST68 V prĤbČhu zrání sýra typu Eidam 30% tvs., vyrobeného bez pĜídavku doplĖkové kultury, bylo izolováno 322 laktobacilĤ ze skupiny NSLAB. U všech laktobacilĤ byla provedena základní fenotypová charakteristika a kmeny byly otestovány na antimikrobiální aktivitu. Bylo vybráno 7 kmenĤ s nejvyšším inhibiþním úþinkem. Tyto kmeny byly dále testovány na antifungální a antiklostridiální aktivitu. Jako potenciální doplĖková protektivní kultura byl vybrán kmen Lb. paracasei ST 68. U tohoto kmene byly stanoveny všechny vlastnosti, které musí splĖovat doplĖková protektivní kultura. Živé buĖky Lb. paracasei ST68 inhibovaly všechny testované kmeny Clostridium tyrobutyricum 2637, 194, Clostridium butyricum 10702 a Clostridium sporogenes 795. U Lb. paracasei ST68 se ovČĜila produkce bakteriocinu. Kmen neprodukoval bakteriocin a inhibiþní úþinek je zpĤsoben zatím blíže neidentifikovanou látkou. Antifungální aktivita Lb. paracasei ST68 se testovala proti Penicillium sp. DMF 0006, Aspergillus niger DMF 0801 a Fusarium proliferatum M 5689 a porovnala se s aktivitou Lactobacillus rhamnosus VT1 a Lactobacillus plantarum DC1246 (popsáno Danisco, Germany). Nejlépe inhibovaly laktobacily rĤst Fusarium proliferatum M 5689, následnČ Penicillium sp. DMF 0006. Inhibiþní úþinek proti Aspergillus niger DMF 0801 byl detekovatelný, nicménČ byl mnohem slabší ve srovnání s úþinkem proti Fusarium a Penicillium.

33

V mléce rostl Lb. paracasei ST68 hĤĜe než v MRS. V prĤbČhu stacionární fáze byl celkový poþet laktobacilĤ již konstantní, a pohyboval se kolem 1. 109 KTJ.ml-1 . V mléce byla kysací schopnost velmi slabá a pH kleslo pouze nepatrnČ. Lb. paracasei ST68 postrádal výraznČjší schopnost zkvašovat laktosu, jež je hlavním zdrojem sacharidĤ v mléce, na laktát, neboĢ pokles pH i rĤst SH bČhem rĤstu tohoto kmene v mléce byl jen velmi pozvolný. Pomalý rĤst a slabá kysací aktivita byla typická pro mnoho kmenĤ Lb. paracasei a Lb. casei (18, 23). Proteolytická aktivita u Lb. paracasei ST68 byla srovnatelná s ostatními testovanými kmeny Lb. paracasei izolovaných ze sýrĤ. V porovnání s komerþními kmeny Lb. delbrueckii subsp. lactis 125 a Lb. helveticus 121 vykazoval kmen dvakrát nižší proteolytickou aktivitu. Naopak mČl aktivitu pĜibližnČ stejnou s komerþním kmenem Lb. casei 163 (17). DoplĖkové kultury s antimikrobiální aktivitou se mohou uplatnit ve smČsi s jinými kulturami, které zajistí technologicky nezbytné aktivity (proteolýzu, rychlý rozklad laktosy, proteolytickou aktivitu atd.). DĤležité je, aby nemČly aktivity spojené se vznikem vad sýrĤ. U kmene Lb. paracasei ST68 se testovala produkce aminĤ z histidinu, tyrosinu, ornithinu a lysinu. Kmen neprodukoval po pĜesnČjším mČĜení ani jeden z aminĤ. Bez znalosti o produkci biogenních aminĤ, by tento, ale i jiné kmeny nemČly být použity pĜi výrobČ sýrĤ a i jiných potravin (7). PĜi testování alergenicity kaseinu, kmen Lb. paracasei ST 68 snižoval významnČ alergenicitu kaseinu, po kultivaci v mléce zbylo pouze 27,1% bílkovin které mohou zpĤsobit alergické reakce. V mléce po kultivaci bez zaoþkování laktobacilama zĤstalo 62,5% bílkovin, které mohou zpĤsobit alergické reakce.

ZávČr Použití protektivních kultur je velice zajímavé, tím spíše že se jedná a pĜírodní charakter ochrany potravin. NicménČ aplikace pĜi výrobČ sýrĤ a dalších produktĤ je zatím velice komplikovaná, vzhledem k nestabilitČ kultur v prostĜedí sýra (15). ýasto dochází ke ztrátČ antimikrobiální aktivity v dané potravinČ. Kultury mají obvykle úzké inhibiþní spektrum proti nežádoucím bakteriím. Jejich rĤst a inhibiþní úþinek mĤže být navíc ovlivnČn pĜítomností NSLAB v sýrech. Aby mohly být kultury úspČšnČ použity, je tĜeba znát jejich rĤstové schopnosti, antimikrobiální vlastnosti vĤþi bakteriím pĜirozenČ se vyskytujících v sýru, proteolytické vlastnosti a schopnost tvoĜit degradací bílkovin a aminokyselin látky pozitivnČ ovlivĖující vĤni a chuĢ. V poslední dobČ se sleduje produkce biogenních aminĤ, které zpĤsobují vážné zdravotní problémy. NČkteré kmeny laktobacilĤ izolovaných ze sýrĤ typu Eidam, vykazovaly antimikrobiální úþinky a jejich další vlastnosti dĤležité pro použití jako doplĖkové protektivní kultury byly porovnány s vlastnostmi komerþních doplĖkových kultur a mají potenciální využití jako protektivní kultury pro výrobu sýrĤ. Použitá literatura: 1. AYAD E.H.E., VERHEUL A., WOUTERS J.T.M., SMIT G.: Population dynamics of lactococci from industrial, artisanal and non-dairy origins in defined strain strters for Goudatype cheese. Int. Dairy J., 11, 51-61 (2001) 2. ANTONSSON M., ARDÖ Y.,NILSSON B.F., MOLIN G.: Screening and selection of Lactobacillus strains for use as a adjunct cultures in production of semi-hard cheese. J. of Dairy Research, 69, 457-472 (2002) 3. ATANASSOVA M.R., CHIPEVA V., IVANOVA I., HAERTLÉ T.: Determination of the growth stages of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3 from Bulgarian yellow cheese by electroconductivity. J. of Microbiological Methods, 46, 227-233 (2001) 4. BERESFORD T.P., FITZIMONS N.A., N. L. BRENNAN., COGAN T.M.:Recent advances in cheese Microbiol.. Int. Dairy J. 11, 259-274 (2001) 34

5. BERESFORD T., WILLIAMS A.: The Microbiol. of Cheese Ripening. V knize: Cheese: Chemistry, Physics and Microbiol. I-General Aspects (P.F. Fox, ed. ), s. 287-310. Elsevier Applied Sci. Publishers, Ltd., London 2004. 6. BOCKELMANN W.: The proteolytic system of starter and non-starter bacteria components and their importance for cheese ripening. Int. Dairy J. 5, 977-994 (1995) 7. BOVER_CID S., HOLZAPFEL W.H.: Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. of Food Microbiol. 53, 33-41 (1999) 8. CARIDI A.: Selection of Escherichia coli inhibiting strains of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. J. of Industrial Microbiol. and Biotechnology 29, 303-308 (2002) 9. CHRISTIANSEN P., PETERSEN M.H., KASK S., MØLLER P.L., PETERSEN M., NIELSEN E.W., VOGENSEN F.K., ARDÖ Y.: Anticlostridial activity of Lactobacillus isolated from semi-hard cheeses. Int. Dairy J. 15, 901-909 (2005) 10. CURRY B., CROW V.: Lactobacillus spp. V knize: Encyclopedia of Dairy Sci.s (Roginski H., Fuquay J., Fox P.F., ed.), s. 1479-1484, 1488-1501. Academic Press, London 2002 11. CROW V., CURRY B., HAYES M.: The ecology of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) and their use as adjuncts in New Zealand Cheddar. Int. Dairy J. 11, 275-283 (2001) 12. DAKO E., EL-SODA M., VUILLEMARD J.C., SIMARD R.E.: Autolytic properties and aminopeptidase activities of lactic acid bacteria. Food Research Int. Vol.28, No.5, 503-509 (1995) 13. DEPOUILLY A., DUFRENE F., BEUVIER E., BERTHIER F.: Genotypic characterisation of the dynamics of the lactic acid bacterial population of Comté cheese. Lait, 84, 155-167 (2004) 14. DESMOND C., FITZGERALD G.F., STANTON C., ROSS R.P.: Improved stress tolerance of GroESL-overproducing Lactococcus lactis and Probiotic Lactobacillus paracasei NFBC 338. Applied and environmental Microbiol. 70, 5929-5936 (2004) 15. DEVLIEGHERE F., VERMEIREN L., DEBEVERE J.: New preservation technologies: Possibilities and limitations. Int. Dairy J. 14, 273-285 (2004) 16. GIRAFFA G., ANDRIGHETTO C., ANTONELLO C., GATTI M., LAZZI C., MARCAZZAN G., LOMBARDI A., NEVIANI E.: Genotypic and phenotypic diversity of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis of dairy origin. Int. J. of Food Microbiol. 91,129-139 (2004) 17. HEBERT E.M., RAYA R.R., TAILLIEZ P., DE GIORI G.S.: Characterization of natural isolates of Lactobacillus strains to be used as starter cultures in dairy fementation. Int. J. of Food Microbiol. 59: 19-27 (2000) 18. HERREROS M.A., FRESNO J.M., PRIETO M.J.G., TORNADIJOM.E.: Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goat´s milk cheese). Int. Dairy J. 13, 469-479 (2003) 19. HOLZAPFEL W.H., GEISEN R., SCHILLINGER U.: Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. Int. J. of Food Microbiol. 24, 343-362 (1995) 20. HUTTUNEN E., NORO K., YANG Z.: Purification and identification of antimicrobial substances produced by two Lactobacillus casei strains. Int. Dairy J. 5, 503-513 (1995) 21. JACK R.W., TAGG J.K., RAY B.: Bacteriocins of Gram positive bacteria. Microbiological Reviews 59, 171-200 (1995) 22. JOOSTEN H.M.L.J, NORTHOLT M.D.: Detection, growth, an amine-producing kapacity of lactobacilli in cheese. Applied and Environmental Mikrobiology 55, 2356-2359 (1989) 23. KASK S., ADAMBERG K., ORLOWSKI A., VOGENSEN F.K., MØLLER P.L., ARDO Y., PAALME T.: Physiological properties of Lactobacillus paracasei, Lactobacillus danicus and Lactobacillus curvatus strains isolated from Estonian semi-hard cheese. Food Research Int., 36, 1037-1046 (2003) 24. KLEBER N., WEYRICH U., HINRICHS J.: Screening for lactic acid bakteria with potential to redukce antigenic response of ȕ-lactoglobulin in bovine skim milk and sweet whey. Innovative Food Sci. and Emerging Technologies 7, 233-238 (2006)

35

25. LAAN H., TAN S.E., BRUINENBERG P., LIMSOWTIN G., BROOME M.: Aminopeptidase activities of starter and Non-starter lactic acid bacteria under simulated Cheddar cheese ripening conditions. Int. Dairy J, 8, 267-274 (1998) 26. MAGNUSSON J., STRÖM K., ROSS S., SJÖRGEN J., SCHNÜRER J.: Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Letters 219, 129-135 (2003) 27. NIKU-PAAVOLA M.L., LAITILA A., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A.: New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. of Apllied Microbiol. 86, 29-35 (1999) 28. PLOCKOVÁ M., CHUMCHALOVA J., GIESOVÁ M., BOUŠKOVÁ O.: Antifungal effectiveness of Lactobacillus rhamnosus VT1 at different temperatures. Advances in Food Sci.s, Vol 26, No.2, 64-68 (2004) 29. PRIOULT G., PECQUET S., FLISS I.: Allergenicity of acidit peptides from bovine ȕlactoglobulin is reduced by hydrolysis with Bifidobacterium lactis NCC362 enzymes. Int. Dairy J. 15, 439-448 (2005) 30. PUERTA A., DIEZ-MASA J.C., FRUTOS M.: Immunochromatographic determination of ȕlactoglobulin and its antigenic peptides in hypoallergenic formulas. Int. Dairy J. 16, 406-414 (2006) 31. SASAKI M., BOSMAN B.W., TAN P.S.T.: Comparison of proteolytic activities in various lactobacilli. J. of Dairy Research 62, 601-610 (1995) 32. VAN DEN BERG: Dutch type cheese. In: Roginsky H. (Ed.), Encyclopedia of Dairy Sci., vol.1. Academic Press, London 371-377 (2003)

Kontaktní adresa: ŠtČpán TĤma, VŠCHT Praha, Ústav Technologie mléka a tukĤ, Technická 3, Praha 6, 166 28, [email protected], tel: 220 44 32 74

36

VLIV DOBY A TEPLOTY SKLADOVÁNÍ NA KONZISTENCI STERILOVANÝCH TAVENÝCH SÝRģ BuĖka František1, ŠtČtina JiĜí2, HrabČ Jan1 1 Ústav potravináĜského inženýrství, FT UTB ve ZlínČ, 2 Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Effect of storage time and temperature on consistency of sterilized processed cheese Summary: The influence of 2-years storage period at temperatures of 8 r 2 °C and 23 r 2 °C on consistency of sterilized processed cheese was evaluated. The change of consistency was observed by instrumental methods (puncture test and dynamic oscillating rheometry) and also by sensory analysis (scale method and paired comparison test). The firmness of sterilized processed cheeses stored at 8 °C kept increasing within the 24 months. The rise in firmness achieved in the products stored at 23 °C was followed by its decrease in the second year. Therefore the cheeses stored at a higher temperature were first firmer than the products stored at 8°C but they became softer during a longer storage period. The increasing in firmness of processed cheeses and worsening of spreadability was caused by an increased proportion of elasticity. Different trends were observed for processed cheese with whey powder in formulation.

Úvod Sterilované tavené sýry jsou obvyklou souþástí bojových dávek potravin, které jsou vydávány vojákĤm v situacích, kdy jim není možné zabezpeþit teplou stravu (odlouþení od jednotky, bojové nasazení aj.). V souþasnosti bojové dávky potravin rovnČž využívány k zabezpeþení þlenĤm Integrovaného záchranného systému pĜi jejich operaþním nasazení. Jednotlivé potravinové komponenty by mČly mít dobu minimální trvanlivosti nejménČ 2 roky pĜi okolní teplotČ (požadavek Standardization Agreement – STANAG 2937)1. Jednou z možností, jak v souþasné dobČ dosáhnout u taveného sýra doby minimální trvanlivosti 2 let, je jeho termosterilace. V roce 2003 byly provedeny experimenty, které zkoumaly vliv definovaného sterilaþního záhĜevu (117 °C po dobu 20 minut) na konzistenci tavených sýrĤ. Sterilované tavené sýry mČly tužší konzistenci než odpovídající vzorky nesterilované2. NČkolikaleté skladování pĜi vyšších než chladírenských teplotách mohou rovnČž zapĜíþinit významné zmČny jakosti tavených sýrĤ. V dostupné literatuĜe se však o procesech probíhajících ve sterilovaných tavených sýrech pĜi dlouhodobém skladování mnoho informací nevyskytuje. Diskutovaným jevem pĜi skladování tavených sýrĤ je hydrolýza tavicích solí – zejména polyfosfátĤ, pĜi které vznikají slouþeniny s nižší molekulovou hmotností. Snižování poþtu monomerĤ v lineární ĜetČzci polyfosfátu má pravdČpodobnČ za následek pokles afinity tČchto hydrolyzovaných polyfosfátĤ k vápenatým iontĤm a tím jejich postupné uvolĖování3. Vápenaté ionty uvolnČné z tavicích solí se mohou zapojovat do dodateþného zesíĢování proteinové matrice, v dĤsledku þehož mĤže docházet ke zvyšování tuhosti tavených sýrĤ bČhem skladování. Nejen vápenaté ionty, ale i hydrolýzou vzniklé nižší polyfosfáty se pravdČpodobnČ mohou zapojit do interakcí s bílkovinami, což mĤže rovnČž vést k jejich dalšímu zesíĢování. Hydrolyzaþní reakce polyfosfátĤ probíhají intenzivnČji v kyselé oblasti pH a za pĤsobení vyšších teplot3-7. Naopak skladování pĜi nižších teplotách mĤže vést k tvorbČ krystalĤ tavicích solí5. Podle UHLMANNa8 et al. se krystaly citrátĤ viditelnČ projevují daleko þastČji než krystaly fosfátĤ a polyfosfátĤ. Krystalizaci však mohou podléhat i další složky tavených sýrĤ, napĜíklad nČkteré aminokyseliny (zejména tyrozin) a jejich soli, laktóza a laktáty. Cílem práce posoudit zmČny konzistence sterilovaných tavených sýrĤ bČhem jejich skladování po dobu 24 mČsícĤ pĜi dvou rĤzných teplotách: chladírenské teplotČ (8 r 2 °C) a okolní – pokojové – teplotČ (23 r 2 °C).

37

Materiál a metody Skladovací pokus byl založen se 4 Ĝadami sterilovaných tavených sýrĤ (sušina 40 % w/w, tuk v sušinČ 45 % w/w), z nichž první dvČ byly vyrobeny v roce 2002 v tehdejší Želetavské sýrárnČ, a. s. (Ĝady I a II) a další dvČ v roce 2003 ve spoleþnosti MADETA, a. s. (Ĝady III a IV). K výrobČ tavených sýrĤ byla použita smČs pĜírodních sýrĤ, máslo, tvaroh, voda a tavicí soli (fosfátové a polyfosfátové tavicí soli, u Ĝad I a II byly použity rovnČž citrátové tavicí soli). Je tĜeba zmínit odlišnost u þtvrté (poslední) výroby, kde byla do surovinové skladby použita sušená syrovátka v množství 0,5 % w/w. Celková doba tavení byla 5 minut a tavicí teplota 91 oC (Ĝady I a II), resp. 94 °C(Ĝady III a IV). Tavenina byla plnČna do 100-gramových obalĤ z taženého hliníku uzavĜených pĜivaĜitelným hliníkovým víþkem. Následoval sterilaþní záhĜev, který byl proveden ve sterilátoru LUBECA pĜi teplotČ 117 °C s výdrží 20 minut, po té byly vzorky ve sterilátoru zchlazeny na 25 °C a odebrány ke skladovacím pokusĤm pĜi rĤzných teplotách. Sterilované tavené sýry skladované pĜi chladírenské teplotČ 8 r 2 °C, jsou oznaþovány jako „L“ a ty, které byly skladování pĜi teplotČ 23 r 2 °C, jsou v této práci pod kódy „S“. Arabská þíslice za mezerou pak oznaþuje dobu skladování v mČsících. Oznaþení „LII_24“ tedy znamená sterilovaný tavený sýr II. Ĝady skladovaný 24 mČsícĤ pĜi teplotČ 8 r 2 °C. Hodnocení konzistence tavených sýrĤ bylo provedeno pĜi pokojové teplotČ (23 r 2 oC) po temperaci vzorku v obalu po dobu cca 3 hodin. Tuhost tavených sýrĤ byla hodnocena penetrometricky pomocí Instron Universal testing machine Series 5500 (Instron Ltd, High Wycombe, UK). Byla sledována síla potĜebná na vtlaþování válcové sondy o prĤmČru 6 mm rychlostí 1 mm/s do spodní strany vzorku po odstranČní obalu. Tuhost vzorku pak vyjadĜuje plocha pod tzv. zatČžovací kĜivkou, tzn. práce vynaložená na vtlaþení sondy do hloubky 10 mm (N.mm). Viskoelastické vlastnosti v oblasti malých nedestruktivních deformací byly hodnoceny dynamickou oscilaþní reometrií na reometru RS80 (Haake, NČmecko) v systému deska – deska (prĤmČr 35 mm, vzdálenost desek 1 mm). Byla sledována amplituda a úhel fázového posunu smykové deformace v závislosti na amplitudČ smykového napČtí (5 – 10 000 Pa, mČĜení bylo ukonþeno pĜi pĜekroþení smykové deformace 50 s-1) pĜi frekvenci oscilace 1 Hz. Pro srovnání vzorkĤ byly použity hodnoty pĜi amplitudČ napČtí 100 Pa, která byla vždy v lineární viskoelastické oblasti. Tuhost vzorku pak vyjadĜuje komplexní modul pružnosti ve smyku zahrnující elastickou (pamČĢový modul G´) a viskózní složku (ztrátový modul G“). Podíl elastické složky na reologických vlastnostech vzorku pak vyjadĜuje tangens úhlu fázového posunu tan G = G´´/G´ (pro þistČ elastickou látku tan G = 0). Komplexní modul pružnosti i pamČĢový modul vykazovaly vysokou korelaci (r=0,952) s tuhostí taveného sýra stanovenou penetrometricky. Proto jsou dále diskutovány pouze hodnoty tan GvyjadĜující podíl elasticity. V rámci senzorické analýzy byl sledován vliv doby a teploty skladování na konzistenci sterilovaných tavených sýrĤ. Hodnocení bylo provedeno pomocí pČtibodových jakostních ordinálních stupnic s charakteristikou každého stupnČ. První stupeĖ byl vyhrazen úrovni „vynikající“ a pátý stupeĖ úrovni „nevyhovující“. Stupnicové metody byly doplnČny párovou porovnávací zkouškou (srovnávaným znakem byla tuhost sterilovaného taveného sýra), která dovoluje zachytit mezi srovnávanými vzorky menší odchylky ve srovnání se stupnicovými metodami. Statistické vyhodnocení bylo provedeno u stupnicových metod jednofaktorovou neparametrickou analýzou rozptylu (Kruskal-WallisĤv test) a u párových porovnávacích zkoušek testem o parametru binomického rozdČlení9.

Výsledky a diskuze V prĤbČhu dvouletého skladování sterilovaných tavených sýrĤ se mČnila jejich konzistence. Z penetrometrického hodnocení vyplývá (viz obrázek 1), že u sterilovaných výrobkĤ Ĝady I a II uložených 2 roky pĜi 8 r 2 °C dochází po poþáteþním poklesu tuhosti (6. mČsíc) k jejímu neustálému zvyšování až do 24. mČsíce skladování. U III. Ĝady hodnoty v jednotlivých mČsících 38

kolísají, celkovČ se však tuhost s narĤstající dobou uložení pĜi 8 r 2oC zvyšuje oproti vstupnímu mČĜení. U Ĝady IV dochází naopak ve druhém roce skladování pĜi 8 r 2 °C ke snižování tuhosti. Z oscilaþní dynamické reometrie (viz obrázek 2) lze pak posoudit jak se na tuhosti sýrĤ podílela elasticita. Výsledky penetrometrické analýzy byly doplnČny prostĜednictvím hodnot tan G, které byly získány metodou dynamické oscilaþní reometrie (viz obrázek 2). U sterilovaných tavených sýrĤ Ĝady I a II uložených pĜi 8 r 2 °C se se podíl elasticity zvyšoval v prĤbČhu dvouletého skladování. Hodnoty tan G se snižovaly, tzn. že více pĜevažovaly hodnoty elastického modulu pružnosti G´ nad ztrátovým modulem pružnosti G´´. Zvýšení tuhosti a zhoršení roztíratelnosti je tedy zapĜíþinČné zvýšením elasticity produktu. Naopak u Ĝady IV bylo snížení tuhosti zjištČné penetrometickým mČĜením doprovázeno postupným snižováním podílu elasticity (zvýšení tan G) v prĤbČhu dvouletého skladování pĜi 8 r 2 °C. Nutno poznamenat, že sýry výroby IV vykazovaly celkovČ podstatnČ menší tuhost a menší podíl elasticity než ostatní vzorky (obrázky 1 a 2).

15

15

B

10

tuhost (N.mm)

tuhost (N.mm)

A

5

0

10

5

0 0

5

10

15

20

25

0

5

doba skladování (mČsíce)

10

15

20

25

15

C

D

10

tuhost (N.mm)

tuhost (N.mm)

15


5

0

10

5

0 0

5

10

15

20

25

0


5

10

15

20

25


Obr. 1. Vývoj hodnot tuhosti urþované penetrometricky (N.mm) bČhem skladování sterilovaných tavených sýrĤ uchovávaných pĜi teplotČ 8 r 2 °C (z, regresní trend þerchovanou þarou) a 23 r 2 °C (S, regresní trend plnou þarou) u 4 posuzovaných Ĝad; A – Ĝada I, B – Ĝada II, C – Ĝada III, D – Ĝada IV

39

0.5

0.5

B

0.4

0.4

0.3

0.3

tan G (-)

tan G (-)

A

0.2

0.1

0.2

0.1

0.0

0.0 0

6

12

18

24

0


6

12

18

24


0.5

0.9

C

D

0.8

0.4

0.7

tan G (-)

tan G (-)

0.6 0.3

0.2

0.5 0.4 0.3 0.2

0.1

0.1 0.0

0.0 0

6

12

18

0

24

6

12

18

24



Obr. 2. Vývoj hodnot tangentu úhlu fázového posunu (tan G) bČhem skladování sterilovaných tavených sýrĤ uchovávaných pĜi teplotČ 8 r 2 °C (z, regresní trend þerchovanou þarou) a 23 r 2 °C (S, regresní trend plnou þarou) u 4 posuzovaných Ĝad; A – Ĝada I, B – Ĝada II, C – Ĝada III, D – Ĝada IV Vývoj konzistence výrobkĤ byl pĜi vyšší skladovací teplotČ odlišný, což vyplývá z porovnání konzistenþních charakteristik u produktĤ skladovaných pĜi 8 r 2 °C a 23 r 2 °C (obrázek 1). U sterilovaných tavených sýrĤ Ĝady I, II a III došlo u výrobkĤ skladovaných pĜi 23 r 2 °C nejprve ke zvýšení tuhosti pozdČji ale následované poklesem až pod poþáteþní úroveĖ. Sýry skladované pĜi vyšší teplotČ byly tedy nejprve tužší než produkty uložené pĜi 8 r 2 °C, ale pĜi delším skladování naopak mČkþí. U jednotlivých Ĝad ale k poklesu tuhosti a ke snížení pod tuhost sterilovaných tavených sýrĤ skladovaných pĜi 8 r 2 °C došlo po jiné dobČ skladování. U Ĝady III tato zmČna nastala již 6 mČsíci skladování, u Ĝady I po 12. mČsíci a u Ĝady II až na konci skladování (24 mČsícĤ). Výsledky dynamické oscilaþní reometrie (hodnoty tan G, obrázek 2) ukazují, že zmČny tuhosti byly opČt vČtšinou doprovázeny zmČnou podílu elasticity, i když v nČkterých pĜípadech došlo k jistému þasovému posunu . V ĜadČ pĜípadĤ potvrdilo tyto zmČny i senzorické hodnocení párovou porovnávací zkouškou (napĜ. Ĝada I na hladinČ významnosti P < 0.05). Ovšem u Ĝady III sice instrumentální metody ukazují na rozdíly ve sterilovaných tavených sýrech uložených pĜi dvou rĤzných teplotách, senzoricky (párová porovnávací zkouška) však rozdíly mezi produkty skladovanými pĜi 8 r 2 °C a 23 r 2 °C prokázány nebyly (P 0.05). 40

U Ĝady II byly sterilované tavené sýry uložené pĜi 8 r 2 °C tužší než produkty skladované pĜi 23 r 2 °C až po 18. mČsíci, což ukazují jak výsledky penetrometrie a dynamické oscilaþní reometrie tak i párové porovnávací zkoušky (P < 0.05). CelkovČ odlišný vývoj byl zaznamenán u sterilovaných tavených sýrĤ Ĝady IV. Penetrometrie i párová porovnávací zkouška (P < 0.05) ukazuje, že po 12. mČsíci skladování se výrobky uložené pĜi 23 r 2 °C stávají tužšími než produkty skladované pĜi 8 r 2 °C. Hodnoty tan G indikují zmČnu až po 18. mČsíci skladování. VysvČtlení odlišnosti vzhledem k Ĝadám I, II a III lze opČt hledat ve zmČnČ tavicích solí a pĜídavku sušené syrovátky. Hédonicky byla konzistence výrobkĤ všech Ĝad v prĤbČhu skladování pĜi 8 r 2 °C hodnocena lépe nebo stejnČ ve srovnání s produkty uloženými pĜi 23 r 2 °C (viz tabulka I).

Tabulka I Výsledky senzorického hodnocení konzistence sterilovaných tavených sýrĤ 5ti bodovou hédonickou stupnicí* (uveden medián zjištČných hodnot). Teplota Doba skladování skladování 0 mČsícĤ 6 mČsícĤ o 8r2 C 12 mČsícĤ 18 mČsícĤ 24 mČsícĤ 6 mČsícĤ 12 mČsícĤ 23 r 2oC 18 mČsícĤ 24 mČsícĤ

ěada I 3 3 3 3 2 3 4 3 3

II 3 3 4 4 3 4 4 4 3

III 3 3 3 2 3 4 3 3 3

IV 3 2 2 2 2 4 3 3 3

* 1 – vynikající, 2 – výborný, 3 – dobrý, 4 – ménČ dobrý, 5 – nevyhovující

VysvČtlení konzistenþních zmČn sterilovaných tavených sýrĤ lze nalézt napĜíklad v hydrolýze polyfosfátových tavicích solí, která byla zapoþata již pĜi procesu tavení a pokraþovala i pĜi sterilaþním záhĜevu. Zde se mohly do zesíĢování proteinové matrice pravdČpodobnČ uplatnit nejen uvolnČné vápenaté ionty, ale jak naznaþují nČkteré publikace3,5 i samotné fosfáty a difosfáty. Vyšší nárĤst tuhosti u tavených sýrĤ skladovaných 3 mČsíce pĜi vyšších teplotách oproti produktĤ skladovaným chladírensky publikovali i TAMIME et al.6 a AWAD et al.10. Podle FRIEDMANa11 a KRISTENSENa et al.12 se do zesíĢování proteinové matrice mohou bČhem skladování zapojit i meziprodukty a produkty reakcí bílkovin (napĜ. Maillardovy reakce). Je rovnČž možné pĜedpokládat, že vlivem sterilace i v prĤbČhu skladování dojde ke snížení molekulové hmotnosti pĜítomných proteinĤ a peptidĤ, což rovnČž mĤže ovlivnit konzistenci. Ze zjištČných zmČn konzistence sterilovaných tavených sýrĤ lze tedy usuzovat, že v prĤbČhu skladování dochází souþasnČ ke dvČma jevĤm. Na jedné stranČ se vytváĜí nové vazby mezi bílkovinami, což vede ke zvyšování tuhosti a podílu elasticity. SouþasnČ ale zĜejmČ mĤže docházet též k degradaci, resp. hydrolýze, bílkovin, napĜ. zbytkovou aktivitou termostabilních proteáz. Když tento proces pĜeváží nad tvorbou nových vazeb, což mohlo nastat pĜi vyšší teplotČ skladování, resp. dĜíve než by tomu bylo nižší teplotČ, dojde k poklesu tuhosti a elasticity. Hypotézu o degradaci bílkovin podporuje i zhoršení chuti a vĤnČ výrobkĤ bČhem skladování. Pro potvrzení této domnČnky je však potĜeba dalších experimentĤ, které by sledovaly i možnou proteolýzu bílkovin.

41

ZávČr V práci byl zkoumán vliv teploty a doby skladování sterilovaných tavených sýrĤ na jejich konzistenci. Konzistence sterilovaných tavených sýrĤ se v prĤbČhu dvouletého skladování mČní. U vČtšiny výrobkĤ skladovaných pĜi 8 r 2 °C se v prĤbČhu 2 let tuhost postupnČ zvyšuje. Sterilované tavené sýry uložené pĜi teplotČ 23 r 2 °C (Ĝada I, II a IV) se ve 2. roce skladování stávají ménČ tuhými než výrobky uchovávané pĜi 8 r 2 °C. DĤležitou roli ve vývoji konzistence sterilovaných tavených sýrĤ sehrává i vhodná volba tavicích solí. PodČkování Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

Použitá literatura: 1. Standarditation Agreement (STANAG) 2937. Survival, Emergency and Individual Combat Ration - Nutritional Values and Packaging., 3. ed., NATO/MAS, Brussels 2001. 2. BUĕKA, F., ŠTċTINA, J., HRABċ, J. Vliv sterilaþního záhĜevu na konzistenci a barvu taveného sýra. In: Sborník Celostátní pĜehlídky sýrĤ 2003., s. 60 – 65, ýeská spoleþnost chemická, Praha 2003. 3. MOLINS, R.A. Phosphates in food., s.261, CRC Press, Boca Raton 1991. 4. SCHÄR, W a BOSSET, J.O. Chemical and Physico-chemical Changes in Processed Cheese and Ready-made Fondue During Storage - A Review. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 35, 2002, 15 – 20. 5. CARIû, M., KALÁB, M. Processed cheese products. In Fox, P.F. (ed.) Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2. Major Cheese Groups, s. 467 – 505, 2. ed. Elsevier Applied Science, London and New York 1997. 6. TAMIME, A. Y., KALAB, M. DAVIES, G., YOUNIS, M. F. Microstructure and firmness of processed cheese manufactured from Cheddar cheese and skim milk powder cheese base. Food Structure, 9, 1990, 23 – 37. 7. NEY, K. H. Gerät zur Messung des Biegebruchverhaltens von Schmelzkäsescheiben. Alimenta, 2, 1988, 31 – 36. 8. UHLMANN, G., KLOSTERMEYER, H., MERKENICH, K. Kristallisations-erscheinungen in Schmelzkäseprodukten - I. Phänomen und Ursachen. Milchwissenschaft, 38, 1983, 582 – 585. 9. HRABċ, J., KěÍŽ, O., BUĕKA, F. Statistické metody v senzorické analýze potravin, s. 114, 1. vyd., VVŠ PV, Vyškov 2001. 10. AWAD, R.A., ABDEL-HAMID, L.B., EL-SHABRAWY, S.A., SINGH, R.K. Texture and Microstructure of Block Type Processed Cheese with Formulated Emulsifying Salt Mixtures. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 35, 2002, 54 – 61. 11. FRIEDMAN, M. Food Browning and Its prevention: An Overview. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44, 1996, 631 – 653. 12. KRISTENSEN, D., HANSEN, E., ARNDAL, A., TRINDERUP, R.A., SKIBSTED, L.H. Influence of light and temperature on the colour and oxidative stability of processed cheese. International Dairy Journal, 11, 2001, 837 – 843. Kontaktní adresa: Ing. František BuĖka, Ph.D., Ústav potravináĜského inženýrství a chemie, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. 576 031 528, e-mail: [email protected]

42

PěÍPRAVA ENZYMOVÝCH HYDROLYZÁTģ V MEMBRÁNOVÉM REAKTORU. ýurda Ladislav, Vaverková Ivana, Mišún Daniel Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Preparation of enzyme hydrolysates in membrane reactor. Summary: Functional and sensory properties of whey proteins can be modified by enzymic hydrolysis. Batch processes are usually used for this purpose, higher process productivity is achieved in membrane reactor operated in continuous mode. Whey protein concentrate solution containing 2 % of proteins was hydrolyzed by enzyme Promod 439L (Biocatalyst, UK) at 40 °C, initial pH 6.5, at different enzyme – substrate ratio and with different residence times. Degree of hydrolysis and capacity of the reactor could be controlled by these parameters. More steady composition of hydrolysate is achieved by the prehydrolysis of the whey protein solution for the same time as the mean residence time. We can obtain at least seven times more of hydrolysate in continuous membrane reactor in comparison with batch mode.

Úvod Pro hydrolýzu bílkovin nebo sacharidĤ lze s výhodou využít enzymových reakcí, protože jsou pro potravináĜské aplikace relativnČ bezpeþné a probíhají za mírných podmínek. Jednou z nevýhod této technologie je obvykle vysoká cena enzymu. Náklady na enzym se mohou snížit jeho opakovaným využitím prostĜednictvím imobilizace na vhodný nosiþ nebo membránového reaktoru. Oba postupy pĜinášejí výhodu možné kontinualizace procesu. Imobilizace enzymu vyžaduje obvykle nároþnou pĜípravu, dochází ke ztrátČ þásti aktivity enzymu, ne ve všech pĜípadech je imobilizovaný enzym stabilní. Enzymový reaktor je naproti tomu zejména pro hydrolytické reakce vhodný, protože enzym je zadržován ultrafiltraþní membránou, zatímco produkty hydrolýzy procházejí membránou do permeátu. OdstraĖování produktu z reakþní smČsi posouvá reakþní rovnováhu žádoucím smČrem a omezuje pomČrnČ þastou inhibici enzymu produkty reakce. V membránovém reaktoru rovnČž odpadá nutnost inaktivace enzymu. Techniky imobilizace a membránového reaktoru mohou být spojeny, pokud je enzym imobilizován na membránČ1. V závislosti na typu aplikace mĤže mít membránový reaktor další výhody. Pokud substrát neprochází membránou, jako tomu je napĜ. pĜi hydrolýze bílkovin, zĤstává zadržen v reakþní smČsi, dokud není hydrolyzován, a nekontaminuje tak produkt. V hydrolyzátu pak mĤžeme navíc pomocí zvolené membrány Ĝídit maximální velikost peptidĤ podle požadovaných vlastností hydrolyzátu2. PĜi zpracování syrovátky lze MBR využít napĜ. pro hydrolýzu laktosy nebo bílkovin. O hydrolýze laktosy, respektive o kontinuální pĜípravČ galakto-oligosacharidĤ v membránovém reaktoru již bylo na semináĜi Mléko a sýry referováno3. Cílem enzymové hydrolýzy bílkovin je ovlivnit jejich funkþní vlastnosti (emulgace, rozpustnost i pĜi vyšších teplotách, tvorba gelu a pČny, reologické vlastnosti) nebo nutriþní vlastnosti (stravitelnost a vstĜebatelnost, alergenicita, vznik biologicky aktivních peptidĤ jako jsou inhibitory ACE a peptidy s bakteriostatickým pĤsobením). Znalosti o prĤbČhu reakce v membránovém reaktoru a možnostech jeho regulace jsou dĤležité pro kvalitu výsledného produktu, nadmČrná hydrolýza bílkovin vede ke špatným senzorickým vlastnostem a vysoké osmolalitČ, pĜi nedostateþné hydrolýze nejsou rozštČpeny sekvence s antigenními vlastnostmi2. ObecnČ lze konstatovat, že enzymová modifikace v membránovém reaktoru znaþnČ rozšiĜuje aplikaþní možnosti syrovátky. Použité materiály a metody Jako substrát byl použit obnovený koncentrát syrovátkových bílkovin (PML, a.s., Nový Bydžov) s výslednou koncentrací bílkovin 20 mg·ml-1. Substrát byl hydrolyzován enzymem Promod 439L (Biocatalyst, UK), alkalickou peptidasou serinového typu, která je produkovaná kmenem Bacillus licheniformis. Podmínky enzymové hydrolýzy byly následující: pomČr enzym/substrát (E/S) 1:100 a 1:500, teplota 40 °C, pH – bez úpravy (6,5). Reaktor byl pro vsádkové pokusy sklenČný s temperovaným pláštČm a magnetickým mícháním o objemu 200 ml. 43

Jako membránový reaktor sloužila jednotka Arno 700 (Mikropur, s.r.o., Hradec Králové) s keramickou membránou (TAMI Industries, NČmecko) s dČlící mezí 8 kDa, doba zdržení v reaktoru byla 15, 30, 60, 120 min, výchozí objem v reaktoru byl 1,5 l. PrĤbČh hydrolýzy byl sledován prostĜednictvím nárĤstu primárních aminoskupin uvolnČných z peptidových vazeb. Primární aminoskupiny aminokyselin reagují s o-ftaldialdehydem (OPA) za pĜítomnosti látky s thiolovou skupinou vzniká 1-alkylthio-2-alkylisoindol, který absorbuje pĜi vlnové délce 335 nm. Jako thiolová slouþenina byl použit N-acetyl-L-cystein (NAC), jehož deriváty jsou stabilní a bez zápachu4,5,6. DĜíve publikovaná metoda5 byla modifikována na základČ testĤ stability absorbance a lepší opakovatelnosti výsledkĤ úpravou pomČru vzorku a þinidla na 1:1 a prodloužením doby reakce na 12 min. Po této dobČ se zmČĜila absorbance pĜi 335 nm proti slepému vzorku, který místo roztoku vzorku obsahoval destilovanou vodu. Pro kvantitativní vyhodnocení byla využita kalibrace s kyselinou glutamovou v koncentraci 0 až 150 Pmol l-1. Hydrolyzáty byly charakterizovány chromatograficky na reverzní fázi7. Vzorky byly nejprve tepelnČ inaktivovány pĜi 90 °C po dobu 10 minut a pĜefiltrovány pĜes filtry Porafil (0,2 Pm). Pro separaci byla použita kolona PLRP-S (30 nm, 150 x 4,6 mm, 8 ȝm) s náplní kopolymeru polystyrendivinylbenzenu. Na kolonu bylo nastĜikováno 20 Pl vzorku. Vzorek byl analyzován gradientovou elucí s eluentem A – roztok 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) ve vodČ a eluentem B – 0,1% roztok TFA ve smČsi acetonitril:voda (80:20). Gradient zaþínal na 5 % eluentu B s postupným nárĤstem na 55 % bČhem 50 min. V závČru analýzy byl podíl eluentu B skokovČ zvýšen na 100 %. Kolona byla temperována na 40 °C. Eluované peptidy byly detekovány pĜi 220 nm. Obsah bílkovin byl stanoven metodou podle Kjeldahla8. Kapacita reaktoru byla vyjádĜena podle vztahu, který použili Perea a Ugalde 9. Kapacita reaktoru K (min-1) je definována jako: J K P V E kde P je koncentrace produktu v permeátu (mg ml-1), J prĤtok permeátu (ml min-1), E poþáteþní koncentrace enzymu (mg ml-1) a V je objem reakþní smČsi (ml). VyjadĜuje množství produktu získaného na jednotku množství enzymu za minutu. Výsledky a diskuse. PrĤbČh vsádkové hydrolýzy je zachycen na obr. 1, kde je uveden stupeĖ hydrolýzy, vyjádĜený jako podíl hydrolyzovaných peptidových vazeb a odpovídající množství uvolnČných primárních aminoskupin. Na obr. 2 je pokus za stejných podmínek v kontinuálním uspoĜádání s dobou zdržení 30 min. StupeĖ hydrolýzy je vhodný pro vyjádĜení prĤbČhu vsádkové reakce, u kontinuálního uspoĜádání vzhledem k možnému kolísání obsahu bílkovin a k rozdílĤm mezi bílkovinami premeátu a retentátu je vhodnČjší pro popis použít obsah aminoskupin. Z obr. 2 je rovnČž vidČt, že k ustálení procesu dojde po 30 – 45 min. V produktu (permeátu) bČhem této doby postupnČ narĤstá obsah peptidĤ, nárĤst odpovídá rostoucímu stupni hydrolýzy na stranČ retentátu. Ustálení je oddalováno pĜidáváním nehydrolyzovaného substrátu. Byla proto zavedena pĜedhydrolýza vsádkovým zpĤsobem, kdy se permeát v této dobČ vrací zpČt do reaktoru a není pĜidáván þerstvý substrát. Doba pĜedhydrolýzy byla zvolena stejná jako stĜední doba zdržení. Teprve po pĜedhydrolýze byl spuštČn kontinuální proces (obr. 3 a 4). NejdĤležitČjšími parametry pro Ĝízení kontinuální hydrolýzy je pomČr E/S a stĜední doba zdržení. Vliv rĤzného pomČru E/S je vidČt z obr. 3. Na stabilitČ procesu se u tČchto experimentĤ negativnČ projevilo ucpávání membrán a ne zcela dokonalá regulace pĜítoku þerstvého substrátu. V dĤsledku toho se prodloužila stĜední doba zdržení pĜibližnČ o 30 % a dochází k mírnému zvyšování koncentrace primárních NH2 skupin, která by za optimálních podmínek a pĜi správné regulaci mČla být konstantní. Možnosti dlouhodobého provozu reaktoru jsou demonstrovány na obr. 4. Z prĤbČhu reakce vyplývá, že lze hydrolyzovat sedminásobné množství substrátu ve srovnání se vsádkovým procesem. Po 220 min lze zaznamenat pokles aktivity enzymu, pokud akceptujeme snížení stupnČ hydrolýzy, dosáhneme tĜináctinásobného využití enzymu. 44

40

20 DH

30

15

20

10

10

5

0

DH [%]

-1

c(NH2) [mmol.L ]

c (N H 2 )

0 0

50

1 00

150

20 0

þ a s [m in ]

Obr. 1. PrĤbČh vsádkové hydrolýzy vyjádĜený pomocí koncentrace NH2 skupin a stupnČ hydrolýzy (DH). Enzym - Promod 439L, substrát – koncentrát syrovátkových bílkovin s výslednou koncetrací bílkovin 20 mg·ml-1, pomČr E/S 1:100, teplota 40 °C, pH 6,5. 25

-1

c(NH2) [mmol.L ]

20

15

10

perm eát

retentát

5

0 0

50

1 00

150

þ a s [m in ]

Obr. 2. PrĤbČh kontinuální hydrolýzy v membránovém reaktoru. Doba zdržení 30 min, ostatní podmínky experimentu – viz legenda k obr. 1. 30

-1

c(NH2) [mmol.L ]

25

20

15 vsád ková pĜedhy drolý za E /S 1:100 permeát E /S 1:100 retentát E /S 1:100 vsád ková pĜedhy drolý za E /S 1:500 permeát E /S 1:500 retentát E /S 1:500

10

5

0 0

50

100 þ a s [m in ]

150

Obr. 3. Kontinuální hydrolýza s pĜedhydrolýzou 30 min a pomČrem E/S 1:100 nebo 1:500, ostatní podmínky experimentu – viz legenda k obr. 1 a 2. 45

25

-1

c(NH2) [mmol.L ]

20

15

10

5

vsá dková pĜe dhydro lýza

pe rme át

retentát

0 0

10 0

20 0

300

40 0

50 0

þas [m in ]

Obr. 4. Kontinuální hydrolýza s pĜedhydrolýzou 30 min a pomČrem E/S 1:100, ostatní podmínky experimentu – viz legenda k obr. 1 a 2. 1 2 ,0 K a p a c ita (E /S 1 : 1 0 0 ) K a p a c ita (E /S 1 : 5 0 0 ) D H (E /S 1 :1 0 0 ) D H (E /S 1 :5 0 0 )

0 ,2

9 ,0

6 ,0

DH [%]

-1

Kapacita [min ]

0 ,3

0 ,1 3 ,0

0

0 ,0 0

20

40

60

80

100

120

140

P o þ á te þ n í d o b a z d r ž e n í [m in ]

Obr. 5. Vliv poþáteþní doby zdržení na kapacitu reaktoru a stupeĖ hydrolýzy (DH).

Obr. 6. Analýza suroviny (nehydrolyzovaný WPC) a retentátu a permeátu z kontinuálního membránového reaktoru metodou RP-HPLC. 46

Nejvyšší kapacita reaktoru byla dosažena pĜi nízkém pomČru E/S a krátké dobČ zdržení (obr. 5). Za tČchto podmínek je ovšem dosahován také nejnižší stupeĖ hydrolýzy. Limitovaná hydrolýza mĤže být v nČkterých aplikacích žádoucí pro urþitou zmČnu funkþních vlastností nebo omezení hoĜké chuti. Peptidový profil (obr. 6) i pĜi 6% stupni hydrolýzy, který odpovídá prĤmČrné délce peptidového ĜetČzce 17 aminokyselin) je výraznČ zmČnČn. ZávČrem lze konstatovat, že hydrolýza bílkovin v membránovém reaktoru je velmi efektivní proces, který mĤže být Ĝízen pomocí stĜední doby zdržení v reaktoru a pomČrem enzym – substrát. Pro ustálené složení hydrolyzátu od poþátku kontinuálního procesu je vhodné zaĜadit vsádkovou pĜedhydrolýzu po stejnou dobu, jaká bude stĜední doba zdržení v kontinuálním provozu.

Práce byla podpoĜená MŠMT ýR (MSM 6046137305). Použitá literatura: 1. Giorno L., Drioli E.: Biocatalytic membrane reactors: applications and perspectives. Trends Biotechnol. 18, 339-349 (2000). 2. Guadix A., Camacho F., Guadix E. M.: Production of whey protein hydrolysates with reduced allergenicity in a stable membrane reactor. J. Food Eng. 72, 398 - 405 (2006). 3. Mišún D., ýurda L., Šípalová O.: Kontinuálna príprava galaktooligosacharidov v membránovom enzýmovom reaktore. Celostátní pĜehlídky sýrĤ – Výsledky pĜehlídek a sborník semináĜe Mléko a sýry, s. 181 - 185, VŠCHT Praha 2006. ISBN 80-7080-620-6. 4. Hernandez M. J., Domingo E. B., Camanas R. M., Alvarez-Cogme M. C.: Use of the o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine reagent in the evaluation of milk proteins. J. Dairy Sci. 74, 1779-1785 (1991). 5. ýurda L., Dryáková A.: Modifikace spektrofotometrické metody pro stanovení primárních aminoskupin v mléþných bílkovinách. Celostátní pĜehlídky sýrĤ – Výsledky pĜehlídek a sborník semináĜe Mléko a sýry 2003, s. 124 - 128, ýSCH Praha 2003. 6. Spellman D., McEvoy E., O’Cuinn G., FitzGerald R. J.: Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis. Int. Dairy J. 13, 447-453 (2003). 7. Janeþková L.: Analytické metody hodnocení syrovátkových bílkovin a jejich hydrolyzátĤ. Diplomová práce. VŠCHT Praha. 8. AOAC, 1990. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists, Helrich K. (Ed.), 15th ed.. IDF-ISO-AOAC Method 920.105: Nitrogen in Milk. Arlington, AOAC, pp. 807-808. 9. Perea A., Ugalde U.: Continuous hydrolysis of whey proteins in a membrane recycle reactor. Enzyme and Microbial Technology 18, 29-34 (1996). Kontaktní adresa: Ladislav ýurda, Ústav technologie mléka a tukĤ, FPBT, VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected]

47

DYNAMIKA MIKROBIÁLNYCH INTERAKCIÍ POýAS KYSNUTIA MLIEKA Valík ďubomír, Medvećová Alžbeta, Bajúsová Barbora, Liptáková Denisa Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave Dynamics of microbial interactions during fermentation of milk Summary: This contribution was aimed at quantitative description of Staphylococcus aureus behaviour in milk in coculture with lactic acid bacteria (LAB). Temperature and initial number of LAB were the main independent variables within the model trials. Other factors as pH and titratable acidity reflecting changes during milk fermentation were also monitored. Results confirmed that in order to control of S. aureus growth the reduction of LAB lag-phase and thus the time to start LAB metabolism were crucial together with temperature of fermentation. Based on laboratory experiments and in connection with artisanal cheese production, the conditions of fermentation were proposed for S. aureus not to reach hygienically relevant numbers.

Syry zo surového mlieka vyrobené remeselne sa tešia v Európe znaþnej obĐube kvôli výnimoþným senzorickým vlastnostiam. Známe sú ako špeciality, produkty s originálnymi vlastnosĢami, geografickým oznaþením alebo pôvodom. Viaceré krajiny si takéto syry chránia a venujú im znaþnú pozornosĢ z hĐadiska zachovania ich výroby, propagácie krajiny a zachovania biodiverzity. Oproti štandardnej priemyselnej veĐkovýrobe syrov z pasterizovaného mlieka sa originálnym syrom zo surového mlieka venuje nezanedbateĐná pozornosĢ aj kvôli vzácnym mikrobiálnym spoloþenstvám, ktoré sa zúþastĖujú na ich zretí1. Syry zo surového mlieka na druhej strane môžu za urþitých nepriaznivých podmienok predstavovaĢ zdravotné riziko. Surové mlieko môže obsahovaĢ choroboplodné mikroorganizmy schopné vyvolaĢ infekþné ochorenie alebo mikroorganizmy, ktoré sa môžu pomnožiĢ, vytvoriĢ množstvo sekundárnych toxických metabolitov a spôsobiĢ intoxikácie2. Zdravotná neškodnosĢ syrov remeselne vyrobených zo surového mlieka je založená na spoloþnom pôsobení viacerých vnútorných a vonkajších faktorov ich prostredia, vrátane technologických podmienok výroby. Hlavnými inhibiþne pôsobiacimi faktormi voþi choroboplodným mikroorganizmom sú všeobecne hodnota pH a s Ėou spojená koncentrácia kyseliny mlieþnej, aktivita vody (hodnota av), redoxný potenciál, kompetícia baktérií mlieþneho kysnutia a koncentrácia ćalších metabolitov vznikajúcich napríklad poþas zretia a iné faktory3. Biochemické procesy prebiehajúce poþas primárneho a sekundárneho zretia sú uskutoþĖované sacharolytickými, proteolytickými a lipolytickými enzýmami príslušných technologicky potrebných mikroorganizmov. Empiricky je pritom zrejmé, že uplatnenie bariérovej funkcie horeuvedených faktorov voþi nežiadúcim/choroboplodným mikroorganizmom musí pôsobiĢ urþitý þas. Z hĐadiska ochrany zdravia konzumentov, požiadaviek legislatívy ale aj na základe horeuvedených poznatkov musí byĢ hygienická bezchybnosĢ výroby syrov pod prísnym dozorom poþnúc od požiadaviek na zdravotný stav zvierat a podmienkami konzumácie konþiac. Pri remeselnej výrobe krátko zrejúcich mäkkých syrov majú zvlášĢ významné miesto opatrenia a postupy správnej výrobnej praxe (SVP), správnej hygienickej praxe (SHP) a HACCP4. Originálnym slovenským krátko zrejúcim syrom vyrábaným zo surového ovþieho mlieka je bryndza. Polotovarom pre jej výrobu je ovþí hrudkový syr, ktorý sa obyþajne remeselne vyrába v horských podmienkach na salašoch. Tento syr podlieha prirodzenej fermentácii natívnymi, najprv baktériami mlieþneho kysnutia, neskoršie proteolytickými baktériami a vláknitými hubami a ich enzýmami5. Proteolytické (sekundárne zretie) prebieha na salaši a v bryndziarni a pôvodne trvalo spolu desaĢ až štrnásĢ dní, neskoršie osem až dvanásĢ dní, priþom sa sušina zvýšila na 54 až 57 %. V súþasnosti tento syr (bryndza) je podrobený iba krátkemu zretiu trvajúcemu maximálne päĢ až sedem dní (spolu þas na salaši a v bryndziarenskom závode). V horských oblastiach v prípade nepriaznivých meteorologickým podmienok je Ģažké zabezpeþiĢ vhodné podmienky pre rýchlu fermentáciu baktériami mlieþneho kysnutia (BMK). Pomalý pokles hodnoty pH môže v praxi byĢ nedostatoþnou prekážkou pre rast patogénnych baktérií, napr. aj toxinogénneho Staphylococcus aureus6,7. PodĐa vlastných vyšetrení môže tento 48

mikroorganizmus, ktorého toxíny sú termostabilné, za krátky þas poþas niekoĐkých hodín prekroþiĢ poþty 106 KTJ/g8. Pri takýchto poþtoch je možné, že koncentrácia toxínov v syre dosiahne úroveĖ, ktorá môže spôsobiĢ intoxikáciu konzumentov, a to aj u potravín alebo jedál teplotne opracovaných9. Pre výrobcov syrov vyrábajúcich syry zo surového mlieka je dôležité zabezpeþiĢ optimálny rast baktérií mlieþneho kysnutia a poznaĢ správanie sa nežiadúcich mikroorganizmov ako aj ich vzájomné vzĢahy. MaĢ k dispozícii aktuálne informácie o poþtoch zúþastnených mikroorganizmov poþas prebiehajúcej fermentácie mlieka alebo mladého syra v praxi nie je možné ani nevyhnutné. Nevyhnutné je však maĢ kontrolu nad prebiehajúcimi procesmi a technologickými podmienkami výroby. CieĐom našej práce bolo preto zistiĢ, þi a kvantitatívne popísaĢ, ako sa baktérie mlieþneho kysnutia vysporiadajú s kontaminantami mlieku. Zamerali sme sa pritom na sledovanie interakcií medzi baktériami mlieþneho kysnutia mezofilnej kultúry Fresco 1010 (Chr. Hansen, Hørsholm, Dánsko) a S. aureus (kmeĖom 2064), ktorý bol izolovaný z ovþieho hrudkového syra MVDr. Hanzelyovou (ŠVPÚ Prešov). Výsledky a diskusia Na obr.1 je znázornená dynamika rastu kmeĖa S. aureus 2064 naoþkovaného spoloþne s baktériami mlieþneho kysnutia kultúry Fresco 1010 do mlieka pri 18 °C. Obdobne boli vykonané pokusy pri teplote 12°C, 15°C, 21°C a 25°C. Tento interval teplôt bol zvolený tak, aby reprezentoval teploty, pri ktorých môže prebiehaĢ kysnutie mlieka a zretie mladého ovþieho hrudkového syra v horských podmienkach. Pri teplote 18°C, ktorú odborníci pokladajú za hraniþnú vzhĐadom na rýchle kysnutie syra, je vidieĢ, aký vplyv má poþiatoþný poþet baktérií mlieþneho kysnutia (BMK) na rast S. aureus. Ak sa BMK nenachádzajú v nadbytku, existuje riziko, že S. aureus dosiahne poþty blížiace sa k hraniþnej koncentrácii 106 KTJ/ml. Pri takomto poþte sa predpokladá, že ak by boli toxinogénne kmene prítomné, koncentrácie ich enterotoxínov by mohli vyvolaĢ stafylokokové enterotoxikózy9. V našom prípade, (obr. vĐavo hore), S. aureus dosiahol poþty v stacionárnej fáze poriadkovo 105 KTJ/ml a oproti poþiatoþnému poþtu narástol o dva logaritmické poriadky, priþom zo smerníc rastových þiar je vidieĢ, že rastová rýchlosĢ BMK (GrBMK = 0,18 h-1) bola vyššia ako rastová rýchlosĢ S. aureus (GrSa = 0,15 h-1). Na druhej strane, ak boli BMK už len v nepatrnom nadbytku (N0 BMK = 3,3 log KTJ/ml), rástli bez lag fázy a poþet S. aureus nedosiahol v stacionárnej fáze ani denzitu 105 KTJ/ml, priþom jeho rastová rýchlosĢ bola nižšia (GrSa = 0,07 h-1, GrBMK = 0,19 h-1; index GRSa/GrBMK = 0,37). Nárast S. aureus (Nmax-N0) bol v tomto prípade (obr. vpravo hore) už o 0,5 log nižší (NmaxSa = 1,7 log oproti 2,2 log v predchádzajúcom prípade). Podobný a ešte výraznejší vplyv na rast S. aureus mali ćalšie vyššie inokulácie kultúry Fresco, priþom v ostatnom prezentovanom prípade vpravo dole pri poþiatoþnom poþte BMK N0BMK = 5,18 došlo síce k nepatrnému rastu v rozsahu 0,5 log, ale sa za krátky þas dosiahla významná inhibícia rastu S. aureus. Z pokusov zobrazených na obr. 1, je zreteĐne tiež vidieĢ, že S. aureus dokázal rásĢ poþas kysnutia mlieka len v þase, kedy nedošlo k zníženiu hodnoty pH, t.j. poþas lag fázy metabolizmu BMK, resp. lag fázy tvorby kyseliny mlieþnej, poþas tzv. lagpH. Táto lag fáza, v závislosti od poþiatoþného poþtu BMK a ich aktivity trvala pri 18°C od 30 do 20 h. Prirodzene v praxi je možné tento þas skrátiĢ ešte vyššou inokuláciou kultúry BMK alebo aj vyššou teplotou fermentácie. Pri zvýšení teploty kysnutia mlieka je však treba poþítaĢ aj s tým, že vyššia teplota môže urýchliĢ tiež rast S. aureus. Túto skutoþnosĢ sme zistili napríklad pri teplote 25°C, pri ktorej pri prakticky rovnakých poþiatoþných poþtoch BMK a S. aureus (N0 BMK = 3,0 a N0 Sa = 2,7 KTJ/ml), S. aureus o 0,5 log prekroþil hraniþnú hodnotu 106 KTJ/ml. Rastové rýchlosti zúþastnených BMK a S. aureus sa navzájom odlišovali menej ako pri teplote 18°C. Rastová rýchlosĢ S. aureus dosahovala pri tejto teplote už približne 72% z rastovej rýchlosti BMK (GrBMK = 0,43 a GrSa = 0,31; index GRSa/GrBMK = 0,72).

49

Obr. 1 Dynamika rastu mezofilnej kultúry Fresco 1110 a S. aureus 2064 poþas spoloþnej kultivácie v mlieku pri 18 °C.

Nmax_Sa-N0_Sa = 1.792+0,00975*T2-0,06637*T*N0_LAB +0,06764*N0_LAB 2 (R = 0,968)

Obr. 2 Vplyv teploty a poþiatoþného poþtu kultúry Fresco na „nárast“ S. aureus (NmaxSa-N0Sa) v mlieku. 50

Na obr. 2 je graficky znázornený vplyv teploty a poþiatoþného poþtu baktérií mlieþneho kysnutia kultúry Fresco na nárast poþtu S. aureus (NmaxSa-N0Sa) poþas ich spoloþného rastu v mlieku. Toto znázornenie reprezentuje všetky opakovane vykonané pokusy pri 12°C, 15°C, 18°C, 21°C a 25°C. Príslušná rovnica lineárnej regresie s dostatoþnou presnosĢou umožĖuje výrobcovi syra v sledovanom intervale teplôt a poþiatoþných poþtov baktérií vypoþítaĢ nevyhnutné poþiatoþné poþty BMK a zvoliĢ správnu teplotu fermentácie aj pri vyšších poþiatoþných poþtoch S. aureus v mlieku urþenom na výrobu syrov, napríklad aj 1000 KTJ/ml. Na druhej strane Valík a kol. (2004)10 zistili, že prirodzený obsah S. aureus vo vzorkách ovþieho surového mlieka odobratých na salašoch v þase od nadojenia až po zasyrenie v putere, (vrátane kontaminácie z príslušných nádob pri prelievaní a filtrácii mlieka), nepresiahol 200 KTJ/ml. Na základe výsledkov znázornených na obr. 2 a pri zabezpeþení hygienických podmienok výroby odporúþame pre výrobu ovþieho hrudkového syra upraviĢ poþiatoþný poþet BMK v mlieku na koncentráciu vyššiu ako 104 KTJ/ml. v takomto prípade, aktívne baktérie mlieþneho kysnutia príslušne rýchlym rastom a tvorbou kyseliny mlieþnej nedovolia S. aureus zvýšiĢ jeho poþiatoþné poþty o viac ako 2 log poriadky, þo by bolo v súlade s platnými limitmi súþasnej legislatívy11. Pri východzích prirodzených poþtoch S. aureus v surovom ovþom mlieku, poriadkovo 102 KTJ/ml a okamžitom spracovaní na syr je možné udržaĢ rast S. aureus pod kontrolou. Navyše podĐa viacerých autorov5,6,7 k inhibícii S. aureus dochádza už poþas zretia ovþieho hrudkového syra na salaši a pokraþuje ćalej v bryndziarni. V súlade s týmito zisteniami je potrebné tiež zdôrazniĢ, že baktérie mlieþneho kysnutia môžu zlepšiĢ mikrobiologickú kvalitu remeselne vyrábaných potravín, avšak len v kombinácii so Správnu hygienickou praxou12.

Záver Horeuvedené zistenia a poþetné opakovane vykonané experimenty sú podkladom pre naše nasledovné závery: Poznanie vzájomných vzĢahov medzi baktériami mlieþneho kysnutia a nežiadúcimi mikroorganizmami prispieva k riešeniu praktických problémov v praxi. BMK sú schopné nešpecificky potlaþiĢ rozvoj patogénnej mikroflóry poþas kysnutia a zretia mlieþnych produktov, vrátane krátko zrejúcich syrov. Nešpecifická úþinnosĢ BMK súvisí s poþiatoþným poþtom, resp. s ich nadbytkom v porovnaní s mikrobiálnou záĢažou choroboplodných baktérií. V prípade ovþieho hrudkového syra a bryndze sa odporúþa vytvoriĢ predpoklady pre úspešnú kompetíciu BMK voþi nežiadúcim mikroorganizmom. Tieto predpoklady súvisia s þo najkratšou lag fázou rastu a metabolizmu BMK(lagpH) a s vytvorením vhodných vonkajších podmienok fermentácie zameraných na optimálnu teplotu a podporu rastu natívne prítomných BMK. V súvislosti s touto podporou odporúþame aj aplikáciu komerþných kultúr BMK ako aj zásad správnej hygienickej praxe.

Poćakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605. Použitá literatura: 1. IDF. Symposium on Cheese: Ripening, Characterization & Technology. Book of Abstracts. 1st edition. Prague: Nakladatelství Galén, 2004, 153 p. 2. COGAN T.M. Public Health Aspects. In ROGINSKI H., FUQUAY J.W., FOX P.F. Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 1, p. 314-320. 3. GÖRNER F., VALÍK ď. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1, vyd. Bratislava: Malé Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. 51

4. ZOTTOLA, E.A., SMITH, L.B. Growth and Survival of Undesirable Bacteria in Cheese. In FOX, P.F Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Gaithersburg: Aspen Publishers, 1999, vol.1, p. 471-492. 5. GÖRNER, F. Der Brinsekäse aus Schafmilch (Brimsen). Ernährung/Nutrition, 4 (4), 1980, s.157-162. 6. GRIEGER, C., BEDNARýÍKOVÁ E., VERDON F. Vplyv zrenia ovþieho hrudkového syra na rastovú krivku Staphylococcus aureus. VeterináĜství, 29, 1979, s. 407-409. 7. PAŽÁKOVÁ, J., PIPOVÁ, M., TUREK, P., NAGY, J. Changes in some microbiological and chemical parameters during the ripening of sheep cheese at different temperatures. Czech J. Food Sci., 19, 2001, p.121-124. 8. VALÍK, ď., SONNEVELD, K., GÖRNER, F. The Lump Cheese from Raw Sheep Milk: PreBryndza Cheese. In: IDF Symposium on Cheese: Ripening, Characterization & Technology, Book of Abstracts. Prague: Nakladatelství Galén, 2004. p.112. 9. ASPERGER, H., ZANGERL, P. Staphylococcus aureus. In ROGINSKI H., FUQUAY J.W., FOX P.F. Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 4, p. 25632509. 10. VALÍK, ď., SONNEVELD, K., GÖRNER, F., BARTO, J. Niektoré mikrobiologické aspekty fermentácie ovþieho hrudkového syra. In: ýSSM Mikrobiologie potravin, Sborník ze semináĜe. Praha: VŠCHT, 2004, s.72-77. ISBN 80-7080-556-0. 11. NARIADENIE ES 2073/2005 z 15. novembra 2005, o mikrobiologických kritériách pre potraviny. Úradný vestník Európskej únie, 22.12.2005. L338, 25 s. Dostupné na internete: http://www.svps.sk/sk/pdf/legislativa/nk_2073_2005.pdf. 12. ADAMS, M.R., NICOLAIDES, L. Review of the sensitivity of different foodborne pathogens to fermentation. Food Control, 8, 1997, p. 227-239.

Kontaktní adresa: ďubomír Valík, Doc. Ing. PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

52

UTILIZÁCIA GLUKÓZY A LAKTÓZY RÔZNYMI KMEĕMI LAKTOBACILOV Greif Gabriel, Greifová Mária, Karoviþová Jolana, Kohajdová Zlatica, Krajþová Eva Ústav biotechnológie a potravinárstva, STU v Bratislave Utilization of glucose and lactose by some strains of lactobacilli Summary: The influence of glucose and lactose on lactic acid formation in MRS broth and milk by lactobacilli strains Lactobacillus rhamnosus VT 1, Lactobacillus rhamnosus LC 705 and Bifidobacterium longum CCM 4990 was investigated. Sterilized MRS broth and semi-skimmed milk were inoculated with 107 CFU/ml of respective strains and stationary incubated at 37 °C. The saccharides (glucose, lactose) and organic acids (lactic acid, acetic acid) were determined by HPLC – RI method. The values of QLA (specific rate of production of lactic acid), and MLA (time, at which QLA is maximal) were calculated from parameters obtained by fitting the function cLA = f(W). The characteristics of growth Pm (specific growth rate) and OҏҞlag phase) were calculated from parameters obtained by fitting the funcion 'OD = f(W). The yield of lactic acid from glucose during lactic acid fermentation in MRS broth for L. rhamnosus LC 705, L. rhamnosus VT1 and B. longum were 74.3, 92.2 and 93.2, respectively

Kyselina mlieþna patrí medzi organické kyseliny, ktoré vo významnej miere ovplyvĖujú organoleptické a technologické vlastnosti ako aj kvalitu výrobkov. Priaznivo pôsobí na senzorické vlastnosti mlieþnych výrobkov. Dodáva im jemne kyslú a osviežujúcu chuĢ, chráni a predlžuje ich údržnosĢ a stráviteĐnosĢ. Vzniká pôsobením baktérií mlieþneho kvasenia (BMK) na laktózu, z ktorej sa pri fermentaþných procesoch premení 20 – 30% na kyselinu mlieþnu [1]. Využíva sa þinnosĢ baktérií mlieþneho kvasenia, ktorých významným zástupcami sú rody Lactobacillus a Bifidobacterium. Baktérie mlieþneho kvasenia nachádzajú v posledných rokoch využitie okrem mlieþnych výrobkov aj v iných odvetviach potravinárskeho priemyslu ako napríklad pri výrobe mlieþne fermentovaných mäsových výrobkov, spracovaní zeleniny a v pekárenskom priemysle [2-7]. CieĐ práce Využite HPLC RID metódy pre sledovanie utilizácie sacharidov a produkcii organických kyselín vybranými kmeĖmi baktérií v rôznych kultivaþných médiách pri teplote 37 °C Materiál a metódy Kultivaþné médiá: MRS bujón, mlieko polotuþné Mikroorganizmy: Lactobacillus rhamnosus VT 1 a Lactobacillus rhamnosus LC 705 (ÚTMT, VSCHT Praha, CZ), Bifidobacterim longum CCM 4990 (Masarykova univerzita v Brne, CZ) Meranie aktívnej kyslosti: stanovenie pH - pH meter InoLab pH Level 2 (WTW Weilheim, Germany) Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón s testovanými mikroorganizmami sa odstredil pri 9000 ot.min-1. Supernatant sa zmiešal v alikvotnom pomere s mobilnou fázou, prefiltroval cez mikrofilter (0,2 Pm) a následne aplikoval na kolónu. 5 cm3 vzorky mlieka s testovaným mikroorganizmom sa zmiešalo s 30 cm3 deionizovanej vody v 50 cm3 odmernej banke. Po pridaní þíriacich roztokov (3 cm3 Carrez I a 3 cm3 Carrez II), premiešaní a doplnení po znaþku sa vzorka prefiltrovala cez skladaný filter a mikrofilter (0,2 Pm) a následne aplikoval na kolónu. Podmienky analýzy: Vysokotlaková pumpa DeltaChrom™ SDS 030, dávkovaþ LCI 30, dávkovacia sluþka 20 Pl, kolóna: Polymer IEX H+ (250 x 8 mm), DelkaChrom™ Temperature Control Unit (40±0,1 °C), mobilná fáza: 9 mM H2SO4, prietok mobilnej fázy: 1 cm3.min-1, detektor: RI K-2301, zberaþ dát a vyhodnotenie v programe Clarity 53

Výsledky a diskusia Rast baktérií mlieþneho kvasenia (BMK) v MRS bujóne pri 37 °C sa sledoval meraním optickej denzity (OD) v nami zvolených þasových intervaloch a bol hodnotený na základe rastových parametrov Pm (špecifická rýchlosĢ rastu) a O (lag fáza) a taktiež rýchlosĢou poklesu aktívnej kyslosti (pH). Výsledky sú uvedené v tab. I. a obr. 1. TabuĐka I Charakteristiky rastu BMK a rýchlosĢ poklesu aktívnej kyslosti MRS bujón

Mikroorganizmus

-1

L. rhamnosus VT 1 B. longum CCM 4990 L. rhamnosus LC 705

Pm (DOD.h )

O (h)

QpH (pH.h-1)

0,22 0,26 0,21

2,2 2,4 3,4

-0,20 -0,21 -0,18

2,5 5,5 2,0 5,0 L. rhamnosus LC 705 L. rhamnosus VT 1 B. longum

4,5

1,0

4,0

0,5

3,5

0,0 0

10

20

30

40

'OD

pH

1,5

50

þas (h) Obr. 1. Rast BMK v MRS bujóne a zmeny pH pri 37 °C Hlavným kritériom pri výbere BMK ako štartovacích kultúr je schopnosĢ rastu v komplexnom médiu a rýchlosĢ prekvášania substrátu s þím je spojená produkcia kyselín (predovšetkým kyseliny mlieþnej) a pokles pH (aktívnej kyslosti). Antimikrobiálna aktivita laktobacilov a bifidobaktérií je daná predovšetkým produkciou organických kyselín (mlieþnej, octovej, propionovej, valérovej) a iných inhibiþných látok H2O2, CO2, diacetylu, bakteriocínov – nízkomolekulárnych látok na báze aminokyselín. Dôležitým kritériom sa zdá byĢ aj produkcia amínov (histamín, tyramín a 2-fenyletylamín) [3,5,6,7]. Utilizácia glukózy rôznymi kmeĖmi laktobacilov Analýza štandardov sacharidov a organických kyselín pomocou HPLC – RID metódy je uvedená na obr. 2.

54

Obr. 2. Chromatogramy sacharidov laktóza (1), glukóza (3), galaktóza (4), a organických kyselín citrónová (2), mlieþna (5), octová (6), propiónová (7)

Obr. 3. Chromatogramy glukózy, kyseliny mlieþnej a octovej v MRS bujóne v 0. a 48. hodine kultivácie Lactobacillus rhamnosus VT 1 pri 37 °C Použité kmene BMK (Lactobacillus rhamnosus VT 1, Lactobacillus rhamnosus LC 705 a Bifidobacterim longum CCM 4990) tvorili z glukózy len kyselinu mlieþnu (obr. 3-5.). Z nameraných výsledkov vyplýva, že ide o homofermentatívne kmene BMK. Kyselina octová, ktorá bola detekovaná v 8,480 min. (obr. 3-5.) pochádza z kultivaþného média (MRS bujón), kde je pridávaná vo forme octanu sodného.

55

Obr. 4. Chromatogramy glukózy, kyseliny mlieþnej a octovej v MRS bujóne v 0. a 48. hodine kultivácie Lactobacillus rhamnosus LC 705 pri 37 °C

Obr. 5. Chromatogramy glukózy, kyseliny mlieþnej a octovej v MRS bujóne v 0. a 48. hodine kultivácie Bifidobacterim longum CCM 4990 pri 37 °C Výsledky (obr. 2. – 5.) ukázali, že nami použité kmene BMK sú homefermentatívne (v MRS bujóne neprodukovali kyselinu octovú). Pík kyseliny octovej, ktorý sa objavuje v chromatogramoch je zo živnej pôdy, do ktorej je kyselina octová pridávaná vo forme octanu sodného (5 g.dm-3) (obr. 2. – 5.). Utilizácia glukózy a produkcia kyseliny mlieþnej použitými kmeĖmi BMK v MRS bujóne je na obr. 6. VýĢažnosĢ kyseliny mlieþnej bola pre Lactobacillus rhamnosus VT 1, Lactobacillus rhamnosus LC 705 a Bifidobacterim longum (92,2; 74,3 a 93,2%). Špecifická rýchlosĢ utilizácie glukózy sa signifikantne nelelíšila u kmeĖov Lactobacillus rhamnosus VT 1 a Bifidobacterim longum (-0,00699 a 0,00701 mol.dm-3.h-1) a taktiež špecifická 56

rýchlosĢ produkcie kyseliny mlieþnej (0,01197 a 0,01210 mol.dm-3.h-1). Tieto hodnoty boli významne nižšie boli u Lactobacillus rhamnosus LC 705 (-0,0062; 0,0085 mol.dm-3.h-1), þo je možné dedukovaĢ z obr. 6. Charakteristiky utilizácie glukózy, resp. produkcie kyseliny mlieþnej boli vypoþítané z parametrov krivky definovanej ako funkcia koncentrácie produktu (cP) od þasu (W):

cP

Ce e

B W M P

BC e kde cP je koncentrácia produktu v þase W, C - maximálna koncentrácia produktu v stacionárnej fáze (horná asymptota), B - smernica priamky v bode M, MP - þas, v ktorom je špecifická rýchlosĢ produkcie amínu̓maximálna, QGlu - špecifická rýchlosĢ utilizácie glukózy, resp. QKM - špecifická rýchlosĢ produkcie kyseliny mlieþnej. Bod M je definovaný vzĢahom

QP

d 2c p dW 2

0,18 0,16

0.

L. rhamnosus LC 705 L. rhamnosus VT 1 B. longum

cGlu; CKM (mol.dm-3)

0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0

10

20

30

40

50

þas (h) Obr. 6. Utilizácia glukózy a produkcia kyseliny mlieþnej použitými kmeĖmi BMK v MRS bujóne pri 37 °C

Obsah laktózy v mlieku inokulovanom L. rhamnosus LC 705 poklesol z 0,1239 mol.dm-3 po 48 h kultivácie na 0,0837 mol.dm-3, þo predstavuje 32,5%. Obsah kyseliny mlieþnej bol 13,34 g.dm-3. Pri inokulácii mlieka kmeĖmi Lactobacillus rhamnosus VT 1 a Bifidobacterim longum CCM 4990 obsah laktózy poklesol za 48 h kultivácie o cca 11,9% a obsah kyseliny mlieþnej bol 5, 4 resp. 5,7 g.dm-3. Týmto výsledkom odpovedali aj pH-hodnoty substrátov v 48. h kultivácie (3,512; 4,559 a 4,385).

57

Obr. 7. Chromatogramy laktózy, kyseliny mlieþnej a octovej v mlieku v 48. hodine kultivácie L. rhamnosus LC 705 a Bifidobacterium longum CCM 4990 pri 37 °C

Poćakovanie Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/3546/06

Literatúra 1. Hylmar B.: Analýza mléþných kysaných výrobkĤ. Praha, SNTL 1986, 320 s. 2. Carr F.J., Chill D., Maida N.: The lactic acid bacteria: A literature survey. Critical Reviews in Microbiology, 28 (4), 281-370 (2002). 3. Karoviþová J., Drdák M., Greif G., Hybenová E.: The choice of strains of Lactobacillus species for the lactic acid fermentation of vegetable juices. Eur. Food Res. Technol., 210 (1), 53-56 (1999). 4. Karoviþová J., Kohajdová Z., Greifová M., Lukáþová D., Greif G.: Porovnanie fermentácií zeleninových štiav. Bull. PV, 41(3), 197-213 (2002). 5. Ross R.P., Morgan S., Hill C.: Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology, 79 (1-2), 3-16 (2002). 6. Künsch U., Schärer, H., Temperli A.: Study on the formation of biogenic amines during sauerkraut fermentation. Food Biotechnol., 4, 192 – 204 (1990). 7. Greif G., Greifová M., Karoviþová J., Hybenová E., Drdák M.: Biogenic amines in the process of lactic acid fermentation of vegetables. In: Book of abstract. 1st Meeting on Chemistry & Life. The Brno, Sep. 9-10. 10. 1999. CZ. p. 35-36 (1999).

Kontaktná adresa: Ing. Gabriel Greif, PhD., FCHPT STUv Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovensko, e-mail: [email protected]

58

APLIKACE PěÍMÉ A NEPěÍMÉ IMPEDANýNÍ METODY PěI STUDIU VLASTNOSTÍ ýMK A KONTAMINUJÍCÍ MIKROFLÓRY MLÉKA. ýerný Vladimír1, Havlíková Šárka1, Kvasniþková Eva1, VyletČlová Marcela2 1 Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o. Praha; 2Výzkumný ústav pro chov skotu Rapotín Application of direct and indirect impedance method for studying a pure dairy culture and milk contaminated culture. Summary: Direct microbiological methods using Rabit apparatus were implemented for studying the resistance of Str. salivarius subsp. thermophilus strains against the temperature between 30-50 °C. Indirect methods were used for properties comparison of group strains Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus and Bacillus licheniformis. Achieved and presented results confirm the suitability of using the Rabit apparatus and impedance microbiology method for studying properties of individual strains of microorganisms.

Úvod : Aplikace impedanþních mČĜení v mikrobiologii není novou záležitostí, první zprávy jsou z pĜelomu 19. a 20. století. Vývoj tČchto metod pokraþoval a v 70. letech 20. století byly vyvinuty jednoúþelové systémy Malthus (Malthus Instruments Ltd. GB) a Bactometr (bioMérieux Vitek Inc., USA). Od té doby udČlaly metody impedanþní mikrobiologie další významný pokrok, zejména v oblasti aplikací zamČĜených na detekci patogenních mikroorganismĤ. Výhody a nevýhody impedanþních mČĜení shrnuje napĜ. ýurda (1) - mnohostranné využití pro široké spektrum mikroorganismĤ, rychlost stanovení, vysoké poĜizovací náklady a nízké provozní náklady, automatický záznam dat, citlivost a reprodukovatelnost i možnost soubČžného hodnocení vČtšího množství vzorkĤ i pĜehled aplikací impedanþních metod v mlékárenské mikrobiologii. Pro testování metod impedanþní mikrobiologie byl v této práci použit pĜístroj RABIT (Don Whitley Scientific Ltd, GB), který umožĖuje zjišĢovat rĤst bakterií pomocí zmČn impedance pĜi jejich kultivaci v mléce nebo ve speciálních živných médiích. Pozornost byla vČnována jak možnostem pĜímé impedanþní metody (založené na mČĜení zmČny impedance použitého kultivaþního média jako výsledku zmČn jeho složení bČhem rĤstu testovaného mikroorganismu), tak i možnostem využití nepĜímé impedanþní techniky (založené na mČĜení zmČn impedance vyvolaných absorpcí CO2 (vytvoĜeného bČhem rĤstu mikroorganismu) v roztoku KOH). Materiál a metody : Pro metody pĜímé impedance byly použity isoláty kmenĤ : - Latobacillus helveticus - Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis - Streptococcus salivarius subsp. thermophilus - Kultivaþní médium – obnovené sušené mléko z jedné výrobní šarže - Teplota kultivace 30°C až 50°C - Dávka inokula – 0,01 % - Pro zpracování namČĜených dat a definování vztahu mezi dobou kultivace a kĜivkou impedanþního záznamu byl použit modifikovaný GompertzĤv model ve tvaru :

P (max) * e X (t ) A * exp( exp( * ( O t ) 1)) X (0) A A ........... hodnota horní asymptoty kĜivky e ........... exp(1) μ(max)... maximální rychlost zmČny impedance O ........... þas lag fáze impedanþní zmČny t ........... þas

ln kde :

59

Pro metody nepĜímé impedance bylo použito : - 10 kmenĤ Bacillus licheniformis - 10 kmenĤ Bacillus cereus - 10 kmenĤ Pseudomonas fluorescens - Tryptone soya broth (Oxoid 0129) obohacený pĜídavkem 1 % sušeného mléka. 5 ml bujónu zaoþkovaného þistou kulturou a jejím desítkovým ĜedČním bylo dávkováno do sklenČné zkumavky a bylo vloženo do kultivaþní cely s hydroxidem draselným, uzavĜeno zátkou a vloženo do kultivaþního bloku pĜístroje. - Teplota kultivace : 21 °C pro Pseudomonas ssp. a 30 °C pro Bacillus ssp. - ěedČní kultury : až do 5. ĜedČní. SoubČžnČ byly odebrány vzorky na stanovení poþáteþních poþtĤ bunČk þi spór klasickou plotnovou metodou. Všechny kultivace pĜímou i nepĜímou metodou byly provedeny dvojmo a soubČžnČ byl vždy kultivován kontrolní vzorek.

PĜímé impedanþní metody. PĜi použití pĜímé metody mČĜení se zaoþkované mléko ve sterilních mČĜících celách vloží do pĜístroje a bČhem kultivace, pĜi pĜedem zvolené teplotČ, jsou mČĜeny a zaznamenávány zmČny impedance kultivaþního média. Tyto zmČny odpovídají zmČnám ve složení kultivaþního média a i zmČnám v poþtu mikroorganismĤ. Použití této metody je výhodné pro typy kultivací spojených s tvorbou kyselin z pĜítomné málo vodivé složky substrátu. Zvyšující se koncentrace vznikajících kyselin vyvolává významnou odezvu v namČĜených hodnotách impedance kultivaþního média. Jako pĜíklady aplikace pĜímé metody mČĜení je uveden zpracovaný soubor kultivací kmene Streptococcus salivarius subsp. thermophilus v obnoveném mléce pĜi teplotách 30 – 50 °C (Obr.þ.1) 13500 13000 impedance (uS)

12500 G0-21-30

12000

G0-21-37

11500

G0-21-43

11000

G0-21-47

10500

G0-21-50

10000 9500 9000 0

300

600

900

1200

1500

1800

doba kultivace (m inuty)

Obr. þ. 1 Str. salivarius ssp. thermophillus - vliv teploty kultivace, obnovené mléko V rámci ovČĜování metod byla testována i opakovatelnost mČĜení použité pĜímé impedanþní metody. Na obr. þ. 2 je uveden pĜíklad vyhodnocení opakované kultivace isolátu Lb. helveticus a uvedené výsledky dokumentují dobrou stabilitu a opakovatelnost mČĜení.

60

lag fáze (hod)

6 5,9 5,8 5,7 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2 5,1 5

b3

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 13 14 15 16 17 18 19 20 21

m ČĜení þ.

Obr. þ. 2 stanovení doby lag-fáze, Lb. helveticus, 43°C, n=17, prĤmČr=5,46 hod, SmOdch=0,65%

NepĜímé impedanþní metody. Vývoj a ovČĜování metody nepĜímé impedance byl spojen s orientaþním testováním vlastností vybraných kontaminantĤ potravináĜských výrobkĤ které jsou i pĜi výrobČ sýrĤ považovány za nežádoucí až nebezpeþnou mikroflóru. Jako zástupce psychrotrofní mikroflóry byl vybrán Pseudomonas flurescens. Jeho technologicky nežádoucí vliv na výslednou jakost zralých sýrĤ byl jednoznaþnČ prokázán i ve VÚM v rámci výzkumného projektu NAZV IE5027. BČžnČ se vyskytuje i ve zkažené potravČ, þasto je izolovan z klinických vzorkĤ. Druhou skupinou jsou termorezistentní aerobní mikroorganismy které pĜežívají tepelné ošetĜení 85 °C po dobu 10 minut (ýSN 570101). Z této skupiny mikroorganismĤ byly k testování vybrány Bacillus cereus a Bacillus licheniformis. Jsou schopny produkovat toxiny. Ve spolupráci s VÚCHS Rapotín byl pro úþely testování vybrán soubor kmenĤ, který zahrnoval 10 kmenĤ Bacillus licheniformis, 10 kmenĤ Bacillus cereus a 10 kmenĤ Pseudomonas fluorescens. Testování bylo zamČĜeno na urþení vztahĤ mezi poþáteþní denzitou spór nebo bunČk jednotlivého testovaného kmene a dobou do dosažení požadované odezvy na pĜístroji (TTD). Z takto získaných hodnot je možno následnČ získat lineární vztah mezi logaritmem poþáteþních poþtĤ bunČk (spór) a odezvou pĜístroje (TTD). Pro testování byl použit Tryptone soya broth (Oxoid 0129) obohacený pĜídavkem 1 % sušeného mléka a teplota kultivace byla 21 °C pro Pseudomonas ssp. a 30 °C pro Bacillus ssp. Pro vyhodnocení závislosti mezi poþtem mikroorganismĤ a TTD byla použita ta ĜedČní, pĜi kterých byl logaritmus poþtu zárodkĤ vČtší jak nula.

Vyhodnocení výsledkĤ : Každé stanovení bylo provádČno dvojmo, soubČžnČ byl kultivován slepý pokus s nezaoþkovaným bujónem. Z výsledkĤ mČĜení byla pro každý kmen urþena lineární závislost mezi log CFU a TTD a její koeficienty ( TTD = A*log CFU + B ). Pro zevšeobecnČní výsledkĤ mČĜení a získání dat popisujících chování jednotlivých druhĤ testovaných mikroorganismĤ byla vypoþítána prĤmČrná hodnota a smČrodatná odchylka jak smČrnice pĜímky (A) tak i konstantního þlenu (B) a jsou uvedeny v následující tabulce. 61

Tab. I: Koeficienty regresní pĜímky pro jednotlivé skupiny mikroorganismĤ. Ps. Fluorescens B. licheniformis B. cereus koeficient "A" "B" "A" "B" "A" "B" 8 9 10 n prĤmČr -4,24 42,00 -2,70 24,32 -1,40 12,35 SmOdch 0,25 3,53 0,21 2,45 0,08 0,59 % 5,81 8,40 7,67 10,07 5,81 4,77 max -3,89 46,54 -2,49 28,14 -1,29 13,34 min -4,67 35,20 -2,97 23,33 -1,55 11,57 rozdíl 11,34 9,11 1,77 Z tČchto hodnot byly vyhodnoceny a následnČ graficky zpracovány intervaly oþekávaných hodnot pro hladinu významnosti a < 0,95. Pro každý rod byly zkonstruovány 3 pĜímky : TTD = (prĤmČr „A“) * log CFU + (prĤmČr „B“) (1) s mezemi : TTD = (prĤmČr „A“) * log CFU + (prĤmČr „B“+ SmOdch) (2) TTD = (prĤmČr „A“) * log CFU + (prĤmČr „B“- SmOdch) (3) Výsledky mČĜení jsou zpracovány v obrázcích þ.3 (Bacillus ssp.) a þ.4 (Pseudomonas ssp.).

30 þas do TTD (hod)

25 B.licheniformis Mean

20

B.licheniformis Mean+STD

15

B.licheniformis Mean-STD B. cereus Mean

10

B. cereus Mean+STD

5

B. cereus Mean-STD

0 0

1

2

3

4

5

6

log (CFU/m l)

Obr. þ. 3 Porovnání rĤstové charakteristiky kmenĤ B. cereus a B.licheniformis 70

þas do TTD (hodiny)

60 50 8 s trains Mean

40

8 s trains Mean+STD 8 s trains Mean - STD

30

2 s trains Mean

20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

log (CFU/m L)

Obr. þ. 4 PrĤmČr závislosti log(CFU/ml) a TTD pro 8 kmenĤ Ps. fluorescens a porovnání s dalšími 2 kmeny 62

Z výsledkĤ byl spoþítán také prĤmČrný þas do zdvojení, který byl pro B. Licheniformis 49 minut a pro B. cereus 25 minut. Z výsledkĤ plyne, že se testované mikroorganismy od sebe liší jak v rychlosti rĤstu tak i v dobČ trvání lag fáze. PĜi vyhodnocování výsledkĤ kultivací Ps. fluorescens bylo nutno dva kmeny vyĜadit ze zpracovávaného souboru, protože se výraznČ lišily od dalších osmi kmenĤ. Zejména jejich koeficient „B“ byl výraznČ vČtší. Z tohoto dĤvodu byly tyto kmeny vyhodnoceny samostatnČ. PrĤmČrné hodnoty jsou uvedeny v pĜíslušném grafu (þervená pĜímka ). Z vyhodnocení kultivací plyne to, že všechny kmeny Pseudomonas fluorescens mají prakticky stejnou dobu do rozdvojení (76,3 min pro soubor 8 kmenĤ proti 75,7 min pro dva vyĜazené kmeny a rozdíl je v dobČ trvání lag fáze. ZávČr : Metody pĜímé impedanþní mikrobiologie s využitím pĜístroje RABIT byly využity pĜi studiu odolnosti kmenĤ Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis a Streptococcus salivarius subsp. thermophilus vĤþi teplotČ v rozsahu 30 – 50 °C. Metody nepĜímé impedanþní s využitím pĜístroje RABIT byly použity pro porovnání vlastností souborĤ kmenĤ Ps. fluorescens, B. cereus a B. licheniformis. Dosažené a presentované výsledky potvrzují vhodnost použití pĜístroje RABIT i metod impedanþní mikrobiologie pro studium vlastností jednotlivých kmenĤ mikroorganismĤ.

Literatura : Holubová J., ýurda L. : Impedanþní metoda a její využití v mlékárenské mikrobiologii, sborník semináĜe Mléko a sýry 2003, VŠCHT Praha 2003, 145-151

Práce vznikla za finanþní podpory grantu MSM2672286101 . Kontaktní adresa: Ing. Vladimír ýerný, VÚM s.r.o. Praha, e-mail : v.cerny @vum-tabor.cz

63

ŽINýICA AKO PROBIOTICKÁ BIODIVERZIFIKOVANÁ POTRAVINA. Keresteš Ján NIKA s r. o., Považská Bystrica, Slovensko Žinþica je tradiþný salašnícky výrobok naturálneho ovþieho hospodárstva. V procese koncentrácie výroby v druhej polovici 20. storoþia a hlavne ako predmet výskumu upadol do zabudnutia, ale ústne podanie technológie výroby a blahodárne úþinky na zdravie konzumenta sa zachovali. V posledných dekádach vplyvom poklesu výroby kravského mlieka na Slovensku oproti roku 1989 až o 45 % existenþné podmienky pôdohospodárov napomohli þiastoþnému rozvoju chovu oviec, produkcie ovþieho mlieka a ovþích mlieþnych výrobkov, hlavne Slovenskej bryndze. Práve ochrana tohto výrobku, žiaĐ ktorý v Bruseli doteraz nie je právne kodifikovaný napomohla širšiemu hlavne biotechnologickému a mikrobiálnemu výskumu a rozpornosti hygienických pohĐadov oproti probiotickým úþinkom. Pre výrobu žinþice, podobne Slovenskej bryndze platí zásada, že je potrebné dodržiavaĢ všetky hygienické normy a technologické postupy a nieje možná výroba v provizórnych podmienkach. VyrábaĢ z tepelne neošetreného mlieka môže len ten, kto zvládne technológie a tie sú nároþnejšie ako vyrábaĢ z pasterizovaného mlieka. Záujem našej spoloþnosti sa sústredil na možnosti vytvorenia priemyselnej formy výroby žinþice. Urþením rozhodujúcich fáz bola vytvorená technologická osnova v algoritme: - príprava separátu znížením obsahu kazeinu za použitia nízkych teplôt pri sýrení a zrážaní - príprava mateþných zákysov v množstve 3 % celkovo použitého separátu metodikou spracovanou Olšanským a KnČzom - kultiváciou zakysaného separátu pri dodržaní tepelného režimu kysania, zrenia a dozrievania. Je to rozhodujúca fáza priemyselnej výroby, pretože presne kopíruje salašnícky spôsob s cieĐom dosiahnutia 1 miliardy celkového poþtu mikroorganizmov na 1 gr. Žinþica je širokospektrálny mikrobiálny výrobok s obsahom asi 1700 druhov mikroorganizmov. Identifikáciu celkového poþtu v 70- ich rokoch minulého storoþia stanovila Prekopová – Porubjaková ( 1976 ) a vychádzala z prác Laxu, Šveca, Olšanského a Kneza. V poslednom období dobieha identifikácia na báze DNA, ktoré vykonáva Ústav bunkovej biológie Prírodovedeckej fakulty v Bratislave vedenej Prof. Ebringerom ( 2005 ). Postup prác vychádza evoluþno - filogenetickej teórie symbiózy a antagonizmu zachovania pamäti genetickej postupnosti a þasovej závislosti. V jednom grame produktu bola zistená doteraz celá škála rodového zastúpenia Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostor, Bifidobacterium, Enterococcus, Sacharomyces, Kluyveromices, mnoho ćalších, tak ako boli deklarované pri hodnotení výskumnej úlohy zo dĖa 10. 1. 2007. PodĐa Ebringera je žinþica súþasĢou funkþných potravín so široko diverzifikovanými úþinkami, podieĐajúcimi sa na regulácii biologických procesov cicavcov. Použitie probiotických druhov vo výrobe mlieþnych produktov v poþte jeden až tri, má zdravotný a výživový význam, ale nie probiotický úþinok. Potvrdzujú to doterajšie zistenia pilotných porovnávacích pokusov. Priemyselná výroba žinþice je typickým produktom fermentaþnej aktivity baktérií mlieþneho kysnutia z laktózy a vznik kyseliny mlieþnej, ktorá znižuje pH v þreve a to je jav dôležitý z hĐadiska inhibície premnoženia nežiadúcich patogénov. Tento antimikrobiálny efekt je zvyšovaný produkciou špecifických inhibítorov typu baktoriocínov. Probiotické baktérie v druhej fáze zrenia a teda produkcie bakteriocínov znižujú obsah prokarcinogénnych enzýmov v þreve hlavne E-glukoronidázy, nitroreduktázy, azoreduktázy a oproti tomu zvyšuje obsah E-galaktozidázy, þo je významné pri prevencii dôsledkov laktózovej intolerancie.( Ćuriš 2005 )

64

Fermentáciou vzniká v procesoch zrenia a dozrievania celá rada metabolitov ako sú bioaktívne peptidy, vitamíny B – komplexu, hlavne vitamnín B –12, kyseliny listovej a produkcia esencialnej konjugovanej kyseliny linolovej. ( Soják 2005 ) Malé peptidy s obsahom 3 – 20 druhov aminokyselín spolupôsobia na aktivitu angiotensimu I. a vzniku angiotensimu II., ktorý úþinne sĢahuje cievy. Laktorfíny, D– kazein – exorfíny majú opiátové úþinky, kazeinofosfopeptidy. zvyšujú využiteĐnosĢ vápnika v zásaditom prostredí, alebo peptidy navodzujúce programovú smrĢ buniek ( apoptózu). Fermentáciou hlavne v tretej fáze vznikajú produkty znižujúce sérový cholesterol a to tým, že GIT v hrubom þreve rozkladajú potravinovú vlákninu. Zvýšenou mikrobiálnou aktivitou vzniká dekonjugácia žlþových kyselín. Vplyvom hlavne enterococcovej aktivity je usmerĖovaný celý proces selénoproteínov s úþinnosĢou glutatioperoidázy ako predpokladu vylúþenia vzniku prokurzoru rakoviny hrubého þreva tvorbou nitrózaminov. Mikeš a Ebringer zistili pri dlhodobom teste na 24 dobrovoĐníkoch štatisticky významný pokles celkového ako aj LDL cholesterolu. Prekvapivým nálezom bol pokles hladiny glykémie, sérového kreatinu, C – reaktívneho proteínu a hodnôt krvného tlaku. Oproti tomu zistenia, že v 100 gr žinþice sa nachádza až 600 mg ionizovaného vápnika je významným benefitom ( pri nižšej pH) v prevencii civilizaþných chorôb vrátane osteoporózy a spolu s vitamínom D chráni pred vznikom kolorektálneho karcionómu hlavne zvýšením vstrebávania v hrubom þreve. Hygienická hypotéza ale aj mnohí odborníci sa prikláĖajú k názoru, že mnohé alergické ale aj iné ochorenia sú dôsledkom nedostatoþného osídlenia makroorganizmu v priebehu ontogenézy ako aj výsledky porovnávacích štatistík mestských a vidieckych osídlení. V minulosti bola potrava bohatšia na prospešné mikroorganizmy a organizmus bol nimi intenzívnejšie osídĐovaný. Ide o akýsi kolobeh mikroflóry v prírode a práve probiotické, mikrobiálne širokospektrálne potraviny ako sú Slovenská bryndza, žinþica, parenica, oštiepky tento deficit môžu naprávaĢ. Probiotiká ako súþasĢ funkþných potravín nám v pilotných a klinických pokusoch túto skutoþnosĢ potvrdili. Z množstva názorov a posledných mikrobiálnych kongresov sa stabilizovala definícia probiotík takto: - Probiotiká sú živé organizmy, podávané v dostatoþnom množstve, zdraviu prospešnými úþinkami gastrointestinálneho traktu (GIT) a inom anatomickom mieste hostila. - Obsadzujú receptory enterocytov, produkujú inhibiþné substancie, zabraĖujú lipnutiu patogénov k þrevnej sliznici a spúšĢajú mechanizmus syntézy cytokínov. Využitie probiotík má v súþasnosti viac smerov a prevládajúce sú dva: - izolácie jednotlivých druhov až do molekulárnych a submolekulárnych štruktúr - symbiiotické pôsobenie v biodiverzifikovaných formách. Pre priblíženie zložitosti problematiky uvádzame niektoré probiotické a terapeutické výsledky: - Gastroenterotídy a hnaþkové ochorenia - sú spôsobené zmenou þrevnej mikroflóry ( II. klinika FNUK ) zodpovednej za kolonizaþnú rezistenciu a je sprevádzaná úbytkom mlieþnych baktérií, následnou dehydratáciou a straty elektrolytov. Pri lieþení postantibiotických hnaþiek sa osvedþili baktérie: Lactobacillus (L ) acidophilus, L. rhamnosus, Bifidobacteriu lomgum, Enterococcus faecium a niektoré druhy Sacharomyces, ale aj infekcií Clostridium defficile.( nové zistenia ) - Zápalové ochorenia a infekcie Helicobacter pilori. Klinicky boli otestované viaceré kmene a druhy mlieþnych baktérií napríklad Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, L dulbrueckií , L. helveticus, L. acidophilus, ktoré modulujú kolonizáciu žalúdoþnej mukózy helicobacterom a to vyluþovaním anti – helicobaktériovými bakteriocínmi. SĐubné sú výsledky získané na CHTF v Bratislave kde Greifová zistila izoláciou supernatantov inhibiþné úþinky voþi niektorým plesniam. 65

-

Terapia reumatoidnej atritídy - kde ide o zmiernenie zápalových ochorení hlavne úþinkom vegetariánskej stravy a zvýšenia syntézy krátkoreĢazcových masných kyselín v hrubom þreve. V Ústave reumatických chorôb v PiešĢanoch pri použití preparátu „ Metotrexát“. Baktérie rodu Enterococcus priaznivo ovplyvĖoval enterokolitidu.

-

Terapia hepatálnej encelopatie – mlieþne baktérie fermentaþnou aktivitou utvárajú podmienky na potlaþenie mikroflóry s prokolytickou a ureázovou aktivitou a znižovania amoniaku v krvi. Pokusy na 16 pacientoch v kombinácii so selénom boli aplikované na I. internej klinike LF UK.

-

v chirurgii - pri operáciách brušnej dutiny ako probiotickú clonu namiesto antibiologickej. Vysvetlenie je v podpore produkcie krátkoreĢazcových masných kyselín. Pozitívne úþinky boli zistené aj aplikáciou L. plantarum s koreĖom þakanky ( obsahuje inulín ) a v terapii akútnej pankreatitídy.

-

Imunomodulaþné a antialergické úþinky až 80 % imunitného systému þloveka sa nachádza GIT þo poskytuje možnosĢ modulovaĢ imunitnú odpoveć konzumáciou probiotickej potravy. Probiotiká regulujú imunitnú elimináciu antigénov patogénnych mikroorganizmov, ako aj imunologickú toleranciu na potravinové antigény ( Ebringer ). Potvrdzuje sa názor, že zvýšený výskyt alergických ochorení detí v priemyselne vyspelých krajinách je dôsledkom nedostatoþného osídĐovania þreva mikroflórou zavineného malým konzumom fermentovaných produktov, sprísnenými hygienickými pravidlami, zvýšenou zdravotníckou starostlivosĢou a chemizáciou životného prostredia. Slizniþný imunitný systém detí je po narodení vystavený iným antigenným stimulom, než na aké bol cez stároþia v priebehu mnohých generácií adaptovaný.

Žinþica je z hĐadiska poþetnosti mikroflóry biotechnologickým výskumom na zaþiatku svojho probiotického uplatnenia v mliekárenskej potravinovej štruktúre a o to sa pokúsila naša spoloþnosĢ so svojím vedeckým potenciálom. Naćalej budeme túto pestrú skupinu identifikovaĢ po stránke taxonomiky, jej génového vybavenia a rozsahu biologickej aktivity. Nabáda nás k tomu, už doteraz známych vyše 100 druhov rodu Lactobacillus alebo novú štruktúru druhov Enterococcus. Cielene chceme rozšíriĢ naturálne syrárstvo na vyšší obsah druhovej skládky mikroflóry. Mlieko stálo a je pri zrode þloveka ako prvá potravina, kyslomlieþne výrobky a multimikrobiálne syry ako forma prežitia. ( Keresteš, 2006 ) Posilnenie postavenia spotreby biodiverzifikovaných mlieþnych výrobkov a zvýšenie ich spotreby je hlavnou úlohou v prevencii a terapii najþastejších ochorení ako sú kardiovaskulárne ochorenia, hyperchlosterolémia, rakovina, osteoporóza, diabetes, imunodeficiencia a infekþné ochorenia. K tomu by nám mali napomôcĢ doteraz neuskutoþnené zámery vytvárania národných mikrobiologických bánk a ich zachovania pre budúce generácie.

Kontaktní adresa: Ing. Ján Keresteš, NIKA spol. s r.o., Nová 135, 017 01 Povážská Bystrica, Slovenská Republika e-mail: [email protected]

66

PROTEKTÍVNE VLASTNOSTI VYBRANÝCH KMEĕOV RODU LACTOBACILLUS Hudáþek Jaroslav, *Zalán Zsolt, Chumchalová Jana, *Halász Anna Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha, * Central Food Research Institute, Budapest Protective properties of selected Lactobacillus strains Summary: Ten identified lactobacilli of species Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Lb. paracasei and Lb. curvatus were chosen after cultivation in skim milk, MRS broth and Jerusalem Artichoke (JA) for a determination of active acidity, titratable activity, organic acids, hydrogen peroxide and histamine. Antifungal activity was examined after cultivation of the strains in MRS broth. Antifungal activity against Fusarium spp. and Aspergillus spp. detected by agar diffusion method in two versions. In the version 1, monitoring of cells activity was investigated after cultivation in MRS broth. In version 2, inhibition of neutralized and heat treated supernatant of culture broth was retrieved. In the following step inhibitory effect of lactobacilli on growth and mycotoxin production of Asp. flavus and Asp. parasiticus was determinated by cultivation in liquid media. Mycelium mass was and production of aflatoxin B1 was determined during cultivation.

Úvod Baktérie mlieþneho kysnutia (BMK) koexistujú s vláknitými hubami a kvasinkami v mnohých ekosystémoch, napr. v rôznych fermentovaných potravinách, kde môžu inhibovaĢ rast plesní a tým je možné ich využite ako bioochrany1. Prv sa antifungálny úþinok pripisoval naprodukovanej kyseline mlieþnej a kyseline octovej. Potom sa záujem zameral na mlieþne baktérie, ktoré vykazovali produkciu zmesi organických kyselín octovej, kaprónovej, mravþej, butyrovej a valérovej, ktoré pri pokuse javili vzájomný synergistický úþinok v inhibícií plesní. Z baktérií mlieþneho kysnutia sa najviac štúdií, na potlaþenie rastu plesní, zabýva kmeĖmi rodu Lactobacillus a rodu Lactococcus. Nedávno boli objavené nové antimikrobiálne aktivity vo filtráte kultúry Lbc. plantarum aktívny i proti plesniam ako F. avenaceum. Ćalšie pokusy boli uskutoþnené s baktériou Lbc. coryniformis subsp. coryniformis. Kde autori pripisujú ochranný úþinok kyseline mlieþnej, octovej, peroxidu vodíka a produkcii bakteriocínov. Baktérie mlieþneho kysnutia taktiež produkujú nízkomolekulárne zlúþeniny2, peptidy3 a proteíny4 s antifungálnymi vlastnosĢami. V súþasnosti sa mnoho nevie o tom ako tieto látky pôsobia na rast plesní. Niektoré baktérie produkujú prchajúce metabolity, ktoré môžu pôsobiĢ na rast a sporuláciu plesní5. Ciele práce CieĐom práce je príprava doplnkových zmesných laktobacilových kultúr pri výrobe výrobkov obsahujúcich mlieþnu a cereálnu zložku. Snaha je vyrobiĢ výrobok obsahujúci protektívnu kultúru, ktorá by inhibovala úþinok možných vyskytujúcich sa plesní. Bolo vybraných desaĢ bakteriálnych kmeĖov kmeĖov izolovaných z rôznych zdrojov, päĢ pochádzalo od þeského riešiteĐa a päĢ od maćarského spoluriešiteĐa. U týchto kmeĖov bola sledovaná fermentácia troch médií (MRS bujón, obnovené odstredené mlieko a artiþokové médium) metódou merania aktívnej a titraþnej kyslosti, produkcia organických kyselín pomocou izotachoforézy, produkcia peroxidu vodíka a produkcia histamínu ELISA metódou. Ćalej sa sledovala antifungálna aktivita kmeĖov rodu Lactobacillus proti plesniam rodu Fusarium a Aspergillus metódou dvojitých agarových platní a to použitím živých bakteriálnych buniek alebo supernatantu po kultivácii laktobacilových kmeĖov v MRS bujóne. V ćalšej þasti práce sme sledovali vplyv laktobacilov na rast plesní a tvorbu aflatoxínu B1 v tekutom médiu pri spoloþnej kultivácii po dobu 20-tich dní pri 30 °C. Boli použité dva kmene plesní, Asp. flavus DMF 0802 a Asp. parasiticus DMF 0805. Rast plesní bol sledovaný metódou váženia mycélia. Získané hodnoty hmotnosti mycélia sa prepoþítali ako prírastok, resp. úbytok, hmotnosti mycélia vzhĐadom ku kontrole. Z filtrátu získaného po kultivácií sa následne izoloval, pomocou imunoafinitnej kolóny, aflatoxín B1 a jeho koncentrácia sa stanovila metódou HPLC.

67

Mikroorganizmy bakteriálne kmene Bakteriálne kmene Lbc. plantarum 01, Lbc. paracasei 05, Lbc. casei 154, Lbc. paracasei SF1, Lbc. rhamnosus VT1 použité v práci pochádzajú zo Zbierky baktérií, plesní a kvasiniek z Ústavu technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha, ýeská republika. Bakteriálne kmene Lbc. plantarum 2142, Lbc. casei 2750, Lbc. curvatus 2768, Lbc. curvatus 2775, Lbc. casei Shirota použité v práci pochádzajú od maćarského spoluriešiteĐa Central Food Research Institute, Budapest, Hungary. kmene plesní Kmene plesní F. proliferatum M 5689, Asp. flavus DMF 0802, Asp. parasiticus DMF 0805 použité v práci pochádzajú zo Zbierky baktérií, plesní a kvasiniek z Ústavu technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha, ýeská republika. A kmene plesní F. culmorum 301, F. culmorum 302, F. graminearum 608 pochádzajú z Výzkumného ústavu rostlinné výroby, OddČlení šlechtitelských metod, Praha, ýeská republika. Výsledky Sledovanie fermentácie média metódou merania aktívnej a titraþnej kyslosti Meraním aktívnej a titraþnej kyslosti po kultivácií kmeĖov v médiach sa zistilo, že najlepšia fermentácia sa dosiahla po kultivácií v MRS bujóne (pH 3,7-4,1; 74,8-48,0 oSH). K horšiemu prekysávaniu dochádzalo po kultivácií kmeĖov v artiþokovom médiu (pH 3,8-4,1; 30,2-15,0 oSH). V odstredenom mlieku bola fermentácia najslabšia (pH 5,5-6,2; 16,5-10,2 oSH). Vo všetkých médiach bola nameraná najvyššia titraþná kyslosĢ u kmeĖa Lbc. casei Shirota a najnižšia u kmeĖa Lbc. rhamnosus VT1. Bolo možné sledovaĢ odlišnosti v hodnotách aktívnej a titraþnej kyslosti medzi kultivaþnými médiami, u všetkých kmeĖov kultivovaných v príslušnom médiu. Z výsledkov vyplýva, že všetky testované kmene najlepšie rástli v komplexnom médiu. Produkcia peroxidu vodíka Najvyššia produkcia, po kultivácií v MRS bujóne, bola nameraná u kmeĖov Lbc. curvatus 2775 (7,5 ȝg/ml), Lbc. casei 2750 (6,9 ȝg/ml), Lbc. paracasei SF1 (3,8 ȝg/ml) a Lbc. paracasei 05 (2,5 ȝg/ml). U ostatných kmeĖov bola nameraná koncentrácia peroxidu vodíka menej ako 2 ȝg/ml. Po kultivácií v odstredenom mlieku najviac peroxidu vodíka produkoval kmeĖ Lbc. casei Shirota (4,83 ȝg/ml), a ostatné kmene naprodukovali menej ako 2 ȝg/ml. Po kultivácií kmeĖov v artiþokovom médiu ani jeden kmeĖ nevyprodukoval viac než 2 ȝg/ml peroxidu vodíku. Enzymaticko imunochemická kvantitatívna analýza histamínu Produkcia histamínu bola sledovaná vo všetkých médiach. Produkcia histamínu bola preukázaná iba po kultivácií kmeĖa Lbc. casei 2750 v MRS bujóne a v artiþokovom médiu, a to o koncentrácii 87,5 ȝg/ml resp. 4 ȝg/ml. Ostatné kmene za daných podmienok histamín neprodukovali. Meranie produkcie organických kyselín metódou izotachoforéza Po fermentácii boli média použité pre urþenie kvalitativného a kvantitativného zastúpenia organických kyselín. Koncentrácie naprodukovaných kyselín boli rozdielne v závislosti na použitom médiu a kmeni. V MRS bujóne produkovali všetky kmene kyselinu mlieþnu (400 až 851 mM/l), bez dvoch kmeĖov (Lbc. curvatus 2768 a Lbc. casei Shirota) kyselinu octovú (25 až 150 mM/l). V obnovenom odstredenom mlieku bola kyselina mlieþna naprodukovaná v koncentráciach 13 až 127 mM/l, kyselinu octovú produkovalo len šesĢ kmeĖov v rozmedzí 8 až 100 mM/l. V artiþokovom médiu kyselina mlieþna dosiahla koncentrácie 110 až 337 mM/l, kyselina octová, ktorá bola produkovaná všetkými kmeĖmi okrem Lbc. paracasei SF1, sa pohybovala v rozmedzí 9 až 180 mM/l. Na základe pomeru dosiahnutých koncentrácií kyseliny mlieþnej a octovej je možné urþiĢ homofermentatívny alebo heterofermentatívny priebeh fermentácie príslušnými bakteriálnymi kmeĖmi v jednotlivých médiach (Tab. I). 68

TabuĐka I Homofermentatívny alebo heterofermentívny priebeh fermentácie jednotlivých kmeĖov rodu Lactobacillus v rozdielnych médiach na základe dosiahnutých koncentrácii kys. mlieþnej a octovej. kys.mlieþna/kys.octová >8 kys.mlieþna/kys.octová <8 Homofermentatívny / Heterofermentatívny MRS bujón Mlieko JA bujón O1 O1 O1 O5 O5 O5 154 154 154 SF1 SF1 SF1 VT1 VT1 VT1 2142 2142 2142 2750 2750 2750 2768 2768 2768 2775 2775 2775 Shirota Shirota Shirota

Stanovenie antifungálnej aktivity metódou dvojitých agarových platní použitím živých buniek a supernatantu Najvyššia aktivita buniek bola zistená u kmeĖov Lbc. curvatus 2775 a Lbc. curvatus 2768, ktoré inhibovaly rast všetkých plesní. Najcitlivejšie boli kmene F. culmorum 302 a Asp. flavus DMF 0802, ktorých rast bol potlaþený bunkami všetkých bakteriálnych kmeĖov. V prípade aktivity supernatantu boli najúþinnejšie kmene Lbc. paracasei 05 a Lbc. curvatus 2768. Pri pôsobení supernatantu bol najviac potlaþený rast F. culmorum 301, F. graminearum 608 a Asp. flavus DMF 0802 (Tab. II).

TabuĐka II Inhibiþný úþinok laktobacilov proti plesniam rodu Fusarium a rodu Aspergillus. kmeĖ 01 05 154 SF1 VT1 2142 2750 2768 2775 Shirota

F. culmorum 301

F. culmorum 302

F. proliferatum M 5689

F. graminearum 608

Asp. flavus DMF 0802

Asp. parasiticus DMF 0805

+/+ +/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

+/+/+ +/+/+ +/+ +/+ +/+/+ +/+ +/+

-/-/+ +/+ -/+/+/+ -/+/+ +/+ +/-

+/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/+ +/+ +/+ +/+ -/+

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

-/-/+ -/+ -/+ -/-/-/+ +/+ +/-/+

aktivita živých buniek / aktivita supernatantu

69

+ ... inhibícia, - ... žiadna inhibícia

Antifungálna aktivita jednotlivých kmeĖov rodu Lactobacillus sa prisudzuje tvorbe organických kyselín, peroxidu vodíka, tvorbe bakteriocínu a ćalších metabolitov. Zo získaných výsledkov (tab. I), ak bol inhibiþný úþinok len v prípade použitia živých buniek (+/-) usudzujeme, že antifungálny úþinok, na rast plesní, bol spojený s tvorbou a následným pôsobením organických kyselín. Ak bola aktivita len v prípade použitia supernatantu (-/+) usudzujeme, že inhibiþný úþinok nenastáva vplyvom organických kyselín, kećže sa supernatant neutralizuje a tepelne ošetruje, ale pravdepodobne pôsobením naprodukovaných látok s antifungálnou aktivitou (nízko molekulárne a tepelne stabilné zlúþeniny, bakteriocíny), ktoré sú v dostatoþnom množstve na zaþiatku rastu sledovanej plesne, a tým pádom dochádza k inhibiþnému úþinku. Inhibiþný efekt sa na miskách prejavoval tvorbou inhibiþnej zóny okolo kolónie živých buniek alebo okolo korkovrtu s difundovaným supernatantom, a to úplným potlaþením rastu plesne alebo degradáciou mycélia a zamedzením sporulácie. Sledovanie inhibície laktobacilov na rast plesní a produkciu aflatoxínu B1 poþas spoloþnej kultivácie v tekutom médiu V ćalšej þasti práce sme sledovali vplyv laktobacilov na rast plesní a tvorbu aflatoxínu B1 v tekutom médiu pri spoloþnej kultivácii po dobu 20-tich dní pri 30°C. Boli použité dva kmene plesní, Asp. flavus DMF 0802 a Asp. parasiticus DMF 0805. Rast plesní bol sledovaný metódou váženia mycélia. Po spoloþnej kultivácii sa médium v príslušných dĖoch sledovania prefiltrovalo. Získané hodnoty hmotnosti mycélia sa prepoþítali ako prírastok, resp. úbytok, hmotnosti mycélia vzhĐadom ku kontrole. Výsledky sú znázornené graficky (obr.1., 2.). Aspergillus flavus DMF 0802

kontrola

hmotnosĢ mycélia (%)

125

01 05 154

100

SF1 VT1 75

2142 2750 2768

50 5

8

14

20

þas (deĖ)

2775 Shirota

Obr. 1. Zmeny hmotnosti mycélia, oproti kontrole, Asp. flavus DMF 0802 v prítomnosti jednotlivých kmeĖov rodu Lactobacillus v priebehu spoloþnej kultivácie v tekutom médiu. Aspergillus parasiticus DMF 0805

kontrola

hm otnosĢ m ycélia (% )

250

01 05

200

154

150

SF1 VT1

100

2142 50

2750 2768

0 5

8

14

þas (deĖ)

20

2775 Shirota

Obr. 2. Zmeny hmotnosti mycélia, oproti kontrole, Asp. parasiticus DMF 0805 v prítomnosti jednotlivých kmeĖov rodu Lactobacillus v priebehu spoloþnej kultivácie v tekutom médiu. 70

Z filtrátu získaného po kultivácií sa následne izoloval, pomocou imunoafinitnej kolóny, aflatoxín B1 (AFB1) a jeho koncentrácia sa stanovila metódou HPLC. Pri spoloþnej kultivácii kmeĖa Asp. flavus DMF 0802 s laktobacilmi nedochádzalo k tvorbe aflatoxínu na rozdiel od prípadu kultivácie Asp. parasiticus DMF 0805, kde sme stanovili príslušné koncentrácie aflatoxínu B1 v priebehu 20-tich dní sledovania. Produkcia aflatoxínu B1 u kmeĖa Asp. parasiticus DMF 0805 bola zaznamenaná už po 5. dĖoch spoloþnej kultivácie v prítomnosti bakteriálnych kmeĖov Lbc. paracasei 05, Lbc. casei 154 a Lbc. paracasei SF1 o koncentrácii približne 0,025 ȝg/ml. Po 8. dni kultivácie bola koncentrácia aflatoxínu B1 v rozmedzí 0,02-0,2 μg/ml, v prítomnosti všetkých bakteriálnych kmeĖov okrem kmeĖa Lbc. rhamnosus VT1. V ćalších dĖoch kultivácie koncentrácia aflatoxínu B1 postupne klesala, len v prípade prítomnosti kmeĖa Lbc. casei 2750 bola koncentrácia po 20. dni kultivácie rovná 0,167 μg/ml. Získané výsledky poukazujú na to, že v prítomnosti laktobacilov nastala produkcia aflatoxínu B1 kmeĖom Asp. parasiticus DMF 0805 vzhĐadom ku kontrole, u ktorej nedochádzalo k produkcii AFB1. Ale na druhej strane, v ćalších dĖoch kultivácie sa koncentrácia AFB1 znižovala, þo mohlo byĢ spôsobené práve prítomnosĢou bakteriálnych buniek kmeĖov rodu Lactobacillus. Diskusia Dôležitou charakteristikou kmeĖov baktérii mlieþneho kysnutia je schopnosĢ rastu v komplexnom médiu a pre mliekarenský priemysel je najdôležitejšou vlastnosĢou schopnosĢ rastu v mlieku. Významným znakom kmeĖov, ktoré sa využívajú pri výrobe fermentovaných mlieþnych výrobkov, je produkcia organických kyselín. V mliekarenstve sa homofermentatívne kmene používajú pri výrobe syrov. Niektoré druhy sa používajú pri výrobe mlieþnych výrobkov, slúžia k priemyselnej výrobe kyseliny mlieþnej z melasy, pretože fermentujú laktózu. Lactobacillus plantarum našel uplatnenie pri konzervácii uhoriek a kapusty, je taktiež súþasĢou kefírových zĚn a spolu s Lactobacillus brevis a Lactobacillus fermentum sa vyskytuje v pekárskom kvásku6,7,8. V posledných rokoch sa skúma využitie laktobacilov k ochrane cereálnych výrobkov. Jedná sa hlavne o využitie kmeĖov vyizolovaných z kvásku, ako napr. Lactobacillus plantarum alebo využitie kmeĖa s potvrdenou antifungálnou aktivitou Lactobacillus rhmanosus VT19. Niektoré baktérie mlieþneho kysnutia produkujú antibakteriálne, ale i antifungálne látky. Tieto látky sa dajú využiĢ ako prírodné konzervanty a mohli by predĎžiĢ skladovateĐnosĢ potravín. Jedná sa o rôznorodé látky, ale dominantné postavenie majú organické kyseliny2. Všeobecne uznávanou konzervaþnou látkou je kyselina octová, pretože inhibuje rast gram-pozitívnych a gram-negatívnych baktérii, ale taktiež aj plesní. Medzi obligátne heterofermentatívne kmene laktobacilov, ktoré produkujú antifungálne látky patrí Lbc. sanfrancisco CB1, ktorý bol vyizolovaný z kvásku. Tento kmeĖ produkoval široké spektrum organických kyselín s antifungálnou aktivitou. Medzi ne patrí kyselina octová a kapronová, ktoré inhibujú rast plesne F. graminearum10. Z Lbc. plantarum MiLAB 393 bola okrem cyklických dipeptidov vyizolovaná kyselina 3-fenylmléþná s pomerom L(+) a D(-) 9:1. Toto spektrum látok pôsobilo inhibiþne proti F. sporotrichioides a Asp. fumigatus11. Existujú tiež laktobacily, ktoré produkujú organické kyseliny na báze mastných kyselín. Okrem mastných kyselín sú tiež niektorými kmeĖmi produkované i estery mastných kyselín. Konkrétne z Lbc. rhamnosus VT1 sa vyizolovali methylestery a 2-methyl-5hydroxyhexanová kyselina12. Nesmieme však zabudnúĢ zohĐadniĢ vplyv okolitých podmienok, ako je doba a teplota inkubácie, pH a kmeĖ. Preukázalo sa, že inhibícia plesní nie je spôsobená iba produkciou organických kyselín, ale i okolitými podmienkami13. Nedávno bolo objavené, že Lbc. coryniformis Si3 môže produkovaĢ antifungálne látky na základe bielkovín4. Taktiež boli identifikované antifungálne cyklické dipeptidy z Lbc. plantarum izolovaného zo siláže11. BMK spôsobia nielen na rast plesní, ale aj na tvorbu mykotoxínov. Existujú dve teórie ako dochádza k odstráneniu mykotoxínov z vodného média v prítomnosti baktérii mlieþneho kysnutia. Prvou je vplyv štruktúr v bunkovej stene, kedy dôjde k naviazaniu mykotoxínu na bunkovú stenu a tým dôjde k jeho inaktivácii. Druhý prístup predpokladá, že k odstráneniu dôjde produkciou niektorých antimikrobiálnych metabolitov BMK. V poslednej dobe sa pozornosĢ sústrećuje na 3 hlavné body: a) väzba lactobacillus-mykotoxin; b) stabilita vzniknutého komplexu; c) vplyv inkubaþného þasu 71

na väzbu toxínu14. Rast Asp. parasiticus sledovaný vážením suchého mycélia bol spoþiatku veĐmi rýchly v zmesnej kultúre, než keć pleseĖ rástla samotná, ale nárast plesne na konci inkubácie bol porovnateĐný v obidvoch kultivovaných kultúrach. Je to možné tým, že bakteriálne metabolity môžu stimulovaĢ rast plesne v poþiatoþnej fáze inkubácie15. Viac ako 2% hm. kyseliny mlieþnej prítomnej v médiu nepodporoval len rast Asp. parasiticus, ale urþitá koncentrácia stimulovala biosyntézu aflatoxínu16. Efekt mlieþnanu sodného na produkciu aflatoxínu je funkciou poþiatoþného pH. Nedisociované organické karboxylové kyseliny, než ich ionizovaná forma, majú sklon byĢ transportované cez bunkové membrány a spomaliĢ alebo zvýšiĢ metabolizmus bunky. Preto pH blízke neutrálnemu je nepriaznivé pre kyselinu mlieþnu transportujúcu sa cez membránu a to môže byĢ dôvod preþo tieto zložky stimulujú produkciu aflatoxínu17. Záver x Na základe meraní aktívnej a titraþnej kyslosti, peroxidu vodíka, histamínu a organických kyselín sa zistil výrazný vplyv použitého kultivaþného média x Najvyššia aktivita buniek bola zistená u kmeĖov Lbc. curvatus 2775 a Lbc. curvatus 2768, ktoré inhibovaly rast všetkých plesní. V prípade aktivity supernatantu boli najúþinnejšie kmene Lbc. paracasei 05 a Lbc. curvatus 2768 x PrítomnosĢ laktobacilov má znaþný vplyv na rast a produkciu aflatoxínu B1, þo sa zistilo v priebehu spoloþnej kultivácie v tekutom médiu x Z uskutoþnených pokusov boli získané pozitívne výsledky, ktoré sa dajú v budúcnosti zohĐadniĢ pri príprave doplnkových zmesných laktobacilových kultúr pre výrobu produktov obsahujúcich mlieþnu a cereálnu zložku. Poćakovanie Táto práca vznikla s podporou výskumného zámeru CEZ: MSM 6046137305 a projektu CZ – HU 5/2004. Autor ćalej ćakuje Mgr. SvČtlane Sýkorovej CSc. za poskytnutie kmeĖov plesní rodu Fusarium. Literatúra 1. SCHNÜRER J., MAGNUSSON J. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends Food Sci. Technol., 2005, vol. 16, pp. 70-78.

2. NIKU-PAAVOLA M. L., LAITILA A., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol.,1999, vol. 86, pp. 29-35.

3. OKKERS D. J., DICKS L. M. T., SILVESTER M., JOUBERT J. J., ODENDAAL H. J. Characterization of pentocin TV35b a bacteriocin like peptide isolated from Lactobacillus pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans. J. Appl. Microbiol., 1999, vol. 87, pp. 726-734.

4. MAGNUSSON J., SCHNÜRER J. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad spectrum proteinaceous antifungal compound. Appl. Environ. Microbiol., 2001, vol. 67, pp. 1-5.

5. WISEMAN D. W., MARTH E. H. Growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus when in the presence of Streptococcus lactis. Mycopathologia, 1981, vol. 73, pp. 49-56.

6. GOBETTI M., CORSETTI J. Lactobacillus sanfrancisco a key sourdough lactic acid bacterium: a review. Food Microbiol., 1997, vol. 14, pp. 175 – 187.

7. ŠILHÁNKOVÁ L. Mikrobiologie, str. 57 – 60, 297, 303 – 304, Victoria Publishing, Praha 2002. 8. LAVERMICOCCA P., VALERIO F., VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products. Appl. Environ. Microbiol., 2003, vol. 69, pp. 634 – 640.

9. LAITILA A., ALAKOMI H-L., RAASKA L., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro nad in malting of barley. J. Appl. Microbiol., 2002, vol. 93, pp. 566 – 576.

10. CORSETTI A., GOBETTI M., ROSSI J., DAMINIANI P. Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of mixture of organic acids by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Appl. Microbiol.

72

Biotechnol., 1998, vol. 50, pp. 253-256.

11. STRÖM K., SJÖGREN J., BROBERG A., SCHNÜRER J. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro) and 3-Phenyllactic acid. Appl. Environ. Mocrobiol., 2002, vol. 68, pp. 4322-4327.

12. PETRÁKOVÁ H. Diplomová práce, VŠCHT, Praha, 2002 13. GOURAMA H., BULLERMAN L. B. Anti-aflatoxigenic activity of Lactobacillus casei pseudoplantarum. Int. J. Food Microbiol., 1997, vol. 34, pp. 131 – 143.

14. PELTONEN K., EL-NEZAMI H. S., HASKARD C. A., AHOKAS J., SALMINEN S. Aflatoxin B1 binding by dairy strains of lactic acid bacteria and bifidobacteria. Journal of Dairy Science, 2001, vol. 84, no. 10, pp. 2152-2156.

15. EL-GENDY S. M., MARTH E. H. Growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus in the presence of Lactobacillus casei. Journal of Food Protection, 1980, vol. 44, pp. 211-212.

16. EL-GAZZAR F. E., RUSUL G., MARTH E. H. Growth and aflatoxin prodution by Aspergillus parasiticus NRRL 2999 in the presence of lactic acid and at different initial pH values. Journal of Food Protection, 1987, vol. 50, pp. 940-944.

17. LUCHESE R. H., HARRIGAN W. F. Growth of, and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus when in the presence of either Lactococcus lactis or lactic acid and at different initial pH values. Journal of Applied Bacteriology, 1990, vol. 69, pp. 512-519.

Kontaktná adresa Jaroslav Hudáþek ([email protected]), VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha 6

73

Plakátová sdČlení

ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA A BUNċýNÁ LYSE KMENģ LACTOCOCCUS LACTIS Abrlová Magdaléna, Šviráková Eva, Hlavsová Barbora, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Basic characterization and cell lysis of Lactococcus lactis strains Summary: This work was aimed at basic phenotypical characterizations and lytic abilities of Lactococcus lactis strains (NIZO R5, NIZO B643, HMM 81 and AM2) in different media. All strains were specified as Lactococcus lactis subsp. lactis on the base of phenotypical characterizations (pH tolerance (9.2, 9.6), NaCl tolerance (2; 4 a 6,5 % w/w), methylen blue tolerance (0.1 % w/w), arginine hydrolysis, citrate fermentation, nisin production, MICnisin), although the AM2 strain was kept as Lactococcus lactis subsp. cremoris in world microbiological collections. Lytic abilities of lactococci were measured in citrate buffer at the temperature 13°C after 12 days. Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO B643 was located as medium lytic strain (cell lysis was from 10 till 30 %) and Lactococcus lactis strains (NIZO R5, HMM 81 and AM2) were located as highly lytic strains (cell lysis were more than 30 %). No prophage was released in Lactococcus lactis AM2 during assignment of presence of thermo-inducible prophage in lactococal strains (in LM17 broth at the temperature 30 and 39 °C after 8 h). Also Lactococcus lactis strains (NIZO R5, NIZO B643 and HMM 81) were non-lytic on condition of this method.

Úvod BunČþná lyse je dĤsledkem enzymatické degradace peptidoglykanĤ bunČþné stČny bakterií endogenními peptidovými hydrolasami – lysiny. Dochází k ní jak u grampositivních, tak u gramnegativních bakterií. Probíhá se za podmínek, které vedou k zastavení syntézy peptidoglykanĤ (napĜíklad pĜi hladovČní nebo jiných nepĜíznivých podmínkách v buĖkách. Bakterie mléþného kvašení, u nichž dochází k bunČþné lysi lze použít jako starterové kultury, napĜ. pĜi fermentaci mléka. ěízení a zvyšování lyse bakterií mléþného kvašení je nezbytným faktorem pĜi kontrole a urychlení zrání sýrĤ. Bakterie mléþného kvašení produkují intracelulární enzymy (peptidasy, lipasy a enzymy pro metabolismus aminokyselin), které hrají klíþovou roli pĜi vývoji aroma bČhem zrání sýrĤ [1]. Cíle práce Cílem této práce bylo zjistit: • základní fenotypickou charakteristiku laktokokĤ • autolysu laktokokĤ v citrátovém pufru • prokázat uvolnČní termoindukovatelného profága u laktokokĤ. Materiál a metody Použité kmeny x Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO B 643 (National Collection of Dairy Organisms, Reading, Velká Británie) x Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 (University College Cork, Irsko) x Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO R5 (Netherlands Institute for Dairy Research, Department of Biophysical Chemistry and Genetics, Ede, Nizozemí) x Lactococcus lactis subsp. lactis HMM 81 (Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, ýeská republika). Fenotypizace laktokokĤ Mezi základní fenotypické charakteristiky laktokokových kmenĤ patĜily: rĤst pĜi pH 9,2 a 9,6; tolerance k NaCl (2; 4 a 6,5 % hm.), tolerance k methylenové modĜi (0,1 % hm.) v mléce, hydrolysa argininu, fermentace citrátĤ, produkce nisinu a MICnisinu).

77

Lyse laktokokĤ v citrátovém pufru BČhem 12 denní kultivace laktokokĤ v citrátovém pufru pĜi teplotČ 13 °C byla mČĜena absorbance (A650). Procento bunČþné lyse bylo vypoþítáno podle rovnice 1: [(A0 - At)/A0] · 100 (rovnice 1), kde A0 je poþáteþní absorbance a At je absorbance mČĜená v þase t [1]. DĤkaz pĜítomnosti termoindukovatelného profága Pro uvolnČní termoindukovatelného profága, který zpĤsobuje bunČþnou lysi laktokokĤ za zvýšené teploty, byla použita kultivace laktokokĤ v bujónu LM17 pĜi teplotách 30 a 39 °C. Je-li profág pĜítomen, projeví se lysí bunČk kultivovaných pĜi vyšší teplotČ. Teplota 39 °C odpovídá poþáteþní fázi výroby sýrĤ typu ýedar, tzv. þedarování [3]. Výsledky Fenotypizace laktokokĤ Tabulka I Fenotypické vlastnosti kmenĤ Lactococcus lactis Tolerance k pH

Tolerance k NaCl [% hm.]

9,2

9,6

2

4

6,5

Tolerance k met. modĜi [0,1 % hm.]

NIZO R5

+

-

+

+

+

+

HMM 81

+

-

+

+

-

+

NIZO B 643

+

-

+

+

-

+

AM2

+

+

+

+

+

+

Kmen L.lactis

+/-…positivní/negativní reakce

Tabulka II Další fenotypické vlastnosti kmenĤ Lactococcus lactis Kmen L.lactis Fermentace citrátĤ Hydrolýza argininu

Produkce nisinu [IU·ml-1]

MICnisinu [IU·ml-1]

NIZO R5

+

+

330

500

HMM 81

+

+

0

50

NIZO B 643

+

+

0

10

AM2

+

+

0

10

+/-…positivní/negativní reakce

78

Autolysa laktokokĤ 2,5

absorbance (-)

2,0

1,5 HMM81 B643 AM2 1,0

0,5

0,0 0

2

6

8

12

þas (den)

Obr. 1. PrĤbČh lyse kmenĤ L. lactis v citrátovém pufru pĜi teplotČ 13 °C bČhem 12 dnĤ. Tabulka III Lyse laktokokĤ v citrátovém pufru pĜi teplotČ 13 °C za 12 dní Kmen L. lactis

BunČþná lyse [%]

NIZO R5

38

HMM 81

44

NIZO B 643

26

AM 2

36

UvolnČní termoindukovatelného profága z laktokokĤ 2,5

absorbance (-)

2,0

1,5 AM2 AM2

t=30°C t=39°C

1,0

0,5

0,0 0

1

2

3

4

5

6

7

þas (h)

Obr. 2. UvolnČní termoindukovatelného profága z laktokokĤ pĜi teplotách 30 a 39 °C. 79

ZávČry • Kmeny Lactococcus lactis vykazovaly obvyklý fenotypický projev. Kmen Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 se jevil jako poddruh lactis. • Autolysy laktokokĤ se v citrátovém pufru lišily. Kmeny Lactococcus lactis (HMM 81, NIZO R5 a AM2) byly vysoce lytické, kmen Lactococcus lactis NIZO R5 se jevil jako stĜednČ lytický. • K uvolnČní termoindukovatelného profága a k lysi bunČk u kmene Lactococcus lactis subsp. lactis AM2 za podmínek použité metody nedošlo. PodČkování Tato práce byla podpoĜena Ministerstvem školství, mládeže a tČlovýchovy ýeské republiky (výzkumný zámČr MSM 6046137305). Literatura 1. Lortal S., Chapot-Chartier M.-P.: Role, mechanism and control of lactic acid bacteria in cheese. Int. Dairy J. 15, 857 - 871 (2005). 2. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V.: Simple tests for predicting lytic behavior of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81, 2321 - 2328 (1998). 3. O‘Sullivan, D., Ross, R. P., Fitzgerald, G. F., Coffey, A.: Investigation of the relation between lysogeny and lysis of Lactococcus lactis in cheese using prophage – targeted PCR. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2192 - 2198 (2000). Kontaktní adresa Magdaléna Abrlová, [email protected]

80

CHARAKTERIZÁCIA RASTU LACTOBACILLUS RHAMNOSUS GG V MLIEKU Medvećová Alžbeta, Valík ďubomír, Liptáková Denisa, Bajúsová Barbora Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave Characterization of growth of the Lactobacillus rhamnosus GG in milk Summary: Growth of L. rhamnosus GG in terms of growth rate and lag phase was described in temperature range from 6 °C to 50 °C. Lag-phase duration of L. rhamnosus increased with decreasing of incubation temperature under the equation 1/lag = 0.0006T2 – 0.0003T + 0.0331 (R2lag = 0.9876). Growth rate was significantly positively related to increase of incubation temperature in accordance with the Ratkowsky´s model: ¥Gr = 0.0235T – 0.0191 (R2Gr = 0.9963) as well as modified Arrhenius model acording to Davey: lnGr = -5.3166 + 0.2472T – 0.003T2 (R2Gr = 0.9964). Based on this equations, optimal temperature Topt = 40.5 to 41.1 °C for growth and metabolism was calculated. The results found in this work may contribute to the information sources that are needed in selection and application of probiotics in dairy industry.

Lactobacillus rhamnosus GG patrí medzi grampozitívne, fakultatívne anaeróbne alebo mikroaerofilné, nepohyblivé, paliþkovité, katalázo-negatívne, nespórotvorné baktérie. Pre svoj rast vyžaduje riboflavín, kyselinu folovú, vápnik, pantotén a nicín (2). Dobre rastie v slabokyslých médiách s poþiatoþnou hodnotou pH 6,4 až 4,5. Patrí k mezofilným mikroorganizmom, ale v závislosti od kmeĖa dokáže rásĢ pri teplotách nad 40 °C a aj pri teplotách nižších ako 15 °C. Hexózy fermentuje výluþne na L(+) kyselinu mlieþnu podĐa Embden-Meyerhofovej dráhy. Pentózy fermentuje vćaka tvorbe aldolázy a fosfoketolázy. Pri nedostatku glukózy fermentuje hexózy na kyselinu mlieþnu, kyselinu octovú, etanol a kyselinu mravþiu (4). L. rhamnosus nie je schopný fermentovaĢ laktózu a rafinózu. Dokáže ale fermentovaĢ galaktózu, maltózu, sacharózu, manitol, ramnózu, glukózu, manózu, ribózu, fruktózu a sorbitol. Okrem toho je schopný fermentovaĢ látky ako sú amygdalín, celobióza, eskutín, glukonáty a melezitóza (2, 7). Bunky Lactobacillus rhamnosus majú paliþkovitý tvar, rastú buć samostatne alebo v krátkych retiazkach. Majú sploštené konce a ich rozmery sú 0,8 až 1,0 x 2,0 až 4,0 μm (9). PozornosĢ mliekarenských technológov a mikrobiológov sa sústrećuje hlavne na jeho probiotické vlastnosti a antimikrobiálnu aktivitu voþi kontaminujúcim mikroorganizmom. Tieto vlastnosti sa komerþne používajú vo forme ochranných kultúr aplikovaných do fermentovaných a aj nefermentovaných mlieþnych výrobkov, ovocných nápojov, syrov, šalátov a na fermentáciu suchých salám na potlaþenie rastu Staphylococcus aureus (3, 7, 8). CieĐom našej práce bolo popísaĢ dynamiku rastu Lactobacillus rhamnosus GG v UHT mlieku v závislosti od teploty inkubácie. Materiál a metódy KmeĖ Lactobacillus rhamnosus GG pochádza od fínskych mikrobiológov Ouwehanda a Salminena a s ich vedomím nám ho poskytla Dr. Lauková zo Štátneho veterinárneho ústavu v Košiciach. Paralelne naoþkované vzorky UHT mlieka štandardnou 18h kultúrou L. rhamnosus sa inkubovali pri teplotách v rozmedzí od 6 do 50 °C. V príslušne stanovených þasových intervaloch sa odoberali množstvá vzorky potrebné na stanovenie poþtu L. rhamnosus GG (MRS agar; Biomark, Pune, India). Poþty L. rhamnosus GG boli vyhodnotené v závislosti od þasu inkubácie podĐa Baranyiho modelu (1). Rastové parametre z príslušných rastových þiar boli podrobené analýze v sekundárnej fáze matematického modelovania mikrobiálneho rastu.

81

Výsledky a diskusia Výsledky pokusov z paralelne vykonaných kultivaþných stanovení poþtov L. rhamnosus GG v UHT mlieku sú uvedené na obr. 1 a 2. Pre lepšiu názornosĢ sú na obr. 1 znázornené rastové þiary L. rhamnosus GG pri teplotách 6, 8, 12, 15 a 18 °C a na obr. 2 sú rastové þiary pri teplotách 21, 30, 35 a 41 °C. Znázornené hodnoty pH mlieka, v pozadí rastových þiar, sa poþas trvania všetkých pokusov prakticky nemenili. Dôvodom môže byĢ skutoþnosĢ, že Lactobacillus rhamnosus GG nie je schopný utilizovaĢ laktózu a ani konvertovaĢ kyselinu pyrohroznovú na kyselinu mlieþnu takou rýchlosĢou akou prebieha glykolýza, a preto kyselinu pyrohroznovú pravdepodobne odbúrava na metabolity ako acetoín, diacetyl alebo acetát (5). 9 8

log KTJ.ml-1

7 6 5 LGG_6 LGG_8

4

LGG_12 LGG_15

3

LGG_18 pH

2 0

24

48

72

96

120

144 168

192

216 240

264

t [h]

Obr. 1. Dynamika rastu kultúry L. rhamnosus GG a hodnoty pH v mlieku v závislosti od teploty inkubácie 9 8

log KTJ.ml-1

7 6 5

LGG_21 LGG_30

4

LGG_35 LGG_41

3

pH 2 0

3

6

9

12

15 18 t [h]

21

24

27

30

33

Obr. 2. Dynamika rastu kultúry L. rhamnosus GG a hodnoty pH v mlieku v závislosti od teploty inkubácie 82

Napriek tomuto nedostatku vykazoval L. rhamnosus GG dobrý rast a v stacionárnej fáze dosiahol poþty vyššie ako 108 KTJ/ml pri všetkých inkubaþných teplotách, okrem okrajových teplôt 6, 8 a 50 °C. Je zaujímavé, že hoci pomaly, ale rástol aj pri teplote 6 °C, kedy po 10 dĖoch inkubácie rástol v exponenciálnej fáze. So zvyšujúcou sa teplotou inkubácie sa skracoval þas trvania lag-fázy a rýchlosĢ rastu v exponenciálnej fáze sa zvyšovala. Najkratší þas potrebný na dosiahnutie stacionárnej fázy bol zaznamenaný pri teplote 41 °C (9h), so zvyšujúcou sa teplotou sa táto doba zaþala predlžovaĢ a to naznaþuje, že teplota 41 °C by mohla byĢ optimálnou teplotou pre rast L. rhamnosus GG. Pre potvrdenie tohto predpokladu sme namerané rastové parametre podrobili ćalšej analýze. Vplyv teploty na rastovú rýchlosĢ Lactobacillus rhamnosus GG Vplyv teploty na rastovú rýchlosĢ mikroorganizmov v oblasti suboptimálnych teplôt sa þasto popisuje Ratkowského odmocninovým modelom, ktorý linearizuje závislosĢ medzi rastovou rýchlosĢou a teplotou inkubácie. Pre charakterizáciu rastu študovaného kmeĖa je preto potrebné urþiĢ koeficienty týchto všeobecne platných vzĢahov. Na ich základe je potom s definovanou pravdepodobnosĢou omylu možné vypoþítaĢ rastovú rýchlosĢ, resp. predpovedaĢ rast v podobnom prostredí vzhĐadom na teplotu inkubácie bez potreby vykonávaĢ ćalšie experimenty. V našom prípade bola závislosĢ odmocniny rastovej rýchlosti od teploty lineárna v rozmedzí teplôt 6 až 41 °C. Táto závislosĢ, popísaná rovnicou ¥Gr = 0,0235T – 0,0191 (R2Gr = 0,9963) je znázornená na obrázku 3. So zvyšujúcou sa teplotou inkubácie sa rastová rýchlosĢ smerom k optimálnej rastovej teplote lineárne zvyšovala. Pri optimálnej teplote bola rýchlosĢ rastu prirodzene maximálna (Gr = 0,859 h-1) a ćalej sa so zvyšovaním inkubaþnej teploty už len znižovala. Takéto správanie sa kultúry v celej oblasti inkubaþných teplôt sa dá popísaĢ modifikovaným Arrheniusovým modelom podĐa Davey-a. Na základe prispôsobovania polynomických rovníc rôzneho stupĖa sme získali rovnicu: lnGr = -5,3166 + 0,2472T - 0,003T2 (R2Gr = 0,9964). Z tejto funkcie sa pomocou aplikácie softvéru Microsoft Excel, tzv. RiešiteĐom vypoþítaĢ optimálna teplota rastu L. rhamnosus GG, Topt = 41,1 °C (vk = 4,6%). 1 0,9 0,8

sqrt_rate

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

y = 0.0235x - 0.0191 R2 = 0.9963

0,1 0 5

10

15

20

25

30

35

40

45

T [°C]

Obr. 3. Grafické znázornenie závislosti odmocniny rastovej rýchlosti (gr) L. rhamnosus GG v mlieku od teploty inkubácie Vplyv teploty na trvanie lag-fázy Lactobacillus rhamnosus GG Faktory, ako fyziologický stav kultúry (príprava inokula) a prispôsobovanie sa buniek novým podmienkam prostredia ovplyvĖujú dĎžku lag-fázy. Trvanie lag-fázy L. rhamnosus GG bolo v našich pokusoch urþované teplotou inkubácie štatisticky vysoko významne podĐa vzĢahu, ktorého grafické znázornenie je na obr. 4. 83

1,6 lag-1 1,4

2

1/lag = 0.0006T - 0.0003T + 0.0331 2 R = 0.9876

1,2

1/lag

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

10

20 T [°C]

30

40

50

Obr. 4. Grafické znázornenie závislosti trvania lag-fázy (lag) L. rhamnosus GG v mlieku od teploty inkubácie Z tohto vzĢahu, tak ako aj z jeho grafického znázornenia je zrejmé, že so zvyšujúcou sa teplotou inkubácie sa trvanie lag-fázy prirodzene skracovalo. To súvisí s rýchlejším prispôsobovaním sa buniek na podmienky prostredia. Táto rovnica má ale svoje obmedzenie, platí len v rozsahu teplôt 6 až 45 °C. Pri teplote 50 °C rástla kultúra takmer bez lag-fázy, preto jej reciproká hodnota bola nevyþísliteĐná (0/1) a nevhodná pre matematické spracovanie. Overenie optimálnej teploty pre rast kultúry Lactobacillus rhamnosus GG v mlieku Poþas experimentov sa okrem rastu Lactobacillus rhamnosus GG sledovali aj zmeny hodnôt pH mlieka. Tieto boli síce nepatrné, ale aplikáciou podĐa Baranyiho (1) bolo v niektorých prípadoch možné vypoþítaĢ parametre ako lag-fáza pH (pHlag) a rýchlosĢ poklesu pH (pHr) poþas rastu vyšetrovanej kultúry v mlieku. Na vhodnosĢ podmienok pre metabolizmus L. rhamnosus GG v mlieku by mohol poukázaĢ súþin týchto parametrov, ktorý v prípade rastu Baranyi a kol. (1) definoval ako fyziologický stav kultúry. Súþin hodnôt pHlag a pHr v závislosti od teploty v našom prípade vykazoval kvadratický priebeh s oblasĢou maxima v intervale okolo teploty 40 °C. Táto oblasĢ teplôt na základe obidvoch súvisiacich a navzájom aj odlišných parametrov pHlag a pHr charakterizovala optimálne podmienky pre metabolizmus L. rhamnosus GG. Na základe grafického znázornenia závislosti fyziologického stavu kultúry od teploty a pomocou “RiešiteĐa” (Microsoft Excel) sa vypoþítala optimálna teplota pre metabolizmus vyšetrovanej kultúry, Topt = 40,5 °C (vk = 6,3%). Týmto sme tiež overili a potvrdili už vypoþítanú optimálnu teplotu pre rast. Obidve vypoþítané optimálne teploty sú navzájom veĐmi blízke a so znaþnou istotou môžeme povedaĢ, že optimálna teplota pre rast a metabolizmus Lactobacillus rhmanosus GG sa nachádza v oblasti 40,5 až 41,1 °C. KmeĖ Lactobacillus rhamnosus GG, ktorý preukázal veĐmi dobré rastové schopnosti v rozmedzí teplôt 6 až 50°C, by mohol byĢ využitý ako probiotikum v mlieþnych produktoch, þi už kyslých alebo sladkých. Získané výsledky naznaþili, že ak by sa pridával do kyslomlieþnych produktov, zachovával by si svoju schopnosĢ prežívaĢ v nich aj pri odporúþanej teplote skladovania. SkutoþnosĢ, že zmeny pH v mlieþnom médiu neboli výrazné, naznaþujú možnú aplikáciu študovanej kultúry aj pri výrobe pasterizovaného mlieka, priþom by sa nemenili jeho senzorické vlastnosti. Poćakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605. 84

Použitá literatúra: 1. BARANYI, J., ROBERTS, T. A., McCLURE, P. A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. In Food Microbiology, 1993, vol. 10, p. 43-49. 2. CURRY, B., CROW, W. Lactobacillus casei group. In ROGINSKI H., FUGUAY, J. W., FOX, P. F. Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 3, p. 1488 – 1494. 3. ERKKILÄ, S., SUIHKO, M. L., EEROLA, S., PETÄJÄ, E., MATTILA-SANDHOLM, T. Dry sausage fermented by Lactobacillus rhamnosus strains. In International Journal of Food Microbiology, 2001, vol. 64, p. 205-210. 4. GÖRNER, F., VALÍK, ď. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd., Bratislava: Malé Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. 5. JYOTI, B. D., SURESH, A. K., VENKATESH, K. V. Effect of preculturing conditions on growth of Lactobacillus rhamnosus on medium containing glucose and citrate. In Microbiological Research, 2004, vol. 159, no. 1, p. 35 – 42. 6. ØSTLIE, H. M., HELLAND, M. H., NARVUS, J. A.: Growth and metabolism of selected strains of probiotic bacteria in milk. In International Journal of Food Microbiology, 2003, vol. 87, no. 1 – 2, p. 17 – 27. 7. RODGERS, S. Preserving non-fermented refrigerated foods with microbial cultures. In Trends in Foods Science and Technology, 2001, vol. 12, no. 8, p. 276 – 284. 8. TYÖPPÖNEN, S., PETÄJÄ, E., MATILLA-SANDHOLM, T. Bioprotectives and probiotics for dry sausage. In International Journal of Food Microbiology, 2003, vol. 83, no. 3, p. 233 – 244. 9. WOOD, B. J. B., HOLZAPFEL, W. H. The generea of lactic acid bacteria. London: Blackie Academic and Professional, 1995, 420 p. ISBN 075140215X Kontaktná adresa: Ing. Alžbeta Medvećová, Doc. Ing. ďubomír Valík, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

85

VÝBċR JOGURTOVÉ KULTURY PRO SÓJOVÉ VÝROBKY Pavlasová Marcela, DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Chumchalová Jana Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Selection of a yoghurt culture for soy products Summary: The aim of this study was to select the most suitable yoghurt culture for making fermented soy products. The selection of culture was made on the basis of titratable and active acidity, total counts of yoghurt culture and sensory analysis. Among the three yoghurt cultures (YO-401, Danisco, Denmark; Laktoflora, Milcom, CR; YC-350, Chr. Hansen, Denmark), the culture YC-350 reached the highest counts of streptococci and lactobacilli and the lowest acidity after fermentation after 8 hours of incubation at 35 °C. For sensory analysis, soy fermented products were manufactured to the decrease in the pH 4.6. All these products contained more then 108 CFU.g-1 of yoghurt cultures and amount of streptococci was comparable. The culture YC-350 (Hansen) reached the highest counts of lactobacilli at pH 4.6 (1.4×108 CFU.g-1). It was found using the Friedman test that soy fermented products did not differ, within each other significantly (P<0.05).

Úvod: Jogurtová kultura je tvoĜena homofermentativními bakteriemi mléþného kvašení Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Laktobacily jsou mikroaerofilní grampozitivní nesporotvorné tyþinky, které se þasto vyskytují v Ĝetízcích a tvoĜí porcelánovČ kompaktní hmotu najednou v celém médiu. Streptokoky Ĝadíme mezi aerobní grampozitivní koky, zkvašující sacharidy za vzniku L(+) kyseliny mléþné. V kravském mléce je jejich spoleþný rĤst popisován jako symbiotický [1], kde se jejich vzájemný pomČr pohybuje v rozmezí 2:1 až 1:2. V sójovém médiu se tento vzájemný vztah neprokázal [2] a jejich pomČr se v prĤbČhu fermentace mČní [3]. Zatímco laktobacily rostou v sójovém médiu pomalu, streptokoky se adaptují na sójové médium dobĜe a vykazují zde vysoký nárĤst. I proto se jogurtová kultura používá pĜi výrobČ sójových analogĤ fermentovaných výrobkĤ patĜící mezi sójové fermentované výrobky druhé generace. Jejich výhodou jsou pozitivní úþinky na organismus, jako je hypocholesterolemický efekt, prevence proti osteoporose a proti nČkterým druhĤm onkologických onemocnČní [4,5]. Nevýhodou sóji je limitující zastoupení sirných aminokyselin a valinu [6]. Fermentované sójové výrobky doprovází atypická chuĢ (tzv. luštČninová), která je zpĤsobena vznikem nízkomolekulárních látek oxidací lipidĤ lipooxygenasami a která lze zmírnit napĜ. pĜidáním ovocného komponentu. Cílem práce bylo vybrat jogurtovou kulturu vhodnou pro sójové médium na základČ zhodnocení parametrĤ získaných pĜi mČĜení rĤstové kĜivky a výsledkĤ získaných ze vzorkĤ pĜipravených pro senzorickou analýzu.

Materiál a metody: Jogurtové kultury. Pro fermentaci byly použity kultury YO-401, Danisco, Dánsko, Laktoflora, Milkom, ýR a YC-350, Chr. Hansen, Dánsko. Sledování rĤstu a metabolické aktivity kultur. Hodnoty pro rĤstové kĜivky byly získány fermentací sójového média nezávisle tĜemi jogurtovými kulturami v 1 hodinových intervalech pĜi teplotČ 35 °C po dobu 8 hodin. Pro stanovení poþtĤ jogurtové kultury byla použita plotnová metoda, dále byly zaznamenány hodnoty titraþní a aktivní kyselosti (postup viz Obrázek 1). Pokusy byly provedeny celkem dvakrát pro každou kulturu, z hodnot byly spoþteny prĤmČry.

86

PĜíprava a rozbory vzorkĤ pro sensorickou analýzu. Jogurtové kultury byly kultivovány v sójovém médiu (Klasik, Sunfood, ýR) pĜi teplotČ 35 ˚C. Fermentace byla ukonþena pĜi dosažení hodnoty pH 4,6. U vzniklých výrobkĤ byly stanoveny poþty mikroorganismĤ jogurtové kultury. Pro senzorickou analýzu byly pĜipraveny výrobky bez pĜíchutČ a s ovocnou pĜíchutí (20 % hm.).

VZOREK

HOMOGENIZACE

stanovení aktivní kyselosti

Hodnocení sensorické analýzy. Pro posouzení sensorických rozdílĤ mezi výrobky bylo použito poĜadového testu. 30 hodnotitelĤ obdrželo 2 skupiny výrobkĤ - 3 vzorky neochucené a 3 ochucené ovocnou složkou. Vzorky ve skupinČ mČli hodnotitelé samostatnČ seĜadit podle intenzity zkoumaného znaku pro každý úkol. PoĜadí pro jednotlivé vzorky a úkoly se seþetly a statisticky vyhodnotily Friedmanovým poĜadovým testem.

odber pro stanovení poctu MO

stanovení titracní kyselosti

REDENÍ fyziologickým roztokem

ODBER 1 ml

Obrázek 1 Postup pĜi rozboru vzorku

PLOTNOVÁ METODA

PLOTNOVÁ METODA

laktobacily MRS agar pH 5,2 anaerobne 37 °C, 3 dny

streptokoky M17 agar aerobne 42 °C, 1 den

Pocty narostlých MO

Výsledky a diskuze: RĤst a produkce kyselin Sledováním rĤstových kĜivek (viz Obrázek 2) bylo zjištČno, že nejlépe rostla v sójovém médiu kultura YC-350, která obsahovala poþty jogurtové kultury 4,3·108 JTK.g-1, z toho streptokokĤ 2,3·108 JTK.g-1 a laktobacilĤ 1,9·108 JTK.g-1. Dále Laktoflora - jogurtová kultura 3,2·108 JTK.g-1, streptokokĤ 3,2·108 JTK.g-1 a laktobacilĤ 5·106 JTK.g-1. NejménČ laktobacilĤ bylo zjištČno u kultury YO-401 s poþtem 4,7·103 JTK.g-1, poþty streptokokĤ 2,6·108 JTK.g-1 a celkové jogurtové kultury 2,6·108 JTK.g-1. 1,0E+09

poþty MO [JTK.g-1]

1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 0:00

1:00

2:00

3:00

Laktoflora streptokoky YC-350 streptokoky YO-401 laktobacily

4:00

5:00

6:00

7:00 8:00 þas [hod]

YO-401 streptokoky Laktoflora laktobacily YO-350 laktobacily

Obrázek 2 Poþty streptokokĤ a laktobacilĤ u sledovaných jogurtových kultur bČhem kultivace pĜi teplotČ 35 °C po dobu 8 hodin 87

Nejlépe prokysávala kultura YC-350 (viz Obrázek 3), po 8 hodinách kultivace dosahovala pH hodnoty 4,2 a titraþní kyselost 73 mmol.kg-1. U kultury Laktoflora a YO-401 byla hodnota pH shodná (pH 4,5). U Laktoflory byla namČĜena titraþní kyselost 61 mmol.kg-1, u YC-350 66 mmol.kg-1. 8,0

70 7,0

pH [-]

60 50

6,0

40 5,0

30 20

4,0

10 3,0

titraþní kyselost [mmol.kg-1]

80

0 0:00

1:00

2:00

3:00

4:00

Laktoflora aktivní kyselost YC-350 aktivní kyselost YO-401 titraþní kyselost

5:00

6:00

7:00

8:00 þas [hod]

YO-401 aktivní kyselost Laktoflora titraþní kyselost YC-350 titraþní kyselost

Obrázek 3 Hodnoty titraþní a aktivní kyselosti u sledovaných jogurtových kultur bČhem kultivace pĜi teplotČ 35 °C po dobu 8 hodin

Rozbor pro sensorickou analýzu PĜi prokysání sójového média jogurtovými kulturami do pH 4,6 (viz Obrázek 4) byly zjištČny nejvyšší poþty jogurtové u kultury YO-401. Tato kultura dosáhla celkových poþtĤ jogurtové kultury 8,3·109 JTK.g-1, avšak poþty laktobacilĤ byly velmi nízké (4,1·102 JTK.g-1). Nejvíce laktobacilĤ bylo zjištČno u kultury YC-350 (1,4·108 JTK.g-1).

-1

poþty MO [JTK.g ]

1,0E+10 1,0E+08 1,0E+06 1,0E+04 1,0E+02 1,0E+00 Laktoflora laktobacily

YC-350 název kultury

streptokoky

YO-401

jogutová kultura celkem

Obrázek 4 Poþty streptokokĤ, laktobacilĤ a celkové jogurtové kultury u sledovaných jogurtových kultur po kultivaci pĜi teplotČ 35 °C do pH 4,6

88

Sensorická analýza PoĜadovým testem byly zjištČny souþty poĜadí, prĤmČry poĜadí a tyto hodnoty porovnány s kritickou hodnotou Ȥ2, která je pro 3 vzorky na hladinČ pravdČpodobnosti (Į=0,05) rovna 5,99. Porovnáním s vypoþtenou hodnotou Friedmanova testu (viz Tabulka I a Tabulka II) bylo zjištČno (všechny hodnoty byly nižší než kritická hodnota), že se jednotlivé kultury mezi sebou významnČ neliší. Tento výsledek mĤže být dán také tím, že fermentované sójové výrobky nejsou bČžnČ rozšíĜené a respondenti nemČli vytvoĜený vlastní standard pro hodnocení.

Tabulka I Statistické vyhodnocení Friedmanovým poĜadovým testem pro vyrobené sójové fermentované výrobky se sledovanými jogurtovými kulturami - výrobky bez pĜíchutČ Výrobek bez pĜíchutČ Hodnocený znak

Laktoflora

PrĤmČrné poĜadí YC-350

YO-401

0,9 4,2

2 1,7

2,1 2,1

1,9 2,2

4,2

1,7

2,1

2,2

2 2

2,3 2,2

Friedman. test

Textura na lžiþce VĤnČ vzorku PĜíjemnost kyselé chuti

Intenzita nepĜíjemné chuti 4,3 1,7 Celkový dojem 2,9 1,8 2 Poznámka: Kritická hodnota Ȥ pro 3 vzorky je 5,99 (pro Į = 0,05)

Tabulka II Statistické vyhodnocení Friedmanovým poĜadovým testem pro vyrobené sójové fermentované výrobky se sledovanými jogurtovými kulturami - výrobky s ovocnou pĜíchutí Výrobek s ovocnou pĜíchutí

PrĤmČrné poĜadí

Hodnocený znak

Friedman. test

Laktoflora

YC-350

YO-401

Textura na lžiþce VĤnČ vzorku

2,6 0,3

2,2 2,1

1,8 2

1,9 1,9

PĜíjemnost kyselé chuti Intenzita nepĜíjemné chuti Celkový dojem

3,3 0,5 1,4

2,1 1,9 2,2

2,2 2,1 2

1,7 2 1,8

ZávČr: Protože se sensoricky výrobky významnČ nelišily, byly porovnávány empirické hodnoty získané z rĤstových kĜivek. Za nejvhodnČjší kulturu lze tedy považovat YC-350 od firmy Chr. Hansen, která vykazovala nejvyšší nárĤst jogurtové kultury (zejména pak laktobacilĤ) i nejvyšší hodnotu titraþní kyselosti. Dále bylo pozorováno, že laktobacily v sójovém médiu rostou témČĜ lineárnČ a mají menší zastoupení než streptokoky, což by bylo zajímavé prozkoumat podrobnČji pĜi pĜíštích pokusech.

PodČkování: Práce byla podpoĜena výzkumným zámČrem CEZ: MSM 6046137305.

89

Použitá literatura: 1. Kurultay, S., Öksüz, Ö., Kaptan, B. : Determination of the effects of different amino acids, sodium formate and their combinations on some growth characteristics of mixed and single cell cultures of yoghurt bacteria. J. Tekirdag Agricult. Facult. 2(2), 153-160 (2005). 2. Chumchuere, S., Robinson, R.K.: Selection of starter cultures for the fermentation of soya milk, Food Microbiol. 16, 129-137 (1999). 3. DvoĜák, M.: Jogurty na bázi sóji s probiotickou mikroflórou. Diplomová práce, ÚTMT, VŠCHT 2005. 4. Andersson, J.J.B., Anthony, M., Messina, M., Garner, S.C.: Effects of phyto-estrogens on tissues. Nutr. Res. Rev. 12, 75-116 (1999). 5. Setchell, K.D.R., Cassidy, S.: Dietary isoflavones: biological effect and relevance to human health. J. Nutr. 129, 758S-767S (1999). 6. Velíšek, J.: Chemie potravin I. kap.2.1.1.1.1, str. 7. Ossis, Tábor 1999. Kontaktní adresa: Marcela Pavlasová ([email protected]), Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6.

90

SKRÍNING VYBRANÝCH STARTOVACÍCH KULTUR NA PěÍTOMNOST DNA SEKVENCÍ KÓDUJÍCÍCH DEKARBOXYLÁZY ÚýASTNÍCÍ SE TVORBY BIOGENNÍCH AMINģ Burdychová Radka, Komprda Tomáš Ústav technologie potravin agronomické fakulty MZLU v BrnČ Screening of selected starter cultures for the presence of DNA sequences coding for decarboxylases causing biogenic amine production Summary: Biogenic amines (BA) are low-molecular organic bases which are normal constituents of many foods. BA are mainly generated by decarboxylation of the corresponding amino acids through substrate-specific enzymes produced by present microorganisms. Microorganisms with a decarboxylase activity can be starter microorganisms or other spontaneous microflora. Several methods have been described to determine the BA production by microorganisms. The newest methods are based on detection of genes encoding microbial decarboxylases responsible for the production of BA. Here, seven different starter cultures used in the production of fermented sausages were screened for the presence or absence of specific DNA sequences coding for tyrosine decarboxylase. PCR with a set of specific primers TDC2/TDC5 was used. The PCR analysis of DNA from two starter cultures confirmed the presence of DNA sequences for tyrosine decarboxylase. A detailed analysis of the starter cultures showed that DNA sequences for tyrosine decarboxylase are contained in genomic DNA of Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei. These results show suitability of the described PCR method for the screening of starter cultures for the presence of the gene for tyrosine decarboxylase that is responsible for the production of the biogenic amine tyramine.

Úvod: Biogenní aminy jsou organické bazické slouþeniny, k jejichž produkci dochází v rĤzných typech potravin jako jsou sýry, víno, pivo, trvanlivé salámy nebo rybí produkty1. K toxikologicky nejvýznamnČjším biogenním aminĤm patĜí histamin, tyramin, putrescin a kadaverin. Nejvíce prostudovaným je tyramin, a to díky jeho fyziologickým úþinkĤm. Tyramin zvyšuje krevní tlak, zpĤsobuje migrény s bolestí hlavy, v krajních pĜípadech mĤže být i pĜíþinou krvácení do mozku, resp. selhání srdce. Toxický úþinek tyraminu závisí na pĜijatém množství, pĜítomnosti jiných biogenních aminĤ (násobení úþinkĤ) a na celkovém fyziologickém stavu jedince2. Základními podmínkami pro vznik tyraminu jsou pĜítomnost volné aminokyseliny tyrosinu v substrátu (potravinČ), pĜítomnost mikroorganismĤ s dekarboxylázovou aktivitou a vhodné podmínky pro rĤst a množení mikroorganismĤ. NČkteré mikroorganismy kódují tyrosindekarboxylázu, enzym úþastnící se tvorby tyraminu z volného tyrosinu. PĜítomnost této specifické DNA sekvence byla popsána u bakterií náležejících do rodĤ Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus a u mnoha zástupcĤ þeledi Enterobacteriaceae3. Zástupci uvedených rodĤ mikroorganismĤ se používají jako startovací kultury pĜi výrobČ fermentovaných potravin živoþišného pĤvodu. NČkteré kmeny bakterií používané do startovacích kultur produkují výše popsaný enzym, úþastnící se tvorby nežádoucího toxického biogenního aminu tyraminu z volného tyrosinu pĜítomného v potravinČ4. Dekarboxylázová aktivita mezi kmeny urþitého druhu se mĤže lišit dokonce až o tĜi Ĝády, existují i kmeny bez dekarboxylázové aktivity4. Proto je v praxi nutné testovat vždy konkrétní použité bakteriální kmeny. Vþasná detekce enzymu tyrosindekarboxylázy, respektive specifické DNA sekvence, která ho kóduje, je pro potravináĜský prĤmysl vzhledem k ochranČ spotĜebitele velmi dĤležitá. Pro rychlou detekci pĜíslušné specifické DNA sekvence ve startovacích kulturách jsou vhodné metody molekulární biologie. Pro skríning startovacích kultur byla použita nedávno publikovaná metoda polymerázové ĜetČzové reakce (PCR), která umožĖuje rychlou, velmi citlivou a specifickou detekci cílového genu. Tato PCR byla popsána5 v roce 2004. Modifikovaná varianta publikované PCR metody je v této práci použita pro ovČĜení sedmi startovacích mikrobiálních kultur, urþených pro výrobu fermentovaných potravin, na pĜítomnost genu kódujícího enzym tyrosindekarboxylázu. 91

Materiál a metody: Bakteriální kmeny a jejich rĤstové podmínky:

Startovací kultury urþené pro výrobu fermentovaných tepelnČ neopracovaných trvanlivých salámĤ (BioCarna, NČmecko) byly kultivovány na PCA, MRS a M17 agaru (Merck, NČmecko). Pro rozlišení a identifikaci jednotlivých mikrobiálních druhĤ byly použity komerþní API testy (Biomerieux, Francie), kataláza test a Gramovo barvení. Složení použitých startovacích kultur je uvedeno v Tab. I. Bakteriální buĖky Enterococcus faecalis CNRZ 2385 byly kultivovány v médiu s kanamycinem, eskulinem a azidem sodným (KEAA, Merck, NČmecko) pĜi 37 °C. Kultura byla použita jako pozitivní kontrola pro PCR. Tabulka I: Použité startovací kultury pro výrobu fermentovaných výrobkĤ, výrobce BioCarna Detekce DNA sekvencí pro ýíslo Oznaþení Složení startovacích tyrosindekarboxylázu startovací startovací kultury kultur DNA z þisté kultury výrobcem (bakteriální druhy) celková DNA kultury 1

PPX

Pediococcus pentosaceus Staphylococcus xylosus

-

-

2

SG1

Staphylococcus carnosus Streptomyces griseus

-

-

3

SC1

Staphylococcus carnosus Lactobacillus curvatus

+

+

Pediococcus acidilactici 4 PLS Staphylococcus carnosus Lactobacillus plantarum Staphylococcus carnosus 5 CXK Staphylococcus xylosus Lactobacillus sakei Pediococcus pentosaceus 6 PPLX Lactobacillus plantarum Staphylococcus xylosus Staphylococcus carnosus 7 SLG1 Lactobacillus plantarum Streptomyces griseus + sekvence detekována, - sekvence nedetekována

-

+

-

-

+ -

Izolace DNA a PCR: Lyze bunČk startovacích kultur, izolace DNA z bakteriálních kultur, její purifikace a zpĤsob kontroly koncentrace a þistoty byly provedeny dle6,7. Pro amplifikaci specifické DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu byla použita dvojice specifických oligonukleotidových primerĤ TD2/TD55. PCR reakce byla provedena v termocyklátoru PTC 130 (MJ Research, Waltham, MA, USA). PCR byla provedena v celkovém objemu 25 Pl a obsahovala 10 ng purifikované DNA, 10 pmol každého primeru TD2/TD5, 1U HotStar Taq DNA polymerázy a pĜíslušné množství HotStar Master Mixu (Qiagen, Hilden, NČmecko). Templátové DNA byly nejprve denaturovány inkubací pĜi 95 °C 15 min. DNA byla amplifikována ve 30 cyklech 92

(denaturace pĜi 95 °C 45 s, hybridizace primerĤ pĜi 52 °C po dobu 45 s a syntéza komplementárního DNA ĜetČzce pĜi 72 °C 75 s). V posledním amplifikaþním cyklu byla teplota 72 °C prodloužena na 10 min, a to pro kompletní dosyntetizování finálního PCR produktu. PCR produkty byly detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy na pĜístroji Easy, model B1 (Owl Scientific, USA) a vizualizovány na UV transluminátoru (EB-20E Ultralum, USA) po nabarvení ethidium bromidem (0,5 μg/ml). Jako pozitivní kontrola PCR byla použita DNA purifikovaná z bunČk Enterococcus faecalis CNRZ 238, jako negativní kontrola PCR byly použity komponenty PCR bez DNA. Výsledky a diskuse: Produkce biogenního aminu tyraminu byla již dĜíve popsána u Ĝady mikroorganismĤ používaných jako startovací kultury pĜi výrobČ fermentovaných výrobkĤ živoþišného pĤvodu4. Vzhledem k tomu, že je tĜeba pro prevenci rizika, které pro spotĜebitele plyne z pĜítomnosti biogenních aminĤ ve fermentovaných potravinách produkci biogenních aminĤ snížit nebo zcela eliminovat, vyvstává nutnost startovací kultury peþlivČ vybírat a testovat. PĜi testování metody PCR pro skríning studovaných startovacích kultur (viz Tab. I) na pĜítomnost þi nepĜítomnost genu pro tyrosindekarboxylázu bylo nejprve nutné ovČĜit specifitu PCR. Do PCR reakce byla jako DNA templát použita purifikovaná DNA izolovaná z bakteriálního kmene Enterococcus faecalis CNRZ 238, který byl popsán5 jako producent tyrosindekarboxylázy. V reakci byl amplifikován PCR produkt pĜedpokládané velikosti (1100 bp). Pro PCR byla v této práci na rozdíl od5 použita HotStar Taq DNA smČs (Qiagen), která obsahuje HotStar Taq DNA polymerázu spolu s pĜíslušnými komponentami PCR. Tato polymeráza je modifikovanou formou Taq DNA polymerázy. V PCR smČsi je v inaktivovaném stavu, takže nemá žádnou polymerázovou aktivitu. Absence polymerázové aktivity brání extenzi nespecificky hybridizovaných primerĤ a vzniku primerových dimerĤ, které se mohou tvoĜit pĜi nízkých teplotách na poþátku PCR a bČhem prvního PCR cyklu. HotStar Taq DNA polymeráza je aktivována desetiminutovou až patnáctiminutovou inkubací pĜi 95 °C8. Koncentrace polymerázy je vzhledem k ostatním komponentám smČsi již optimalizována, což minimalizuje tvorbu nespecifických PCR produktĤ a zaruþuje dobrou amplifikaþní úþinnost enzymu. PCR pufr obsahuje vyváženou kombinaci KCl a (NH4)2SO4, které jsou dĤležité pro specifickou hybridizaci primerĤ s DNA matricí. Optimalizovaná koncentrace hoĜeþnatých iontĤ zaruþuje dobrou úþinnost reakce a reakþní specificitu. Pro optimalizaci PCR je nutné pouze ovČĜení vhodného množství DNA a poþtu PCR cyklĤ, obojí bylo v této práci testováno. Optimální bylo použití 10 ng DNA do PCR smČsi a 30 cyklĤ polymerázové ĜetČzové reakce. Po ovČĜení specificity a funkþnosti byla PCR použita pro skríning startovacích kultur používaných pro výrobu fermentovaných potravin (Tab. I). Po izolaci a purifikaci celkové DNA z jednotlivých smČsných startovacích kultur byla tato DNA použita jako matrice pro PCR. Specifické PCR produkty oþekávané velikosti (1100 bp) byly detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy ve smČsné kultuĜe SC1 (þ. 3, obsahující mikroorganismy Staphylococcus carnosus a Lactobacillus curvatus) a CXK (þ. 5, obsahující mikroorganismy Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus a Lactobacillus sakei) (þíslování kultur viz Tab. I). Detekce specifických PCR produktĤ v tČchto smČsných kulturách je uvedena na Obr. 1. Po detekci pĜítomnosti genu pro tyrosindekarboxylázu ve smČsných startovacích kulturách byly tyto smČsné kultury kultivovány a purifikovány s použitím specifických kultivaþních pĤd. PĜítomnost jednotlivých bakteriálních druhĤ v þistých kulturách byla ovČĜena provedením základních biochemických reakcí. Z þistých kultur jednotlivých bakteriálních druhĤ byla dále izolována a purifikována DNA, která byla použita jako DNA matrice (10 ng) pro PCR. Postup detekce genu pro tyrosindekarboxylázu byl stejný jako u kontrolního kmene. Specifické PCR produkty se amplifikovaly s použitím DNA bakterií druhu Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus (Tab I). Uvedené nespecifikované kmeny tČchto dvou bakteriálních druhĤ byly tedy identifikovány jako potenciální producenti tyrosindekarboxylázy a mohou se tedy ve fermentovaných potravinách úþastnit tvorby biogenního aminu tyraminu. 93

Vzhledem k ochranČ konzumenta pĜed nežádoucími vlastnostmi tyraminu, který mohou za vhodných podmínek9 startovací kultury þ. 3 a þ. 5 (Tab I) obsahující druhy Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus tvoĜit, se výrobci analyzovaných startovacích kultur nedoporuþuje tyto mikroorganismy používat a distribuovat.

M 1 2

3 4

5 6 7 8 9

bp

bp

1200 1000

1100

500

Obr. 1. PCR detekce sekvencí kódujících tyrosindekarboxylázu v celkové DNA izolované ze startovacích kulur. M: 100 bp ladder (New England Biolabs), bČh þ. 1 – 7: startovací kultury þ. – 7 (Tab.1), bČh þ. 8: pozitivní kontrola - E. faecalis CNRZ 238 (COTON a kol., 2004), bČh þ. 9: negativní kontrola (komponenty PCR bez DNA) Použitá literatura: 1. BRINK, B. T., DAMINK, C., JOOSTEN, H. J., HUIS IN´T VELD, J. Occurence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food Microbiol. 1990, 11, s. 73 – 84. 2. SILLA-SANTOS M. H. Biogenic amines: their importance in foods. Int J Food Microbiol. 1996, 29: s. 213 – 231. 3. SHALABY, A. R. Significance of biogenic amines in food safety and human health. Food Res. Int. 1996, 29, s. 675 – 690. 4. KOMPRDA, T., SMċLÁ, D., PECHOVÁ, P., KALHOTKA, L., ŠTENCL, J., KLEJDUS, B. Effect of starter culture, spice mix and storage time and temperature on biogenic amine content of dry fermented sausages. Meat Sci. 2004, 67, 4: s. 607 – 616. 5. COTON, M., COTON, E., LUCAS, P., LONVAUD, A. Identification of the gene encoding a putative tyrosine decarboxylase of Carnobacterium divergens 508. Development of molecular tools for the detection of tyramine-producing bacteria. Food Microbiol. 2004, 21, s. 125 – 130. 6. SAMBROOK, J., MACCALLUM, P., RUSSELL, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001. 2344 s. 7. AUSUBEL, F. M., BRENT, R., KINGSTON, R. E., MOORE, D. D., SEIDMAN, J. G., SMITH, J. A., STRUHL, K. Current protocols in molecular biology. New York: Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. 1994. 350 s. 8. DRÁBER, P., PETěÍýEK, M., BOUBELÍK, M., BRDIýKA, R., ZADINA, J. Pokroky v PCR technologii a jejím využití. Pracovní materiály semináĜe. 1. vyd. Praha: Ústav molekulární genetiky AVýR. 1993. 550 s. 9. KOMPRDA, T., SMċLÁ, D., NOVICKÁ, K., KALHOTKA, L., ŠUSTOVÁ, K., PECHOVÁ, P. Content and distribution of biogenic amines in Dutch-type hard cheese. Food Chemistry. 2007, 102, s. 129 – 137.

Kontaktní adresa: Ing. Radka Burdychová, Ph.D., Ústav technologie potravin Agronomické fakulty MZLU v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, email: [email protected], tel: +420 545 13 3334 94

VPLYV BAKTÉRIÍ MLIEýNEHO KYSNUTIA NA RAST STAPHYLOCOCCUS AUREUS V MLIEKU Bajúsová Barbora, Valík ďubomír, Liptáková Denisa, Medvećová Alžbeta Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave Effect of lactic acid bacteria on growth of Staphylococcus aureus in milk Summary: The behaviour of Staphylococcus aureus 2064 and lactic acid bacteria (LAB) were studied in co-culture in milk in temperature range from 10 to 25 °C. Effect of temperature, inoculum density and Iactic acid development by LAB on the growth of S. aureus 2064 is showed by the changes of growth curves and calculated growth parameters. S. aureus did not reach the counts indicating presence of its enterotoxins during cultivation with Iactic acid bacteria of the various inoculum (0.5, 1, 2, 4 and 6 % v/v).

Pod spoloþným názvom „baktérie mlieþneho kysnutia“ (BMK) radíme skupinu nie striktne taxonomicky definovaných baktérií, ktoré sú však fylogeneticky podobné a vyznaþujú sa mnohými spoloþnými fyziologickými a ekologickými vlastnosĢami1. V súþasnosti sa v princípe medzi tzv. BMK poþítajú rody (v abecednom poradí): Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weisella. Baktérie mlieþneho kysnutia sú prirodzenými antagonistami nežiadúcich mikroorganizmov v potravinách. Hlavným inhibiþne pôsobiacim faktorom pri fermentácii mlieka je nízka hodnota pH spôsobená vzniknutou kyselinou mlieþnou priþom smerodajná je koncentrácia nedisociovanej kyseliny mlieþnej. Úþinné sú aj iné kvantitatívne menej významné sekundárne metabolity. VzhĐadom na druhy BMK a fermentovaný substrát to môžu byĢ aj iné organické kyseliny, bakteriocíny, CO2, peroxid vodíka, etanol, diacetyl, nízky redoxný potenciál, vyþerpanie živín, nahromadenie rôznych metabolitov1. Tieto faktory môžu pĤsobiĢ individuálne alebo synergicky. V ovþom mlieku získanom a spracovanom na salaši je Staphylococcus aureus najfrekventovanejším podmienene patogénnym mikroorganizmom2. Jeho pôvodným prameĖom sú mlieþna žĐaza oviec, pokožka Đudí a prostredie. Dôležitým faktorom jeho rizikovosti v ovþom hrudkovom syre a potom v syre bryndza sú spôsob a podmienky spracovania ovþieho mlieka na hrudkový syr3,4. S. aureus pritom mĤže byĢ inhibovaný alebo sa mĤže rozmnožiĢ na denzity produlcujúce rizikové množstvo stafylokokových enterotoxínov5. Natívne prítomné baktérie mlieþneho kysnutia, ktoré sa roznmožujú pri výrobe ovþieho hrudkového syra však množenie a toxínotvorbu S. aureus mĤžu inhibovat. PodĐa niektorých autorov, asi jedna tretina až 80% plazmakoagulázo-pozitívnych kmeĖov S. aureus produkuje za vhodných podmienok enterotoxíny, ktoré zapríþiĖujú alimentárne otravy u Đudí6,7. Stafylokokové toxíny sú termostabilné, a preto ani tepelná úprava kontaminovaného mlieka tento problém nerieši. Dôležité preto je, potlaþit rast S. aureus v štádiu, kým koncentrácia toxínov nie je dostatoþne vysoká pre vyvolanie enterotoxikózy. Pri optimálnom kysnutí mlíeka je inhibícia rastu S. aureus vćaka metabolizmu BMK prirodzená. PodĐa Holzapfela8 prídavok štartovacích kultúr napomáha procesu fermentácie a vzniknuté organické kyseliny pôsobia inhibiþne na rast patogénnych mikroorganizmov. Predmetom tejto práce bolo preto túto skutoþnost overit a kvantitatívne popísaĢ vzĢahy medzi zúþastnenými BMK, konkrétne mezofilnou kultúrou AC zloženou z laktokokov a Lactobacillus acidophilus a kmefiom Staphylococcus aureus 2064 spoloþne naoþkovaných do mlieka.

Materiál a metódy KmeĖ Staphylococcus aureus 2064 bol izolovaný z ovþieho syra na Štátnom veterinárnom a potravinovom ústave v Prešove (poskytnutý MVDr. Haniélyovou). Identifikácia tohto kmeĖa bola dodatoþne potvrdená systémom API (BioMérieux, Marcy l‘Etoile, Francúzsko). 95

Poþas subkultivácie kmeĖa Staphylococcus aureus 2064 a kultúry AC v mlieku pri teplotách 10°C, 15°C, 18°C, 21°C a 25°C sa poþty S. aureus zisĢovali v príslušných þasových intervaloch na Baird-Parkerovom agare (ImunaPharm, Šarišské MichaĐany, SR) podla STN ISO 6888. Baktérie mlieþneho kysnutia kultúry AC sa do mlieka pridávali v poþiatoþných inokuláciách 0,5%, 1 %‚ 2 %, 4 % a 6 % (obj.). Poþty KTJ/ml kultúry AC sa stanovovali orientaþne na agare Ml7 (Merck, Darnistatd, SRN). Súþasne sa zisĢovali hodnoty pH a titraþnej kyslosti. Aktívna kyslosĢ bola stanovená pH metrom Radelkis OP-201 (BudapešĢ, Maćarsko), potenciálna kyslosĢ sa stanovila titraþne (cNaOH = 0,25 mo1.l-1 ; indikátor fenolftaleín). Zo zistených poþtov sa zostrojili rastové þiary, ktoré sa podrobili primárnemu modelovaniu podĐa Baranyiho9, výsledkom ktorého boli vypoþítané rastové parametre (rastová rýchlosĢ, lag-fáza a i.). Rastové parametre z príslušných rastových þiar boli podrobené analýze v sekundárnej fáze matematického modelovania mikrobiálneho rastu.

Výsledky a diskusia Na obr. 1 až 6 sú znázornené rastové þiary kmeĖa S. aureus 2064 poþas spoloþnej kultivácie s kultúrou AC v mlieku pri teplotách 18°C, 21°C a 25°C. Ako možno vidieĢ z grafov, na rast S. aureus vplývala teplota skladovania a tiež poþiatoþný poþet baktérií mlieþneho kysnutia. Pri teplote 18 °C (obr. 1 a obr. 2) sa 50 zvyšujúcim sa prídavkom kultúry AC rastová rýchlosĢ S. aureus znižovala. Pri 0,5% prídavku kuhúry AC dosiahla rastová rýchlosĢ S. aureus hodnotu GrSa = 0,066 h-1, priþom S. aureus narástol (Nmax - N0) o 1,7 log poriadku. Pri 2% prídavku kultúry AC (obr. 2) sa táto rýchlosĢ znížila na GrSa = 0,055 h-1 a nárast S. aureus bol už len o 1,2 log. Z prezentovaných obrázkov je tiež vidieĢ, že S. aureus rástol pri nezmenených hodnotách P14, teda v þase, kedy metabolizmus BMK bol ešte v tzv. lag-fáze (lagpH).

Obr. 1 a 2. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a mezofilnej kultúry AC (0,5% a 2%) poþas spoloþnej kultivácie v mlieku pri 18°C.

Táto skutoþnosĢ sa potvrdila aj v nasledujúcich pokusoch vykonaných pri teplote 21 °C (obr. 3 a 4). Prídavok 1 % kultúry AC umožnil S. aureus nárast o 1,6 log a rastová rýchlosĢ dosiahla hodnom 0,090 h-1. Zvýšenie prídavku BMK na 2% ešte výraznejšie ovplyvnilo rast S. aureus, þo sa ukázalo na ćalšom znížení rastovej rýchlosti S. aureus GrSa = 0,038 h-1. Za týchto podmicnok S. aureus zvýšil svoj poþet len o 0,5 logaritmického poriadku.

96

Obr. 3 a 4. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a mezofilnej kultúry AC (1% a 2%) poþas spoloþnej kultivácie v mlieku pri 21°C. Pri fermentácii mlieka 1% inokuláciou BMK pri teplote 25°C (obr. 5) S. aureus dosiahol rastovú rýchlosĢ 0,293 h-1, þo bola najvyššia rýchlosĢ zo všetkých vykonaných pokusov. Avšak pri 2% inokulácii kultúrou AC S. aureus znížil rastovú rýchlosĢ o 65 %‚ na 0,104 h-1. Nárast S. aureus pri 1 a 2% inolculácii kultúrou AC bol 1,6 log a 0,75 log v poradí.

Obr. 5 a 6. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a mezofilnej kultúry AC (1% a 2%) poþas spoloþnej kultivácie v mlieku pri 25°C

Záver V pokusoch sa potvrdila všeobecne známa skutoþnosĢ, že BMK a v našom prípade kultúra AC pósobia inhibiþne na rast S. aureus 2064. Za podmienok našich experimentov sa rast študovaného kmeĖa S. aureus zastavil pri všetkých vyšetrovaných teplotách. Inhibícia jeho rastu bola tým úþiinnejšia, þím bol poþiatoþný prídavok kultúry AC vyšší a teplota inkubácie nižšia. Ani pri jednom z vykonaných z pokusov S. aureus nedosiahol poþty 106 KTJ.ml-1, ktoré by mohli znamenaĢ riziko prítomnosti enterotovínov7,11. Poćakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605. 97

Použitá literatúra: 1. ADAMS, R., NICOLAIDES, L.: Review of the sensitivity of different foodborne pathogens to fermentation. Food Control, 199‘7, vol. 8, p. 227-239. 2. ELEýKO, J., JACKOVA, A. VASIL, M.: Dynamika výskytu mastitíd pri klasickom ruþnom a strojovom dojení oviec. Chov oviec a kóz, 23, 2003, þ.2, s. 15-17. 3. GRIEGER, C., BEDNARCIKOVA, E. A VERDON, F.: Vplyv zrenia ovþieho hrudkového syra na rastovú kriku Staphylococcus aureus. VeterináĜství, 1979, roþ. 29, ý. 9, s. 407-409. 4. GYARMATHY, E.: Spracovanie ovþieho mlieka a charakteristika mlieþnych výrobkov. In: Problematika rozvoja chovu oviec na Slovensku. [HTML dokument]. Nitra, SPU [cit. August 2003]. Dostupný z http ://www .agroporadestvo .sk. 5. ASPERGER, H., ZANGERL, P.: Staphylococcus aureus. In ROGINSKI H., FUQUAY J.W., FOX P.F.:Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 4, p. 25632509. 6. BALABAN, N., RASOOLY, A.: Staphylococcal enterotoxin. International Journal of food Microbiology, 2000, vol 61, p. 1-10. 7. GÖRNER, F., VALIK, L.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd., Bratislava: Malé Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. 8. HOLZAPFEL, W.H., GIESEN, R., SCHILLINGER, U.: Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology, 1995, vol. 24, p. 343-362. 9. BARANYI, J., ROBERTS, T. A., McCLURE, P.: A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 1993, vol. 10, p. 43-49. 10. HOLZAPFEL, W.H.: Use of starter cultures in fermentation on hausehold scale. Food control, 1997, vol. 8, p. 241-258. 11. LINDQVIST, R., SYLVEN, S., VAGSHOLM, I.: Quantitative microbial risk assessment by Staphylococcus aureus in unripened cheese made from raw muk. International Journal of Food Microbiology, 2002, vol. 78, p. 155-170. 12. STN ISO 6888. Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na stanovenie poþtu baktérií Staphylococcus aureus. Metóda poþÍtania kolónií. Slovenský ústav technickém normalizácie, 1997, 16 s. Kontaktná adresa: Ing. Barbora Bajúsová, Doc. Ing. Lubomír Valík PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, 81237 Bratislava, Slovensko

98

VLIV KOMBINACE LYSOYZYMU A LAKTOKOKģ PRODUKUJÍCÍCH NISIN NA RģST BACILLUS CEREUS DMF 2001 V MODELOVÉM SYSTÉMU MLÉKA UHT Šviráková Eva, Ostapþuk Radek, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Influence of combination of lysozyme and nisin-producing lactococci on the growth of Bacillus cereus DMF 2001 in the model UHT milk system. Summary: This work was focused on monitoring of common effect of Lactococcus lactis subsp. lactis (NIZO R5 or HMM 32 strain) and lysozyme (100 mg l-1) on the growth of Bacillus cereus DMF 2001 in the model UHT milk system (0.5 % w/w milk fat content). The density of B. cereus DMF 2001 was on the decrease in three decimal reduction (from density 3.6 · 107 CFU ml-1 till 3.0 · 104 CFU ml-1) by the growth of L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (nisin-producing strain, 330 IU nisin ml-1 of LM17 broth, and lactic acid-producing strain) and also by using of lysozyme (100 mg l-1) in the UHT milk. The density of B. cereus DMF 2001 was on the decrease in one decimal reduction (from density 3.6 · 107 CFU ml-1 till 1.6 · 106 CFU ml-1) by the growth of L. lactis subsp. lactis HMM 32 (nisin-non-producing strain and lactic acid-producing strain) and also by using of lysozyme (100 mg l-1) in the UHT milk. The significative common effect of lactococcal strains (producing nisin and lactic acid) and lysozyme was proved during inhibition of B. cereus DMF 2001 in the model UHT milk system. The role of the nisin produced in situ was not underlying and some significative differences between effects of nisin-producing and nisin-non-producing strains were not proved in the work.

ÚVOD B. cereus je grampozitivní, aerobní, sporulující bakterie bČžnČ se vyskytující v pĤdČ, na rostlinách, a také v syrových materiálech (napĜ. syrové mléko aj.). ŠtČpí bílkoviny za vzniku amoniaku a sacharidy fermentuje s ménČ významnou tvorbou kyselin [1]. Jeho spory jsou odolné vĤþi vysokým (pasteraþním) i nízkým (chladniþkovým) teplotám [2]. Spory, pĜítomné v potravináĜských výrobcích, pĜedstavují zvýšené zdravotní riziko.

a) b) Obr. 1. Mofrologický obraz (a) (médium PEMBA) a mikroskopický obraz (b) (zvČtšení 1600 ×) B. cereus 2008 [3]. Kmeny L. lactis produkují mnoho antimikrobiálních látek. Jde pĜedevším o kyselinu mléþnou, která pĜirozenČ snižuje pH potraviny a pozastavuje nebo inhibuje rĤst nČkterých mikroorganismĤ [4], ale také o rĤzné bakteriociny (diplococcin, lactostrepcin, lactococcin, lacticin 481, bac, nisin) [5]. V mlékárenském prĤmyslu nejþastČji používá nisin [6]. Nisin pĜímo rozrušuje cytoplazmatickou membránu grampozitivních (G+) vegetativních bunČk, což vede k jejich lysi [7]. Nisin inhibuje germinaci spor grampozitivních bakterií [8]. V ýeské republice (ýR) se nisin (E 234) používá jako konzervaþní látka napĜ. pĜi výrobČ mlékárenských výrobkĤ typu zrající a tavené sýry v nejvyšším pĜípustném množství 12,5 mg kg-1 potraviny [9]. Lysozym hydrolyticky štČpí ȕ(1-4) glykosidické vazby N-acetylmuramové kyseliny a N-acetylglukosaminu v peptidoglykanu bunČþných stČn G+ bakterií [10]. ÚþinnČ pĤsobí 99

pĜi prevenci germinace spor Clostridium tyrobutyricum v sýrech. V ýR se v mlékárenském prĤmyslu pĜipouští použití lysozymu jako konzervaþní látky (E 1105) u pĜírodních zrajících sýrĤ v nezbytném množství [9]. PĜi kombinaci pĤsobení nisinu s lysozymem na buĖky nejdĜíve pĤsobí lysozym (vznik sféroplastu), nisin následnČ perforuje cytoplazmatickou membránu a dojde k bunČþné lysi [11]. CÍLE PRÁCE V pĜedložené práci byla provČĜována role pĜidávaného lysozymu a nisinu (pĜirozenČ produkovaného kmenem L. lactis subsp. lactis NIZO R5 za podmínek in situ) v modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mléþného tuku) pĜi cíleném potlaþování rĤstu B. cereus DMF 2001 pĤvodnČ izolovaného z pudinkového dezertu Danette. MATERIÁL A METODY Bakteriální kmeny. Pro práci byly použity následující bakteriální kmeny (Sbírka bakterií, plísní a kvasinek, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze, ýR): B. cereus DMF 2001 (izolát z dezertu Danette, ýR, 1995) B. cereus DMF 2007 (izolát z jogurtu, ýR, 1995) B. cereus DMF 2008 (izolát z mléka UHT, ýR, 1995) B. subtilis LCC 666 (DMF 2006) (izolát z mléka UHT, ýR, 1995) B. stearothermophillus LCC 796 (DMF 2003) (ATCC, USA, 1995) L. lactis subsp. lactis FI 5876 (DMF 4014) (nisin A; IFR Norwich, VB) L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (DMF 4009) (nisin A; NIZO, Ede, NL) L. lactis subsp. lactis HMM 32 (DMF 4017) (Hostomice, ýR) L. lactis subsp. cremoris MG 1614 (DMF 4012) (IFR Norwich, VB) [12, 13]. Lb. helveticus CH-1 (DMF 3008) (citlivost k nisinu; Ch. Hansen Laboratories A/S, KodaĖ, DK) [14, 15]. Stanovení citlivosti bacilárních a laktokokových kmenĤ k nisinu. Citlivost bacilárních a laktokokových kmenĤ k nisinu byla zjišĢována formou minimální inhibiþní koncentrace nisinu (MICnisinu), vyjadĜující nejnižší detekovatelnou koncentraci nisinu (Nisaplin®; 0; 0.1; 0.5; 1; 5; 10; 50; 100; 500; 1000 IU nisinu.ml-1 = 0,0025; 0,0125; 0,025; 0,125; 0,25; 1,25; 2,5; 12,5; 25 mg nisinu.l-1), zpĤsobující v rĤstových agarech inhibici rĤstu konkrétního testovaného kmene (za vzniku vyjasnČných inhibiþních zón rĤstu kmene pipetovaného na Petriho misku). Stanovení citlivosti bacilárních a laktokokových kmenĤ k lysozymu. U bacilárních a laktokokových kmenĤ byla zjišĢována taková koncentrace lysozymu (Sigma, St. Louis, USA) (0; 0,5; 5; 10; 50; 100 mg.l-1), která u vyšetĜovaných kmenĤ v rĤstových bujónech zpĤsobovala nejvyšší redukci jejich rĤstu, tzn. nejnižší poþet mikroorganismĤ (JTK.ml-1) stanovených plotnovou metodou. Spoleþná kultivace laktokokĤ a bacilĤ v modelovém systému mléka UHT s pĜídavkem lysozymu. Do mléka UHT (0,5 % hm. mléþného tuku) (50 ml) byly jednotlivČ oþkovány (inokulum 1 % obj.) kmeny (B. cereus DMF 2001, L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 a HMM 32)) nebo spoleþnČ kmeny (B. cereus DMF 2001 a L. lactis subsp. lactis NIZO R5; B. cereus DMF 2001 a L. lactis subsp. lactis HMM 32). ZároveĖ byl do kultivaþních nádob (Erlenmayerovy baĖky) pĜidán lysozym (100 mg.l-1). Kultivace kmenĤ probíhaly pĜi teplotČ 30 ºC po dobu 16-18 h. PĜed a po uskuteþnČných kultivacích se byly kmenĤ stanoveny jejich poþty (plotnová metoda) a zmČĜeny aktivní kyselosti mléka (pH). 100

VÝSLEDKY VýbČr bacilárního kmene a Nis+ a Nis- laktokokových kmenĤ pro spoleþné kultivace. Vliv nisinu Z testovaných bacilárních kmenĤ byl k nisinu nejcitlivČjší B. cereus DMF 2001 (MICnisinu byla 0,5 IU nisinu.ml-1 = 0,0125 mg nisinu.l-1). Z testovaných laktokokových kmenĤ byl k nisinu naopak nejménČ citlivý L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (MICnisinu byla 1000 IU nisinu.ml-1 = 25 mg nisinu.l-1). Pro spoleþné kultivace bacilĤ a laktokokĤ v modelovém systému mléka UHT byly vybrány kmeny B. cereus DMF 2001 a L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 a HMM 32).

a) b) Obr. 2. Mikroskopický obraz laktokokových kmenĤ; a) L. lactis subsp. lactis NIZO R5, b) L. lactis subsp. lactis HMM 32 [16]. Vliv lysozymu Z bacilárních kmenĤ došlo ke nejvyššímu snížení poþtu bunČk - o dva Ĝády - u B. cereus DMF 2001 v Živném bujónu za pĜítomnosti lysozymu (100 mg.l-1) (vzhledem ke kultivaþnímu systému bez pĜídavku lysozymu). Z laktokokových kmenĤ došlo ke nejvyššímu snížení poþtu bunČk - o jeden Ĝád - u L. lactis subsp. lactis NIZO R5 v bujónu LM17 za pĜítomnosti lysozymu (100 mg.l-1) (vzhledem ke kultivaþnímu systému bez pĜídavku lysozymu). U kmene L. lactis subsp. lactis HMM 32 došlo v bujónu LM17 za pĜítomnosti lysozymu (100 mg.l-1) ke snížení poþtu bunČk v rámci jednoho Ĝádu (vzhledem ke kultivaþnímu systému bez pĜídavku lysozymu). Kultivaþní systémy bacilárních a laktokokových kmenĤ s pĜídavkem lysozymu (0,5 - 100 mg.l-1) se chovaly velmi individuálnČ. Pro spoleþné kultivace bacilĤ a laktokokĤ v modelovém systému mléka UHT byl vybrán lysozym (100 mg.l-1), který u B. cereus DMF 2001 zpĤsobil nejvyšší snížení poþtu bunČk. Vliv lysozymu a Nis+ a Nis- kmenĤ L. lactis subsp. lactis na rĤst B. cereus DMF 2001 v modelovém systému mléka UHT V mléce UHT byl rĤst B. cereus DMF 2001 snížen v pĜítomnosti L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (produkujícího nisin) o tĜi Ĝády (z hodnoty 3,6.107 JTK.ml-1 na 3,0.104 JTK.ml-1) a v pĜítomnosti L. lactis subsp. lactis HMM 32 (neprodukujícího nisin) o jeden Ĝád (z hodnoty 3,6.107 JTK.ml-1 na 1,6.106 JTK.ml-1). Na snížení rĤstu B. cereus DMF 2001 se podílela kyselina mléþná (produkovaná obČma laktokoky), nisin (pĜirozenČ produkovaný, 145 IU.ml-1 = 3,6 mg.l-1) a pĜidávaný lysozym (100 mg.l-1). Lysozym (100 mg.l-1) snižoval poþet laktokokĤ u obou kmenĤ L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 i HMM 32) i bacilĤ (B. cereus DMF 2001). PĜi spoleþných rĤstech bacilĤ a laktokokĤ v modelovém systému mléka UHT bylo zjištČno, že bacily významnČ neovlivĖovaly (nestimulovaly ani neinhibovaly) rĤst laktokokĤ, pĜestože byla v minulosti stimulace bakterií mléþného kvašení v kokultivaci se silnČ proteolyticky aktivními kontaminanty rodu Bacillus prokázána [17]. 101

Tabulka I Spoleþná kultivace laktokokových kmenĤ a bacilárního kmene v modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mléþného tuku) pĜi teplotČ 30 °C a po dobu 16-18 h za pĜídavku lysozymu (100 mg.l-1) Kultivaþní systém

Krok kultivace

Poþet laktokokĤ -1 JTK [ml ]

L. lactis subsp. lactis NIZO R5

PĜed kultivací

3,5 · 10

Po kultivaci

6,3 · 10

L. lactis subsp. lactis HMM 32

PĜed kultivací

1,3 · 10

Po kultivaci

3,0 · 10

B. cereus DMF 2001

PĜed kultivací

-

6,6 · 10

Po kultivaci

-

3,6 · 10

L. lactis subsp. lactis NIZOR5 PĜed kultivací + B. cereus DMF 2001

pH

8

-

6,32

8

-

4,67

9

-

6,30

8

-

5,47

2,7 · 10

8

9

Po kultivaci

1,7 · 10

L. lactis subsp. lactis HMM 32 PĜed kultivací + B. cereus DMF 2001

Poþet bacilĤ -1 JTK [ml ]

Po kultivaci

9

1,5 · 10

6,8 · 10

8

7

6,31

7

6,26

7

6,31

4

4,34

7

6,29

6

5,21

6,9 · 10 3,0 · 10 3,4 · 10 1,6 · 10

ZÁVċRY V modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mléþného tuku) byl prokázán významný spoleþný úþinek kmenĤ L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 a HMM 32, produkujících kyselinu mléþnou a nisin) a lysozymu (100 mg.l-1) pĜi redukci rĤstu B. cereus DMF 2001. V modelovém systému mléka UHT nebyly prokázány významné antimikrobiální rozdíly mezi L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (kmenem produkujícím nisin) a L. lactis subsp. lactis HMM 32 (kmenem neprodukujícím nisin). Zkušenosti získané z modelového systému mléka UHT by bylo v budoucnu vhodné otestovat v systému reálných potravin. PodČkování Tato práce byla podpoĜena Ministerstvem školství, mládeže a tČlovýchovy ýeské republiky (výzkumný zámČr MSM 6046137305) a Národní agenturou pro zemČdČlský výzkum (výzkumný projekt NAZV QF 3163). LITERATURA 1. Görner F., Valík L.: V knize: Aplikovaná mikrobiológia požívatín (Görner F., Valík L., ed.), s. 334 - 336. Malé Centrum, Bratislava 2004. 2. Meer R.R., Baker J., Bodyfelt F.W., Griffiths M.W.: Psychrotrophic Bacillus spp. in fluid milk products: A review. J. Food Prot. 54, 969 - 979 (1991). 3. David C.: The effect of nisin on the growth of undesirable microorganisms in thermisized curd desserts. Diploma thesis, s. 29, Department of Dairy and Fat Technology, ICT Prague, Prague 2005. 4. Kimoto H., Mizumachi K., Okamoto T., Kurisaki J.: New Lactococcus strains with immunomodulatory activity: Enhancement of Th1-type immune response. Microbiol. Immunol. 48, 75 - 82 (2004). 5. Klaenhammer T.D.: Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochemie 70 (3), 337 - 349 (1988). 102

6. Davidson P.M., Braner A.L.: Antimicrobials in Food, Academic Press, London 1993. 7. Henning S., Metz R., Hammes W.P.: Studies on the mode of action of nisin. Int. J. Food Microbiol. 3, 121-134 (1986). 8. Delves-Broughton J., Gasson M.J.: Nisin. V knize: Natural Antimicrobial Systeme and Food Preservation (Dillon V.M., Board R.G., ed.), s. 99 - 131. Wallingford, Cab International 1994. 9. Vyhláška MZe þ. 304/2004 Sb. kterou se stanoví druhy a podmínky použití pĜídatných a pomocných látek pĜi výrobČ potravin. Sbírka zákonĤ 1997, þástka 110 (2004). 10. McKenzie H.A., White, F.H.: Lysozyme and alpha-lactalbumin: structure, function, and interrelationships. Adv. Prot. Chem. 41, 173 - 315 (1991). 11. Chung W., Hancock R.E.W.: Action of lysozyme and nisin mixtures against lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 60, 25 - 32 (2000). 12. Gasson M.J.: Plasmid components of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing. J. Bacteriol. 154, 1 - 9 (1983). 13. Gasson M.J.: Transfer of sucrose fermenting ability, nisin resistance and nisin production in Streptococcus lactis 712. FEMS Microbiol. Rev. 21, 7 - 10 (1984). 14. Dodd H.M., Horn N., Zhang H., Gasson M.J.: A lactococcal expression system for engineering nisin. Appl. Environ. Mikrobiol. 136, 555 - 556 (1992). 15. Dood H.M., Horn N., Giffard C.J., Gasson M.J.: A gene replacement strategy for engineering nisin. Microbiology 142, 47 - 55 (1996). 16. Tichovský P.: Význam antibakteriálnČ aktivních bakterií mléþného kvašení pro výrobu þerstvých sýrĤ. BakaláĜská práce, s. 36, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze, Praha 2006. 17. Šviráková E., David C., Plocková M.: Vliv Nis+ a Nis- kmenĤ Lactococcus lactis subsp. lactis na rĤst Bacillus cereus DMF 2008 v modelovém systému mléka. MlékaĜské listy - Zpravodaj 93, 15 - 18 (2005). Kontaktní adresa: Eva Šviráková, Ústav technologie mléka a tukĤ, FPBT, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6, ýeská republika, tel: +420 220 443 271, fax: +420 220 443 285, e-mail: [email protected]

103

VPLYV LACTOBACILLUS RHAMNOSUS GG NA RAST CANDIDA MALTOSA V MLIEKU Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Bajúsová Barbora, Medvećová Alžbeta Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, STU Bratislava, Slovensko Effect of Lactobacillus rhamnosus GG on the growth dynamics of Candida maltosa in milk Summary: The growth and survival of yeast Candida maltosa YP1 in ultra-pasteurized milk were studied in relation to the influence of incubation temperature and different initial concentration of probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. Application of 1 % of L. rhamnosus GG at initial concentration of 104 and 106 CFU.ml-1 resulted in partial inhibition of the growth and multiplication of acidtolerant and psychrotrophic strain C. maltosa YP1. At the initial density of L. rhamnosus GG 102 KTJ.ml-1, typical sigmoid kinetics of Candida maltosa YP1 growth was observed. At the higher initial concentrations, the growth of L. rhamnosus GG, caused biphasic growth kinetics of C. maltosa YP1. Inhibitory effect of lactobacillus was performed by primary and secondary metabolites and their undissociated forms, lower pH and temperature. High counts of the culture GG (from 108 to 109 CFU.ml-1) reached in stationary growth phase after 7 to 97 h have also contributed to the yeast growth inhibition. Influence of the factors mentioned above on growth rate of C. maltosa YP1 was significantly described by secondary mathematical linear equations. The need to identify the non-specific metabolites of L. rhamnosus GG also resulted from our study. On the base of the results the possible application of the culture in combination with other strains of lactic acid bacteria is be recommended.

Mlieþne výrobky patria medzi spotrebiteĐsky obĐúbené produkty. V súþasnosti sa do popredia dostáva snaha zvýšiĢ hygienickú kvalitu a bezpeþnosĢ potraviny. Nežiadúci je každý mikrobiálny kontaminant, ktorý dokáže rásĢ, rozmnožovaĢ sa a metabolizovaĢ vo vnútornom prostredí mlieþnych výrobkov. Jedným z novších spôsobov, ako zabrániĢ, resp. spomaliĢ rozmnožovanie nežiadúcich mikroorganizmov v mlieþnych produktoch, je aplikácia tzv. ochranných kultúr. Ich prídavok môže spomaliĢ rast kontaminujúcich mikroorganizmov a predĎžiĢ tak trvanlivosĢ produktu. Jedným z druhov, o ktorý prejavujú mliekarenskí technológovia a mikrobiológovia záujem je druh Lactobacillus rhamnosus. Vybrané kmene tohto druhu, napríklad L. rhamnosus LC 705, sa už využívajú ako komerþné ochranné kultúry v zmesi so zástupcami Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii. Okrem kyseliny mlieþnej, octovej a propiónovej tvoria aj široké spektrum ćalších bližšie neidentifikovaných antimikrobiálne pôsobiacich látok. Iné kmene, napríklad L. rhamnosus GG, sa vyznaþujú probiotickými vlastnosĢami, a tak ich aplikáciou možno zvýšiĢ nielen hygienickú ale i lieþebno-dietetickú hodnotu mlieþnych produktov. Vybrané kmene Lactobacillus rhamnosus sa þasto spolu s Lactobacillus acidophillus využívajú ako probiotické kmene do kyslomlieþnych produktov. Konzumácia mlieþnych produktov obsahujúcich tieto baktérie napomáha lepšie tolerovaĢ laktózu (1, 2). Pozitívny úþinok probiotík na Đudský organizmus bol pozorovaný aj v prípade prevencie cestovateĐských hnaþiek ako aj hnaþiek spájaných s užívaním antibiotík, sulfónamidov, chemoterapeutík ćalej pri urovaginálnych infekciách, imunitných poruchách a osteoporóze. Preukázalo sa, že Lactobacillus rhamnosus GG, ktorý sa vyznaþuje Đudským pôvodom, efektívne redukuje trvanie rotavírusom vyvolanej gastroenteritídy (3, 4, 5, 6) vo svojej štúdii uvádzajú, že kmeĖ L. rhamnosus GG napomáha k urýchleniu lieþby respiraþných ochorení a znižuje potrebu užívania antibiotík. Ćalšou pozitívnou vlastnosĢou probiotík je ich podiel na antikarcinogénnom pôsobení, dokázanom vo viacerých vedeckých štúdiách. Napríklad u Đudí trpiacich na rakovinu hrubého þreva vedci preukázali zníženie obsahu Escherichia coli v stolici pôsobením Lactobacillus acidophilus. Zaznamenalo sa tiež zníženie aktivity E-glukuronidázy, azoreduktázy a nitroreduktázy. Podobné úþinky sa pozorovali aj v prípade aplikácie Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus plantarum a L. rhamnosus GG (7, 8, 9). Zdraviu prospešné úþinky probiotických baktérií sa však prejavia iba v prípade, ak sa do hrubého þreva dostanú v požadovanom množstve. V probiotických produktoch, napríklad jogurtoch 104

a acidofilnom mlieku, by mala byĢ ich koncentrácia na konci doby trvanlivosti 106 až 107 KTJ.ml-1. Iba v tejto a vyššej koncentrácii majú v þreve požadovaný úþinok (10, 11, 12). CieĐom našej práce bolo sledovaĢ vzájomný vzĢah medzi þistou probiotickou kultúrou Lactobacillus rhamnosus GG a kvasinkou Candida maltosa YP1 v UHT mlieku pri viacerých teplotách uchovávania. CieĐom práce bolo získaĢ þo najviac rastových odoziev C. maltosa YP1 na rôzne kombinácie teploty a poþiatoþnej koncentrácie L. rhamnosus GG v mlieku. V práci sa použili princípy prediktívnej mikrobiológie, ktorá sa v potravinárskej mikrobiológii používa najmä na predikcie poþtu a správania sa mikroorganizmov ako aj na predpovede tvorby metabolitov a toxínov mikroorganizmov v rôznych modelových i reálnych substrátoch. Dynamika rastu kvasinky Candida maltosa YP1 zámerne inokulovanej do mliek zaoþkovaných þistou kultúrou Lactobacillus rhamnosus GG (102, 104, 106 KTJ.ml-1) pri teplotách uchovávania 8, 10, 15, 21 a 25 ± 0,5 °C. KmeĖ Lactobacillus rhamnosus GG, ktorý pochádza od fínskych mikrobiológov prof. Ouwehand a Salminena nám za úþelom vykonania experimentov poskytla Dr. Lauková A. z Ústavu fyziológie hospodárskych zvierat SAV Košice s veĐkorysým povolením vyššie uvedených vedeckých pracovníkov z Oddelenia Biochémie a Potravinárskej Chémie Univerzity v Turku, Fínsko. Z rastových þiar vyšetrovaného kmeĖa C. maltosa YP1 pri každej z použitých koncentrácií L. rhamnosus GG a teplotách 8, 10, 15, 21 a 25 ± 0,5 °C sa vypoþítali rastové parametre: dĎžka lagfázy, rastová rýchlosĢ a generaþný þas. S využitím štatistického balíka Microsoft sme analyzovali závislosĢ prvej a druhej rastovej rýchlosti C. maltosa YP1 ako funkcie prirodzeného logaritmu (ln μ) od teploty a poþiatoþnej inokulácie UHT mliek kultúrou L. rhamnosus GG. Kombinovaný vplyv oboch sledovaných faktorov prostredia na rastové rýchlosti C. maltosa bolo možné popísaĢ rovnicami s vysokými korelaþnými koeficientami (R2μ1 = od 0,7282 do 0,9962; R2μ2 = od 0,7248 do 0,9133; obr. 1 a 2). Najvyššie hodnoty rastových rýchlostí C. maltosa boli pozorované pri teplote 25 °C, kedy sa prvé rastové rýchlosti pohybovali v rozmedzí od 0,23 h-1 vo vzorkách bez prídavku laktobacila do 0,032 h-1 vo vzorkách obsahujúcich 6,4. 106 KTJ.ml-1 laktobacila. V prípade nižších teplôt uchovávania, napríklad 8 a 10 °C, boli hodnoty prvých rastových rýchlostí kvasinky C. maltosa vypoþítané v intervale od 0,0119 h-1 (pre LGG 06) do 0,031 h-1(pre kontrolnú vzorku) pri 8 °C, resp. od 0,013 h-1 (pre LGG 06) do 0,044 h-1(pre kontrolnú vzorku) pri 10 °C. Dynamika rastu kvasinky vo vzorkách obsahujúcich poþiatoþné koncentrácie L. rhamnosus GG N0 = 2,0 log, resp. N0 = 4,0 log, bola veĐmi podobná a k výraznejšiemu poklesu prvej rastovej rýchlosti pri jednotlivých teplotách dochádzalo až po inokulácii mliek priemernou poþiatoþnou denzitou laktobacila N0 = 6,0 log. Napríklad pri teplote 15 ± 0,5 °C, vo vzorkách bez obsahu laktobacila bola zaznamenaná rastová rýchlosĢ C. maltosa 0,072 h -1. Zvýšením jeho poþiatoþnej koncentrácie na 2,0 až 4,0 log sa rastová rýchlosĢ C. maltosa znížila na hodnoty 0,059, resp. 0,060 h -1. Až po prídavku L. rhamnosus GG v priemernej poþiatoþnej denzite N0 = 6,0 log klesla prvá rastová rýchlosĢ kvasinky na 0,029 h -1, t. j. takmer o 50 % v porovnaní s predchádzajúcimi experimentami (obr. 1 a 2). V prípade druhej fázy dvojfázových rastových þiar C. maltosa YP1 (obr. 2) sa so zvyšujúcou sa poþiatoþnou koncentráciou L. rhamnosus GG v mlieþnych substrátoch predlžovala druhá lag-fáza, priþom jej najdlhšie trvanie bolo zaznamenané pri teplote 8 °C a N0 = 6,0 log L. rhamnosus GG (225 h, t. j. 9 dní). So zvyšujúcou sa teplotou inkubácie dochádzalo pri jednotlivých priemerných poþiatoþných denzitách laktobacila k zvyšovaniu druhej rastovej rýchlosti (obr. 2). Napríklad pri teplote 8 °C a koncentrácii N0 = 6,0 log L. rhamnosus GG bola druhá rastová rýchlosĢ vypoþítaná na 0,0089 h -1. Postupným zvyšovaním teploty až na 25 °C sa jej hodnota zvýšila takmer 8- násobne (μ2 = 0,071 h -1). Podobne aj pri nižšej poþiatoþnej denzite laktobacila (LGG 04) sa hodnoty druhej rastovej rýchlosti s teplotou zvyšovali, napríklad z hodnoty 0,012 h -1 stanovenú pri teplote 10 °C až na 0,125 h -1 vypoþítanú pri 25 ± 0,5 °C. 105

0,3

y8°C = -0,0026x + 0,0303 2

R = 0,8957

rastová rýchlosĢ [h-1]

0,25

y10°C = -0,0039x + 0,0449 R2 = 0,7282

0,2

y15°C = -0,0058x + 0,0749 2

R = 0,7822

0,15

y21°C = -0,0186x + 0,1651 R2 = 0,9962

0,1

y25°C = -0,0256x + 0,2441 R2 = 0,7631

0,05 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

-1

log [ KTJ.ml ] LGG

0

8 °C

10°C

15°C 25°C

21°C

yLGG06 = 0,1355x - 6,2336 R2 = 0,9133

ln rastová rýchlosĢ

-1 -2

LGG 04 LGG 06

-3 -4 -5

yLGG04 = 0,1411x - 6,2021 R2 = 0,7428

-6 0

5

10

15

20

25

30

teplota [°C]

Obr. 1. a 2. Vplyv L. rhamnosus GG a teploty uchovávania na prvé a druhé rastové rýchlosti C. maltosa YP1. Rast kvasinky v mlieku s 1 % prídavkom probiotickej kultúry L. rhamnosus GG v poþiatoþnej koncentrácii N0 = 6,0 log bolo možné porovnaĢ aj s výsledkami experimentov súbežnej kultivácie C. maltosa YP1 s prídavkom 18 h kultúry L. rhamnosus VT1 v rovnakej poþiatoþnej koncentrácii pri teplote 8 a 21 ± 0,5 °C. Pri súbežnej kultivácii C. maltosa a L. rhamnosus VT1, kvasinka vykazovala klasický sigmoidálny rast, kým poþas kultivácie s kmeĖom L. rhamnosus GG bol pozorovaný dvojfázový rast. Inhibiþný úþinok kultúry L. rhamnosus VT1 sa prejavil hlavne v predĎžení lag-fázy C. maltosa, þo bolo pravdepodobne výsledkom pôsobenia kyseliny mlieþnej, ktorá je jedným z inhibiþných metabolitov vytváraným L. rhamnosus VT1, ale aj v dôsledku pôsobenia iných faktorov (nízke pH, teplota a iné metabolity). Percentuálny obsah kyseliny mlieþnej pôsobiaci na zaþiatku rastu kvasinky sa pohyboval od 0,30 do 0,34 % v závislosti od teploty kultivácie. V prípade kultúry L. rhamnosus GG bol obsah kyseliny mlieþnej na zaþiatku experimentov stanovený na 0,16 %, priþom dĎžky prvej lag-fázy C. maltosa YP1 boli pri jednotlivých teplotách podstatne kratšie ako v prípade súbežných kultivácii kvasinky s L. rhamnosus VT1. Nízky obsah kyseliny mlieþnej mohol pôsobiĢ þiastoþne ako stimulant rastu kvasinky, ktorá sa vyznaþuje oxidatívnym metabolizmom. 106

Záver CieĐom našej štúdie bolo sledovaĢ dynamiku rastu psychrotrófnej, acido- a termorezistentnej kvasinky C. maltosa YP1 zámerne inokulovanej do UHT mliek zaoþkovaných rôznymi koncentráciami probiotického kmeĖa L. rhamnosus GG pri teplotách 8, 10, 15, 21 a 25 °C. Pri aplikácii poþiatoþných koncentrácií kultúry L. rhamnosus 102 KTJ.ml-1 došlo k zníženiu rastovej rýchlosti kvasinky pri jednotlivých teplotách v priemere o 30 % v porovnaní s kontrolnými vzorkami. Prídavok kultúry L. rhamnosus GG do UHT mlieka v poþiatoþných koncentráciách 104 a 106 KTJ.ml-1 viedol k výraznejšej parciálnej inhibícii rastu a rozmnožovania kvasinky C. maltosa YP1, þo sa prejavilo dvojfázovým rastom. Za inhibiþný vplyv L. rhamnosus GG zodpovedali pravdepodobne primárne a sekundárne metabolity a ich nedisociované formy, ktoré v spolupôsobení s kyselinou mlieþnou, zníženým pH a teplotou vytvárali nepriaznivé podmienky pre rast kvasinky. Parciálne k inhibícii prispievali aj vysoké poþty kultúry GG (108 až 109 KTJ.ml-1) dosiahnuté v UHT mlieku po 7 až 97 hodinách súbežnej kultivácie (pri 25 až 8 °C). Kultúra GG a teplota ovplyvĖovali predovšetkým rastové rýchlosti kvasinky, þo bolo možné popísaĢ lineárnymi rovnicami s vysokými korelaþnými koeficientami (R2μ1 = od 0,7282 do 0,9962; R2μ2 = od 0,7248 do 0,9133). Na základe získaných výsledkov je možné aplikáciu kultúry v kombinácii s ćalšími druhmi baktérií mlieþneho kysnutia odporuþiĢ aj ako ochrannú kultúru. Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605. Literatúra: 1. OLIVEIRA, M. N. - SODINI, I. – REMEREF, F. – CORRIER, G.: Effect of milk supplementation and culture composition on acidification, texture properties and microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria. In International Dairy Journal, 2001, vol. 11, p. 935 – 942. 2. OUWEHAND A. C. – SALMINEN, S. J. – ISOLANRI, E.: Probiotics: an overview of beneficial effects. In Antonie van Leeuwenhoek, 2002, vol. 82, no. 1 – 4, p. 279 – 289. 3. OUWEHAND, A. C. – KIRJAVAINEN, P. V. - SHORTT, C. – SALMINEN, S.: Probiotics: mechanisms and established effects. In International Dairy J, 1999, vol. 9, no. 1, p. 43-52. 4. OUWEHAND A. C. – SALMINEN, S. J.: The health effects of cultured milk products with viable and non – viable bacteria. In International Dairy Journal, 1998, vol. 8, no. 9, p. 749 – 758. 5. RINKINEN, M. – JALAVA, K. – WESTERMARCK, E. – SALMINEN, S. – OUWEHAND, A. C.: Interaction between probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor for intestinal Enterococcus faecium colonization? In Veterinary Microbiology, 2003, vol. 92, p. 111 – 119. 6. SAXELIN, M. – TUNKKYNEN, S. – MATTILA-SANDHOLM, T. – DE VOS, V.: Probiotic and other functional microbes: from markets to mechanisms. In Current Opinion Biotechnology, 2005, vol. 16, p. 204 – 211. 7. SAARELA, M. – MOGENSEN, G. – FONDÉN, R. – MÄTTÖ, J. – SANDHOM, T. M.: Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. In Journal Biotechnology, 2000, vol. 84, no. 3, p. 197-215. 8. MERCENIER, A. – PAVAN, S. – POT, B.: Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects. In Current Pharmaceut Design, 2003, vol. 9, no. 2, p. 175-191. 9. SALMINEN, S. - OUWEHAND, A.C. - ISOLAURI, E.: Clinical applications of probiotic bacteria. In International Dairy Journal, 1998, vol. 8, no. 5-6, p. 563-572. 10. VINDEROLA, G. G. – REINHEIMER, J. A.: Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented products. In International Dairy Journal, 2000, vol. 10, p. 271 – 275. 11. FORESTIER, Ch. – DE CHAMPS, Ch. – VATOUX, C. – JOLY, B.: Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. In Research in Microbiology, 2001, vol. 152, p. 167 – 173. 12. GÖRNER, F., VALÍK, ď.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1st ed. Bratislava: Malé Centrum, 2004. 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

Kontaktná adresa: Ing. Liptáková Denisa PhD., Doc. Ing. Valík ďubomír PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika 107

EXTRAKCE BAKTERIOCINU KMENE ENTEROCOCCUS MUNDTII EN3 ORGANICKÝM ROZPOUŠTċDLEM A POMOCÍ ADSORPCE BAKTERIOCINU NA BUNċýNOU STċNU Miller Petr1, Bakir Hatice Eda2, Kuþerová KateĜina1, Chumchalová Jana1, Míková Kamila3 1 Ústav technologie mléka a tukĤ, 3Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha, 2 Department of Food Engineering, Istanbul Technical University. Purification of bacteriocin produced by Enterococcus mundtii EN3 using a organic solvent and the adsorption on the cell surface method Summary: The aim of this work was to determine methods for bacteriocin extraction from the cell-free supernatant of Enterococcus mundtii EN3 strain using protein extraction by organic solvent method and the adsorption on the cell surface method. These methods are used as the first step of bacteriocin’s isolation. Seven different solvents were tested, the influence of broth acidity and supernatant/solvent ratio were determinate. The highest total recovery, the highest antibacterial activity and the highest purification were achieved with 1/3 supernatant/solvent ratio at pH 3 with n-propanol extraction. LM17 was determinated as a more suitable cultivation medium for the adsorption method. The optimal pH value for releasing bacteriocin from the cell is 2. Extraction method gives better results but is laborious, time consuming and requires special equipment. Adsorption method could be an economical procedure to produce large quantities of bacteriocins.

Úvod Bakteriociny jsou bioaktivní peptidy þi peptidové komplexy produkované nČkterými bakteriemi (nejþastČji bakteriemi mléþného kvašení), které mají baktericidní þi bakteriostatické úþinky na jiné, þasto pĜíbuzné druhy. Bakteriociny se používají ke konzervaci potravin a to jak v þisté formČ (komerþní preparát nisinu) tak ve formČ kultury produkující daný bakteriocin (Lactococcus lactis ssp. cremoris JS102, sýr þedar) [1]. Získání þistého bakteriocinu vyžaduje nákladné chromatografické metody a schopnost rĤstu dané kultury v urþité potravinČ bývá omezená a þasto nežádoucí. Tato práce byla zamČĜena na porovnání extrakce baktericionu dvČma výše uvedenými metodami. Bakteriocin produkovaný kmenem EN3 (Enterococcus mundtii, izolát z Tatarské omáþky) má široké antibakteriální úþinky (19 z 20 testovaných kmenĤ laktobacilĤ, 3 z 5 laktokokĤ, Bacillus cereus DMF2001 a Listeria monocytogenes CCM5576). Principem metody ‘extrakce rozpouštČdlem‘ je zmČna dielektrické konstanty zpĤsobená rozpouštČdlem. Ta má vliv na rozpustnost látek. Principem metody ‘adsorpce‘ je adsorpce bakteriocinu na bunČþnou stČnu pĜi neutrální hodnotČ pH a desorpce pĜi nízké hodnotČ pH. Metody Stanovení bakteriocinového titru (BT) Pro stanovení bakteriocinového titru byl použit jako indikátorový mikroorganismus Lactobacillus sakei DMF 3017. U vzorku byla vytvoĜena Ĝada dvojkových, resp. pČtkových ĜedČní (ĜedČno fosfátovým pufrem, pH 6,5), které byly vpichovány na plotnu (agarová vpichová metoda). Plotny byly inkubovány aerobnČ pĜi teplotČ 37 °C po dobu 16-18 hod. Po inkubaci bylo odeþteno nejvyšší ĜedČní, které ještČ zpĤsobovalo vznik inhibiþní zóny. Bakteriocinový titr byl poþítán podle následujícího vzorce: 2 x 1000 5 y 1000 BT BT V V resp. [AU ml-1] (1, resp. 2) kde x resp. y je nejvyšší ĜedČní zpĤsobující tvorbu inhibiþní zóny pro dvojkové ĜedČní (rov. 1) resp. pČtkové (rov. 2) a V [ml] je objem vpichovaného vzorku. V pĜípadČ, že jedno ĜedČní poskytovalo zĜetelnou inhibiþní zónu a následující ĜedČní již zónu neohraniþenou, byl pro výpoþet BT použit prĤmČr z tČchto ĜedČní [2].

108

Extrakce antibakteriálních látek organickým rozpouštČdlem Byl pĜipraven supernatant kmene EN3. Supernatant byl extrahován organickým rozpouštČdlem. K extrakci byl použit n-hexan, diethylether, chloroform, n-propanol, n-butanol, isobutanol a n-amylalkohol. Na vakuové odparce bylo pĜi teplotČ 45 °C pro n-hexan, diethylether a chloroform a pĜi teplotČ 60 °C pro n-propanol, n-butanol, isobutanol a n-amylalkohol rozpouštČdlo odpaĜeno. V pĜípadČ použití n-propanolu byl ke smČsi n-propanolu a supernatantu pĜidán NaCl (50 g l-1) pro oddČlení fází. Organická fáze byla oddČlena a na vakuové odparce byl zbytek rozpouštČdla odpaĜen (45 °C pro n-hexan, diethylether a chloroform a pĜi teplotČ 60 °C pro n-propanol, n-butanol, isobutanol a n-amylalkohol). Zbytek po odpaĜení rozpouštČdla byl rozpuštČn ve 20 ml sterilní vody [4]. Byla stanovena antibakteriální aktivita vodných i organických fází vĤþi Lactobacillus sakei DMF 3017 agarovou vpichovou metodou þi titrem bakteriocinu. V pĜípadČ, kdy byla stanovována vhodná kyselost supernatantu, byla hodnota pH supernatantu upravena pĜed extrakcí na 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 a úþinnost extrakce byla vyhodnocena podle tČchto parametrĤ: specifická aktivita (SA) = BT / obsah bílkovin [AU mg-1] (3) stupeĖ pĜeþištČní (SP) = specifická aktivita (vzorek) / specifická aktivita (supernatant) [1] (4) (5) celková aktivita (CA) = BT V [AU] výtČžnost = 100 celková aktivita (vzorek) / celková aktivita (supernatant) [%] (6) kde V je objem vzorku. V pĜípadČ, kdy byl urþován vhodný pomČr rozpouštČdla k supernatantu, byl k extrakci použit n-propanol v objemovém pomČru 1:1, 1:2, 1:3, 2:3 a pro opakovanou extrakci v pomČru 1:1 vĤþi supernatantu a úþinnost extrakce byla vyhodnocena dle výše uvedených rovnic (3, 4, 5 a 6). Extrakce bakteriocinu adsorpcí na bunČþnou stČnu Byly pĜipraveny roztoky A, B a C (A: 1,0 mol l-1 NaCl, 0,08 % hm. Tweenu 20, 0,066 mol l-1 KH2PO4 o pH upraveném pomocí 1% obj. H3PO4 na hodnotu 1,5, B: na hodnotu pH 2, C: na hodnotu pH 2,5) na desorpci bakteriocinu z bunČþné stČny. Kyselost þerstvČ narostlého kmene EN3 v bujónu LM17 þi MRS nebo LM17 s Tweenem 80 (1 % hm.) byla upravena na hodnotu pH 6. Bujón byl 1,5 hod míchán magnetickým míchadlem pĜi teplotČ 4 °C a poté odstĜedČn (otáþky: 6000 min-1, teplota: 4 °C, doba: 15 min). Usazené buĖky byly promyty fosfátovým pufrem (pH 6,5) a znovu odstĜedČny za stejných podmínek. Usazené buĖky byly rozpuštČny v roztoku B nebo A, B a C a suspenze byly míchány 1,5 hod magnetickým míchadlem pĜi teplotČ 4 °C. Poté byly suspenze odstĜedČny (otáþky: 9000 min-1, teplota: 4 °C, doba: 20 min). Byly sbírány tyto vzorky: pĤvodní supernatant, promývací pufr a supernatanty po koneþném odstĜedČní (koneþné extrakty). Všechny vzorky byly tepelnČ ošetĜeny (90 °C, 10 min.) [1]. Stanovení obsahu bílkovin (OB) Pro stanovení obsahu bílkovin podle Bradfordové bylo použito komerþní þinidlo Bio-Rad. Pomocí standardu hovČzího sérového albuminu byla sestrojena kalibraþní pĜímka pro koncentrace BSA od 0 do 25 Pg ml-1. Reakce vzorku (1,6 ml) s þinidlem (0,4 ml) trvala 20 min a poté byla mČĜena absorbance pĜi vlnové délce 595 nm. Slepý vzorek byl pĜipraven reakcí þinidla Bio-Rad s destilovanou vodou.

Výsledky a diskuse Extrakce bakteriocinu organickým rozpouštČdlem Nejprve bylo vybráno vhodné rozpouštČdlo pro extrakci bakteriocinu ze supernatantu kmene EN3. Ze sedmi testovaných rozpouštČdel byl jako nejvhodnČjší urþen n-propanol, jelikož jako jediný extrahoval bakteriocin do organické fáze (viz tab. I). Z výsledkĤ je patrné, že aspoĖ þást molekuly bakteriocinu je polárního charakteru.

109

Tabulka I Stanovení vhodného rozpouštČla pro extrakci. Fáze RozpouštČdlo vodná organická chloroform ++ n-butanol ± ± isobutanol n-amylalkohol ± n-propanol +++ n-hexan ± diethylether + supernatant +++ - žádná antibakteriální aktivita, r velmi slabá aktivita, + slabá aktivita, ++ silná aktivita, +++ velmi silná aktivita

Podobných výsledkĤ dosáhl také ten Brink, který dokázal acidocin B produkovaný kmenem Lbc. acidophilus M64 extrahovat n-propanolem, n-butanolem a isoamylalkoholem do organické fáze [4]. Dále byla hledána optimální aktivní kyselost, v rozmezí hodnot pH 3-9, supernatantu kmene EN3 pro extrakci bakteriocinu n-propanolem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce II pouze pro hodnoty pH 3-5, jelikož u supernatantĤ o vyšších hodnotách pH nedocházelo k pĜechodu bakteriocinu do organické fáze nebo byl pĜechod velmi slabý. Tabulka II Vliv hodnoty pH na extrakci antibakteriálních látek kmene EN3 n-propanolem. OB pH BT SP CA SA Fáze -1 -1 -1 [AU ml ] ] [1] [AU] [AU mg vzorku [Pg ml ] supernatant 1120 28,7 39000 22400 3 vodná 50 16,9 2600 0 700 organická 500 9,4 53100 1 10000 supernatant 350 32,9 10600 7000 4 vodná 0 15,9 0 0 0 organická 220 6,3 35000 3 4400 supernatant 500 54,1 9200 10000 5 vodná 150 18,2 8200 1 2300 organická 100 7,3 13700 1 2000

VýtČžnost [%] 5 45 0 65 25 20

BT bakteriocinový titr, OB obsah bílkovin, SA specifická aktivita, SP stupeĖ pĜeþištČní, CA celková aktivita

U vzorku pĜi hodnotČ pH 3 (organická fáze) je dosahováno nejvČtší celkové aktivity (10000 AU ml-1) a u vzorku pĜi hodnotČ pH 4 (organická fáze) je dosahováno nejvČtšího stupnČ pĜeþištČní (3) a výtČžnosti (65 %). Proto byly tyto postupy extrakce vybrány jako nejvhodnČjší a byl u nich stanoven pomČr vhodného rozpouštČdla. Byly zkoušeny tyto objemové pomČry supernatantu a rozpouštČdla 1:1, 1:2, 1:3, 2:3 a dále opakovaná extrakce v pomČrech 1:1 (viz tab. III). S rostoucím obsahem rozpouštČdla dochází k vyextrahování menšího obsahu bílkovin do organické fáze, ale bílkoviny s antibakteriální aktivitou se extrahují ve stejném množství (pH 4) nebo jejich obsah roste (zvýšená výtČžnost pĜi pomČrech rozpouštČdla 1:2 a 1:3 u supernatantu o hodnotČ pH 3). S rostoucím obsahem rozpouštČdla tedy dochází k vČtšímu pĜeþištČní bílkovin. Jako nejvhodnČjší zpĤsob extrakce bakteriocinĤ ze supernatantu kmene EN3 organickým rozpouštČdlem byl zvolen tento postup: extrakce n-propanolem v objemovém pomČru 1:3 pĜi hodnotČ pH supernatantu 3 do organické fáze, protože u tohoto postupu dochází k nejvČtšímu pĜeþištČní a je dosahováno nejvyšší aktivity a nejvyšší výtČžnosti. 110

Tabulka III Stanovení vhodného pomČru n-propanolu k supernatantu. pH supernatantu 3 PomČr Fáze SP CA VýtČžnost rozpouštČdla [1] [AU] [%] supernatant 22 400 vodná 0 700 3 1:1 organická 1 10 000 45 vodná 0 200 0 1:2 organická 4 22 400 100 vodná 0 100 0 1:3 organická 5 22 400 100 vodná 0 300 1 2:3 organická 1 10 000 45 vodná 0 200 0 2x organická 2 10 000 45

SP [1] 0 3 0 4 0 5 0 3 0 3

pH supernatantu 4 CA VýtČžnost [AU] [%] 7 000 0 0 4 400 65 0 0 4 400 65 0 0 4 400 65 0 0 4 400 65 0 0 4 400 65

SP stupeĖ pĜeþištČní, CA celková aktivita, 2x opakovaná extrakce v pomČrech 1:1

Extrakce bakteriocinu adsorpcí na bunČþnou stČnu Byla provedena extrakce antibakteriálních látek pomocí adsorpce bakteriocinu na bunČþnou stČnu. Bylo zjištČno, že vhodné kultivaþní médium pro extrakci, je LM17 (viz. tab. IV). Díky pĜítomnosti Tweenu 80 v bujónu LM17 s Tweenem 80 nedocházelo k extrakci. Byla zjišĢována vhodná hodnota pH na desorpci bakteriocinu z bunČþné stČny. Adsorpce probíhala pĜi hodnotČ pH 6 a desorpce tedy pĜi hodnotách pH 1,5, 2 a 2,5 (roztok A, B a C). Výsledky jsou uvedeny v tabulce V. Samotné roztoky A, B a C nemají žádnou antibakteriální aktivitu. Nejlepších výsledkĤ se dosáhlo za použití roztoku B. K nejvČtší desorpci bakteriocinu dochází tedy pĜi pH o hodnotČ 2. Tabulka IV Stanovení vhodného kultivaþního média pro extrakci bakteriocinu. Bujón Výsledný extrakt LM17 + LM17 + Tween 80 MRS +,- pozitivní, negativní antibakteriální aktivita

Tabulka V Extrakce bakteriocinu adsorpcí na bunČþnou stČnu po kultivaci kmene EN3 v bujónu LM17. OB BT SP CA VýtČžnost SA Vzorek [AU ml-1] [1] [AU] [%] [AU mg-1] [Pg ml-1] pĤvodní 800 50,4 15 900 40 000 supernatant promývací pufr 100 7,7 13 100 1 3 000 10 S(A) 1 600 40,5 39 500 2 32 000 80 S(B) 1 600 39,9 40 000 3 32 000 80 S(C) 1 600 43,4 36 900 2 32 000 80 S(A) výsledný extrakt za použití roztoku A, S(B) výsledný extrakt za použití roztoku B, S(C) výsledný extrakt odstĜedČní za použití roztoku C

111

ZávČr Jako nevýhodnČjší zpĤsob extrakce antibakteriálních látek organickým rozpouštČdlem ze supernatantu kmene EN3 byl vybrán postup: extrakce n-propanolem v objemovém pomČru 1:3 pĜi hodnotČ pH supernatantu 3 do organické fáze, protože u tohoto postupu dochází k nejvČtšímu pĜeþištČní (stupeĖ pĜeþištČní 5) a je dosahováno nejvyšší aktivity a nejvyšší výtČžnosti (100 %). Metodou extrakce bakteriocinu na bunČþnou stČnu je získáno 80 % antimikrobiálních látek pĜi stupni pĜeþištČní 3 ze supernatantu kmene EN3 kultivovaném v LM17 bujónu. Vzhledem k dosaženým výsledkĤm, k jednoduchosti a pĜístrojové nenároþnosti byla tato metoda zvolena jako nejvhodnČjší metoda pro extrakci antibakteriálních látek ze supernatantu kmene EN3 a bude dále použita jako první stupeĖ pĜi snaze o úplné pĜeþištČní a následném sekvenování tohoto bakteriocinu. Tato práce byla podpoĜena výzkumným zámČrem MSM 6046137305 a vnitĜním grantem 322080015. Použitá literatura: 1. Eguchi T., Kaminaka K., Shima J., Kawamoto S., Mori K., Choi S., Doi K., Ohmono S.: Isolation and characterization of enterocin SE-K4 produced by thermophilic enterococci, Enterococcus faecalis K-4. Biosci. Biotech. Biochem. 65, 247-253 (2001). 2. Chumchalová J., Josephsen J., Plocková M.: The antimicrobial activity of acidocin CH5 in MRS broth and milk with added NaCl, NaNO3 and lysozyme. Int. J. Food. Microbiol. 43, 33-38 (1998). 3. Schillinger U., Geisen R., Holzapfel W.H.: Potential of antagonistic microorganism and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends Food. Sci. Technol. 7, 58-64 (1996). 4. ten Brink B., Minekus M., van der Vossen J.M.B.M., Leer R.J., Huis inct Veld J.H.J.: Antimicrobial activity of lactobacilli: preliminary characterization and optimization of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus M64. J. Appl. Bacteriol. 77, 140-148 (1994). Kontaktní adresa: [email protected]

112

VÝSKYT BACILLUS CEREUS A BACILLUS LICHENIFORMIS V PRģBċHU VÝROBY STERILOVANÉ SMETANY A TERMIZOVANÉHO DEZERTU NČmeþková Irena1, Roubal Petr1, Pechaþová Marta1, VyletČlová Marcela2, Nejeschlebová Ludmila2 1 MILCOM, a.s., Praha, 2 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis during the manufacturing of sterilized cream and thermized dessert Summary: B. cereus and B. licheniformis play an important role at the production and manufacturing of milk, namely from the point of view food-safety and sensory quality and shelf-life of final products. Occurrence of these microorganisms, total mesophilic count and count of thermoresistant microorganisms were monitored in phase samples taken from the manufacturing line of coffee cream sterilized in autoclave and creamy-curd thermized dessert. 55 of 103 spore-forming isolates were identified as B. licheniformis and 5 as B. cereus. B. licheniformis occurred during the whole manufacturing process. Manufacturing lines had no serious problems. Deterioration of monitored parameters could arise in consequence of incorrect function or improper sanitation of technological plant for fat standardization, cream pasteurisation, cream storage or curd manufacturing.

Úvod V syrovém mléce je dominantním mezofilním sporulátem B. licheniformis, dále B. pumilus a B. subtilis (11). Ze spíše psychrotrofních druhĤ, zpĤsobujících alimentární onemocnČní, byl nejþastČji identifikován B. cereus (13). V roce 1998 byly psychrotolerantní kmeny B. cereus, které rostou pĜi 4 – 7 °C a nerostou pĜi 40 – 43 °C, zaĜazeny do samostatného druhu B. weihenstephanensis (7). Bacily se vyznaþují bohatým enzymovým vybavením, zejména tvorbou proteas a lipas. Typické vady enzymatického pĤvodu jsou sladké srážení mléka, gelovatČní nebo tvorba sedimentu, hoĜknutí nebo zatuchlá pachuĢ (2, 9, 12). B. cereus zpĤsobuje Ĝadu infekþních onemocnČní a otrav z potravin, které jsou zapĜíþinČny tvorbou emetického nebo diarrheálního toxinu (6). Dalšími virulenþními faktory jsou napĜ. extracelulární hemolysin nebo fosfolipasa C (10). B. licheniformis svými toxiny zpĤsobuje vznik otrav z potravin provázených prĤjmy a v polovinČ pĜípadĤ také zvracením (1). Postup práce Cílem této práce je v provozních podmínkách prokázat prĤchod B. cereus a B. licheniformis jednotlivými technologickými kroky a vytipovat možná riziková místa. Ve spolupráci s mlékárnami byly odebírány fázové vzorky z výroby smetany do kávy sterilované v autoklávu a smetano-tvarohového termizovaného dezertu. Celkem byly od každého výrobku analyzovány þtyĜi šarže vyrobené v prĤbČhu pĤl roku. Fázové vzorky byly hodnoceny po jednom kuse, finální výrobky po šesti kusech (sterilovaná smetana po termostatové zkoušce 30 °C/15 dnĤ). Stanovován byl celkový poþet mezofilních mikroorganismĤ (CPM) podle ýSN ISO 6610 (4) a poþet termorezistentních mikroorganismĤ (TRM, 85 °C/10 min) podle ýSN 56 0100 (3). B. cereus a B. licheniformis byly konfirmovány s využitím ýSN ISO 7932 (5). Identifikace obou bacilĤ byla potvrzena v ýeské sbírce mikroorganismĤ, Brno. Výsledky a diskuse Stanovené denzity mikroorganismĤ vykazovaly ve všech þtyĜech šaržích srovnatelné trendy – prĤmČrná data jsou znázornČna na obr. 1 až 3. V pĜípadČ smetany do kávy (obr. 1) se poþet termorezistentních mikroorganismĤ až do sterilace významnČ nemČní – pohybuje se ĜádovČ v desítkách. Naproti tomu celkový poþet mezofilních mikroorganismĤ je ovlivnČn pasterací. Nejvyšší je CPM v syrovém mléce a v syrové 113

smetanČ – 105 až 106 JTK/ml. Pasterací smetany o tuþnosti 10 % (95 – 98 °C/2 – 10 s) je usmrceno 99,95 % mikroorganismĤ. V dalším technologickém kroku (standardizaci) vzrĤstá denzita pĜítomných mikroorganismĤ o Ĝád a v prĤbČhu dalších operací se drží v tisících. Sterilací (117 °C/20 min) je vČtšina mikroorganismĤ usmrcena – ze všech finálních výrobkĤ dohromady byly vykultivovány pouze dvČ kolonie.

7

6

log (JTK/ml)

5

4 CPM TRM 3

2

1

0 syr. ml.

syr. sm.

past. sm. stand. sm.

pĜed homog.

po homog. pĜed steril.

Obr. 1 Fázová kontrola výroby smetany do kávy Na obr. 2 a 3 jsou znázornČny mikrobiologické pomČry pĜi výrobČ smetano-tvarohového termizovaného dezertu. Za daných podmínek (83 – 85 °C/8 min) byl zjištČn pasteraþní efekt pro mléko 99,98 %, pro ostrou smetanu pasterovanou 95 – 98 °C/2 – 10 s tato hodnota þiní 98,56 %. Mléko je zakysáváno smetanovou kulturou na denzitu 105 – 106 JTK/ml. BČhem fermentace se CPM zvyšuje o Ĝád a v dalších fázích výroby tvarohu se na této hodnotČ udržuje. Používaný záhĜev (60 – 64 °C/4 – 6 min) neslouží k inaktivaci mikroorganismĤ, ale ke zvýšení výtČžnosti v dĤsledku navázání ȕ-laktoglobulinu na Ȥ-kasein. BČhem skladování tvarohu klesá celkový poþet mikroorganismĤ o více než tĜi Ĝády. To by mohlo být zpĤsobeno odumíráním mikroorganismĤ ve výraznČ kyselém prostĜedí (pH nižší než u fermentovaných mléþných výrobkĤ), zejména pokud je tvaroh nedostateþnČ chlazen nebo delší dobu skladován. Naproti tomu bČhem skladování pasterované smetany se prakticky obnovuje výše CPM, která byla v syrovém mléce. Smísením s ostatními surovinami se CPM ještČ o Ĝád zvyšuje. PravdČpodobnČ dochází k dalšímu pomnožení mikroorganismĤ ze smetany, neboĢ CPM tvarohu je tisíckrát nižší než CPM smetany a další suroviny na výrobu dezertu (cukr, stabilizátory, aroma) netvoĜí významný podíl na objemu smČsi. Porovnáním obr. 2 a 3 lze však konstatovat, že tvaroh mĤže být pĜíþinou navýšení denzity termorezistentĤ. Termizací smČsi (68 – 70 °C/15 s) je zniþeno 97,42 % mikroorganismĤ. BČhem skladování finálního výrobku klesá CPM o témČĜ dva Ĝády. Denzita termorezistentních mikroorganismĤ se v poþáteþních fázích výroby pohybuje ĜádovČ v desítkách, od záhĜevu koagulátu až po finální výrobek je o Ĝád vyšší.

114

8 7

log (JTK/ml popĜ. g)

6 5 CPM

4

TRM

3 2 1 0 syr. ml.

past. ml.

zakysání

koagulát

koag. zahĜ.

tvaroh odstĜ.

tvaroh barel

Obr. 2 Fázová kontrola výroby dezertu – výroba tvarohu

7

6

log (JTK/ml popĜ. g)

5

4 CPM TRM 3

2

1

0 syr. sm.

past. sm.

sm. silo

smČs pĜed smČs po term. term.

smČs nášleh.

Obr. 3 Fázová kontrola výroby dezertu – pĜíprava a zpracování smČsi

115

výrobek

Izolováno bylo celkem 103 sporotvorných aerobních bakterií, v prĤmČru 10 z jedné šarže výroby smetany a 16 z výroby dezertu. 55 izolátĤ bylo identifikováno jako B. licheniformis, 5 jako B. cereus. VysvČtlením tohoto rozdílu mĤže být výrazné zastoupení B. licheniformis, který proti B. cereus pĤsobí inhibiþnČ (11). Vyšší frekvenci záchytnosti B. licheniformis než B. cereus uvádí ve své práci i VyletČlová a Hanuš (14). B. cereus byl izolován pouze ze syrové smetany, pasterovaného mléka a finálního termizovaného dezertu. B. licheniformis byl pĜi výrobČ sterilované smetany izolován ze všech odbČrových míst s výjimkou smetany po standardizaci a finálního výrobku. Protože pĜi standardizaci nedochází k inaktivaci mikroorganismĤ, pĜedpokládat lze jeho prĤchod. Vzhledem k rozsahu této práce a nízké pravdČpodobnosti záchytu bakterií po sterilaci nebyl prĤchod sledovaných bacilĤ do finálního výrobku prokázán. Tato možnost však nebyla vyvrácena. Ve druhé sledované šarži termizovaného dezertu byl B. licheniformis zachycen ve všech fázích výroby. Výjimkou byl tvaroh skladovaný v barelu pĜed použitím k pĜípravČ smČsi. Z tohoto místa byl B. licheniformis izolován ve þtvrté šarži. ZĜejmý je prĤchod B. licheniformis celým výrobním procesem od syrového mléka až po finální výrobek. ZávČr Použitými metodami nebyly u žádného z vyšetĜovaných vzorkĤ zjištČny závady. Vytipovány však byly technologické kroky, které mohou být v pĜípadČ nesprávné funkce nebo nedostateþné sanitace pĜíþinou zhoršení sledovaných mikrobiologických parametrĤ. Výroba sterilované smetany nezahrnuje výraznČ riziková místa. Pozornost by mČla být vČnována standardizaci tuþnosti. Ke zhoršení mikrobiologických parametrĤ mĤže docházet smČšováním s ménČ kvalitní surovinou nebo v dĤsledku nesprávnČ provádČné sanitace. V pĜípadČ smetano-tvarohového termizovaného dezertu se ukázala jako slabé místo výroba smetany. Problematická je pasterace ostré smetany, neboĢ vysoký obsah tuku zhoršuje proces sdílení tepla a navíc pĤsobí pĜi záhĜevu vĤþi mikroorganismĤm protektivnČ. Nezbytná je správná funkce pastéru – pĜetlak na stranČ pasterované smetany a dostateþná tČsnost zaĜízení, aby nedocházelo k prĤniku syrové smetany do pasterované, a dále dĤkladné odstraĖování usazenin z tepelného výmČníku. K nevhodnému nárĤstu celkového poþtu mikroorganismĤ dochází bČhem skladování pasterované smetany. Doporuþit lze co nejvČtší možné zkrácení doby skladování a dodržení chladícího ĜetČzce. V obou sledovaných výrobách je denzita termorezistentních mikroorganismĤ prakticky konstantní nebo se mírnČ zvyšuje. Jediným krokem, ve kterém dochází k jejímu snížení, je sterilace. Hlavním zdrojem termorezistentĤ v dezertu je tvaroh. PravdČpodobnými pĜíþinami jsou kontaminace z biofilmĤ nebo aktivace spor pĜi záhĜevu koagulátu. S výjimkou sterilace byl v provozních podmínkách prokázán prĤchod B. licheniformis celým výrobním procesem sterilované smetany i termizovaného dezertu od vstupní suroviny až po finální výrobek. V souladu se zjištČním, že hlavním zdrojem B. cereus v pasterovaném mléce je vstupní surovina (8), ze získaných výsledkĤ pro obČ sledované technologie vyplývá význam kontaminace syrového mléka B. licheniformis. PodČkování Tato práce vznikla za finanþní podpory NAZV MZe ýR pĜi Ĝešení projektu QF 4004 – Vývoj metody pro urþení pĤvodu kontaminace finálních mléþných výrobkĤ potravními patogeny. Literatura 1. Bacteria Genomes, Bacillus licheniformis [on-line]. European Molecular Biology Laboratory – European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) [cit. 2006-12-20]. Dostupný na www:

116

2. Celestino, E. L., Iyer M., Roginski, H.: Reconstituted UHT-treated milk: Effects of raw milk, powder quality and storage conditions of UHT milk on its physico-chemical attributes and flavour. Int. Dairy J. (1997), 7: 129 – 140. 3. ýSN 56 0100 Mikrobiologické zkoušení poživatin, pĜedmČtĤ bČžného užívání a prostĜedí potravináĜských provozoven. ýNI, Praha, 1994. 4. ýSN ISO 6610 Mléko a mléþné výrobky – Stanovení poþtu jednotek mikroorganismĤ tvoĜících kolonie – Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 30 °C. ýNI, Praha, 1996. 5. ýSN ISO 7932 Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení poþtu Bacillus cereus. Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 30 °C. ýNI, Praha, 2005. 6. Gabig-Ciminska, M., Andresen, H., Albers, J., Hintsche, R., Enfors, S. O.: Identification of pathogenic microbial cells and spores by electrochemical detection on a biochip. Microb. Cell Factor. (2004), 3:2. 7. Lechner, S., Mayer, R., Francis, K.P., Prüss, M., Kaplan, T., Wiessner-Gunkel, E., Steward, G.S.A.B., Scherer, S.: Bacillus weihenstephanensis spp. no. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int. J. Syst. Bacteriol. (1998), 48: 1373 – 1382. 8. Lin, S., Schraft, H., Odumera, J. A., Griffiths, M. W.: Identification of contamination sources of Bacillus cereus in pasteurised milk. Int. J. Food Microbiol. (1998), 43: 159 – 171. 9. Santos, M. V., Ma, Z., Caplan, Z., Barbano, D. M.: Sensory threshold of off-flavours caused by proteolysis and lipolysis in milk. J. Dairy Sci. (2003), 86: 1601 – 1607. 10. Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E., Holt, J. G.: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1986, str. 1113, 1131, 1133. ISBN 0-683-07893-3. 11. Sutherland, A. D. & Murdoch, R.: Seasonal occurrence of psychrotrophic Bacillus species in raw milk, and studies on the interaction with mesophilic Bacillus sp. Int. J. Food Microbiol. (1994), 21: 279 – 292. 12. Valero, E., Villamiel, M., Miralles B., Sanz J., Martínez-Castro I.: Changes in flavour and volatile components during storage of whole and skimmed UHT milk. Food Chem. (2001), 72: 51 – 58. 13. VyletČlová, M., Švec, P., Páþová, Z., Sedláþek, I., Roubal, P.: Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis strains in the course of UHT milk production. Czech J. Anim. Sci. (2002), 47 (5): 200 – 205. 14. VyletČlová M., Hanuš O.: Výskyt vybraných potravních patogenĤ pĜi výrobČ UHT mléka, jogurtu a sýru a jejich vztah k nČkterým skupinám mikroorganismĤ. VeterináĜství (2005), 9: 567 – 572. ISSN 050-68-231. Kontaktní adresa Ing. Irena NČmeþková, MILCOM, a.s., Ke Dvoru 12a, 160 00 Praha 6, tel.: 235 354 551-2, [email protected]

117

MIKROBIOLOGICKÁ A MOLEKULÁRNċ-BIOLOGICKÁ DETEKCE BAKTERIE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM V POLOTVRDÝCH SÝRECH Sládková Pavla, Burdychová Radka Ústav technologie potravin, MZLU Brno Detection of Clostridium tyrobutyricum in semi-hard cheeses using microbiological and PCR methods Summary: Butyric acid fermentation caused by the outgrowth of clostridial spores present in raw milk can create considerable loss of product, especially in the production of semihard cheeses. This defect is called the late blowing defect in cheese. Modern studies show, that only one bacterium of the genus Clostridium is able to provoke late blowing – Clostridium tyrobutyricum. Semihard cheeses with visible clostridial defect were used for analysis. In this work, microbiological detection of butyric acid producing clostridia in semihard cheeses was optimalized. Also biochemical analysis (using API testes) of mentioned bacteria was performed. Further experiments were focused on optimalization of rapid PCR method for Clostridium tyrobutyricum identification. The results show, that this PCR metod is suitable for rapid screening of the presence of Clostridium tyrobutyricum in late- blowing defect cheeses.

Úvod: Vedle požadavku na zdravotní nezávadnost sýra jsou základními znaky kvality zralého polotvrdého sýra odpovídající fyzikálnČ-chemické složení a senzorické vlastnosti. PĜi zrání a vývoji výsledné chuti a vĤnČ zralých sýrĤ hrají významnou úlohu zmČny bílkovinné matrice sýrĤ spolupĤsobením proteáz z mléka, použitými þistými mlékaĜskými kulturami, použitého syĜidla i kontaminující mikroflórou, pĜežívající pasteraci mléka urþeného pro výrobu sýrĤ (3). Významný vliv na výslednou kvalitu polotvrdých sýrĤ mají bakterie máselného kvašení rodu Clostridium. Ke kontaminaci touto bakterií nejþastČji dochází ze siláže, pĜípadnČ v prvovýrobČ mléka pĜi špatných hygienických podmínkách. Jestliže zvíĜe pozĜe vČtší množství tČchto anaerobních bakterií nebo spor, mĤže za urþitých podmínek v trávicím traktu dojít k jejich zmnožení, jsou vyluþovány výkaly a mĤžou i pĜi minimálním zneþištČní vemene kontaminovat mléko. Zástupci rodu Clostridium mají v sýrech vhodné podmínky pro klíþení a pomnožování, s následnou produkcí vodíku a kyseliny máselné. Dochází k tvorbČ vČtších i menších dutinek oddČlených od sebe tenkou blankou a sýry získávají pálivou chuĢ po zvČtralém másle. Tato vada se oznaþuje jako pozdní duĜení sýrĤ. Za pĤvodce této vady byla v nejnovČjších studiích oznaþena jediná bakterie – Clostridium tyrobutyricum (4). Množství spor, které pozdní duĜení zpĤsobuje, se pohybuje v rozmezí 5 až 106 spor na litr mléka urþeného k výrobČ sýrĤ (6). Poþet spor, které zpĤsobí pozdní duĜení sýrĤ, je závislé také na velikosti a tvaru sýra. Jsou známé pĜípady, kdy kontaminace jednou endosporou C. tyrobutyricum zpĤsobila vadu pozdního duĜení u sýru Gouda (5). Clostridium tyrobutyricum je grampozitivní sporulující anaerobní bakterie. Na masopeptonovém krevním agaru roste v drobných, okrouhlých šedobílých koloniích s jemnými hladkými okraji o velikosti 0,5 mm. Optimální teplota rĤstu je 37 °C, je schopno rĤstu i pĜi teplotČ 25 °C. PĜi teplotČ 45 °C již mikrob neroste. RĤst v bujónu podporuje pĜítomnost fermentativních cukrĤ jako je glukosa, fruktosa nebo laktosa. RĤst je inhibován pĜítomností 6,5 % NaCl v mléku. V souþasné dobČ se mnoho prací zabývá technologickým významem a negativním vlivem C. tyrobutyricum na zrání polotvrdých sýrĤ a jejich finální kvalitu. Mezi metody pro stanovení a identifikaci této bakterie patĜí kultivace na RCM (Reinforced Clostridium Medium) a API testy vyrábČné firmou bioMerieux, Inc. Pomocí API je mikrobiální identifikace jednodušší, rychlejší a spolehlivČjší. Další významnou metodou je molekulárnČ biologická metoda PCR. S její pomocí jsme schopni na základČ analýzy deoxyribonukleové kyseliny stanovit konkrétní druh mikroorganismu. V roce 1995 použili (6) tuto metodu ke stanovení výše zmiĖovanému C. tyrobutyricum v syrovém mléce.

118

Materiál a metody: 1. Bakteriální kmeny a jejich rĤstové podmínky Bakteriální buĖky C. tytobutyricum (soukromá sbírka Milcom, Tábor) byly kultivovány anaerobnČ na RCM médiu pĜi 37 °C po dobu 5 dní. Kultura byla použita jako pozitivní kontrola pro PCR. 2. Izolování mikroorganismĤ ze sýrĤ K analýze byly použity polotvrdé sýry s vadou pozdního duĜení. Dvojice 10 g vzorkĤ byla zalita 90 ml sterilního fyziologického roztoku (NOACK, Francie) a homogenizována 2 minuty. NáslednČ byly zhomogenizované vzorky zĜedČny sterilním fyziologickým roztokem v pomČru 1:10 a rozpipetovány do sterilních Petriho misek v množství 1 ml. Jako živná pĤda bylo použito RCM médium s bromcresolovou modĜí (Milcom,Tábor, ýeská republika) a s polymyxinem B (500 mg/l roztoku). Vzorky byly kultivovány v anaerobních podmínkách pĜi 37°C po dobu 5 dní. Presumptivní kolonie byly 2x pĜeþištČny pĜes jednu kolonii a použity pro izolaci DNA. PĜi zkumavkové metodČ bylo použito RCM médium s bromcresolovou modĜí (Milcom,Tábor, ýeská republika) a s polymyxinem B (500 mg/l roztoku), které bylo rozpipetováno po 10 ml do sterilních zkumavek. Do média bylo rozpipetováno pĜíslušné ĜedČní homogenizovaného vzorku v množství 1 ml. Obsah zkumavky byl šetrnČ promíchán a po mírném zchladnutí zalit sterilním parafinovým voskem. Zkumavky byly inkubovány v termostatu pĜi 37 °C po dobu 5 dní. 3. Izolace DNA PCR metodou Standardní DNA manipulace byly provedeny podle SAMBROOK et al. (2001). PCR byla provedena v koneþném objemu 25 μl obsahujícím 10 ng genomové DNA, 10 pmol každého primeru Ct1F/Ct1R, 1 U Taq DNA polymerázy a pĜíslušné množství Qiagen HotStar Master Mixu (Qiagen, Hilden, Germany). Vzorky DNA byly nejprve kompletnČ denaturovány 15 min. inkubací pĜi 95 °C. DNA byla amplifikována ve 30 cyklech: denaturace pĜi 95 °C po dobu 45 s, pĜipojení primerĤ pĜi 55 °C po dobu 45 s a elongace pĜi 72 °C po dobu 75 s, s použitím modelu PTC – 150 HB thermal cycler (MJ Research, Waltham, MA, USA). V posledním amplifikaþním cyklu byly vzorky inkubovány 5 min pĜi 72 °C pro kompletní elongaci PCR produktĤ. PCR produkty byly vizualizovány agarosovou gelovou elektroforézou (1 %, 5 V/cm, 60 min.) a barvením ethidium bromidem (0,5 μl/ml). Nested PCR byla provedena s primery Ct2F/Ct2R pĜi stejném amplifikaþním programu. Do PCR smČsi bylo pĜidáno 5 μl PCR produktu z 1. cyklu. Výsledky a diskuse: Práce byla zamČĜena na stanovení a identifikaci kmene C. tyrobutyricum ze dvou vzorkĤ polotvrdých sýrĤ, které vykazovaly zjevné senzorické zmČny s podezĜením na vadu pozdního duĜení sýrĤ. Zkumavková metoda byla v této práci využita pouze k orientaþnímu stanovení druhu C. tyrobutyricum. Tato metoda je doporuþena k orientaþnímu stanovení kyseliny a plyn produkujících druhĤ Clostridium sp. v mléce (7). PĜi stanovení C. tyrobutyricum zkumavkovou metodou byla využita pĤda RCM s bromcresolovou modĜí a polymyxinem B. Již po 24 hodinách byly zaznamenány pozitivní reakce. Došlo ke zmČnČ barvy média z þervenofialové na žlutohnČdou. Tvorbou vodíku byla parafinová zátka vyražena smČrem vzhĤru a agar ve zkumavce na nČkolika místech potrhán. Stanovení C. tyrobutyricum bylo provedeno plotnovou metodou. PĜi práci bylo použito RCM médium s bromcresolovou modĜí (Milcom, a.s., Tábor) pro stanovení poþtu sporulujících anaerobních mikroorganismĤ v mléþných výrobcích, obohaceno pĜídavkem polymyxinu B (500 mg/l). C. tyrobutyricum bylo detekováno v obou vzorcích sýra rĤstem specifických velkých þoþkovitých žlutých kolonií o prĤmČru 0,5 mm. ýichem bylo možné zaznamenat zápach po kyselinČ máselné. Tvorba vodíku byla patrná potrháním agaru. Poþet kolonií odeþtených a 119

zprĤmČrovaných ve vzorku þ. 1 byl 10,0 KTJ/g. Ve vzorku þ. 2 bylo 55,0 KTJ/g. (6) uvádČjí, že množství spor, které zpĤsobuje pozdní duĜení sýrĤ, se pohybuje v rozmezí 5 až 106 spor na litr mléka urþeného k výrobČ sýrĤ. Stanovené poþty C. tyrobutyricum ve vzorcích sýrĤ prokazují vadu pozdního duĜení sýrĤ. Pro srovnání správnosti pracovního postupu a vyhodnocení plotnové i zkumavkové metody byl souþasnČ testován obČma metodami sbírkový bakteriální druh C. tyrobutyricum (soukromá sbírka Milcom, Tábor). PĜítomnost C. tyrobutyricum byla potvrzena pomocí API testĤ (bioMérieux, Francie) - API 50 CHB a RAPID ID 40 A. Protože jsou však API testy založeny na prĤkazu biochemických vlastností analyzovaných bakterií a z literatury je známo, že se biochemické vlastnosti sbírkových a terénních kmenĤ mohou znaþnČ lišit, pĜítomnost C.tyrobutyricum byla ovČĜena pomocí PCR, která je založena na analýze DNA stanovovaných mikroorganismĤ. Pro PCR byla v této práci použita HotStar Taq DNA smČs (Qiagen), která obsahuje HotStar Taq polymerázu spolu s pĜíslušnými komponentami PCR. Tato polymeráza je modifikovanou formou Taq DNA polymerázy. V PCR smČsi je v inaktivovaném stavu, takže nemá žádnou polymerázovou aktivitu. Absence polymerázové aktivity brání extenzi nespecifických hybridizaþních primerĤ a vzniku primerových dimerĤ, které se mohou tvoĜit pĜi nízkých teplotách na poþátku PCR a bČhem prvního PCR cyklu. HotStar Taq DNA polymeráza je aktivována desetiminutovou až patnáctiminutovou inkubací pĜi 95 °C (2). Koncentrace polymerázy je vzhledem k ostatním komponentám smČsi již optimalizována, což minimalizuje tvorbu nespecifických PCR produktĤ a zaruþuje dobrou amplifikaþní úþinnost enzymu. PCR pufr obsahuje vyváženou kombinaci KCl a (NH4)2SO4, které jsou dĤležité pro specifickou hybridizaci primerĤ s DNA matricí. Optimalizovaná koncentrace hoĜeþnatých iontĤ zaruþuje dobrou úþinnost reakce a reakþní specifitu. Pro optimalizaci PCR je nutné pouze ovČĜení vhodného množství DNA a poþtu PCR cyklĤ (1). Optimální bylo použití 10 ng DNA do PCR smČsi a 30 cyklĤ polymerázové ĜetČzové reakce. PCR byla použita pro identifikaci vykultivovaných kolonií z analyzovaných vzorkĤ sýrĤ (Obr. I). Do PCR reakce byla jako DNA templát použita purifikovaná DNA izolovaná z presumptivního bakteriálního kmene C. tyrobutyricum z RCM agaru. Specifické PCR produkty oþekávané velikosti (237 bp) byly detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy, která potvrdila pĜítomnost kmene C. tyrobutyricum v analyzovaných vzorcích sýrĤ. 1 bp

bp

2

3

4

5

bp

1200 1000 500 237

Obr. 1. PCR detekce C. tyrobutyricum izolovaného z polotvrdých sýrĤ. BČh þ. 1 a 2: vzorky sýru pozitivního na pĜítomnost C. tyrobutyricum, bČh þ. 3: pozitivní PCR kontrola (C. tyrobutyricum, Milcom, Tábor), bČh þ. 4: negativní PCR kontrola (komponenty PCR bez DNA), bČh þ. 5: 100 bp ladder (New England Biolabs, Anglie) 120

ZávČr: 1. C. tyrobutyricum bylo detekováno ve všech sýrech s viditelnou klostridiální vadou v koncentraci 10.0 a 55.0 KTJ/g. 2. PĜítomnost C. tyrobutyricum byla potvrzena pomocí API testĤ (BioMérieux, Francie) API 50 CHB a RAPID ID 40 A. 3. PĜítomnost C. tyrobutyricum byla potvrzena pomocí PCR (6). Použitá literatura: 1. BURDYCHOVÁ, R.: Skríning vybraných startovacích bakteriálních kultur na pĜítomnost DNA sekvencí kódujících dekarboxylázu tyrosinu. Acta univ. Agric. Et silvic. Mendel. Brun., 2006, LIV, No. 5, pp. 7 – 12 2. DRÁBER, P., PETěÍýEK, M., BOUBELÍK, M., BRDIýKA, R., ZADINA, J.: Pokroky v PCR technologii a jejím využití. Pracovní materiály semináĜe. 1. vyd. Praha: Ústav molekulární genetiky AVýR. 1993, 550 s. 3. ERBAN, V., ýERNÝ, V., KOMÁRKOVÁ, E.: ZmČny ve složení sýrové hmoty bČhem zrání. Sborník mléko a sýry, 2006, pp. 4 4. FRAZIER, W. C., WESTHOFF, D.: Food Mikrobiology, 1988, 4th edition. New York: McGrew Hill Book, ISBN 0-07-021921-4, 539 s 5. CHENG, S. Y., INGHAM, S. C.: Influence of milk centrifugation, brining and ripening conditions in preventing gas farmation by Clostridium spp. in Gouda Cheese, International Journal of Food Mikrobiology, 2000, [online], vol. 54, is. 3 [cit. 2006 –12-07] 6. HERMAN, L. M. F., DE BLOCK, J. H., WAES, G. M.: A direct PCR Detection Method for Clostridium tyrobutyrikum Spores in up to 100 Milliliters of Raw Milk, Applied and Environmental Microbiology, Dec. 1995, p. 4141-4146 7. NċMEýKOVÁ, I., PECHAýOVÁ, M., ROUBAL, P.: Semikvantitativní stanovení Clostridium sp. zkumavkovou metodou, MlékaĜské listy, 2006, 95, pp. 16 - 17 8. SAMBROOK, J., FRITCH, E. F., MANIATIS, T.: Molecular cloning, 2001, 3rd. Ed. New York: Cold spring Barbor Lab. Press.

Kontaktní adresa: Ing. Pavla Sládková, Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, ýeská republika. Ing. Radka Burdychová Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, ýeská republika.

121

IZOLÁCIA A PCR-TYPIZÁCIA KMEĕOV BAKTÉRIÍ MLIEýNEHO KYSNUTIA Z BRYNDZE 1 Bertaová Gabriela , Kuchta Tomáš 1, Valík ďubomír 2, Pangallo Domenico 3 1 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava; 2 Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita, Bratislava, 3 Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied, Bratislava Isolation and PCR-typing of lactic acid bacteria from bryndza cheese Summary: Non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) are the natural microflora of bryndza cheese (typical Slovak sheep cheese). NSLAB during cheese manufacturing contribute to an increase in the level of free amino acids, peptides, and free fatty acids, which leads to enhanced flavour intensity and accelerates cheese ripening. Several kinds of NSLAB were isolated from two different bryndza cheeses by cultivation on MRS plates. The isolated NSLAB were identified by API 50 CHL as: Lactobacillus plantarum (11 strains), Lb. brevis (4 strains), Lb. paracasei subsp. paracasei (6 strains), Lb. acidophilus (2 strains), Lb. curvatus (2 strains), Lb. fermentum (5 strains) and Lactococcus lactis subsp. lactis (5 strains). All the NSLAB were also characterized by two PCR-based methods, the repetitive extragenic palindrome polymerase chain reaction (REP-PCR) and the random amplified microsatellite polymorphic DNA (RAMP). The methods were optimized by setting up the correct DNA concentration of the samples and by the selection of a suitable PCR program. Both methods were able to differentiate the NSLAB strains on the species level and also to extend their characterization to the subspecies level.

Úvod Bryndza je zrejúci tvarohovitý syr s bielou až žltkavou farbou a jemnou roztierateĐnou konzistenciou, ktorý patrí do skupiny prírodných syrov. Výroba bryndze má na území Slovenskej Republiky dlhoroþnú tradíciu. Základnou surovinou na výrobu bryndze je ovþí syr (ovþí hrudkový syr), alebo jeho skladovaná forma – skladovaný ovþí syr (sudový ovþí syr) vyrobený z ovþieho mlieka a hrudkový syr vyrobený z kravského mlieka. Najviac zastúpenou mikroflórou v bryndzi sú baktérie mlieþneho kysnutia. Baktérie mlieþneho kysnutia tvoria veĐkú prirodzenú skupinu nepohyblivých, nesporulujúcich grampozitívnych kokov a paliþiek, ktoré svojím fermentatívnym metabolizmom produkujú kyselinu mlieþnu a ćalšie látky, vćaka ktorým tradiþná bryndza získava svoje jedineþné vlastnosti [1]. CieĐom tejto práce bola izolácia kmeĖov baktérií mlieþneho kysnutie z bryndze, priþom sme sa sústredili na druhy rodu Lactobacillus. Použili sa klasické fenotypické metódy a molekulárnobiologické metódy založené na polymerázovej reĢazovej reakcii (PCR). ZároveĖ sa overila aplikovateĐnosĢ typizaþných metód REP-PCR a RAMP na súbore izolovaných kmeĖov Lactobacillus sp. Materiál a metódy Vzorky bryndze sa spracovali štandardnou mikrobiologickou technikou a analyzovali na selektívnych médiách MRS Lactobacillus agar (anaeróbna kultivácia pri 37 °C, 24-72 h) a M-17 agar (aeróbna kultivácia pri 30 °C, 24-48 h). Z vyrastených kolónií na MRS agare sa z každej vzorky na základe morfológie kolónií vybralo 5-6 kolónií. Vybrané kolónie sa podrobili morfologickej, fyziologickej analýze: farbenie podĐa Grama, katalázová skúška, KOH test, rast baktérií v zvislom agarovom stĎpci, tvorba plynu z glukózy a biochemickej analýze identifikaþným systémom API 50 CHL (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francúzsko). Ako kontrolné kmene sa použili: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCM 7275, Lb. casei CCM 4798, Lb. plantarum CCM 3626, Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 1877. Z 5 ml kultúry vyrastenej poþas 24 h kvapalnej pôde MRS pri 37 °C sa izolovala DNA použitím chaotropickej extrakcie na tuhej fáze súpravou QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko). PCR sa realizovala v 25 μl reakþnej zmesi. Na RAMP sa použili priméry K7 (CAA CTC TCT CTC TCT) a 1254 (CCG CAG CCA A) [2]. Pre REP-PCR sa použili priméry REP 1R-I (III 122

ICG ICG ICA TCI GGC) a REP 2-I (ICG ICT TAT CIG GCC TAC) [3]. Použila sa HotStarTaq DNA polymeráza (Qiagen). Pri optimalizácii koncentrácie DNA sa použivalo 50, 100, 150, 200, 300 ng DNA. Amplifikácia prebiehala v cykléri Biometra Personal (Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom: úvodná denaturácia pri 95 °C, 15 min; 30 cyklov amplifikácie (denaturácia pri 94 °C, 60 s; annealing pri 40 °C, 90 s; polymerizácia pri 68 °C, 180 s); závereþná polymerizácia pri 68 °C, 10 min. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5% agarózovom géli [4]. Výsledky a diskusia Fenotypizaþnými metódami sa získalo druhové taxonomické spektrum baktérií mlieþneho kysnutia: Lactobacillus acidophilus, Lb. brevis, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. fermentum, Lb. paracasei subsp. paracasei a Lactococcus lactis subsp. lactis. Celkový zoznam kmeĖov uvádza TabuĐka I. TabuĐka I Zoznam izolovaných a identifikovaných kmeĖov pochádzajúcich z piatich výrobní bryndze. Druh ýíslo kmeĖa OblasĢ 22A2 Tisovec Lactobacillus brevis Lactococcus lactis subsp. lactis 24A2 Tisovec 28A1 Tisovec Lactobacillus fermentum 3D1 Liptovský Mikuláš Lactobacillus brevis 27C Turþianske Teplice Lactobacillus acidophilus 21C Turþianske Teplice Lactobacillus acidophilus Lactococcus lactis subsp. lactis 16C1 Turþianske Teplice Lactococcus lactis subsp. lactis 16C2 Turþianske Teplice Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 14C1 Turþianske Teplice Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 14C2 Turþianske Teplice 21A1 Tisovec Lactobacillus fermentum Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 9B2 Zvolenská Slatina Lactococcus lactis subsp. lactis 22C Turþianske Teplice 10B1 Ružomberok Lactobacillus fermentum Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 19C Turþianske Teplice 25A1 Tisovec Lactobacillus fermentum 27A1 Tisovec Lactobacillus fermentum 18C Turþianske Teplice Lactobacillus rhamnosus 4D1 Liptovský Mikuláš Lactobacillus brevis 26A11 Tisovec Lactobacillus curvatus 26A12 Tisovec Lactobacillus curvatus 1F6 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F5 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F31 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F61 Ružomberok Lactobacillus plantarum 2F4 Turþianske Teplice Lactobacillus brevis 2F2 Turþianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F6 Turþianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F11 Turþianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F1 Turþianske Teplice Lactobacillus plantarum 1F1 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F11 Ružomberok Lactobacillus plantarum Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 2F Turþianske Teplice 123

Obr. 1. REP-PCR profily: 1,2 - Lb. acidophilus, 3 - Lb. fermentum, 4,5 - Lc. lactis, 6,7 - Lb. paracasei, 8 - Lb. paracasei CCM7275, 9. - Lc. lactis CCM1877, 10 - Lb. brevis, 11 - Lb. paracasei, L - štandard molekulových hmotností 250 bp.

Obr. 2. RAMP profily: 1, 2, 3 - Lb. fermentum, 4 - Lc. lactis, 5 - Lb. rhamnosus, 6 - Lb. acidophilus, 7 - Lb. plantarum, 8 - Lb. fermentum, 9 - Lb. acidophilus, 10 - Lb. brevis, 11 - Lb. paracasei, 12 Lc. lactis, L - štandard molekulových hmotností 250 bp.

124

Nevýhodou fenotypizaþných metód je þasová nároþnosĢ, technická obtiažnosĢ a malá univerzálnosĢ. Sú limitované obmedzeným poþtom vlastností vhodných pre analýzu, variabilná expresia génov môže viesĢ k nesprávnym výsledkom a nie každý zástupca príslušného bakteriálneho druhu je typizovateĐný. DNA analyzaþné metódy, v porovnaní s fenotypizaþnými metódami, nie sú závislé od fyziologického stavu bunky, sú univerzálnejšie, vhodné na detekciu viacerých bakteriálnych druhov a detekciu špecifických DNA sekvencií, charakteristických len pre urþitý druh, þi kmeĖ.[5]. Práve preto ćalším cieĐom tejto práce bolo nájsĢ vhodné metódy na typizáciu. Ako prvé sme na PCR-typizáciu izolovaných kmeĖov vybrali dve metódy založené na DNA analýze: REP-PCR – polymerázová reĢazová reakcia repetitívnych sekvencií a RAMP náhodne amplifikované polymorfné mikrosatelity. Metódy REP-PCR a RAMP sa optimalizovali þo do použitého teplotného programu a optimalizovala sa koncentrácia templátovej DNA. Obe metódy umožĖovali druhové rozlíšenie a v niektorých prípadoch tiež rozlíšenie rôznych kmeĖov v rámci jedného druhu. Záver Na základe výsledkov sme dospeli k záveru, že obe metódy REP-PCR aj RAMP umožĖujú medzidruhové rozlíšenie a do urþitej miery sú vhodné aj na subtypizáciu kmeĖov rámci jedného druhu. Na overenie týchto metód je nutná analýza ćalších kmeĖov. Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605. Použitá literatúra: 1. Görner, F. - Valík, ď.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava : Malé centrum, 2004, 528 s. 2. Kun-sheng, W. - Jones, R. - Danneberger, L. - Scolnik, P.: Detection of microsatellite polymorphisms without cloning. Nucleic Acids Research, 22, 1994, s. 3257-3258. 3. Versalovic, J. - Koeuth, T. - Lupski, J. R.: Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19, 1991, s. 6823-6831. 4. Pangallo, D. - Karpíšková, R. - TurĖa, J. - Kuchta, T.: Typing of food-borne Listeria monocytogenes by the optimized repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s. 449-454. 5. Busch, U. - Nitschko, H.: Methods for the differentation of microorganisms. Journal of Chromatography B, 722, 1999, s. 263-278.

Kontaktná adresa: Mgr. Gabriela Bertaová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, 824 75 Bratislava 26, Slovensko. [email protected]

125

MONITORING A IDENTIFIKÁCIA POTENCIÁLNYCH BAKTERIÁLNYCH KONTAMINANTOV OVýIARSKYCH VÝROBKOV VO VÝROBNOM PROCESE Kostolníková Mária, KoreĖová Janka, Lopašovská Janka Výskumný ústav potravinársky Bratislava, Odd. hygieny, sanitácie a mikrobiológie potravín Monitoring and identification of bacterial contaminants in production process of sheep products Summary: The work is a meant to enhance the sanitary standards of the production of traditional regional specialities from sheep´s milk. It is targeted on monitoring of selected genera of bacterial contaminants and on identification of authentic tribes G- and G bacteria izolated from products and processing surfaces (stainless steel, plastic material, wood) in 4 sheep plants. It were the staphylococci and the enterococci of the G bacteria and the coliforms of G- bacteria of the processed graph of the quantity of the selected contaminant genera, that were the most common ones on all 3 kinds of surfaces. The staphylococci, enterococci, coliforms bacteria and pseudomas were the most frequent contaminants present in traditional products from sheep´s milk (sheep´s milk, fresh cheese, slovak steamed cheese „parenica“ and slovak sheep cheese „bryndza“). After identification of G- bacteria we found the occurrence of the species: E. coli, Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae and the genus Pseudomonas, which occurrence is certified even by foreign literature. From G bacteria we found Staphylococcus aureus, St. haemolyticus, St. saprophyticus, St. hominis, Enterococcus faecalis, Ent. faecium, Bacillus cereus, B. cereus var. mycoides.

Úvod Problematika mikrobiologickej bezpeþnosti výroby tradiþných potravín živoþíšneho pôvodu a potravín vôbec je zohĐadnená v Nariadeniach ES [1, 2, 3]. Ako z nich vyplýva, jedným z cieĐov potravinového práva je vysoká úroveĖ ochrany verejného zdravia. Jedným z možných zdrojov kontaminácie produktov je aj nedokonalé oþistenie povrchov výrobných zariadení po výrobe a následne tým ovplyvnená neúþinná dezinfekcia [4]. Navyše mikroorganizmy sú schopné nadobudnutia rezistencie na nízke koncentrácie dezinfekþných prostriedkov, ktorá má za následok spolu s organickými zvyškami aj vhodné podmienky pre tvorbu biofilmov na povrchoch zariadení. Ako východisko k štúdiu podmienok tvorby a merania aktivity biofilmov na tuhých povrchoch sme sa pokúsili zmapovaĢ prostredie prevádzok ovþiarskych výrobkov z hĐadiska výskytu mikrobiologických kontaminantov potravín na povrchoch výrobných zariadení a vo výrobkoch. Materiál a metódy Odber vzoriek: Vzorky z nerezových, plastových a drevených povrchov výrobných zariadení sme odoberali priamo v prevádzkach vatovým tampónom z plochy 100 cm2. Z desiatkového riedenia sa inokulovalo 0,2 ml - 0,5 ml na povrch príslušnej selektívnej pôdy, poþet baktérií bol udávaný na plochu 1 cm2. Ako alternatívna metóda stanovenia poþtu baktérií bola použitá odtlaþková metóda (Hygicult, Orion Diagnostica). Získaný materiál sme podrobili mikrobiologickému rozboru z hĐadiska CPM, poþtu koliformných baktérií a enterokokov, ktorých druhy sú považované za významné z hĐadiska hygieny [5]. Ćalej sme selektovali stafylokoky, pseudomonády a Bacillus cereus. Kultivaþné médiá: Pre stanovenie CPM bolo použité médium GTK agar (HiMedia). Pre stanovenie poþtu koliformných baktérií médium VýŽL (Chromocult C, Merck). Pre stanovenie poþtu enterokokov Slanetz-Bartleyho médium (HiMedia). Pre stanovenie poþtu stafylokokov Baird-Parkerovo médium (BioMark). Pre stanovenie poþtu koagulázo-pozitívnych stafylokokov Baird Parkerovo médium + králiþia plazma (Bio-Rad). Pre izoláciu pseudomonád Pseudomonas Isolation Agar (HiMedia). Pre stanovenie Bacillus cereus selektívne médium MYP (Merck).

126

Identifikácia MO: Zo selektívnych médií bolo vybraných 10 typických kolónií enterobaktérií, enterokokov, stafylokokov a pseudomonád z každej Petriho misky. Boli inokulované na GTK agar a po overení þistoty kultúry, zaradenia podĐa Gramma, mikroskopického obrazu, boli kmene identifikované súpravami ENTEROtest 24, EN-COCCUStest, STAPHYtest 16, NEFERMtest 24 (Mikrolatest, Lachema). Výsledky a diskusia Zo spracovaného prehĐadu poþtu kontaminantov v ovþiarskych prevádzkach boli na všetkých troch povrchoch najviac zastúpené stafylokoky, enterokoky a koliformné baktérie (obr.1-3). V tradiþných výrobkoch z ovþieho mlieka (ovþie mlieko, þerstvý syr, slovenský oštiepok, slovenská parenica a slovenská bryndza) boli z kontaminantov najviac zastúpené: stafylokoky, enterokoky, koliformné baktérie a pseudomonády, ktorých þíselné hodnoty sú uvedené v tab. I. Po identifikácii kmeĖov G baktérií sme zistili prítomnosĢ nasledovných druhov: E. coli, Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae a rod Pseudomonas, ktorých výskyt potvrdzuje aj zahraniþná literatúra (tab. II). Rod Pseudomonas sa vo veĐkej miere podieĐa na tvorbe biofilmov [6, 4]. Z G baktérií z ovþiarskych prevádzok sme stanovili rod Staphylococcus, Enterococcus a Bacillus (Staphylococcus aureus, St. haemolyticus, St. saprophyticus, St. hominis, Enterococcus faecalis, Ent. faecium, Bacillus cereus, B. cereus var. mycoides) (tab. III). Druh Bacillus cereus sa zaraćuje medzi patogény pre produkciu enterotoxínov a je významným bežným kontaminantom vzduchu, mlieka a cereálií [7, 8]. Obsah Staphylococcus aureus je spolu s CPM meraným štandardom pre surové kravské a ovþie mlieko [9, 10]. Podmienky pre rast stafylokokov na povrchoch výrobných liniek a možnej rekontaminácii produktov aj po ich tepelnom ošetrení sú potenciálnym rizikom ohrozenia Đudského zdravia [11, 12].

nerez-ovþ CPM

6

koli

log KTJ/cm2

5

enterok stafylok

4

B.cereus plesne

3 2 1 0 2

5

7

9

prevádzka

Obr. 1. PrehĐad poþtu vybraných kontaminantov v ovþiarskych prevádzkach na nerezových povrchoch výrobných zariadení.

127

plast-ovþ.

log KTJ/cm2

6 5

CPM

4

koli enterok

3

stafylok

2

pseudom

1

plesne

0 2

4

6

7

þ. odberu vzoriek

Obr. 2. PrehĐad poþtu vybraných kontaminantov v ovþiarskych prevádzkach na plastových povrchoch výrobných zariadení. drevo ovþ. 4 3,5

KTJ/cm2

3 2,5

CPM koli

2

plesne

1,5 1 0,5 0 4

6 þ. odberu vzoriek

Obr. 3. PrehĐad poþtu vybraných kontaminantov v ovþiarskych prevádzkach na drevených povrchoch výrobných zariadení. Pozn.: V prevádzkach 4 - 6 bol vyšetrovaný len poþet CPM, koliformných baktérií a plesní. Tabulka I Priemerné poþty MO vo výrobkoch z ovþieho mlieka KTJ/g enterokoky

stafylok.

pseudom.

Bacillus cereus

plesne

mlieþne baktérie

bryndza

koliform.

ovþie mlieko þerstvý syr zrelý syr parený syr

1,2.104 3,0.105 2,8.105 7,7. 104 6,2. 104

2,2. 104 2,9. 105 1,3. 104 7,9. 104 1,3. 105

5,7. 105 1,3.107 1,2. 105 2,3. 105 3,5. 107

1,9. 101 8,6. 102 2,6. 102 6,3. 101 1,0

2,7. 101 1,0 1,0 1,0 1,0

2,8. 102 5,1. 103 2,8. 105 1,0 3,1. 104

2,7. 105 5,5. 108 3,2. 109 1,4. 108 3,9. 108

128

Tabulka II Identifikované kmene G- baktérií na povrchoch a vo výrobkoch Literatúra (G v mliek.prevádzkach)

Ovþiarske prevádzky

Enterobaktérie (38 kmeĖov)

Iné G kmene

11x Escherichia coli 7x Klebsiella oxytoca 6x Proteus vulgaris 4x rod Citrobacter 2x Enterobacter cloacae 2x Kluyvera ascorbata 4 kmene mimo diagn. škály rod Pseudomonas

Ps. fluorescens [6] Ps.fragi [13] Shigella E. coli E. aerogenes Klebsiella Proteus [14]

Tabulka III Identifikované kmene G baktérií na povrchoch a vo výrobkoch Literatúra (G v mliek.prevádzkach)

Ovþiarske prevádzky

Stafylokoky (15 kmeĖov)

Iné G kmene

3x St. hominis 2x St. haemolyticus 2x St. aureus 1x St. warneri/pasteuri St. auricularis St. simulans Kocuria kristinae 4 kmene mimo diagn. škály 3x Bacillus cereus 6x B.c. var. mycoides

L.monocytogenes [13,15,16] Bacillus sp. Bacillus cereus [14,17] Staphylococcus sp. Staphylococcus aureus Micrococcus sp. [14]

Záver Z vyšetrovaných G baktérií na povrchoch výrobných zariadení poþas výroby boli zaznamenané stafylokoky a enterokoky v množstve 103-104 KTJ/cm2. Bacillus cereus a B. cereus var. mycoides v þerstvom ovþom mlieku 101 KTJ/ml a vo vyšetrovanom vzduchu. Z G - koliformné baktérie v priemere 102-103 KTJ/cm2, vo výrobkoch – enterokoky 104-105 KTJ/g, stafylokoky 105-107 KTJ/g, celkové koliformné baktérie 104-105 KTJ/g a pseudomonády 101-102 KTJ/g. Druhy identifikovaných baktérií zodpovedajú druhom mikroorganizmov publikovaných v literatúre, ako potenciálne schopné tvorby biofilmov a následnej odolnosti voþi dezinfekþným prostriedkom. Použitá literatúra: 1. Nariadenie (ES) þ. 178/2002 Európskeho Parlamentu a Rady z 28. januára 2002, ktorým sa ustanovujú všeobecné zásady a požiadavky potravinového práva, zriaćuje Európsky Úrad pre bezpeþnosĢ potravín a stanovujú postupy v záležitostiach bezpeþnosti potravín 129

2. Nariadenie Európskeho Parlamentu a Rady (ES) þ. 854/2004 z 29. apríla 2004, ktorým sa ustanovujú osobitné predpisy na organizáciu úradných kontrol produktov živoþíšneho pôvodu urþených na Đudskú spotrebu 3. Nariadenie komisie (ES) þ. 2073/2005 z 15. novembra 2005, o mikrobiologických kritériách pre potraviny 4. Ammor, S. - Chevallier, I. - Laguet, A. - Labadie, J. - Talon, R. - Dufour, E.: Investigation of the selective bactericidal effect of several decontaminating solutions on bacterial biofilms including useful, spoilage and/or pathogenic bacteria. Food Microbiology, 21, 2004, s. 11-17. 5. Schönwälder, A. - Kehr, R. - Wulf, A. - Smalla, K.: Wooden boards affecting the survival of bacteria?, Holz als Roh- und Werkstoff, 60, 2002, s. 249-257. 6. Lindsay, D. - Brözel, V.S. - Mostert, J.F. - von Holy, A. 2002. Differencial efficacy of a chlorine dioxide - containing sanitizer against single species and binary biofilms of a dairy associated Bacillus cereus and a Pseudomonas fluorescens isolate. Journal of Applied Microbiology, 92, 2002, s. 352-361. 7. Andersson,A. - Rönner, U. - Granum, P.E.: What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? Int. J. Food Microbiology, 28, 1995, s. 145-155. 8. KoreĖová, J. - Valík, ď. - Liptáková, D. - Petríková, J.: Využitie princípov prediktívnej mikrobiológie pri zvyšovaní bezpeþnosti potravín. Zborník z vedeckej konferencie BezpeþnosĢ a kontrola potravín, Nitra, 2006, s. 48 – 52. 9. Nariadenie vlády SR þ.312/2003 o zdravotných požiadavkách na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mlieþnych výrobkov, þasĢ D 10. Nariadenie vlády SR þ. 284/2004, ktorým sa mení a dopĎĖa nariadenie 312/2003 o zdravotných požiadavkách na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mlieþnych výrobkov 11. Kleiss, T. - van Schotorst, M. - Cordier, J.-L. - Untermann, F.: Staphylococci in a whey powder plant environment: an ecological survey as a contribution to HACCP studies. Food Control, 5(3), 1994, s. 196-199. 12. Smith, J.P. - Phillips Daifas, D. - El-Khoury, W. - Koukoutsis, J. - El-Khoury, A.: Shelf Life and Safety Concerns of Bakery Products – A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44, 2004, s. 19-55. 13. Norwood, D.E. - Gilmour, A.: The differencial adherence capabilities of two Listeria monocytogenes strains in monoculture and multispecies biofilms as a function. Letters in Applied Microbiology, 33, 2001, s. 320-324. 14. Sharma, M. - Anand, S.K.: Characterization of constitutive microflora of biofilms in dairy processing lines. Food Microbiology, 19, 2002, s. 627-636. 15. Borucki, M.K. - Peppin, J.D. - White, D. - Loge, F. - Call, D.R.: Variation in biofilm formation among strains of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology, 69, 2003, s. 7336-7342. 16. Zhao, T. - Doyle, M.P. - Zhao, P.: Control of Listeria monocytogenes in a biofilm by competetive – exlusion mocroorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 70, 2004, s. 3996-4003. 17. Oosthuizen, M.C. – Steyn, B. – Lindsay, D. – Brözel, V.S. – von Holly, A.: Novel method for the proteomic investigation of a dairy – associated Bacillus cereus biofilm. FEMS Microbiology Letters, 194(1), 2001, s. 47-51.

Kontaktná adresa: Ing. Mária Kostolníková, Výskumný ústav potravinársky, Kostolná 7, 900 01 Modra, Slovenská republika, e-mail: [email protected]

130

SLEDOVÁNÍ ZMċN KYSELOSTI MLÉKA BċHEM VÝROBY KOZÍCH SÝRģ KouĜimská Lenka, KováĜová Eva, Dragounová Hedvika, Babiþka Luboš Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze Monitoring of milk acidity changes during goat cheesemaking Summary: Goat milk acidity was monitored in different stages of lactation during the processing. Titratable acidity of samples was determined by Soxhlet-Henkel method. Goat cheese products were frozen and transported to the laboratory where their acidity was determined too. The average titratable acidity of milk after milking was 6.55 SH. Its maximum value (7.88 SH) was in the 198th day of lactation, which corresponds with feed portion change that time. Higher acidity of milk influenced cheesemaking: the milk coagulation time was shorter and the acidity of final products was higher. The obtained data show that the acidity of milk reasonably affects the quality of cheese.

Úvod Aþkoliv výroba kozího mléka pĜedstavuje pouze 2 % celkové svČtové produkce1, hraje kozí mléko dĤležitou roli ve výživČ þlovČka2. PĜedpokladem výroby kvalitních mléþných produktĤ je vysoká kvalita mléka. Tato vstupní surovina musí vyhovovat organoleptickým, nutriþním, fyzikálnČ-chemickým a mikrobiálním jakostním požadavkĤm3. Kyselost mléka patĜí k dĤležitým parametrĤm mléka, které jsou posuzovány pĜi jeho zpracování na mléþné výrobky. ZmČny kyselosti mléka ovlivĖují významnČ nejen jeho chuĢ, vĤni a konzistenci, ale též jeho technologické vlastnosti. PĜedložená práce sleduje zmČny kozího mléka bČhem výroby sýrĤ a vliv kyselosti mléka na kyselost finálních výrobkĤ. Materiál a metody Vzorky mléka byly získány na soukromé kozí farmČ na Hané, která je od roku 1992 þleny PRO-BIO a hospodaĜí ekologicky. Na farmČ bylo chováno 30 koz plemene koza bílá krátkosrstá, které patĜí u nás k nejrozšíĜenČjším. Dojivost na této farmČ se pohybuje v prĤmČru kolem 1000 kg mléka za laktaci. Zaþátek laktace u sledovaných koz byl v druhé polovinČ února. Kozám bylo pĜedkládáno mechanicky upravené krmivo, pĜiþemž rozhodujícím krmivem v letním období byla zelená píce. Základ krmné dávky v zimním období tvoĜilo pĜevážnČ seno. PĜechod na toto krmivo probČhl v první polovinČ mČsíce záĜí. Dojení bylo provádČno dvakrát dennČ strojovČ do konví. Po nadojení bylo mléko zchlazeno bČhem dvou hodin pod 6 °C do následujícího dne. Syrové kozí mléko urþené k výrobČ sýrĤ se tepelnČ ošetĜovalo šetrnou pasterací pĜi 72 – 72 °C po dobu 30 sekund. OdbČr vzorkĤ byl proveden v šesti sériích mezi 68. a 231. dnem laktace. Pokaždé byla promČĜena titraþní kyselost vzorkĤ mléka ve þtyĜech fázích technologie: okamžitČ po nadojení, po zchlazení, po pasteraci a pĜed pĜidáním syĜidla. ZároveĖ byla zmČĜena titraþní kyselost vyrobených sýrĤ a oddČlené syrovátky. Stanovení titraþní kyselosti mléka a syrovátky bylo provádČno podle ýSN 57 05304, titraþní kyselost sýrĤ pak dle ýSN 57 01075. Výsledky a diskuse ZjištČné hodnoty titraþní kyselosti kozího mléka a þerstvých sýrĤ jsou uvedeny v tabulce I. PrĤmČrná titraþní kyselost syrového kozího mléka okamžitČ po nadojení byla 6,55 SH, pĜiþemž minimální namČĜená hodnota byla 5,91 SH (v 98. dni laktace), maximální pak 7,88 SH ke konci laktaþního období (198. den laktace). Zvýšení titraþní kyselosti mléka koresponduje s pĜechodem na zimní krmivo. Stanovené hodnoty titraþní kyselosti kozího mléka jsou v souladu s literaturou6,7,8,9.

131

Tabulka I Titraþní kyselost kozího mléka a þerstvých sýrĤ. Rozptyl Titraþní kyselost [SH] PrĤmČr výbČru mléka po nadojení 6,55 0,604 mléka po zchlazení 6,45 0,558 mléka po pasteraci 6,20 0,674 mléka pĜed sýĜením 6,73 0,533 þerstvých sýrĤ 86,60 5,082 syrovátky 4,91 0,079

Sm.odch. výbČru 0,777 0,747 0,821 0,730 2,254 0,281

Min.

Max.

5,91 5,91 5,51 6,11 83,73 5,33

7,88 7,74 7,62 7,98 89,64 5,33

Na obrázku 1 jsou znázornČny zmČny prĤmČrné titraþní kyselosti mléka bČhem zpracování, spolu se hodnotami titraþní kyselosti vyrobeného sýra a syrovátky. Kyselost þerstvého kozího mléka po zchlazení lehce poklesla, což mĤže být zpĤsobeno snížením obsahu CO2 v mléce10. Kyselost mléka se po pasteraci ještČ snížila, což je v souladu s literaturou11. PĜídavek zákysové kultury a þinnost mikroorganismĤ titraþní kyselost mléka pĜed sýĜením zvýšily. PrĤmČrná titraþní kyselost kozího mléka 100,00 86,60

90,00 Titraþní kyselost [SH]

80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00

6,55

6,45

6,20

6,73

Mléko po nadojení

Mléko po zchlazení

Mléko po pasteraci

Mléko pĜed sýĜením

4,91

0,00 Sýr

Syrovátka

Obr. 1. PrĤmČrná titraþní kyselost kozího mléka, sýra a syrovátky bČhem technologického zpracování. V tabulce II jsou uvedeny korelaþní koeficienty závislosti titraþní kyselosti kozího mléka bČhem zpracování na titraþní kyselosti výsledného produktu. Získané hodnoty ukazují na velmi tČsný vztah mezi kyselostí mléka a výsledného produktu. Tabulka II Korelaþní koeficienty závislosti titraþní kyselosti kozího mléka a vyrobeného sýra. Titraþní kyselost mléka Korelaþní koeficient mezi kyselostí mléka a sýra po nadojení 0,854 po zchlazení 0,850 po pasteraci 0,888 pĜed sýĜením 0,900 KromČ korelaþních koeficientĤ byl pomocí regresní analýzy zkoumán prĤbČh závislosti mezi kyselostí mléka pĜed sýĜením a kyselostí sýra (hodnota korelaþního koeficientu zde byla nejvyšší). Koeficient lineární regresní pĜímky R2 byl 0,8101, z þehož vyplývá, že se zvyšující kyselostí mléka ve sledovaném rozsahu stoupá kyselost vyrobeného sýra a tato závislost mĤže být lineárnČ aproximována. 132

ZávČr ZmČny složení krmiva ovlivĖují hodnotu titraþní kyselosti nadojeného kozího mléka. MČĜení zmČn titraþní kyselosti kozího mléka bČhem výroby sýra ukázalo, že titraþní kyselost významnČ ovlivĖuje kvalitu finálního produktu. Sledováním zmČn kyselosti mléka si mĤže zpracovatel ovČĜit kvalitu vstupní suroviny, jakož i správný prĤbČh technologie výroby.

Použitá literatura: 1. Haenlein, G. F. W. Relationship of somatic cell counts in goat milk to mastitis and productivity. Small Rumin. Res. 2002, No. 45, s. 163 – 178. 2. Haenlein, G. F. W. Goat milk in human nutrition. Small Rumin. Res. 2004, No. 51, s. 155–163. 3. Raynal-Ljutovac, K., Gaborit, P., Lauret, A. The relationship between quality criteria of goat milk, its technological properties and the quality of the final products. Small Rumin. Res. 2005, No. 60, s. 167 – 177. 4. ýSN 57 0530 Metody zkoušení mléka a tekutých mléþných výrobkĤ. Praha: ýeský normalizaþní institut. 1972. 100 s. 5. ýSN 57 0107 Metody zkoušení sýrĤ, tvarohĤ, krémĤ a pomazánek. Praha: ýeský normalizaþní institut. 1965. 28 s. 6. Aganga, A. A., Amarteifio, J. O., Nkile, N. Effect of Stage of Lactation on Nutrient Composition of Tswana Sheep and Goat’s Milk. J. Food Comp. Anal. 2002, No. 11, s. 533–543. 7. Franco, I., Prieto, B., Bernardo, A., Prieto, J. G., Carballo, J. Biochemical changes throughout the ripening of a traditional Spanish goat cheese variety (Babia-Laciana). 2003, No. 13, s. 221-230. 8. Mehaia, A. M., Saad, M. E. Physiochemical characteristics and rennet coagulation time of ultrafiltered goat milk. Food Chemistry. 1998, vol. 62, No. 3, s. 257–263. 9. Torii, M. S., Damasceno, J. C., Riberio, L. R., Sakaguti, E. S., Santos, G. T., Matsushita, M., Fukumoto, N. M. Physical-Chemical Characteristics and Fatty Acids Composition in Dairy Goat Milk in Response to Roughage Diet. Braz. Arch. Biol. Technol. 2004, vol. 47, No. 6, s. 903–909. 10. GajdĤšek, S., MlékaĜství II. 1. vyd. Brno: Mendelova zemČdČlská a lesnická universita. 1998. 135 s. ISBN 80-7157-342-6. 11. Forman, L. a kol. Mlékárenská technologie. 2. vyd. Praha: VŠCHT Praha. 1996. ISBN 80-7080-250-2. Kontaktní adresa: Dr. Ing. Lenka KouĜimská, Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: [email protected].

133

VLIV POěADÍ LAKTACE NA CHEMICKÉ SLOŽENÍ OVýÍHO MLÉKA Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Zajícová Pavlína Ústav chovu a šlechtČní zvíĜat, MZLU v BrnČ Influence of parity on the chemical composition of sheep milk Summary: The aim of the study was determined the influence of parity on ewe’s milk composition. The evaluation was performed on base of analyses of milk sampled from 22 sheep (Lacaune x East Friesian x Improved Walachian) with 11 ewes each in parities 1, 2. The sampling was carried five times during whole lactation (on 65th (1st sampling), 99th (2nd sampling), 139th (3rd sampling), 167th (4th sampling) and 202nd day of lactation (5th sampling). The analysis involved a total of 110 milk samples. Milk was analysed by standard methods for total solids TS (%), fat F (%) solids-non-fat SNF (%), protein P (%), casein C (%) and lactose L contents. Recorded data were statistically analyzed by program UNISTAT 5.1. Milk of first parity contained on average 19,98 % TS, 7,76 % F, 12,22 % SNF, 6,54 % P, 5,16 % C and 4,49 % L. Milk of second parity contained on average 18,74 % TS, 7,06 % F, 11,68 % SNF, 6,18 % P, 4,71 % C and 4,49 % L. The parity had only significant effect (P d 0,05) on SNF content for the whole lactation. The parity had significant effect (P d 0,05) in the1st sampling on C, in the 2nd sampling on C and SNF, in the 3rd sampling on TS, in the 4th sampling on F, SNF, P, C. The parity had highly significant effect (P d 0,01) in the 4th sampling on TS and in the 5th sampling on all chosen parameters under study.

Úvod V ýR jsou stavy dojných ovcí v pomČru k ostatním užitkovým kombinacím na nízké úrovni, pĜesto je však produkce ovþího mléka a výroba ovþích sýrĤ perspektivní (4). Ovþí mléko je vodnatá, bílá nebo lehce nažloutlá tekutina s mírnČ natrpklou chutí. Složením se ovþí mléko znaþnČ liší od mléka kravského. Obsahuje prĤmČrnČ 5,5 % bílkovin, 7 % tuku, 5 % cukru a 0,9 % popelovin (18). Ovþí mléko se u nás k pĜímému konzumu nepoužívá (19), pĜiþemž na rozdíl od kravského a kozího mléka je toto mléko využíváno témČĜ výhradnČ k výrobČ sýrĤ, když základním je sýr hrudkový. Na výrobu 1 kg hrudkového sýra je tĜeba pĜibližnČ 3 - 5 kg mléka. Z hrudkového sýra se dále vyrábí brynza, parenica, oštČpky, roquefort a camembert (10). PĜi výrobČ sýrĤ hraje dĤležitou roli chemické složení mléka a variabilita obsahu jednotlivých složek (15). Složení a kvalita ovþího mléka je ovlivĖována celou Ĝadou faktorĤ, pĜiþemž mezi nejvýznamnČjší patĜí: plemenná pĜíslušnost, fáze a poĜadí laktace, þetnost vrhu, klimatické podmínky, výživa, zdravotní stav a management (1, 3, 12, 13, 15, 16). Cílem našeho sledování se stalo zhodnocení vlivu poĜadí laktace na složení ovþího mléka a to u bahnic kĜíženek plemen Lacaune (L), Východofrízská ovce (VF) a ZušlechtČná valaška (ZV). Podobnou studii, nicménČ u jiných plemen realizovali taktéž Casoli et al. (5), Gonzalo et al. (11), ýapistrák et al. (6) a Sevi et al. (17). Materiál a metodika K laboratorním analýzám byly použity vzorky ovþího mléka z ekologické farmy ve Valašské BystĜici. Do pokusu bylo zaĜazeno 22 kusĤ bahnic kĜíženek L 50 VF 37,5 ZV z toho 11 bahnic bylo na 1. laktaci a dalších 11 na 2. laktaci. Všechny sledované bahnice byly chovány v identických podmínkách a po celou dobu sledování byly v dobrém zdravotním a výživném stavu. Jejich krmná dávka v prĤbČhu celého sledování byla založena na ad libitní celodenní pastvČ na trvalém travním porostu. DoplnČk krmné dávky tvoĜily pšeniþné otruby, jejichž prĤmČrná spotĜeba na kus a den þinila 50 g a minerální liz (ad libitum). BahnČní u sledovaných ovcí probíhalo koncem mČsíce února, následnČ byl provádČn tradiþní odchov jehĖat pod matkami. Odstav jehĖat byl realizován v prĤmČrném 60. dni laktace (konec mČsíce dubna). NáslednČ se zapoþalo s dojením, které bylo ukonþeno na poþátku mČsíce Ĝíjna. OdbČry vzorkĤ byly realizovány v pravidelných intervalech pČtkrát v prĤbČhu celé laktace a to v prĤmČrném 65. dni (první odbČr), 99. dni (druhý odbČr), 139. dni (tĜetí odbČr), 167. dni (þtvrtý odbČr) a 202 dni (pátý odbČr). Dojení ovcí bylo provádČno strojnČ, pĜiþemž vzorky mléka na laboratorní analýzy byly odebírány z ranního dojení a ihned po odbČru vychlazeny na teplotu 5-8 °C a poté, v termoboxu, pĜevezeny do rozborových laboratoĜi na MZLU v BrnČ. V rámci laboratorních analýz byly zjišĢovány obsahy následujících 134

mléþných složek: sušina (S), tuk (T), tukuprostá sušina (TPS) bílkoviny (B), kasein (Kas) a laktóza (L). CelkovČ bylo vyhodnoceno 110 vzorkĤ. Obsah S (%) byl stanovován vážkovou metodou pĜi teplotČ 102 r 2°C dle ýSN ISO 6731 (9). Obsah T (%) byl stanovován acidobutyrometrickou metodou dle Gerbera (8). Obsah TPS byl zjištČn výpoþtem, když obsah tuku byl odeþten od obsahu sušiny. Obsahy B a Kas (%) byly stanoveny na pĜístroji PRO – MILK (Danish Co. Foss Electric) (7). Obsah L (%) byl stanovován polarimetricky (7). Statistické zpracování bylo realizováno s využitím statistického programu UNISTAT 5.1. K urþení diferencí mezi jednotlivými skupinami bylo využito Mann-Whitneyova U testu.

Výsledky a diskuse Zhodnocení vlivu poĜadí laktace na vybrané složky ovþího mléka je uvedeno v tabulce I. Z této tabulky je sice patrné, že hodnoty obsahu všech sledovaných složek mléka za celou laktaci byly mírnČ vyšší u mléka bahnic na 1. laktaci, s výjimkou obsahu L, kdy bylo dosaženo shodného obsahu (4,49 %), nicménČ prĤkazný rozdíl (P d 0,05) byl zjištČn pouze mezi obsahy TPS. Také Ploumi et al. (14) zaznamenali nižší hodnoty TPS a T u mléka bahnic na 2. laktaci než na 1. laktaci a témČĜ shodný obsah L u obou skupin. Naproti tomu zjistili mírnČ vyšší obsah B u bahnic na 2. laktaci. Dále ve své práci výše uvedení potvrzují vliv poĜadí laktace na produkci mléka. Také ýapistrák et al. (6) zaznamenali vliv poĜadí laktace na obsahy TPS, B a L. Naproti tomu Bencini (2) a Sevi et al. (17) uvádí, že se zvyšujícím se poĜadím laktace se zvyšují obsahy T a B v mléce a snižuje obsah L. Z tabulky I. dále vyplývá, že v rámci jednotlivých odbČrĤ, s výjimkou prvního odbČru, byly obsahy S, T, TPS, B a Kas vždy vyšší u bahnic na 1. laktaci. Také obsah L byl ve všech odbČrech mírnČ vyšší u bahnic na 1. laktaci, nicménČ pĜi 5. odbČru byl zjištČn výraznČ vyšší obsah této složky u bahnic na druhé laktaci (4,39 % vs. 3,94). Co se týká prĤkazného vlivu poĜadí laktace na obsahy vybraných složek mléka v jednotlivých fázích laktace, tak v 1. odbČru byl zjištČn prĤkazný rozdíl (P d 0,05) mezi bahnicemi na 1. a na 2. laktaci pouze v obsahu Kas. Ve 2. odbČru byly prokázány prĤkazné rozdíly (P d 0,05) v hodnotách Kas a TPS. Ve 3. odbČru byl zaznamenán prĤkazný vliv (P d 0,05) poĜadí laktace pouze na obsah S. Ve 4. odbČru byly zjištČny prĤkazné rozdíly (P d 0,05) mezi bahnicemi na 1. a na 2. laktaci v obsahu T, TPS, B, Kas, když vysoce prĤkazný rozdíl (P d 0,01) mezi bahnicemi na obou laktacích byl zjištČn v obsazích sušiny. V 5. odbČru byl zjištČn vysoce prĤkazný vliv (P d 0,01) poĜadí laktace na obsahy všech sledovaných chemických složek. Dynamika zmČn všech sledovaných složek v prĤbČhu laktace probíhala u obou poĜadí laktace ve stejném trendu. Obsahy S (obr. 1), T (obr. 2), TPS (obr. 3), B (obr. 4) a Kas (obr.5) se mČnily následovnČ: nejdĜíve došlo k nárĤstu jejich hodnot, poté nastal jejich pokles, který byl ovlivnČn vzrĤstající se dojivostí (139 den laktace), nicménČ posléze následovalo pomČrnČ razantní zvyšování jejich obsahĤ a to až do konce laktace. Naproti tomu obsah L (obr. 6) se mČnil v opaþném trendu. Výše uvedené odpovídá trendĤm jež uvádČjí Bencini (2), Ploumi et al. (14) a Sevi et al. (17).

ZávČr Hodnoty obsahu všech sledovaných složek mléka za celou laktaci byly mírnČ vyšší u mléka bahnic na 1. laktaci, s výjimkou L, u které byly zjištČny shodné obsahy. NicménČ statisticky prĤkazný rozdíl (P d 0,05) byl zjištČn pouze mezi obsahy TPS. Z našeho sledování dále vyplývá, že se zvyšujícím se dnem laktace se taktéž zvyšuje i poþet ukazatelĤ u nichž jsou zjišĢovány statistické diference z pohledu faktoru poĜadí laktace.

PodČkování: Sledování bylo realizováno s podporou MSM 432100001.

135

Tabulka I Vlivu poĜadí laktace na vybrané složky ovþího mléka. Období Bahnice na 1. laktaci Ukazatel laktace sx x 1. odbČr 17,43 1,73 2. odbČr 19,40 1,37 3. odbČr 18,21 1,55 Sušina (%) 4. odbČr 19,25 0,90 5. odbČr 25,61 1,75 celá laktace 19,98 3,26 1. odbČr 6,53 1,08 2. odbČr 7,38 1,10 Tuk 3. odbČr 6,50 1,01 (%) 4. odbČr 7,21 0,75 5. odbČr 11,19 1,07 celá laktace 7,76 2,01 1. odbČr 10,90 0,72 2. odbČr 12,03 0,41 Tukuprostá 3. odbČr 11,71 0,66 sušina 4. odbČr 12,04 0,33 (%) 5. odbČr 14,42 0,76 celá laktace 12,22 1,32 1. odbČr 5,31 0,61 2. odbČr 6,29 0,39 Bílkoviny 3. odbČr 6,07 0,52 (%) 4. odbČr 6,37 0,39 5. odbČr 8,65 0,81 celá laktace 6,54 1,26 1. odbČr 3,66 0,56 2. odbČr 4,69 0,43 Kasein 3. odbČr 4,71 0,61 (%) 4. odbČr 5,17 0,49 5. odbČr 7,55 0,82 celá laktace 5,16 1,43 1. odbČr 4,57 0,24 2. odbČr 4,62 0,26 Laktóza 3. odbČr 4,69 0,18 (%) 4. odbČr 4,63 0,19 5. odbČr 3,94 0,28 celá laktace 4,49 0,36 * = (P d 0,05); ** = (P d 0,01)

136

Bahnice na 2. laktaci sx x 18,17 1,42 18,76 0,71 17,03 1,04 18,02 0,98 21,71 1,88 18,74 2,01 7,12 1,13 7,13 0,54 5,80 0,73 6,42 0,76 8,84 1,15 7,06 1,34 11,05 0,61 11,64 0,27 11,23 0,46 11,60 0,35 12,87 0,81 11,68 0,82 5,70 0,51 6,12 0,41 5,70 0,37 5,97 0,34 7,39 0,68 6,18 0,78 4,03 0,52 4,50 0,29 4,21 0,40 4,63 0,54 6,18 0,81 4,71 0,93 4,36 0,30 4,50 0,15 4,63 0,31 4,58 0,21 4,39 0,21 4,49 0,26

PrĤkaznost

* ** **

* **

*

* ** *

* **

* *

**

**

9

24

obsah B (%)

obsah S (%)

26

22 20

7

18 16

5 1. odb.

2. odb.

3. odb.

1. laktace

4. odb.

5. odb.

1. odb.

2. laktace

2. odb.

3. odb.

1. laktace

Obr. 1. ZmČny obsahu sušiny v prĤbČhu laktace

4. odb.

5. odb.

2. laktace

Obr. 4. ZmČny obsahu bílkoviny v prĤbČhu laktace

obsah Kas (%)

obsah T (%)

13 11 9 7 5

5

3 1. odb.

2. odb.

3. odb.

1. laktace

4. odb.

5. odb.

1. odb.

2. laktace

2. odb.

3. odb.

1. laktace

Obr. 2. ZmČny obsahu tuku v prĤbČhu laktace

4. odb.

5. odb.

2. laktace

Obr. 5. ZmČny obsahu kaseinu v prĤbČhu laktace

15

5

14

obsah L (%)

obsah TPS (%)

7

13 12

4

11 10

3 1. odb.

2. odb.

3. odb.

1. laktace

4. odb.

5. odb.

1. odb.

2. laktace

2. odb.

3. odb.

1. laktace

Obr. 3. ZmČny obsahu tukuprosté sušiny v prĤbČhu laktace

4. odb.

5. odb.

2. laktace

Obr. 6. ZmČny obsahu laktózy v prĤbČhu laktace

Použitá literatura: 1. ANTUNOVIC, Z., et al. Changes in ewe milk composition depending on lactation stage and feeding season. Czech Journal of Animal Science. 2001, 47, s. 80-84. 2. BENCINI, R. Factors Affecting the Quality of Ewe’s Milk. In THOMAS, D. L. and PORTER, S. (ed.) Proceedings of the 7th Great Lakes Dairy Sheep Symposium. Eau Claire, Wisconsin: [s.n.], 2001: 52-84. 3. BENCINI, R., PULINA, G. The quality of sheep milk: A review Australian Journal of Experimental agriculture.1997, 37, s. 485-504. 4. BUCEK, P., et al. Roþenka chovu ovcí a koz v ýeské republice za rok 2005. [s.l.] : [s.n.], 2006. 89 s. ISBN 80-239-7482-3. 137

5. CASOLI, C., et al. Quantitative and compositional variations of Massese sheep milk parity and stage of lactation. Small Ruminant Research. 1989, 2, s. 47-62. 6. ýAPISTRAK, A., et al. Produkci a zloženie mlieka oviec plemena zošlechtČná valaška poþas dojnej periódy. Živoþišná výroba. 1995, 40, s. 187-190. 7. ýSN 57 0530. Metody zkoušení mléka a tekutých mléþných výrobkĤ. Vydavatelství ÚNM (ÚĜad pro normalizaci a mČĜení), Praha, 1974. 108 s. 8. ýSN ISO 2446. Mléko - Stanovení obsahu tuku (Rutinní metoda). ýeský normalizaþní institut, Praha, 2001. 16 s. 9. ýSN ISO 6731. Mléko, smetana a zahuštČné neslazené mléko - Stanovení obsahu celkové sušiny. ýeský normalizaþní institut, Praha, 1998. 5 s. 10. DRAGOUNOVÁ, H., HEJTMÁNKOVÁ, A. ZmČny základních ukazatelĤ kvality ovþího mléka v prĤbČhu laktace. In ŠTċTINA, J., ýURDA, L. Mléko a sýry. Praha : VŠCHT Praha, 2006. s. 120-123. 11. GONZALO, C., et al. Factors influencing variation of test day milk yield, somatic cells count, fat and protein in diary sheep. Journal of Dairy Science. 1994, 77, s. 537-1542. 12. FUERTES, J., et al. Parameters of test day milk yield and milk components for dairy ewes. Journal of Dairy Science. 1998, 81, s. 1300–1307. 13. PAVIû, V., et al. Influence of stage of lactation on the chemical composition and physical properties of sheep milk. Czech Journal of Animal Science. 2002, 47, s. 80-84. 14. PLOUMI, K., et al. Some factor affecting daily milk yield and composition in a flock of Chios ewes. Small Ruminant Research. 1998, 28, s. 89-92. 15. PUGLIESE, C., et al. Evolution of chemical composition, somatic cell count and renneting properties of the milk of Massese ewes. Small Ruminant Research. 2000, 35, s. 71-80. 16. SAHAN, N., et al. Changes in chemical and mineral content of Awassi ewe’s milk during lactation. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 2005, 29, s. 589-593. 17. SEVI, A., et al. Effect of parity on milk yield, composition, somatic cell count and renneting parameters and bacteria count of Comisana ewes. Small Ruminant Research. 2000, 37, s. 99107. 18. ŠTOLC, L., NOHEJLOVÁ, L. Mléþná užitkovost ovcí. In Den mléka 2003. Praha : ýZU Praha, 2003. s. 79-81. 19. ŠTOLCOVÁ, J., et al.Ovþí mléko v podmínkách ýeské Republiky. In Den mléka 2006. Praha : ýZU Praha, 2006. s. 168-170.

Kontaktní adresa: Ing. Lenka Novotná, MZLU v BrnČ, ÚCHŠZ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, email: [email protected] tel.: 5 45 13 32 39

138

OBSAH A SLOŽENÍ SYROVÁTKOVÝCH BÍLKOVIN KOZÍHO A OVýÍHO MLÉKA Jansová Blanka1, Hejtmánková Alena1, Dragounová Hedvika2 1 Katedra chemie, 2Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, Fakulta agrobiologie, potravinových a pĜírodních zdrojĤ, ýZU v Praze Content and constituion of goat and sheep whey proteins Summary: Depending on the lactation stage, the overall whey proteins were undergoing the alterations in their content. However, these alterations were not substantial and only small oscillations from the average values (0,450 g.100g-1) were noticed. It appears nonetheless from the results that the higher contents of whey proteins were noticed on the beginning of the lactation, playing a role in the immunisation process of the sucklings, and in the final stage of the lactation, probably in the connection with the increase of the overall protein. By 72°C heating for 10 minutes, the denaturation in the goat milk touched 36 % of the whey proteins, whereas only 33 % in the sheep´s milk and 30 % in the cow milk. The average percentage of the whey proteins in the overall proteins of the sheep´s milk is 17,51 %, which is approximately equivalent to the composition of the goat milk. The amino acid composition of proteins and whey proteins of sheep’s and goat milk was determinate.

Úvod Syrovátkové bílkoviny jsou pĜirozenou souþástí mléka. PĜi výrobČ sýrĤ, tvarohĤ a kaseinu se nesráží a odchází v podobČ syrovátky. Hlavními komponenty syrovátkových bílkovin jsou E-laktoglobulin (ȕ-LG), Į-laktalbumin (Į-LA), sérový albumin, imunoglobuliny a proteoso – peptonová frakce. Význam syrovátkových bílkovin spoþívá v jejich vysoké nutriþní hodnotČ, která je vyšší než u kaseinu. Celkový obsah bílkovin (N – látek) v syrovátce kolísá od 14 do 24 % (Forman, 1959). Bílkoviny obsažené v syrovátce pĜedstavují jeden z nejhodnotnČjších bČžnČ dostupných bílkovinných materiálĤ. Je to pĜiþítáno vhodnému složení jejich aminokyselin. S rostoucí výrobou sýrĤ a tvarohĤ, roste i výroba syrovátky. Její ekonomicky efektivní využití je stále problém, a proto se neustále hledají nové technologie pro její zpracování a nová uplatnČní v nejrĤznČjších odvČtvích. Sienkiewicz a Riedel (1990) uvádČjí, že syrovátka obsahuje 50 % všech složek mléka. Díky nízké koncentraci tČchto složek (sušinu syrovátky tvoĜí asi 6,4 – 7 %) nebyla syrovátka dlouho považována za vedlejší produkt, ale produkt odpadní a byla pĜevážnČ zkrmována hospodáĜskými zvíĜaty. Veselá (2003) uvádí, že v roce 1970 se v EU využilo pro lidskou výživu jen 5 % vyrobené syrovátky, zatímco ke krmným úþelĤm 95 %. V roce 2000 byl již tento pomČr 50 : 50. PĜedpokládá se, že využití syrovátky k lidské výživČ stále poroste. Syrovátku zpracovává i farmaceutický prĤmysl. Je pĜidávána do pleĢových mlék, vod a krémĤ. PĜi vnČjším použití skvČle vyhlazuje pokožku. Reguluje její pH a stabilizuje kyselou reakci povrchu tČla. Syrovátka má mnoho pozitivních úþinkĤ na lidský organismus. AutoĜi se shodují, že napĜ. pĤsobí detoxikaþnČ a podporuje þinnost ledvin, pĜíznivČ upravuje metabolismus, kladnČ ovlivĖuje þinnost stĜev a obnovuje stĜevní mikroflóru a dodává tČlu potĜebné vitamíny a minerály. Malá (2002) uvádí, že u syrovátkových bílkovin byl zjištČn podíl 21 % z celkového proteinu u koz plemene murcinano-granadina. E-laktoglobulin tvoĜí 11,4 % (5,8 g.l-1) z celkových bílkovin. Sražený E-laktoglobulin se váže do pevné vazby s bílkovinami kaseinu. D-laktalbumin je pĜítomen v obsahu 3,4 % (1,5 g.l-1) a je nezbytný pro biosyntézu laktózy. Zbývající syrovátkové proteiny jsou obsaženy ze 3,4 % (1,4 g.l-1), jsou tvoĜeny pĜedevším imunoglobuliny. Velmi malý podíl syrovátkových bílkovin tvoĜí proteoso – peptony, jejichž obsah v kozím mléce nebyl ještČ zjišĢován.

139

Metody V letech 2003-2005 bylo analyzováno kozí mléko a syrovátka v prĤbČhu laktaþního období. V roce 2005 bylo také analyzováno ovþí mléko a syrovátka. Pro analýzu syrovátkových bílkovin byly použity vzorky kozího mléka a syrovátky ze dvou soukromých ekofarem zamČĜujících se na chov koz plemene bílá krátkosrstá a vzorky ovþího mléka a syrovátky z farmy zamČĜující se na chov ovcí plemene východofríského. Pro stanovení syrovátkových bílkovin byla použita metoda vyluþovací vysokoúþinné kapalinové chromatografie. Metoda vychází z normy ISO/DIS 11814. SouþasnČ byly stanoveny celkové bílkoviny na pĜístroji Milco-Scan 133 B. Analýzy byly provádČny ve dvou paralelních opakováních. V tabulkách jsou uvedeny prĤmČrné hodnoty. Výsledky byly zpracovány statisticky v poþítaþovém programu Excel metodou Anova, dvoufaktorovou analýzou rozptylu s opakováním. Dále byl sledován stupeĖ denaturace syrovátkových bílkovin v kozím mléce a porovnání tepelné stability syrovátkových bílkovin kozího mléka s tepelnou stabilitou syrovátkových bílkovin mléka kravského a ovþího. Mléko kozí, kravské a ovþí bylo zahĜíváno pĜi teplotČ 65 °C po dobu 10, 20 a 30 minut a pĜi 72 °C po dobu 10 minut. SouþasnČ bylo sledováno aminokyselinové složení syrovátkových bílkovin kozího a ovþího mléka. Stanovení bylo provedeno metodou HPLC po kyselé hydrolýze. Výsledky a diskuse Za syrovátkové bílkoviny byly považovány látky eluující se v þase v rozmezí 8,5 – 12 minut. Z kolony byly vymývány první pravdČpodobnČ imunoglobuliny (þas 8,7 minut), sérum albumin (9,5 minut), ȕ-laktoglobulin (10,5 minut) a Į-laktalbumin (11,3 minut). Píky s vyššími eluþními þasy nelze považovat za syrovátkové bílkoviny. MĤže se jednat napĜíklad o látky peptidické povahy, mohou se zde objevovat i jiné ve vodČ rozpustné a v UV oblasti absorbující složky mléka. Bylo stanoveno celkové množství syrovátkových bílkovin, ȕ-laktoglobulinu a souhrnné množství ȕ-laktoglobulinu a Į-laktalbuminu. Rozdíl mezi celkovým množstvím syrovátkových bílkovin a množstvím ȕ-LG a Į-LA pĜipadá na imunoglobuliny, sérum albumin a proteosopeptonovou frakci. PrĤmČrné zastoupení syrovátkových bílkovin v proteinech kozího mléka bylo 15,7 % a bylo nižší než v mléce kravském (cca 20 %) (Velíšek, 2002). Souhrnné množství Į-LA a ȕ-LG v syrovátkových bílkovinách kozího mléka bylo na obou farmách pomČrnČ vyrovnané a pohybovalo se v rozmezí 87-90 %. PomČr zastoupení Į-LA a ȕ-LG se bČhem laktace mČnil (množství ȕ-LG se pohybovalo od 19,7 do 66 %). Ve vČtšinČ pĜípadĤ pĜevažovalo množství Į-LA nad ȕ-LG. Hodnoty celkových syrovátkových bílkovin namČĜené v kozí syrovátce byly v prĤmČru o 24,03 % nižší než v mléce. Hodnoty syrovátkových bílkovin v kozí syrovátce se pohybovaly v rozmezí od 0,015 do 0,446 g.100g-1. Ve srovnání s mlékem kozím (2,81 g.100g-1), bylo v ovþím mléce zjištČno více než dvojnásobné množství celkového proteinu (6,356 g. 100g-1). Zatímco v prĤbČhu laktace celkové bílkoviny kozího mléka byly zhruba na stejné hodnotČ a pouze ke konci laktace došlo k jejich mírnému nárĤstu, bílkoviny v ovþím mléce se postupnČ zvyšovaly a ke konci laktace byl zaznamenán výraznČjší nárĤst jejich hodnot. PrĤmČrná hodnota syrovátkových bílkovin v ovþím mléce byla 1,113 g.100g-1. V ovþí syrovátce byly namČĜeny hladiny syrovátkových bílkovin v prĤmČru o 17,77 % nižší než v mléce. PrĤmČrné zastoupení syrovátkových bílkovin v celkových proteinech ovþího mléka je 17,51 %, což zhruba odpovídá složení mléka kozího. NejcitlivČjší na tepelné namáhání byly syrovátkové bílkoviny kozího mléka. PĜi nejvyšším záhĜevu (72 °C po dobu 10 minut) došlo k denaturaci 36 % syrovátkových bílkovin. V ovþím mléce to bylo 33 % a v kravském 30 % syrovátkových bílkovin. 140

Bylo také stanoveno aminokyselinové složení hrubých i syrovátkových bílkovin kozího a ovþího mléka, které ukazuje tabulka V (s výjimkou tryptofanu, který se po kyselé hydrolýze rozkládá a je tímto zpĤsobem nestanovitelný). V syrovátkových bílkovinách kozího mléka oproti hrubým výraznČji stouplo zastoupení glycinu a alaninu a kleslo zastoupení glutamové kyseliny a methioninu. V ovþích syrovátkových bílkovinách výraznČji stoupl alanin a kyselina asparagová a klesl methionin, prolin a kyseliny glutamová.

g.100g -1

Denaturace SB 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

SUMA-kravské SUMA-kozí SUMA-ovþí

syrové

65°C /10min

65°C /20min

65°C /30min

72°C /10min

teplota a doba záhĜevu

Obr. 1 Denaturace syrovátkových bílkovin kozího, ovþího a kravského mléka

Tabulka I Hodnoty syrovátkových bílkovin v ovþím mléce v g.100g-1, farma C, 2005 farma C datum odbČru 10.6. 27.7. 23.8. 20.9. 25.10. prĤmČr

mléko 0,894 0,749 1,015 1,117 1,791 1,113

SUMA syrovátka 0,820 0,730 0,959 0,628 1,440 0,915

Į-LA+ȕ-LG mléko syrovátka 0,817 0,784 0,715 0,702 0,980 0,836 1,100 0,520 1,440 1,244 1,010 0,817

mléko 0,508 0,489 0,637 0,457 1,306 0,576

ȕ-LG syrovátka 0,496 0,451 0,238 0,341 1,184 0,645

Tabulka II Zastoupení syrovátkových bílkovin v proteinech ovþího mléka, farma C, 2005 datum odbČru 10.6. 27.7. 23.8. 20.9. 25.10. prĤmČr

celkový protein(g.100g-1) 4,78 4,81 5,6 7,98 8,61 6,36

141

SUMA(g.100g-1) 0,894 0,749 1,015 1,117 1,791 1,113

SUMA/celk.protein(%) 18,7 15,57 18,13 14 20,8 17,51

Tabulka III Hodnoty syrovátkových bílkovin v kozím mléce g.100g-1 – farma A, 2005 Farma A 2005 datum odbČru 14.3. 18.4. 13.5. 27.6. 8.8. 26.9. 17.10. prĤmČr

SUMA mléko syrovátka 0,472 0,433 0,493 0,478 0,513 0,447 0,424 0,361 0,382 0,308 0,667 0,221 0,465 0,492 0,388

Į-LA+ȕ-LG mléko syrovátka 0,409 0,332 0,434 0,419 0,437 0,395 0,396 0,350 0,331 0,279 0,572 0,198 0,398 0,430 0,339

mléko 0,142 0,143 0,143 0,098 0,103 0,221 0,142

ȕ-LG syrovátka 0,105 0,095 0,096 0,086 0,065 0,057 0,142 0,092

Tabulka IV Zastoupení syrovátkových bílkovin v proteinech kozího mléka, farma A, 2005 datum odbČru 14.3. 18.4. 13.5. 27.6. 8.8. 26.9. prĤmČr

celkový protein(g.100g-1) 2,69 2,7 2,8 2,58 2,71 3,07 2,83

SUMA(g.100g-1) 0,472 0,493 0,513 0,424 0,382 0,667 0,492

SUMA/celk.protein(%) 17,55 18,26 18,32 16,43 14,10 21,73 17,38

Tabulka V Procentické zastoupení aminokyselin v hrubých a syrovátkových bílkovinách kozího a ovþího mléka a jejich vzájemný pomČr AMK Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe

hrubé bílkoviny (%) kozí ovþí 7,31 7,02 3,1 2,68 20,26 17,4 1,85 2,06 2,83 2,86 3,46 3,76 4,12 3,45 3,12 3,65 10,79 10,2 2,9 4,31 3,03 3,91 7,65 7,08 2,28 3,19 7,6 8,07 5,25 5,54 9,74 9,93 4,7 4,84

syrovátkové bílkoviny (%) kozí ovþí 10,16 9,92 4,23 4,47 14,08 13,68 5,28 5,16 1,8 1,72 3,5 3,14 5,43 5,82 8,78 9,57 6,95 6,53 3,45 3,98 3,77 2,38 6,57 7,09 0,25 0,48 8,29 8,19 5,98 6,01 9,13 9,45 2,33 2,42

142

pomČr kozí 1,39 1,36 0,69 2,85 0,63 1,01 1,31 2,81 0,64 1,18 1,24 0,85 0,11 1,09 1,13 0,93 0,49

ovþí 1,41 1,67 0,79 2,51 0,6 0,84 1,69 2,62 0,64 0,92 0,61 1 0,15 1,01 1,08 0,95 0,5

ZávČr Nebyly zjištČny statisticky významné rozdíly v obsahu syrovátkových bílkovin mezi sledovanými farmami ani jednotlivými roky. Množství syrovátkových bílkovin je však do jisté míry statisticky závislé na dobČ odbČru mléka v prĤbČhu laktaþního období. V závislosti na fázi laktace docházelo u celkových syrovátkových bílkovin ke zmČnám jejich obsahu. Tyto zmČny však nebyly výrazné a docházelo pouze k malým výkyvĤm od prĤmČrných hodnot (0,450 g.100g-1). Z výsledkĤ je patrné, že vyšší obsahy syrovátkových bílkovin byly zaznamenány na poþátku laktace, což patrnČ souvisí s jejich rolí pĜi získávání imunity mláćat, a v koneþné fázi laktace, což pravdČpodobnČ souvisí se zvyšováním celkového proteinu. Aminokyselinové složení syrovátkových bílkovin kozího a ovþího mléka se lišilo pĜedevším v zastoupení methioniu a tyrosinu. V syrovátkových bílkovinách ovþího mléka bylo stanoveno témČĜ dvojnásobné množství methioninu než v syrovátkových bílkovinách mléka kozího. Množství tyrosinu bylo vyšší v syrovátkových bílkovinách mléka kozího. Práce vznikla za finanþní podpory výzkumného zámČru MSM 6046070901

Použitá literatura: 1. FORMAN, L. – MERGL, M. a kol. Syrovátka – její využití v lidské výživČ a ve výživČ hospodáĜských zvíĜat. 1. vydání. Praha: StĜedisko technických informací potravináĜského prĤmyslu – Výzkumného ústavu potravináĜského prĤmyslu v Praze, 1959. 343 s. 2. MALÁ, G. Kozí mléko pod lupou: Bílkoviny vládnou mléku. Zpravodaj Svazu chovatelĤ ovcí a koz v ýR, 2002, þ.2, s. 43-46. ISSN 1213-374X. 3. SIENKIEWICZ, T. – RIEDEL, C.-L. Whey and whey utilization. 2. edit. Verlag Th. Mann, Gelsenkirchen-Buer, Germany, 1990. 379 s. ISBN 3-7862-0086-6. 4. VELÍŠEK, J. Chemie potravin I. 2. vydání. OSSIS, 2002, 331 s. ISBN 80-86659-00-3. 5. VESELÁ, P. Syrovátka = hodnotná surovina. Celostátní pĜehlídky sýrĤ: Výsledky pĜehlídek a sborník semináĜe Mléko a sýry 2003. ýeská spoleþnost chemická, 2003. s. 55-59. ISBN 80-8623831-8.

Kontaktní adresa: Ing. BLANKA JANSOVÁ, ýeská zemČdČlská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a pĜírodních zdrojĤ, 165 21 Praha 6-Suchdol, ýeská republika, tel.: +420 224 382 727; e–mail: [email protected]

143

VLIV STADIA LAKTACE NA MLÉýNOU UŽITKOVOST HOLŠTÝNSKÉHO SKOTU Skýpala Martin, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtČní zvíĜat, AF, MZLU, Brno The influence of stage of lactation on milk efficiency of holstein cattle Summary: The aim of this study was to found out influence of stage of lactation on milk yield and composition of milk of Holstein cattle on the first lactation breed in the school farm Žabþice. The samples of milk were taken from the morning milking. We measure the milk yield, milk fat yield, milk protein yield, milk fat content, milk protein content, protein /fat ratio, milk lactose content, somatic cell count. The dairy cows were divided out 2 groups: group 1 (n = 39, to 200.day of lactation) and group 2 (n = 40, more than 200. day of lactation). We found high significant influence (P<0,01) in milk yield, milk fat yield and milk protein yield. The significantly influence (P<0,05) was found in protein/fat ratio. No significantly influence was found in milk fat content, milk protein yield, milk lactose content and somatic cell count.

Úvod Mléko je hlavní zdroj potravy v rozvinutých zemích. Po staletí bylo neustálou snahou zlepšit produkci a složení mléka (1). Mléþné složky jsou nejen významným indikátorem vnitĜního prostĜedí dojnice, ale mají bezprostĜední vztah k zpenČžování mléka a tím významnČ ovlivĖují rentabilitu výroby mléka (2). Pro mléþnou užitkovost krav je dĤležitá nejen produkce mléka, ale také produkce jeho jednotlivých složek (3). Mléþná užitkovost má v prĤbČhu laktace nČkteré zákonitosti, které jsou v jednotlivých stádech více þi ménČ zĜetelné, neboĢ mimo genotypu jsou pro produkci významné i vnČjší podmínky chovu a jejich úroveĖ, zdravotní stav jednotlivých zvíĜat i celého stáda (4). Laktací – þili laktaþním obdobím se nazývá období tvorby mléka od porodu do zaprahnutí (5). U krávy je žádoucí doba laktace kolem 305 dnĤ (6). Materiál a metodika K experimentu bylo použito mléko krav holštýnského plemene na 1. laktaci chovaných na ŠZP Žabþice. Krávy byly ustájeny ve stejné stáji a krmeny shodnou krmnou dávkou. Vzorky mléka byly odebírány z ranního dojení pomocí zaĜízení Tru-test. ZjišĢovalo se množství mléka, produkce tuku, produkce bílkovin, obsah tuku, obsah bílkovin, pomČr tuk:bílkovina, obsah laktózy, poþet somatických bunČk. Dojnice byly rozdČleny na 2 skupiny: skupina 1 (n = 39, do 200. dne laktace) a skupina 2 (n = 41, nad 200. den laktace). Mléko bylo analyzováno ve VÚCHS v RapotínČ na pĜístrojích Milko-scan 133 B (obsah bílkovin, obsah tuku, obsah laktózy) a PSB fossomatic 90 (poþet somatických bunČk). Výsledky a diskuze Produkce a složení mléka se mČní se stádiem laktace nebo dobou produkce mléka (7). Pokud uvážíme 305 denní laktaci, období produkce normálního mléka bez 5 dní po otelení je 300 dní (8). Denní dojivost zjištČnou v kontrolních dnech lze vyjádĜit graficky do tzv. laktaþní kĜivky (9). Typická laktaþní kĜivka je popisována jako zvyšování produkce mléka od otelení až po maximální výtČžnost, udržení maximální výtČžnosti a poté množství mléka klesá až do konce laktace (10). NamČĜili jsme vysoce statisticky vČtší (P<0,01) množství mléka u skupiny 1 (15,0 kg), než u skupiny 2 (12,7 kg). Tyto výsledky odpovídají prĤbČhu laktaþní kĜivky, kdy s postupující laktací množství mléka klesá. V mléce se vyskytují 2 typy bílkovin: globulární syrovátkové bílkoviny, které jsou rozpustné v mléþném séru a kaseiny, které se vyskytují jako stabilní koloidní suspenze agregátĤ známé jako kaseinové micely (11). Bílkoviny mléka jsou z nutriþního hlediska nejvýznamnČjší složkou mléka, jsou to vysokohodnotné bílkoviny (obsahují nenahraditelné esenciální aminokyseliny) dodávající mléku vysokou biologickou hodnotu. Bílkoviny podmiĖují rovnČž hlavní technologické vlastnosti mléka (kvasnost a syĜitelnost mléka) (12). Obsah bílkovin byl 144

vysoce statisticky prĤkaznČ vyšší u skupiny 2 (3,54 %) než u skupiny 1 (3,18 %). VČtší obsah bílkovin na konci laktace uvádČjí také SUCHÁNEK et al. (13), SEMJAN et al. (8). Produkce bílkovin v prĤbČhu laktace mírnČ klesala (skupina 1 – 0,48 kg; skupina 2 – 0,45 kg), což je ve shodČ s údaji BARTESE a HOLUBÁěE (4). Vyšší produkce bílkovin na zaþátku laktace a její pokles na konci je zpĤsoben nádojem, ze kterého se tato produkce poþítá. Tuk v mléce pĜedstavují kuliþky v rozmezí 1 - 10 ȝm, vČtšinou kolem 4 ȝm, závisející na plemeni krávy a roþním období (14). Tuk je nejvíce promČnlivou složkou v mléce pĜežvýkavcĤ. Obsah tuku v mléce je ovlivnČn zvíĜetem a faktory životního prostĜedí jako plemeno, výživa, fáze laktace, roþní období, okolní teplota a tČlesná kondice (15). Obsah tuku v mléce se podle ZADRAŽILA (12) pohybuje od 3,20 % do 6,00 %. Také u obsahu tuku v mléce jsme pozorovali na konci laktace vyšší než na zaþátku (skupina 1 – 4,13 %; skupina 2 - 4,20 %). Nízký obsah tuku v první pĤli laktace a jeho zvýšený obsah na konci laktace zmiĖuje také GAJDģŠEK (16). I ýEJNA a CHLÁDEK (17) zjistili na konci laktace vyšší obsah tuku. Jak uvádí BARTES a HOLUBÁě (4) jsou svým vývojem v laktaci antagonistou k samotné produkci mléka s tím, že u tuþnosti je v daném stádČ zĜetelná þasová prodleva za vývojem dojivosti. Produkce tuku byla na konci laktace vysoce statisticky prĤkaznČ nižší, než na zaþátku laktace (skupina 1 – 0,61 kg; skupina 2 – 0,53 kg). Také BARTES a HOLUBÁě (4) uvádí na zaþátku laktace vyšší produkci tuku oproti konci laktace. Pro posouzení výživy, konverze živin a metabolismu má význam také sledování pomČru obsahu tuku a bílkovin. Za optimální lze považovat pomČr T/B = 1,2 – 1,4. PĜi klesající hodnotČ tohoto kvocientu lze pĜedpokládat nástup subklinických acidóz bachorového obsahu, vysoká acidogenní zátČž vnitĜního prostĜedí, ohrožení reprodukþní výkonnosti dojnic a nebezpeþí vzniku poruch minerálního metabolismu. Zvýšení kvocientu nad 1,4 signalizuje energetický deficit a pĜi nálezu ketolátek subklinickou ketózu (18). Ketózy všeobecnČ jsou v období vzniku tzv. „energetické díry“ resp. negativní energetické bilance po otelení zpĤsobené vyšším výdejem živin laktací organismu oproti nižšímu pĜívodu. Jsou charakterizovány odbouráváním tČlesných energetických (pĜedevším tukových) rezerv (19). Zjistili jsme u 1. skupiny jsme prĤmČrnou hodnotu 1,31 a u 2. skupiny 1,19. Také ýEJNA a CHLÁDEK (20) uvádČjí, že s postupující laktací klesá pomČr tuk:bílkovina. Mléþný cukr neboli laktóza je disacharid (C12H22O11), který se nachází pouze v mléce (21). Pokud je rozpuštČna ve vodČ nebo syrovém mléce, existuje ve dvou formách: alfa a beta (22). Obsah laktózy v mléce se podle AUDIC et al. (23) pohybuje kolem 4,8 %. Obsah laktózy byl u 1. skupiny 4,99 % u 2. skupiny poklesl na 4,93 %. Pokles laktózy v prĤbČhu laktace popisují i SEMJAN et al. (8) a TEPLÝ et al. (24). Poþet somatických bunČk v kravském mléce je indikátorem zdraví vemene a kvality mléka a mĤže souviset s bunČþnou imunitní odezvou na zánČtlivý proces (25). Podle BOETTCHERA et al. (26) je to z toho dĤvodu, že leukocyty se mobilizují do vemene ke zníþení patogenĤ. Stadium laktace má vliv na poþet somatických bunČk. V prvním týdnu laktace je poþet somatických bunČk nejvyšší, poté se snižuje a ke konci laktace opČt stoupá (v koneþné fázi laktace množství mléka klesá a stejný poþet somatických bunČk se tak Ĝedí v menším objemu) (16). Zjistili jsme, že u skupiny 1 bylo v mléce v prĤmČru 141 000 somatických bunČk v 1 ml a u skupiny 2 175 000 somatických bunČk v 1 ml. Zvyšování poþtu somatických bunČk ke konci laktace uvádí také DE VLIEGHER et al., (27).

145

Tabulka I PrĤmČrné hodnoty, jejich smČrodatné odchylky a variaþní koeficienty stanovovaných ukazatelĤ u skupin 1 a 2 Skupina 1 Skupina 2 Ukazatel Stat.prĤk. VX X SX VX X SX nádoj (kg) 15,0 2,71 17,99 12,7 2,41 18,94 ** tuk (%) 4,13 0,77 18,61 4,20 0,58 13,72 NS tuk (kg) 0,61 0,12 19,01 0,53 0,12 22,32 ** bílkoviny (%) 3,18 0,26 8,16 3,54 0,35 9,93 ** bílkoviny (kg) 0,48 0,09 18,05 0,45 0,07 16,66 NS T/B 1,31 0,26 20,23 1,19 0,14 11,57 * laktóza (%) 4,99 0,13 2,61 4,93 0,23 4,71 NS PSB (tis./ml) 141 141,91 100,35 175 233,06 133,44 NS **vysoce statisticky prĤkazný vliv (P<0,01), *statisticky prĤkazný vliv (P<0,05), NS - statisticky neprĤkazný vliv

16,5

0,68

16,0

0,66 0,64

15,5

0,62

15,0

0,60 tuk (kg)

nádoj (kg)

14,5 14,0

0,58 0,56

13,5 0,54 13,0

0,52

12,5

0,50

12,0

0,48

11,5

0,46 1

2

1

skupina

Graf 1. Rozdíly mezi množstvím mléka u skupiny 1 a 2

Graf 2. Rozdíly mezi produkcí tuku u skupiny 1 a 2

3,7

1,40

3,6

1,35

3,5

1,30

3,4

1,25 T/B

bílkoviny (%)

2 skupina

3,3

1,20

3,2

1,15

3,1

1,10

1,05

3,0 1

1

2

Graf 3. Rozdíly mezi obsahem bílkovin u skupiny 1 a 2

2 skupina

skupina

Graf 4. Rozdíly mezi pomČrem tuk:bílkovina u skupiny 1 a 2 146

ZávČr Pro mléþnou užitkovost krav je dĤležitá nejen produkce mléka, ale také produkce jeho jednotlivých složek. Zjistili jsme vysoce statisticky prĤkazný rozdíl (P<0,01) mezi množstvím mléka u skupin 1 (n = 39; do 200. dne laktace) a 2 (n = 41; nad 200. den laktace), kdy se potvrzuje, že s postupující laktací klesá množství mléka. Vysoce statisticky prĤkazný rozdíl (P<0,01) je i mezi produkcí tuku u skupiny 1 a 2 a obsahem bílkovin. Ty spolu s tuky mají opaþnou tendenci, tedy s postupující laktací dochází k jejich nárĤstu. Statisticky prĤkaznČ vyšší hodnota (P<0,05) byla mezi pomČrem tuk:bílkovina u skupiny 1. U ostatních ukazatelĤ (obsah tuku, produkce bílkovin, obsah laktózy a poþet somatických bunČk) byly zjištČné rozdíly statisticky neprĤkazné. PodČkování: PĜíspČvek byl vypracován s podporou projektu QF 4005. Použitá literatura: 1. HOUDEBINE, L-M., RIVAL, S., PANTANO, T., JOLIVET, G., THEPOT, D., ATTAL, J.: Transgenesis for the study and the control of lactation. Reprod. Nutr. Dev., 2002, 42:117-125 2. DIVOKÝ, L.: Mléþné složky a výživa. Plemo report, listopad 2005, s. 30-31 3. ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJDģŠEK, S., POSPÍŠIL, Z.: PrĤbČh a variabilita složek a vlastností mléka krav v prvních 100 dnech laktace. Živoþ. Výr., 34, 1989, 8: 675-685 4. BARTES, P., HOLUBÁě, J.: Mléþná užitkovost dojnic a její vývoj v laktaci. Plemo report, listopad 2005, s.19-21 5. HROUZ, J., ŠUBRT, J.: Obecná zootechnika. Brno: MZLU, 2000, 207 s. 6. SOVA, Z. et al.: Fyziologie hospodáĜských zvíĜat. Praha: Státní zemČdČlské nakladatelství, 1981, 512 s. 7. SCOTT, T. A., YANDELL, B., ZEPEDA, L., SHAVER, R. D., SMITH, T.R.: Use of lactation curves for analysisof milk production data. J. Dairy Sci., 1996, 79:1885-1984 8. SEMJAN Š. et al.: Výroba kvalitného mlieka. Bratislava: Príroda, 1987, 304 s 9. PAŠEK, V., et al.: Cviþení z chovu skotu I. Praha: VŠZ, 1983, 140 s. 10. GROSSMAN, M., HARTZ, S.M., KOOPS, W.J.: Persistency of lactation yield: A novel approach. J. Dairy Sci., 1999, 82:2192-2197 11. HORNE, D. S., BANKS, J. M.: Rennet-induced coagulation of milk. Cheese: chemistry, Physics and microbiology. Third edetion – Volume 1: general aspects, 2004, p. 47-66 12. ZADRAŽIL, K.: MlékaĜství. Praha: ýZU A ISV, 2002, 128 s. 13. SUCHÁNEK, B. et al.: Zvyšování produkce mléka. Praha: SZN, 1973, 380 s. 14. MICHALSKI, M-C., BRIARD, V., MICHEL, F.: Optical parameters of milk fat globules for laser light scattewring measurements. Lait, 2001, 81:797-796 15. McGUIRE, M. A., BAUMAN, D. E.: Milk fat. Encyclopedia od Dairy Sciences, 2002, p. 18281834 16. GAJDģŠEK, S.: Laktologie. Brno: MZLU. 2003, 84 s. 17. ýEJNA, V., CHLÁDEK, G.: Vliv stádia laktace na vybrané mléþné ukazatele holštýnských dojnic na první laktaci. Sborník Mendelnet04Agro (MZLU Brno), 2004, multimediální CR-rom 18. HAAS, D., HOFÍREK, B.: Diagnostický význam mléþných složek pro zdraví þlovČka a dojnice. Sborník: Den mléka 2004. s. 107-114 19. HANUŠ, O., FRELICH J., KRON, V., ěÍHA, J., POZDÍŠEK, J.: Kontrola tČlesné kondice, zdravotního stavu a výživy dojnic a zlepšování jejich produkce. ZemČdČlské informace, 2004, 3, 72 s. 20. ýEJNA, V., CHLÁDEK, G.: PomČr tuk:bílkovina v mléce holštýnských dojnic. Náš chov þ. 2, 2006, s. 24-26. 147

21. SCHUCK, P., DOLIVET, A.: Laktose crystallization: determination of Į-lactose monohydrate in spray-dried dairy products. Lait, 2002, 82:413-421 22. VUATAZ, G.: The phase diagram of milk: a new tool for optimising the drying process. Lait, 2002, 82:485-500 23. AUDIC, J-L., CHAUFER, B., DAUFIN, G.: Non-food application of milk components and dairy co-products: A review. Lait. 2003, 83:417-438 24. TEPLÝ M. et al.: Mléko a jeho produkce k prĤmyslovému zpracování. Praha: SNTL, 1979, 376 s. 25. LINDMARK-MÅNSSON, H., BRÄNNING, C., ALDÉN, G., PAULSSON, M.: Relatioship between somatic cell count, individua leukocyte populations and milk components in bovine udder quarter milk. International Dairy Journal, 2006, 16:717-727 26. BOETTCHER, P.J., CARAVIELLO, D., GIANOLA, D.: Genetic analysis of somatic cell scores in US Holsteins with a Bayesian mixture model. J. Dairy Sci., 2007, 90:435-443 27. DE VLIEGHER, S., BARKEMA, H.W., STRYHN, H., OPSOMER, G., DE KRUIF, A.: Impact of early lactation somatic cell counts over the first lactation. J. Dairy Sci., 2004, 87:3672-3682 Kontaktní adresa: [email protected], [email protected]

148

VARIABILITA DUSÍKATÝCH LÁTEK V MLÉCE. Šustová KvČtoslava1, Kopunecz Pavel2 1 Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ 2 ýMSCH Variability of nitrogenous matter in milk Summary: This work occupied with variability nitrogenous matter (proteins, casein and urea) in cow ´s milk. About 6200 samples were followed from 40 dairies during the year. The percentage of samples was determined according to content of proteins and urea. About 20 % of dairy cows had a deficiency of energy in feeding amount during the season May to August. This value increased over 36 % in June.

Bílkoviny mléka jsou souþástí složitého komplexu dusíkatých látek v mléce, který oznaþujeme jako celkové bílkoviny. Dusíkaté látky mléka tvoĜí nejkomplexnČjší složku mléka, urþují také základní fyzikální a chemické vlastnosti mléka. Ze zpracovatelského hlediska jsou významné þisté bílkoviny, jejichž obsah se v kravském mléce pohybuje v rozmezí 3,0 až 3,3 %. NejvýznamnČjší složkou mléþných bílkovin je kasein, jehož množství kolísá v rozmezí 2,4 až 2,6 %. Jako hrubé bílkoviny potom oznaþujeme þisté bílkoviny spoleþnČ s tzv. nebílkovinnými dusíkatými látkami. Koncentrace nebílkovinných dusíkatých látek v mléce od zdravých a dobĜe krmených zvíĜat se pohybuje v rozmezí od 250 do 350 mg N v 1 litru mléka, v pĜevážné þásti se jedná o produkty metabolismu. NejvČtší podíl z tČchto látek tvoĜí moþovina. Množství moþoviny v syrovém mléce není normou stanovený jakostní ukazatel. Moþovina je koneþným produktem metabolismu bílkovin a je obsažena v krvi, moþi, slinách i mléku. Byla prokázána úzká korelace mezi koncentrací moþoviny v krevní plazmČ a mléku. V krevní plazmČ zdravých dojnic pĜi optimální výživČ je koncentrace moþoviny 3,0-5,0 mmol/l. Hodnoty koncentrace moþoviny v mléku se pohybují v rozmezí 2,64,6 mmol/l. Koncentrace moþoviny v krevní plazmČ a mléku je výslednicí energetického a dusíkatého metabolismu. PĜi nedostateþném pĜíjmu sacharidĤ jsou v pĜedžaludku dusíkaté látky nedostateþnČ využívány (nedostateþná tvorba bakteriálního proteinu) a játra syntetizují z resorbovaného amoniaku moþovinu, která je vyluþována z organismu moþí a mlékem. RovnČž pĜi zkrmování dusíkatými látkami se koncentrace moþoviny zvyšuje v krvi, moþi i mléku. Koncentrace moþoviny v krevní plazmČ a mléku je velmi citlivým ukazatelem úrovnČ zásobení organismu dusíkatými látkami a jejich využitím [3, 5]. ÚroveĖ obsahu moþoviny v syrovém mléce diagnostikuje vhodnost složení krmné dávky [6]. Fyziologické rozmezí úrovnČ moþoviny leží mezi 150-300 mg na 1 litr mléka. Ve znaþném poþtu pĜípadĤ dochází ke zvýšení obsahu moþoviny nad fyziologicky optimální hranici do 300 mg/l. Jako pĜíþinu lze uvést zejména pĜekrmování dusíkatými látkami, nedostatek energie nebo situaci, kdy je vyrovnaný pomČr energie a dusíkatých látek, ale dochází ve znaþné míĜe k odbourávání dusíkatých látek v bachoru. Ze stanovení obsahových složek mléka a obsahu moþoviny lze vyvodit, že vysoká hladina moþoviny v mléce pĜi fyziologickém obsahu bílkovin je zpĤsobena pĜebytkem bílkovin v krmivu a vysoká hladina moþoviny v mléce pĜi nízkém obsahu bílkovin je zpĤsobena nedostatkem energie v krmivu [1]. Obsah moþoviny stoupá pĜi podávání krmiva, jež obsahuje více než 17 % hrubých bílkovin nebo pĜi zkrmování mladé zelené píce þi pastevního porostu s vysokým obsahem rychle rozpustných a rychle degradovatelných dusíkatých látek. Zvýšené hodnoty moþoviny v mléku jsou zjišĢovány i pĜi nedostateþném využívání dusíkatých látek z dĤvodu nedostatku pohotové energie. Zvýšení koncentrace moþoviny v mléku jsou zpravidla doprovázeny alkalózou bachorového obsahu, poruchami trávení a nedostateþnou tvorbou tČkavých mastných kyselin i bakteriálního proteinu [2]. PĜi dlouhodobČ zvýšené zátČži dusíkatými látkami dochází k rĤzným poruchám metabolismu. Skladba mléka je výraznČ narušena. Dochází ke snížení tukuprosté sušiny, obsahu bílkovin, laktózy, snižuje se titraþní kyselost mléka a zvyšuje se poþet somatických bunČk v mléce. 149

Tabulka I Hodnoty moþoviny v syrovém kravském mléce pro urþování správné výživy dojnic [4]. Obsah moþoviny v mg / 100 ml 15 - 30

> 30

Nedostatek bílkovin a pĜebytek energie

PĜebytek energie

PĜebytek bílkovin a energie

3,2 - 3,6

Nedostatek bílkovin a slabý pĜebytek energie

Bílkoviny a energie v rovnováze

PĜebytek bílkovin a slabý nedostatek energie

< 3,2

Nedostatek energie a bílkovin

Nedostatek energie

PĜebytek bílkovin a nedostatek energie

< 15 Obsah bílkovin v % > 3,6

Jakost mléþných bílkovin je urþena proporcionálním zastoupením všech dusíkatých látek v mléce. Vliv deficitní výživy, zejména energie, mĤže vést i ke snížení termostability bílkovin, což se negativnČ projevuje pĜi všech tepelných procesech pĜi zpracování mléka [3]. Pro mlékaĜskou technologii je výhodný velmi nízký obsah zbytkového dusíku a vysoký obsah kaseinu v mléce. V dnešní dobČ, kdy se platí za mléko hlavnČ podle obsahu celkových bílkovin, by se mČlo pĜihlédnout k faktu, že kasein, který má hlavní význam pĜi výtČžnosti výroby sýrĤ tvoĜí pouze v prĤmČru 75 % z celkových bílkovin. Pro zvýšení obsahu bílkovin v mléce jsou tedy zkrmovány vyšší dávky krmiv s vysokým obsahem dusíkatých látek, což má za následek navýšení také obsahu moþoviny. Dusík z moþoviny následnČ ovlivĖuje výpoþet obsahu bílkovin z celkového dusíku. Cíl práce Cílem práce bylo zhodnotit roþní variabilitu dusíkatých látek mléka a jejich vzájemný vztah. Vzorky byly odebírány celoroþnČ pĜibližnČ od 40 mlékáren, poþet vzorkĤ za mČsíc byl 6200. V práci byly použity údaje z rozborĤ vzorkĤ mléka z centrální laboratoĜe Pardubice. Vzorky byly odebírány od ledna do prosince v roce 2003. U vzorkĤ byl vyhodnocen obsah celkových bílkovin, kaseinu a moþoviny. Výsledky a diskuse Nejvyšší prĤmČrná mČsíþní hodnota bílkovin byla zjištČna v listopadu (3,52 %) a nejnižší prĤmČrná hodnota byla zjištČna v þervnu (3,24 %). Podle obsahu bílkovin jsme vytvoĜili intervaly po 0,2 % v rozmezí od 2,8 do 4,0 %. V jednotlivých intervalech bílkovin jsme stanovili þetnost vzorkĤ. Nejvyšší þetnost v intervalu bílkovin od 3,4 do 3,6 % byla v zimním období a to Ĝíjen až únor. Po zbytek roku byla nejvyšší þetnost v intervalu bílkovin 3,2 až 3,4 %. V þervnu dokonce byla þetnost v intervalu bílkovin 3,0 až 3,2 % témČĜ 35 % z celkových bílkovin. Nejvyšší prĤmČrná mČsíþní hodnota kaseinu byla zjištČna v listopadu (2,71 %) a nejnižší prĤmČrná hodnota byla zjištČna v þervnu a srpnu (2,36 %). Obsah kaseinu koreluje s obsahem bílkovin, byla prokázána pozitivní závislost mezi obsahem bílkovin a obsahem kaseinu. TČsnost závislosti byla velmi vysoká, výjimku tvoĜí mČsíc záĜí, kdy tČsnost byla “pouze“ velká. Vypoþtené hodnoty korelaþního koeficientu byly vysoce prĤkazné (P = 0,01). Kaseinové þíslo se vypoþítá jako procentické množství kaseinu z celkových bílkovin. Hodnota kaseinového þísla, jak uvádí tabulka II mírnČ klesala od ledna do srpna (73 >> 72), od záĜí se zvyšovala na 75 a do prosince hodnota kaseinového þísla stoupala až na 77. Závislost obsahu kaseinu na syrovátkových bílkovinách, byla pozitivní, tČsnost význaþná až velká. Výjimku tvoĜil mČsíc záĜí, kdy byla tČsnost nízká. Vypoþtené hodnoty korelaþního koeficientu jsou vysoce prĤkazné (P = 0,01). 150

Tabulka II Variabilita kaseinového þísla mČsíc leden únor bĜezen duben kvČten þerven þervenec srpen záĜí Ĝíjen listopad prosinec

x 73,4 72,7 73,0 73,0 72,9 72,8 72,4 71,9 75,0 76,2 77,1 77,2

2 Sx

Sx

0,77 0,71 0,64 0,61 0,62 0,64 0,87 0,67 4,94 1,71 1,22 1,26

0,88 0,84 0,80 0,78 0,79 0,80 0,93 0,82 2,22 1,31 1,11 1,12

Vx 1,19 1,16 1,10 1,07 1,08 1,10 1,29 1,14 2,96 1,72 1,43 1,45

min. 58,7 63,3 62,7 60,1 63,8 53,4 60,6 54,8 50,3 68,1 71,4 71,4

max. 94,1 88,7 78,0 81,8 77,2 77,2 79,1 76,0 82,8 95,6 96,9 83,9

Tabulka III Variabilita obsahu moþoviny mČsíc x (mg/100ml) leden 19,9 únor 23,3 bĜezen 24,8 duben 25,4 kvČten 25,1 þerven 22,3 þervenec 25,1 srpen 25,2 záĜí 24,5 Ĝíjen 26,5 listopad 20,4 prosinec 21,7

2 Sx

Sx

75,1 74,5 91,1 84,0 93,7 72,4 72,7 76,3 92,6 87,8 64,0 72,4

8,7 8,6 9,5 9,2 9,7 8,5 8,5 8,7 9,6 9,4 8,0 8,5

Vx 43,6 37,1 38,5 36,1 38,5 38,2 33,9 34,6 39,2 35,4 39,2 39,2

min. 0,9 1,4 1,7 1,4 3,2 1,2 5,1 3,0 0,7 5,0 2,6 4,3

max. 58,8 59,9 73,4 65,3 72,4 70,6 58,8 60,1 59,5 59,7 55,9 58,7

Tabulka IV Vzájemná korelace mezi obsahem bílkoviny, kaseinu a moþoviny pearson mČsíc leden unor bĜezen duben kvČten þerven þervenec srpen záĜí Ĝíjen listopad prosinec

bílkovina moþovina bílkovina moþovina kasein kasein 0,167 0,199 0,988 0,183 0,220 0,989 0,195 0,242 0,989 0,202 0,238 0,990 0,155 0,183 0,987 0,102 0,127 0,986 0,054 0,084 0,978 0,024 0,058 0,987 0,108 0,254 0,881 0,040 0,089 0,959 0,089 0,138 0,986 0,095 0,149 0,984

Nejnižší obsah moþoviny bývá zjišĢovány dubnu, nejvyšší pak v záĜí [6]. V našich výsledcích byl nejnižší obsah v lednu (19,9 mg /100 ml) a nejvyšší v Ĝíjnu (26,5 mg /100 ml). V období únor až kvČten byly hodnoty moþoviny spíše vyšší. Závislost mezi obsahem moþoviny a obsahem bílkovin a mezi obsahem moþoviny a kaseinu je pozitivní, tČsnost nízká. Vypoþtené hodnoty korelaþního koeficientu jsou vysoce prĤkazné (P = 0,01). Výjimku tvoĜí mČsíc srpen, kde se závislost obsahu bílkovin na obsahu moþoviny neprokázala. Zajímavé výsledky poukazuje prĤmČrné množství moþoviny v jednotlivých intervalech bílkovin. Dá se Ĝíci, že množství moþoviny stoupá až do intervalu bílkovin 3,4 až 3,6 respektive 3,6 až 3,8 a dále pak klesá s rostoucím intervalem bílkovin. Výjimku tvoĜí letní mČsíce kvČten a þerven, kdy v intervalu bílkovin nad 4 % zase obsah moþoviny roste, v þervnu dokonce v intervalu bílkovin nad 4 % je extrémnČ vysoké množství moþoviny (31,1 mg/100 ml). Výsledky jsou ovšem ovlivnČny malou þetností v intervalech bílkovin vyšších než 3,6 až 3,8 %. 151

Jak vyplývá z tabulky I., správnČ vybilancovaná krmná dávka je základem pro zisk mléka s optimálním složením. Procentické zastoupení námi sledovaných vzorkĤ mléka podle obsahu bílkovin a moþoviny je patrné z obr. 1 a 2.

leden

únor

bĜezen

duben

kvČten

þerven

Obr. 1. Procentické zastoupení vzorkĤ v jednotlivých intervalech bílkovin a moþoviny v mČsících leden až þerven podle tab. I 152

þervenec

srpen

záĜí

Ĝíjen

listopad

prosinec

Obr. 2. Procentické zastoupení vzorkĤ v jednotlivých intervalech bílkovin a moþoviny v mČsících þervenec až prosinec podle tab. I

153

V období kvČten až srpen trpí nad 20 % dojnic nedostatkem energie, v þervnu se dokonce tato hodnota zvýšila až na 36 % veškerých dojnic. Tyto hodnoty souvisí ovšem také s nejvČtším poþtem laktací v letním období. V mČsících Ĝíjen až leden trpí zase dojnice pĜebytkem energie, v listopadu je to témČĜ tĜetina z celkového poþtu. Na druhé stranČ bílkovin je v krmné dávce nedostatek v mČsících listopad až leden, po zbytek roku je v krmné dávce bílkovin spíše pĜebytek. PĜes to všechno v prĤmČru u 40 % dojnic je každý mČsíc krmná dávka vybilancovaná správnČ. Z výsledkĤ je patrné, že ve znaþném poþtu pĜípadĤ dochází ke zvýšení obsahu moþoviny nad fyziologicky optimální mez (30mg/100ml), v nČkterých mČsících dokonce u více než tĜetiny analýz a tím k ekonomickým ztrátám v chovech. Jako pĜíþinu lze uvést zejména pĜekrmování dusíkatými látkami, nedostatek energie nebo situaci, kdy je vyrovnaný pomČr energie a dusíkatých látek, ale dochází ve znaþné míĜe k odbourávání dusíkatých látek v bachoru. Pro zvýšení obsahu bílkovin v mléce tedy nČkteĜí zemČdČlci zkrmují vyšší dávky krmiv s vysokým obsahem dusíkatých látek, avšak zvýší se hlavnČ obsah moþoviny. Dusík z moþoviny pak negativnČ ovlivĖuje nejen výpoþet obsahu bílkovin z celkového dusíku ale i celkovou výtČžnost sýrĤ. Práce podrobnČ statisticky vyhodnotila obsáhlý soubor vzorkĤ mléka a mĤže být vzhledem k velkému množství zpracovaných dat dĤležitým pĜínosem pro výrobce i zpracovatele mléka.

Použitá literatura: 1. BUCEK, P. a kol. Výsledky analýz mléka v chovatelských laboratoĜích. Náš chov, 2002, 5, s. 30-31. 2. FRANK, B., SWENSSON, C. Relationship between content of crude protein in rations for dairy cows and milk yield, concentration of urea in milk and ammonia emissions, J Dairy Sci., Sweden, 2002, 7, p. 1829-38. 3. ILLEK, J., KADLEC, I. Výživa dojnic a její vliv na jakost a složení mléka. In Problematika prvovýroby mléka. Pardubice: ÚVO, 1995, s. 69-105. 4. KADLEC, I. a kol. Požadavky a pĜíþina nízké jakosti mléka. Milcom servis, a.s., Praha 1995. 202s. 5. KOUKAL, P. Metabolizovatenlý protein ve výživČ dojnic, Náš chov, 2004, 8, s. 37-42. 6. SEYDLOVÁ, R., KADLEC, I. Využívání výsledkĤ jakosti mléka pro zabezpeþování jakostní výroby mléka a výživy dojnic. In Problematika prvovýroby mléka. Pardubice: ÚVO, 1995, s. 107-110. Kontaktní adresa: Ing. KvČtoslava Šustová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Fakulta agronomická, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, tel. 545 133 257, e-mail: [email protected]

154

VLIV KONCENTRACE MOýOVINY NA SÝRAěSKÉ VLASTNOSTI KRAVSKÉHO MLÉKA ýejna Vladimír, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtČní zvíĜat, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ Effect of milk urea level on cheese-making properties of cow’s milk Summary: Milk composition can considerably affect milk processing and consequently quality and quantity of dairy products. We found a statistically significant negative effect (P<0.05) milk urea concentration on rennet coagulation time. This result implies that urea concentration monitoring is important not only for producers but also for dairy factories.

Úvod Složení mléka mĤže mnoha zpĤsoby ovlivĖovat výrobní proces a následnČ kvalitu a kvantitu mléþných produktĤ [1]. Z hlediska zpracovatelnosti a výroby mlékárenských produktĤ je nutné, aby mléko mČlo nejen vhodné složení, ale i vlastnosti. Ze základních vlastností mléka se jedná pĜedevším o jeho kyselost (titraþní i aktivní) a z technologických vlastností podle zpĤsobu zpracování o kysací schopnost, syĜitelnost a tepelnou stabilitu [2]. Koncentrace moþoviny v mléce je uznávaným indikátorem dusíkato–energetické bilance ve výživČ dojnic ve vztahu jejich dojivosti, kdy zvýšené hodnoty jsou þasto dány absolutním nebo relativním pĜebytkem dusíkatých látek nebo nedostatkem energie [3]. V mléce pĜedstavuje koncentrace moþoviny 2,5 až 3 % z celkového dusíku v kravském mléce [4]. K nežádoucímu vzrĤstu koncentrace moþoviny v krvi a v mléce dochází pĜi pĜekroþení proteosyntetické kapacity bachorové mikroflóry, napĜ. pĜebytkem N–látek v krmné dávce, nebo nedostatkem pohotové energie pro metabolickou mikrobiální aktivitu. Amoniak, vzniklý v bachoru v dĤsledku rozštČpení pĜibližnČ 70 % krmného proteinu, pak nemĤže být mikrobiálnČ zpČtnČ využit plnČ k proteosyntéze, jeho pĜebytek pĜechází do krve a je v játrech detoxikován na moþovinu [5]. PĜi dlouhodobém a dieteticky zcela nevhodném krmení tak dále dochází k neúmČrnému zatížení detoxikaþní kapacity jater a následnČ ke zvýšení obsahu moþoviny ve všech tČlesných tekutinách, vþetnČ mléka a krve. Každé odbourávání moþoviny v játrech je energeticky velmi nároþným procesem a jen prohlubuje energetický deficit [6]. Martin et al. (1997) [7] uvádČjí, že moþovina bezprostĜednČ ovlivĖuje prokysávání mléka, chemické složení a texturní vlastnosti sýrĤ, pĜiþemž moþovina pĜímo neovlivĖuje chuĢ sýrĤ. Vysoké hladiny moþoviny v mléce jsou také spojovány se zhoršováním jednotlivých ukazatelĤ reprodukce [8, 9, 10, 11]. NapĜ. Hanuš et al. (2001) [12] uvádČjí, že dlouhodobé navýšení obsahu moþoviny v mléce v dĤsledku zatížení dusíkatými látkami ve výživČ o 10 mg/100 ml nad bČžný prĤmČr (cca 26 až 28 mg/100 ml) mĤže prodloužit servis periodu cca o 10 dní a zkrátit produkþní vČk dojnice cca o 0,5 laktace. Zhoršující ukazatele reprodukce pak mají za následek zhoršení ekonomické situace chovatelĤ [13]. Zadražil (2002) [14] uvádí fyziologicky únosnou koncentraci moþoviny 15–30 mg/100 ml mléka. Cílem práce bylo zjistit vliv rĤzných hladin moþoviny na sýraĜské vlastnosti mléka (syĜitelnost a kvalita sýĜeniny). Materiál a metodika Byly analyzovány individuální vzorky kravského mléka v rámci dvou chovĤ. V chovu A (Moravskoslezský kraj) byly odebírány vzorky (veþerní nádoj) od dojnic holštýnského (n = 8; H75 a vyšší, poĜadí laktace = 1,00) a þeského strakatého plemene (n = 8; C75 a vyšší; poĜadí laktace = 2,1) v prĤbČhu celé laktace. Výsledný soubor dat (prĤmČrná koncentrace moþoviny: 33,79 mg/100 ml) byl rozdČlen na tĜi koncentraþní hladiny moþoviny: 1 (20,00–29,99); 2 (30,00–39,99) a 3 (40,00–49,99 mg/100 ml). V chovu B (Jihomoravský kraj) byly odebírány vzorky (denní nádoj) od þistokrevných holštýnských dojnic (n = 24; poĜadí laktace = 1,43) v prĤbČhu celé laktace. Výsledný soubor dat (prĤmČrná koncentrace moþoviny: 44,87 mg/100 ml) byl rozdČlen na tĜi koncentraþní hladiny moþoviny: 1 (30,00–39,99); 2 (40,00–49,99) 155

a 3 (50,00–59,99 mg/100 ml). Vzorky od dojnic, jejichž mléko bylo vylouþeno z dodávky pro mlékárnu, nebyly analyzovány. Koncentrace moþoviny byla zjištČna pomocí enzymaticko–konduktometrické metody (Ureakvant 2) v laboratoĜi LRM Brno-Chrlice. Ostatní ukazatele byly zjištČny v laboratoĜi Ústavu chovu a šlechtČní zvíĜat MZLU v BrnČ. SyĜitelnost mléka byla stanovena pomocí „Nefelo– turbidimetrického snímaþe koagulace mléka“ mČĜící principem vysvČtleným v práci ýejny a Chládka (2005) [15]. Bylo použito syĜidlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po zĜedČní syĜidla 1:4. Kvalita sýĜeniny byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasýĜeného mléka pĜi 35 °C a posouzena dle známé tabulky [16] hodnotící vzhled sýĜeniny a syrovátky (tĜída 1 = nejlepší, tĜída 5 = nejhorší). Titraþní kyselost byla provádČna dle ýSN 57 0530 þl. 58. Výsledky a diskuze PrĤmČrné hodnoty sledovaných technologických vlastností v jednotlivých koncentraþních hladinách moþoviny v chovech A a B uvádí tab. I. Grafické znázornČní zmČn syĜitelnosti a kvality sýĜeniny v jednotlivých hladinách moþoviny je patrné z grafu 1. V obou sledovaných chovech mČla zvyšující se koncentrace moþoviny statisticky prĤkazný vliv (P<0,05) na zhoršování syĜitelnosti. V chovu A se projevilo zhoršování syĜitelnosti v jednotlivých hladinách moþoviny takto: 203 s; 212 s a 257 s. Obdobné zhoršování syĜitelnosti se prokázalo i v chovu B (201 s; 209 s a 233 s). Jedním z vysvČtlením mĤže být skuteþnost, že vysoké hladiny moþoviny v mléce ovlivĖují složení a pomČr mléþných složek vþetnČ minerálních látek, což se výslednČ projeví zhoršením syĜitelnosti mléka. NapĜ. Doležal et al. (2005) [6] uvádČjí, že s vČtším vyluþováním amoniaku mĤže docházet k zvýšení obsahu vápníku v moþi. Vyšší hladiny moþoviny také negativnČ ovlivnily kvalitu sýĜeniny ve sledovaných chovech, ovšem bez statisticky prĤkazných rozdílĤ. V chovu A došlo k tomuto zhoršení kvality sýĜeniny: 1,45 tĜ.; 1,52 tĜ. a 1,92 tĜ. V chovu B se kvalita sýĜeniny zhoršovala v lineárním trendu (1,94 tĜ.; 2,01 tĜ. a 2,10 tĜ.). Naše výsledky jsou ve shodČ s Martin et al. (1997) [7], kteĜí zjistili u skupiny dojnic s vysokou koncentrací moþoviny horší syĜitelnost a pomalejší tvorbu sýĜeniny. Tabulka I PrĤmČrné hodnoty sledovaných technologických vlastností v jednotlivých koncentraþních hladinách moþoviny v chovech A a B chov A

koncentrace moþoviny (mg/100 ml) 1 2 3 20,00 - 29,99

n

30,00 - 39,99

chov B

40,00 - 49,99

koncentrace moþoviny (mg/100 ml) 1 2 3 30,00 - 39,99

40,00 - 49,99

50,00 - 59,99

n 53 70 52 67 13 Cx 35,43 45,18 54,07 33,88 43,46 min min 30,10 40,40 50,20 30,09 40,22 max max 39,90 49,90 59,90 39,85 49,34 sx sx 3,069 2,826 2,815 2,690 2,690 v% v% 8,659 6,255 5,206 7,942 6,188 syĜitelnost (s) syĜitelnost (s) Cx Cx 203a 212 257b 201a 209 233b sx sx 60,6 69,2 20,1 46,3 52,8 71,1 v% v% 29,8 32,6 7,84 23,0 25,3 30,6 kvalita sýĜeniny (tĜ.) kvalita sýĜeniny (tĜ.) Cx Cx 1,45 1,52 1,92 1,94 2,01 2,10 sx sx 0,730 0,699 0,730 0,872 0,765 0,815 v% v% 50,467 45,901 37,947 44,957 37,988 38,869 PrĤmČrné hodnoty jednoho faktoru oznaþené ve stejném Ĝádku rĤznými písmeny (a, b) se liší statisticky prĤkaznČ (P<0,05). Cx

56 26,59 20,56 29,96 2,412 9,073

156

Obr. 1: Grafické znázornČní zmČn syĜitelnosti a kvality sýĜeniny v jednotlivých hladinách moþoviny v chovech A a B

ZávČr Složení mléka zásadním zpĤsobem ovlivĖuje jeho technologické vlastnosti. Zjistili jsme statisticky prĤkazný vliv (P<0,05) koncentrace moþoviny na zhoršování syĜitelnosti mléka. Z toho vyplývá, že sledování koncentrace moþoviny v mléce je dĤležité nejen pro prvovýrobce (z hlediska reprodukce a následnČ ekonomiky chovu), ale i pro zpracovatele (z hlediska optimálních technologických vlastností mléka). PĜíspČvek byl vypracován s podporou projeku QF 4005.

Literatura 1. AULDIST, M. J. , MULLINS, C., O´BRIEN, B., O´KENNEDY, B. T., GUINEE. T.: Effect of cow breed on milk coagulation properties. Milchwissenschaft, 2002, 57(3): 140 - 143 2. GAJDģŠEK, S.: Sezónní zmČny dusíkatých látek a vlastností kravského mléka. Živoþišná výroba, 1993, 38(8): 745-752 3. JOHNSON, R. G., YOUNG, A. J.: The association between milk urea nitrogen and DHI production variables in Western commercial dairy herds. J. Dairy Sci., 2003, 86:3008-3015 4. DePETERS, E. J., CANT, P.: Nutritional factors influencing the nitrogen composition of bovine milk: a review. J. Dairy Sci., 1992, 75:2043-2070 5. HANUŠ, O., GENýUROVÁ, V., FICNAR, J., GABRIEL, B., ŽVÁýKOVÁ, I.: Vztah obsahu moþoviny a bílkovin v stádových vzorcích mléka k nČkterým chovatelským faktorĤm. Živoþišná výroba, 1993, 38(1):61-72 6. DOLEŽAL, P., DVOěÁýEK, J., ZEMAN, L.: Vliv volného þpavku v krmivech a jeho pĤsobení na trávení. Náš chov, 2005, (65)3: 31-34 157

7. MARTIN, B., COULON, J. B., CHAMBA, J. F., BUGAUD, C: Effect of milk urea content on characteristics of matured Reblochon cheeses. Le Lait, 1997, 77(4):505-514 8. BUTLER, W. R., CALAMAN, J. J., BEAM, S. W.: Plasma and milk urea nitrogen in relation to pregnancy rate in lactating dairy cows. J. Anim. Sci., 1996, 74:858-865 9. BURKE, J. M., STAPLES, C. R., RISCO, C. A., de la SOTA, R. L., THATCHER, W. W.: Effect of ruminant grade menhaden fish meal on reproductive and productive performance on lactating dairy cows. J. Dairy Sci., 1997, 80:3386-3398 10. LARSON, S. F., BUTLER, W. R., CURRIE, W. R.: Reduced fertility associated with low progesterone postbreeding and increased milk urea nitrogen in lactating cows. J. Dairy Sci., 1997, 80:1288-1295 11. LEE, J. H., KIM, C. K., CHUNG, Y. C., YOON, J. T.: Efeect of milk production, season, parity and lactation period on variations of milk urea nitrogen concentration and milk components of Holstein dairy cows. Asian-Aust. J. Anim. Sci., 2004, 17(4):479 12. HANUŠ, O., KVAPILÍK, J., KLOPýIý, M., BJELKA, M.: DĤležité složky dusíkaté fáze mléka a chovatelské faktory. In Chov a šlechtČní skotu pro konkurenceschopnou výrobu. VÚCHS Rapotín, 2001, s. 114-121 13. HANUŠ, O., HEGEDÜŠOVÁ, Z., BJELKA, M., LOUDA, F., MACHÁLEK, A.: Reprodukce dojených krav, její problémy v souþasných podmínkách a faktory, které ji ovlivĖují ve vztahu k produkci mléka. In Vliv výrobních faktorĤ a welfare na zdraví a plodnost dojnic a kvalitu a bezpeþnost mléka jako potravinové suroviny. VÚCHS Rapotín, 2006, s. 99-128 14. ZADRAŽIL, K.: MlékaĜství. Praha ýZU, 2002, 127 s. 15. ýEJNA, V., CHLÁDEK, G.: Individuální syĜitelnost mléka holštýnských dojnic a její vztah k poĜadí a stadiu laktace. In Mléko a sýry 2005 1. vyd. Praha: ýeská spoleþnost chemická, 2005, s. 33 – 37 16. GAJDģŠEK, S.: MlékaĜství II (cviþení). Brno: MZLU. 1999, 92 s.

Kontaktní adresa: Ing. Vladimír ýejna, ÚCHŠZ AF MZLU BRNO, ZemČdČlská 1, 613 00 e-mail:[email protected]

158

MLIEKO SO ZVÝŠENÝM OBSAHOM SELÉNU, AKO SUROVINA PRE VÝROBU FUNKýNÝCH POTRAVÍN V PREVENCII PROTI NÁDOROVÝM OCHORENIAM Foltys Vladimír1, Kirchnerová Katarína1, Bobþek Rastislav2. 1 Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živoþíšnej výroby, Nitra, 2 Alltech Slovakia, Nitra Milk with higher Selenium content as the raw material for functional food production in the prevention of tumour disease Summary: We studied the effect of feeding the organic selenium on somatic cell count in milk of dairy cows, health status of mammary gland, and the increase of selenium content in milk. Selenium was added to the premix in form of Selplex Se (firm Alltech, Inc.) in the amount 0.2 ppm into 1 kg feed mixture. The enriched mixture was fed to 44 dairy cows during 8 weeks. SCC and Selenium content was studied in milk samples and compared with the control group. Decrease of SCC from 229.3x103/ml to 174.5x103/ml (P<0.001) was noticed with Se feeding from 1st to 8th week of experiment. Content of Se in milk rose from 0.048 mg/ml to 0.138 mg/ml during the experiment, i.e. by 288 % compared with common cow's milk.

Vitálne funkcie selénu V súvislosti s þoraz viac zaĢaženým životným prostredím sa znaþná pozornosĢ venuje antioxidaþnej ochrane Đudí a zvierat. Medzi jej najaktívnejšie zložky patria selenoproteíny. Dôležitým selenoproteínom je enzým glutation peroxidáza, ktorý má kĐúþovú úlohu v antioxidaþných reakciách pri odstraĖovaní peroxidov vodíka, fosfolipidových peroxidov a iných škodlivých hydroperoxidov na membránach a v cytoplazme. Treba tu zároveĖ aj uviesĢ, že mnohé antioxidaþné reakcie Se prebiehajú v úzkom vzĢahu s vitamínom E, a preto sa niektoré príznaky ich deficiencie môžu prekrývaĢ. (1) Ćalším významným selenoproteínom je thioredoxín reduktáza. Jej úlohou je redukcia cysteínových zvyškov v transkripþných faktoroch a tým aj zásah do nukleotidov v DNA syntéze, regenerácia antioxidaþného systému, udržiavanie redukovaného stavu v bunke transfermi elektrónu (kritické pre životaschopnosĢ bunky) a regulácia expresie génov kontrolou redox potenciálu pri väzbe transkripþných faktorov na DNA (2). V poslednej dobe si veĐkú pozornosĢ ako selenoproteíny získali tri izoenzýmy jódtyronín dejodinázy, z ktorých dva katalyzujú aj konverziu neaktívnej formy hormónu tyroxínu (T4) sekrétovaného štítnou žĐazou na aktívnu formu 3,3,5-trijódtyronín (T3) (3). Selén má znaþnú úlohu v imunitných funkciách. Je známe, že jeho deficiencia znižuje bunkovú aj humorálnu imunitnú schopnosĢ u Đudí a zvierat. Evidentne to súvisí s vysokou aktivitou GSH-Px v bielych krvinkách (4). Pomerne veĐa sa hovorí o potenciálnom antikarcinogénnom úþinku selénu na základe poþetných štatistických a modelových prác. Pri dávkach odporúþaných pre Đudí, v USA a VeĐkej Británii (príjem cca 60 a 75 Pg denne) Se funguje ako antimutagénny faktor zabraĖujúci malígnej transformácii normálnych buniek a aktivácii onkogénov prostredníctvo antioxidaþných funkcií GSH-Px a rioredoxín reduktázy. Zdá sa však, že aj tento, doposiaĐ odporúþaný príjem, bude potrebné zvýšiĢ až na 80 – 100 Pg denne vzhĐadom na nové kritéria saturovateĐnosti GSH-Px v trombocytoch (5). Pri ešte vyšších príjmoch Se (200 až 300 Pg denne) sa predpokladá, že by sa mohli navyše uplatniĢ podobné mechanizmy úþinku niektorých jeho metabolitov, ako boli zistené in vitro inhibícia tvorby kolónií tumorových buniek a ich selektívna deštrukcia (6). U Đudí má selén má dôležitú úlohu aj v duševnom zdraví. Súvisí to s narušením obratu niektorých neurotransmiterov poþas Se-deficiencie. Mozgové tkanivá sú chudobné na katalázu a preto produkty peroxidácie ako H2O2 a primárne peroxidy musia byĢ odstránené prevažne antioxidaþnými selenoenzýmami (7). Prieskum ústavu preventívnej a klinickej medicíny potvrdil, že patríme ku krajinám s nízkym stavom selénu. Štúdie potvrdzujú, že Đudia s nízkou hladinou selénu majú až trojnásobne vyššie riziko onkologických a kardiovaskulárnych ochorení. Odporúþané denné množstvá podĐa 159

WHO by mali byĢ 50 – 200 Tg. Optimálne množstvo je 100. Prieskum v SR ukázal, že u nás je to od 46 – 77 Tg/l. Nedostatoþný prívod Se hospodárskym zvieratám zapríþiĖuje vznik poþetných zdravotných porúch (nutriþná myodystrofia, exsudatívna diatéza a edémy hydiny a zdravotný stav mlieþnej žĐazy). V poslednej dobe sa dostala do popredia otázka výhodnosti suplementácie kĚmnych zmesí pre hospodárske zvieratá prípravkami s organickou formou Se, namiesto doposiaĐ užívaného seleniþitanu sodného. Prirodzené pozadie selénu tvorené Se-metionínom a Se-cysteínom bielkovín jednotlivých komponentov našich kĚmnych zmesí je na úrovni len cca 0,03 až 0,12 mg.kg-1 sušiny (skôr sa pohybuje v oblasti nižších hodnôt), þo by znamenalo jeho výraznú deficienciu so všetkými následnými zdravotnými problémami. Preto sú v súþasnosti kĚmne zmesi u nás dotované seleniþitanom sodným v množstve cca 0,2 mg Se na kg sušiny krmiva, þím sa dosahuje jeho takmer optimálny príjem. Základným rozdielom medzi anorganickými a organickými zlúþeninami Se je schopnosĢ z þreva resorbovaného selenometionínu, ktorý pri nadbytku Se nie je použitý na syntézu selenoproteínov, zabudovaĢ sa do bielkovín svalov, peþene, erytrocytov a podobne. Nahrádza tu obyþajný metionín, ktorý obsahuje v molekule síru, kećže tRNAMet ich nevie odlíšiĢ. Tým sa vytvára metabolická rezerva pre budúce prípadné stresy, ochorenia a tiež pre prenos Se cez selenometionín na mláćatá v reprodukþných procesoch. Zdravotný stav mlieþnej žĐazy charakterizuje poþet somatických buniek (PSB). Normálny PSB v mlieku sa pohybuje okolo 100 x 103/ml. Za normálnej situácie sú v mlieku bunky (epiteliálne bunky a krvné bunky, t.j. leukocyty a lymfocyty) podliehajúce prirodzenému odbúravaniu a ich náhrade. Keć na mlieþnu žĐazu pôsobia škodlivé vplyvy, ako chovateĐské podmienky, chyby v dojení, infekcia rôznymi pôvodcami poprípade výživa, dochádza k zvýšenému prívodu týchto buniek a ich poþet v mlieku sa silne zvyšuje. Vtedy PSB funguje ako kritérium poškodenia a obrannej reakcie mlieþnej žĐazy. PodĐa STN 57 0529 (8) je rozhodujúcou hranicou 400 000 SB v 1 ml surového mlieka. V experimentálnej þasti príspevku popisujeme výsledky nášho výskumu, ktoré ukazujú, že prídavok organicky viazaného selénu do kĚmnej dávky zlepšuje zdravotný stav vemien dojníc a výrazne zvyšuje aj obsah selénu v mlieku. Materiál a metódy CieĐom pokusu bolo zistiĢ, þi pri prídavku organického selénu do kĚmnej dávky dôjde k zníženiu poþtu somatických buniek v mlieku dojníc. Vlastný pokus sme zorganizovali v poĐnohospodárskom podniku s priemerným stavom 270 dojníc holštajnského plemena s priemernou dojivosĢou 7540 kg na dojnicu. KĚmna dávka pre dojnice s dennou dojivosĢou 30 l bola zostavená podĐa požiadaviek správnej výživy dojníc, zodpovedala požiadavkám normy potreby živín pre danú kategóriu zvierat s uvedenou dojivosĢou a bola doplnená nasledovným obsahom selénu: - Se pokusná skupina 6,0 mg - Se kontrolná skupina 2,2 mg Selén vo forme Selplex Se (od firmy Alltech,Inc.) bol daný do premixu podĐa odporuþenia UKSÚP. Do premixu, ktorý dodala firma Biofaktory. Selén bol v množstve 0,2 ppm v 1 kg kĚmnej zmesi v organickej forme ako Selenomethionin a Selenocystein. KĚmilo sa krmným vozom a kravy zožrali krmivo bezo zvyšku. KĚmna zmes obohatená selénom bola podávaná skupine dojníc po otelení, teda vysokoprodukþným dojniciam. Vzorky mlieka pre zistenie PSB sme odoberali od 44 dojníc ako kontrolná vzorka pred skrmovaním Se a potom 1., 2., 3., 5., 8. týždeĖ vždy od tých istých zvierat. Ako kontrolné vzorky pre zistenie fyziologického poklesu PSB v priebehu laktácie sme odobrali individuálne vzorky mlieka od 40 dojníc v rovnakom þase po otelení. Prvý odber bol týždeĖ po otelení, potom po 8 týždĖoch. Vzorky mlieka na stanovenie obsahu Se v mlieku sme odobrali od 10 dojníc pred podávaním Selplexu Se a potom v 3. a 8. týždni.

160

Výsledky a diskusia TabuĐka I dokumentuje PSB pri skupine dojníc pred zaþatím pokusu so skrmovaním Se a v priebehu pokusu. Pred pokusom bol priemerný PSB 249,7 x 103/ml. Pri vlastnom pokuse sme zaznamenali znižovanie PSB od 1. týždĖa po 8. týždeĖ pokusu z priemerných 229,3 x 103/ml po 174,5 x 103/ml. Vo všetkých sledovaných týždĖoch bol pokles PSB oproti predpokusnému stavu vysoko preukazný (P<0,001). Celkový pokles PSB (obr. 1) bol o 30,13 %. TabuĐka I Poþet somatických buniek (PSB) v mlieku dojníc pred a po skrmovaní organického Se v kĚmnej dávke (tis./ml). n dojníc=44 Pred Se (0) 1. týždeĖ 2. týždeĖ 3. týždeĖ 5. týždeĖ 8. týždeĖ PSB priemer 249,7 229,3 211,0 202,0 184,4 174,5 Št. odchýlka 119,7 104,7 98,2 96,3 86,5 85,0 Max 529 432 405 503 418 399 Min 31 61 60 43 39 56 Párový t-test (P) vo vzĢahu 0,012 8,7E-05 0,001 9,31E-05 7,51E-06 k týždĖu 0 ++ VýznamnosĢ +++ +++ +++ +++

PSB (tis/ml)

400,0 300,0 200,0 R2 = 0,991

100,0 0,0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

týždne skrmovania organického Se (Sel-Plex) dojniciam

Obr. 1. Poþet somatických buniek v mlieku v priebehu pokusu. Je všeobecne známe, že pokles PSB závisí od þasu po otelení, þím dlhší þas, tým väþší pokles PSB. Preto sme vybrali druhú skupinu dojníc v danom stáde v rovnakom þase po otelení, kde nebol skrmovaný Se a výsledky sme porovnali. PodĐa záznamov v tabuĐke II vidíme, že dojnice v 1. týždni mali PSB 243,2 x 103/ml a po 8. týždĖoch 224,8 x 103/ml. Tento pokles bol síce štatisticky preukazný (P<0,05), ale bol len 7,57 %. TabuĐka II PSB v mlieku dojníc bez pridania Se do kĚmnej dávky (tis/ml). n dojníc=40 1k.týždeĖ 8k.týždeĖ PSB priemer 243,2 224,8 Št. odchýlka 109,0 99,1 Max 523 497 Min 53 56 Predmet porovnania 0 – 1k 1k – 8k+ 8 – 8k++ T-test (P) 0,828 0,043 0,006 VýznamnosĢ + ++

161

Preto, až po potvrdení uvedených pozorovaní, sme si dovolili konštatovaĢ, že pokles PSB pri skrmovaní organického selénu bol spôsobený práve týmto prvkom. V pokusnej aj kontrolnej skupine sme sledovali aj výskyt mastitíd. V skupine so selénom sme pre ochorenie mlieþnej žĐazy museli vyradiĢ 4 dojnice. V kontrolnej skupine to však bolo až 9 dojníc. I v tomto prípade sa podávanie organického Se prejavilo lepším zdravotným stavom dojníc. V neposlednom rade sme našim experimentom chceli overiĢ, þi skutoþne dochádza aj k zvýšeniu obsahu Se v mlieku. V tabuĐke III uvádzame hodnoty obsahu selénu v mlieku pred jeho skrmovaním. Priemerná hodnota bola 0,048 mg/l. V 3. týždni podávania Se táto hodnota stúpla na 0,071 mg/l a v 8. týždni na 0,138 mg/l. Tento nárast predstavoval 48 % a 188 % oproti obsahu selénu v bežnom surovom kravskom mlieku (obr.2).

Se (mg/l)

TabuĐka III Množstvo Se v mlieku pred a po skrmovaní Se v kĚmnej dávke dojníc ( mg/l ). n dojníc=10 Pred Se (0) 3. týždeĖ 8. týždeĖ Se priemer 0,048 0,071 0,138 Št. odchýlka 0,026 0,027 0,036 Max 0,09 0,1 0,21 Min 0,01 0,02 0,08 Párový T-test (P) 0,011 7,78E-06 vo vzĢahu k týždĖu 0 VýznamnosĢ +++ +++ 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0

1

2

3

4

5

y = 0.0419e

0.1323x

6

7

8

týždne skrmovania organického Se (Sel-Plex) dojniciam

Obr. 2. Obsah Se v mlieku v priebehu pokusu. Úþinky Se sú podobné i v ćalších štúdiách (9; 10) a potvrdzujú naše poznatky o znižovaní PSB. Uvedené výsledky potvrdzujú aj zahraniþné pozorovania (5, 11); títo autori udávajú zvýšenie selénu v surovom kravskom mlieku 3 až 6 násobne. Zvýšenie obsahu selénu v mlieku dáva možnosĢ mliekarenským závodom uvažovaĢ o výrobe funkþnej potraviny – tzv. Selénové mlieko, prípadne mlieþnych výrobkov, ktoré by obsahovali nadštandardné množstvo selénu. Podobným produktom sú aj selénové vajíþka z Novogalu, ktoré sú modernou, tzv. funkþnou potravinou, vyrobenou pomocou špiþkových biotechnológií. Obsahujú nadštandardné množstvo selénu vo forme esenciálnej aminokyseliny selénometionínu, prírodnej a najlepšie biovyužiteĐnej formy tohto pre život nevyhnutného mikroprvku. Skonzumovanie len dvoch selénových vajíþok znamená prívod cca 55 Pg selénu, þo predstavuje viac ako 70 % denného príjmu (75 Pg/deĖ) tohto mikroprvku 162

Pri pôdach chudobných na selén v celej Strednej Európe, zabezpeþujú bežné potraviny na Slovensku len jeho veĐmi nízky príjem Đudskou populáciou (do 38 Pg denne), z þoho znaþná þasĢ nie je v metabolicky najvhodnejšej forme. Následkom deficientného príjmu selénu je zhoršený zdravotný stav našej populácie. Selén má prostredníctvom svojich špecifických selénoenzýmov nezastupiteĐnú funkciu pri antioxidaþnej ochrane organizmu pred voĐnými radikálmi, pri vývoji a udržiavaní prirodzenej imunity voþi rôznym ochoreniam, ako aj v správnych funkciách štítnej žĐazy a reprodukþných orgánov oboch pohlaví. Poþetné plošné štúdie v celom svete preukázali jeho významnú úlohu v prevencii srdcovocievnych ochorení a vzniku nádorov prostaty, prsníka, pĐúc a hrubého þreva. Selén sa podieĐa na udržiavaní duševného zdravia Đudí a tvorbou inertných zlúþenín s Ģažkými kovmi znižuje ich toxicitu. Zásahom do mechanizmov oxidaþného stresu má zvýšený príjem selénu pozitívny vplyv aj na zdravotný stav Đudí postihnutých reumatickými zápalmi kĎbov, astmou a zápalmi pankreasu. Záver Ukonþený experiment jednoznaþne ukázal, že skrmovanie organického selénu v množstve 0,2 ppm v kĚmnej zmesi znižuje dojniciam PSB v mlieku a zvyšuje obsah selénu v mlieku, þo by mohlo byĢ využité pre výrobu mlieka a mlieþnych výrobkov so zvýšeným obsahom organicky viazaného selénu. Funkþné potraviny sú najvhodnejším spôsobom ako priviesĢ potravinovým reĢazcom dostatoþné množstvo esenciálnych nutriþných látok vo vhodnej biovyužiteĐnej forme pre naše telo. Použitá literatúra: 1. KÖHRLE, J.:Selenium in biology: facts and medical perspectives. Biol. Chem., 381, 9-10, 2000, s. 849-864 2. ARNER, E. S., HOLMGREN, A.:Physiological function of thioredoxin reductase. Eur. j. Biochem., 267, 2000, s. 6102-6109 3. KVIýALA, J.: Status and selenium intake as related to the thyroid gland in the population. VnitĜ. Lék., 52, 1996, s. 738-742 4. RAYMAN, M.G.: The importance of selenium to human health. Lancet, 15, 356, 2000, s. 233241 5. EDENS, F.W.: Organic selenium : feathers to muscle integrity to drip loss. Five years onward : no more sodium selenite. In: Biotechnology in the Feed Industry, 13th Animal Sympozium, Nottingham Univ. Press, 1996, UK, p.165 6. SCHRAUZER, G.N.: Anticarcinogenic effects of selenium. Cell. Mol. Life Sci., 57, 2000, s. 588-590 7. CASTANO, A.: Low selenium diet increases the dopamine turnover in prefrontal cortex of the rat. Neurochem. Int., 30, 1997, s. 549-555 8. STN 57 0529 „Surové kravské mlieko pre mliekarenské ošetrenie a spracovnaie, 1999. 9. HEMKEN, R.A.: Effect of source and level of copper and zinc and selenium on growth and organ trace mineral levels in cow. J.Anim.Sci., 1998, 76, s. 2711-2718 10. WEIESS, W.P., HOGAN, J.S., TODHUNTER, D.A., SMITH, K.L.: Effect of vitamin E supplementation in diets with a low concentration of Selenium on mammary gland health of dairy cows. J.Dairy Sci., 1997, 80: 1728 11. ALLAWAY, W.H., MOORE, D.P., OLDFIELD, J.E., MUTH ,O.H.: Movement of physiological levels selenium from soil through plants to animals. J.Nutr., 1996, 98, s. 411-418 Kontaktná adresa: Ing. Vladimír Foltys, PhD., Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, [email protected]

163

VLIV DOTACE KRMNÉ DÁVKY DOJNIC CHRÁNċNÝMI ESENCIÁLNÍMI AMINOKYSELINAMI NA TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI MLÉKA. ýerný Vladimír1, TĜináctý JiĜí2, Havlíková Šárka1, Kvasniþková Eva1, Hadrová Sylvie2 1 Milcom a.s., Výzkumný ústav mlékárenský Praha, pracovištČ Tábor, 2 Výzkumný ústav pro chov skotu, pracovištČ PohoĜelice The influence of milk cow feeding ration with protected essential amino acids on the technological properties of milk. Summary: Four lactating Holstein cows with ruminal and duodenal cannulas were used to examine the effect of added purified soya protein enriched by the amino acids lysine, methionin (experiment 1) and leucin (experiment 2) on the technological properties and composition of milk. Amino acids were fed in the form of rumenprotected tablets or in the powdered form. The most positive effect on the monitored technological parameters had the application of tablets containing the amino acids combination (lysine and methionin) under the experimental condition. Effect of protected amino acid leucin was lower than effect of amino acids methionin and leucin.

Ve dvou pokusech, každý provedený na þtyĜech laktujících holštýnských dojnicích, byl sledován vliv doplĖku AK lysinu, methioninu a kombinace AK lysinu a methioninu (pokus 1) a dále AK leucinu (pokus 2), podávaného ve formČ ruminálnČ chránČných tablet do krmné dávky dojnic, na technologické vlastnosti a složení mléka. Do každého pokusu byly zaĜazeny 4 dojnice holštýnského typu se srovnatelnou užitkovostí. Dojnice byly individuálnČ ustájeny ve vazných stáních. Každý pokus byl rozdČlen do 4 period v délce 14 dní (každá perioda se skládala z 10 dnĤ pĜípravného období a 4 dnĤ experimentálního období). Krávy byly krmené individuálnČ dvakrát dennČ (v 7.00 a v 16.35 hod) ad libitum KD založenou na kukuĜiþné siláži, vojtČškové senáži a doplĖkové smČsi. Krmné dávky byly sestaveny tak, aby byla vyrovnaná energetická a bílkovinná potĜeba1 i požadavek na zastoupení aminokyselin2. Aminokyseliny byly podávány ve formČ ruminálnČ chránČných tablet. Tablety byly aplikovány po celou periodu bezprostĜednČ pĜed krmením a to zamícháním do doplĖkové krmné smČsi dojnic. BČhem experimentálního období každé periody byla zaznamenána užitkovost dojnic a z každého dojení byly odebrány vzorky mléka k analýzám. Z každého experimentálního období (1x v každé periodČ) bylo odebráno cca 12 l mléka pro stanovení technologických parametrĤ a mikrobiologický rozbor mléka. Vzorky mléka byly bezprostĜednČ po nadojení vychlazeny na teplotu cca 4 – 6 °C a pĜevezeny na pracovištČ VÚM v TáboĜe, kde byly následnČ uloženy v chladírnČ pĜi teplotČ cca 8°C a druhý den ráno zapoþaly rozbory mléka. Každý vzorek mléka byl rozdČlen na 3 þásti : 1. dovezené mléko – je použito pro mikrobiologické rozbory a základní charakteristiku vzorkĤ mléka, 2. odstĜedČné mléko - þást mléka je zbavena tuku odstĜedČním. Toto mléko je po úpravČ jeho titraþní kyselosti na standardní hodnotu použito k hodnocení dalších vlastností syrového mléka. Tento postup umožĖuje eliminaci vlivu obsahu tuku v mléce i jeho rozdílné kyselosti na mČĜení základních technologických parametrĤ mléka. 3. odstĜedČné pasterované mléko - þást mléka upraveného dle bodu 2 byla podrobena šetrné pasteraci pĜi teplotČ 65 °C po dobu 30 minut a jeho úprava i analytické, mikrobiologické a technologické zkoušky jsou opakovány. UspoĜádání pokusu 1 Pokus 1 byl uspoĜádán ve formČ latinského þtverce 4x4 se þtyĜmi úrovnČmi faktoru – kontrola, lysin, methionin, methionin + lysin (Met + Lys). V první periodČ dostávala dojnice þ. 1 kontrolní KD, dojnice þ. 2 lysin, dojnice þ. 3 methionin, dojnice þ. 4 Met+Lys. V každé další periodČ docházelo k rotaci dojnic takovým zpĤsobem, aby se na každé dojnici vyskytly všechny úrovnČ faktoru. 164

UspoĜádání pokusu 2 Pokus 2 byl uspoĜádán ve formČ „cross-over“ designu se dvČma úrovnČmi faktoru (kontrola a leucin) ve þtyĜech periodách. V první periodČ dojnice þ. 1 a 3 – kontrola, dojnice þ. 2 a 4 – leucin. V každé další periodČ docházelo k rotaci dojnic takovým zpĤsobem, aby se na každé dojnici vyskytly obČ úrovnČ faktoru. Analytické metody : Stanovení aktivní kyselosti pH metrem Stanovení titraþní kyselosti – roztokem NaOH o c(NaOH) 0,25 mol/l Stanovení obsahu sušiny mléka vážkovou metodou Stanovení tuku butyrometricky Stanovení tukuprosté sušiny výpoþtem Stanovení obsahu celkového dusíku (TN) v mléce Kjeldahlovou metodou Stanovení obsahu nekaseinového dusíku (NCN) v mléce Kjeldahlovou metodou po srážení pĜi pH 4,6 – vyjádĜeno v procentech z celkového dusíku Stanovení obsahu kazeinu výpoþtem jako rozdíl TN – NCN Stanovení obsahu vápníku v mléce komplexometricky Stanovení obsahu nČkterých nízkých organických kyselin v mléce isotachoforeticky na kapilárním isotachoforetickém analyzátoru ZKI 01(Villa Labeco, Spišská Nová Ves) Testy technologické: Kvasná zkouška dle ýSN 56 0101 Stanovení kysací schopnosti mléka - zjišĢuje se kyselost mléka dosažená zaoþkováním mléka. 1 % smetanové kultury a kultivací po dobu 4 hodin pĜi 30°C. PĜed pĜídavkem smetanové kultury se provede inaktivace mléka rychlým záhĜevem na 85°C s výdrží 5 minut a vychlazení na 30°C. Kontrola aktivity zákysu se stanoví soubČžnou zkouškou za použití obnoveného mléka prostého inhibiþních látek. Minimální hodnota titraþní kyselosti dle SH je pro mléko s dobrou kysací schopností 10 ml NaOH/100 ml c(NaOH) 0,25 mol/l. Stanovení syĜitelnosti mléka - zjišĢuje se þas potĜebný ke koagulaci mléka (k okamžiku prvního srážení mléka) pĜi teplotČ 32°C po pĜídavku 1% roztoku syĜidla o koagulaþní aktivitČ 1:1000. Doba potĜebná ke sražení dobrého syrového mléka je 5 - 7 minut. Stanovení prĤbČhu koagulace mléka a vytužování sýĜeniny na pĜístroji MKM-1, který je obdobou pĜístroje Laktodynamograf. Tuhost sýĜeniny je urþena odporem, který je kladen kmitající membránČ a je vyjádĜen hodnotou síly. PrĤbČh koagulace je popsán þasem srážení /R/ a dobou od zasýĜení do dosažení tuhosti odpovídající nárĤstu tlaku o 10 Pa /k10/ a o 20 Pa /k20 / a je vyjádĜen hodnotami p1, p2, pc. SoubČžnČ je využíváno vyhodnocení celého prĤbČhu vytužování sýĜeniny po dobu prvních 60 minut od zasýĜení. Vyhodnocení této závislosti bylo pro názornost zpracováno do formy grafu. Mléko dovezené do VÚM i mléko po jeho úpravách pro vlastní rozbory bylo kontrolováno po mikrobiologické stránce tak, aby byl vylouþen potenciální vliv nČkterých skupin mikroorganismĤ na jeho chemické složení þi na technologické vlastnosti. Kvalita syrového mléka byla vyrovnaná bez významnČjších rozdílĤ a ani pĜi porovnání mikrobiologického složení mléka z pokusných a kontrolních nábČrĤ nebyly zjištČny výraznČjší rozdíly. Výsledky rozborĤ z pokusu 1 s chránČnými aminokyselinami Lysin a Methionin jsou shrnuty v tabulkách þ. Ia až Id, výsledky rozborĤ z pokusu 2 s chránČnou aminokyselinou leucin jsou shrnuty v tabulkách þ. IIa až IIc. Výsledky rozborĤ vztažených k jednotlivým dojnicím a oznaþených þísly od 1 do 4 jsou uvedeny v tabulkách þ. IIIa až IIIc a v obrázku þ.1 (dokumentuje vliv individuality dojnice na vytužování sýĜeniny) a obrázku þ.2 (dokumentuje vliv chránČných amikokyselin použitých v pokusu 1 na vytužování sýĜeniny). 165

I. Výsledky pokusu 1 – chránČná aminokyseliny LYS, MET a LYS+MET : Tabulka Ia Rozbory dovezeného mléka - prĤmČry podle typu krmení Typ tablet kontrola Methionin Lysin MET+LYS

°SH

pH

6,6 6,4 6,5 6,5

6,70 6,70 6,72 6,71

Tuk (%) 2,59 2,13 1,75 1,86

Sušina Ca CB (%) mg/100g (%) 9,12 126 3,02 9,09 125 3,05 9,16 127 3,27 9,16 120 3,12

NCN (%) 0,70 0,71 0,75 0,72

Kazein Citrát Fosfát (%) mg/100g mg/100g 2,32 181 222 2,34 173 216 2,53 174 224 2,40 178 217

Tabulka Ib Rozbory odstĜedČného mléka - prĤmČry podle typu krmení Typ tablet kontrola Methionin Lysin MET+LYS

R (s) 428 408 404 459

P10 (s) 648 616 595 653

P20 (s) 882 832 788 871

R+P10 R+Pc (s) (s) 1075 1958 1024 1857 998 1786 1112 1983

Pc (-) 1,02 1,12 0,93 0,89

P1 (-) 0,50 0,55 0,47 0,42

P2 (-) 0,52 0,56 0,47 0,47

SyĜitel. kysaþka (s) (SH) 416 17,1 399 17,0 395 16,9 430 17,3

Tabulka Ic Rozbory odstĜedČného pasterovaného mléka - prĤmČry podle typu krmení Typ tablet kontrola Methionin Lysin MET+LYS

R (s) 535 438 436 460

P10 (s) 931 720 666 714

P20 (s) 1412 1036 921 998

R+P10 R+Pc (s) (s) 1466 2878 1158 2194 1102 2023 1174 2172

Pc (-) 1,43 1,41 1,09 1,15

P1 (-) 0,69 0,66 0,52 0,55

P2 (-) 0,75 0,75 0,57 0,60

SyĜitel. kysaþka (s) (SH) 501 15,9 402 16,5 424 17,1 440 17,0

P1 (-) 36,2 18,9 12,2 30,4

P2 (-) 43,4 32,9 21,0 28,9

SyĜitel. kysaþka (s) (SH) 20,4 -7,0 0,7 -2,9 7,1 1,5 2,4 -1,6

Tabulka Id Prodloužení þasĤ a zmČna koeficientĤ vlivem pasterace (%) Typ tablet 1 kontrola 2 Methionin 3 Lysin 4 MET+Lys

R (s) 25,0 7,2 8,0 0,2

P10 (s) 43,7 16,9 12,1 9,4

P20 (s) 60,1 24,5 16,9 14,6

R+P10 R+Pc (s) (s) 36,3 47,0 13,0 18,2 10,4 13,3 5,6 9,5

Pc (-) 39,8 26,0 16,6 29,6

II. Výsledky pokusu 2 – chránČná aminokyselina LEUCIN : Tabulka IIa Rozbory dovezeného mléka - prĤmČry podle typu krmení krmeni typ Leucin n=8

prĤmČr RSD RSD % MIN MAX kontrola prĤmČr n=8 RSD RSD % MIN MAX

kyselost mléka °SH pH 6,13 6,75 0,71 0,10 11,65 1,47 5,40 6,61 7,30 6,91 6,21 6,73 0,56 0,04 9,01 0,66 5,40 6,68 7,10 6,83

Tuk Ca Citrát Fosfát kys. akt. % mg/100g mg/100g mg/100g °SH 3,09 117 168 219 14,8 0,59 9 30 34 1,9 19,19 8 18 16 12,9 2,40 106 116 187 11,6 4,20 132 215 281 17,8 3,49 118 172 207 15,1 0,93 6 21 25 1,9 26,70 5 12 12 12,8 2,15 106 135 173 12,2 5,00 124 201 238 17,4

166

Tabulka IIb Rozbory odstĜedČného mléka - prĤmČry podle typu krmení krmeni typ Leucin n=8


Sušina % 9,24 0,06 0,61 9,13 9,31 9,19 0,16 1,77 9,01 9,55

CB % 3,25 0,11 3,50 3,05 3,37 3,21 0,20 6,14 2,82 3,46

NCN % 0,80 0,03 3,22 0,74 0,83 0,79 0,04 5,28 0,70 0,85

Kazein SyĜitelnos Kys.akt. Pc % s °SH 2,45 408 15,5 0,84 0,10 98 1,8 0,07 4,10 24 11,5 8,25 2,26 318 13,2 0,76 2,55 589 18,6 0,95 2,42 427 15,5 0,87 0,21 73 2,4 0,15 8,51 17 15,6 17,57 2,01 294 13,1 0,64 2,61 539 19,2 1,13

P1 0,44 0,04 8,24 0,37 0,51 0,47 0,13 26,61 0,33 0,75

P2 0,40 0,07 17,03 0,32 0,53 0,40 0,08 19,32 0,31 0,52

P1 0,49 0,07 13,32 0,38 0,59 0,54 0,09 16,12 0,37 0,65

P2 0,50 0,09 18,02 0,42 0,66 0,56 0,12 22,35 0,41 0,78

Tabulka IIc Rozbory odstĜedČného pasterovaného mléka - prĤmČry podle typu krmení krmeni typ Leucin n=8


Sušina % 9,23 0,12 1,30 9,01 9,39 9,17 0,18 1,91 8,93 9,48

CB % 3,28 0,14 4,36 2,93 3,43 3,21 0,18 5,47 2,86 3,42

NCN % 0,76 0,03 3,37 0,71 0,80 0,76 0,03 4,48 0,69 0,82

Kazein SyĜitelnos Kys.akt. Pc % s °SH 2,52 434 15,6 0,99 0,12 114 1,5 0,14 4,88 26 9,9 13,81 2,21 340 13,8 0,81 2,65 723 18,4 1,23 2,45 455 16,0 1,10 0,18 66 1,4 0,17 7,25 14 8,5 15,68 2,10 362 13,8 0,78 2,60 604 18,2 1,35

III. Vyhodnocení rozborĤ provedených v pokusu 2 podle jednotlivých dojnic : Tabulka IIIa Rozbory dovezeného mléka - prĤmČry podle jednotlivých dojnic dojnice þíslo 1 2 3 4

kyselost mléka °SH pH 5,65 6,77 5,80 6,76 6,08 6,77 7,15 6,66

Tuk % 2,48 2,86 4,25 3,56

Ca Citrát Fosfát Kys.akt. mg/100g mg/100g mg/100g °SH 115 162 190 14,9 116 196 187 13,3 120 181 220 16,2 118 140 256 16,2

Tabulka IIIb Rozbory odstĜedČného mléka - prĤmČry podle jednotlivých dojnic dojnice þíslo 1 2 3 4

Sušina % 9,22 9,18 9,32 9,13

CB % 3,17 3,29 3,21 3,26

NCN % 0,78 0,80 0,81 0,79

Kazein SyĜitelnos Kys.akt. % s °SH 2,39 365 14,8 2,48 355 15,3 2,40 406 16,7 2,46 543 15,3

167

Pc 0,87 0,82 0,76 0,96

P1 0,50 0,47 0,39 0,45

P2 0,36 0,35 0,37 0,51

Tabulka IIIc Rozbory odstĜedČného pasterovaného mléka - prĤmČry podle jednotlivých dojnic dojnice þíslo 1 2 3 4

Sušina % 9,17 9,20 9,33 9,11

CB % 3,18 3,23 3,21 3,30

NCN % 0,76 0,76 0,77 0,75

Kazein SyĜitelnos Kys.akt. % s °SH 2,42 399 15,6 2,47 398 15,0 2,44 427 16,8 2,55 554 16,0

Pc 1,02 1,02 0,88 1,26

P1 0,56 0,52 0,42 0,55

P2 0,45 0,50 0,45 0,70

120

tuhost sýĜeniny (Pa)

100 80

P1 P2

60

P3 P4

40 20 0 0

1000

2000

3000

4000

þas (s)

Obr. þ.1 : vytužování sýĜeniny - pasterované odstĜedČné mléko od jednotlivých dojnic - kontrola

120 tu host sýĜeniny (Pa)

100 1 MET+LYS

80

2 kontrola

60

3 methionin

40

4 lysin

20 0 0

1000

2000

3000

4000

þas (s)

Obr. þ.2 : Vliv chránČných aminokyselin na vytužování sýĜeniny - pasterované odstĜedČné mléko, dojnice þ.4 168

Shrnutí výsledkĤ : PrĤmČrné hodnoty výsledkĤ rozborĤ mléka od 4 dojnic z pokusu 1 a prezentovaných v tabulkách þ. Ia-Id lze shrnout do tČchto bodĤ : - aplikace chránČných aminokyselin methioninu, lysinu a methioninu spoleþnČ s lysinem nemČla vliv na zmČny v titraþní a aktivní kyselosti mléka (P!0,05). Po podání tablet s lysinem byl patrný pozitivní vliv na nČkteré ze sledovaných technologických parametrĤ (tuk, sušina, celkový obsah N-látek, kaseinu, parametry popisující koagulaci mléka a vytužování vznikající sýĜeniny po zasýĜení odstĜedČného pasterovaného mléka). ZjištČné výsledky však nebyly statisticky prĤkazné (P!0,05). - nejmenší vliv pasterace mléka na zmČnu parametrĤ popisujících koagulaci mléka a vytužování vznikající sýĜeniny byl pĜi aplikaci tablet obsahujících lysin + methionin. - výsledky rozborĤ vztažené na jednotlivé dojnice potvrzují významný vliv individuality dojnice na sledované technologické parametry (obr.1 a 2) PrĤmČrné hodnoty výsledkĤ rozborĤ mléka od 4 dojnic z pokusu 2 a prezentovaných v tabulkách þ. IIa-IIc lze shrnout do tČchto bodĤ : 1. dovezená mléka od dojnic krmené KD s dotací tabletovaným leucinem mČla mírnČ nižší kyselost ( 0,08 °SH, 0,02 pH), kysací aktivitu (0,3 °SH) i hodnotu pĜírĤstku kysací aktivity vztažené ke kontrolnímu mČĜené na obnoveném mléce ( 0,8 °SH), výraznČ nižší obsah tuku (0,4 %) a mírnČ vyšší obsah fosfátu ( 12 mg/100g), 2. odstĜedČná mléka od dojnic krmené KD s dotací tabletovaným leucinem mČla mírnČ vyšší obsah tukuprosté sušiny (0,05 %), celkových bílkovin ( 0,04 %), nekazeinového dusíku (0,01 %), kazeinu (0,03 %), lepší syĜitelnost (19 s), i hodnoty Pc, P1 a P2 popisujících vytužování sýĜeniny. 3. Pasterovaná odstĜedČná mléka od dojnic krmené KD s dotací tabletovaným leucinem vykazují obdobnou charakteristiku jako mléka odstĜedČná a rozdíly jsou o nČco vyšší, 4. Vypoþítané hodnoty smČrodatné odchylky i rozdíly mezi maximální (MAX) a minimální (MIN) hodnotou pro jednotlivé analyty jsou vysoké a ukazují, že intervaly hodnot se u všech analytĤ pĜekrývají. Z toho je možno dovozovat, že zjištČné rozdíly je možno pro tento soubor dat považovat za statisticky nevýznamné a na souboru dat se projevují další vlivy, napĜ. individualita dojnice. Soubor výsledkĤ z pokusu 2 vztažený na individuální dojnice je uveden v tabulkách þ. IIIa – IIIc : 5. Takto zpracované výsledky ukazují na výrazný vliv individuální charakteristiky dojnic, který následnČ zpĤsobuje pĜi statistickém zpracování namČĜených dat velkou hodnotou smČrodatné odchylky a vysvČtlují i výrazné rozdíly mezi maximální a minimální namČĜenou hodnotou jednotlivých analytĤ. Tato skuteþnost se markantnČ projevuje napĜ. u tuþnosti mléka nebo syĜitelnosti ( rozdíl je 1,77 % resp. 188s ). 6. Tyto výsledky jsou i v souladu v výsledky získanými v pokusu 1 a prezentovaných na obrázcích þ.1 a þ.2. Použitá literatura: 1. Sommer A. et al., 1994. Nutrient Requirement and Tables of Nutritional Values of Feedstuffs for Ruminants. Editor Research Institute of Animal Nutrition PohoĜelice, 198 p. 2. Rulquin H., 2001. Acides aminés digestibles dans líntestin. INRA Prod. Anim. 14, 275-278 Práce vznikla za finanþní podpory grantu MZe NAZV 1B44037. Kontaktní adresa: Ing. Vladimír ýerný, MILCOM a.s., VÚM Praha, e-mail : v.cerny @vum-tabor.cz 169

OBSAH HYDROXYMETHYLFURFURALU A PěÍBUZNÝCH LÁTEK V MLÉCE Bartáková Klára, Borkovcová Ivana, Vorlová Lenka, Krþková Lucie, Chocholáþová Markéta Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Content of hydroxymethylfurfural and related compounds in milk Summary: In this study was determined content of hydroxymethylfurfural (HMF) and related compounds (furfural (F), methylfurfural (MF) and furylmethylcetone (FMC)) in ultra-high-temperature-treated (UHT) milk. The samples of milk were sorted according to fatness (fat-extracted milk – 8 samples, half-fat milk – 10 samples, whole milk – 4 samples). Furfural compounds content was determined using RP-HPLC with UV detection. HMF contents ranged from 21.2 to 66.8 Pg.(100 ml)-1, F contents ranged from 1.0 to 9.8 Pg.(100 ml)-1. No MF and FMC were detected in the analysed samples. It was found that fat content in milk did not influence neither HMF content nor F content.

Úvod Hydroxymethylfurfural (HMF) je cyklický aldehyd, který je uznávaným indikátorem kvality potravin z hlediska nadmČrné tepelné úpravy, skladování nebo i jejich falšování. Názory na jeho cytotoxické, genotoxické a karcinogenní úþinky doposud nejsou jednotné, ale jisté je, že pĜítomnost HMF zhoršuje organoleptické vlastnosti a nutriþní hodnotu potravin. PĜítomnost HMF v medu je dlouhodobČ známa a je podchycena jak v legislativČ národní, tak i mezinárodní. HMF je pĜítomen v celé ĜadČ dalších potravin, které obsahují sacharidy v kyselém prostĜedí anebo pĜi jejichž technologickém opracování probíhá Maillardova reakce. Koncentrace HMF v tČchto potravinách mĤže dosahovat významných hodnot. V mléce mĤže HMF vznikat dvČma cestami – z Amadoriho slouþenin, které jsou meziprodukty Maillardovy reakce, v pĜítomnosti aminoslouþenin nebo izomerizací laktózy. HMF je první furfuralová slouþenina vznikající v prĤbČhu Maillardovy reakce. V dalších krocích Maillardovy reakce mohou z HMF vznikat další látky, jako je furfural (F), methylfurfural (MF) a furylmethylketon (FMC). Materiál a metodika Materiál Analyzované vzorky UHT mléka byly zakoupeny na pĜelomu let 2006 a 2007 v tržní síti ýeské republiky a pĜedstavují rĤzné druhy mléka vyskytující se na pultech brnČnských obchodĤ, supermarketĤ a hypermarketĤ. VyšetĜená mléka byla rozdČlena podle tuþnosti do tĜí skupin (odtuþnČné – 8 vzorkĤ, polotuþné – 10 vzorkĤ, plnotuþné – 4 vzorky). Metodika Obsah HMF a jemu pĜíbuzných látek (furfuralu, methylfurfuralu a furylmethylketonu) byl stanoven pomocí metody HPLC, která byla zavedena na základČ již používané metody pro stanovení HMF v medu. PĜíprava vzorku byla provedena na základČ postupu uvedeného v publikaci autorĤ Ferrer et al. (2000)1 – 15 ml mléka bylo inkubováno s kyselinou šĢavelovou ve vroucí vodní lázni, poté byla pĜidána kyselina trichloroctová a smČs byla dvakrát tĜepána a odstĜećována. V získaném supernatantu byl HMF a jemu pĜíbuzné látky stanoven pomocí kapalinového chromatografu Breeze firmy Waters (USA), který byl složen z nČkolika modulĤ (717 plus Autosampler, 1525 Binary HPLC Pump a 2487 dual O Absorbance Detector). K separaci byla využita kolona ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 u 150 mm, 5 Pm), mobilní fází byla voda a methanol v pomČru 90:10 v izokratickém režimu za prĤtoku mobilní fáze 1,0 ml.min-1. Teplota na kolonČ byla 30 °C, objem nástĜiku 20 Pl. Detekce probČhla v UV oblasti pĜi vlnových délkách 285 nm pro hydroxymethylfurfural a furfural, 274 nm pro furylmethylketon a 293 nm pro methylfurfural. Statistické vyhodnocení bylo provedeno v programu Microsoft Excel 97.

170

Výsledky a diskuse Validaþní parametry HPLC metody NovČ zavedená HPLC metoda pro stanovení HMF a jemu pĜíbuzných látek v mléce byla nejprve validována, pĜiþemž byla stanovena mez detekce metody pro všechny þtyĜi látky 0,17 Pg.(100 ml)-1. Co se týþe opakovatelnosti metody - pĜi prĤmČrné hodnotČ HMF 80,25 Pg.(100 ml)-1 v zahĜátém vzorku mléka byla SD 4,69 Pg.(100 ml)-1 a RSD 5,8 % a pĜi prĤmČrné hodnotČ F 2,95 Pg.(100 ml)-1 v zahĜátém vzorku mléka byla SD 0,43 Pg.(100 ml)-1 a RSD 14,7 %. Obsah dalších dvou stanovovaných látek se pohyboval pod mezí detekce metody. Obsah HMF a pĜíbuzných látek v mléce ZjištČný obsah HMF a F v mléce je uveden v tabulce I a na obrázcích 1 a 2. Obsah dalších dvou stanovovaných látek (methylfurfural a furylmethylketon) se v analyzovaných vzorcích mléka pohyboval pod mezí detekce metody. Na obrázcích 3 a 4 jsou ukázky chromatogramĤ standardĤ všech þtyĜ stanovovaných látek a vzorku mléka. Z tabulky I je zĜejmé, že obsah HMF se v analyzovaných vzorcích mléka prĤmČrnČ pohyboval v hodnotách 34,9 r 11,8 μg.(100 ml)-1 a obsah F v hodnotách 2,4 r 1,8 μg.(100 ml)-1. ZjištČné množství HMF ĜádovČ odpovídá obsahu HMF ve španČlských vzorcích mléka (21,7 – 66,4 μg.(100 ml)-1) analyzovaných autory Ferrer et al. (2000)1. Tito autoĜi však v žádném vzorku mléka nedetekovali pĜítomnost furfuralu, methylfurfuralu ani furylmethylketonu. Z tabulky I a z obrázkĤ 1 a 2 je zĜejmé, že obsah tuku v mléce nemá vliv na množství HMF ani na množství F. ZĜejmČ jiné vlivy než tuþnost mohou ovlivĖovat tvorbu HMF a F v tepelnČ ošetĜeném mléce, protože analyzované vzorky mléka pocházely od rĤzných výrobcĤ z ýeské i Slovenské republiky. Jak je vidČt z obrázkĤ 1 a 2, ve dvou rĤzných vzorcích mléka o stejné tuþnosti se obsah HMF nebo F mĤže trojnásobnČ nebo i vícenásobnČ lišit. Tabulka I Obsah hydroxymethylfurfuralu (HMF) a furfuralu (F) v analyzovaných vzorcích mléka. mléko

HMF [μg.(100 ml)-1] smČrodatná prĤmČr odchylka

F [μg.(100 ml)-1] smČrodatná prĤmČr odchylka

odtuþnČné (n = 8)

32,2

13,9

2,1

1,1

polotuþné (n = 10)

37,8

11,2

2,8

2,4

plnotuþné (n = 4)

34,0

2,7

1,9

0,1

všechny vzorky (n = 22)

34,9

11,8

2,4

1,8

171

70 HMF [P g.(100 ml)-1]

60 50 40 30 20 10 0 odtuþnČné

polotuþné

plnotuþné

Obr. 1. Obsah hydroxymethylfurfuralu (HMF) v analyzovaných vzorcích mléka.

10 9 8 F [ g.(100 ml) -1]

7 6 5 4 3 2 1 0 odtuþnČné

polotuþné

plnotuþné

Obr. 2. Obsah furfuralu (F) v analyzovaných vzorcích mléka.

F - 6.001

0.030

0.025

0.517

0.005

FMC - 12.958

0.010

MF - 16.227

0.015

HMF - 4.824

AU

0.020

0.000 1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00 Minutes

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

Obr. 3. Ukázka chromatogramu standardĤ hydroxymethylfurfuralu (2.pík), furfuralu (3.pík), furylmethylketonu (4.pík) a methylfurfuralu (5.pík).

172

HMF - 4.797

0.010

0.50

0.008

0.40 AU

0.006

0.002

0.20

6.338

AU

F - 5.970

0.004

0.30

0.000 4.20

HMF - 4.773

0.300

3.869

0.10

4.40

4.60

4.80

5.00

5.20

5.40

5.60

5.80

6.00 Minutes

6.20

6.40

6.60

6.80

7.00

7.20

7.40

7.60

0.00 1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00 Minutes

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

Obr. 4. Ukázka chromatogramu vzorku mléka – poslední pík je HMF (menší obrázek je zvČtšená þást chromatogramu s viditelnými píky hydroxymethylfurfuralu (1.pík) a furfuralu (2.pík)).

HMF v mléce a v jiných potravinách Porovnáním zjištČného obsahu HMF v mléce s již dĜíve stanoveným obsahem HMF v medu a v ovocných a zeleninových výrobcích jsme zjistili, že pĜíjem HMF z mléka není nikterak vysoký. Obsah HMF v medu se mĤže pohybovat v závislosti na stáĜí medu v rozmezí 0 – 66,1 mg.kg-1, v ovocných sirupech a džusech byl zjištČn obsah HMF v rozmezí 0 – 27,3 mg.kg-1, v džemech 4,5 – 159,6 mg.kg-1 a v keþupech 0,8 – 189,8 mg.kg-1. Tato množství HMF jsou ve vČtšinČ pĜípadĤ vyšší než koncentrace HMF zjištČná v UHT mléce (0,212 – 0,668 mg.l-1)2,3. HMF a zdravotní riziko? I když je HMF považován za potenciální karcinogen, bylo zjištČno, že pĜi obvyklé denní dávce kolem 1 mg.kg-1 tČlesné hmotnosti nehrozí pro þlovČka nebezpeþí. Škodlivý efekt nebyl pozorován až do dávky 80 mg.kg-1 tČlesné hmotnosti4. Z této informace je zĜejmé, že pĜi bČžném tepelném opracování potravin, u kterých to technologický proces vyžaduje, se z hlediska obsahu HMF není tĜeba obávat zdravotního rizika. Proto není nutné uvažovat o legislativním ošetĜení obsahu HMF v potravinách, u kterých se pĜedpokládá vznik HMF v dĤsledku technologického procesu. Zcela jinak je tomu však u medu, kde jakékoliv tepelné ošetĜení není žádoucí, ba naopak každé zahĜátí snižuje nutriþní hodnotu medu. Proto v legislativČ týkající se medu je zakotvena limitní hodnota pro obsah HMF (40 mg.kg-1) jako indikátor nežádoucího tepelného ošetĜení a jiných zpĤsobĤ porušení medu5. ZávČr Tato studie byla pilotní ve stanovení obsahu HMF a jemu pĜíbuzných látek v mléce vyskytujícím se v tržní síti ýeské republiky. Cílem bylo zjistit, v jakých hladinách se HMF a zároveĖ jemu pĜíbuzné látky v þeském mléce nacházejí a z toho vyplývající pĜípadné riziko pro zdraví þlovČka. Bylo zjištČno, že pĜíjem HMF z mléka není nikterak vysoký, protože v jiných druzích potravin se HMF pohybuje v hodnotách i o nČkolik ĜádĤ vyšších. Práce byla financována z prostĜedkĤ Výzkumného zámČru „Veterinární aspekty bezpeþnosti a kvality potravin“ MSM6215712402. Použitá literatura: 1. FERRER, E., ALEGRÍA, A., COURTOIS, G., FARRÉ, R. High-performance liquid chromatographic determination of Maillard compounds in store-brand and name-brand ultra-hightemperature-treated cows´ milk. Journal of Chromatography A, 2000, Vol. 881, p. 599-606. 173

2. KALÁBOVÁ, K., VORLOVÁ, L., BORKOVCOVÁ, I., SMUTNÁ, M., VEýEREK, V. Hydroxymethylfurfural in Czech honeys. Czech Journal of Animal Science, 2003, Vol. 48, p. 551-557. 3. VORLOVÁ, L., BORKOVCOVÁ, I., KALÁBOVÁ, K., VEýEREK, V. Hydroxymethylfurfural contents in foodstuffs determined by HPLC method. Journal of Food and Nutrition Research, 2006, Vol. 45, p. 34-38. 4. POTRAVINÁěSKÉ AKTUALITY – výživa, trendy v potravináĜství, legislativa. Ústav zemČdČlských a potravináĜských informací Praha, 2001, No. 0/2001, p. 11. 5. VYHLÁŠKA þ. 76/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro pĜírodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a smČsi kakaa s cukrem, þokoládu a þokoládové bonbony. Sbírka zákonĤ, 2003, þástka 32, s. 2470-2487. Kontaktní adresa: Ing. Klára Bartáková, Ph.D.; Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno [email protected]

174

HPLC ANALÝZA SACHARIDOV A ORGANICKÝCH KYSELÍN V MLIEýNYCH PRODUKTOCH Greifová Mária, Greif Gabriel, Krajþová Eva, Karoviþová Jolana, Schmidt Štefan Ústav biotechnológie a potravinárstva FCHPT-STU v Bratislave, Slovenská republika HPLC estimation of saccharides and organic acids in milk products Summary: A new HPLC method was issued by AOAC and accepted by IDF for estimattion of saccharides (galactose, glucose, lactose) and organic acids (lactic, acetic) in milk products. We estimated lactose, galactose and lactic acid by this method using ionex column in H+ cycle and RI detector. Estimation of lactose and other sugars has a great importance from both the methodic and nutritional points of view.

Laktóza je najvýznamnejší sacharid mlieka. Skladá sa z ȕ-D-galaktopyranózy a ȕ-D-glukopyranózy, ktoré sú spojené ȕ(1-4) glykozidovou väzbou. HO HO

CH2

CH2

O O

OH

4 1

OH

E

O

OH

OH OH

OH

Obr. 1. Laktóza Laktóza sa syntetizuje v bunkách mlieþnych žliaz cicavcov a je nevyhnutná vo výžive mladých jedincov. Je Đahko stráviteĐná a zároveĖ je vhodným zdrojom energie. Mlieþny cukor, oproti ostatným sacharidom z rastlinných surovín ( sacharóza – repný alebo trstinový cukor, glukóza – dextróza), má niektoré odlišné fyzikálne i fyziologické vlastnosti. Laktóza má výrazne nižšiu sladivosĢ než sacharóza alebo glukóza. Vysoká sladivosĢ rastlinných sacharidov sa javí v porovnaní s laktózou ako negatívna vlastnosĢ. Laktóza má osobitnú úlohu v rannom období mláćaĢa ako zdroj glukózy a galaktózy. Samotná glukóza predstavuje veĐmi dôležitú zložku krvi a zároveĖ slúži aj ako stavebná zložka glykogénu. Galaktóza je nepostrádateĐná najmä pri formovaní nervových tkanív a pozitívne ovplyvĖuje reguláciu telesnej teploty a reguláciu pohybu þriev. Okrem toho priaznivo vplýva na absorpciu a využitie vápnika v tele, þo má význam pri raste kostí. V závislosti od živoþíšneho druhu je koncentrácia laktózy v mlieku 0-7%. Laktóza v neposlednom rade je zdrojom uhlíka pre kyslomlieþne baktérie v procese mliekarenskej technológie[1, 2]. CieĐ práce Pomocou HPLC metódy stanoviĢ sacharidy (galaktóza, glukóza, laktóza) a organické kyseliny (hlavne k. mlieþna) v rôznych mlieþnych výrobkoch. Metóda zahĚĖa stanovenie sacharidov a organických kyselín na ionexovej kolóne v H+ cykle pri použití RI detektora. Materiál a metóda Zoznam testovaných výrobkov je uvedený v tabuĐke I. Výrobky boli zakúpené na tuzemskom trhu a boli testované pred vypršaním expiraþnej doby.

175

TabuĐka I Zoznam testovaných výrobkov ýíslo vzorky Názov vzorky 1 acidko 2 jugurt probio biely 3 zakysanka 4 Bryndza zimná balená 5 bryndza zimná vážená 6 mini Monika natierka 7 Eidamská tehla 8 Parenica údená 9 Paladin Edelp 10 nátierka 11 kidiboo – tavený syr 12 tavený syr bryndzauer 13 encián 14 syrové nite slané údené 15 vrchár 16 eidam tehla 17 domáci þerstvý syr (kravský) 18 syrové slané nite 19 mlieko polotuþné Úprava vzorky: Naváži sa 30 g zhomogenizovanej vzorky, extrahuje 30 ml deionizovanej vody (30 min) a vyþíri sa 5 ml roztoku Carrez I a 5 ml roztoku Carrez II. Po premiešaní sa obsah odmernej banky doplní do 100 ml deionizovanou vodou. Po 5 min. státia sa obsah banky prefiltruje cez skladaný filter. Pred dávkovaním na kolónu sa filtrát ešte raz prefiltruje cez mikrofilter (0,22 Pm). Podmienky HPLC metódy [3] Vysokotlaková pumpa DeltaChromTM SDS 030; Dávkovaþ: LCI 30, dávkovacia sluþka 20 Pl Kolóna: Polymer IEX H+ cyklus 300 x 8 mm DeltaChrom TM Temperature Control Unit (40 ± 0,1 °C) Mobilná fáza: 9 mM H2SO4; Prietok mobilnej fázy: 1 cm3. min-1; Detektor: K-2301 KNAUER

176

Výsledky Obsah sacharidov a kyseliny mlieþnej vo vybraných mlieþnych výrobkoch zakúpených v obchodnej sieti je uvedený v tabuĐke II. TabuĐka II Obsah sacharidov a kyseliny mlieþnej vo vybraných mlieþnych výrobkoch. vzorka

n

Obsah laktózy

1. acidko 2. jugurt probio biely 3. zakysanka 4. bryndza zimná balená 5. bryndza zimná važená 6. Monika – nátierka 7. eidamská tehla 8. parenica údená 9. paladin Edelp 10. nátierka 11. tavený syr kidiboo 12. tavený syr bryndzauer 13. encián 14. syrové nite slané údené 15. vrchár 16. eidam tehla 17. domáci þerstvý syr (kravský) 18. syrové slané nite 19. mlieko polotuþné ND – nedetekovateĐné množstvo

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

3,19-3,35 2,44-2,62 2,92-3,12 0,39-0,42 0,45-0,49 2,98-3,25 0,19-0,21 0,12-0,18 0,37-0,41 4,44-4,67 2,15-2,35 1,33-1,46 ND 0,65-0,73 0,17-0,20 0,22-0,32 2,51-2,57 0,27-0,32 4,18-4,25

Obsah galaktózy (g/100g) 0,04-0,06 0,78-0,86 0,03-0,05 0,13-0,15 0,02-0,04 0,50-0,59 ND 0,07-0,1 0,15-0,19 0,49-0,52 0,03-0,05 0,04-0,06 ND 0,05-0,07 ND ND ND ND ND

Obsah kys. mlieþnej 0,71-0,78 0,91-0,98 0,66-0,73 1,35-1,41 1,28-1,33 0,56-0,64 0,75-0,83 1,19-1,29 1,06-1,13 0,76-0,85 0,43-0,47 0,86-0,95 0,05-0,07 0,71-0,79 1,33-1,42 1,04-1,09 0,01-0,04 1,59-1,66 ND

Diskusia V práci boli uvedenou metódou analyzované rôzne vzorky mlieþnych výrobkov na obsah sacharidov a kyseliny mlieþnej. Chromatografický záznam štandardov je uvedený na obr. 2 a vzorky „zakysanka“ na obr. 3. Stanovenie laktózy a ćalších cukrov v týchto výrobkoch má veĐký význam z metodického aj z výživového hĐadiska. Laktóza sa odlišuje od rastlinných sacharidov (sacharózy, glukózy, fruktózy, maltodextrinu, škrobu) tiež tým, že k jej tráveniu dochádza až v þrevách. Trávenie rastlinných sacharidov zaþína už v ústnej dutine po zmiešaní potravy so slinami. Tu môžu byĢ potravou pre baktérie, ktoré sa v nej vyskytujú. Môžu podporovaĢ ich množenie a tým podporovaĢ vznik zubného kazu. Iná situácia je pri trávení laktózy. Laktóza prechádza ústnou dutinou, žalúdkom a až v þrevách, kde sa nachádzajú baktérie produkujúce príslušný enzým - laktázu, dochádza k rozkladu laktózy na základné zložky ( glukózu a galaktózu) a ich vstrebávanie. Existuje však skupina Đudí, ktorá nie je vybavená týmto enzýmom. Hovoríme vtedy o intoleráncií (neznášanlivosti) laktózy. Nestrávená laktóza sa v hrubom þreve rozkladá za vzniku plynných substancií (metán, vodík) a štiepnych produktov (kyselina mravþia, kyselina octová, formaldehyd), ktoré pôsobia veĐmi dráždivo na sliznicu þreva. Intoleranciou laktózy trpí 70-90 % obyvateĐov Afriky, Ázie a Stredomoria. U európskej populácii je situácia omnoho priaznivejšia.

177

[mV] E:\CVIKO\STANDARD 1C

3

150

E:\cviko\Zm es Lak+KC+Glu+KP+KO

1

2

Voltage

100

4

50 5 7

6

0

-50 0

5

10

15

20

25

[min.]

Time

Obr. 2. Chromatogram štandardov: laktóza (1), kyselina citrónová (2), glukóza (3), galaktóza (4), kyselina mlieþna (5), kyselina octová (6), kyselina propiónová (7)

Obr. 3. Chromatografický záznam sacharidov: laktóza (Lak), galaktóza (Gal) a organických kyselín: kyselina citrónová (KC), kyselina mlieþna (KM) a kyselina octová (KO) vo vzorke zakýsanka

178

Len 10-15 % belochov sa musí vyhýbaĢ z tohto dôvodu konzumácii mlieka. Nedostatok enzýmu laktázy môže byĢ vrodený, ale môže byĢ aj dôsledkom niektorých ochorení, napr. gastroenteridíty alebo celiakie. U þasti dospelých jedincov klesá aktivita laktázy s vekom. S intoleranciou laktózy sa stretávame preto skôr u dospelých vo veku nad 25 rokov, ale postihuje aj dojþatá. Lieþba pozostáva z obmedzenia laktózy a povoĐujú sa iba kyslomlieþne výrobky. V týchto sa trávenie nezastavuje, ale spomaĐuje a pomáhajú k tomu prítomné baktérie. V zahraniþnej literatúre sa konštatuje, že obsah laktózy do 20 g/l nespôsobuje problémy. Preto je veĐmi dôležité vedieĢ stanoviĢ obsah laktózy vo finálnom výrobku.

Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/2392/05; VEGA 1/3546/06.

Literatúra 1. Cataldi T.R.I., Angelotti M., Bianco G.: Determination of mono- and disaccharides in milk and milk products by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Analytica Chimica Acta, 485, 43–49 (2003) 2. Ferreira I.M.P.L.V.O., Gomes A.M.P., Ferreira M.A.: Determination of sugars, and some other compounds in infant formulae, follow-up milks and human milk by HPLC-UV/RI. Carbohydrate Polymers, 37 225–229 (1998). 3. ISO/DIS 22662 | IDF 198, International Organization for Standardization and International Dairy Federation: Milk and milk products — Determination of lactose content by highperformance liquid chromatography (Reference method) 2005

Kontaktná adresa: Ing. Mária Greifová, PhD., FCHPT STUv Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovensko, e-mail: [email protected]

179

HODNOCENÍ FYZIKÁLNċ-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ SÝRģ S NÍZKODOHěÍVANOU SÝěENINOU POMOCÍ FT-NIR Draþková Michaela1, ěeĜuchová Mirka1, Hadra Luboš2, PĜidalová Hana1, Navrátilová Pavlína1, Janštová Bohumíra1, Vorlová Lenka1 1 Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2 Bioveta, a.s. Determination of physical and chemical properties in low scalded cheese by FT-NIR Summary: The aim of this study was to determine the physical and chemical properties (fat in solids, total solids and fat content, titratable acidity, water and NaCl content) of low scalded cheese by FT-NIR spectroscopy. A set of 100 samples Edam type of cheese were purchased in various grocery stores in the Czech Republic. The instrument was calibrated by partial least squares (PLS) method. Spectra were measured in the reflectance mode with a compressive cell between 10000 and 4000 cm-1, averaging 100 scans. The calibration models were developed and evaluated by statistical values. The best results were obtained for total solids: correlation coefficient R = 0.965 and standard error of calibration SEC = 0.774. A reliable calibration model for total solids, aw and NaCl content were developed. Good calibration levels were obtained for fat and fat in solids contents. Cross validation were pointed out the applicability of NIR spectrometer for the determination of basic components. FT-NIR presents thus a viable technique for rapid cheese analysis.

Úvod Spektroskopie v blízké infraþervené oblasti s Fourierovou transformací (FT-NIR) a statistické softwary zvyšují možnosti fyzikálnČ-chemické analýzy potravin a krmiv. Tato technika nahrazuje laboratorní a þasovČ nároþné konvenþní metody. Oproti tradiþním chemickým metodám nabízí NIR spektroskopie Ĝadu výhod. Jedná se o fyzikální, nedestruktivní metodu, kde pĜíprava vzorkĤ je minimalizována nebo zcela eliminována. Další výhody pĜedstavují úspora práce, þasu a materiálu, snadná obsluha a možnost mČĜení vzorkĤ i pĜes transparentní obaly. Jedno spektrum je použitelné ke kvalitativní analýze i kvantitativnímu stanovení více složek.1,2 NIR spektroskopie je široce používanou technikou pro stanovení fyzikálnČ-chemických parametrĤ sýrĤ. V souþasné dobČ má také znaþnou perspektivu pĜi kontrole výroby sýrĤ. Stanovením fyzikálnČ-chemických parametrĤ (tuk, bílkoviny, sušina atd.) v sýrech pomocí NIR spektroskopie se zabývala Ĝada autorĤ.3,4 Tato metoda byla použita také k sledování vlhkosti, pH a senzorických vlastností.5,6 Cílem práce bylo vytvoĜit kalibraþní modely pro stanovení fyzikálnČ-chemických parametrĤ sýrĤ s nízkodohĜívanou sýĜeninou pomocí FT-NIR spektroskopie. Materiál a metodika Vzorky sýrĤ (100 ks) s nízkodohĜívanou sýĜeninou (eidamského typu) pocházely z rĤzných prodejen z tržní sítČ ýeské republiky. Ve vzorcích byly stanoveny obsahy tuku v sušinČ, sušiny, tuku, titraþní kyselost (ýSN 570107, 1965)7 a obsah NaCl (ýSN 570107-þást 12, 1980)8. Aktivita vody byla stanovena pomocí aw-metru Thermoconstanter TH 200 (Novasina, Švýcarsko). Vzorky byly pĜed stanovením homogenizovány mletím. Vzorky sýrĤ byly promČĜeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. ýas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla mČĜena na integraþní sféĜe v režimu reflektance s kompresní kyvetou. NamČĜená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509 (Thermo Elektron Corporation, Madison, USA) metodou PLS (þásteþných nejmenších þtvercĤ). Stejné vzorky byly použity pro kĜížovou validaci. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Pro srovnání hodnot namČĜených pomocí FT-NIR s hodnotami zjištČnými v laboratoĜi byl použit párový T-test.9

180

Výsledky a diskuse U vzorkĤ byly stanoveny parametry: obsah tuku v sušinČ, sušiny, tuku, titraþní kyselost, aktivita vody a obsah NaCl. RozpČtí referenþních hodnot pro sledované parametry byly vyjádĜeny jako smČrodatné odchylky prĤmČru (tab. I.). Odlehlé standardy, u kterých byly nepĜesnČ stanoveny referenþní hodnoty nebo se objevila spektrální odchylka ve zmČĜeném spektru, byly odstĜedČny pomocí diagnostických nástrojĤ Spectrum Outlier a Leverage. Tabulka I Referenþní hodnoty x parametr n min max SD Tuk v sušinČ (%) 99 38,18 18,43 79,00 10,78 Sušina (%) 100 52,75 42,86 61,69 3,06 Tuk (%) 97 20,23 9,92 42,00 5,77 Titraþní kyselost (ºSH) 100 66,45 28,50 85,00 8,09 Aktivita vody 95 0,974 0,954 0,990 0,008 NaCl (%) 100 1,90 1,03 3,02 0,37 n – poþet vzorkĤ, x - prĤmČr, min a max – minimální a maximální hodnota, SD – smČrodatná odchylka Tabulka II Kalibraþní a validaþní výsledky parametr

n

PLS faktory

Tuk v sušinČ (%) Sušina (%) Tuk (%) Titraþní kyselost (ºSH) Aktivita vody NaCl (%)

81 95 84 74 67 86

4 10 5 5 9 10

kalibrace R

SEC

0,936 0,965 0,972 0,942 0,985 0,991

2,67 0,77 1,17 2,22 0,001 0,04

validace CCV (%) 7,23 1,46 6,06 3,26 0,12 2,02

R

SECV

0,915 0,950 0,951 0,742 0,735 0,906

3,05 0,92 1,54 4,48 0,005 0,12

PCV (%) 8,26 1,74 7,97 6,58 0,46 6,66

R – korelaþní koeficient, SEC – smČrodatná odchylka kalibrace, SECV – smČrodatná odchylka validace, CCV – kalibraþní variaþní koeficient, PCV – predikþní variaþní koeficient, n – poþet vzorkĤ po odstranČní odlehlých standardĤ

Kalibraþní modely pro všechny sledované parametry byly vytvoĜeny pomocí PLS algoritmu. PLS využívá u vyšetĜených vzorkĤ spektrální a souþasnČ koncentraþní informaci ke stanovení latentních promČnlivých (PLS faktorĤ) v souboru dat.5 U všech vytvoĜených kalibraþních modelĤ byl zvolen maximální poþet PLS faktorĤ 10. Nejvyšší poþty faktorĤ byly zjištČny pro sušinu a NaCl (10). Nejmenší poþet PLS faktorĤ (4) byl nalezen pro obsah tuku v sušinČ. Stejný poþet PLS faktorĤ získali také další autoĜi.10 Všechny kalibraþní modely byly získány na 1. derivaci s výjimkou sušiny, kde kalibraþní model byl vytvoĜen bez derivace spekter. Nejlepší kalibraþní modely byly vybrány na základČ korelaþních koeficientĤ (R) a standardních chyb kalibrace (SEC). Spolehlivost kalibraþních modelĤ byla ovČĜena metodou kĜížové validace.5 Korelaþní koeficienty kalibrace (R) byly pro jednotlivé parametry získány v rozmezí od 0,991 pro obsah NaCl do 0,936 pro obsah tuku v sušinČ se smČrodatnými odchylkami kalibrace (SEC) 0,04 % a 2,67 (%) (tab. II, grafy 1 a 4). Obdobné výsledky zjistili i jiní autoĜi10, kteĜí sledovali v sýrech obsah tuku, bílkovin a sušiny. Pro všechny sledované parametry zjistili korelaþní koeficienty v rozmezí 0,98 – 0,99 v závislosti na použité derivaci. K vytvoĜení kalibraþních modelĤ tito autoĜi použili metody PCA (principal component analysis) a modifikovanou metodu þásteþných nejmenších þtvercĤ (MPLS). 181

predikované hodnoty (%)

Pro vytvoĜení validaþních modelĤ byla použita stejná sada vzorkĤ jako pĜi kalibraci. KĜížovou validací byla ovČĜena spolehlivost kalibraþního modelu. Jedná se o pevnou závislost mezi hodnotami referenþními a hodnotami predikovanými (grafy. 1 - 4). PĜesnost validace byla posouzena na základČ korelaþních koeficientĤ validace (R) a standardních chyb validace (SECV).5 Korelaþní koeficienty validace (R) byly nalezeny v rozmezí 0,951 pro obsah tuku a 0,735 pro aktivitu vody se smČrodatnými odchylkami validace (SECV) 1,54 % a 0,005 (tab. II, graf 3). NIR reflektanþní techniku využili pro stanovení obsahu tuku a vlhkosti i další autoĜi6, kteĜí získali pro obsah sušiny korelaþní koeficienty kalibrace 0,990 - 0,998 a pro vlhkost 0,75 – 0,87. Pomocí NIR spektroskopie lze sledovat také senzorické vlastnosti sýrĤ. Reflektanþní a transmitanþní spektroskopie byla využita ke sledování senzorických vlastností sýrĤ, které byly kontaminovány mikroorganismy Cl. tyrobutyricum a propionibakteriemi.5 Na základČ posouzení hodnot parametrĤ kalibraþních variaþních koeficientĤ (CCV) a predikþních variaþních koeficientĤ (PCV) 11 byla posouzena spolehlivost kalibraþních modelĤ (tab. II). ZjištČné výsledky byly statisticky zhodnoceny pomocí programu STAT Plus.9 Mezi referenþními hodnotami a vypoþítanými hodnotami pomocí FT-NIR nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p = 0,05). 55

y = 0,8753x + 4,6052 R = 0,9356

50 45 40 35

y = 0,8566x + 5,3618 R = 0,9149

30 25 20 20

25

30

35

40

45

50

55

laboratorní hodnoty (%) kalibrace

cross validace

kalibrace

validace


Obr. 1. Kalibraþní a validaþní model pro tuk v sušinČ

y = 0,9305x + 3,6743 R = 0,9646

62 57 52

y = 0,9106x + 4,7252 R = 0,9497

47 42 42

44

46

48

50

52

54

56

58

60


cross validace

kalibrace

Obr. 2. Kalibraþní a validaþní model pro sušinu

182

validace

62


32

y = 0,9439x + 1,0824 R = 0,9715

28 24 20

y = 0,934x + 1,333 R = 0,9507

16 12 8 8

12

16

20

24

28

32


cross validace

kalibrace

validace


Obr. 3. Kalibraþní a validaþní model pro tuk

3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2

y = 0,982x + 0,034 R = 0,9915

y = 0,7481x + 0,4637 R = 0,9061

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0


cross validace

kalibrace

validace

Obr. 4. Kalibraþní a validaþní model pro NaCl

ZávČr Byly vytvoĜeny kalibraþní modely pro stanovení obsahu tuku v sušinČ, sušiny, tuku, titraþní kyselost, aktivitu vody a obsah NaCl. Výsledky byly posouzeny na základČ korelace mezi referenþními a vypoþtenými hodnotami z kalibraþních rovnic a na základČ smČrodatných odchylek kalibrace a validace (SEC, SECV). Nejlepší výsledky byly zjištČny pro obsah sušiny. Pro získání lepších výsledkĤ pro obsah NaCl by bylo dobré zaĜadit více vzorkĤ s vyšší koncentrací. KĜížová validace naznaþila možnost využití NIR spektrometru pro stanovení základních složek. FT-NIR tak pĜedstavuje vhodnou techniku pro rychlou analýzu fyzikálnČ-chemických parametrĤ sýrĤ s nízkodohĜívanou sýĜeninou. Práce vznikla za podpory výzkumného zámČru MSM6215712402 Veterinární aspekty bezpeþnosti a kvality potravin.

183

Použitá literatura: 1. BÜNING-PFAUE, H. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chem., 2003, vol. 82, no. 1, p. 107-115. 2. ýURDA, L., KUKAýKOVÁ, O., NOVOTNÁ, M. NIR spektroskopie a její využití pĜi analýze mléka a mléþných výrobkĤ. Chem. Listy, 2002, vol. 96, no. 5, p. 305-310. 3. WITTRUP, CH., NØRGARD, L. Rapid near infrared spectroscopic screening of chemical parameters in semi-hard cheese usiny chemometrics. J. Dairy Sci., 1998, vol. 81, no. 7, p. 1803-1809. 4. McQUEEN, DH., WILSON, R., KINNUNEN, A., JENSEN, EP. Comparison of two infrared spectroscopic methods for cheese analysis. Talanta, 1995, vol. 42, p. 2007-2015. 5. SØRENSEN, LK., JEPSEN, R. Assessment of sensory properties of cheese by near-infrared spectroscopy. Int. Dairy J., 1998, vol. 8, no. 10-11, p. 863-871. 6. McKENNA, D. Measuring moisture in cheese by near infrared absorption spectroscopy. 2001, vol. 84, no. 2, p. 623-628. 7. ýSN 570107. Metody zkoušení sýrĤ, tvarohĤ, krémĤ a pomazánek. Vydal ÚĜad pro normalizaci a mČĜení, Praha, 1965, s. 28. 8. ýSN 570107, þást 12. Metody zkoušení pĜírodních a tavených sýrĤ. Stanovení obsahu chloridu sodného. Vydal ÚĜad pro normalizaci a mČĜení, Praha, 1980, s.4. 9. MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská pĜíruþka, verse 1.01., 1992. Veterinary Research institute, Brno, CR., s. 168. 10. RODRIGUEZ-OTERO, JL., HERMIDA, M., CEPEDA, A. Determination of fat, protein, and total solids in cheese by near-infrared reflectance spectroscopy. J. AOAC Int., 1995, vol. 78, no. 3, p. 802-806. 11. ALBANELL, E. CÁCERES P., CAJA G., MOLINA E., GARGOURI A. Determination of fat, protein and total solids in ovine milk by near-infrared spectroscopy. J. AOAC Int., 1999, vol. 82, p. 753-758.

Kontaktní adresa: MVDr. Michaela Draþková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, 612 42 Brno, e-mail: [email protected]

184

VYUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE PěI SLEDOVÁNÍ PRģBċHU ZRÁNÍ EIDAMSKÝCH SÝRģ RģZNÝCH VÝROBCģ Králíková Marcela, Lužová TáĖa, Mlþek JiĜí, Šustová KvČtoslava Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ The use of NIR spectroscopy by monitoring rippening eidamcs cheeses from different producers Summary: Our objective was to determine range of usage NIR spectroscopy during monitoring of rippening eidam cheeses 4 different makers. For measuring were used eidam cheeses 45% fat form makers A, B, C, D. Samples were controled every month from 7 months at FT NIR Antaris in reflectance mode with number of scans 80, with resolution 4 with using a spinner. Every samle were measured 4times. For interpretetion was used average spectrum. The individual groups (clusters) were analyzed by discriminant analyse. With use discriminant analyse were differentiated all cheeses from 4 different producers after first month of rippening.

Úvod Díky své rychlosti a nedestruktivitČ se NIR spektroskopie stává stále více využívanou metodou pĜi rutinních analýzách v zemČdČlství, farmacii, zejména pak v potravináĜství. Blízká infraþervená spektroskopie je hojnČ využívána v mlékaĜství. FRANK a BIRTH se již v roce 1982 zabývali stanovením základních složek jako tuk, bílkoviny. DvČ rozdílné metody infraþervené spektroskopie pĜi analýze sýrĤ porovnával McQUEEN et al. (1995). KromČ stanovení základních majoritních složek se NIR spektroskopie zabývá i analýzou kvantitativní, pĜi které lze pomocí diskriminaþní analýzy rozlišit materiály do definovaných tĜíd (clusterĤ). Takto lze napĜíklad rozlišit rĤzné druhy sýrĤ. PILLONEL et al. se zjišĢoval schopnost NIR spektrometru rozlišit geografický pĤvod ementálského sýru (2003). V naší práci jsme se zabývali možností využití NIR spektroskopie pĜi rozlišování eidamských sýrĤ 4 rĤzných výrobcĤ a rovnČž schopností zachytit rozdíl u eidamských sýrĤ vyrobených s použitím dvou rĤzných startovacích kultur. Materiál a metody K analýze byly použity eidamské sýry 4 rĤzných výrobcĤ (A, B, C, D). Vzorky byly mČĜeny po dobu 7 mČsícĤ. Každý mČsíc byly analyzovány na pĜístroji FT NIR Antaris ve spektrálním rozsahu 4000 – 10000 cm-1 v režimu reflektance s rozlišením 4 a poþtem scanĤ 80. Každý vzorek sýru byl zmČĜen 4krát. Vyhodnoceno bylo prĤmČrné spektrum. K vyhodnocení spekter byla použita metoda diskriminaþní analýzy. Tato metoda rozliší spektra dle kvality. Urþí tĜídu, která je nejpodobnČjší posuzovanému spektru vzorku. Poþet tĜíd je roven poþtu porovnávaných vzorkĤ. Velké rozdíly mezi tĜídami mohou být patrné z pĜítomnosti diskriminaþního kĜíže. Diskriminaþní analýza byla použita pro porovnání všech þtyĜ výrobcĤ a rovnČž pro rozlišení dvou rĤzných startovacích kultur (YY, LL).

Výsledky Ke zjištČní možného rozdílu mezi 4 rĤznými výrobci eidamských sýrĤ A, B, C, D byly použity vzorky sýrĤ o 45% tuþnosti. Každý vzorek byl zmČĜen 4krát a k vytvoĜení kalibraþních modelĤ byla použita spektra prĤmČrná. Byla použita metoda diskriminaþní analýzy. Jednotlivé tĜídy popisují standardy, jež tvoĜí shluk kolem tČžištČ tĜídy (cluster). Na následujících obrázcích jsou zaznamenány rozdíly mezi jednotlivými výrobci A, B, C, D.

185

Obrázek I Rozlišení výrobce A (þtverec) a B (trojúhelník)

Obrázek II Rozlišení výrobce A (þtverec) a B (trojúhelník)

Obrázek III Rozlišení výrobcĤ A(þtverec) a D(trojúhelník)

186

Obrázek IV Rozlišení výrobcĤ D(þtverec) a C(trojúhelník)

Obrázek V Rozlišení výrobce B (þtverec) a D (trojúhelník)

Obrázek VI Rozlišení výrobce B (þtverec) a C (trojúhelník) Na obrázcích I-VI vidíme, že NIR spektroskopie dokázala rozlišit všechny výrobce 187

již po prvním mČsíci zrání sýrĤ. TémČĜ ve všech pĜípadech je pĜítomen diskriminaþní kĜíž. Pouze u výrobcĤ D x C se diskriminaþní kĜíž neobjevil, ale i tak je možno oba výrobce od sebe odlišit. Na obrázcích VII-VIII jsou uvedeny výsledky diskriminaþní analýzy, která byla zhotovena pro pĜípad dvou rĤzných startovacích kultur. BČhem sedmi mČsícĤ skladování nebyly zaznamenány diskriminaþní analýzou významné rozdíly mezi kulturami LL a YY.

Obrázek VII Startovací kultura YY (þtverec) a startovací kultura LL (trojúhelník) první mČsíc sledování

Obrázek VIII Startovací kultura YY (þtverec) a startovací kultura LL (trojúhelník) sedmý mČsíc sledování ZávČr V naší práci jsme se zabývali možností využití NIR spektroskopie pĜi sledování prĤbČhu zrání eidamských sýrĤ rĤzných výrobcĤ. Z výsledkĤ lze usuzovat, že je tato technika schopna rozlišit rĤzné výrobce eidamských sýrĤ stejné tuþnosti. Diskriminaþní analýzou se rozdíl mezi sýry výrobcĤ A, B, C, D potvrdil již po prvním mČsíci zrání. V pĜípadČ rozlišení rĤzných startovacích kultur pro výrobu eidamských sýrĤ se s použitím diskriminaþní analýzy nepodaĜilo dobĜe rozlišit kultury pĜi žádném mČĜení bČhem 7mi mČsíþního pokusu. Metodu lze používat pro odlišení rĤzných výrobcĤ eidamských sýrĤ v praxi pro její rychlost a nedestruktivitu.

188

Použitá literatura: 1. FRANK J. F., BIRTH G. S., 1982. Application of near infrared reflectance spectroscopy to cheese analysis, Jurnalo of Dairy Science 65: 1110-1116 2. McQUEEN D. H., WILSON R., KINNUNEN A., JENSEN E. P., 1995. Comparison of two infrared spectroscopic methods for cheese analysis, Talanta 42: 2007-2015 3. PILLONEL L., LUGINBU W., PICQUE D., SCHALLER E., TABACCHI R., BOSSET J. O., 2003. Analytical methods for the determination of geographic origin of Emmental cheese: Midand near-infrared spectroscopy, European Food Research and Technology 2: 174-178 Kontaktní adresa: Marcela Králíková, Ústav Technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, Brno 613 00, ýeská republika Tel: +420 545 133 362, email: [email protected]

189

VYUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE PěI ANALÝZE SUŠENÉHO MLÉKA RĤžiþková Jana1, Šustová KvČtoslava2 1 UTB ve ZlínČ, Fakulta technologická, Ústav potravináĜského inženýrství, Zlín 2 MZLU v BrnČ, Fakulta agronomická, Ústav technologie potravin, Brno Application of the FT NIR spectroscopy for analysis of milk powder Summary: The aim of this work was to examine the possibility of application of near-infrared spectroscopy for analysis of moisture content and titrable acidity of milk powder. The samples of milk powder and whey powder were mixed for increasing the scale of reference values. The mixed samples were measured by FT NIR Antaris at integrating sphere in Petri dish within reflectance mode in wavelengths ranging from 10 000 to 4 000 cm-1. Every sample of milk powder was measured three times and for calibration average spectrum was used. To develop the calibration model for examined components the partial lest squares (PLS) method was used and this model was validated by full cross validation. The highest correlation coefficients estimated were 0,993 of calibration and 0,990 of validation for titrable acidity of milk powder and 0,885 of calibration and 0,842 of validation for moisture content of milk powder. The results of this study prove the availability of NIR spectroscopy for a quick and non-destructive analysis of selected quantitative parameters of the milk powder.

NIR spektroskopie je metoda využívající blízké infraþervené oblasti spektra, která poskytuje širokou paletu aplikací v kontrole kvantitativních a kvalitativních ukazatelĤ potravináĜských surovin, meziproduktĤ i finálních výrobkĤ. Díky snadné obsluze, rychlosti analýz pĜi minimální spotĜebČ chemikálií a úpravách vzorkĤ si tato technika našla své místo v mlékárenském oboru. Blízká infraþervená spektroskopie se bČžnČ využívá pĜedevším pro stanovení hlavních základních složek (sušina, bílkoviny, tuk, laktóza) u syrového mléka10,11, fermentovaných mléþných výrobkĤ a sýrĤ6,4 a také rovnČž pro stanovení fyzikálnČ chemických ukazatelĤ u daných výrobkĤ9. Mezi další aplikace NIR v mlékárenském prĤmyslu je oblast výroby sušeného mléka, syrovátky a rĤzných mléþných smČsí ke stanovení základních jakostních ukazatelĤ (obsah tuku, bílkovin, laktózy) pomocí filtrových pĜístrojĤ1,7 þi jiných typĤ spektrometrĤ8. NIR spektrometrie je vhodná ke zjištČní složení originálního a lyofilizovaného sušeného mléka2, pĜípadnČ pĜi kontrole jakosti z hlediska možných pĜímČsí a neþistot v sušeném mléce5. Cílem naší práce bylo použití blízké infraþervené spektroskopie pĜi stanovování vybraných kvantitativních ukazatelĤ sušeného mléka – obsah vody, titraþní kyselost. Metodika K analýze byly použity vzorky odstĜedČného sušeného mléka a sušené syrovátky, byly dodány mlékárnou Olma, a. s., Olomouc a sušárnou mléka Brno, a.s. Vzorky sušeného mléka a sušené syrovátky byly míchány mezi sebou v rĤzných pomČrech pro zajištČní vČtšího rozsahu referenþních hodnot. Referenþní analýzy pro stanovení obsahu vody a titraþní kyselosti byly provedeny v laboratoĜi Ústavu technologie potravin MZLU v BrnČ. U sušených mléþných výrobkĤ se pro stanovení vlhkosti (obsahu vody) použila metoda dle ýSN 57 0105, kdy se obsah vody stanoví sušením pĜi teplotČ 87 ± 2°C, pĜi které nedochází k porušení organických látek. Suší se do nejnižší váhy. Obsah vody v % se dopoþítá. Pro stanovení titraþní kyselosti u sušeného mléka se postupovalo podle metody SoxhletHenkela. Princip spoþívá ve spotĜebČ alkalického odmČrného roztoku pĜi neutralizaci zkoušeného vzorku na pĜedepsaný indikátor (fenolftalein). Titraþní kyselost dle Soxhlet-Henkela (°SH) udává poþet mililitrĤ odmČrného roztoku (0,25M NaOH) potĜebných k neutralizaci 100 ml mléka a tekutých mléþných výrobkĤ. Pro sušená mléka je spotĜeba odmČrného roztoku vztažena na 100 ml obnoveného mléka3. Vzorky sušeného mléka byly následnČ mČĜeny v Petriho misce pĜístrojem FT NIR Antaris firmy ThermoNicolet na integraþní sféĜe v režimu reflektance pĜi vlnoþtech 10 000 – 4 000 cm-1. Konstantní vrstva sušeného mléka byla vymezena výškou Petriho misky a také vrstvou alobalu. 190

Snímání probíhalo v programu Omnic s rozlišením 8 a poþtem scanĤ 100. Doba pro získání jednoho spektra byla cca 50 vteĜin. Vzorky byly mČĜeny tĜikrát na rĤzných místech a do kalibraþního modelu bylo zaĜazeno prĤmČrné spektrum. NáslednČ byly pomocí PLS algoritmu vytvoĜeny kalibraþní modely pro každou stanovovanou složku a jejich spolehlivost ovČĜena kĜížovou validací. Zhodnocení výsledkĤ bylo provedeno na základČ korelace mezi referenþními hodnotami a hodnotami získanými výpoþtem kalibraþních rovnic a na základČ velikosti smČrodatných odchylek kalibrace (SEC) a validace (SEP). Vhodnost modelu se posuzuje také podle korelaþních koeficientĤ (R). ýím víc se hodnota blíží 1, tím lze považovat kalibraci za použitelnČjší. Dalším ukazatelem spolehlivosti je hodnota kalibraþního variaþního koeficientu (CCV), která by nemČla pĜesáhnout 5%, a hodnota predikþního variaþního koeficientu (PCV), nČhož je stanovena hranice do 10%. Rozdíly mezi referenþními a predikovanými (NIR) hodnotami byly porovnávány párovým T-testem.

Výsledky a diskuze PĜi tvorbČ kalibraþního modelu vlhkosti bylo použito 71 vzorkĤ odstĜedČného sušeného mléka. Do kalibraþního modelu titraþní kyselosti bylo zaĜazeno 40 vzorkĤ sušeného mléka namíchaného v rĤzném pomČru se sušenou syrovátkou pro rozšíĜení rozpČtí referenþních hodnot titraþní kyselosti. Koneþný poþet vzorkĤ byl upraven technikami TQ Analyst (Leverage, PC Scores a Spektrum Outlier) umožĖující odstranČní odlehlých spekter, které by mohly negativnČ ovlivĖovat výslednou kalibraci. Základní statistické údaje pro obČ kalibrace jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka I Základní statistické údaje pro stanovení vlhkosti a titraþní kyselosti sušeného mléka Kalibrovaná složka

n

xp

sx

min

max

Vlhkost (%) 66 3,27 0,439 2,45 4,10 Titraþní kyselost (°SH) 37 6,20 0,247 5,84 6,63 n – poþet vzorkĤ; xp – prĤmČr; sx – smČrodatná odchylka; min – minimální hodnota; max – maximální hodnota; PLS – poþet faktorĤ.

PLS 4 4

Kalibraþní modely byly vytvoĜeny pomocí PLS algoritmu (metoda þásteþných minimálních þtvercĤ). PLS faktory použité v modelech zahrnují spektrální a také koncentraþní informaci. Pokud je poþet PLS faktorĤ pĜíliš vysoký lze usuzovat, že v model má v sobČ zahrnuto pĜíliš mnoho spektrálního šumu, který se mĤže zkreslovat koneþné výsledky kalibrace. V našem pĜípadČ je poþet faktorĤ nízký (4) pro oba modely a prĤbČh PRESS má klesající trend. Výsledky kalibrace a validace pro vlhkost a titraþní kyselost sušeného mléka jsou uvedeny v tabulkách II a III. Korelaþní koeficienty kalibrace vlhkosti sušeného mléka dosahují hodnot 0,885 a 0,842, což ukazuje na dobrou korelaþní závislost modelu. TČsnost závislostí modelu je patrna z grafického vyjádĜení (obr. 1). Rozdíl mezi smČrodatnými odchylkami SEC a SEP je minimální a jejich velikost se pohybovala v rozmezí od 0,204% do 0,237%. Pro ovČĜení spolehlivosti vyhotoveného kalibraþního modelu se vypoþítaly kalibraþní (CCV) a predikþní (PCV) variaþní koeficienty. Hodnota CCV je 6,24%, což pĜesahuje podmínku spolehlivosti modelu (CCV pod 5%). Hodnota PCV by se mČla pohybovat pod 10%, tuto podmínku kalibraþní model splĖuje (hodnota PCV je 7,24%). Dá se tedy konstatovat, že model pro stanovení vlhkosti sušeného mléka je relativnČ spolehlivý.

191

Tabulka II Kalibraþní výsledky vlhkosti a titraþní kyselosti sušeného mléka Kalibrovaná složka a ± bx R 0,7088 + 0,7831x 0,0806 + 0,9870x

Vlhkost (%) Titraþní kyselost (°SH)

0,885 0,993

SEC

CCV (%)

0,204 2,84·10-2

6,235 0,458

a ± bx – regresní rovnice; R – korelaþní koeficient; SEC – smČrodatná odchylka kalibrace; CCV – kalibraþní variaþní koeficient.

4,5 y = 0,7831x + 0,7088 R = 0,885

NIR hodnoty (%)

4 3,5 3

y = 0,7312x + 0,87 R = 0,842

2,5 2 2

2,5

3

3,5

4

4,5

Referenþní hodnoty (%) Kalibrace

Validace

Lineární (Kalibrace)

Lineární (Validace)

Obr. 1. Grafické znázornČní kalibraþních a validaþních výsledkĤ vlhkosti sušeného mléka.

Tabulka III Validaþní výsledky vlhkosti a titraþní kyselosti sušeného mléka Kalibrovaná složka

a ± bx

R

SEP

PCV (%)

Vlhkost (%) 0,8700 + 0,7312x 0,842 0,237 7,244 -2 Titraþní kyselost (°SH) 0,1564 + 0,9743x 0,990 3,55·10 0,573 a ± bx – regresní rovnice; R – korelaþní koeficient; SEP – smČrodatná odchylka predikce; PCV – predikþní variaþní koeficient.

Kalibraþní hodnota korelaþního koeficientu u modelu titraþní kyselosti sušeného mléka je znaþnČ vysoká (0,993), což svČdþí o velmi pevné závislosti vyhotovené kalibrace. SmČrodatná odchylka kalibrace je 2,84·10-2 °SH (tab. II), která je patrná i z grafického prĤbČhu na obrázku 2. Výsledky pro validaci (tab. III) potvrzují výsledky kalibrace, hodnota korelaþního koeficientu je opČt velmi vysoká a témČĜ se shoduje s korelaþním koeficientem kalibrace (0,990). Dle velikosti CCV (kalibraþního variaþního koeficientu) a PCV (predikþního variaþního koeficientu) lze kalibraþní modely pro stanovení titraþní kyselosti u sušeného mléka považovat za velmi spolehlivé, ponČvadž hodnota CCV þinila 0,46 a 0,90%. Nedošlo tedy k pĜekroþení hraniþní hodnoty spolehlivosti modelu 5%. Hodnota PCV þinila 0,57 a 1,32 %, což je hluboko pod hranicí 10% (mez spolehlivosti u PCV). 192

6,8

NIR hodnoty (°SH)

6,6

y = 0,987x + 0,0806 R = 0,993

6,4 6,2 6

y = 0,9743x + 0,1564 R = 0,990

5,8 5,6 5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

Referenþní hodnoty (°SH) Kalibrace

Validace

Lineární (Kalibrace)

Lineární (Validace)

Obr. 2. Grafické znázornČní kalibraþních a validaþních výsledkĤ titraþní kyselosti sušeného mléka.

Tabulka IV Statistické vyhodnocení vlhkosti a titraþní kyselosti sušeného mléka T-testem Kalibrovaná složka

xREF

xNIR

SD

tstat -2

tkrit (1)

tkrit (2)

-2

Vlhkost (%) 3,27 3,27 5,40·10 3,58·10 1,669 1,987 -2 -2 Titraþní kyselost (°SH) 6,20 6,20 4,07·10 -1,2·10 1,688 2,028 xNIR – hodnoty predikované; xREF – hodnoty referenþní; d – diferenþní rozdíl predikovaných a referenþních hodnot; sx – smČrodatná odchylka diference; t stat – T-test; t krit.(1) – tabulková hodnota pĜi Į = 0,05; t krit.(2) – tabulková hodnota pĜi Į = 0,01. Použitelnost vytvoĜených modelĤ jsme ovČĜili za pomocí statistických metod. Pro oba dva vytvoĜené kalibraþní modely byl aplikován dvouvýbČrový párový T-test. PĜi srovnání souborĤ referenþních hodnot a hodnot vypoþítaných spektrometrem pro vlhkost a titraþní kyselost sušeného mléka (tab. IV), vyplývá, že mezi nimi není zaznamenán statisticky prĤkazný rozdíl (tstat < ttab) ani v hladinČ významnosti Į = 0,05 (tkrit(1)) ani pĜi Į = 0,01 (tkrit(2)). Literární prameny uvádí vyšší hodnoty korelaþních koeficientĤ u kalibraþních modelĤ vlhkosti sušeného mléka. BARABÁSSY a KAFFKA (1995) dosáhli pĜístrojem NIRSystems 6500 hodnot v modelech vlhkosti sušeného mléka R = 0,988 a SEC = 0,161%, pĜístroj PMC spectralyzer 1025 vykázal ještČ lepší výsledky a to R = 0,998 a SEC = 0,098%. BAER et al. (1983) uvádí filtrovým spektrometrem korelaþní koeficient pro model vlhkosti (R) 0,971 a smČrodatnou odchylku predikce (SEP) 0,274%. Naše výsledky jsou nepatrnČ horší, což mĤže být zpĤsobené menším poþtem vzorkĤ v kalibraci a menším rozptylem hodnot vlhkosti v sušeném mléce. K problematice stanovení titraþní kyselosti sušeného mléka jsme nenašli žádné literární zdroje. Jedná se pravdČpodobnČ o první aplikaci spektrometrie pro stanovení titraþní kyselosti sušeného mléka. ZávČrem lze konstatovat, že vytvoĜené kalibraþní modely splĖují podmínky spolehlivosti. U modelu stanovení vlhkosti jsou parametry nepatrnČ horší, ale pro orientaþní zjištČní je model použitelný. Kalibraþní model na stanovení titraþní kyselosti u sušeného mléka je velmi spolehlivý a vysoce robustní, tudíž ho lze doporuþit pro bČžné rutinní stanovení v praxi. 193

Použitá literatura: 1. BAER, R. J., FRANK, J. F., LOEWENSTEIN, M. Compositional analysis of nonfet dry milk by using near infrared diffuse reflectance spectroscopy. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 1983, 66: 858–863. 2. BARABÁSSY, S. P., TURZA, S. Investigation of the lyophilization effect on mixed milk powder product by near infrared spectroscopy. Near Infrared Spectroscopy: The Future Waves, 1995, IM Publications, Chichester. 3. ýSN 57 0105 Metody zkoušení mléþných výrobkĤ sušených a zahuštČných, 1965. 4. KAROUI, R., MOUAZEN, A. M., DUFOUR, E., PILLONEL, L., SCHALLER, E., PICQUE, D., DE BAERDEMAEKER, J., BOSSET, J.-O. A comparison and point use of NIR and MIR spectroscopic methods for determination of some parameters in European Emmental cheese. European Food Research and Technology, 2006, 223: 44–50. 5. MARABOLI, A., CATANEO, T. M. P., GIANGIACOMO, R. Detection of vegetable proteins from soy, pea and wheat isolates in milk poder by near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2002, 10: 63–69. 6. NAVRÁTIL, M., CIMANDER, C., MANDENIUS, C.-F. On-line Multisensor Monitoring of Jogurt and Filmjölk Fermentations on Production scale. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(3): 415–420. 7. PASTIEROVÁ, E. Stanoveni bielkovin v sušenom mlieku metódou NIR, Bulletin PV 30, 1991, s. 263–269. 8. RACHEV, M., PETROVA, S. Analysis of dry milk infant foods by near infrared spectroscopy (NIR). Journal of Chromatography, 1991, 552: 273–279. 9. SKEIE, S., FETEN, G., ALMØY, T., ØSTLIE, H., ISAKSSON, T. The use of near infrared spectroscopy to predict selected free amino acids during cheese ripening. International Dairy Journal, 2006, 16: 236–242. 10. SPITZER, K., KÜNNEMEYER, R., WOOLFORD, M., CLAYCOMB, R. On-line milk spectrometry: Analysis of bovine milk composition. Proceedings of SPIE – The International Society for Optical Engineering, 2005, Volume 5852 PART II: 698–707. 11. WOO, Y.-A., TERAZAWA, Y., CHEN, J. Y., IYO, C., TERADA, F., KAWANO, S. Development of a new measurement unit (MilkSpec-1) for rapid determination of fat, laktose, and protein in raw milk using near-infrared transmittance spectroscopy. Applied Spectroscopy, 2002, 56: 599–604. Kontaktní adresa: Ing. JANA RģŽIýKOVÁ, Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín Tel.: +420 57 603 1524, e-mail: [email protected]

194

STANOVENÍ JAKOSTNÍCH UKAZATELģ ýERSTVÝCH KOZÍCH SÝRģ POMOCÍ NIR SPEKTROSKOPIE Lužová TáĖa, Šustová KvČtoslava, Horáková Ruth Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ The determination of quality indexes fresh goatcs cheeses with used NIR spectroscopy Summary: In our work we occupied by monitoring basic performace indexes fresh goatcs cheeses over a period of lactation from April to November 2007. The samples were analysed every 14 days. With reference methods were at Department of Food Technology, MZLU Brno defined indexes: dry matter, pH, NaCl, titrable acidity, fat. After this were samples measured at FT NIR Antaris in reflectance mode with resolution 8 and number of scans 100. With help PLS methods were made calibration models. The models were checked with cross-validation.

V dnešní dobČ se NIR spektroskopie hojnČ využívá v chemii, farmacii, petrochemii a medicínČ. Klasickou oblastí pro aplikaci NIR je analýza potravin (Centner, 1999). Výhody, které poskytuje analýza NIR spektrometrií ve srovnání s klasickou spektrometrií a chromatografií, jsou hlavnČ rychlost a vysoká spolehlivost této nedestruktivní metody (Šikola, 2002). PĜi analýze mléka a mlékárenských výrobkĤ bývá NIR spektrometrie nejþastČji využívána pro stanovování základních složek, jako je sušina, obsah bílkovin, tuku, laktózy. Takovou analýzou se zabývali (Jankovská et al., 2003) a také (Laporte et al., 1999). RovnČž byla publikovaná Ĝada výsledkĤ v analýze sýrĤ (Skeie et al., 2005, McQueen et al., 1995). Inspirací pro náš þlánek nám byl neustále se zvyšující zájem o kozí sýry. Rozhodli jsme se proto vyzkoušet aplikaci NIR spektroskopie pro analýzu základních ukazatelĤ þerstvých kozích sýrĤ. Materiál a metodika K analýze byly použity vzorky þerstvých kozích sýrĤ, které byly odebírány od dubna do listopadu 2007. Každých 14 dní byl referenþními metodami u vzorkĤ stanoven obsah sušiny, tuku, NaCl, pH a titraþní kyselost. Vzorky byly analyzovány na pĜístroji FT NIR Antaris v režimu reflektance s poþtem scanĤ 100, rozlišení 8. K vyhodnocení byla použita prĤmČrná spektra. Na základČ získané závislosti mezi spektrální informací a složením vzorku byly vytvoĜeny kalibraþní modely. Kalibraþní modely byly ovČĜeny kĜížovou validací. Kalibraþní modely pro pH a tuk byly upraveny 1. derivací. Ke statistickému zpracování dat byl použit program Excel. Výsledky a diskuze Pro vytvoĜení kalibraþních modelĤ byl použit algoritmus PLS. Kalibraþní modely byly následnČ ovČĜeny kĜížovou validací. V tabulce I a II jsou uvedeny hodnoty korelaþních koeficientĤ kalibrace i validace (R), smČrodatné odchylky (SEC, SEP), hodnoty kalibraþních (CCV) a predikþních (PCV) koeficientĤ. Tabulka I Kalibraþní výsledky složky sušina (%) pH SH NaCl (%) Tuk (%)

R

SEC

CCV (%)

PLS faktory

bx + a

0,81005 0,95863 0,95256 0,96407 0,82477

1,2300 0,0231 0,8490 0,0701 0,7860

2,66 0,48 0,78 5,79 3,40

5 4 6 10 4

0,6563x+15,896 0,9210x+0,3756 0,9072x+10,146 0,9278x+0,0883 0,6800x+7,3997

R – korelaþní koeficient, SEC – smČrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibraþní variaþní koeficient, y = bx + a – rovnice regresní pĜímky

195

Tabulka II Validaþní výsledky složky sušina (%) pH SH NaCl (%) Tuk (%)

R

SEP

PCV (%)

PLS faktory

bx + a

0,67145 0,65885 0,90118 0,86721 0,66911

1,6000 0,0626 1,1200 0,1350 1,0600

3,46 1,31 1,02 11,15 4,59

5 4 6 10 4

0,5656x+20,083 0,5366x+2,2132 0,8550x+15,768 0,8531x+0,1830 0,5619x+10,080

R – korelaþní koeficient, SEP – smČrodatná odchylka predikce, PCV – predikþní variaþní koeficient, y = bx + a – rovnice regresní pĜímky

Spolehlivost kalibraþního modelu bývá urþena více faktory. Kalibraþní i validaþní koeficienty se mČly co nejvíce blížit jedné. V tabulce I a II si mĤžeme povšimnout vysokých koeficientĤ s relativnČ nízkými smČrodatnými odchylkami. DobĜe fungující model by nemČl mít více jak 15 PLS faktorĤ pro stanovení na NIR spektrometru, což nedosahuje ani jedna námi stanovovaná složka. V tabulce I pro stanovení obsahu soli hodnota CCV lehce pĜesahuje 5%, rovnČž hodnota PCV pro stanovení NaCl v tabulce II lehce pĜekraþuje mezní hodnotu 10%. To znamená, že model není natolik spolehlivý. U všech ostatních sledovaných vlastností nedošlo pĜekroþení limitních hodnot CCV (5%) a PCV (10%). Modely lez proto považovat za spolehlivé. V tabulce III jsou zaznamenány výsledky statistického vyhodnocení predikovaných NIR a referenþních hodnot jež byly testovány párovým t-testem. Nebyl zjištČn statisticky prĤkazný rozdíl mezi refernþními a predikovanými hodnotami. Tabulka III Statistické vyhodnocení párovým t-testem, n = 30 složky xREF xNIR SD 46,25 4,77 109,39 1,21 23,12

sušina pH SH NaCl tuk

46,25 4,77 109,39 1,21 23,12

0,397 0,016 0,595 0,051 0,273

t-test

t1 (krit)

t2 (krit)

0,003 0,000 0,000 -0,050 0,500

1,701 1,700 1,720 1,710 1,706

2,048 2,050 2,070 2,060 2,056

xREF- hodnoty referenþní, xNIR-hodnoty predikované, SD-smČrodatná odchylka diference 116 y = 0.9072x + 10.146 R = 0.9524

114 112 110

y = 0.855x + 15.768 R = 0.9117

108 106 104 102

104 kalibrace

106 validace

108

110 Lineární (validace)

112

114

116

Lineární (kalibrace)

Obrázek I Kalibraþní a validaþní výsledky pro titraþní kyselost (SH)

196

52 kalibrace y = 0,6563x + 15,896 R = 0,8100

50 48 46

validace y = 0,5656x + 20,083 R = 0,6716

44 42 40 40

42

kalibrace

44

validace

46

48

Lineární (validace)

50

52

54

Lineární (kalibrace)

Obrázek II Kalibraþní a validaþní výsledky pro sušinu

ZávČr Z našich výsledkĤ kalibraþních modelĤ je patrné, že hodnoty korelaþních koeficientĤ kalibraci, validace jsou vysoké, pĜi relativnČ nízkých smČrodatných odchylkách, a velmi dobrých hodnotách CCV, PCV. Takovéto výsledky poukazují na funkþnost modelĤ s možností využití v praxi pro rychlé stanovení sušiny. Jedinou vyjímkou byl kalibraþní model pro stanovení obsahu soli, jehož hodnoty CCV a PCV mírnČ pĜekraþovaly hraniþní hodnoty.

Použitá literatura: 1. CENTER V., 1999. Blízká infraþervená spektroskopie (NIR) a její prĤmyslové aplikace, CHEMagazín 1,22 –23 2. JANKOVSKÁ R., ŠUSTOVÁ K., 2003. Analysis of Cow Milk by Near-infrared Spectroscopy, Czech J. Food science 4, 123-128 3. LAPORTE M. F., PAQUIN P., 1999. Near-infrared analysis of fat protein and casein in cowcs milk, Journal of Agricultural and Food Chemistry 7, 2600-2605 4. McQUEEN D. H., WILSON R., KINNUNEN A., JENSEN E. P., 1995. Comparison of two infrared spectroscopic methods for cheese analysis, Talanta 42, 2007-2015 5. SKEIE S., FETEN G., ALMOY T., OSTLIE H., ISAKSSON T., 2006. The use of near infrared spectroscopy to predict selected free amino acids during cheese ripening, International Dairy Journal 16, 236-242 6. ŠIKOLA J., 2002. NIR SPEKTROSKOPIE – Perspektivní metoda pro kvalitativní a kvantitativní analýzu v potravinách, Kvalita potravin 4, 18-19

Kontaktní adresa: TáĖa Lužová, Ústav Technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, Brno 613 00, ýeská republika Tel: +420 545 133 362, email: [email protected]

197

SLEDOVÁNÍ JAKOSTI JEDLÝCH ROZTÍRATELNÝCH A SMċSNÝCH ROZTÍRATELNÝCH TUKģ Panovská ZdeĖka, Dostálová Jana, Doležal Marek, Culková Jana, Šedivá Alena Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha Monitoring of quality of margarines and spreads Summary: The fats and oils are important parts of our nutrition. The margarines and table spreads with vegetable fats offer an acceptable alternative to butter. They are formulated to have the same or similar taste, appearance, and nutritional value as butter. The objectives of this study were to compare main chemicals parameters and to describe the sensory attributes of margarines and spreads with vegetable fat and with mixture vegetable and animals fats which are on the Czech markets This study was conducted as part of a evaluation done in cooperation with newspaper Mlada Fronta Dnes. 18 samples with fat content among 25 to 80% have the contents of saturated FA 24-61% and amounts of trans FA (TFA) ranged from 0.2 to 7.2%. A descriptive profiling test was used to evaluate the sensory characteristics of selected products. The differences in sensory characteristics were mainly in texture and saltiness, taste were evaluated better in samples contain mixture of animal and vegetable fat.

Úvod Významnou souþást naší výživy tvoĜí tuky a oleje. Jejich celková spotĜeba se neustále sleduje, protože dlouhodobČ pĜekraþuje výživové doporuþené dávky. Podle vyhlášky þ. 124/2004 Sb. se jedlé tuky nebo oleje dČlí na sedm skupin - rostlinné, živoþišné, ztužené, pokrmové, roztíratelné, smČsné roztíratelné a tekuté emulgované. ZvláštČ u skupiny jedlé tuky roztíratelné a smČsné roztíratelné, které se používají pro mazání na peþivo a pĜípravu pomazánek, se výrobci snaží zavádČt stále nové výrobky. JeštČ pĜed 20 lety se používalo k tČmto úþelĤm pĜevážnČ máslo, které je vyrobeno z mléka a neobsahuje jiný než živoþišný tuk. Jeho nejvČtší pĜedností je pĜíjemná výrazná chuĢ, navíc je bohaté na vitamin A a neobsahuje barviva ani konzervaþní látky. K omezení jeho používání došlo hlavnČ proto, že obsahuje cholesterol cca 250 mg/100 g. Další nevýhodou másla, kromČ výživového hlediska, je špatná roztíratelnost. Roztíratelné jedlé tuky (dĜíve nazývané margaríny) obsahují rostlinné tuky. Jejich hlavní výhodou je z hlediska výživy lepší složení mastných kyselin a nepĜítomnost cholesterolu, takže jsou považovány za zdravČjší. Výhodou je i jeho dobrá roztíratelnost. V posledních letech se u tČchto výrobkĤ soustĜedila pozornost na obsah tzv. trans nenasycených mastných kyselin. SmČsný tuk obsahuje kromČ rostlinných tukĤ i tuk živoþišný. Tím se zlepší jeho chuĢ pĜi zachování dobré roztíratelnosti, ale zvýší se obsah nasycených mastných kyselin a sníží obsah mastných kyselin nenasycených. Na VŠCHT v Praze se dlouhodobČ sleduje a posuzuje jak výživová, tak sensorická kvalita tČchto výrobkĤ. V roce 2006 ve spolupráci s Mladou Frontou Dnes byly testovány vybrané parametry jedlých roztíratelných a smČsných roztíratelných tukĤ zakoupených a bČžnČ dostupných v þeské tržní síti. Dodáno a otestováno bylo celkem 18 vzorkĤ. U vzorkĤ byly testovány jak chemické parametry, tak parametry sensorické. Experimentální þást Popis vzorkĤ viz tabulka I Chemická analýza Z chemických parametrĤ bylo metodou GC-FID sledováno zastoupení jednotlivých skupin mastných kyselin (nasycené, nenasycené, trans nenasycené a n-3 nenasycené). Transesterifikace pĜítomných lipidĤ za vzniku methylesterĤ mastných kyselin byla provedena methanolickým roztokem hydroxidu draselného (1). Analýza vzniklých methylesterĤ metodou kapilární plynové chromatografie byla provedena na pĜístroji Agilent 6890 (Palo Alto, USA) za použití plamenovČionizaþního detektoru (FID) a kapilární kolony SP 2560, 100m x 0,25mm, s tloušĢkou filmu 0,20 Pm (Supelco, Bellefonte, USA). 198

Tabulka I – Popis vzorkĤ NÁZEV 1 Jihoþeské AB 2 Zlatá Haná 3 Mazlíþko Masmix kombinace másla a rostlinného tuku 4 se smetanou 5 Perla zlaté ráno 6 Rama Creme Bonjour 7 Lurpak 8 Lando 9 Bertolli s olivovým olejem 10 Sunny Glade, Na celý den 11 Easy 12 Roztíratelný tuk Euro shopper 13 Jedlý roztíratelný tuk Sonnenreife 14 Linco Family 15 Alfa Optima s máslovou chutí 16 Rama Classic 17 Flora nové složení 18 Perla tip

VÝROBCE Madeta ýeskéBudČjovice Olma Olomouc V Polsku

% TUKU 78 76 65

Raisio Polsko

75

Unilever ýR, P 8 Unilever ýR, P 8 Arla Foods, Dánsko Clever Stolz, Kleve, NČmecko Unilever ýR, P 8 Polsko Olma Olomouc Ahold (ýR) pro Lidl NČmecko Royal Brinkers Maćarsko Setuza, Ústí nad Labem Unilever ýR, P 8 Unilever ýR, P 8 Unilever ýR, P 8

74 70 80 70 48 25 76 25 80 40 70 70 70 25

Senzorická analýza Senzorické hodnocení probíhalo v senzorické laboratoĜi VŠCHT v Praze. Hodnocení se zúþastnil senzorický panel VŠCHT. PĜi senzorické analýze se postupovalo v souladu s mezinárodní normou ISO 8589, tj. vzorky byly pĜedkládány a hodnoceny anonymnČ (zakódované). Hodnotitelé byli vybráni a vyškoleni také dle normy ISO. Postup všech senzorických analýz byl v souladu s mezinárodními normami ISO. U vzorkĤ se hodnotila pĜíjemnost barvy, pĜíjemnost vĤnČ, pĜíjemnost chuti, pĜíjemnost textury, roztíratelnost. Pro hodnocení bylo použito pČtibodové stupnice s tím, že deskriptor pĜíjemnost chuti byl násoben koeficientem. Posuzovatelé použili na hodnocení vzorkĤ i metodu slovního popisu. Stupnice pĜíjemnosti: 1. vynikající 2. velmi dobrý 3. celkem pĜijatelný, prĤmČrný 4. velmi špatný 5. nepĜijatelný Výsledky a diskuse Výsledky senzorické analýzy Hodnocení smČsných tukĤ PĜi senzorickém hodnocení byly vzájemnČ porovnány nejprve smČsné tuky tj. vzorky 1-7. Ze slovního popisu vzorkĤ vyplynulo, že nejvČtší rozdíly mezi vzorky byly v pĜíjemnosti chuti. Vzorek þ. 3 byl chuĢovČ nevyvážený se slabou pachutí. Mezi vzorky byly rozdíly ve slané chuti vzorkĤ, vzorek þ. 7 byl hodnocen jako výraznČ slaný (popsán jako jemnČ slaný již na etiketČ), jeho chuĢ byla vČtšinou hodnocena jako pĜíjemná. Slaná chuĢ byla zaznamenána také u vzorkĤ 4 a 6, u ostatních byla slanost jen velmi slabá. U jednotlivých vzorkĤ nebyly shledány velké rozdíly v barvČ ani vĤni. V roztíratelnosti se lišil vzorek þ. 2 , který byl výraznČ tužší a naopak vzorek þ. 7 mČkþí. V textuĜe byl pouze u vzorku þ. 3 zaznamenán výraznČ krupiþkovitý charakter. 199

Barva vzorkĤ byla vČtšinou hodnocena kladnČ, vzorky se vČtšinou významnČ nelišily pouze vzorky 1 a 7 byly svČtlejší. VĤnČ byla u vzorkĤ þ. 1, 2, 3, 5 slabá a u vzorkĤ þ. 4, 5 a 6 intenzivní, vČtšinou máslová, což bylo hodnoceno kladnČ. Nebyl zaznamenán vzorek s nepĜíjemnou vĤní. Roztíratelnost byla u vzorkĤ þ. 1, 3, 4, 5 stejná, tj. velmi dobrá. Vzorek þ. 2 byl za stejné teploty po vyndání z chladniþky tužší proti ostatním vzorkĤm, naopak vzorek .þ 7 byl po vyndání z chladniþky oproti ostatním vzorkĤm výraznČ až nepĜíjemnČ mČkký. Je však nutné upozornit, že vzorek þ. 7 mČl jako jediný na etiketČ poznámku „vhodný ke zmrazování“ a po vyndání z mrazniþky byl tuhý asi jako máslo po vyndání z chladniþky. Hodnocení roztíratelných tukĤ Barva vČtšiny vzorkĤ byla podobná, pouze u vzorkĤ þ. 11, 13 a 16 byla pĜíliš intenzivní, nepĜirozenČ žlutá a vzorek þ. 18 byl pĜíliš svČtlý. VĤnČ byla u vČtšiny vzorkĤ jemná, nepĜíliš výrazná, mezi vzorky nebyly velké rozdíly. SilnČjší vĤnČ byla u vzorkĤ þ. 9 a 10, slabší vĤnČ u vzorkĤ þ. 11 a 12. Roztíratelnost u vČtšiny vzorkĤ byla velmi dobrá, vČtšina vzorkĤ byla mČkþích, takže s roztíratelností nebyly problémy. VýraznČjší slanost byla zaznamenaná u vzorkĤ þ. 9 a 13. Textura byla u vČtšiny vzorkĤ výborná, u vzorkĤ þ. 9 a 13 se po chvíli stání objevil olej, u vzorku þ. 10 jemné krupiþky. Vzorek þ. 8 vykazoval lojovitou chuĢ a celkovČ jeho chuĢ byla nevyvážená. Výsledky stanovení složení mastných kyselin roztíratelných a smČsných roztíratelných tukĤ Tabulka II. : Složení mastných kyselin tuku (% celkových mastných kyselin) Vzorek

SFA

MUFA

PUFA

TRANS

1 Jihoþeské AB * 61,9 32,2 5,7 2,5 2 Zlatá Haná * 56,9 32,1 10,9 1,1 3 Mazlíþko * 53,4 37,6 8,9 2,1 4 Masmix * 37,9 43,8 18,3 1,4 5 Perla zlaté ráno * 52,5 30,1 17,3 0,7 6 Rama Creme Bonjour * 52,9 31,7 15,2 1,1 7 Lurpak * 57,1 33,5 9,0 3,4 8 Lando * 50,5 31,3 18,2 0,7 9 Bertolli s olivovým olejem 48,8 38,9 12,3 0,4 10 Sunny Glade, Na celý den 27,4 53,5 19,1 3,0 11 Easy 31,2 52,4 16,4 7,2 12 Roztíratelný tuk Euro shopper 26,4 32,0 41,6 1,3 13 Jedlý roztíratelný tuk Sonnereife 34,1 40,4 25,5 0,6 14 Linco Family 30,8 29,0 40,2 2,4 15 Alfa Optima s máslovou chutí 31,2 33,9 34,9 1,4 16 Rama Classic 40,2 32,9 26,8 0,3 17 Flora nové složení 24,7 23,4 51,9 0,6 18 Perla tip 31,2 24,4 44,4 0,2 * smČsný roztíratelný tuk SFA – nasycené mastné kyseliny, MUFA – monoenové mastné kyseliny, PUFA – polyenové mastné kyseliny, TRANS – trans nenasycené mastné kyseliny

200

Hodnocení složení mastných kyselin roztíratelných a smČsných roztíratelných tukĤ Obsah trans nenasycených mastných kyselin nepĜekroþil u žádného výrobku 10 % z celkových mastných kyselin, což je oproti pĜedchozím letĤm výrazné zlepšení. V sérii analýz, které jsme provedli u 43 tukĤ zakoupených v prvním pololetí 2004 pĜekroþilo obsah 10 % 9 výrobkĤ. PrĤmČrný obsah trans kyselin v letošním testu je jen o nČco vyšší než dvČ procenta, zatímco v analogickém testu MF DNES pĜed tĜemi roky byl v prĤmČru 10 %. Zlatá Haná mČla v tomto testu 15,3%, dnes jen 1,1. VýraznČ se zlepšilo i složení Jihoþeského AB. To znamená, že výrobci již prakticky nepoužívají ve výrobcích þásteþnČ ztužené tuky s vysokým obsahem trans kyselin. Vyšší obsah než 0,5 g trans mastných kyselin na porci, který musí výrobci v USA od 1.1.2006 povinnČ vyznaþovat na obalech by pĜekroþil pouze výrobek Easy (1,08 g) a Lurpak (0,54 g) a to za pĜedpokladu, že porce je 20 g výrobku.

ZávČr Sensorickým hodnocením smČsných tukĤ bylo zjištČno, že nejvČtší rozdíly mezi vzorky byly dány rozdílnou pĜíjemností chutí vzorkĤ. Rozdíly byly rovnČž nalezeny ve slané chuti vzorkĤ a v textuĜe vzorkĤ. V barvČ a ve vĤni podstatné rozdíly mezi vzorky nalezeny nebyly. Roztíratelné tuky byly rovnČž v barvČ velmi podobné, mČly vČtšinou jemnou a ne pĜíliš výraznou vĤni. Textura a roztíratelnost u tČchto vzorkĤ byla hodnocená nejþastČji jako dobrá. U vzorkĤ Bertolli a Sonnereife již po krátké dobČ stání vystupoval olej, vzorek Sunny Glade byl krupiþkovitý. Obsah trans nenasycených mastných kyselin nepĜekroþil u žádného výrobku 10 % z celkových mastných kyselin. PrĤmČrný obsah trans kyselin v letošním testu jsou necelá dvČ procenta. Z hlediska obsahu nasycených, monoenových a polyenových mastných kyselin je výraznČ výhodnČjší složení roztíratelných tukĤ než složení smČsných roztíratelných tukĤ, které mají vyšší obsah nasycených mastných kyselin a nižší obsah mastných kyselin nenasycených. Nejvyšší obsah polyenových mastných kyselin mČla Flora nové složení, Perla tip, roztíratelný tuk Euro shoper a Linco family.

PodČkování: Práce byla vytvoĜena za podpory MŠMT grant 6046137305 Použitá literatura: 1. Nollet L.M.L.: Handbook of Food Analysis, Vol. 1, Dekker, New York, 1996, 358-360. Kontaktní adresa: [email protected]

201

SENZORICKÉ HODNOCENÍ MRAŽENÝCH KRÉMģ Jarošová Alžbeta, Šulcerová Hana, ýoþková Dana Ústav technologie potravin, MZLU Brno Sensorial assessment of frozen creams Summary: At present time when market has been saturated, decisive indicators for customers are not only diet features but also sensorial characteristics of products, especially seasonings. Common consumer concentrates on descriptors already at chosing products at purchase itself, the others are judged while consuming. Experience from previous consuming influence next choise of the same or other product. At sensorial evaluation descriptors of two frozen vanilla creams Terno and Prima were monitored in dependence on vegetable as well as animal fat portion. Terno frozen cream contains milk and vegetable fat, Prima only vegetable fat. The evaluation was conducted by qualified people in sensorial laboratory of MZLU Brno, Faculty of Agronomy, Department of Food Technology during three years. Chosen descriptors were assessed at teperatures of - 6 °C and at common room temperature. Results were evaluated and statistically analyzed by programme Unistat Ltd.

ÚVOD První písemné záznamy a odborná literatura uvádČjí, že již faraónové ve starém EgyptČ znali ovocné šĢávy chlazené snČhem. StaĜí ěekové a ěímané si pochutnávali na zmrzlinách, které byly slazené medem a ochuceny rĤznými druhy ovocných šĢáv a vínem. Také anglický král Jakub II si pochutnával na takto pĜipravených ovocných šĢávách. Tyto poživatiny nemČly charakter dnešní zmrzliny, byly to zmrzlé vodní krystalky vzniklé z ovocných šĢáv (2). Prvním pokrokem smČĜující k výrobČ mražené krémové smČsi bylo objevení umČlého ledu mužem jménem Blasius Villafrance z ěíma. Ten v roce 1550 zjistil, že je možné snížit bod mrazu, když se ke snČhu pĜidá ledek nebo sĤl (5). K dalšímu vývoji došlo v roce 1970, kdy paní Nancy Johnsonová sestrojila stroj na výrobu zmrzliny (2). PrĤlom pĜi výrobČ zmrzliny zpĤsobil první ruþní výrobník zmrzliny vynalezen v roce 1846 a samozĜejmČ patentování ledniþky Carlem von Linde v roce 1876 (5). Hladkou konzistenci získala zmrzlina až s vynálezem dvouplášĢových míchacích zaĜízení (2). V roce 1922 se Thomas Wall rozhodl pro výrobu balené zmrzliny. V té dobČ se také objevuje mražený krém mezi dvČma oplatkami ("Sibirka") a v 30. letech "zmrzliny na klacku". Ve 40. letech se zmrzlinový prĤmysl "usadil" a výroba zĤstala bez podstatných zmČn až do 70. let. V té dobČ zaþala tradiþní zmrzlina ustupovat s nárĤstem balených zmrzlinových výrobkĤ pro velké samoobsluhy (5). PĜestože se objevují nové suroviny i pĜísady, lze s urþitostí Ĝíci, že umČní výroby zmrzlin se za posledních 100 let již témČĜ nezmČnilo (2). V dnešní dobČ má spotĜeba mražených krémĤ stoupající tendenci. SpotĜeba v ýR þiní asi 6 l na osobu, což je o tĜetinu ménČ než ve starých zemích EU. Celková spotĜeba je od roku 2001 stabilní (12 300 až 12 900 t). Podíl mražených krémĤ na celkové spotĜebČ mléþných výrobkĤ je 13 %. V ýeské republice jsou nejpopulárnČjší „levné“ zmrzlinové dorty – þeská a slovenská specialita. Asi tĜetina tuzemské produkce se exportuje – témČĜ celý export (2 843 t) jde na Slovensko. Dovoz mražených krémĤ dosáhl v roce 2004 60 %. Jednalo se pĜedevším o import z Maćarska (2 412 t), Polska (2 323 t) a Slovenska (1 030 t). Senzorická analýza nachází v potravináĜském prĤmyslu stále významnČjší uplatnČní. Její dĤležitost pĜi výrobČ je dána odezvou spotĜebitele. PrávČ spotĜebitel hodnotí zakoupenou potravinu základními smysly, což pĜedstavuje základ senzorické analýzy. Na základČ jeho hodnocení se tato potravina stane kupovanou nebo ne. Mražené smetanové krémy patĜí do skupiny potravin, u kterých jsou pĜesnČ stanovené znaky pro sledování senzorické jakosti výrobku.

202

MATERIÁL A METODY Použitý materiál K senzorickému hodnocení bylo použito dvou druhĤ mražených krémĤ. Vzorky byly zakoupeny v obchodní síti mČsta Brna. V obou pĜípadech se jednalo o vzorky vanilkového polárkového dortu. Charakteristika vzorkĤ Vzorek 1: Mražený vanilkový polárkový dort Prima - výrobce - NOWACO s.r.o., Opava – složení: voda, cukr, rostlinný tuk, pĜírodnČ identické smetanové aroma, sušené odstĜedČné mléko, sušenou syrovátku, stabilizátory (estery masntných kyselin E 471, karubin E 410, guma gust E 412), rozpouštČdlo – hydroxypropyl – škrobový difosfát (E 1442), pĜírodní a pĜírodnČ identická aromata, potravní doplĖky, barviva. Vzorek 2: Mražený vanilkový polárkový dort Terno - výrobce - NANUK Zdounky - složení: voda, cukr, mléþný tuk, rostlinný tuk (9%), sušené podmáslí, sušenou syrovátku, škrob, emulgátor (mono a diglyceridy E 471), stabilizátory (alginát sodný E401, karagenan E407, karubin E410, guma gust E412), smetanové aroma vanilkové a smetanové pĜírodnČ identické aroma, ethylvanilin, kakaovou polevu (voda, cukr, sušená syrovátka, kakao (7 %), corobový prášek, škrob. Použité metody Senzorická analýza U vzorkĤ mražených smetanových krémĤ byla provedena senzorická analýza se zamČĜením na vybrané vlastnosti.Mražené krémy byly hodnoceny studenty Mendelovy zemČdČlské a lesnické univerzity v BrnČ, oboru Technologie potravin. Vlastní hodnocení probíhalo v senzorické laboratoĜi Ústavu technologie potravin, která splĖuje pĜesnČ definované podmínky mezinárodní normy ISO 8589, pro vybavení místnosti, pĜípravy a pĜedkládání vzorkĤ (3). Vzorek mraženého krému byl posuzovatelĤm podáván pĜi dvou teplotách v závislosti na deskriptorech, který hodnotili. Textura zmrzliny byla analyzována pĜi teplotČ vzorkĤ -6 °C, chuĢ byla hodnocena až po roztátí zmrzliny (teplota místnosti). Vzorek byl pĜedkládán vždy o stejném množství (30 g). Pro hodnocení byly použity intervalové grafické nestrukturované stupnice (100 mm, 1 mm = 1 bod) se slovním popisem krajních bodĤ. PĜi zpracovávání formuláĜĤ byli zvlášĢ vyhodnoceny odpovČdi žen a mužĤ a následnČ byla vytvoĜena prĤmČrná hodnota, která byla porovnávána mezi jednotlivými vzorky. Statistické metody Výsledky mČĜení získané vyhodnocením dotazníkĤ byly vloženy do programu MS Excel. Pomocí tohoto programu byly vypoþteny prĤmČrné hodnoty jednotlivých deskriptorĤ, jejich minimální a maximální hodnota, smČrodatná odchylka a variaþní koeficient. NamČĜené hodnoty byly statisticky zpracovány v statistickém programu Unistat Ltd.

VÝSLEDKY A DISKUZE U mražených krémĤ byly hodnoceny tyto deskriptory: barva, rovnomČrnost zabarvení, chladivost v ústech, tvrdost v ústech, konzistence, viskozita, pĜilnavost v ústech, sladká chuĢ, intenzita pĜíchuti, smetanová chuĢ, chuĢ po mléþném tuku, karamelová chuĢ a chuĢ hoĜká. Hodnocené deskriptory byly rozdČleny do tĜí skupin: hodnocení vybraných vlastností, hodnocení textury, hodnocení chutČ.

203

hodnotitelská stupnice

Hodnocení vanilkového polárkového dortu Prima ¾ Hodnocení vybraných vlastností Barva by mČla být typická pro danou pĜíchuĢ, s pĜimČĜenou intenzitou. PrĤmČrná hodnota (38) byla stanovena jako mírnČ svČtlá. Dalším hodnoceným deskriptorem bylo rovnomČrnost zabarvení. Je dĤležité, aby barva s intenzitou zabarvení tvoĜila jednotný celek. Okraje nesmí být tmavší nebo svČtlejší. Hodnotitelé posuzovali barvu za dosti rovnomČrnou (32). Chladivost v ústech udává, zda výrobek je pro spotĜebitele osvČžující nebo vyvolávající pĜípadný pocit bolesti z chladu. Tento deskriptor byl posuzován jako nadprĤmČrnČ intenzivní (68).

100 50 0 barva muži

prĤmČr

rovnomČrnost zabarvení

ženy

chladivost v ústech

deskriptory

Obr. 1 Senzorické hodnocení vybraných vlastností polárkového dortu Prima


¾ Hodnocení textury Tvrdost v ústech je pro konzumenta jedna s nejdĤležitČjších texturních vlastností. CelkovČ byla hodnocena jako mírnČ mČkká (28). Konzistence výrobku byla hodnocena jako stĜednČ hladká (42).Viskozita výrobku byla hodnocena jako prĤmČrná, tzn., že výrobek viskozitou hodnotitelĤm zcela vyhovoval. PĜilnavost v ústech by nemČla být pĜíliš vysoká, což vzorek splĖoval.

60 50 40 30 20 10 0 tvrdost v ústech muži

prĤmČr

konzistence

ženy

viskozita

pĜilnavost v ústech

deskriptor

Obr. 2 Senzorické hodnocení texturních vlastností polárkového dortu Prima

ho dnotitelská stupnice

¾ Hodnocení chuti Sladká chuĢ byla hodnocena jako dosti intenzivní (69). Intenzitu pĜíchutČ a smetanovou chuĢ všichni hodnotitelé zvolili jako prĤmČrnou, tzn. zcela vyhovující. ChuĢ po mléþném tuku byla hodnocena jako stĜednČ intenzivní (44). Mezi vady chuti byla zaĜazena chuĢ karamelová a hoĜká. 80 60 40 20 0 sladká chuĢ

muži

prĤmČr

intenzita pĜíchuti

ženy

smetanová chuĢ

chuĢ po mléþném tuku

karamelová hoĜká chuĢ chuĢ

deskriptor

Obr. 3 Senzorické hodnocení chuti polárkového dortu Prima 204

Hodnocení vanilkového polárkového dortu Terno ¾ Hodnocení vybraných vlastností Barva by mČla být krémovČ žlutá. Posuzovatelé ji hodnotili jako mírnČ svČtlou (39). RovnomČrnost zabarvení - vzorek byl tím rovnomČrnČji zabarven þím mČl nižší bodové ohodnocení - velmi rovnomČrné (12). Chladivost v ústech byla hodnocena jako dosti intenzivní (65).


100 50 0 barva

-50 muži

rovnomČrnost zabarvení

prĤmČr

ženy

chladivost v ústech

de skriptor

Obr. 4 Senzorické hodnocení vybraných vlastností polárkového dortu Terno


¾ Hodnocení textury Tvrdost v ústech byla vnímána jako dosti mČkká (23). Konzistence byla hodnocena jako dosti hladká (22) - nižší bodové hodnocení vyjadĜovalo hladší konzistenci. Viskozita byla prĤmČrná, tzn., výrobek viskozitou hodnotitelĤm vyhovoval. PĜilnavost v ústech by nemČla být pĜíliš vysoká, což vzorek splĖoval. Posuzovatelé jej hodnotily jako velmi mírnČ pĜilnavou (28).

60 40 20 0 tvrdost v ústech muži

prĤmČr

konzistence ženy

viskozita

pĜilnavost v ústech

de skriptor

Obr. 5 Senzorické hodnocení texturních vlastností polárkového dortu Terno


¾Hodnocení chuti Sladká chuĢ byla hodnocena jako mírnČ intenzivní (67). Intenzita pĜíchutČ (53) i smetanová chuĢ (58) byly vnímány jako prĤmČrné. ChuĢ po mléþném tuku (39) karamelová chuĢ (19) byly zhodnoceny jako HoĜká chuĢ byla nepatrná (4). 100 80 60 40 20 0 -20

muži

sladká chuĢ

prĤmČr

intenzita pĜíchuti ženy

smetanová chuĢ

chuĢ po mléþném tuku

deskriptor

Obr. 6 Senzorické hodnocení chuti polárkového dortu Terno

205

karamelová chuĢ

hoĜká chuĢ

Srovnání hodnocení mražených smetanových krémĤ Prima (P) a Terno (T) ¾ Hodnocení vybraných vlastností První hodnoceným deskriptorem byla barva. U obou vzorkĤ ji posuzovatelé vyhodnotili jako mírnČ svČtlou až stĜednČ intenzivní (P – 38, T – 39). Další hodnocenou vlastností byla rovnomČrnost zabarvení. Vzorek Prima byl vyhodnocen jako dosti rovnomČrnČ zabarvený (32) a vzorek Terno jako velmi rovnomČrnČ zabarvený (12). Chladivost v ústech byla ohodnocena v obou pĜípadech (P – 68, T - 65) jako dosti intenzivní. Bylo prokázáno, že vzorek Prima vykazoval vysoce významný statisticky prĤkazný rozdíl v porovnání s vzorkem Terno v rovnomČrnosti zabarvení. Terno byl nepatrnČ tmavší, ale i pĜesto výrobce dokázal docílit rovnomČrnosti zabarvení. Lze usoudit, že vzorek Prima pravdČpodobnČ nebyl pĜi výrobČ dostateþnČ homogenizován þi použité barvivo nebylo vhodnČ zvoleno a upraveno. I pĜesto, že zde bylo použito E 1442, které se používá k rozpouštČní, ĜedČní a jiné fyzikální úpravČ pĜídatných látek, nebylo docíleno dostateþné rovnomČrnosti zabarvení. ¾ Hodnocení textury K hodnoceným deskriptorĤm byla do této skupiny zaĜazena tvrdost v ústech. Tento deskriptor byl u vzorku Terno vnímán jako dosti mČkký (23) a u vzorku Prima jako mírnČ mČkký (28). Další vlastností byla konzistence vzorku. U vzorku Prima byla hodnocena jako stĜednČ hladká (42) a u vzorku Terno jako dosti hladká (22). U této vlastnosti byl prokázán vysoce významný statisticky prĤkazný rozdíl. Viskozita obou výrobkĤ byla hodnocena jako prĤmČrná, tzn., že výrobky viskozitou hodnotitelĤm vyhovovaly (P – 48, T – 43). Posledním posuzovaným deskriptorem v této skupinČ byla pĜilnavost v ústech. Posuzovatelé u vzorku Prima hodnotily pĜilnavost v ústech jako dosti slabČ pĜilnavý (37) a u vzorku Terno jako mírnČ pĜilnavý (28). Mezi výsledky stanovenými u pĜilnavosti v ústech byl stanoven statisticky prĤkazný rozdíl. Na základČ zjištČných výsledkĤ lze vyhodnotit, že vzorek Prima byl tvrdší než Terno, ale tento rozdíl nedosahoval statisticky prĤkazného rozdílu. Naopak vzorek Terno byl dosti hladké konzistence a v porovnáním se vzorkem Prima rozdíl dosahoval statisticky velmi prĤkazného rozdílu. Také pĜilnavost v ústech u tohoto vzorku dosáhla statisticky prĤkazného rozdílu v porovnání s vzorkem Terno. PĜi hodnocení texturních vlastností se projevil statisticky prĤkazný rozdíl u dvou deskriptorĤ, a to u konzistence a pĜilnavosti v ústech. U obou vlastností posuzovatelé dávali pĜednost vzorku Terno. Konzistence i pĜilnavost v ústech je ovlivnČna mnoha aspekty, a to jak pĜi výbČru surovin tak i pĜi vlastní výrobČ. PĜi sestavování smČsi záleží na vhodnČ zvoleném tuku, stabilizátoru a emulgátoru. U mraženého krému Prima nebylo použito emulgátoru, který má vliv na stabilitu tuku v mraženém krému. Velký vliv na konzistenci má opČt správná homogenizace základní smČsi, þímž se vytvoĜí hladká konzistence a zabrání se vyvstávání nebo shlukování mléþného tuku, který je patrný pĜi hodnocení pĜilnavosti v ústech a celkové lehkosti MK. ¾ Hodnocení chuti Sladká chuĢ - tato vlastnost byla u obou vzorkĤ vnímána jako dosti intenzivní (P – 69, T- 67). Intenzita pĜíchutČ (P – 58, T – 53) a smetanová chuĢ (P – 57, T – 58) byli považovány hodnotiteli za prĤmČrné. ChuĢ po mléþném tuku byla vyhodnocena jako mírnČ slabá (39) u vzorku Terno a u vzorku Prima jako stĜednČ intenzivní (44). K nežádoucím chuĢovým vlastnostem patĜí karamelová a hoĜká chuĢ. U obou vzorkĤ byla karamelová chuĢ zaznamenaná jako mírnČ slabá (P – 22, T – 19). HoĜká chuĢ byla vyhodnocena u vzorku Prima jako mírnČ patrná (8) a u vzorku Terno byla zhodnocena jako nepatrnČ zaznamenaná (4). U této vlastnosti byl prokázán statisticky prĤkazný rozdíl. HoĜká chuĢ by se nemČla v mražených krémech vĤbec vyskytovat. Jejím zdrojem mohli být pĜídavné látky. Jelikož u vzorku Prima byla hoĜká chuĢ intenzivnČjší a zároveĖ i intenzita pĜíchuti byla vyšší je možné usoudit, že hoĜká chuĢ pocházela z vanilkového aroma.

206

60 40 20

T erno

HoĜká chuĢ

Karamelová chuĢ

Smetanová chuĢ

Intenzita pĜíchuti

Sladká chuĢ

Viskozita

Konzistence

Tvrdost v ústech

PĜilnavost v ústech de skriptor

ChuĢ po mléþném tuku

Prima

Chladivost v ústech

-20

RovnomČrnost zabarvení

0 Barva


80

Obr. 7 Porovnání senzorického hodnocení polárkových dortĤ Prima a Terno

ZÁVċR PĜi porovnávání dvou druhĤ mražených krémĤ hodnotitelé dávali pĜednost mraženému krému Terno. Tento krém mČl rovnomČrnČjší zabarvení, hladší konzistenci, pĜilnavost v ústech nebyla tak intenzivní a hoĜká chuĢ byla pĜítomna jen nepatrnČ. Posuzovatelé jej hodnotili jako svČží s pĜimČĜenou sladkostí a s pĜimČĜenou intenzitou pĜíchuti a chutí smetanovou. U deskriptorĤ se statisticky prĤkazným rozdílem (pĜilnavost v ústech, hoĜká chuĢ) nebo vysoce významným prĤkazným rozdílem (rovnomČrnost zabarvení, konzistence) mČl mražený krém Terno vždy kvalitativnČ lepší výsledky. Mražený krém Prima byl vyhodnocen posuzovateli jako vyhovující. Byl svČtlejšího zabarvení a s nižší rovnomČrností zabarvení. PĜi hodnocení texturních vlastností byla zjištČna stĜední viskozita, ménČ hladká konzistence. PĜi hodnocení chuĢových vlastností dosahoval nadprĤmČrných vlastností. Byla u nČj výrazná hoĜká a karamelová chuĢ. Mražený krém Terno byl hodnocen jako velmi dobrý. Použitá literatura: 1. GAJDģŠEK, S. Mlékárenství II. Brno: MZLU, 2000. 142 s. ISBN 80-7157-342-6. 2. HAMR, K., STEJSKALOVÁ, J., KADLEC, F. Receptury pro cukráĜskou výrobu: Zmrzliny. 1. vyd.: Idea servis, konsorcium, 1996. 84 s. ISBN 18-66-030-96. 3. JAROŠOVÁ, A. Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno: MZLU, 2001. 84 s. ISBN 80-7157-539-9. 4. JANTOŠOVÁ, B., HOLEC, J. Hygiena a technologie mléka a mléþných výrobkĤ. 1. vyd. Brno: VFU, 2004. 72 s. ISBN 4-1190-054. 5. ANONYM 2003: Zmrzlina. www.guido.cz / [online].[cit. 2004-09-02]. ýeský. Dostupný z WWW:http://www.agris.cz/potravinarstvi/index.php Kontaktní adresa Ing. Hana Šulcerová, Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, tel.: 545 133 337, e-mail: [email protected].

207

SLEDOVÁNÍ ZMċN SENZORICKÝCH VLASTNOSTÍ BÍLÝCH JOGURTģ PO DOBU JEJICH MINIMÁLNÍ TRVANLIVOSTI Šulcerová Hana, Šustová KvČtoslava, Vaculínová Hana Ústav technologie potravin, MZLU Brno Changes monitoring of white yoghurts sensorial characteristics during their minimal endurance time Summary: Besides chemical and microbial parameters of white yoghurts, other quality indexes are also one of sensorial features. Products introduced in market have to fulfill set criteria. One of them is minimum endurance time. Of course, even during this period certain sensorial changes appear which can influence customer choice at repetitional purchase. In sensorial lab of Institute of MZLU Brno, Faculty of Agronomy, Department of Food Technology, samples of white yoghurts of different fat proportion from different producers were evaluated by qualified staff. Samples were given to the lab right from the producer and assessed on their production day. Changes of particular descriptors were monitored depending on length of storage and fat proportion during their minimum endurance time. Finally, results were evaluated and statistically analyzed.

ÚVOD ýlovČk konzumuje kysaná (fermentovaná) mléka již dlouhá staletí, aþkoliv pĜesnČjší údaje o jejich pĤvodu a vzniku se liší. PĤvodnČ byl jogurt pĜipravován z ovþího a buvolího mléka a þásteþnČ z kozího a kravského. Používal se v lidské stravČ pro pĜímou konzumaci, pozdČji byl ochucován a fortifikován dalšími pĜísadami jako zelenina, ovoce a koĜení, byl využívám pro vaĜení a peþení. PrĤmyslovČ byl jogurt poprvé pĜipraven firmou DANONE (1922) a rozvoj výroby, jako takové, se datuje po druhé svČtové válce (4). V souþasné dobČ je celosvČtovČ uznávanou skuteþností, že rĤzné druhy ušlechtile zakysaných mlék vhodnými mikroorganismy jsou možností, jak konzumovat mléko, které mĤže nejménČ škodit a má naopak v mnoha ohledech pro þlovČka nespornČ kladný význam (6). Fermentované mléþné výrobky patĜí mezi historicky nejstarší mléþné výrobky. Jejich skladba je velmi pestrá a jsou výrazné rozdíly ve složení a vlastnostech tČchto výrobkĤ a to zemČpisné i krajové (5). Jogurty jsou v celosvČtovém mČĜítku nejrozšíĜenČjšími a nejoblíbenČjšími kysanými mléþnými výrobky. RozšíĜení jejich výroby pĜineslo s sebou i Ĝadu odlišných výrobních technologií a rozmanitost v charakteristických znacích finálních výrobkĤ. Podle charakteru výroby i požadovaných organoleptických vlastností se Ĝídí i výbČr vhodných þistých mlékaĜských kultur pro zajišĢování biochemických pochodĤ (3). Jogurty jsou kysané mléþné výrobky získané kysacím procesem z pasterovaného mléka s rĤzným obsahem mléþného tuku, za použití „jogurtové kultury“, která obsahuje mikroorganismy druhu Streptococcus salivarum ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrücki ssp. bulgaricus ve vhodném pomČru a vyvolává charakteristické biochemické zmČny (4). ýinnost Streptococcus salivarum ssp. thermophilus se uplatĖuje zejména na poþátku doby zrání, kdy produkuje rĤstové látky, které stimulují rĤst Lactobacillus delbrücki ssp. bulgaricus. Streptococcus thermophilus je znaþnČ citlivý vĤþi inhibiþním látkám, þasto dochází k oslabení jeho þinnosti, což zpĤsobí snížení jakosti finálního výrobku (1). Nepatrná peptonizaþní þinnost Lactobacillus bulgaricus je významná tím, že uvolĖuje nČkteré aminokyseliny z kaseinu a podporuje pokraþovací rĤst Streptococcus thermophilus po spotĜebování dĤležitých aminokyselin v mléce. Symbióza Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus zpĤsobuje vznik typického aroma, jehož hlavní složkou je acetaldehyd. Hlavním producentem acetaldehydu je Lactobacillus bulgaricus, ale ve smČsné kultuĜe se tvoĜí rychleji a ve vČtším množství. PomČr Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus (nejþastČji 1:1 þi 2:1)v jogurtové kultuĜe závisí na teplotČ, dobČ kultivace a množství inokula.Vyšší teplota a delší kultivaþní doba i vyšší množství inokula zpĤsobují vyšší podíl Lactobacillus bulgaricus, a tudíž i vyšší aromatiþnost výrobku. Nižší teplota a vyšší množství inokula zapĜíþiĖují zvýšený podíl Streptococcus thermophilus, což zpĤsobuje pomalé prokysávání a menší tvorbu aromatických látek. 208

Zákazníci jsou, bohužel, velmi málo informováni o tom, proþ vlastnČ jogurty – a obecnČ zakysané výrobky – jsou zdravé, co je toho podstatou, a podle jakých zásad by si je mČli vybírat, aby skuteþnČ pro jejich zdraví zaruþili doporuþované dieteticko-léþebné výhody (6). Jedním z ukazatelĤ, sloužících k opakovanému výbČru a konzumaci jogurtĤ spotĜebiteli, jsou senzorické vlastnosti výrobkĤ, podle nichž se bČžný spotĜebitel orientuje. Tyto vlastnosti se samozĜejmČ mČní v prĤbČhu doby skladování (minimální trvanlivosti). Avšak ne vždy jsou právČ tyto senzorické vlastnosti na konci doby minimální trvanlivosti odpovídající þerstvému výrobku. MATERIÁL A METODY Použitý materiál Pro mikrobiální rozbory a senzorické hodnocení bílých jogurtĤ byly použity vzorky od rĤzných výrobcĤ, kteĜí své produkty dodávají do maloobchodních i velkoobchodních sítí nejen na þeském trhu. Vzorky pocházely ze šarží po výrobČ a na konci doby minimální trvanlivosti v období mezi 20.12.2006 až 31.12.2006. Charakteristika vzorkĤ Vzorek 1: Moravia – bílý jogurt - výrobce: Moravia Lacto, a.s., Jihlava - složení: mléko, živá jogurtová kultura - obsah tuku: min. 3,5% Vzorek 2: Klasik – bílý jogurt se sníženým obsahem tuku - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: mléko, sušené odstĜedČné mléko, škrob, sušená syrovátka, želatina, živá jogurtová kultura - obsah tuku: ménČ než 3% Vzorek 3: Bio Via Natur – biojogurt bílý - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: mléko, škrob, sušené odstĜedČné mléko/sušená syrovátka - obsah tuku: nejménČ 3,2 % Vzorek 4: Silueta light jogurt – natur 0,1% tuku, bez cukru pro štíhlou linii - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: odstĜedČné mléko, sušené mléko, sušené odstĜedČné mléko, škrob, mléþné bílkoviny, želatina, živá jogurtová kultura - obsah tuku: nejvýše 0,1% Vzorek 5: Revital aktive bílý - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: mléko, sušené odstĜedČné mléko, škrob, mléþná bílkovina, želatina, inulín, jogurtová a probiotická kultura - obsah tuku: ménČ než 3% Vzorek 6: Smetanový jogurt bílý - výrobce: Mlékárna Valašské MeziĜíþí, spol. s r.o., Valašské MeziĜíþí - složení: smetana, živá jogurtová kultura - obsah tuku: 10% - známka KLASA Vzorek 7: Bílý jogurt z Valašska - výrobce: Mlékárna Valašské MeziĜíþí, spol. s r.o., Valašské MeziĜíþí - složení: mléko, sušené mléko, živá jogurtová kultura - obsah tuku: 3%

209

Použité metody Senzorická analýza Vzorky bílých jogurtĤ byly hodnoceny studenty Mendelovy zemČdČlské a lesnické univerzity v BrnČ, oboru Technologie potravin. Senzorické hodnocení probíhalo v senzorické laboratoĜi Ústavu technologie potravin, která splĖuje podmínky mezinárodní normy ISO 8589, pro vybavení místnosti, pĜípravy a pĜedkládání vzorkĤ (2). Vzorky jogurtĤ byly posuzovatelĤm pĜedloženy ihned po výrobČ (první den zaþátku doby minimální trvanlivosti) a následnČ v poslední den doby minimální trvanlivosti. V mezidobí byly skladovány pĜi teplotách doporuþených výrobcem, jež byly uvedeny na obalech. Vzorky byly podávány hodnotitelĤm vždy o stejném množství (30 g). Pro senzorickou analýzu byly použity formuláĜe s bodovými stupnicemi se slovním popisem jednotlivých bodĤ. Senzorické hodnocení jogurtĤ probíhalo se zamČĜením na vybrané vlastnosti. Mikrobiální analýza K rozborĤm byla odebírána celá spotĜebitelská balení. OdbČr vzorkĤ byl provádČn dle normy ýSN ISO 707 a jejich úprava dle normy ýSN ISO 8261. Stanovení celkového poþtu mikroorganismĤ (CPM) dle normy ýSN ISO 6610 Kultivace se provádí na pĤdČ PCA (Plate Count Agar) firmy NOACK, Francie, aerobnČ, po dobu 72 hod., pĜi teplotČ 30°C. Oþkování se provádí pĜelivem. Stanovení rodu Streptococcus dle normy ýSN ISO 9232 Kultivuje se na pĤdČ M17 + bakteriologický agar firmy MERCK, NČmecko, aerobnČ, po dobu 72 hod., pĜi teplotČ 37°C. Oþkování se provádí pĜelivem. Stanovení rodu Lactobacillus dle normy ýSN ISO 9232 Kultivace se provádí na pĤdČ MRS firmy NOACK, Francie, anaerobnČ, po dobu 72 hod., pĜi teplotČ 30°C. Oþkování se provádí pĜelivem. Analytické metody - stanovení titraþní kyselosti (SH) Stanovení titraþní kyselosti je jednou ze základních metod hodnocení mléþných výrobkĤ. Vychází ze spotĜeby odmČrného roztoku NaOH (0,25 mol*l-1) na neutralizaci kysele reagujících látek na indikátor fenolftalein ve 100 ml (100 g) vzorku.

VÝSLEDKY A DISKUZE U všech zkoušených vzorkĤ byly sledovány tyto deskriptory: uvolĖování syrovátky, viskozita, textura, vĤnČ, intenzita vĤnČ, chuĢ, kyselost, pĜítomnost cizích pĜíchutí, celkový dojem. Z tČchto deskriptorĤ byly vybrány a porovnávány u jednotlivých vzorkĤ takové, které jsou považovány pro spotĜebitele jako stČžejní. PĜi pozitivním ohodnocení tČchto deskriptorĤ se zvyšuje pravdČpodobnost, že konzument bude nákup opakovat. Senzorická zkouška se provádČla vždy na zaþátku a na konci doby trvanlivosti, každého hodnocení se zúþastnilo 10 hodnotitelĤ. Bílý jogurt z Valašska VĤnČ byla na zaþátku i na konci doby skladování ohodnocena velmi kladnČ. Na poþátku byla oznaþena 5 hodnotiteli z 10 jako „velmi pĜíjemná, typická pro daný výrobek“, na konci doby skladování ji stejnČ ohodnotili 3 posuzovatelé. ChuĢ se nepatrnČ zhoršila, zatímco ji na zaþátku 7 hodnotitelĤ oznaþilo jako „ typickou, dosti pĜíjemnou“ na konci jich bylo 5, i když v jednom pĜípadČ byla chuĢ posouzena lépe – „velmi pĜíjemná, typická pro daný výrobek“. Kyselost v prĤbČhu skladování vzrostla a na konci byla vČtšinou posuzována jako „prĤmČrná, dostateþnČ kyselá“. Celkový dojem z daného výrobku se zhoršil. Na poþátku skladování jej 4 hodnotitelé oznaþili jako „velmi dobrý, lahodný“, na konci byl vzorek takto ohodnocen pouze v jednom pĜípadČ. 210

Smetanový jogurt bílý Tento jogurt si po celou dobu skladování udržoval velmi dobré vlastnosti. VĤnČ se témČĜ nezmČnila. Na poþátku byla hodnocena od „typické pro daný výrobek, velmi pĜíjemná“ pĜes „dosti pĜíjemná“ až po „prĤmČrná, ještČ vyhovující“, na konci skladování byla vĤnČ ve všech pĜípadech oznaþena jako „typická pro daný výrobek, velmi pĜíjemná“ a „dosti pĜíjemná“. ChuĢ se mírnČ zlepšila a témČĜ ve 100% byla srovnatelná na zaþátku i na konci, ani v jednom pĜípadČ nebyla hodnocena hĤĜe než „prĤmČrná, ještČ pĜíjemná“. Kyselost v prĤbČhu skladování klesla. Celkový dojem je srovnatelný jak na zaþátku tak na konci. BČhem skladování si výrobek udržel své vlastnosti a jeho senzorická kvalita nebyla zmČnČna, což je velmi pozitivní pro spotĜebitele a dĤležité pro opakovanou koupi. Titraþní kyselost u vzorku smetanového jogurtu byla nejnižší, což mohlo být zpĤsobeno obsahem tuku 10%. Klasik U vĤnČ došlo ke zhoršení, zatímco na zaþátku byla vĤnČ oznaþena 8 hodnotiteli jako „dosti pĜíjemná“ na konci tento poþet poklesl na 5. ChuĢ se v prĤbČhu skladování zhoršila, Kyselost zĤstala témČĜ srovnatelná a na konci ji 2 hodnotitelé ohodnocena jako „silnČ kyselá“. Celkový dojem se zhoršil, polovina respondentĤ tento vzorek oznaþila body „prĤmČrný“ a „ne zcela uspokojivý“. Silueta light VĤnČ byla po dobu minimální trvanlivosti srovnatelná. Hodnocení chuti se na poþátku pohybovalo v rozmení „velmi pĜíjemná, typická pro daný výrobek“ po „prĤmČrná, ještČ pĜíjemná“, na konci byla uplatnČná stupnice „typická, dosti pĜíjemná“ po „témČĜ nevyhovující, témČĜ nepĜíjemná“. Nejvyšší þetnost v obou pĜípadech je u bodu „prĤmČrná, ještČ pĜíjemná“. Kyselost výraznČji klesla a na konci skladování byla ohodnocena také jako „velmi slabá“. Celkový dojem se zhoršil. Na zaþátku je nejvyšší þetnost u hodnoty „velmi dobrý, lahodný“ a „ lepší než prĤmČrný“, zatímco na konci se hodnocení pohybovalo v mezích „lepší než prĤmČrný“ a „prĤmČrný“. Revital VĤnČ se bČhem skladování zhoršila. Na zaþátku byla ohodnocena nejþastČji jako „typická pro daný výrobek, velmi pĜíjemná“ a „dosti pĜíjemná“, na konci byla nejvČtší þetnost u bodu „prĤmČrná, ještČ pĜíjemná“. Docházelo též k výraznému uvolĖování syrovátky na konci doby skladování. U chuti došlo k nepatrnému zhoršení. Kyselost na zaþátku i na konci byla srovnatelná. Cekový dojem se zhoršil. Na zaþátku 7 z 10 posuzovatelĤ oznaþilo celkový dojem jako „velmi lahodný, lahodný“, na konci skladování byl stejnČ ohodnocen pouze ve 3 pĜípadech a jedním hodnotitelem byl oznaþen jako „ne zcela uspokojivý“. Moravia Na zaþátku oznaþilo 8 z 10 hodnotitelĤ vĤni jako „typickou pro daný výrobek, velmi pĜíjemnou“, na konci ji stejnČ ohodnotil pouze 1 z 10 posuzovatelĤ. PĜesto se hodnocení ve všech pĜípadech pohybovalo do hodnoty „prĤmČrná, ještČ pĜíjemná“ a nebyl ani jeden vzorek hodnocen jako „skoro nevyhovující, málo pĜíjemná“ nebo „nevyhovující, netypická, nepĜíjemná, cizí pachy“. ChuĢ se výraznČ zhoršila. Zatímco na zaþátku 5 hodnotitelĤ z 10 oznaþili chuĢ jako „velmi pĜíjemnou, typickou pro daný výrobek“, na konci takto nebyl ohodnocen ani jednou, 3 z 10 posuzovatelĤ urþili chuĢ jako „témČĜ nevyhovující, témČĜ nepĜíjemná“. Kyselost se v prĤbČhu skladování þásteþnČ zvýšila. Celkový dojem se pohyboval na poþátku v rozmezí „vynikající, lahodný, harmonický“ až po „lepší než prĤmČrný“. Na konci se hodnocení pohybovalo od „lepší než prĤmČrný“ pĜes „prĤmČrný“ po „ne zcela uspokojivý“. Titraþní kyselost byla u tohoto vzorku nejvyšší. Bio Via Natur U tohoto vzorku došlo v prĤbČhu skladování k viditelnému uvolĖování syrovátky a naprostá vČtšina hodnotitelĤ tuto vadu charakterizovala. VĤnČ se mírnČ zhoršila. ChuĢ na zaþátku i na konci se pohybovala témČĜ v celé škále hodnotitelské stupnice. Na konci byla chuĢ ve dvou 211

pĜípadech ohodnocena jako „nevyhovující, nepĜíjemná, netypická pro daný výrobek“. Kyselost se zvýšila. Celkový dojem se zhoršil a na konci se pohyboval od hodnoty „lepší než prĤmČrný“ po „velmi špatný“. SamozĜejmČ by tento výsledek senzorického hodnocení mČl být alarmující pro výrobce i spotĜebitele. Vyhláška 77/ 2003 Sb., ve znČní pozdČjších zmČn a pĜedpisĤ, kterou se stanoví požadavky na mléko a mléþné výrobky, mražené krémy, jedlé tuky a oleje vymezuje požadavky na jogurty a podle ní má 1 g jogurtu obsahovat nejménČ 107 mléþné mikroflóry. Ve všech vzorcích byl tento limit dodržen. Pro CPM není limit vyhláškou stanoven, avšak jeho stanovení je významné, jako základní informace o stupni mikrobiální kontaminace nejen mléka jako vstupní suroviny, ale i hotových výrobkĤ. Z výsledkĤ lze usuzovat na dodržení technologických a hygienických postupĤ pĜi výrobČ a je možno urþit pravdČpodobnou trvanlivost a zjistit poþínající zkázu potravin.

ZÁVċR V souboru vzorkĤ, které byly hodnoceny se vyskytovalo pČt, se srovnatelným obsahem tuku (cca 3%), jeden vzorek – smetanový jogurt bílý – s obsahem tuku 10% a jeden jogurt Silueta light s obsahem tuku 0,1%. Dva poslední vzorky zde byly uvedeny pro srovnání. Podstatné zmČny pĜi mikrobiální i senzorické analýze byly zjištČny u dvou vzorkĤ. Patrný rozdíl – nárĤst – CPM byl zaznamenán u dvou vzorkĤ, a to Klasik a Bio Via Natur, kde narostlé kolonie v sedmém a osmém ĜedČní byly na konci doby trvanlivosti již nepoþitatelné. U tČchto dvou vzorkĤ došlo v prĤbČhu doby skladování též k nárĤstu poþtu streptokokĤ. Tímto nárĤstem mohl být ovlivnČn celkový poþet mikroorganismĤ. Poþet laktobacilĤ se snížil. U obou vzorkĤ došlo také ke zhoršení senzorických vlastností. Syrovátka se uvolĖovala v nepatrném množství již pĜi hodnocení ihned po výrobČ, a pĜi následné senzorické analýze na konci doby skladování došlo k jejímu výraznému uvolĖování. Tento jev mohl být zpĤsoben pĜídavkem sušené syrovátky do obou výrobkĤ. V ostatních vzorcích se sušená syrovátka nevyskytovala. Všechny uvedené parametry mohly výraznČ ovlivnit senzorické vlastnosti, protože také chuĢ a celkový dojem byly pĜi senzorickém hodnocení u výrobkĤ Klasik a Bio Via Natur nejhorší . Výsledky tohoto hodnocení by mČly být nejen informací pro spotĜebitele, dle jakých parametrĤ si mají vybírat jogurty v tak velké škále nabídek, ale také pro výrobce, neboĢ nízká senzorická kvalita potravináĜských výrobkĤ rozhoduje o obchodovatelnosti jejich zboží. Použitá literatura: 1. GAJDģŠEK, S. Mlékárenství II. Brno: MZLU, 2000. 142 s. ISBN 80-7157-342-6. 2. JAROŠOVÁ, A. Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno: MZLU, 2001. 84 s. ISBN 80-7157-539-9. 3. HYLMAR, B. Výroba kysaných mléþných výrobkĤ. Nakladatelství technické literatury, 1986, s. 209 4. SNÁŠELOVÁ, J., DOSTÁLOVÁ, L. Jogurty v naší výživ, Spoleþnost pro výživu, 54, 1999, s. 39-40 5. SIMEONOVONÁ, J., INGR, I., GAJDģŠEK, S. Zpracování a zbožíznalství živoþišných produktĤ. 1. vyd. Brno: MZLU, 2003. 124 s. ISBN 80-7157-708-1. 6. KROOVÁ, H. Jogurtový receptáĜ. Milcom servis, a.s., Praha, 1992, 39 s. Kontaktní adresa Ing. Hana Šulcerová, Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno tel.: 545 133 337, e-mail: [email protected].

212

VIRTUÁLNÍ REALITA V ELEKTRONICKÝCH POTRAVINÁěSKÝCH DATABÁZÍCH Uvíra Roman1, Pudil František1, Maryška Martin2 1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav skla a keramiky, VŠCHT Praha Virtual reality in electronic food databases Summary: With the full advantage of LUCIA G 5.0 software image analyser (Laboratory Imaging, Czech Republic) an image database for foods and food products is being developed within our workgroup. Virtual image documentation is also included in the database. Contribution of 3D focusing and three-dimensional imaging (through anaglyphs and 3D models), which create electronic virtual reality for reviewing food quality and for commodity expertise, is discussed on characteristic examples of ripening cheese.

Úvod Virtuální realitu chápeme jako umČlé prostĜedí vytvoĜené poþítaþi. PĜestože je umČlé, umožĖuje nám simulovat reálné systémy, jejich vlastnosti a dČje v nich probíhající 1. Pokroþilá virtuální realita vyžaduje zatím dosti drahé vybavení (pĜilby se stereoskopickými displeji a prostorovým zvukem, rukavice s hmatovými senzory, atd.) a odpovídající technické zázemí, a proto není zatím pĜíliš rozšíĜená mimo oblast vojenského a zábavního prĤmyslu. Zjednodušené virtuální prostĜedí je realizovatelné i na bČžném poþítaþi, kde pĜes vhodné zobrazovací zaĜízení (monitor, projekce, brýle) do virtuálního prostoru „vstupujeme“ a nČjakým zpĤsobem (napĜ. myší a klávesnicí) s ním interagujeme 2. Hlavním cílem tČchto technologií je intenzivnČjší a vČrohodnČjší pĤsobení na smysly þlovČka. Na rĤzných úrovních nachází virtuální realita široké uplatnČní ve vojenství (letecké a jiné simulátory), medicínČ, biologii, strojírenství (CAD aplikace), zábavním prĤmyslu (3D poþítaþové hry), atd. Typickým pĜíkladem „reálného“ využití virtuální reality je virtuální mikroskopie. Virtuální mikroskopie je prezentací digitalizovaných obrazĤ mikroskopických preparátĤ (které již fyzicky nemusí existovat) prostĜednictvím výpoþetní techniky 345. S obrazy mĤžeme manipulovat jako bychom sedČli u reálného mikroskopu. Navíc mĤžeme využívat rĤzná zobrazení a projekce. Virtuální mikroskopický obraz mĤže mít díky speciálnímu zpracování pĤvodních snímkĤ podstatnČ vyšší hloubku ostrosti než dovoluje samotný mikroskop. Ovšem nezobrazuje se právČ existující fyzický objekt, ale prezentují se elektronická data získaná jeho pĜedchozím snímáním a zpracováním. Jedním druhem virtuální reality jsou vizualizované snímky z pro þlovČka neviditelných oblastí spektra (UV, IR, apod.). NejvČtším pĜínosem technologií virtuální reality je možnost vidČt, prezentovat nebo modelovat vČci, které reálnČ vidČt není možné. Taková virtuální realita není pouze poþítaþem vygenerovaná fikce, ale je to urþitý jednoznaþný odraz reálnČ existujícího svČta. V potravináĜství je virtuální realita využívána v obrazové analýze pĜi studiu mikroorganismĤ 6, vlastností materiálĤ 7 nebo potravináĜských parazitĤ 8. Cílem práce bylo na pĜíkladech jednodušších virtuálních obrazových dokumentĤ zachycujících typické objekty plísĖových sýrĤ posoudit možnosti jejich využití v odborných potravináĜských aplikacích.

213

Materiál a metody Virtuální obrazová dokumentace byla vytvoĜena z fotografií plísĖových sýrĤ Fourme d’Ambert (distributor Laktoimpex, ýeská Republika) a Lazur perlový Pearl (Spóádzielna Mleczarska Lazur, Polsko) zakoupených v obchodním ĜetČzci Delvita. Materiál byl snímán tĜíþipovou TV kamerou Hitachi HV-C20 (Hitachi, Japonsko) s objektivem s promČnnou ohniskovou vzdáleností Navitar Macro Zoom (Navitar, USA). OsvČtlení bylo zajištČno soustavou osvČtlovacích prvkĤ Kaiser RB 5000 DL (Kaiser, NČmecko) a prosvČtlovací skĜíní Hama LP5000 K (Hama, NČmecko). Pro snímání objektĤ byla využita poslední verze softwaru pro obrazovou analýzu Lucia G 5.0 (Laboratory Imaging, ýeská Republika) obsahující modul RozšíĜené hloubky ostrosti, který umožĖuje tvorbu virtuálních obrazĤ. Výsledky Snímáním objektĤ pĜi velkém optickém pĜiblížení dochází ve smČru Z-osy k hloubkovému rozostĜení, kdy je zaostĜená pouze þást objektu v rovinČ. Jemnou regulací objektivem a snímáním jednotlivých zaostĜených rovin byly vytvoĜeny sekvence þásteþnČ zaostĜených obrazĤ jednotlivých objektĤ plísĖových sýrĤ ((d) (e) (f) Obr. 1a-1c). Modul RozšíĜené hloubky ostrosti dokáže takto vytvoĜené sekvence snímkĤ zaostĜených na rĤzných hladinách slouþit do jednoho obrazu s mnohem vČtší hloubkou ostrosti (tzv. 3D zaostĜování). Výsledný obraz lze prezentovat tĜemi zpĤsoby: jako standardní barevný obraz ((d) (e) (f) Obr. 1d), jako prostorový anaglyf ((d) (e) (f) Obr. 1e) nebo jako 3D model ((d) (e) (f) Obr. 1f). Objekty na anaglyfech mají dvojí barevné kontury, jejichž pozorováním pĜes odpovídající filtry (dvoubarevné brýle) vzniká vČrohodný prostorový dojem 9. 3D modely, které lze v Lucia G 5.0 zkoumat pomocí vestavČného prohlížeþe, simulují povrch snímaného objektu vystupujícího do prostoru. Vybrané virtuální obrazy plísĖových sýrĤ v rĤzných formách jsou prezentovány na Obr. 2a-2f.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Obr. 1. Ukázková sekvence obrazĤ plísĖového sýru Fourmet d’Ambert demonstrující použitou techniku a možnosti výstupních forem. Obrazy s rĤznou hloubkou ostrosti (a-c), výsledný zaostĜený obraz (d), prostorový anaglyf - pro trojrozmČrný vjem je zapotĜebí brýlí s barevnými filtry (e), 3D model (f). 214

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f) Obr. 2. Vybrané virtuální obrazy plísĖových sýrĤ – Fourmet d’Ambert (a-c), Lazur Pearl (d-f).

215

ZávČr Je zĜejmé, že uvedené techniky virtuální reality pĜinášejí Ĝadu dalších možností pro studium potravináĜských materiálĤ a pro pĜípravu elektronických obrazových dokumentací. Mohou významnČ obohatit rĤzné zbožíznalecké obrazové databáze, jako napĜ. databáze koĜení, potravináĜských mikroorganismĤ, parazitĤ, atd. Plnohodnotné využití technologií virtuální reality pĜinese v budoucnu v mnoha odvČtvích aspekty, které jsou v dnešní dobČ pro mnohé lidi tČžko pĜedstavitelné.

Literatura a internetové zdroje [cit. 06.01.2007] 1. http://en.wikipedia.org/wiki/Virtual_reality 2. http://omicron.felk.cvut.cz/~bobr/ucspoc/virtreal.htm 3. Helin H. O., Lundin M. E., Laakso M., Lundin J., Helin H. J., Isola J.: Virtual Microscopy in Prostate Histopathology: Simultaneous Viewing of Biopsies Stained Sequentially With Hematoxylin and Eosin, and Į-Methylacyl-Coenzyme A Racemase/p63 Immunohistochemistry, The Journal of Urology 175 (2), str. 495-499, (2006). 4. http://neuroinformatica.com/ 5. Kobayashi N., Hosoya T., Adachi M., Haku T., Yamaguchi K.: Virtual MR microscopy for unruptured aneurysm, Computer Methods and Programs in Biomedicine 66 (1), str. 99-103, (2001). 6. http://education.denniskunkel.com/catalog/index.php?cPath=5 7. http://microscopy.fsu.edu/micro/gallery/flavors/flavor.html 8. http://education.denniskunkel.com/catalog/product_info.php?products_id=473 9. http://en.wikipedia.org/wiki/Anaglyph_image 10. Uvíra R., Pudil F.: Anaglyfy v odborných potravináĜských dokumentech, Sborník pĜíspČvkĤ, XXXVII. Symposium o nových smČrech výroby a hodnocení potravin, Skalský DvĤr 29.531.5.2006. 11. Pittet J.-J., Henn Ch., Engel A., Heymann J. B.: Visualizing 3D Data Obtained from Microscopy on the Internet, Journal of Structural Biology 125, str. 123–132, (1999). Kontaktní adresa: Ing. Roman Uvíra, Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628

216

HOUBOVÉ AROMA V TAVENÝCH SÝRECH Pudil František1, Uvíra Roman1, Janda Václav2 1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav technologie vody a prostĜedí, VŠCHT Praha Mushroom flavour in processed cheese Summary: Processed cheese flavouring is known to be one of the traditional ways of increasing product attractivity and distribution. Fresh (cultivated) mushrooms, dried mushrooms, mushroom flavour products or synthetic additives are suitable for mushroom flavour acquisition. Typical mushroom flavour of fresh sporocarps is caused by the „mushroom alcohol“ 1-octen-3-ol. Volatile compounds of two samples, „Tavený sýr se žampiony (processed cheese with champion mushrooms)“ and „Tavený sýr lahĤdkový roztíratelný (same cheese with no champion mushrooms)“ (both Delvita, Czech republic), were thoroughly analyzed using GC/MS chromatography. Volatile compounds were isolated using SPME technique. Mushroom flavour in the sample of the processed cheese with champion mushrooms is caused by the presence of 1-octen-3-ol, which was apparently a part of a flavouring additive. Presence of other natural mushroom flavour components was not proved reliably.

Úvod Ochucování tavených sýrĤ patĜí k tradiþním zpĤsobĤm zvýšení atraktivity výrobku a rozšíĜení sortimentu. Pro získání houbové pĜíchuti je možno využít þerstvých (pČstovaných) hub, sušených hub, houbových koĜenících pĜípravkĤ nebo synthetických pĜísad. Typické houbové aroma þerstvých hub zpĤsobuje tzv. „houbový alkohol“ 1-okten-3-ol 1,2. V pĜírodních produktech pĜevažuje (R)-(-)-1-okten-3-ol, zatímco (S)-(+)-1-okten-3-ol bývá zastoupen jen nepatrnČ3. V synthetických houbových aromatech bývají oba enantiomery ve srovnatelném množství. Materiál a metody DetailnČ byl analyzován „Tavený sýr se žampiony“ a „Tavený sýr lahĤdkový roztíratelný“ (oba Delvita, ýeská Republika)(Obr. 1). Pro srovnání byl použit pĜírodní sýr s bílou plísní „Bonifaz Waldpilze“ (Bergader Privatkäserei, NČmecko).

Obr. 1. Etikety analyzovaných vzorkĤ tavených sýrĤ. Analýza tČkavých látek sýrĤ byla provádČna plynovou chromatografií ve spojení s hmotnostní spektrometrií na pĜístroji Fisons Instruments GC 8000 s hmotnostním detektorem MSD 800 (Fisons Instruments, Itálie). Pro separaci tČkavých látek byla zvolena kapilární kolona 30 m × 0,32 mm se stacionární fází TR-5 s tloušĢkou filmu 1 ȝm (Thermo Fisher Scientific, USA). Teplota kolony byla programována od 50 °C (2 min izotermní prodleva) do 220 °C rychlostí 5 °C/min. Teplota nástĜiku byla 230 °C. Nosným plynem bylo helium. Energie ionizujících elektronĤ byla 70eV. 217

Vzorek byl nastĜikován technikou SPME po adsorpci na vlákno se zakotvenou fází 65 ȝm CarbowaxTM – divinylbenzene (Supelco Park, USA). TČkavé látky z þerstvČ rozbaleného sýru umístČného do uzavĜené vialky byly izolovány pĜi teplotČ 60 °C po dobu 30 min. Pro identifikaci látek byla využita knihovna hmotnostních spekter NIST (NIST, Velká Británie). Výsledky a diskuse Porovnání GC-MS analýz obou podobných vzorkĤ tavených sýrĤ je na Obr. 2 a identifikované tČkavé látky ze vzorku s pĜídavkem žampionĤ jsou shrnuty v Tabulka I. Identifikace hlavní složky houbového aroma 1-okten-3-olu ve vzorku „Tavený sýr se žampiony“ je na Obr. 3. 7TSN1 1.695

100

16.793 16.848

2.777 %

Scan E TIC 6.10e RT

22.746 26.910 32.340

3.208 4.923 6.969 7.602

10.354

16.343

31.680

26.497

20.728

13.13314.307

28.20331.092

20.425

37.522 38.329 36.449 33.872

10 7TSZ3 1.640

100

10.564 16.756

3.190 %

26.910 32.339

10.317

4.043 7.629 5.079 6.639

11

Scan E TIC 3.95e RT

22.755

20.727 22.984 26.506 13.14214.316 14.83017.618 19.93920.874

33.862 31.596 34.797 28.606 31.092

37.531 38.347

rt 2.000 4.000 6.000 8.000 10.00012.00014.00016.00018.000 20.00022.00024.00026.00028.00030.00032.00034.00036.00038.00040.000

Obr. 2. GC-MS analýzy tČkavých látek vzorkĤ „Tavený sýr lahĤdkový roztíratelný“ (nahoĜe) a „Tavený sýr se žampiony“ (dole). Identifikované složky viz Tabulka I. 7TSZ2 1140 (10.482) Cm (1140-(1135+1147)) 1.29e5

57

100

%

27

41 43

29 31

39

44

54

55

72

58

67

73

0 F:959

81

85

95

99

110

WILEY 6880: 1-OCTEN-3-OL Hit 3

57

100

% 27

29

41 43 54

39 31 0

44

38

53

58

65

72

67

73

81

85

95

99

110

100

110

m/z 20

30

40

50

60

70

80

90

120

130

140

Obr. 3. Hmotnostní spektrum 1-okten-3-olu identifikovaného ve vzorku houbového taveného sýra (nahoĜe) ve srovnání s referenþním spektrem z knihovny (dole). KromČ toho zde byla identifikována Ĝada dalších látek, ale pro houbové aroma má zĜejmČ význam jen obsah 1-okten-3-olu. Skupina volných mastných kyselin a 2-ketonĤ a aldehydĤ nalezená v obou vzorcích je typická pro tento druh výrobku. Blíže neidentifikované laktony jsou pravdČpodobnČ produkty vzniklé tepelným úþinkem z odpovídajících hydroxyderivátĤ a jsou také hojnČ zastoupeny v obou vzorcích. To je pĜípad i 2-fenylacetaldehydu, který se sice bČžnČ vyskytuje v houbových aromatech, ale pĜítomnost v obou vzorcích nasvČdþuje tomu, že jeho pĤvod je zde jiný. 218

Tabulka I Složky identifikované metodou GC-MS ve vzorku „Tavený sýr se žampiony“, retenþní þasy Rt odpovídají hodnotám v Obr. 2. Rt (min) Identifikovaná složka Poznámka 1,640 kyselina octová 1,768 ethyl-acetát 2,722 kyselina propionová 3,190 3-methylbutanal smČsný pík 4,419 kyselina valerová 4,703 butandiol 1,3 ? 4,942 butandiol 2,3 ? 5,079 hexanal 6,639 2-furylmethanol ? 7,629 2-heptanon 10,317 kyselina kapronová 10,564 1-okten-3-ol „houbový alkohol“ 10,904 1-pentylfuran 11,436 oktanal 13,142 2-fenylacetaldehyd 13,518 kyselina enanthová 14,316 2-nonanon 14,830 nonanal 16,756 kyselina kaprylová 17,618 dodekan ? 18,618 2,4-nonadienal 19,939 2-decenal 20,727 2-undekanon 20,874 lakton ? 22,755 kyselina kaprinová 22,984 2-undecenal 26,506 2-tridekanon 26,910 lakton ? C8 28,258 kyselina laurová ? 28,606 undekanol 29,276 ftalát kontaminant 31,596 lakton ? 31,679 2-pentadekanon 32,339 lakton ? 36,458 2-heptadekanon 37,531 lakton ? 38,347 ftalát kontaminant ? – neúplná nebo nejistá identifikace Ve vzorku „Tavený sýr lahĤdkový roztíratelný“ byl navíc nalezen maltol (Rt = 15,279), jeho hydroxyderivát (Rt = 1,343) a další cyklický karbonylový derivát (Rt = 13,821, možná methylcyklopentatrion). Tyto komponenty zĜejmČ pocházejí ze sacharidických prekurzorĤ, které u sýra s houbovou pĜíchutí nebyly použity. Z detailního porovnání GC-MS analýz taveného a plísĖového „houbového“ sýra „Bonifaz“ (Obr. 4) je vidČt, že i v plísĖovém sýru je významnou komponentou 1-okten-3-ol (Rt = 10,528), ale jsou zde pĜítomny i další dvČ složky, které se v pĜírodních houbových aromatech bČžnČ vyskytují, tj. 3-oktanon (Rt = 10,748) a 3-oktanol (Rt = 11,087). Všechny tyto látky mohou být též alespoĖ þásteþnČ produkty metabolismu pĜítomných plísní. 219

7TSZ2

Scan EI+ TIC 5.50e5 RT

10.482

100

10.198

10.354

%

0 Scan EI+ TIC 7.88e5 RT

7BONZ2 10.528

100

% 10.354

10.748 11.087

0 10.000

10.100

10.200

10.300

10.400

10.500

10.600

10.700

10.800

10.900

11.000

11.100

rt 11.200

Obr. 4. Detail GC-MS analýzy tČkavých látek ze vzorkĤ „Tavený sýr se žampiony“ (nahoĜe) a „Bonifaz Waldpilze“ (dole).

ZávČry Houbové aroma vzorku taveného sýra se žampiony je zpĤsobeno pĜítomností 1-okten-3-olu, který byl zĜejmČ souþástí aromatizaþní pĜísady. Nebyla spolehlivČ prokázána pĜítomnost dalších komponent pĜítomných v pĜírodních houbových aromatech. Literatura 1. Maga J. A.: Mushroom flavor, Journal of Agriculture and Food Chemistry 29, str. 1-4, (1981). 2. Mosandl A., Heusinger G., Gessner M.: Analytical and sensory differentiation of 1-octen-3-ol enantiomers, Journal of Agriculture and Food Chemistry 34, str. 119-122, (1986). 3. Zawirska-Wojtasiak, R.: Optical purity of (R)-(-)-1-octen-3-ol in the aroma of various species of edible mushrooms, Food Chemistry 86, str. 113-118, (2004). Kontaktní adresa: Ing. Roman Uvíra, Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Prof. Ing. Václav Janda, CSc., Ústav technologie vody a prostĜedí, [email protected] Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628

220

VLIV GENETICKÝCH VARIANT KASEINU NA VÝTċŽNOST PěI VÝROBċ SÝRģ Legarová Veronika, KouĜimská Lenka Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze The effect of casein genetic varieties on the yield during cheesemaking Summary: The aim of this work was to evaluate the dependence of some technological characteristics of Holstein cattle on the kappa-casein genotype. Kappa-casein is a milk protein that does not pass to whey after milk coagulating, yet it remains in cheese, thus contributing to the basic yield of cheese as well as other technological properties, especially the curdling ability of milk, coagulation, syneresis (liberation of whey from junket), etc. Milk with favourable cheese-making properties is prerequisite for the higher yield of cheese with a required composition. Proteins are one of the basic milk components. The quality and quantity of the proteins rank among the most significant indicators of cheese yield. The principal technological property of milk is curdling. This is the ability of milk to curdle with the curdling agent to produce junket of desired qualities. The ability to separate whey (syneresis) during the time of junket formation is another indicator determining the suitability of milk for cheese production. The yield proper depends on the dry matter units that are transferred into cheese from one kilogram of milk.

Úvod Byl zkoumán vliv genetických variant kappa-kaseinu na výtČžnost pĜi výrobČ sýrĤ. Cílem práce bylo posouzení závislosti nČkterých technologických vlastností na genotypu kappa-kaseinu. Prekursorem mléþných bílkovin je v bachoru se utváĜející kyselina propionová. Bílkoviny mléka jsou výsledným produktem biosyntetických procesĤ v mléþné žláze, kdy je syntetizováno a dále merokrinním zpĤsobem vyluþováno šest hlavních mléþných bílkovin: alfa S1 - kasein (DS1 - CN), alfa S2 - kasein (DS2 - CN), beta - kasein (E - CN) a kappa - kasein (N - CN), dále beta laktoglobulin (E - LG) a alfa - laktalbumin (D - LA). Ostatní bílkovinné frakce (bovinní sérový albumin nebo imunoglobuliny) pĜecházejí do mléka z krve. U mléþných bílkovin bylo popsáno nČkolik desítek genetických variant. Všechny bílkoviny mléka jsou polymorfní. Polymorfizmus mléþných bílkovin je výsledkem substitucí, inzercí a delecí aminokyselin. Poznatky o genetickém polymorfizmu mléþných bílkovin a jeho vztazích k chemickému složení mléka, užitkovým a reprodukþním vlastnostem dojnic jsou významné nejen z hlediska šlechtČní, ale též z hlediska efektivního zpracování mléka.1 Kasein je mléþná bílkovina, která je syntetizována v ribozomech endoplazmatického retikula bunČk mléþné žlázy a je transportován do Golgiho aparátu, kde je fosforylován pravdČpodobnČ pĜednostnČ pĜi utváĜení micelárních jednotek, které tvoĜí kaseinovou micelu. Kaseinové micely jsou tvoĜeny komplikovanými bílkovinnými strukturami uspoĜádanými v kulovitých þásticích s množstvím kanálkĤ a dutinek vyplnČných vodnou fází. Tím se vysvČtluje vysoká hydratace kaseinové micely (2 – 2,5g vody na 1g bílkoviny).1 PĜi výrobČ sýrĤ, dochází pĤsobením rĤzných bakterií rodu Streptococcus a Laktobacillus k okyselení mléka na pH zhruba 5,5. V této fázi kvašení se pĜidává proteolytický enzym chymosin (syĜidlo). PĤsobením enzymu dojde ke specifické hydrolýze PĤsobením enzymu dojde k specifické hydrolýze N-kaseinu témČĜ výhradnČ v urþité peptidové vazbČ a molekula se rozštČpí na dvČ þásti a to: para-N-kasein a N-kaseinmakropeptid. Vzniklý para-N-kasein (protein složený ze 105 aminokyselin) obsahuje hydrofobní þást molekuly N-kaseinu. ZĤstává proto souþástí kaseinových micel, ale na rozdíl od nativního N-kaseinu zde již nemá ochrannou funkci. Mezi micelami vznikají silné vazby a za úþasti Ca2+ iontĤ dojde k vysrážení kaseinĤ (sýĜeniny). Zbytek molekuly je

221

N-kaseinmakropeptid, glykopeptid složený ze 64 zbytkĤ aminokyselin. Obsahuje hydrofilní þást molekuly N-kaseinu s vázanými oligosacharidy, a proto pĜechází do syrovátky.2 Kappa-kasein (N-CN) se skládá z jedné hlavní bezcukerné složky a minimálnČ šesti malých složek. Kappa-kasein je menší smČs polymerĤ spojených intermolekulárními disulfidickými mĤstky. Primární struktura hlavní bezcukerné složky je tvoĜena 169 aminokyselinami. ObdobnČ jako pĜedchozí složky má kyselou povahu. Vzhledem k tomu, že kappa-kasein podmiĖuje stabilitu kaseinového komplexu vþetnČ syrovátkových bílkovin, pĜedstavuje kappa-kasein výjimeþnou složku mezi kaseiny. V molekulách malých složek kaseinu je kromČ fosforu obsažena rovnČž kyselina A-acetylneuraminová, galaktóza a galaktosamin. Kappa-kasein je jedinou frakcí kaseinu, která obsahuje sirné aminokyseliny (cystein a methionin) a jako jediná kaseinová frakce se nesráží vápenatými ionty. Je jedinou bílkovinnou frakcí, která je v poþáteþní fázi pĤsobení syĜidla štČpena chymosinem. Jsou popsány polymorfní genetické varianty N-CN A, B, C, E, F a G. U vČtšiny plemen je varianta A predominantní.1

Technologické vlastnosti mléka z hlediska výroby sýrĤ Technologické vlastnosti mléka z hlediska výroby sýrĤ jsou podmínČny Ĝadou faktorĤ a mají vliv na jakost sýrĤ a ekonomiku výroby. Vliv genetického polymorfizmu bílkovin na složení mléka je popisován u fenotypĤ jednotlivých kaseinových frakcí, E-laktoglobulinu, u stupnČ glykosylace N-kaseinu, u obsahu minerálních látek, zejména vápníku a u velikosti kaseinových micel.3 Tabulka I: Vliv genetické varianty N-CN a E-LG na technologické vlastnosti mléka4 genetická varianta: A B kappa-kasein obsah bílkovin * vyšší kaseinové þíslo * vyšší þas sýĜení * kratší syneréze * rychlejší tuhost sraženiny * vyšší výtČžnost sýrĤ vyšší beta-laktoglobulin obsah bílkovin kaseinové þíslo tuhost sraženiny výtČžnost sýrĤ

* * * *

vyšší vyšší vyšší vyšší

* = ve srovnání s

Z hlediska zpracování mléka na sýry je dĤležitá jeho syĜitelnost. Je to schopnost mléka srážet se syĜidlem a tvoĜit sýĜeninu požadovaných vlastností. SyĜitelnost je v prvé ĜadČ podmínČna obsahem vápníku v mléce, zejména jeho ionizované formy, množstvím kaseinu a zastoupením jeho jednotlivých frakcí v kaseinové micele, hodnotou pH apod. Faktory, které ovlivĖují syĜitelnost ovlivĖují také tvorbu a pevnost sýĜeniny, ale oba vlivy nemusí být vždy paralelní. Je všeobecnČ známo, že vyšší titraþní kyselost (nižší pH) zlepšuje syĜitelnost i tvorbu a pevnost sýĜeniny, ale pevnost sýĜeniny stoupá s poklesem pH až do maxima pĜi pH 5,8. PĜi nižších hodnotách pH pevnost sýĜeniny rapidnČ klesá (zaþíná pĜevažovat kyselé srážení a sraženina má zcela jiný charakter) zatímco syĜitelnost se trvale zkracuje.5 222

Mléka s dobrou syĜitelností obsahují pĜevážnČ genetické varianty typu B-E-kaseinu, B-N-kaseinu a B-E-laktoglobulinu, zatímco mléka s horší syĜitelností a vČtší termostabilitou obsahují bílkovinné varianty A. Normální obsah kaseinu 2,6 % je dobrým pĜedpokladem dobré syĜitelnosti mléka, zvýšený obsah imunních globulinĤ má negativní vliv na syĜitelnost. Za dobrou syĜitelnost považujeme srážení mléka upraveného k výrobČ sýrĤ pĜi 32°C tak, že první vloþky sraženiny se tvoĜí za 15 až 18 minut.1 Byl také zjištČn vliv genetického polymorfizmu bílkovin mléka na synerézy. SilnČjší syneréze byla zjištČna u sraženiny mléka N-CN AB proti AA, obecnČ je vyšší syneréze u mlék s variantou N-CN B ve srovnání s AA a to i pĜi nízkém i vysokém obsahu N-CN.3 Pozorováním bylo zjištČno, že sýr vyrobený z mléka typu N-CN BB snížil o 15 % více hmotnosti bČhem 24 hodin než sýr vyrobený z mléka typu N-CN AA, což poukazuje na intenzivnČjší synerézy u sýĜeniny mléka N-CN BB.6 VýtČžnost sýrĤ z mléka je dána sumou tuku, bílkovin, ostatních složek sušiny a vody, pĜevedených ze sýraĜského mléka do sýra. VyjadĜuje se buć jako spotĜeba litrĤ sýraĜského mléka na výrobu 1 kg daného sýra nebo naopak jako množství sýra v kg, které se vyrobí ze 100 l mléka. Sýry jsou produkty, ve kterých jsou koncentrovány mléþný tuk a bílkoviny, je tedy jasné, že výtČžnost je závislá pĜedevším na jejich obsahu v mléce. PĜechod tuku do sýra (výtČžnost tuku) není obvykle problematický. V závislosti na mechanickém zpracování sýĜeniny výtČžnost kolísá od 85 až do 93 %. Všechny proteiny mléka jsou polymorfní a byla u nich popsána Ĝada genetických variant, lišících se poĜadím aminokyselin v bílkovinném ĜetČzci. Odlišnosti jednotlivých genetických variant ovlivĖují i vlastnosti tČchto bílkovin. Tyto odlišnosti se významnČ projevují i pĜi zpracování mléka na sýry. Z hlediska technologického jsou mnohem výhodnČjší jak u N-CN, tak i u E-Lg alely B, zlepšující syĜitelnost, kvalitu sýĜeniny, výtČžnost apod. Zastoupení jednotlivých frakcí bílkovin mléka je dáno geneticky a je tedy u každé dojnice nemČnné. Celkový obsah hrubých bílkovin, pomČr syrovátkových bílkovin a kaseinu, velikost kaseinových micel i vlastnosti mléka jsou však ovlivnČny Ĝadou dalších faktorĤ a jejich vliv mĤže zcela pĜekrýt vlivy genetického polymorfizmu bílkovin mléka. Z chovatelského hlediska nejvýznamnČjšími faktory jsou zdravotní stav a výživa zvíĜat.5

Metodika Pokusný soubor tvoĜilo 50 dojnic holštýnského plemene narozených v roce 1999 až 2000. Soubor byl rozdČlen podle zásadního kriteria a to podle genotypu kappa-kaseinu na tĜi skupiny dojnic. První skupinu tvoĜilo 13 dojnic s genotypem AA. Druhá skupina zahrnovala 18 dojnic s genotypem AB a poslední, tĜetí skupina þítala 19 dojnic s genotypem BB. VýtČžnost byla zjišĢována pĜi demonstraþní výrobČ þerstvých sýrĤ z mléka z veþerního nádoje podle vzorce:

výtežnost

hmotnost sýra kg sušina % množství mléka l

(SJ)

Výpoþtem se z namČĜených hodnot vyjádĜí výtČžnost jako sušinové jednotky, které pĜejdou do sýra z 1 kilogramu mléka.

223

Výsledky

Vztah genetického polymorfizmu bílkovin mléka a jeho technologických vlastností byl zkoumán u pasterovaného mléka. Výsledky lze použít k výbČru genotypu bílkovinného systému se zvýšeným procentem pĜechodu sušiny z mléka do sýra, vyšším obsahem bílkovin a kaseinĤ a vhodným prĤbČhem koagulace. Tabulka II: Doba koagulace - þas od pĜidání syĜidla do pokrájení sýĜeniny 2005 AA AB BB záĜí 10:20 - 12:55 10:25 - 12:55 10:35 - 12:55 Ĝíjen 9:40 – 12:50 10:10 - 12:50 10:30 - 12:50 listopad 10:45 - 13:20 11:15 - 14:00 11:45 - 14:30 prosinec 11:45 - 14:10 11:45 - 14:10 12:15 - 14:35

Mléko s genotypem BB ve všech mČĜeních vykazuje nejkratší þas sýĜení kromČ mČsíce listopadu, kdy nejkratší dobu sýĜení vykazuje mléko s genotypem AA (2 hod. a 35 minut). Mléko s genotypem AB má také dobu sýĜení kratší oproti genotypu AA, opČt kromČ listopadu, kdy doba sýĜení je shodná s genotypem BB a je delší oproti genotypu AA o 10 minut. V prĤmČru je nejdelší doba sýĜení u genotypu AA (Ø 161 minut), kratší doba sýĜení je u genotypu AB (Ø 155 minut)a nejkratší u genotypu BB (Ø 146 minut). PĜi zjišĢování obsahu tuku v sýru genotyp AA vykazoval nejnižší hodnoty v prĤbČhu celého sledování. U genotypu AB byly namČĜeny ve všech pĜípadech hodnoty vyšší než u genotypu AA. Hodnoty namČĜené u genotypu BB jsou nejvyšší ve tĜech mČsících pouze v mČsíci listopadu byla namČĜená hodnota genotypu AB vyšší než u genotypu BB. Z prĤmČrných hodnot má nejvyšší obsah tuku v sýru genotyp BB (18,34 %), nižší obsah tuku v sýru vykazuje genotyp AB (17,63 %) a pouhých 15,13 % tuku obsahuje sýr genotypu AA. Tabulka III Obsah tuku v sýru (v %) v závislosti na genotypu kappa-kaseinu

2005 záĜí Ĝíjen listopad prosinec

AA 16,50 14,00 13,00 17,00

AB 17,50 18,00 18,00 17,00

BB 18,00 19,50 17,00 19,00

Hmotnost sýra byla v záĜí a Ĝíjnu nejvČtší u genotypu AA a v listopadu a prosinci byla u genotypu AA hmotnost sýra nejmenší. Naopak právČ v listopadu a prosinci byla hmotnost sýra nejvČtší u genotypu BB. Zato u genotypu AB byly namČĜeny hodnoty nejnižší bČhem celého sledování. PrĤmČrná hmotnost sýra genotypu AB je 210,71 gramĤ, u genotypu BB byla prĤmČrná hodnota hmotnosti sýra 230,32 gramĤ a nejvČtší pak u genotypu AA a to 248,30 gramĤ. Ve všech þtyĜech mČsících sledování byl obsah sušiny nejnižší u genotypu AA, naopak nejvyšší je u genotypu BB, vyjma mČsíce listopadu, kdy je obsah sušiny nejvyšší u genotypu AB. Nejvyšší prĤmČrnou hodnotu obsahu sušiny v sýru vykazuje genotyp BB (40,44 %), stĜední prĤmČrnou hodnotu vykazuje genotyp AB (39,38 %) a nejnižší genotyp AA a to pouhých 34,78 %. Hlavním cílem práce bylo sledovat vliv genotypu kaseinu na výtČžnost mléka a mléþných výrobkĤ. Z grafického znázornČní namČĜených hodnot je patrný vliv alely B i pĜesto, že hodnoty namČĜené v záĜí a Ĝíjnu vykazují pozitivní vliv genotypu AA na výtČžnost þerstvých sýrĤ. PrĤmČrné hodnoty totiž jasnČ ukazují pozitivní vliv genotypu BB na výtČžnost. Genotypy AA a AB se od sebe prĤmČrnými hodnotami výtČžnosti liší neparnČ a to AA 8,19 SJ a AB 7,97 SJ, kdežto genotyp BB vykazuje prĤmČrnou výtČžnost s viditelným rozdílem a to BB 8,88 SJ. 224

10 9 8 7 6 SJ

5 4 3 2 1 0

zá Ĝí

Ĝíje n

lis to p a d

p ro s in e c

AA

8 ,2 6 9

9 ,1 9 7

7 ,5 2 2

7 ,8 0 4

AB

6 ,5 3 9

8 ,5 5 1

8 ,5 2 5

8 ,2 6 9

BB

8 ,1 2 0

8 ,9 4 2

8 ,5 7 7

9 ,8 8 0

Obr. 1 Závislost výtČžnosti sýra na genotypu kappa-kaseinu

ZávČr

Mléko vhodné pro výrobu sýrĤ musí vykazovat takové technologické vlastnosti, aby kvalita sýĜeniny odpovídala veškerým požadavkĤm. SýraĜské vlastnosti mléka významnČ participují na celém procesu výroby a výsledné kvalitČ produkovaných sýrĤ. SouhrnnČ ovlivĖují množství vyrobených sýrĤ (obsah bílkovin, syĜitelnost) a dosažení požadovaných hodnot sýĜeniny (kvalita sýĜeniny, množství vylouþené syrovátky). Kyselost syrového mléka se podílí na predikci neporušenosti a vhodnosti mléka k výrobČ sýrĤ. Mléko s pĜíznivými sýraĜskými vlastnostmi dává pĜedpoklad vyšší výtČžnosti sýrĤ s jejich požadovaným složením než mléko s nevhodnými technologickými vlastnostmi. Základní technologická vlastnost mléka je jeho syĜitelnost. SyĜitelnost mléka je kombinací iniciaþní enzymatické hydrolýzy a následné enzymovČ nezávislé agregaþní reakce proteinĤ. Dobrá syĜitelnost mléka závisí na jeho neporušeném složení, na obsahu kaseinových bílkovin, jejich složení a genetickém typu, na obsahu minerálních látek a jejich rovnováze s bílkovinami, na formČ minerálních látek a na pĜirozeném pH mléka, které s tČmito faktory pĜímo souvisí. Další velmi dĤležitá technologická vlastnost mléka je schopnost vyluþovat syrovátku (syneréze) bČhem tvorby sýĜeniny. Syneréze rovnČž determinuje vhodnost mléka k výrobČ sýrĤ. Vyluþování syrovátky ze sýĜeniny je výsledkem kontrakce sýĜeniny zpĤsobenou pĜeskupením vabeb mezi proteinovými agregáty. DĤležitost syneréze spoþívá v množství vylouþené syrovátky, která se projeví ve výsledné sušinČ sýrĤ. Genetický polymorfismus bílkovin má rovnČž velký vliv na výtČžnost sýrĤ. VýtČžnost se vyjadĜuje v sušinových jednotkách, které pĜejdou do sýra z 1kilogramu mléka. Z namČĜených hodnot u výše uvedených technologických vlastností byl patrný pozitivní vliv alely B genotypu kappa-kaseinu. Mléko s genotypem BB poskytovalo nejkvalitnČjší sýĜeninu za nejkratší dobu sýĜení s následnou nejvyšší prĤmČrnou výtČžností, vypoþtenou dle vzorce Böhmové a ýerného. Na závČr lze obecnČ shrnout, že nejpĜíznivČjší technologické vlastnosti pĜi výrobČ þerstvých sýrĤ jednoznaþnČ vykazovalo mléko s genotypem kappa-kaseinu BB, následovalo mléko s genotypem N-CN AB a nejménČ žádoucí hodnoty byly zjištČny u mléka s genotypem N-CN AA.

225

Použitá literatura

1. Zadražil, K.: MlékaĜství. Praha, 2002, s. 128. 2. Velíšek, J.: Chemie potravin I.. Tábor, 2002, s. 344. 3. Böhmová, J. - ýerný, V.: Stanovení technologických vlastností mléka z hlediska výroby sýrĤ.Ministerstvo zemČdČlství, Národní agentura pro zemČdČlský výzkum, þ. R - 329 - 142/2, 1992 - 1994. 4. Marziali, A.S. - Ng-Kwai-Hang, K.F.: Effects of milk composition and genetic polymorphism on coagulation properties of milk. J.Dairy Sci., 1986. 5. GajdĤšek, S.: Faktory ovlivĖující výtČžnost sýrĤ. Syrotech - zborník spĜednášok. Žilina, 2000, s. 224. 6. Michalak, W.: Influence of E-lactoglobulin and N-casein genotype and lactation stage on relative amounts of major milk constituents. Pr. Mater. Zootech., 1973, s. 31 - 56. Kontaktní adresa

Ing. Veronika Legarová, Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze Email: Legarová@af.czu.cz

226

VARIANTY SÝRģ S MLETOU SÝěENINOU A JEJICH POLOPROVOZNÍ VÝROBA Mrázek Josef, Tykvartová Dagmar, Vráblíková Eva VOŠ potravináĜská a SPŠ mlékárenská KromČĜíž Variaties of milled curd cheese and their pilot plant production Summary: Within the bounds of this work five selected varieties of cheese with milled rennet curd were experimentaly produced: one natural cheese, two of marblelike colour and two flavoured ones. Their physical-chemical and sensoric qualities were examined here. The cheese mostly showed typical characteristics of this cheese group. The experiment also showed the possibility to expand the assortment by unusual and untraditional taste and visual varieties. The authors are convinced that some of the mentioned varieties can be, after the completion of technological process, viable and perspective for potential producers on the Czech market.

ÚVOD Polotvrdé sýry s mletou sýĜeninou jsou vyrábČné po celém svČtČ. Celkovým objemem výroby pĜevyšují všechny ostatní skupiny sýrĤ. Situace v ýeské republice se zcela liší. V souþasné dobČ není na trhu sýr této skupiny tuzemské výroby. Cílem naší práce1 bylo: upravit obecnČ známý technologický postup výroby sýrĤ s mletou sýĜeninou na podmínky školního poloprovozu; ovČĜit možnost výroby vybraných variant tČchto sýrĤ a posoudit jejich senzorické vlastnosti. MATERIÁL K pokusným výrobám bylo použito: smČsné plné kravské mléko odpovídající vyhl. MZe þ. 203/2003 Sb., mlékárensky ošetĜené odstĜedČním a šetrnou pasterací firmou Kromilk s.r.o., KromČĜíž; mlékárenské kultury (provozní smetanový zákys, monokultury Lactobacillus helveticus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus casei subsp. casei); chymosinové syĜidlo CHY-MAX Ultra (750 IMCU); nasycený roztok CaCl2, krystalický KNO3; chuĢové a barvící látky (barvivo Annato A320-WS, suché þervené víno odrĤdy Merlot, rozinky ošetĜené sterilací v páĜe 2x10 min, koĜení hĜebíþek). METODY K výrobČ sýrĤ byl použit výrobní postup podle Havlíþka2 upravený dle smČrného technologického postupu3 a podmínek školního poloprovozu. FyzikálnČ-chemický rozbor byl proveden bČžnými analytickými metodami4 (stanovení obsahu tuku mléka a sýrĤ acidobutyrometricky, stanovení sušiny sýrĤ pĜesnou vážkovou metodou, stanovení aktivní kyselosti sýrĤ potenciometricky, stanovení titraþní kyselosti mléka a sýrĤ titraþnČ podle Soxhleta-Henkela, stanovení obsahu NaCl v sýru argentometricky podle Mohra). Sýry senzoricky hodnotila odborná komise složená ze zamČstnancĤ a studentĤ školy a vybraných pracovníkĤ fy Kromilk s.r.o. VÝSLEDKY Byly provedeny 4 pokusné výroby a následnou úpravou a vzájemnou kombinací þedarizované hmoty bylo vyrobeno 5 variant sýrĤ s mletou sýĜeninou: x sýr pĜírodní - viz. Obr. 1. x sýr mramorovitČ obarvený annatem - viz. Obr. 2. x sýr mramorovitČ obarvený þerveným vínem - viz. Obr. 3. x sýr ochucený rozinkami - viz. Obr. 4. x sýr ochucený hĜebíþkem - viz. Obr. 5. Vybrané výrobní údaje jsou uvedeny v Tabulce I. Sýry zrály ve vakuované fólii Cryovac po dobu cca 3 mČsícĤ, resp. 6 mČsícĤ. ZjištČné fyzikálnČ-chemické vlastnosti sýrĤ jsou uvedeny v Tabulce II. 227

Tabulka I Vybraná technologická data þedarizace, lisování a zrání u jednotlivých variant sýrĤ s mletou sýĜeninou barvený barvený ochucený ochucený varianta sýra pĜírodní annatem vínem rozinkami hĜebíþkem prokysání hmoty (þedarizace) 120 120 120 100 100 pĜi cca 40°C [min] hmotnost použité prokysané 4,0 1,5* 0,9* 2,0 2,8 a nebarvené hmoty [kg] hmotnost použité prokysané -1,9 1,4 --a barvené hmoty [kg] celková hmotnost sýra [kg] 4,0 3,4 2,3 2,0 2,80 pĜídavek ochucovadel [g] ---100 20 pĜídavek NaCl [%] 3,5 3,0 3,0 3,0 3,2 délka lisování [h] 16 17 17 16 16 koneþné lisovací tlaky 27,5 19,3 19,3 22,9 22,9 [kg/kg sýra] délka osychání [h] 24 24 24 24 24 teplota zrání [˚C] 9-10 9-10 9-10 9-10 9-10 délka zrání** [dny] 105 98 98 96 96 * sýĜenina nakrájená na kostky cca 1x1x1 cm ** délka zrání do senzorického hodnocení Tabulka II FyzikálnČ-chemické vlastnosti jednotlivých variant sýrĤ s mletou sýĜeninou barvený barvený ochucený varianta sýra pĜírodní annatem vínem rozinkami stáĜí sýra pĜi hodnocení [dny] 65 58 58 56 pH 4,68 5,40 5,20 4,30 titr. kyselost dle Soxhleta113,5 69,4 73,8 135,5 Henkela obsah sušiny [%] 59,75 66,85 60,96 61,41 obsah tuku v sušinČ [%] 52,30 48,99 53,72 53,33 obsah NaCl [%] 2,68 2,14 1,96 2,01

ochucený hĜebíþkem 56 4,40 127,2 61,73 53,86 2,05

Bylo vyrobeno celkem 14,5 kg sýrĤ. Použitý technologický postup se u žádné varianty nijak podstatnČ nelišil, zásadním odlišujícím krokem pĜi pĜípravČ jednotlivých variant byla aplikace barvící nebo ochucující látky. Barvivo annato bylo pĜidáno do mléka pĜed sýĜením. Barvení vínem bylo provedeno namoþením nastrouhaného sýĜeniny do cca 38 °C teplého vína po dobu 20 minut. Takto vzniklé barevné hmoty pak byly smíšeny s kostkami neobarvené sýĜeniny. PĜídavek ošetĜených rozinek a hĜebíþku byl proveden do nastrouhané hmoty pĜed tvarováním a lisováním. KoĜení nebylo tepelnČ upraveno. Po pĜídavku kuchyĖské soli byly sýry mechanicky lisovány v obdélníkové kovové formČ do druhého dne. Po oschnutí povrchu byly sýry vakuovČ zabaleny do plastových sáþkĤ (cryovak). Sýry zrály uvedenou dobu pĜi stálé teplotČ 9 – 10 °C. Senzorické hodnocení sýrĤ bylo provedeno ve stáĜí 3 – 3,5 mČsíce (viz Tabulka I) komisionálnČ odbornou komisí. U varianty „sýr s mletou sýĜeninou, pĜírodní) byly zjištČny následující vlastnosti: Barva stejnorodá, krémovČ mléþnČ bílá, charakteristická pro prozrávající sýr. Konzistence celistvá, jemná, krátká, drobivá. VĤnČ charakteristická, sýrová, þistá. ChuĢ sýrová, þistá, kyselejší, slanČjší. 228

Obr. 1. Sýr s mletou sýĜeninou pĜírodní U varianty „sýr s mletou sýĜeninou mramorovitČ barvený annatem“ byla pozorována: Barva mramorovitá, krémovČ bílá neobarvená zĜetelnČ oddČlená zrna pomČrnČ pravidelnČ rozmístČná v okrovČ žlutČ zbarvené hmotČ. Konzistence jemná, celistvá, minimálnČ drobivá, elastická. VĤnČ þistá, nevýrazná. ChuĢ jemnČ sýrová, nevýrazná, þistá.

Obr. 2. Sýr s mletou sýĜeninou mramorovitČ barvený annatem

Obr. 3. Sýr s mletou sýĜeninou mramorovitČ barvený vínem 229

Zajímavou variantou se jevil „sýr s mletou sýĜeninou mramorovitČ barvený vínem“, které mČlo vliv nejenom na vzhled sýra, ale také na jeho chuĢové vlastnosti. Komise hodnotila sýr následovnČ: Barva mramorovitá, krémovČ bílá neobarvená zrna rovnomČrnČ rozptýlená v temnČ fialovoþervené hmotČ, ohraniþení ménČ zĜejmé jak u pĜedcházející varianty. Konzistence celistvá, pružná, polotvrdá. VĤnČ sýrová, þistá, zĜetelná po použitém vínČ. ChuĢ sýrová, ménČ slaná, pikantní, neobvyklá, výrazná po vínČ. Ochucené varianty vykazovaly obdobný vzhled – þásti rozinek þi hĜebíþku byly víceménČ pravidelnČ rozmístČny v hmotČ sýra, které mČlo tvarohovitý charakter, bylo krátké a drobivé. VĤnČ a chuĢ výraznČ kyselá byla zpĤsobena pĜekysáním sýra, což potvrdily i výsledky fyzikálnČchemické kontroly (viz Tabulka II). Vlastnosti „sýra s mletou sýĜeninou ochuceného rozinkami“ byly: Barva na Ĝezu mléþnČ bílá, typická pro neprozrálý sýr, rozinky pravidelnČ rozmístČny v celém Ĝezu. Konzistence krátká, drobivá, tvarohovitá. VĤnČ zĜetelnČ kyselá, sýrová. ChuĢ sýrová, výraznČ kyselá chuĢ pĜekrývá pĜíchuĢ rozinek.

Obr. 4. Sýr s mletou sýĜeninou ochucený rozinkami

Obr. 5. Sýr s mletou sýĜeninou ochucený hĜebíþkem

230

Senzorickým posouzením „sýra s mletou sýĜeninou ochuceného hĜebíþkem“ jsme dospČli k následujícím zjištČním: Barva charakteristicky bílá pro neprozrálý sýr, koĜení rozmístČno ménČ pravidelnČ. Konzistence krátká, drobivá, tvarohovitá, tuhá, koĜení tvrdé až nepoživatelné. VĤnČ nakyslá, výrazná po použitém koĜení. ChuĢ výraznČ aromatická po použitém koĜení, neobvyklá, pĜíliš kyselá. Další hodnocení senzorických vlastností bylo provedeno po cca 6 mČsících po výrobČ. Zjistili jsme, že vlastnosti sýrĤ se po 3 a 6 mČsících zrání významnČ nelišily, výraznČji se projevila pouze sýrovitá chuĢ daná probíhajícím zráním sýrĤ. BČhem pokusných poloprovozních výrob se vyskytly i nČkteré problémy. PĜedevším problematickým se jevilo zajištČní správného prĤbČhu prokysání, které s výjimkou barvených sýrĤ, zpomalovalo jejich prozrávání. Také zpĤsob, zvolený k barvení sýĜeniny vínem, je podle našeho názoru možný provádČt jen pĜi skuteþnČ malém množství sýrĤ, pro vČtší a velké objemy je nereálný. Další úskalí pĜedstavuje mikrobiální þistota použitých ochucujících pĜísad. Rozinky jsme pĜed použitím opakovanČ (2 x) ošetĜili záhĜevem v páĜe pĜi 100 °C, vždy po dobu 10 minut. PĜesto u jednoho vzorku, který byl ponechán v prĤbČhu zrání 48 hodin pĜi pokojové teplotČ, se objevila zĜetelná tvorba plynu. Lze se proto domnívat, že uvedené tepelné ošetĜení rozinek nebylo dostateþné. Zbývající vzorky tohoto sýra, podobnČ jako u sýra ochuceného hĜebíþkem, a zrající pĜi stálé teplotČ 9 – 10 °C byly beze zmČn. Mikrobiální vyšetĜení jsme neprovádČli. RovnČž jsme zjistili, že hĜebíþek, který jsme pĜed použitím tepelnČ ani mechanicky neupravovali, byl pĜíliš tuhý, konzistenþnČ pĜíliš odlišný až rušil celkový dojem a v této formČ i nepoživatelný. PĜílišnou chuĢovou aromatiþnost lze snadno upravit na optimální míru jiným dávkováním. ZÁVċR V rámci prezentované práce bylo pokusnČ vyrobeno pČt vybraných variant sýrĤ s mletou sýĜeninou: jeden sýr pĜírodní, dva mramorovitČ barvené a dva ochucené. Byly studovány jejich fyzikálnČ-chemické a senzorické vlastnosti. Sýry vykazovaly zpravidla typické vlastnosti sýrĤ této skupiny. ZároveĖ také ukázaly možnost rozšíĜení sortimentu o neobvyklé a netradiþní chuĢové a vizuální varianty. AutoĜi jsou pĜesvČdþeni, že nČkteré z uvedených variant mohou být po dopracování technologického postupu na našem trhu životaschopné a pro pĜípadného výrobce perspektivní. LITERATURA 1. VRÁBLÍKOVÁ, E. Varianty sýrĤ s mletou sýĜeninou a jejich výroba. Absolventská práce VOŠP a SPŠM KromČĜíž, 2005, s. 9 – 46 2. HAVLÍýEK, Z. Praktikum sýraĜské výroby, SNTL Praha 1975, s. 193 – 211 3. SmČrné technologické postupy. STP Otava, ýedar. Mlékárenský prĤmysl, koncern Praha, vydal TOMOS 1987, s. 187 – 194 4. INDRA, Z., MIZERA, J. Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. Uþebnice pro SPŠP, þ.j. 13197/92, 1992, s. 76 – 163 Kontaktní adresa

Ing. Josef Mrázek; VOŠ potravináĜská a SPŠ mlékárenská, ŠtČchovice 1358, 767 54 KromČĜíž [email protected]

231

VYUŽITÍ PLÍSNċ PENICILLIUM NALGIOVENSE K VÝROBċ PLÍSĕOVÉHO SÝRA Mrázek Josef, Pospíšil Michal, Korbelová Marie, Heraltová Veronika VOŠ potravináĜská a SPŠ mlékárenská KromČĜíž Use of Penicillium nalgiovense for production of cheese covered by white mould Summary The component of this work was the verification of the use of the mould Penicillium nalgiovense for the production of cheese covered by white mould. By the means of the experiments it was established that the cheese produced from the cow´s and goat´s milk with the help of the mould culture „M-EK-4 BactofermTM“ and „M-EK-6 BactofermTM“ shows similar characteristics to other cheese of this group. These types of cheese ripen in the similar way and have analogous sensoric qualities. It is possible to say that the use of the examined mould for the cheese production proves to be possible and may become an interesting marketing alternative particularly for smaller or beginning producers.

ÚVOD K výrobČ mČkkých sýrĤ zrajících s plísní na povrchu se v ýeské republice používá výhradnČ plíseĖ Penicillium camemberti (syn. Penicillium candidum), pouze v nČkterých pĜípadech kombinovaná s jinými typy povrchových kultur. Inspirací pro naše pokusy byla existence Nalžovského sýra vyrábČného na pĜelomu a poþátkem 20. století v obci Nalžovské Hory v západních ýechách. PĜi výrobČ sýru se používala plíseĖ Penicillium nalgiovensis, prvnČ popsaná Laxou a studovaná Doležálkem1. Cílem naší práce bylo: ovČĜit možnost použití nČkterých kmenĤ plísnČ Penicillium nalgiovense, která jsou v souþasné dobČ distribuované jako ochranná plísĖová kultura povrchu uzenáĜských výrobkĤ, rovnČž k výrobČ sýrĤ; sýry vyrobit z kravského i kozího mléka a posoudit jejich vlastnosti. MATERIÁL K pokusným výrobám bylo použito: smČsné plné kravské mléko odpovídající vyhl. MZe þ. 203/2003 Sb., mlékárensky ošetĜené odstĜedČním a šetrnou pasterací firmou Kromilk s.r.o., KromČĜíž, titraþní kyselost podle Soxhleta-Henkela 6,6 – 7,2, tuþnost 3,60 – 4,50 %; kozí mléko z malochovu, titraþní kyselost podle Soxhleta-Henkela 7,8, tuþnost 4,10 %; provozní smetanový zákys; lyofilizované kultury plísnČ Penicillium nalgiovense distribuované pod obchodním oznaþením M-EK-4 BactofermTM a M-EK-6 BactofermTM firmou Chr. Hansen GmbH); mikrobiální syĜidlo FROMASE 750 TL (750 IMCU); nasycený roztok CaCl2, krystalický KNO3. METODY K výrobČ sýrĤ byl použit smČrný technologický postup2,3 upravený na podmínky školního poloprovozu. FyzikálnČ-chemický rozbor byl proveden bČžnými analytickými metodami4 (stanovení obsahu tuku mléka a sýrĤ acidobutyrometricky, stanovení sušiny sýrĤ pĜesnou vážkovou metodou, stanovení aktivní kyselosti sýrĤ potenciometricky, stanovení titraþní kyselosti mléka a sýrĤ titraþnČ). Sýry senzoricky hodnotila odborná komise složená ze zamČstnancĤ a studentĤ školy a vybraných pracovníkĤ fy Kromilk s.r.o. VÝSLEDKY Byly provedeny 4 pokusné výroby plísĖového sýru z kravského mléka, vždy byla použita plíseĖ Penicillium nalgiovense M-EK-6, pĜi 2. a 3. pokusu byla pĜidána do mléka pĜed sýĜením, pĜi 1. a 4. pokusu byla aplikována rozstĜikem ve formČ suspenze na povrch prokysaných a krystalickou solí solených sýrĤ v množství cca 3 %, resp. 2 % soli z hmoty sýrĤ. Sýry následnČ zrály 4 dny pĜi teplotČ 15 °C a dále pĜi teplotČ 12 °C až do stáĜí 21 dnĤ. Senzoricky hodnoceny byly z dĤvodu kontaminace pouze vzorky z 2. a 4. pokusu. Na následující 2 pokusy bylo použito kozí mléko, které jsme laboratornČ ošetĜili záhĜevem na 73 °C s krátkou výdrží. Sýry byly vyrobeny obdobným zpĤsobem jako sýry z kravského mléka, zpracování sýĜeniny bylo prodlouženo na 30 minut. Solení se provádČlo, obdobnČ jako v pĜedešlých 232

pokusech, krystalickou solí na povrch sýrĤ, množství soli bylo cca 2 % na hmotu sýrĤ. Na povrch prokysaných a vysolených sýrĤ byla aplikována nástĜikem vždy jiná plísĖová kultura (M-EK-6 a M-EK-4). Sýry zrály 3 dny pĜi cca 20 °C, dále pĜi cca 6 °C. Sýry byly hodnoceny ve stáĜí 14 a 28 dní, resp. 14, 21 a 35 dní. Tabulka I Vybraná data pokusných výrob sýrĤ z kravského mléka s plísní Penicillium nalgiovense M-EK-6 pokusná výroba þ. 1 2 3 4 titraþní kyselost mléka dle Soxhleta6,6 7,2 6,6 7,2 Henkela tuþnost mléka [%] 3,90 4,30 4,50 3,60 provozní smetanový zákys [%] 3,75 2,50 2,50 1,75 prokysání [min] 20 20 20 20 plísĖová kultura do mléka [g/100 l mléka] -25 50 -titraþní kyselost pĜed sýĜením dle 8,0 8,2 8,2 7,8 Soxhleta-Henkela mikrobiální syĜidlo [ml / 100 l mléka] 10 10 10 10 srážení pĜi 35 °C [min] 20 20 20 20 zpracování sýĜeniny [min] 15 15 15 15 pH 24 h po výrobČ 4,56 5,12 4,99 4,89

Senzorické hodnocení plísĖových sýrĤ z kravského mléka

Obr. 1. Sýr z kravského mléka, stáĜí 14 dní

Obr. 2. Sýr z kravského mléka, stáĜí 21 dní 233

SýrĤ z kravského mléka vyrobené s pomocí plísnČ Penicillium nalgiovense M-EK-6 (viz Obr. 1. a Obr. 2.) byly senzoricky hodnoceny po 14 dnech zrání studenty a zamČstnanci školy a po 21 dnech zrání odbornou komisí, kterou kromČ již uvedených tvoĜili také vybraní pracovníci z mlékárenské praxe. Komise zjistila následující senzorické vlastnosti sýrĤ: Vzhled a barva: tvar pravidelný se stopami po zracím roštu, po 3 týdnech mírnČ svraštČlý povrch jako známka pĜezrání, povrch porostlý bílou plísní bez známek kontaminace. Konzistence a struktura: jemná, mČkká, celistvá bez trhlin a dutinek, smetanovČ žluté tČsto bylo dlouhé a roztíratelné, ve stáĜí 2 týdnĤ zrání bylo patrné tvarohovité jádro. VĤnČ: þistá, pĜíjemnČ houbovČ sýrová, mírný náznak po amoniaku se objevil po 3 týdnech zrání ChuĢ: þistá, sýrovČ jemná až máslová s pĜíchutí po houbách, u prozrálého sýra intenzívní houbová chuĢ a nahoĜklá, ne však nepĜíjemná, dochuĢ; výraznČ slaná. Senzorické hodnocení plísĖových sýrĤ z kozího mléka RovnČž i v pĜípadČ plísĖových kozích sýrĤ byly senzorické vlastnosti hodnoceny komisionálnČ studenty a zamČstnanci školy a vybranými pracovníky praxe a to ve stáĜí 14 a 28 dní, resp. 14, 21 a 35 dní.

Obr. 3. Kozí sýr, stáĜí 28 dní, kultura M-EK-6 PĜi posuzování kozích plísĖových sýrĤ, vyrobených za pomoci plísnČ Penicillium nalgiovense M-EK-6 (viz Obr. 3.) byly zjištČny následující senzorické vlastnosti: Vzhled zrání 14 dnĤ: nesouvislý porost plísnČ (potrhaný), barva bílá až svČtle šedá, prosvítá rĤžové zbarvení, tvar mírnČ deformovaný, povrch svraštČlý zrání 28 dnĤ: typicky pĜezrálý, svraštČlý, potrhaná vrstva plísnČ Konzistence, struktura zrání 14 dnĤ: tČsto bílé, celistvé, krátké, konzistence jemná, bez hrudek, mČkká zrání 28 dnĤ: celistvá, jemná, krémové barvy, roztíratelná, ojedinČlé dutinky, lepí se, povrchová vrstva plísnČ tuhá, oddČluje se, mírné roztékání pod povrchem ChuĢ a vĤnČ zrání 14 dnĤ: vĤnČ jemná, houbovitá, neþistá, zadušená; chuĢ kyselá, mírnČ nahoĜklá, výrazná kozí zrání 28 dnĤ: vĤnČ houbovitá, náznak po žampionech; chuĢ kyselejší, pikantní, výrazná kozí, neþistá, nahoĜklá, houbovitá 234

ObdobnČ byly hodnoceny kozí sýry porostlé plísní Penicillium nalgiovense M-EK-4 (viz Obr. 4.). Byly zjištČny tyto vlastnosti: Vzhled souvislý porost plísnČ, ze spodní strany potrhaný, barva snČhobílá, pravidelný, zĜetelné stopy po odkapní desce, od 3 týdnĤ boky svraštČlé a horní strana propadající se Konzistence, struktura zrání 14 dnĤ: bílý souvislý porost plísnČ, spodní strana lososovČ rĤžová, konzistence jemná, hladká, roztíratelná, tČsto mléþnČ bílé zrání 21 dnĤ: hmota bílá, hladká, jemná, mČkká, roztíratelná až mazlavá, celistvá, lepí se, zrání 35 dnĤ: celistvá bílá hmota, hladká, lesklá, jemná, mČkká, mazlavá, lepí se, bez trhlinek, tuhá kĤra ruší dojem ChuĢ a vĤnČ zrání 14 dnĤ: vĤnČ a chuĢ jemná, þistá, houbovitá, kyselejší, typicky kozí, pĜíjemnČ pikantní zrání 21 dnĤ: jemná houbovitá vĤnČ, þistá; chuĢ mírnČ nakyslá, þistá, zĜetelnČ kozí, pĜíjemná zrání 35 dnĤ: pĜíjemná houbovitá vĤnČ, þistá, výrazná, typická kozí chuĢ, nepatrnČ nakyslá, v konci mírnČ nahoĜklá, slabČ mýdlovitá, pĜezrálá ale pĜesto pĜíjemná

Obr. 4. Kozí sýr, stáĜí 28 dní, kultura M-EK-4 PĜi provádČných pokusných výrobách jsme Ĝešili nČkolik závažných problémĤ. Prvním komplikujícím faktorem bylo zajištČní optimálního prĤbČhu kysací kĜivky vzhledem k velmi malému zpracovávanému množství mléka a k malé þetnosti pokusĤ. Druhým problémem bylo zajištČní vhodného klima pĜi zrání, které vyústili ve znehodnocení vzorkĤ kontaminací cizí plísní u 1. a 3. výroby sýrĤ z kravského mléka. PĜi pokusu s kozím sýrem naoþkovaným plísní Penicillium nalgiovense M-EK-6 kolísala teplota zrání v rozmezí 0 °C až 12 °C v období 4. – 6. dne zrání. Potrhaná a místy od sýra odtržená povrchová vrstva plísnČ je následkem opoždČného obracení sýrĤ, kdy zrací rošt zarostl vitální plísní. I pĜes výše citované problémy a malé množství pokusĤ je však možné Ĝíci, že senzorické vlastnosti vyrobených sýrĤ odpovídaly naši pĜedstavám a bČžným požadavkĤm na skupinu sýrĤ s bílou plísní na povrchu. Pro praktické použití bude nutné Ĝešit standardizaci technologického postupu hledáním optimálních podmínek výroby a zrání. Proto pokusy s výše uvedenými testovanými plísnČmi na našem pracovišti pokraþují.

235

ZÁVċR Souþástí této práce bylo ovČĜení použitelnosti plísnČ Penicillium nalgiovense k výrobČ sýrĤ s plísní na povrchu. Provedenými pokusy bylo zjištČno, že sýry z kravského i kozího mléka vyrobené za pomoci uvedené plísnČ dodávané pod oznaþením M-EK-4 BactofermTM a M-EK-6 BactofermTM vykazují obdobné vlastnosti jako ostatní sýry s bílou plísní na povrchu, obdobnČ prozrávají a mají i podobné senzorické vlastnosti. Lze konstatovat, že použití testované plísnČ k sýraĜským úþelĤm se v této fázi jeví jako možné a mĤže být zajímavou marketingovou alternativou pĜedevším pro menší nebo dosud nezavedené výrobce. PODċKOVÁNÍ AutoĜi dČkují panu Ing. Vladimíru Valentovi z fy Chr. Hansen Czech Republic s.r.o. za laskavé poskytnutí vzorkĤ testovaných plísní. LITERATURA 1. DOLEŽÁLEK, J. Biochemie a technologie plísĖových sýrĤ. ÚVÚPP Praha, 1967, s. 89 - 240 2. SmČrné technologické postupy. STP Hermelín. Mlékárenský prĤmysl, koncern Praha, vydal TOMOS Praha, 1987, s. 138 - 145 3. MRÁZEK, J. Schémata technologických postupĤ výroby sýrĤ. SýraĜský pracovní sešit. SPŠM KromČĜíž, 1996, s.14 4. INDRA, Z., MIZERA J.: Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. Uþebnice pro SPŠP, þ.j. 13197/92, 1992, s. 76 - 163 Kontaktní adresa

Ing. Josef Mrázek; VOŠ potravináĜská a SPŠ mlékárenská, ŠtČchovice 1358, 767 54 KromČĜíž [email protected]

236

VLIV PěÍDAVKU KAPPA- A IOTA-KARAGENANU NA VISKOELASTICKÉ A ORGANOLEPTICKÉ VLASTNOSTI TAVENÝCH SÝRģ ýerníková Michaela 1), BuĖka František 1), Pavlínek Vladimír 2), ýechová Leona 1), BĜezina Pavel 1), HrabČ Jan 1) 1) Ústav potravináĜského inženýrství, FT UTB ve ZlínČ 2) Centrum polymerních materiálĤ FT UTB ve ZlínČ The effect of addition of kappa- and iota-carrageenans on viscoelastic and organoleptic properties of processed cheeses Summary: Consistency is a very important sensory characteristic of processed cheeses. In the work, there were analyzed and compared the samples of processed cheeses with additions of 0.25 % w/w N-carrageenan and L-carrageenan, after 14 days of storage at 6 r 2 oC using the dynamic oscillatory rheometry. With used concentration of both carrageenans there increased the storage modulus G´ and the loss modulus G´´ in comparison with control samples. Influence of 0.25 % w/w L-carrageenan on viscoelastic and organopeptic properties was higher as compared with N-carrageenan in the same dosing. Additions of both carrageenans (0.25 % w/w) were sensory acceptable (there were no off-flavours).

Úvod Polysacharidy (pektin, modifikované škroby, algináty, karagenany aj.) jsou k nČkterým mlékárenským produktĤm pĜidávány s cílem stabilizovat strukturu finálního výrobku, resp. optimalizovat jeho konzistenci1,2. Karagenany mají význam také v technologii výroby tavených sýrĤ pro schopnost ovlivnit a stabilizovat konzistenci. Karagenany jsou anionaktivní lineární polysacharidy extrahované z þervených Ĝas (Rhodophyceae) obsahující jako základní jednotku disacharid karabinózu (E-D-galaktopyranóza a 3,6-anhydro-D-D-galaktopyranóza). Existují tĜi hlavní frakce karagenanĤ (N-kappa, L-iota a O-lambda), které se odlišují poþtem a polohou sulfátových skupin (SO3-) na základním dimeru. Kappa-karagenan a iota-karagenan tvoĜí gely, což úzce souvisí s jejich schopností vytvoĜit za urþitých teplot (obvykle pod 50 oC) helikální konformaci. Kappa-karagenan obvykle poskytuje tuhé a kĜehké gely, zatímco L-karagenan mČkké elastické gely. Lambda-karagenan není schopen tvoĜit stabilní gely3-9. Kaseinové micely jsou složeny z hlavních frakcí DS1-, DS2-, E- a N-kaseinĤ. Práce Thaiudom & Goff2, Tziboula & Horne7 a Augustin a kol.10 dokazují, že interakce N-karagenanu a L-karagenanu s kaseinovými micelami již byly publikovány. Tyto reakce se vČtšinou zdĤvodĖují specifickými elektrostatickými interakcemi negativnČ nabitých sulfátových skupin karagenanĤ s kladnČ nabitými oblastmi mezi 97. a 112. aminokyselinovým zbytkem na N-kaseinové frakci, která tvoĜí obalovou (ochrannou) vrstvu micely11,12. Vlastnosti kaseino-karagenanového systému závisí na velkém poþtu parametrĤ, k nimž patĜí koncentrace obou biopolymerĤ, pH, pĜítomnost a koncentrace iontĤ, pĜítomnost a koncentrace cukrĤ, teplota systému, molekulové hmotnosti proteinĤ, podmínky technologických operací aj.9. Kappa-karagenan i iota-karagenan se adsorbují na kaseinové micely pĜi teplotách, kdy jsou karagenany v helikální konformaci. Adsorpce je teplotnČ reverzibilní pro N-karagenan, zatímco u L-karagenanu je ireverzibilní13,14. Langendorff a kol.13 pĜedpokládají dva typy interakcí v systému L-karagenan-kaseinová micela závisející zejména na obsahu polysacharidu. Podle této hypotézy, je-li koncentrace L-karagenanu nižší než 0,2 % (w/w), tvoĜí tento polysacharid adsorbovaný na povrch kaseinových micel jen „mezivrstvu“ mezi kaseinovými micelami (za pĜedpokladu, že teplota systému se nachází v oblasti, kdy je L-karagenan v helikální konformaci). PĜi vyšších koncentracích L-karagenanu pak pravdČpodobnČ vznikají nejen výše popsané vazby, ale navíc je tvoĜena síĢ mezi samotnými karagenanovými ĜetČzci. Podle Langendorff a kol.14 se v systému N-karagenankaseinová micela tvoĜí pouze druhý typ interakcí (síĢ mezi karagenanovými ĜetČzci). 237

Bourriot a kol.15 pĜedpokládají, že existuje minimální koncentrace N-karagenanu, pĜi které se výše zmínČná síĢ mĤže efektivnČ vytvoĜit a je stabilní. V pĜírodních sýrech (eidamského a ementálského typu), které jsou základní surovinou pro tavené sýry, se však nenachází ani kaseinové micely ani N-kaseinová frakce v její nativní podobČ (tedy se 169 aminokyselinovými zbytky). Jen velmi málo studií se zabývá interakcemi N-karagenanu a L-karagenanu s jednotlivými kaseinovými frakcemi4,12. Lynch & Mulvihill16 pĜedpokládají schopnost interakcí DS- a E-kaseinových frakcí s karagenany, které jsou však podmínČny pĜítomností vápenatých iontĤ a esterovČ vázaného fosforu zejména na serylových zbytcích. Cílem této práce bylo použít N-karagenan a L-karagenan pĜi výrobČ tavených sýrĤ s 50 % tuku v sušinČ a studovat rozdíly ve viskoelastických a organoleptických vlastnostech tavených sýrĤ s rĤznými karagenany. Použitá koncentrace karagenanĤ ve finálním výrobku byla zvolena tak, aby byla splnČna podmínka tvorby 2 typĤ sítí, které pĜedpokládá Langendorff a kol.13, tedy nad 0,2 % w/w (viz výše). Materiál a metody Analyzovány byly tavené sýry s obsahem 40 % (w/w) sušiny a 50 % tuku v sušinČ (w/w), k jejichž výrobČ byly použity: smČs pĜírodních sýrĤ (eidamská cihla 30 % tuku v sušinČ w/w, eidamská cihla 45 % tuku v sušinČ w/w), máslo, voda a komerþnČ dodávané tavicí soli. Tavené sýry byly vyrábČny na zaĜízení Vorwerk Thermomix TM 21 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; GmbH, Wuppertal, NČmecko), pĜi tavicí teplotČ 92 oC a celkové dobČ tavení cca 10 minut. Stejné zaĜízení pro výrobu tavených sýrĤ použili Lee a kol.17. Tavené sýry byly po výrobČ zchlazeny na 6 r 2 oC a pĜi této teplotČ skladovány do doby provedení analýz. K taveným sýrĤm byly samostatnČ pĜidávány N-karagenan a L-karagenan (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, USA) v množství 0,25 % w/w, a to pĜímo v práškové formČ. Reologické a senzorické hodnocení bylo provedeno po 14 dnech skladování. Pro reprodukovatelnost výsledkĤ byla stejná technologie výroby vþetnČ koncentrací N-karagenanu a L-karagenanu použita ve 4 opakováních (skupiny I až IV). Reologické vlastnosti pĜipravených tavených sýrĤ byly charakterizovány pomocí rotaþního viskozimetru Bohlin Gemini (Bohlin Instruments, UK) v geometrii deska-deska (prĤmČr 40 mm, štČrbina 1 mm) pĜi teplotČ 20 oC. MČĜení bylo provádČno v oscilaþním režimu s amplitudou smykového napČtí 20 Pa v oblasti lineární viskoelasticity. Elastický modul pružnosti G´ a ztrátový modul pružnosti G´´ byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1 až 50 Hz. Senzorické hodnocení bylo v jednotlivých šaržích provedeno 20 vybranými posuzovateli (zamČstnanci Ústavu potravináĜského inženýrství) vyškolenými podle ýSN ISO 8586-118. Vzorky byly pĜedkládány anonymnČ pĜi pokojové teplotČ (22 r 2 oC). Hodnoceny byly 3 senzorické znaky (tuhost, roztíratelnost, chuĢ a vĤnČ), a to podle sedmibodových ordinálních stupnic s charakteristikou každého stupnČ. Pro statistické vyhodnocení byl použit Kruskal-WallisĤv test19. Výsledky a diskuze Dynamickou oscilaþní reometrií byly analyzovány þtyĜi skupiny tavených sýrĤ s obsahem 40 % w/w sušiny a 50 % w/w tuku v sušinČ. Realizovány byly pĜídavky N-karagenanu a L-karagenanu v množství 0,25 % w/w. Základní analýza ukázala, že všechny vzorky þtyĜ testovaných skupin mají prakticky stejné pH (v rozmezí 5,88 až 5,95) i obsah sušiny (v rozmezí 40,00 až 41,00 % w/w). Obdobný obsah sušiny a pH umožnil srovnání vlivu pĜídavku rĤzných karagenanĤ, neboĢ pH i obsah sušiny znaþnČ ovlivĖují konzistenci tavených sýrĤ17,20. Jednotlivé skupiny tavených sýrĤ (I až IV) se lišily ve výrobci použitých pĜírodních sýrĤ a jejich stupni prozrálosti z dĤvodu vyšší vypovídací schopnosti výsledkĤ pro prĤmyslovou praxi, kde je velmi obtížné zajistit vždy stejného dodavatele suroviny a konstantní stupeĖ prozrálosti. Proto mČly kontrolní vzorky v jednotlivých testovaných skupinách odlišnou poþáteþní tuhost (viz hodnoty 238

elastického modulu pružnosti G´, ztrátového modulu pružnosti G´´ a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu pro referenþní frekvenci 1 Hz v tabulkách I a II). ZávČry o vlivu pĜídavku 0,25 % w/w N-karagenanu nebo L-karagenanu byly pak vztahovány ke kontrolnímu vzorku dané skupiny. Tabulka I Hodnoty elastického modulu pružnosti G´, ztrátového modulu pružnosti G´´ a tangentu úhlu fázového posunu tan G pro referenþní frekvenci 1 Hz u tavených sýrĤ s pĜídavkem 0,25 % w/w N-karagenanu a L-karagenanu ve skupinách I a II Tavený sýr Kontrola N-karagenan L-karagenan

Skupina tavených sýrĤ I G´ [Pa] G´´ [Pa] 1275.0 1329.0 4098.0 2719.0 5288.0 2969.0

tan G [-] 1.043 0.664 0.561

II G´ [Pa] 352.4 641.0 2750.0

G´´ [Pa] 563.1 721.6 1722.0

tan G [-] 1.600 1.126 0.627

Tabulka II Hodnoty elastického modulu pružnosti G´, ztrátového modulu pružnosti G´´ a tangentu úhlu fázového posunu tan G pro referenþní frekvenci 1 Hz u tavených sýrĤ s pĜídavkem 0,25 % w/w N-karagenanu a L-karagenanu ve skupinách III a IV Tavený sýr Kontrola N-karagenan L-karagenan

Skupina tavených sýrĤ III G´ [Pa] G´´ [Pa] 178.6 337.0 322.7 500.6 1335.0 1133.0

tan G [-] 1.889 1.552 0.848

IV G´ [Pa] 46.3 597.3 924.0

G´´ [Pa] 128.0 552.2 796.4

tan G [-] 2.762 0.926 0.863

Tabulka III Výsledky senzorické analýzy tavených sýrĤ s pĜídavkem 0,25 % w/w N-karagenanu a L-karagenanu (vyjádĜeno jako medián) u II. a IV. skupiny Tavený sýr Kontrola N-karagenan L-karagenan

Skupina tavených sýrĤ II RoztíraTuhost telnost 5a 5a 4b 4b c 3c 3

IV ChuĢ a vĤnČ 3a 3a 3a

Tuhost 6a 5b 4c

Roztíratelnost 6a 5b 4c

ChuĢ a vĤnČ 3a 2a 2a

Tuhost: 1-velmi tuhý, 7-velmi mČkký Roztíratelnost: 1-vzorek není možné rozetĜít, 4-optimální roztíratelnost, 7-tekutý vzorek ChuĢ a vĤnČ: 1-vynikající, 7-naprosto nepĜijatelná Rozdílné písmenné indexy v jednotlivých sloupcích znaþí signifikantní rozdíly (P < 0,05)

Na obrázku 1 je zobrazena (pro 4 posuzované skupiny) závislost elastického modulu pružnosti G´ a ztrátového modulu pružnosti G´´ na frekvenci (0,1 až 50 Hz) u tavených sýrĤ, které byly skladovány 14 dnĤ pĜi teplotČ 6 r 2 oC. Z výsledkĤ vyplývá, že použitá koncentrace obou karagenanĤ (0,25 % w/w) zvýší hodnoty elastického modulu pružnosti G´ i ztrátového modulu 239

pružnosti G´´ oproti pĜíslušným kontrolním vzorkĤm v celé oblasti testovaných frekvencí (0,1 až 50 Hz). Tyto zmČny indikují skuteþnost, že množství 0,25 % w/w N-karagenanu i L-karagenanu v taveném sýru zmČní povahu jeho gelu, který vykazuje vyšší tuhost ve srovnání s kontrolou. Lze to pravdČpodobnČ vysvČtlit tím, že N-karagenan i L-karagenan prostĜednictvím interakcí svých ĜetČzcĤ pĜispČjí k vytvoĜení intenzivnČji zesíĢované matrice tavených sýrĤ. V pĜípadČ pĜídavku L-karagenanu je možné také pĜedpokládat adsorpci ĜetČzcĤ karagenanu v helikální konformaci na kaseinové frakce a vytvoĜení „mezivrstvy“13,14. ZjištČní, že tavené sýry s pĜídavkem 0,25 % w/w N-karagenanu i L-karagenanu jsou signifikantnČ (P < 0,05) tužší a ménČ roztíratelné než pĜíslušné kontrolní vzorky, byl potvrzen i senzorickou analýzou, jejíž výsledky pro II. a IV. Ĝadu jsou prezentovány v tabulce III. Realizované pĜídavky karagenanĤ negativnČ neovlivnily chuĢ a vĤni u posuzovaných tavených sýrĤ (P 0,05).

A

B

C

D

Obr. 1. Závislost elasického modulu pružnosti G´ [Pa] u kontrolního vzorku (), vzorku s pĜídavkem 0,25 % w/w N-karagenanu (z), vzorku s pĜídavkem 0,25 % w/w L-karagenanu (S) a ztrátového modulu pružnosti G´´ [Pa] u kontrolního vzorku (), vzorku s pĜídavkem 0,25 % w/w N-karagenanu ({), vzorku s pĜídavkem 0,25 % w/w L-karagenanu (U) na frekvenci [Hz]; A – skupina I, B –skupina II, C – skupina III a D – skupina IV Z tabulek I a II a obrázku 1 vyplývá, že L-karagenan pĜispČl k vytvoĜení pevnČjšího gelu než N-karagenan (pro pĜídavek 0.25 % w/w). Jednoznaþné vysvČtlení vČtší úþinnosti L-karagenanu než N-karagenanu není jednoduché, zvláštČ vezme-li v úvahu tvrzení Imeson6, že N-karagenan tvoĜí tuhé gely a L-karagenan mČkké elastické gely. OdpovČć lze pravdČpodobnČ hledat napĜíklad v pĜítomnosti kationtĤ (zejména draselných a vápenatých), jimiž je síla karagenanové sítČ signifikantnČ ovlivnČna21. V pĜírodních sýrech (základní surovina pro tavené sýry) se vyskytuje podle Fox a kol.22 pĜibližnČ desetinásobné množství vápenatých iontĤ, ke kterým je z hlediska tvorby gelu citlivý zejména L-karagenan, oproti draselným iontĤm, ke kterým je citlivý zejména 240

N-karagenan. Podle Spagnuolo a kol.3 totiž mĤže mít vliv nejen množství vápenatých a draselných iontĤ, ale i jejich vzájemný pomČr. PĜevaha koncentrace vápenatých iontĤ nad draselnými pak mĤže sehrávat významnou roli v pevnosti gelu N-karagenanu a L-karagenanu. Je vhodné rovnČž zohlednit práci MacArtain a kol.23, kteĜí zjistili, že pro N-karagenan existuje optimální koncentrace vápenatých iontĤ v prostĜedí. V oblasti koncentrací menších než optimum zapĜíþiní jejich rostoucí koncentrace zvyšování pevnosti gelu N-karagenanu. Na druhou stranu pĜekroþí-li v daném systému koncentrace vápenatých iontĤ optimum, pak s jejím dalším zvyšováním klesají hodnoty elastického modulu pružnosti G´ vytvoĜeného gelu (jeho tuhost). Na základČ výsledkĤ senzorické analýzy lze konstatovat, že u testovaných skupin posuzovatelé oznaþili tavené sýry s 0,25 % w/w L-karagenanu jako signifikantnČ tužší a ménČ roztíratelné (P < 0,05) než výrobky se stejným množstvím N-karagenanu. ZávČr V práci byla srovnávána konzistence tavených sýrĤ s pĜídavky 0,25 % w/w N-karagenanu nebo L-karagenanu s kontrolním vzorkem u celkem 4 skupin výrobkĤ s obsahem 50 % w/w tuku v sušinČ. Použité karagenany zapĜíþinily ve srovnání s kontrolním vzorkem nárĤst elastického modulu pružnosti G´ i ztrátového modulu pružnosti G´´. Z toho plyne, že se tavené sýry v dĤsledku pĜídavku 0,25 % w/w karagenanĤ staly tužšími. NárĤst tuhosti a pokles roztíratelnosti se u pĜídavku karagenanĤ (ve srovnání s kontrolním vzorkem) signifikantnČ projevil i pĜi senzorické analýze testovaných výrobkĤ. Ani u jednoho taveného sýra s karagenany nebyly zjištČny nežádoucí pĜíchuti nebo pachuti. Ze srovnání úþinnosti N-karagenanu a L-karagenanu metodou dynamické oscilaþní reometrie vyplynulo, že pĜídavek 0,25 % w/w L-karagenanu je úþinnČjší ve zvyšování tuhosti a snižování roztíratelnosti tavených sýrĤ oproti N-karagenanu. Tento závČr byl u tĜí ze þtyĜ posuzovaných skupin tavených sýrĤ potvrzen i senzorickou analýzou. PodČkování Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101. Použitá literatura: 1. Simeone, M., Alfani, A., Guido, S. Phase diagram, rheology and interfacial tension of aqueous mixtures of Na-caseinate and Na-alginate. Food Hydrocolloids, 18, 2004, 463 – 470. 2. Thaiudom, S., Goff, H.D. Effect of N-carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures. International Dairy Journal, 13, 2003, 763 – 771. 3. Spagnuolo, P.A., Dalgleish, D.G., Goff, H.D., Morris, E.R. Kappa-carrageenan interactions in systems containing casein micelles and polysaccharide stabilizers. Food Hydrocolloids, 19, 2005, 371 – 377. 4. Ribeiro, K.O., Rodrigues, M.I., Sabadini, E., Cunha, R.L. Mechanical properties of acid sodium caseinate-N-carrageenan gels: effect of co-solute addition. Food Hydrocolloids, 18, 2004, 71 – 79. 5. Singh, H., Tamehana, M., Hemar, Y., Munro, P.A. Interfacial compositions, microstructures and properties of iol-in-water emulsions formed with mixtures of milk proteins and Ncarrageenan: 1. Sodium caseinate. Food Hydrocolloids, 17, 2003, 539 – 548. 6. Imeson, A.P. Carrageenan. In Handbook of hydrocolloids. Eds. Phillips, G.O. & Williams, P.A. Woodhead Publishing Limited and CRC Press: Boca Raton, 2000, 87 – 102. 7. Tziboula, A., Horne, D.S. Influence of milk proteins on N-carrageenan gelation. International Dairy Journal, 9, 1999, 359 – 364. 8. Velíšek, J., Cejpek, K., Davídek, T., Míková, K., Pánek, J., Pokorný, J. Chemie potravin I. 1. vyd. Tábor: OSSIS, 1999, 352 s. 241

9. Syrbe, A., Bauer, W.J., Klostermeyer, H. Polymer Science Concepts in Dairy Systems – An Overview of Milk Protein and Food Hydrocolloid Interaction. International Dairy Journal, 8, 1998, 179 – 193. 10. Augustin, M.A., Puvanenthiran, A., McKinnon, I.R. The effect of N-carrageenan conformation on its interaction with casein micelles. International Dairy Journal, 9, 1999, 413 – 414. 11. Garnier, C., Michon, C., Durand, S., Cuvelier, G., Doublier, J.L., Launay, B. Iota-carrageenan/casein micelles interactions: evidence at different scales. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 31, 2003, 177 – 184. 12. Vega, C., Dalgleish, D.G., Goff, H.D. Effect of N-carrageenan addition to dairy emulsions containing sodium caseinate and locust bean gum. Food Hydrocolloids, 19, 2005, 187 – 195. 13. Langendorff, V., Cuvelier, G., Launay, B., Michon, C., Parker, A., de Kruif, C.G. Casein micelle/iota-carrageenan interactions in milk: influence of temperature. Food Hydrocolloids, 13, 1999, 211 – 218. 14. Langendorff, V., Cuvelier, G., Michon, C., Launay, B., Parker, A., de Kruif, C.G. Effects of carrageenan type on the behaviour of carrageenan/milk mixtures. Food Hydrocolloids, 14, 2000, 273 – 280. 15. Bourriot, S., Garnier, C., Doublier, J.L. Micellar-casein-N-carrageenan mixtures. I. Phase separation and ultrastructure. Carbohydrate Polymers, 40, 1999, 145 – 157. 16. Lynch, M.G., Mulvihill, D.M. Rheology of L-carrageenan gels containing caseins. Food Hydrocolloids, 10, 1996, 151 – 157. 17. Lee, S.K., Anema, S., Klostermeyer, H. The influence of moisture content on the rheological properties of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology, 39, 2004, 763 – 771. 18. ISO Standard No. 8586-1:1993 Sensory analysis – General guidance for the selection, training and monitoring of assessors – Part 1: Selected assessors. International Organization for Standardization, Geneva, 1993. 19. HrabČ, J., KĜíž, O., BuĖka, F. Statistické metody v senzorické analýze potravin [skripta]. 1. vyd. Vyškov : VVŠ PV, 2001, 114 s. 20. Marchesseau, S., Gastaldi, E., Lagaude, A., Cuq, J.L. Influence of pH on Protein Interactions and Microstructure of Process Cheese. Journal of Dairy Science, 80, 1997, 1483 – 1489. 21. Nickerson, M.T., Paulson, A.T., Hallett, F.R. Dilute solution properties of N-carrageenan polysaccharides: effet of potassium and calcium ions on chain conformation. Carbohydrate Polymers, 58, 2004, 25 – 33. 22. Fox, P.F., Guinee, T.P., Cogan, T.M., McSweeney, P.L.H. Fundamentals of Cheese Science. Aspen Publication, 2000, 559 s. 23. MacArtain, P., Jacquier, J.C., Dawson, K.A. Physical characteristics of calcium induced Ncarrageenan networks. Carbohydrate Polymers, 53, 2003, 395 – 400. Kontaktní adresa: MVDr. Michaela ýerníková, Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. 576 031 511, e-mail: [email protected]

242

VLIV VYBRANÝCH HYDROKOLOIDģ NA MECHANICKÉ VLASTNOSTI GELU N-KARAGENANU V MLÉCE Šilhavá Jaroslava, ŠtČtina JiĜí , Loužecký Tomáš Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Influence of selected hydrocoloids on mechanical properties of N-carrageenan gel in milk. Summary: The influence of addition of representative hydrocolloids (guar gum, locust bean gum, tara gum, conjac gum) on mechanical properties and syneresis of carrageenan gels prepared in reconstituted skim milk (10 % w/w) was evaluated. A 0.5 % blend of hydrocolloids standardized to content 10 % of KCl, in which the part of galactomannans or glucomannans was 5 - 50 %, were used for gel preparation. Mechanical properties of gels were evaluated by the puncture test at 10 °C. Solidity, adhesiveness, deformability and firmness were evaluated. Konjac gum had different influence on mechanical properties of carrageenan gels in milk than galactomannans. The former increased the firmness and deformability, while the later decreased firmness and had only low effect on gel deformability. Conjac increased gel solidity up to its content 20 % in mixture with carrageenan, while galactomannans decreased it. The maximum solidity was found for the carrageenan gel mixed with 20 % of conjac gum, whereas the maximum firmness and deformability was found for the gel with 50 % of conjac gum. The least solidity and firmness was found for the gel prepared from the mixture of carrageenan with 50 % guar gum. The gel syneresis decreased as the gum content in blend with carrageenan was increased.

Úvod Kappa-karagenan (lineární sulfatovaný polysacharid tvoĜený opakující se sekvencí E-D-galaktopyranosy a 3,6-anhydro-D-galaktopyranosy)1 je þasto využíván jako želírující prostĜedkem (E407) urþující texturu rĤzných typĤ mléþných dezertĤ. Samotný N-karagenan tvoĜí v mléce tuhý a kĜehký termoreverzibilní gel podléhající syneresi. Mechanické vlastnosti tČchto gelĤ jsou pozitivnČ ovlivnČny interakcemi N-karagenanu s kaseinem, mohou se ovšem lišit podle pĤvodu a zpĤsobu rafinace N-karagenanu1. S cílem minimalizace synereze a zvýšení krémovitosti výrobku jsou þasto kombinovány s dalšími hydrokoloidy, napĜíklad galaktomannany3, polysacharidy tvoĜenými ĜetČzcem E-(1o4)-D-mannopyranosy s rĤzným poþtem substituentĤ D-galaktosy pĜipojených (1o6) D-glykosidickou vazbou.4 Jedná se napĜíklad o guarovou, lokustovou a tara gumu. Guarová guma je dobĜe rozpustná ve vodČ na silnČ viskózní roztoky stabilní v rozmezí pH 4 až 10. Lokusová a tara guma jsou rozpustné až po záhĜevu. NetvoĜí samostatnČ gely, ale zvyšují elasticitu a pevnost gelĤ agaru a karagenanĤ.4 Jiným polysacharidem, který zvyšuje elasticitu a tuhost gelu karagenanu, je glukomannan konjaková guma jehož ĜetČzec tvoĜí jednotky D-mannopyranosy a D-glukopyranosy spojené (1o4) E-glykosidickou vazbou.5 V pĜedchozích pracech6 byly charakterizovány mechanické vlastnosti gelu vzorku rafinovaného N-karagenanu a jeho smČsí s guarovou, lokustovou, tara a konjakovou gumou v rĤzných substrátech, vþetnČ obnoveného mléka. PĜi tČchto experimentech byla použita relativnČ vysoká koncentrace karagenanu, tak aby smČsi tvoĜily dostateþnČ tuhý gel i v þisté vodČ. Cíle této práce bylo doplnit údaje o vlivu uvedených doplĖkových hydrokoloidĤ na mechanické vlastnosti gelu karagenanu v mléce pĜi obsahu smČsi tČchto polysacharidĤ odpovídající aplikacím v mléþných dezertech. Materiály a metody Materiál Hydrokoloidy: rafinovaný karagenan, konjaková guma, lokustová guma, guarová guma, tara guma (TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd) – charakterizaci uvádí Loužecký.6 Z hydrokoloidĤ byla pĜipravena smČs karagenanu s podílem 5-50 % doplĖkového hydrokoloidu, standardizovaná na obsah KCl 10 % hm. Pro pĜípravu substrátu bylo použito sušené odstĜedČné mléko (PML a.s., Nový Bydžov). 243

PĜíprava gelĤ a hodnocení V substrátu (obnovené sušené odstĜedČné mléko; 10g mléka/90g destilované vody). byla rozmíchána 0,5 % smČsi hydrokoloidĤ a míchána 30 minut pĜi 90°C. Vzniklá disperze byla ohĜátá a temperována za souþasného míchání pĜi 90 °C po dobu 30 min a pĜelita do kádinky 400 ml (prĤmČr 7,5 cm) do výšky cca 4 cm (cca 200 ml). Po hodinČ chladnutí na pokojovou teplotu byl gel skladován do druhého dne pĜi 10°C. PĜíprava a mČĜení gelĤ provedena dvakrát. Mechanické vlastnosti vyhodnoceny metodou vtlaþování válcové sondy do gelu (prĤmČr 2 cm; rychlost pohybu sondy 0,5 mm/s; hloubka vtlaþování 25 mm; vysunutí na pĤvodní pozici sondy rychlostí 1 mm/s.) pĜi teplotČ 10°C. MČĜení bylo provedeno na pĜístroji Textrure Analyser TA. XT. plus (Stable Micro Systems UK). Ze zatČžovací kĜivky (Obr. 1) byly vyhodnoceny následující veliþiny: x S - poþáteþní elasticita; smČrnice zatČžovací kĜivky do hloubky 2 mm - vyjadĜuje tuhost [N/mm] x F - síla na mezi pevnosti; vyjadĜuje pevnost [N] x H - hloubka vpichu (pozice sondy) na mezi pevnosti; vyjadĜuje deformovatelnost [mm] x A - práce na pĜekonání tĜení pĜi vytažení sondy; vyjadĜuje pĜilnavost [g.mm] Ve vzorku po hodnocení mechanických vlastností pak byla po jednom dni skladování pĜi teplotČ 10 °C stanoveno množství uvolnČné vody. For ce (N)

1

2

3

4

5

11

10

9

8

H 7

6

5

4

F

3

2

S

A

1

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Tim e (s ec)

vtlaþování sondy do gelu

vysunování sondy z gelu

Obr. 1. PĜíklad zatČžovací kĜivky pĜi hodnocení mechanických vlastností gelu metodou vtlaþování (A – práce na pĜekonání tĜení pĜi vytažení sondy - pĜilnavost; F - síla na mezi pevnosti - pevnost; H - hloubka na mezi pevnosti - deformovatelnost; S – poþáteþní elasticita – tuhost; 1 – hloubka vtlaþení sondy 2 mm, 2 – mez pevnosti; 3 - hloubka vtlaþení sondy 25 mm; 4 – nulová síla pĜi vysunování sondy; 5 – koneþná pozice sondy) Výsledky a diskuse Z charakteru zatČžovací kĜivky (Obr.1) je zĜejmé, že karagenan gely karagenanu v mléce vykazují výraznou lomivost. V prĤbČhu vtlaþování se nejprve potĜebná síla témČĜ lineárnČ zvyšuje až do meze pevnosti pĜi které dochází k výraznému lomu gelu a tudíž prudkému poklesu síly. BČhem dalšího vtlaþování síla již jen kolísá a nedochází k žádnému dalšímu zvýšení. 244

PĜi vysunování sondygel vykazoval relativnČ malou pĜilnavost. Ze srovnání zatČžovacích kĜivek gelĤ s rĤznými doplĖkovými hydrokoloidy (podíl 20%, Obr.2) je vidČt, že zatímco konjak pevnost a lomivost gelu zvyšoval, ostatní gumy naopak snižovaly. NicménČ charakter zatČžovacích kĜivek se nezmČnil. Force (N) 12 11

1

10 9 8

2

7 6

3

5 4

4

3 2

5

1 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Time (sec)

Obr. 2 Vliv druhu doplĖkového hydrokoloidu (1 konjaková guma; 2 samotný karagenan; 3 tara guma; 4 lokustová guma; 5 guarová guma) na charakter zatČžovací kĜivky gelu karagenanu v mléce. Podíl doplĖkového hydrokoloidu 20%. Vliv podílu a druhu doplĖkového hydrokoloidu na jednotlivé sledované mechanické vlastnosti a synerezi gelu karagenanu v mléce je uveden na obrázcích 3 a 4. Z grafĤ je zĜejmé rozdílné pĤsobení galaktomannanĤ a konjaku. Zatímco konjak zvyšuje tuhost (elasticitu) gelu až do podílu ve smČsi s karagenanem 20 % (Obr. 3A), galaktomannany ji naopak snižovaly (poĜadí tuhosti gelu lokust > tara > guar). PĜi vysokém podílu konjaku ovšem tuhost gelu klesla pod tuhost gelĤ s galaktomananny. Konjak zvyšoval i pevnost a deformovatelnost gelu (síla a hloubka vpichu na mezi pevnosti, Obr. 3B a 3C). Zvýšení deformovatelnosti a tím i pevnosti gelu je pĜi podílu konjaku nad 10 % velmi významné, pĜi podílu 50 % již pĜi vtlaþování k prasknutí gelu vĤbec nedošlo. Galaktomannany pevnost gelu naopak snižovaly (poĜadí pevnosti tara > lokust > guar), deformovatelnost ovšem podstatnČji neovlivnily, pouze pĜi nejvyšším podílu lokustové a tara gumy došlo k jejímu mírnému zvýšení. Podobné závislosti byly zjištČny i pĜi dávce hydrokoloidĤ 1,5 %, kdy ovšem tara guma vykazovala vyšší tuhost než lokust (rozdíly mezi tČmito gumami jsou ale vzhledem k jejich podobné struktuĜe málo prĤkazné ) a galaktomannany mírnČ zvyšovaly deformovatelnost gelu v celém rozmezí jejich podílu ve smČsi6. PĜilnavost gelĤ (Obr. 4A) se vyznaþovala znaþnou variabilitou, pravdČpodobnČ vlivem lomivosti gelĤ a tudíž nahodilosti vzniklé struktury po pĜekonání meze pevnosti. Hodnota pĜilnavosti proto také zĜejmČ necharakterizuje lepivost þi krémovitost gelu, ale vykazuje statisticky významnou korelaci s tuhostí gelu (r = 0,82). Rozdíly mezi podíly ve smČsi 5 až 20 % jsou ovšem vzhledem k variabilitČ pĜilnavosti vČtšinou neprĤkazné, ale je zĜejmý pokles pĜilnavosti pĜi vysokém podílu všech doplĖkových hydrokoloidĤ a tedy pĜi poklesu tuhosti gelu. NejvČtší syneresi (cca 2,5 % uvolnČné vody) vykazovaly gely s 5% podílem doplĖkového hydrokoloidu, a to srovnatelnou s gelem samotného karagenanu. Množství uvolnČné vody z gelĤ klesalo s rostoucím podílem doplĖkového hydrokoloidu až na zanedbatelnou hodnoty okolo 0,1 %. 245

A

900 J

L

T

G

800 700 tuhost (N/m)

600 500 400 300 200 100 0 0

10

20

30

40

50

40

50

40

50

podíl doplĖkového hydrokoloidu (%)

B

14 J

L

T

G

12

F [mN]

10 8 6 4 2 0 0

10

20

30

podíl doplĖkového hydrokoloidu [%]

C

14 J

L

T

G

12

H [mm]

10 8 6 4 2 0 0

10

20

30

Podíl doplĖkového hydrokoloidu [%]

Obr. 3 Vliv podílu doplĖkového hydrokoloidu (K – kojaková guma; L – lokustová guma; G – guarová guma; T – tara guma) na tuhost (A), pevnost (B) a deformovatelnost (C) gelu karagenanu v mléce (0,5 % smČsi karagenanu s doplĖkovým hydrokoloidem a 10 % KCl). 246

A

-12

pĜilnavost [mN.m]

-10

-8

-6

-4

-2

0 J

L

T

podíl doplĖkového hydrokoloidu

množství uvolnČné vody (hm. %)

B

0%

5%

G

10%

20%

30%

50%

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

J

L

podíl doplĖkového hydrokoloidu

T 0%

5%

10%

G 20%

30%

50%

Obr. 4 Vliv podílu doplĖkového hydrokoloidu (K – kojaková guma; L – lokustová guma; G – guarová guma; T – tara guma) na pĜilnavost (A) a synerezi (B) gelu karagenanu v mléce (0,5 % smČsi karagenanu s doplĖkovým hydrokoloidem a 10 % KCl). Chybové úseþky pĜedstavují interval spolehlivosti na hladinČ významnosti 95 %.

247

ZávČr Byl charakterizován a kvantifikován vliv bČžných galaktomannanĤ, resp. glukomannanu konjaková guma, na mechanické vlastnosti gelu karagenanu. NejpevnČjší a nejvíce deformovatelný gel obsahuje 50% podíl konjakové gumy, naopak nejmenší pevnost a deformovatelnost mČl gel s podílem 50 % guarové gumy, který zase vykazoval nejlepší vazbu vody. Získané výsledky budou využity pro návrh smČsí hydrokoloidĤ pĜi konkrétních aplikacích karagenanu do mléþných desertĤ. PodČkování Tato práce byla finanþnČ podpoĜena z projektu Ministerstva prĤmyslu a obchodu ýR - MPO þ.FTTA/069 "Standardizace hydrokoloidĤ a jejich aplikace pro potravináĜský prĤmysl“. Projekt je Ĝešen ve spolupráci se spoleþností TRUMF International s.r.o. (Dolní Újezd). Literatura 1. Velíšek J.: Chemie potravin 1, 196 – 245, OSSIS Tábor 2002 2. Imerson A.P.: Carrageenan, In: Handbook of hydrocolloids, (Add Phillips G. O., Williams P.A.), 88 – 102, Woodhead publishing limited, Cambridge 2000 3. Thaidom S., Goff H.D.: Effect of k.carrageenan on milk protein polysacharides mixtures. International Dairy Journal 13, 763 – 771 (2003) 4. Wielinga W.C. :Galactomannans, In: Handbook of hydrocolloids, (Add Phillips G. O., Williams P.A.), 137 - 154, Woodhead publishing limited Cambridge 2000 5. Takigami S.: Konjac mannan., In: Handbook of hydrocolloids, (Add Phillips G. O., Williams P.A.), 413 - 424, Woodhead publishing limited Cambridge 2000 6. Loužecký T., ŠtČtina J.: Reologické vlastnosti gelĤ karagenanu s galaktomannany v mléce, Sborník Celostátní pĜehlídky sýrĤ 2006, 205 – 210, VŠCHT Praha 2006 Kontaktní adresa: Ing. JiĜí ŠtČtina, CSc., Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected]

248

TEXTURNÍ VLASTNOSTI GELģ Ȁ-KARAGENANU S VYBRANÝMI HYDROKOLOIDY V MLÉýNÝCH A SÓJOVÝCH SUBSTRÁTECH Loužecký Tomáš, DvoĜák Milan, DvoĜáková Eva, Šilhavá Jaroslava, ŠtČtina JiĜí Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Textural properties of ț-carrageenan gels with chosen hydrocolloids in milk and soya mixtures Summary: The mixtures of ț-carrageenan with representative hydrocolloids (guar gum, locust bean gum, tara gum and conjac gum) were prepared. The rheological properties and water release were evaluated. For preparation 0.5% mixtures of hydrocolloids standardized to content 10 % of KCl, in which the part of galactomannans or glucomannans was 5 - 50 %, were used. The mixtures of refined ț-carrageenan were prepared in reconstitute skim milk (10 % w/w) and in soya drink (13.5 %) at the temperature 90 °C. The gels were stored after cooling one day at the temperature 10 °C. Mechanical properties of prepared gels were evaluated by the way of compressive method at the temperature 10 °C. The solidity, deformability and firmness were evaluated. The biggest solidity was found out in the gel, where was the mixture of ț-carrageenan with 30 % conjac gum prepared in reconstitute skim milk (27.3 kPa) and with 50 % conjac gum prepared in soya drink (18.0 kPa), whereas the fewest solidity was found out in the gel, where was the mixture of ț-carrageenan with 50 % guar gum prepared in reconstitute skim milk (1.9 kPa) and in soya drink (1.1 kPa). The biggest deformability was found out in the gel, where was the mixture of ț-carrageenan with 50 % conjac gum prepared in reconstitute skim milk (74 %) and in soya drink (78 %), whereas the fewest deformability was found out in the gel, where was the mixture of ț-carrageenan with 50 % guar gum prepared in reconstitute skim milk (24 %) and in soya drink (19 %). The biggest firmness was found out in the gel, where was the mixture of ț-carrageenan with 20 % conjac gum prepared in reconstitute skim milk (36.0 kPa) and with 20 % locust bean gum prepared in soya drink (27.0 kPa), whereas the fewest firmness was found out in the gel, where was the mixture of ț-carrageenan with 50 % guar gum prepared in reconstitute skim milk (6.9 kPa) and in soya drink (5.0 kPa). The gels prepared in reconstitute skim milk released less water (1.7 % w/w), than the gels prepared in soya drink, where was in several cases the amount of released water over 4 % w/w.

ÚVOD Karagenany jsou lineární sulfátované polysacharidy, vyskytující se v þervených moĜských Ĝasách (Rhodophyceae), zejména v rodech Euchema, Chondrus, Gigartina [2]. Základní strukturní jednotkou karagenanu jsou 3,6-anhydro-ȕ-D-galaktopyranosa (1ĺ4) a Į-D-galaktopyranosa (1ĺ3) [5,6]. Existují tĜi základní typy karagenanĤ (kappa, iota, lambda), které se liší poþtem a umístČním sulfátových skupin na jednotce galaktosy [8]. Kappa a iota karagenany vykazují želírující vlastnosti, které jsou závislé na ĜadČ fyzikálnČ-chemických veliþin, zejména na obsahu pĜítomných iontĤ (Na+, K+, Ca2+), pH, iontové síle v roztoku, molekulové hmotnosti a dalších [1,6,7]. Galaktomannany patĜí mezi vČtvené polysacharidy, vyskytující se v semenech mnoha rostlin. Základní ĜetČzec tvoĜí ȕ-D-mannopyranosa (1ĺ4), na které je v urþitých místech vázána Į-D-galaktopyranosa (1ĺ6). NejpoužívanČjšími galaktomannany jsou guarová guma, lokusová guma a tara guma [4,9]. Samotné galaktomannany gely netvoĜí, nČkteré z nich vykazují synergické pĤsobení s karagenanem, stejnČ jako glukomannan konjaková guma [9]. Želírující vlastnosti karagenanĤ a jejich smČsí se þasto využívají v mnoha mléþných výrobcích, kde se uplatĖuje jejich interakce s mléþnými bílkovinami, zejména s kaseinem. Požadované textury výrobku mĤže být dosaženo rovnČž kombinací karagenanu s guarovou nebo lokusovou gumou [10]. NČkteré hydrokoloidy a jejich smČsi se používají pĜi aplikaci v sójových výrobcích, kde ovlivĖují jejich senzorické a reologické vlastnosti [3]. CÍL PRÁCE V provedených mČĜeních byly sledovány texturní vlastnosti smČsí ț-karagenanu s vybranými hydrokoloidy s cílem, porovnat chování smČsí pĜipravených v odstĜedČném obnoveném mléce a v sójovém nápoji z hlediska charakteru vzniklého gelu. Na základČ získaných výsledkĤ pĜípadnČ navrhnout vhodný stabilizátor pro potravináĜské aplikace. 249

MATERIÁL A METODY x hydrokoloidy: rafinovaný ț-karagenan, guarová guma, lokusová guma, tara guma, konjaková guma (TRUMF International s.r.o. , Dolní Újezd). Základní složení vzorkĤ hydrokoloidĤ je uvedeno v Tab. I. x sušené odtuþnČné mléko (PML a.s., Nový Bydžov), mléko bylo obnoveno v destilované vodČ na 10% hm. roztok x sójový nápoj Klasik - sušina 13,5 % hm. (SUNFOOD, Dobruška) x složení smČsi hydrokoloidĤ: smČs ț-karagenanu s 5 - 50 % pĜídavného hydrokoloidu, standardizovaná na obsah KCl 10 % hm. Tabulka I Složení vzorkĤ hydrokoloidĤ (% hm.) sušina bílkoviny ț-karagenan 91,1 0,4 guarová guma 90,7 4,6 lokusová guma 90,5 5,7 tara guma 91,4 2,1 konjaková guma 90,0 0,8

AIS 0,6 3,6 6,7 2,3 1,3

KCl 14,7 0,2 0,6 0,7 0,5

popeloviny 36,1 0,7 1,5 0,8 1,1

K 13,9 0,1 0,3 0,4 0,3

Na 1,0 0,1 0,1 0,1 0,1

Ca 1,7 0,1 0,1 0,0 0,0

AIS - látky nerozpustné v kyselinČ (acid insoluble substances) PĜíprava gelĤ

SmČsi hydrokoloidĤ byly rozpuštČny v odstĜedČném obnoveném mléce a v sójovém nápoji na 0,5% hm. roztoky. PĜipravené smČsi byly po zahĜátí temperovány a míchány ve sklenČných duplikovaných nádobkách po dobu 30 minut pĜi teplotČ 90 °C. Poté byly smČsi pĜelity do plastových zkumavek (50 ml) a po ochlazení na laboratorní teplotu (asi po jedné hodinČ) byly umístČny do termostatu, kde byly skladovány pĜi teplotČ 10 °C do druhého dne. Texturní vlastnosti pĜipravených gelĤ a množství uvolnČné vody (% hm.) z 200 g gelu byly hodnoceny den po skladování pĜi teplotČ 10 °C. Hodnocení mechanických vlastností vzniklých gelĤ

Následující den po pĜípravČ byly vytvoĜeny vzorky gelĤ ve tvaru válce o prĤmČru 27 mm a výšce 30 mm, jejichž mechanické vlastnosti byly hodnoceny metodou stlaþování mezi deskami na pĜístroji TA.XTplus Texture Analyser (Stable Micro Systems, UK). Rychlost pohybu horní desky byla 1 mm/s a maximální deformace vzorku dosáhla 90 %. Ze získané zatČžovací kĜivky byly vyhodnoceny následující veliþiny (Obr. 1): x

napČtí na mezi pevnosti Vmp (kPa), reprezentující pevnost gelu V mp

Fmp h

S r02 h0

x

relativní deformace na mezi pevnosti Hmp (%), která pĜedstavuje deformovatelnost gelu Hmp = ((h0-h)/h0)*100

x

modul pružnosti na mezi pevnosti E (kPa), vyjadĜující tuhost gelu E = Vmp/HHmp , , ,

kde Fmp síla, pĜi které je dosaženo meze pevnosti gelu; r0 poþáteþní polomČr vzorku; h0 poþáteþní výška vzorku (mm), h výška vzorku pĜi lomu (mm) a HHmp = ln(h0/h) Henckyho deformace na mezi pevnosti (-).

250

A1 A2 A3 F1 F2

práce na pĜekonání meze pevnosti (N.mm) práce na maximální stlaþení z meze pevnosti (N.mm) práce na pĜekonání pĜilnavosti vzorku (N.mm) - pĜilnavost mez pevnosti jako síla (N) síla pĜi maximální deformaci (N) tvrdost v ústech

Obr. 1 - PĜíklad zatČžovací kĜivky pĜi stlaþování vzorku gelu mezi deskami.

VÝSLEDKY A DISKUSE A

Gely v obnoveném mléce (0,5% smČsi)

B

30 kĜehkost

kĜehkost

houževnatost (tuhost)

houževnatost (tuhost)

25

pevnost gelu V mp (kPa)

25


Gely v sójovém nápoji (0,5% smČsi)

30

20

15

10

5

20

15

10

5 mČkkost mČkkost

gumovitost

gumovitost

0

0 10

20

30

40

50

60

70

80

90

deformovatelnost gelu H m p (% )

10

20

30

40

50

60

70

80

90

deformovatelnost gelu H mp (% )

Obr. 2 Texturní mapy smČsí ț-karagenanu s doplĖkovými hydrokoloidy v rĤzných substrátech: A - v obnoveném mléce, B - v sójovém nápoji. Samotný karagenan , pĜídavek doplĖkového hydrokoloidu: 5 %, 10 %, 20 %, 30 % a 50%; guarová guma: svČtle šedé symboly, þerné ohraniþení symbolĤ; lokusová guma: þerné symboly, þerné ohraniþení symbolĤ; tara guma: bílé symboly, þerné ohraniþení symbolĤ; konjaková guma: tmavČ šedé symboly, bílé ohraniþení symbolĤ (bez ohraniþení)

251

90

30

80

deformovatelnost gelu H mp (%)


25

20

15

10

5

70 60 50 40 30 20 10

obnovené mléko

sójový nápoj

10%

20%

30%

tara guma

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

samotný karagen

tara guma

obnovené mléko

Podíl doplĖkového hydrokoloidu:

5%

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

samotný karagen

tara guma

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

samotný karagen

tara guma

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

0 samotný karagen

0

sójový nápoj


50%

0

ěada1

5%

10%

20%

30%

50%

0

ěada1

Obr. 3 - Pevnosti gelĤ smČsí ț-karagenanu (vlevo) a deformovatelnosti gelĤ smČsí ț-karagenanu (vpravo) s doplĖkovými hydrokoloidy. 40

5,0 4,5

35

4,0

uvolnČná voda (% hm.)

tuhost gelu E (kPa)

30 25 20 15 10

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0

5

0,5

obnovené mléko

sójový nápoj

10%

20%

30%

50%

tara guma

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

samotný karagen

tara guma

lokusová guma

konjaková guma obnovené mléko


5%

guarová guma

samotný karagen

tara guma

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

samotný karagen

tara guma

lokusová guma

konjaková guma

guarová guma

0,0 samotný karagen

0

sójový nápoj


0

ěada1

5%

10%

20%

30%

50%

0

ěada1

Obr. 4 - Tuhosti gelĤ smČsí ț-karagenanu s doplĖkovými hydrokoloidy (vlevo) a množství uvolnČné vody u smČsí ț-karagenanu s doplĖkovými hydrokoloidy (vpravo). Texturní vlastnosti smČsí ț-karagenanu s vybranými hydrokoloidy pĜipravených v odstĜedČném obnoveném mléce a v sójovém nápoji jsou uvedeny na Obr. 2, kde jsou vyjádĜeny v podobČ texturní mapy, tedy závislosti pevnosti gelu na jeho deformovatelnosti. ZmínČná texturní mapa tedy poskytuje informace o charakteru vzniklých gelĤ z hlediska jejich mechanických vlastností, které jsou z praktického hlediska významné zejména pĜi konzumaci potravináĜských výrobkĤ. Na základČ zmČny pevnosti a deformovatelnosti lze definovat þtyĜi základní ukazatele textury, kterými jsou kĜehkost, houževnatost (tuhost), mČkkost a gumovitost. Kombinací vhodnČ zvolených smČsí hydrokoloidĤ je možné navrhnout texturnČ pĜijatelný výrobek. Pevnosti gelĤ (napČtí potĜebné k porušení struktury gelu) a deformovatelnosti gelĤ (relativní deformace) jsou uvedeny na Obr. 3. Na Obr. 4 jsou uvedeny tuhosti gelĤ, vyjádĜené jako zdánlivé moduly pružnosti a množství uvolnČné vody po dni skladování, které vyjadĜuje synerezi vzniklého gelu. Na základČ tČchto výsledkĤ lze vyvodit následující závČry. x Guarová guma snižuje pevnost a tuhost gelĤ v obnoveném mléce i v sójovém nápoji, deformovatelnost nepatrnČ snižuje do obsahu 30 %, kdy je pokles výraznČjší. x Konjaková guma zvyšuje pevnost gelĤ do podílu 30 % v obnoveném mléce a 50 % v sójovém nápoji. Tuhost gelĤ zvyšuje do obsahu 20 % v obnoveném mléce, resp. 30 % v sójovém nápoji, pĜiþemž deformovatelnost gelĤ zvyšuje od podílu 10 % v obnoveném mléce i v sójovém nápoji. x Lokusová guma snižuje od podílu 20 % tuhost gelĤ v obnoveném mléce i v sójovém nápoji, pĜiþemž do obsahu 20 % tuhost prakticky nemČní. x Tara guma snižuje od podílu 10 % tuhost gelĤ v obnoveném mléce i v sójovém nápoji, pĜiþemž do obsahu 10 % tuhost prakticky nemČní. 252

x

x x

x x

x

x

Lokusová guma a tara guma snižují pevnost gelĤ od obsahu 10 % v obnoveném mléce. V sójovém nápoji do podílu 20 % pevnost nevýraznČ zvyšují, od koncentrace 20 % dochází k poklesu pevnosti gelĤ. Lokusová guma a tara guma nepatrnČ snižují deformovatelnost v obnoveném mléce, zatímco v sójovém nápoji deformovatelnost nepatrnČ zvyšují. Chování smČsí s pĜídavkem lokusové gumy a tara gumy v obnoveném mléce, resp. sójovém nápoji bylo srovnatelné z hlediska charakteru vzniklého gelu (pevnost, deformovatelnost, tuhost). Gely s pĜídavkem guarové gumy pĜipravené v obnoveném mléce vykazovaly vČtší pevnost, deformovatelnost i tuhost, než gely v sójovém nápoji. Gely s pĜídavkem konjakové gumy pĜipravené v obnoveném mléce vykazovaly rovnČž vČtší pevnost, deformovatelnost i tuhost, než gely v sójovém nápoji, s výjimkou smČsi s 50% obsahem konjakové gumy v sójovém nápoji, kde byla deformovatelnost vČtší. Gely s pĜídavkem lokusové gumy a tara gumy pĜipravené v sójovém nápoji vykazovaly nepatrnČ vyšší pevnosti a tuhosti, než gely v obnoveném mléce. Deformovatelnosti byly prakticky totožné. Množství uvolnČné vody se snižovalo s pĜídavkem doplĖkového hydrokoloidu. Nejvíce vody se uvolĖovalo u smČsí s lokusovou gumou a tara gumou s podílem 5 % a 10 %, pĜipravených v sójovém nápoji. Menší množství vody se uvolĖovalo ze smČsí pĜipravených v obnoveném mléce.

ZÁVċR Na základČ získaných výsledkĤ budou navrženy smČsi hydrokoloidĤ vhodné pro aplikace do mléþných a sójových výrobkĤ a desertĤ. PodČkování Tato práce byla finanþnČ podpoĜena z projektu Ministerstva prĤmyslu a obchodu ýR - MPO þ.FT-TA/069 „Standardizace hydrokoloidĤ a jejich aplikace pro potravináĜský prĤmysl“. Projekt je Ĝešen ve spolupráci se spoleþností TRUMF International s.r.o. (Dolní Újezd). Práce byla rovnČž podpoĜena vnitĜním grantem VŠCHT Praha (þ. grantu: 322/08/0016).

LITERATURA: 1. Depypere Frédéric, Verbeken Dirk, Thas Olivier, Dewettinck Koen (2003): Mixture design approach on the dynamic rheological and uniaxial compression behaviour of milk desserts. Food Hydrocolloids, 17: 311 - 320. 2. Dyrby M., Petersen R.V., Larsen J., Rudolf B., Nørgaard L., Engelsen S.B. (2004): Towards online monitoring of the composition of commercial carrageenan powders. Carbohydrate Polymers, 57: 337 - 348. 3. El-Sayed E.M., El-Gawad I.A. Abd, Murad H.A., Salah S.H. (2002): Utilization of laboratory-produced xanthan gum in the manufacture of yogurt and soy yogurt. European Food Research and Technology, 215: 298 - 304. 4. Chen Y., Liao M.-L., Boger D.V., Dunstan D.E. (2001): Rheological characterisation of ț-carrageenan/locust bean gum mixtures. Carbohydrate Polymers, 46: 117 - 124. 5. Chen Yu, Liao Ming-Long, Dunstan Dave E. (2002): The rheology of K+ -ț-carrageenan as a weak gel. Carbohydrate Polymers, 50: 109 - 116. 6. MacArtain P., Jacquier J.C., Dawson K.A. (2003): Physical characteristics of calcium induced ț-carrageenan networks. Carbohydrate Polymers, 53: 395 - 400.

253

7. Nickerson M.T., Paulson A.T., Hallett F.R. (2004): Dilute solution properties of ț-carrageenan polysaccharides: effect of potassium and calcium ions on chain conformation. Carbohydrate Polymers, 58: 25 - 33. 8. Singh Harjinder, Tamehana Michelle, Hemar Yacine, Munro Peter A. (2003): Interfacial compositions, microstuctures and properties of oil-in-water emulsions formed with mixtures of milk proteins and ț-carrageenan: 1. Sodium caseinate. Food Hydrocolloids, 17: 539 - 548. 9. Tako Masakuni, Qi Zhi-Qing, Yoza Eriko, Toyama Seizen (1998): Synergistic interaction between ț-carrageenan isolated from Hypnea charoides LAMOUROUX and galactomannan on its gelation. Food Research International, 31: 543 - 548. 10. Thaiudom S., Goff H.D. (2003): Effect of ț-carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures. International Dairy Journal, 13: 763 - 771.

Kontaktní adresa: Ing. Tomáš Loužecký, Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6 - Dejvice, e-mail: [email protected]

254

ANTIFUNGÁLNÍ VLASTNOSTI ACYLGLYKOSIDģ A JEJICH VYUŽITÍ Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Antifungal properties of acylglycosides and their usage Summary: At present foodstuffs without synthetic additives are preferred. A possibility how to decrease the amount of preservatives, is to substitute them with compounds based on fatty acids and their derivatives. Fatty acid esters with glycerol, glucose and sucrose are commonly used as surfactants and have also a broad spectrum of antimicrobial activity1. These compounds could be therefore used also in dairy industry. The objective of this study was to investigate the susceptibility of Fusarium culmorum DMF 0103 to the antifungal properties of several fatty acids and their esters and verify their activity in a food product. Fatty acids (C10, C11, C12, C16 and C16:1), their corresponding monoacylglycerols, monoacylglucose C16:1 and monoacylfructoses (C12, C14 and C16) were used. Antifungal activity of fatty acids (C10, C11 and C12) and their 1-monoacylglycerols at their highest concentrations was verified in restored milk. A spectrophotometric method (A630) was used for the quantitative detection of the fungal growth. The number of viable spores cultivated in restored milk with the addition of tested compounds was determined by the plate cultivation method. Our results indicate that the addition of tested compounds decreases the number of viable spores. Fatty acids C10 and C11 and their corresponding monoacylglycerols showed the highest antifungal activity. The antifungal effects of the compounds used in restored milk were similar and the inhibition was 20 - 30 %.

Cíl práce: Cílem této práce bylo otestovat antifungální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich esterĤ na kmeni Fusarium culmorum DMF 0103 a ovČĜit jejich aktivitu v potravináĜském výrobku. Byly použity mastné kyseliny (C10, C11, C12, C16 a C16:1), jejich pĜíslušné 1-monoacylglyceroly, monoacylglukosa C16:1 a monoacylfruktosy (C12, C14 a C16). U nejvyšších testovaných koncentrací mastných kyselin (C10, C11 a C12) a jejich 1-monoacylglycerolĤ byla ovČĜena antifungální aktivita v obnoveném odtuþnČném mléce. Úvod: Souþasným trendem v potravináĜství je snaha co nejvíce snížit obsah syntetických aditiv. Jedním z možných Ĝešení je nahrazení konzervaþních látek slouþeninami na bázi mastných kyselin a jejich derivátĤ. Estery mastných kyselin s glycerolem, glukosou a sacharosou jsou bČžnČ používány jako emulgátory a zároveĖ projevují antimikrobiální aktivitu vĤþi širokému spektru mikroorganismĤ1. Tyto látky je proto s úspČchem možné využít také v mlékárenských technologiích. Antifungální vlastnosti mastných kyselin jsou již dlouho známé. Úþinek závisí na délce ĜetČzce, koncentraci a pH prostĜedí. PĜi výbČru optimální délky mastné kyseliny musí být brán ohled nejen na její inhibiþní aktivitu proti danému mikroorganismu, ale také na její rozpustnost2. Mastné kyseliny a jejich estery ovlivĖují rĤst þi germinaci spor plísní. Dochází k inhibici myceliálního rĤstu a germinace konidií3. Mechanismus inhibiþních úþinkĤ mastných kyselin a jejich derivátĤ na mikroorganismy není dosud pĜesnČ znám. PovrchovČ aktivní látky ve vyšších koncentracích zpĤsobují poškození cytoplazmatických membrán, které vedou až k usmrcení buĖky4. K inhibici rĤstu mikroorganismĤ dochází dĤsledkem zmČny bunČþné permeability2. Antimikrobiální efekt je zpĤsoben inkorporací mastných kyselin do bunČþných membrán5. Což zpĤsobuje neuspoĜádanost okolních mastných kyselin a vede ke zvýšení membránové fluidity. Nespecifické zmČny fyzikálních vlastností lipidové dvojvrstvy mohou zpĤsobit zmČny membránových proteinĤ a mČnit tak jejich normální funkci. Lipidová dvojvrstva membrán plísní je tedy primárním cílem úþinku mastných kyselin3. 255

Materiály a metody: Testované látky: Byly použity mastné kyseliny (MK) - kaprinová (C10), undekanová (C11), laurová (C12), palmitová (C16) od firmy Fluka. Kyselina palmitolejová (C16:1) byla izolována z makadamiového oleje na ÚTMT, VŠCHT Praha. PĜíslušné 1-monoacylglyceroly (MAG) mastných kyselin, monoacylgukosa (GLU) C16:1 a monoacylfruktosy (FRU) (C12, C14 a C16) byly syntetizovány na ÚTMT, VŠCHT Praha. ýistota testovaných látek byla 95 % (GLC). Jako rozpouštČdlo testovaných látek byl použit ethanol, který mČl výslednou koncentraci v mediu 2 %. Testované koncentrace: Byly použity koncentrace 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 a 0,8 mmol/l pro všechny látky, kromČ monoacylfruktos (0,625; 1,25; 2,5 a 5 mmol/l). Testovaný mikroorganismus: Fusarium culmorum DMF 0103; koncentrace spor v inokulu byla upravena na 1.105 ml-1. Použitá media: Bujon se sladovým extraktem (MEB), agar se sladovým extraktem (MEA); pH 5,4. Použité potravináĜské výrobky: Sušené mléko - odtuþnČné, Laktino; pH upraveno kyselinou mléþnou na 5,4. Použité metody: Ke stanovení antifungální aktivity testovaných látek bylo použito pĜímé stanovení rĤstu v tekuté pĤdČ (MEB) pomocí multispektrofotometru (630 nm): Suspenze spor plísní byla zaoþkována do sady zkumavek obsahujících medium s danou koncentrací testovaných látek. Z tČchto zkumavek byly naplnČny sterilní mikrotitraþní destiþky, ve kterých probíhala kultivace i mČĜení absorbance. Po 24 h byla na multispektrofotometru promČĜována denzita nárĤstu kultury. Výstupem byly kĜivky závislosti absorbance na þase (240 h). Ke stanovení rĤstu plísnČ v obnoveném mléce byla použita plotnová metoda a detekcí nárĤstu kolonií na pevné pĤdČ (MEA): Suspenze spor plísní byla zaoþkována do sady zkumavek obsahujících obnovené mléko s danou koncentrací testovaných látek. Pro stanovení poþtu životaschopných spor plísnČ byla použita technika poþítání kolonií. Po 24; 96; 120 a 168 h kultivace bylo 0,1 ml obnoveného mléka reinokulováno na povrch agaru. Výstupem byly kĜivky závislosti logCFU na þase (168 h). Výsledky a diskuse: Byly zmČĜeny rĤstové kĜivky testovaného kmene kultivovaného v tekutém mediu v mikrotitraþních destiþkách s pĜídavkem inhibiþních látek po dobu 10 dnĤ (240 h). Výsledky mČĜení byly graficky vyjádĜeny jako rĤstové kĜivky Fusarium culmorum DMF 0103. Z výsledkĤ je patrné, že pĜídavek inhibiþních látek snižuje poþet životaschopných spor. Z obr.1a vyplývá, že v pĜítomnosti kyseliny dekanové dochází k prodloužení lag fáze rĤstu a ke snížení nárĤstu koltury. PĜi použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný nárĤst kultury. Acylfruktosy byly úþinné pouze v nejvyšších použitých koncentracích (viz obr. 1b). Ostatní látky nemČly výrazný inhibiþní úþinek (viz obr. 1c). NČkteré látky (MK C16:1 a její estery) rĤst plísnČ podporovaly (viz obr. 1d). Pro srovnání inhibiþních úþinkĤ testovaných látek byly vypoþteny plochy pod jednotlivými inhibiþními kĜivkami pro jednotlivé koncentrace inhibiþních látek a po srovnání s kontrolou vypoþteny procentuální inhibice rĤstu kultury. Pro vzájemné porovnání použitých látek byly výsledky zracovány do formy pĜehledných map (viz obr. 2). Je patrné, že zvýšení koncentrace vede k vyššímu inhibiþnímu efektu. NČkteré látky rĤst mikroorganismu podporovaly.

256

1,6

1,6

1,4

1,4

1,2

K

1,2

1,0

0,05

1,0

A 0,8

0,10 0,20

A 0,8

0,6

0,40

0,6

0,4

0,80

0,4

K 0,625 1,25 2,5 5

0,2

0,2

a)

0,0 0

50

100

150

200

b)

0,0 0

250

50

100

200

250

Ĳ [h]

Ĳ [h]

1,8

1,8

1,6

1,6

1,4

1,4 K

1,2

A

150

1,0

0,05 0,10

0,8

0,20

0,6

0,40 0,80

0,4

A

0,2

c)

0,0 0

50

100

150

200

K

1,2

250

0,05

1,0

0,10

0,8

0,20

0,6

0,40

0,4

0,80

0,2

d)

0,0 0

50

Ĳ [h]

100

150

200

250

Ĳ [h]

Obr. 1. RĤstové kĜivky F. Culmorum po pĜídavku rĤzných koncentrací (mmol/l) a) MK C10, b) FRU C12, c) MK C16, d) MK C16:1. Pozn.: K – kontrola bez pĜídavku inhibiþních látek. Fusarium culmorum DMF 0103 Slouþenina

Fusarium culmorum DMF 0103

c [mmol/l] 0,05

0,10

0,20

Slouþenina 0,40

0,80

c [mmol/l] 0,625

MK C10

Fru C12

MK C11

Fru C14

MK C12

Fru C16

1,250

2,500

5,000

MK C16

Inhibice

MK C16:1 MAG C10

> 90 %

MAG C11

50 - 90 %

MAG C12

25 - 50 %

MAG C16

0 - 25 % Vyšší nárĤst

MAG C16:1 Glu C16:1

0 - 50 %

Obr. 2. Inhibiþní efekt testovaných látek pĜi všech použitých koncentracích na F. culmorum. Byly zmČĜeny rĤstové kĜivky testovaného kmene kultivovaného v obnoveném odtuþnČném mléce s pĜídavkem inhibiþních látek po dobu 168 h. Výsledky mČĜení byly graficky vyjádĜeny jako rĤstové kĜivky Fusarium culmorum DMF 0103. Pro srovnání inhibiþních úþinkĤ testovaných látek byly vypoþteny plochy pod inhibiþními kĜivkami a po srovnání s kontrolou vypoþteny procentuální inhibice rĤstu kultury. V obnoveném mléce byl úþinek použitých látek vyrovnaný a hodnoty inhibice se pohybovaly mezi 20 – 30 % (viz obr. 3).

257

Inhibice rĤstu

Inhibice rĤstu [%]

100 80 60 40 20 0 MK C10

MK C11

MK C12 MAG C10 MAG C11 MAG C12

Inhibiþní látka

Obr. 3. Inhibice rĤstu F. culmorum po pĜídavku 0,80 mmol/l MK a MAG v obnoveném mléce.

ZávČr: Byly testovány antifungální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich esterĤ na kmeni Fusarium culmorum DMF 0103. Dále byla ovČĜena antifungální aktivita vybraných látek v obnoveném mléce. Z výsledkĤ je patrné, že pĜídavek inhibiþních látek snižuje poþet životaschopných spor. PĜi použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný rĤst plísnČ. Nejvíce úþinné byly mastné kyseliny C10 a C11 a jejich 1-monoacylglyceroly. Acylfruktosy byly úþinné pouze v nejvyšších použitých koncentracích. Ostatní látky nemČly výrazný inhibiþní úþinek. NČkteré látky (MK C16:1 a její estery) rĤst plísnČ podporovaly. V obnoveném mléce byl úþinek použitých látek vyrovnaný a hodnoty inhibice se pohybovaly mezi 20 – 30 %. Literatura: 1. Bergsson G., Arnfinnsson J., Steingrímsson Ó., Thormar H.: In vitro killing of Candida albicans by fatty acids and monoglycerides, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 3209 – 3212 (2001). 2. Kabara J. J., v knize Antimikrobial in Food (Branen A. R., Davidson P. M., Eds.), Marcel Dekker, New York 1993. 3. Avis T. J., Bélanger R. R.: Specificity and mode of action of the antifungal fatty acid cis-9heptadecenoic acid produced by Pseudozyma flocculosa, Apllied and Environmental Microbiology 67 (2001). 4. Šilhánková L.: Mikrobiologie pro potravináĜe a biotechnology. Victoria Publishing, Praha 1995. 5. Gray S. N., Robinson P., Wilding N., Markham P.: Effect of oleic acid on vegetative growth of the aphid-pathogenic fungus Erynia neoaphidis, FEMS Microbiology Letters 68 (1990). Kontaktní adresa: Ing. Tereza Karlová, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6; [email protected]

258

MIKROBIOLOGICKÉ A REOLOGICKÉ VLASTNOSTI VYBRANÝCH PROBIOTICKÝCH SÓJOVÝCH VÝROBKģ DvoĜáková Eva, DvoĜák Milan, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela, Chumchalová Jana, ŠtČtina JiĜí Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Microbial and rheological properties of probiotic soy products Summary: In this study fifteen foreign fermented soy products mostly with probiotic culture were investigated. These fermented soy products were produced by seven companies. The aim of the research was to analyze the characteristics of the products (counts of LAB - Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus and Steptococcus thermophilus, titratable acidity and active acidity). Five products without flavouring were evaluated by rheological properties. The products were fermented below pH 4,5 and their titrable acidities ranged from 48,2 mmol·l-1 to 79,4 mmol·l-1. At the end of the expiration date, fifty percents of the products were declared as „probiotic quality” and reached therapeutic minimum 106 CFU·g-1. The highest total counts of probiotic microorganisms were detected in products of both (commercial) companies SOJADE and BONNETERRE. The highest viscosity and thixotropy were detected in products PROVAMEL natural and CHAMPION natural.

Úvod PomČr probiotických sójových výrobkĤ k neprobiotickým je na francouzském trhu vyšší v porovnání s tuzemským trhem [1]. Jako probiotická kultura se nejþastČji používá ABT kultura (smČs bakterií – rod Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus a Steptococcus thermophilus). Sójové nápoje a média mají vhodné pĜedpoklady pro rĤst probiotických kultur díky svému prebiotickému charakteru [2]. KromČ þasto se vyskytujících vysokých poþtĤ bakterií mléþného kvašení v sójových fermentovaných výrobcích [3], jsou pro konzumenta dĤležité i reologické vlastnosti koagulátu – napĜ. dobrá rozmíchatelnost, minimální uvolĖování sójové syrovátky a vhodná viskozita. Uvedené vlastnosti zvyšují prodejnost výrobkĤ, proto Ĝada výrobcĤ využívá na úpravu textury pĜídavkĤ hydrokoloidních látek zejména rostlinného pĤvodu (pektin, agar, karob, guarová guma, karagenany a modifikované škroby).

Materiál a metody: Analyzované vzorky fermentovaných sójových výrobkĤ (viz Tabulka I a II) byly zakoupeny ve Francii v prodejnách racionální výživy a v supermarketu Champion. Výrobky byly skladovány pĜi teplotČ 6 – 8 °C do data spotĜeby a následnČ analyzovány. U jednotlivých produktĤ byla stanovena aktivní a titraþní kyselost, poþty vybraných bakterií mléþného kvašení a reologické vlastnosti výrobku. Reologické vlastnosti vybraných vzorkĤ bez pĜíchuti byly mČĜeny na reometru RheoStress RS 80 (HAAKE, NČmecko) v uspoĜádání kužel – deska (C60/4, prĤmČr 60 mm s úhlem 4°) pĜi teplotČ 10 °C. Vzorek byl pĜed nanesením vždy normalizovanČ rozmíchán. Po temperaci byla mČĜena závislost viskozity na þase pĜi konstantní smykové rychlosti 10 s-1 resp. 100 s-1 v þasovém rozpČtí 600 s resp 300 s. Dále byl proveden OSC CD frequency sweep test s amplitudou deformace 0,01 a frekvencí 0,1 – 100 Hz. Pro úþely srovnání byly použity hodnoty komplexního modulu púružnosti ve smyku a fázového posunu pĜi frekvenci oscilace 1 Hz. Aktivní kyselost byla stanovena za pomocí pH metru se sklenČnou kombinovanou elektrodou pĜi pokojové teplotČ. Titraþní kyselost byla stanovena titrací 25,0 g (± 0,1 g) vzorku s pĜídavkem 1 ml fenoftaleinu (2%) do pH 8,3 roztokem NaOH (0,1 M) [4].

259

Stanovení poþtu mikroorganismĤ. Poþty rodu Bifidobacterium (bifidobakterie) byly stanoveny na pĤdČ MRS pH 6,8 s L-cysteinem a dicloxacillinem pĜi teplotČ 37 °C, anaerobnČ 3 dny [5]; Lactobacillus acidophilus (acidofily) na pĤdČ MNA pĜi teplotČ 37 °C, anaerobnČ 7 dní [6]; S. thermophilus (streptokoky) na pĤdČ M17 pĜi teplotČ 42 °C, aerobnČ 1 den. Tabulka I Zakoupené sójové fermentované výrobky pro rozbor bez ovocného komponentu Zkratka

Název

C1

Champion natural (Champion)

D1

Sojade natural (Sojade)

P

Provamel natural (Provamel)

S1

Sojasun natural (Sojasun)

T

Bonneterre natural (Bonneterre)

Složení

Nutriþní složení

Obsah

voda, sójový protein 6 %, sójový olej 2,4 %, modifikovaný tapiokový škrob, kultura 209 kJ (50 kcal); bílkoviny 5,3 g; Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus, sacharidy 1,1 g; lipidy 2,7 g sĤl, vitamin E

100 g

sójový nápoj (voda, sója), kultura Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus

210 kJ (50 kcal); bílkoviny 4,5 g; sacharidy 2,4 g; lipidy 2,5 g

100 g


125 g


100 g


125 g

voda, odslupkované sójové boby 9,4 %, tapiokový sirup, stabilizátory: pektin a agar-agar, moĜská sĤl, korektor kyselosti: kyselina citronová, kultura Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus sójový nápoj (voda, sója), fosforeþnan vápenatý, kultura Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus, vitamin E sójový nápoj (voda, sója 13 %), kultura Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus

Výsledky a diskuze: Reologické vlastnosti Viskozita pĜi stálé smykové rychlosti - prokazatelnČ nejvyšší poþáteþní hodnoty viskozity pĜi smykové rychlosti 10 s-1 a 100 s-1 (viz Obr. 1) byly namČĜeny u výrobku PROVAMEL natural, který obsahoval v porovnání s ostatními vzorky kromČ srovnatelného obsahu sójových bílkovin navíc stabilizátor: pektin a agar-agar. Dále následovaly tĜi vzorky – CHAMPION natural s nejvyšším obsahem bílkovin a pĜídavkem stabilizátoru: modifikovaného tapiokového škrobu, SOJADE natural a BONNETERRE natural, u kterých byly rozdíly viskozit na poþátku mČĜení nevýznamné. Nejmenší viskozity jak pĜi smykové rychlosti 10 s-1 tak 100 s-1 vykazoval výrobek SOJASUN natural. NejvČtší diference mezi poþáteþní a koneþnou viskozitou, která charakterizuje míru tixotropie vzorku, byla namČĜena u výrobkĤ PROVAMEL natural a CHAMPION natural. Zatímco pĜi smykové rychlosti 10 s-1 byly jejich diference srovnatelné, u smykové rychlosti 100 s-1 byl pozorován výraznČ vyšší rozdíl u produktu CHAMPION natural. Odlišné reologické chování vzorku CHAMPION natural od ostatních by mohlo naznaþovat rozdíl pĜi výrobČ média, který je i patrný z neobvyklého složení (sójové boby jsou zde nahrazeny sójovým proteinem a sójovým olejem). OSC CD frequency sweep test – z tohoto testu je možné pomocí namČĜených hodnot komplexního modul pružnosti, resp. ztrátového a pamČĢového modulu, posoudit tuhost vzorku, resp. její elastickou viskozitní složku. Úhel fázového posunu pak vyjadĜuje pomČr elastického a viskózitního chování. V pĜípadČ zkoumaných výrobkĤ se hodnoty úhlu fázového posunu pĜi frekvenci oscilace 1 Hz pohybovaly v pomČrnČ úzkém intervalu od 24,4° (SOJASUN natural) do 27,8° (PROVAMEL natural). Z namČĜených úhlĤ fázového posunu je patrné, že vzorek SOJASUN natural má v porovnání s ostatními vzorky nejvíce zastoupenou elastickou složku a vzorek PROVAMEL natural viskozitní složku. 260

6,00

0,70

5,00

0,60 0,50 ƾ [P a .s ]

ƾ [P a .s ]

4,00 3,00 2,00

0,40 0,30 0,20

1,00

0,10 0,00

0,00 Provamel Bonneterre Champion (P) (T) (C1) poþáteþní ƾ

Provamel Bonneterre Champion (P) (T) (C1)

Sojasun Sojade (D1) (S1)

rozdíl poþáteþní a koneþné ƾ

poþáteþní ƾ

Sojasun (S1)

Sojade (D1)

rozdíl poþáteþní a koneþné ƾ

Obr. 1. Hodnoty viskozity pĜi smykové rychlosti 10 s-1 a 100 s-1 u vybraných výrobkĤ bez pĜíchuti

Aktivní a titraþní kyselost Všechny zkoumané výrobky mČly hodnotu pH od 4,0-4,5 (viz Tabulka II), to znamená stejné nebo nižší než je pH isoelektrického bodu hlavní frakce sójové bílkoviny – glycininu [7]. Titraþní kyselost byla vyšší u výrobkĤ s ovocnou pĜíchutí s nízkým pH (Champion ovoce 79,4 mmol·kg-1). U výrobku Provamel natural byla vysoká hodnota zpĤsobena zĜejmČ pĜídavkem kyseliny citrónové. Titraþní kyselost u sójových fermentovaných výrobkĤ je zpravidla oproti mléþným nižší, jedním z dĤvodĤ je i nižší produkce kyselin v médiích na bázi sóji. Tabulka II Hodnoty aktivní a titraþní kyselosti, stanovené poþty bifidobakterií, acidofilĤ a streptokokĤ na konci doby spotĜeby u zkoumaných výrobkĤ. Zkratka

Název

Hodnota pH [-]

Titraþní kyselost [mmol/kg]

Bifidobakterie [JTK/g]

Acidofily [JTK/g]

Streptokoky [JTK/g]

B

BIOCHAMPS jedlé kaštany

4,1

73,6

3,3×104

-

4,1×108

C1

CHAMPION natural

4,3

48,2

3,1×106

1,7×105

3,3×108

C2

CHAMPION þervené ovoce

4,1

79,4

8,4×105

1,2×105

2,0×108

D1

SOJADE natural

4,4

52,1

1,7×107

«103

2,8×108

D2

SOJADE pomeranþ, citron

4,1

68,6

1,6×106

«103

5,5×105

D3

SOJADE þervené ovoce

4,1

63,0

3,6×106

«103

2,2×105

N1

DANONE ananas

4,3

69,3

-

-

7,5×106

N2

DANONE tĜešeĖ, malina

4,3

65,1

-

-

1,5×107

P

PROVAMEL natural

4,0

72,6

-

-

5,9×108

S1

SOJASUN natural

4,5

51,3

3,1×107

4,7×104

6,5×108

S2

SOJASUN mango, citron

4,3

67,9

4,9×103

«103

4,4×108

S3

SOJASUN meruĖka

4,3

67,3

«103

«103

1,1×108

S4

SOJASUN cereálie s ovocem

4,3

65,3

2,0×104

«103

9,2×107

S5

SOJASUN sušená švestka

4,3

64,9

7,3 × 105

1,5×104

1,7×108

T

BONNETERRE natural

4,5

51,5

1,6×107

«103

2,9×108

Poznámka: «103 ménČ než 103 JTK/g - tato skupina mikroorganismĤ nebyla deklarována

261

Poþty mikroorganismĤ TĜi z 15 výrobkĤ nemČly probiotický charakter. Jednalo se o dva výrobky firmy DANONE (ananas a tĜešeĖ, malina), u kterých byla deklarována pĜítomnost monokultury - Steptococcus vegetalis, a výrobek firmy PROVAMEL natural, který byl kultivován jogurtovou kulturou. U ochucených výrobkĤ SOJASUN bylo možno v porovnání s produktem SOJASUN natural pozorovat vliv jednotlivých ovocných komponent na poþty bakterií mléþného kvašení na konci skladování. Nejnižší poþty byly pozorována u výrobku SOJASUN meruĖka (viz Tabulka II). Nejvíce probiotické kultury bylo nalezeno ve výrobcích firmy SOJADE a BONNETERRE (více než 106 JTK·g-1).

ZávČr: Reologii sójových výrobkĤ ovlivĖují výraznČ hydrokoloidní látky – pektin a agar; a zpĤsob pĜípravy sójového média. Z namČĜených dat vyplývá, že sójové médium je vhodné pro probiotické kultury, zvláštČ pro bifidobakterie. Legislativa nedostateþnČ specifikuje poþty probiotické kultury v sójových fermentovaných výrobcích, tudíž všechny výrobky splĖují legislativní požadavky.

PodČkování: Práce byla podpoĜena vnitĜním grantem VŠCHT Praha þ. FIS 322/08/0016 a výzkumným zámČrem CEZ: MSM 6046137305.

Použitá literatura: 1. DvoĜák, M.: Jogurty na bázi sóji s probiotickou mikrofórou. Diplomová práce, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha (2005). 2. Gomes, A. M. P., Marcata, F. X.: Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Trends in Food Science & Technology 10, 139-157 (1999). 3. ŠĤchová, E.: Fermentované sójové výrobky s probiotickou mikrofórou. Diplomová práce, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha (2006). 4. ýSN 570530 Metody zkoušení mléka a tekutin mléþných výrobkĤ. ýeský normalizaþní institut, Praha (1995). 5. Sozzi, T., Brigidi, P., Mignot, O., Matteuzzi, O. (1990). Use of dicloxacillin for the isolation and counting of Bifidobacterium from dairy products. Lait, 70, 357-361. 6. Lankaputhra, W.E., Shah N.P.: A simple method for selective enumeration of Lactobacillus acidophilus in yoghurt supplemented with L. acidophilus and Bifidobacterium sp. Milchwissenschaft 51, 446-451 (1996). 7. Garroa, M. S., de Valdeza, G. F., de Gloria, G. S.: Temperature effect on the biological activity of Bifidobacterium longum CRL 849 and Lactobacillus fermentum CRL 251 in pure and mixed cultures grown in soymilk, Food Microbiology 21, 511-518 (2004).

Kontaktní adresa: Eva DvoĜáková ([email protected]), Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6.

262

PěÍPRAVA GALAKTOOLIGOSACHARIDģ A JEJICH APLIKACE DO MLÉýNÝCH A SÓJOVÝCH MÉDIÍ 1 DvoĜák Milan , DvoĜáková Eva1, Hinková Andrea2, Chumchalová Jana1, ýurda Ladislav1, Hellerová Klára1, Loužecký Tomáš1, Pavlasová Marcela1 1 Ústav technologie mléka a tukĤ, 2Ústav chemie a technologie sacharidĤ Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Preparation of galactooligosaccharides and their application into milk and soy media Summary: The mixture of monosaccharides, disaccharides and the higher galactooligosaccharides (GOS) was produced during the transformation of lactose by use of ȕ-galactosidase. This reaction was used for production of GOS containing mixture of saccharides (MS) in which the following concentrations of components were estimated by use of HPAEC PAD: 11.0 % w/w glucose; 7.8 % w/w galactose; 8.6 % w/w lactose and 5.7% w/w GOS. MS was added in concentrations 0; 5; 10; 15; 20 % w/w to cow skim milk and soy milk inoculated with two different amounts of Bifidobacterium BB12. The effect of MS addition on the growth and acidification activity of Bifidobacterium BB12 was tested. The growth of Bifidobacterium BB12 in aerobic conditions was generally better in soy than in cow milk. Addition of 5 and 10 % w/w MS possessed the stimulative effect on the growth of Bifidobacterium BB12 in cow milk even in the case of lower inoculum of Bifidobacterium BB12. In the case of higher inoculum, the stimulative effect was not obvious. The addition of MS into the soy milk did not significantly influence the growth and acid production of Bifidobacterium BB12. Only a low decrease in GOS content after the fermentations in both types of media was detected.

Úvod Galaktooligosacharidy (GOS) jsou nestravitelné složky potravy, jsou témČĜ rezistentní vĤþi pĤsobení gastrointestinálních enzymĤ a pĜecházejí do tlustého stĜeva, kde jsou využívány probiotickými kmeny bakterií (Bifidobacterium, Lactobacillus), které pozitivnČ ovlivĖují zdraví þlovČka. GOS pĤsobí preventivnČ proti vzniku rakoviny tlustého stĜeva, mají kladný vliv na absorbci minerálních látek, snižují hladinu cholesterolu a ovlivĖují metabolismus lipidĤ [1]. V posledním desetiletí je patrný zvýšený zájem o výrobky s probiotickou mikroflórou. Mléþná média jsou v porovnání se sójovými ménČ vhodná pro rĤst probiotických bakterií. Jednou z možností je aplikace zmínČných GOS pĜipravených enzymatickou hydrolýzou substrátu transgalaktosylaþní aktivitou ȕ-galaktosidasy jako prebiotikum. Funkþním substrátem pro pĜípravu GOS mĤže být laktosa nebo provoznČ výhodnČjší sladká syrovátka [2]. Využívání syrovátky jako vedlejšího produktu a její aplikace do nových druhĤ výrobkĤ mĤže být pro potravináĜský prĤmysl velmi atraktivní. Pro laboratorní aplikace a následné analýzy je vhodnČjší využívat substrát definovaných parametrĤ, kterým je laktosa. Sójové fermentované výrobky na rozdíl od mléþných výrobkĤ obsahují tzv. sójové oligosacharidy (rafinosa, stachyosa). PĜídavek GOS jako další prebiotické složky mĤže ovlivnit množství probiotické kultury ve výrobcích.

Metodika PĜíprava galaktooligosacharidĤ enzymatickou hydrolýzou Pro pĜípravu GOS byla použita laktosa. V prĤbČhu mČĜení bylo pĜipraveno nČkolik šarží obsahujících GOS, z nichž pro pokusy byly vybrány šarže G a H. Pro pĜípravu šarže H bylo použito 200 g laktosy rozpuštČné v 800 g roztoku pufru (0,01M K2HPO4.3 H2O; 0,015M KCl a 0,012M MgCl2.6H2O). Po úpravČ pH na hodnotu 6,75 kyselinou citrónovou o koncentraci 30% hm. a temperaci na 37 °C byl pĜidán enzymový preparát Maxilact LX 5000 v koncentraci 1 g/l. Enzymová reakce probíhala pĜi 37 °C po dobu 30 min. NáslednČ byla ukonþena inaktivací enzymu tepelným záhĜevem v UHT jednotce (95 °C, prĤtok 20 l/h, p = 0,5 bar). TepelnČ ošetĜený produkt byl následnČ zĜedČn demineralizovanou vodou 1 : 1 a pĜefiltrován pĜes ultrafiltraþní jednotku k odstranČní denaturovaného enzymu. Rozdíl v pĜípravČ šarže G byl v množství použité laktosy 263

(300 g) rozpuštČné v 700 g pufru, v množství pĜidaného enzymového preparátu (2 g/l) a ve zpĤsobu inaktivace enzymu (vsádkovČ, 95 °C, 10 min). Vzhledem k malému objemu této šarže nebyl produkt pĜeþištČn ultrafiltrací. PĜíprava média s pĜídavkem galaktooligosacharidĤ (GOS) a jejich fermentace K fermentaci byla použita dvČ média - obnovené odstĜedČné mléko od firmy PML a.s., ýR (dále jen zkratka M) a sójový nápoj Klasik od firmy Sunfood, ýR (dále jen zkratka S). Po jejich sterilaci (100 °C, 20 min) byl do obou médií sterilnČ pĜidán roztok GOS v množství 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % hm. Vzniklé kombinace byly zaoþkovány probiotickou kulturou Bifidobacterium BB12 tak, aby na poþátku fermentace byly v médiích poþty v Ĝádu 106 JTK/g resp. 1010 JTK/g. Fermentace probíhala pĜi 37 °C aerobnČ a byla ukonþena v prvním pĜípadČ po 12, 20, 36 hod a ve druhém pĜípadČ po 20 hod. V uvedených þasech se stanovovaly poþty bifidobakterií, titraþní a aktivní kyselost. PĜíprava vzorkĤ na HPLC pomocí Carrezových þinidel Navážka 10 g vzorku byla vyþeĜena pĜídavkem 3 ml Carrez I (vodný roztok Zn(OAc)2 5,5 g ve 100 ml destilované vody) a 3 ml Carrez II (vodný roztok K4Fe(CN)6 – 2,7 g na 100 ml destilované vody) s následným odstĜedČním (Hettich Universal 320R, Hettich, SRN). KvĤli odstranČní tukové þásti bylo nutno vzorek vytemperovat na teplotu 4 °C. OdstĜedČní probíhalo pĜi stejné teplotČ po dobu 30 minut, pĜi otáþkách 4000 rpm. NáslednČ byl supernatant kvantitativnČ pĜeveden do odmČrné baĖky (50 ml) a doplnČn destilovanou vodou. Vhodné ĜedČní pro stanovení sacharidu na HPLC bylo provádČno ultraþistou vodou (Millipore, Francie). NaĜedČný vzorek byl pĜefiltrován pĜes mikrofiltr 20 ȝm (Millipore, Francie). Stanovení sacharidĤ pomocí HPLC Pro analýzu sacharidĤ byla použita vysokoúþinná chromatografie s kolonou Nucleosil 1000-7-NH2 (250×4 mm) s LSD detektorem, který umožĖuje gradientovou eluci. Detektor byl nastaven na citlivost 500 mV a teplotu 55 °C, teplota kolony 40 °C, prĤtok 1 ml·min-1. Eluce byla nejdĜíve zvolena isokratická s mobilní fází acetonitril - voda (70:30). Dále pak byly provedeny gradientové eluce s rĤznými pomČry acetonitrilu (60 - 99 %). Jako vnČjší standardy byly použity: fruktosa, galaktosa, glukosa, sacharosa, maltosa, rafinosa, verbaskosa, stachyosa a maltotriosa. Objem nástĜiku vzorku byl standardnČ 10 ȝl. Stanovení poþtu mikroorganismĤ Poþty rodu Bifidobacterium (bifidobakterie) byly stanoveny na pĤdČ MRS pH 6,8 s L-cysteinem a dicloxacillinem pĜi teplotČ 37 °C, anaerobnČ 3 dny. Poþet mikroorganismĤ N pĜítomných ve zkoumaném vzorku byl spoþten jako vážený prĤmČr dvou po sobČ následujících ĜedČní v 1 g vzorku [3,4]. U stanovení poþtu bakterií byly zaĜazeny do výpoþtu všechny plotny s koloniemi od poþtu 10 až do 300 JTK/g.

N 6C n1 n2 d

¦C (n1 0,1 n2 ) d

, kde:

souþet kolonií na všech plotnách použitých pro výpoþet; poþet ploten použitých pro výpoþet z prvního zvoleného ĜedČní; poþet ploten použitých pro výpoþet z druhého zvoleného ĜedČní; ĜedČní odpovídající pro první zvolené ĜedČní.

Stanovení aktivní a titraþní kyselosti Aktivní kyselost byla stanovena pomocí pH metru se sklenČnou kombinovanou elektrodou pĜi pokojové teplotČ. Titraþní kyselost byla stanovena titrací 25,0 g (± 0,1 g) vzorku s pĜídavkem 1 ml fenolftaleinu (2%) do pH 8,3 roztokem 0,1 M NaOH [5]. 264

Stanovení sušiny Vzorek byl sušen na pĜístroji METTLER pĜi teplotČ sušení 125 °C do konstantní hmotnosti.

Výsledky a diskuse

Byla vybrána 2 základní média, která se používala pro kultivaci probiotické kultury – mléþné medium (obnovené odstĜedČné mléko) a sójové medium (sójový nápoj Klasik SUNFOOD). U obou médií (tepelnČ ošetĜené 100 °C, 20 min) byla stanovena sušina a sacharidy (viz Tabulka I). Tabulka I Stanovení obsahu sacharidĤ a sušiny v tepelnČ ošetĜeném mléþném a sójovém médiu Název sacharidĤ

Galaktosa Glukosa Fruktosa Sacharosa Laktosa Rafinosa Stachyosa Maltosa Verbaskosa GOS* Celkem sacharidĤ Sušina

Mléþné médium (M) [g/100g vzorku] 0,03 0,01 0,00 0,00 4,11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,08 4,24 9,40%

Sójové médium (S) [g/100g vzorku] 0,00 2,50 0,08 0,60 0,02 0,04 0,32 0,29 0,01 0,00 3,86 13,80%

Poznámka: * GOS a neidentifikované sacharidy

Tabulka II Stanovení obsahu sacharidĤ a sušiny v tepelnČ ošetĜené smČsi pĜipravených GOS (šarže G a H) SmČs GOS SmČs GOS SmČs GOS SmČs GOS Název sacharidĤ (šarže G) (šarže H) (šarže G) (šarže H) [g/100g vzorku] [g/100g vzorku] [%] [%] Galaktosa 7,84 1,77 22,8 16,9 Glukosa 11,87 2,41 34,4 23,0 Fruktosa 0,06 0,00 0,2 0,0 Sacharosa 0,00 0,00 0,0 0,0 Laktosa 8,62 4,92 25,0 46,9 Rafinosa 0,36 0,05 1,0 0,4 Stachyosa 0,00 0,00 0,0 0,0 Maltosa 0,00 0,00 0,0 0,0 Verbaskosa 0,00 0,00 0,0 0,0 GOS* 5,71 1,35 16,6 12,9 Celkem sacharidĤ 34,46 10,49 100,0 100,0 Sušina 35,66% 10,60% Poznámka: * GOS a neidentifikované sacharidy

265

Hodnocení pĜipravených šarží GOS Z pĜipravených smČsí GOS byly k dalším analýzám použity dvČ základní šarže G a H (viz Tabulka II). Šarže G obsahovala 34,46 % sacharidĤ, z toho 5,71 % GOS. U šarže H bylo celkem 10,49 % sacharidĤ a z toho 1,35 % GOS. Z výsledkĤ vyplývá, že šarže G byla více než tĜikrát koncentrovanČjší a tudíž byla vhodnČjší pro pĜípravu fermentaþních smČsí. VýbČr probiotické kultury a její kultivace v mléþném a sójovém médiu Je známo, že rod Bifidobacterium je obecnČ anaerobní. NČkteré kmeny tohoto rodu jsou tolerantnČjší ke kyslíku, což je z provozního hlediska výhodnČjší [6], proto pro pokusy byl použit kmen Bifidobacterium BB 12.

Kultivace Bifidobacterium BB12 s poþáteþním inokulem v Ĝádu 106 JTK/g VČtšina sójových médií na rozdíl od mléþných dosahovala Ĝádu 108 JTK/g již po 12 hod (viz Obrázek 1). Vzorky mléþného média s pĜídavkem 0 %, 15 % a 20 % nebyly ĜádnČ prokysány ani po 20 hodinách a hodnota aktivní kyselosti byla nad pH 5,4, proto byla kultivace prodloužena na 36 h. Nejvyšších hodnot titraþní kyselosti dosáhl vzorek sójového média s pĜídavkem 10 % smČsi GOS (68,7 mmol/kg), u mléþných s 5 % smČsi GOS (66,0 mmol/kg) (viz Tabulka III).

1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00

poþty [JTK/g]

poþty [JTK/g]

Kultivace Bifidobacterium BB12 s poþáteþním inokulem v Ĝádu 1010 JTK/g a sledování zmČny složení sacharidĤ po fermentaci PĜi využití inokula 1010 JTK/g došlo ke koagulaci po 20 hodinách u všech médií (mléþných i sójových). Hodnoty titraþní kyselosti se pohybovaly u všech médií kolem 80 - 90 mmol/kg, poþty bifidobakterií v Ĝádu 108 JTK/g (viz Tabulka IV).

S_0%

S_5%

S_10% S_15% S_20%

M_0%

sójová média s % pĜídavkem GOS (G) 12 hod

1,0E+10 1,0E+09 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 M_5% M_10% M_15% M_20%

mléþná média s % pĜídavkem GOS (G)

20 hod

12 hod

20 hod

36 hod

Obrázek 1 - Celkové poþty kultury Bifidobacterium BB12 v prĤbČhu kultivace pĜi teplotČ 37 °C, aerobnČ v sójových médiích (vlevo; 12 a 20 hod) a mléþných médiích (vpravo; 12, 20 a 36 hod) s pĜídavkem s pĜídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % smČsi GOS (G)

U sójových médií se množství sacharidĤ po fermentaci snížilo v prĤmČru o 20 %, u mléþných pouze o 10 %, nejménČ u mléþného média s 0 % pĜídavkem GOS. Galaktooligosacharidy významnČ ovlivĖovaly fermentaci obou médií vybranou probiotickou kulturou. Fermentace sójových oligosacharidĤ byla v sójových médiích využita více, než u médií s nízkým nebo žádným pĜídavkem GOS. Stanovené množství sacharidĤ po zmínČné fermentaci je uvedeno níže (viz Tabulka V).

266

Tabulka III Hodnoty aktivní a titraþní kyselosti po 12 a 20 hod kultivaci kultury Bifidobacterium BB12 pĜi teplotČ 37 °C aerobnČ – v mléþných (M) a sójových médiích (S) s pĜídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % smČsi GOS (G) pH [-]

Médium

titraþní kyselost [mmol/kg]

12 hod

20 hod

12 hod

20 hod

M_0%

6,5

6,5

17,3

17,7

M_5%

6,5

4,7

17,5

66

M_10%

6,5

4,9

17,5

60,4

M_15%

6,5

5,4

17,6

34,8

M_20%

6,4

5,8

17,8

25,5

S_0%

5,8

5,1

24,3

42,1

S_5%

5,5

4,6

32,3

59,7

S_10%

5,6

4,5

29,4

68,7

S_15%

5,5

4,6

29,8

62,4

S_20%

5,5

4,6

28,2

60,1

Tabulka IV SpotĜeba GOS (galaktooligosacharidĤ), SOS (sójových oligosacharidĤ) a celková spotĜeba sacharidĤ bČhem fermentace, dosažené poþty Bifidobacterium BB12 a hodnoty titraþní a aktivní kyselosti po 20 hod fermentace pĜi 37 °C, aerobnČ – fermentace mléþného (M) a sójového (S) média s pĜídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % smČsi GOS (G)

Vzorek

SpotĜeba sacharidĤ bČhem fermetance GOS* SOS Celkem

Poþty bifidobakterií [JTK/g]

Titraþní kyselost [mmol/kg]

pH [-]

M_0%

-49,6%

-

-3,3%

2,9x108

79

4,6

M_5%

-26,2%

-

-4,3%

1,3x108

88,8

4,5

M_10%

-33,7%

-

-15,1%

1,2x108

83,3

4,6

M_15%

-30,9%

-

-8,7%

1,0x108

86,9

4,5

M_20%

-28,7%

-

-7,4%

7,1x107

80,5

4,5

S_0%

0,0%

-9,7%

-24,6%

2,4x108

84,5

4,3

S_5%

-43,9%

-8,7%

-22,4%

2,2x108

84,9

4,4

S_10%

-43,6%

-5,4%

-23,4%

4,3x108

86,1

4,3

S_15%

-43,0%

-4,1%

-19,9%

5,8x108

82,9

4,4

S_20%

-43,0%

-0,1%

-18,7%

2,2x108

79,4

4,4

267

Tabulka V Množství sacharidĤ po fermentaci mléþného (M) a sójového (S) média s pĜídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % smČsi GOS (G), sušiny vzorkĤ Množství sacharidĤ v g na 100 g vzorku

Vzorek

Galaktosa Glukosa Fruktosa Sacharosa Laktosa Rafinosa Stachyosa Maltosa Verbaskosa

Sušina [%]

GOS*

Celkem

M_0%

0,15

0,03

0,00

0,00

3,88

0,00

0,00

0,00

0,00

0,04

4,10

9,30

M_5%

0,43

0,25

0,03

0,12

4,39

0,02

0,00

0,00

0,00

0,27

5,51

10,20

M_10%

0,67

0,61

0,02

0,22

4,19

0,04

0,00

0,00

0,00

0,43

6,17

11,40

M_15%

1,04

1,14

0,02

0,36

4,74

0,06

0,00

0,01

0,00

0,64

8,01

12,60

M_20%

1,37

1,64

0,03

0,49

5,04

0,08

0,00

0,02

0,00

0,86

9,52

14,00

S_0%

0,00

1,88

0,10

0,30

0,01

0,04

0,29

0,28

0,01

0,00

2,91

13,60

S_5%

0,23

2,29

0,11

0,46

0,32

0,06

0,28

0,26

0,00

0,16

4,18

14,20

S_10%

0,52

2,52

0,11

0,57

0,65

0,08

0,27

0,25

0,01

0,32

5,30

15,30

S_15%

0,86

3,01

0,10

0,70

1,02

0,09

0,27

0,23

0,00

0,49

6,77

16,50

S_20%

1,22

3,35

0,10

0,81

1,38

0,11

0,26

0,23

0,00

0,65

8,12

17,70

G

7,84

11,87

0,06

0,00

8,62

0,36

0,00

0,00

0,00

5,71

34,46

35,70

M

0,03

0,01

0,00

0,00

4,11

0,00

0,00

0,00

0,00

0,08

4,24

9,40

S

0

2,5

0,08

0,6

0,02

0,04

0,32

0,29

0,01

0

3,86

13,9

ZávČr ¾ Kmen Bifidobacterium BB12 je velmi vhodný pro provozní využití - fermentuje sójová i mléþná média za aerobních podmínek. ¾ Bifidobacterium BB12 v sójových médiích roste dobĜe i bez pĜídavku GOS, pĜídavek mírnČ podporuje rĤst. ¾ Kultivace Bifidobacterium BB12 v kravském mléce je obtížná, avšak pĜídavek 5 % a 10 % smČsi GOS významnČ ovlivĖuje fermentaci. Po 20 hodinách kultivace s inokulem v Ĝádu 108 JTK/g dochází ke koagulaci. Médium bez pĜídavkĤ GOS nebo s vyššími pĜídavky do 20 hod nekoaguluje. ¾ Mléþná i sójová média mohou zkoagulovat do 20 hod od zaþátku fermentace v pĜípadČ použití inokula v Ĝádu 1010 JTK/g. PodČkování: Práce byla podpoĜena vnitĜním grantem VŠCHT Praha þ. FIS 322/08/0016 a výzkumným zámČrem CEZ: MSM 6046137305. Použitá literatura: 1. Crittende RG, Playne MJ.: Production, properties and application of food-grade oligosaccharides. Trends in Food Science and Technology 7: 353-361 (1996). 2. Mahoney RR.: Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis. Food Chemistry 63: 147-154 (1998). 3. ýSN ISO 7218 (56 0103) Mikrobiologie potravin a krmiv – Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. ýeský normalizaþní institut, Praha (1998). 4. ýSN ISO 8261 (56 0111) Mléko a mléþné výrobky – PĜíprava analytických vzorkĤ a ĜedČní pro mikrobiologické zkoušení. ýeský normalizaþní institut, Praha (1995). 5. ýSN 570530 Metody zkoušení mléka a tekutin mléþných výrobkĤ. ýeský normalizaþní institut, Praha (1995). Kontaktní adresa: Milan DvoĜák ([email protected]), Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6.

268

LABTECH PRAHA spol. s r.o. Kováků 26 150 00 Praha 5 tel. 257328175, 606737749 fax 257323278 [email protected]

Analytické přístroje ALLIANCE INSTRUMENTS pro potravináře ( především pro mlékárenský průmysl )

OPTIGRAPH - sledování časového vývoje koagulace mléka prostřednictvím měření transmitance NIR signálu současně v deseti vzorcích mléka. Důležité informace pro optimalizaci výrobního procesu sýrů (doba koagulace, vývoj tuhosti ).

CINAC - současné sledování až 32 hodnot ( teplota, pH, vodivost, redox) charakterizujících průběh acidifikace při procesech v mlékárenském průmyslu.

INFRASCAN - NIR spektrofotometr pro široké použití v potravinářském průmyslu např. měření vlhkosti, obsahu tuků, proteinů atd.

FUTURA - kontinuální průtokový analyzátor (CFA) vhodný v potravinářství např. pro analýzu dusičnanů, dusitanů, močoviny atd.

Hygienický audit

GHP + HACCP

ÿeská republika MERAK, spol. s r.o. Podnásepní 1d 602 00 Brno Tel.: 548 210 777 Fax: 548 210 666 e-mail: [email protected] www.merak.cz

Slovensko MERAK, spol. s r.o. BáĀ 126 930 30 BáĀ Tel.: 031/5501171 Fax: 031/5501172 e-mail: [email protected] www.merak.sk

SanitaĀní plány

SanitaĀní zaĢízení

Servis sanitaĀního zaĢízení

CIP stanice

Školení personálu

Ekonomika sanitace

Program snižování AOX

Dávkovací a mďĢící technika

Nakládání s chemickými pĢípravky

ÿistící a desinfekĀní prostĢedky

Laboratorní, analytická a prĤmyslová technika Elektrochemie Ĝada pĜístroju ORION Star Firma Thermo Fisher SCIENTIFIC ORION ELECTROCHEMISTRY PRODUCTS nabízí progresivní technologii vþetnČ pĜíslušenství, unikátní strukturu prĤvodce menu a nejvyšší kvalitu mČĜení vþetnČ IQ/OQ/PQ. Zabudovaný GLP systém zajišĢuje analytickou integritu, metody mČĜení a kalibraþní data. Software STAR NAVIGATOR 21 zabezpeþuje namČĜená data, jejich archivaci, systém validace a kontrolu prĤbČhu zpracování dat.

MČĜení: Ŷ pH / mV / ORP / °C Ŷ rozpuštČného kyslíku

Ŷ ISE iontovČ selektivní stanovení Ŷ vodivosti, salinity a TDS

Jedno, dvou a multi parametrové mČĜící pĜístroje v laboratorním nebo pĜenosném provedení v kombinaci s mČĜícími sondami a rĤzným pĜíslušenstvím ( pH, ISE elektrody, vodivostní a DO sondy, teplotní ATC þidla, elektrolyty certifikované NIST pH pufry, standardy pro mČĜení Redox potenciálu, standardy pro mČĜení vodivosti, uchovávací a þistící roztoky pro pH elektrody ) www.neotec.cz/orion

Speciální aplikaþní sety pro stanovení: Ŷ pH

Ɣ v sýrech Ɣ v mléce

Ŷ chloridĤ

Ɣ v sýrech Ɣ v mléce

Ŷ vápníku

Ɣ v mléce

Ŷ draslíku

Ɣ v mléce

Ŷ vodivosti USP (645)

Ɣ ultra destilované vody

Laboratorní technika, prĤmyslová technologie

IKA£

LABORATORNÍ TECHNIKA:

tĜepaþky, topné láznČ, termostaty magnetické míchaþky, homogenizátory extraktory, mlýnky, rotaþní odparky laboratorní reaktory, míchací motory

VÝROBNÍ A POLOPROVOZNÍ ZAěÍZENÍ:

Dispergaþní technologie – vsádková a kontinuální Míchací, smČšovací a homogenizaþní zaĜízení HnČtaþe - kontinuální, vertikální a horizontální Kompletní emulgaþní a míchací sestavy

NEOTEC, spol. s r.o. Jinonická 804/80 158 00 Praha 5

http: www.neotec.cz http: www.neotec.cz/orion e-mail: [email protected]

Tel: 257 289 511 Fax: 233 312 515 [email protected]

Specialisté v oboru molekulové spektroskopie FT-NIR analyzátory potravináĜských výrobkĤ Stanovení bČžných parametrĤ potravináĜských výrobkĤ za nČkolik minut, bez destrukce vzorku a potĜeby chemikálií. Zakázkový vývoj metod, vþetnČ automatizace stanovení, bezplatné pĜedvedení pĜístrojĤ s možností mČĜení vlastních vzorkĤ.

Servisní práce zdarma.

Aplikaþní, servisní a obchodní stĜedisko:

Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem 11 106 00 Praha 10

T/F: 272 760 432, 272 768 569 Mobil: 602325829, 603554788, 603725812

ThermoScientific FTIR, FTNIR, Raman, Microscopy

Kvalita spektrometrĤ Nicolet ovČĜena více než 250 uživateli v ýR a SR.

100-TCAV-inzerat-defi-A

22.1.2007

14:32

Str. 1

JAK dosáhnout lep‰ích v˘sledkÛ ve va‰em v˘zkumu a v˘voji? Jak zv˘‰it konkurenceschopnost va‰í firmy? Jste vûdeck˘ pracovník a hledáte nové moÏnosti v˘zkumné spolupráce?

Jste spoleãnost, která vyvinula zajímavou technologii a hledá moÏnosti jejího uplatnûní na zahraniãních trzích?

Nebo naopak urãité technologické fie‰ení hledáte?

VyuÏijte sluÏeb TECHNOLOGICKÉHO CENTRA AV âR jako jedné z moÏností jak jak jak jak

získat partnera pro v˘zkum nebo v˘voj získat zájemce o zakoupení va‰í inovaãní technologie získat inovaãní technologie pro zv˘‰ení va‰í konkurenceschopnosti si nechat ocenit va‰i technologii nebo získat pomoc pfii sjednávání a uzavírání licenãních smluv jak se zúãastnit mezinárodních technologick˘ch burz jak získat nové poznatky z oblasti inovací v rámci ‰kolení

Kontakty pro spolupráci a nabídky, resp. poptávky po technologiích si po registraci mÛÏete vyhledat nebo zadat sami na: www.circ.cz/hledate-technologii/ nebo nás mÛÏete kontaktovat: Potraviny: Jaroslav Lorenz, tel.: 234 006 139, 724 247 076, www.circ.cz Biotechnologie: Radka Hávová, tel.: 234 006 138, 724 331 015, www.circ.cz Programy ‰kolení: www.cett.cz nebo pfiímo Barbora MachoÀová, [email protected], tel.: 234 006 156

CHCETE se zapojit do mezinárodních v˘zkumn˘ch programÛ EU? 7. rámcov˘ program EU pro v˘zkum, technologick˘ rozvoj a demonstrace 2007 – 2013 pfiiná‰í fiadu pfiíleÏitostí jak pro v˘zkumné organizace a univerzity, tak i pro prÛmyslové podniky jak získat finanãní pfiíspûvek na v˘zkumné a v˘vojové aktivity v fiadû oborÛ. Informace o 7. rámcovém programu EU najdete na www.fp7.cz Kontakt pro oblast Zemûdûlství, potraviny, biotechnologie v 7. rámcovém programu: Naìa Koníãková, [email protected], tel.: 234 006 109 www.tc.cz

CELOSTÁTNÍ PěEHLÍDKY SÝRģ 2007 Výsledky pĜehlídek a sborník pĜednášek semináĜe „Mléko a sýry“

Vydavatel:

Vysoká škola chemicko technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6

Editor:

ŠtČtina J., ýurda L.

Tisk:

KANAG – TISK, s.r.o. Technická 5, 166 28 Praha 6

Rok vydání:

2007

Poþet stran:

282

ISBN

978-80-7080-661-6

Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah pĜíspČvkĤ odpovídají autoĜi.

ISBN 978-80-7080-661-6

CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR 2007

Recommend Documents