pagina 1/20
CAT Critically Appraised Topic Flowcytometrische immunofenotypering van lymfeklieraspiraat/-biopsie Auteur: apr. Dries Coenen Supervisor project: prof. dr. Nancy Boeckx Supervisor methodologie/search: dr. Johan Frans Presentatiedatum: 12 december 2006 Vervaldatum: 12 december 2008 CLINICAL BOTTOM LINE Immunofenotypering van lymfeklierweefsel speelt een belangrijke rol bij de diagnose en classificatie van lymfomen. De technieken die gebruikt kunnen worden voor immunofenotypering zijn immunohistochemie (dienst pathologische ontleedkunde) en flowcytometrie (dienst LAG). De voor- en nadelen volgens de literatuur van flowcytometrie ten opzichte van immunohistochemie worden in deze CAT besproken. In overleg met de hematologen en anatomopathologen moet op basis van deze gegevens beslist worden of de dienst LAG flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel zal gaan uitvoeren. CLINICAL/DIAGNOSTIC SCENARIO Lymfomen vormen een belangrijke groep binnen de lymfoproliferatieve aandoeningen en worden onderverdeeld in Hodgkin lymfomen en non-Hodgkin lymfomen (NHL). De WHOclassificatie voor lymfoproliferatieve aandoeningen [zie attachment 1] is gebaseerd op multidisciplinaire bevindingen waarbij immunofenotypering een belangrijke rol speelt. Immunofenotypering met behulp van flowcytometrie maakt gebruik van gelabelde monoklonale antilichamen waarmee specifieke antigenen op de membraan of in de cel aangetoond kunnen worden. In het kader van diagnose, classificatie en follow-up van lymfomen wordt flowcytometrische immunofenotypering op LAG toegepast op perifeer bloed en beenmergaspiraten. Een aantal types van NHL gaan immers vaak gepaard met lokalisatie in het beenmerg en het bloed (leukemische lymfomen), andere types zijn zelden leukemisch [zie attachment 2]. Flowcytometrie vereist suspensie van individuele cellen. Indien uitgaande van lymfeklierweefsel (bekomen via chirurgische biopsie of via fijne naald aspiratie) celsuspensies bereid kunnen worden, kan flowcytometrische immunofenotypering hierop ook toegepast worden. Momenteel wordt in het UZ Gasthuisberg op lymfeklierweefsel enkel immunofenotypering met behulp van immunohistochemie gedaan. Dit wordt uitgevoerd door de anatomopathologen. Deze kritische testevaluatie zal nagaan of flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel volgens de literatuur een meerwaarde kan hebben bij de diagnose en classificatie van lymfomen.
pagina 2/20 QUESTION(S) •
Wat is de waarde van flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel bij de diagnose en classificatie van lymfomen volgens de literatuur?
•
Wat zijn de voordelen/nadelen immunohistochemie?
van
flowcytometrie
in
vergelijking
met
SEARCH TERMS 1) MeSH Database (PubMed): MeSH term: “flow cytometry”, “immunophenotyping”, “lymphoma/diagnosis”. 2) PubMed Clinical Queries (from 1966; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi): Systematic Reviews; Clinical Queries using Research Methodology Filters (diagnosis + specific, diagnosis + sensitive, prognosis + specific): Search term: “fine needle aspiration”, “lymph node biopsy”. 3) Pubmed (Medline; from 1966), SUMSearch (http://sumsearch.uthscsa.edu/), National Guideline Clearinghouse (http://www.ngc.org/), Institute for Clinical Systems Improvement (http://www.icsi.org), The National Institute for Clinical Excellence (http://www.nice.org.uk/), Cochrane (http://www.update-software.com/cochrane, Health Technology Assessment Database (http://www.york.ac.uk/inst/crd/htahp.htm) 4) Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA; http://www.cms.hhs.gov/clia/) 5) BSCH guidelines (http://www.bschguidelines.org/search.asp), ESMO Minimum Clinical Recommendations (http://www.esmo.org) American Society of Hematology (http://www.hematology.org), Leukemia and Lymphoma Society (http://www.leukemialymphoma.org), Diagnostisch Kompas (http://www.dk.cvz.nl), SIHON (http://www.sihon.nl), International Society for Analytical Cytology (www.isac-net.org), EBM guidelines (www.ebm-guidelines.com), UK-NEQAS (http://www.ukneqas.org). 6) UpToDate Online version 14.2 (2006) RELEVANT EVIDENCE/REFERENCES Guidelines and Recommendations 1) European Society for Medical Oncology. ESMO Minimum Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow-up of 1) newly diagnosed follicular lymphoma, 2) chronic lymphocytic leukaemia, 3) Hodgkin’s disease, 4) newly diagnosed large cell non-Hodgkin’s lymphoma, 5) relapsed diagnosed large cell non-Hodgkin’s lymphoma. Ann Oncol. 2005;16 Suppl 1. 2) British Committee for Standards in Haematology (BCSH). Diagnosis and therapy for nodal non-Hodgkin's lymphoma. 2002. 3) British Committee for Standards in Haematology (BCSH).
Revised guideline on immunophenotyping in acute leukaemias and chronic lymphoproliferative disorders. Clin Lab Haematol. 2002 Feb;24(1):1-13.
pagina 3/20 4) The Belgian Association for Cytometry/Belgische Vereniging voor Cytometrie / Association Belge de Cytometrie. Van Bockstaele DR, Deneys V, Philippe J, Bernier M, Kestens L, Chatelain B, De Waele M, Demanet C. Belgian consensus recommendations for flow cytometric immunophenotyping. Acta Clin Belg. 1999 Apr;54(2):88-98. 5) CLSI (formerly NCCLS). Clinical Applications of Flow Cytometry: Immunophenotyping of Leukemic Cells; Approved Guideline. H43-A. 1998. 6) Davis BH, Foucar K, Szczarkowski W, Ball E, Witzig T, Foon KA, Wells D, Kotylo P, Johnson R, Hanson C, Bessman D. U.S.-Canadian Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematologic neoplasia by flow cytometry: medical indications. Cytometry. 1997 Oct 15;30(5):249-63.
Systematic Reviews and Meta-analyses Geen gevonden. Reviews 7) Dey P. Role of ancillary techniques in diagnosing and subclassifying non-Hodgkin's lymphomas on fine needle aspiration cytology. Cytopathology. 2006 Oct;17(5):27587. 8) Szczepanski T, van der Velden VH, van Dongen JJ. Flow-cytometric immunophenotyping of normal and malignant lymphocytes. Clin Chem Lab Med. 2006;44(7):775-96. 9) Gudgin EJ, Erber WN. Immunophenotyping of lymphoproliferative disorders: state of the art. Pathology. 2005 Dec;37(6):457-78. 10) Jorgensen JL. State of the Art Symposium: flow cytometry in the diagnosis of lymphoproliferative disorders by fine-needle aspiration. Cancer. 2005 Dec 25;105(6):443-51. 11) Caraway NP. Strategies to diagnose lymphoproliferative disorders by fine-needle aspiration by using ancillary studies. Cancer. 2005 Dec 25;105(6):432-42. 12) Dunphy CH. Applications of flow cytometry and immunohistochemistry to diagnostic hematopathology. Arch Pathol Lab Med. 2004 Sep;128(9):1004-22. 13) Braylan RC. Impact of flow cytometry on the diagnosis and characterization of lymphomas, chronic lymphoproliferative disorders and plasma cell neoplasias. Cytometry A. 2004 Mar;58(1):57-61. 14) Stetler-Stevenson M. Flow cytometry in lymphoma diagnosis and prognosis: useful? Best Pract Res Clin Haematol. 2003 Dec;16(4):583-97.
pagina 4/20 15) Sandhaus LM. Fine-needle aspiration cytology in the diagnosis of lymphoma. The next step. Am J Clin Pathol. 2000 May;113(5):623-7. 16) Ward MS. The use of flow cytometry in the diagnosis and monitoring of malignant hematological disorders. Pathology. 1999 Nov;31(4):382-92. 17) Das DK. Value and limitations of fine-needle aspiration cytology in diagnosis and classification of lymphomas: A review. Diagn Cytopathol. 1999 Oct;21(4):240-9. 18) Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J, Lister TA, Bloomfield CD. The World Health Organization classification of neoplasms of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee meeting—Airlie House, Virginia, November, 1997. Hematol J. 2000;1(1):53-66. 19) Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood. 1997 Oct 15;90(8):2863-92.
Original Articles 20) Dey P, Amir T, Al Jassar A, Al Shemmari S, Jogai S, Bhat M G, Al Quallaf A, Al Shammari Z. Combined applications of fine needle aspiration cytology and Flow cytometric immunphenotyping for diagnosis and classification of non Hodgkin Lymphoma. Cytojournal. 2006 Oct 27;3:24. 21) Mathiot C, Decaudin D, Klijanienko J, Couturier J, Salomon A, Dumont J, Vielh P. Fine-needle aspiration cytology combined with flow cytometry immunophenotyping is a rapid and accurate approach for the evaluation of suspicious superficial lymphoid lesions. Diagn Cytopathol. 2006 Jul;34(7):472-8. 22) Pugh JL, Jhala NC, Eloubeidi MA, Chhieng DC, Eltoum IA, Crowe DR, Varadarajulu S, Jhala DN. Diagnosis of deep-seated lymphoma and leukemia by endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy. Am J Clin Pathol. 2006 May;125(5):703-9. 23) Laane E, Tani E, Bjorklund E, Elmberger G, Everaus H, Skoog L, Porwit-MacDonald A. Flow cytometric immunophenotyping including Bcl-2 detection on fine needle aspirates in the diagnosis of reactive lymphadenopathy and non-Hodgkin's lymphoma. Cytometry B Clin Cytom. 2005 Mar;64(1):34-42. 24) Sigstad E, Dong HP, Davidson B, Berner A, Tierens A, Risberg B. The role of flow cytometric immunophenotyping in improving the diagnostic accuracy in referred fine-needle aspiration specimens. Diagn Cytopathol. 2004 Sep;31(3):159-63. 25) Ravoet C, Demartin S, Gerard R, Dehon M, Peny MO, Petit B, Delannoy A, Husson B. Contribution of flow cytometry to the diagnosis of malignant and non malignant conditions in lymph node biopsies. Leuk Lymphoma. 2004 Aug;45(8):1587-93. 26) Zeppa P, Marino G, Troncone G, Fulciniti F, De Renzo A, Picardi M, Benincasa G, Rotoli B, Vetrani A, Palombini L. Fine-needle cytology and flow cytometry
pagina 5/20 immunophenotyping and subclassification of non-Hodgkin lymphoma: a critical review of 307 cases with technical suggestions. Cancer. 2004 Feb 25;102(1):55-65. 27) Battaglia A, Ferrandina G, Buzzonetti A, Malinconico P, Legge F, Salutari V, Scambia G, Fattorossi A. Lymphocyte populations in human lymph nodes. Alterations in CD4+ CD25+ T regulatory cell phenotype and T-cell receptor Vbeta repertoire. Immunology. 2003 Nov;110(3):304-12. 28) Martinez A, Aymerich M, Castillo M, Colomer D, Bellosillo B, Campo E, Villamor N. Routine use of immunophenotype by flow cytometry in tissues with suspected hematological malignancies. Cytometry B Clin Cytom. 2003 Nov;56(1):8-15. 29) Zeppa P, Picardi M, Marino G, Troncone G, Fulciniti F, Vetrani A, Rotoli B, Palombini L. Fine-needle aspiration biopsy and flow cytometry immunophenotyping of lymphoid and myeloproliferative disorders of the spleen. Cancer. 2003 Apr 25;99(2):118-27. 30) Mourad WA, Tulbah A, Shoukri M, Al Dayel F, Akhtar M, Ali MA, Hainau B, Martin J. Primary diagnosis and REAL/WHO classification of non-Hodgkin's lymphoma by fine-needle aspiration: cytomorphologic and immunophenotypic approach. Diagn Cytopathol. 2003 Apr;28(4):191-5. 31) Verstovsek G, Chakraborty S, Ramzy I, Jorgensen JL. Large B-cell lymphomas: fineneedle aspiration plays an important role in initial diagnosis of cases which are falsely negative by flow cytometry. Diagn Cytopathol. 2002 Nov;27(5):282-5. 32) Sanchez ML, Almeida J, Vidriales B, Lopez-Berges MC, Garcia-Marcos MA, Moro MJ, Corrales A, Calmuntia MJ, San Miguel JF, Orfao A. Incidence of phenotypic aberrations in a series of 467 patients with B chronic lymphoproliferative disorders: basis for the design of specific four-color stainings to be used for minimal residual disease investigation. Leukemia. 2002 Aug;16(8):1460-9. 33) Bertram HC, Check IJ, Milano MA. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. Am J Clin Pathol. 2001 Aug;116(2):191-203. 34) Kaleem Z, White G, Vollmer RT. Critical analysis and diagnostic usefulness of limited immunophenotyping of B-cell non-Hodgkin lymphomas by flow cytometry. Am J Clin Pathol. 2001 Jan;115(1):136-42. 35) Siebert JD, Weeks LM, List LW, Kugler JW, Knost JA, Fishkin PA, Goergen MH. Utility of flow cytometry immunophenotyping for the diagnosis and classification of lymphoma in community hospital clinical needle aspiration/biopsies. Arch Pathol Lab Med. 2000 Dec;124(12):1792-9. 36) Dunphy CH. Contribution of flow cytometric immunophenotyping to the evaluation of tissues with suspected lymphoma? Cytometry. 2000 Oct 15;42(5):296-306. 37) Meda BA, Buss DH, Woodruff RD, Cappellari JO, Rainer RO, Powell BL, Geisinger KR. Diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. The
pagina 6/20 usefulness and limitations of combined fine-needle aspiration cytomorphology and flow cytometry. Am J Clin Pathol. 2000 May;113(5):688-99. 38) Young NA, Al-Saleem TI, Ehya H, Smith MR. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 1998 Aug 25;84(4):252-61. 39) The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project. A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 1997 Jun 1;89(11):3909-18.
Reference Works, Handbooks and Databases 40) Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. (Eds.): World Health Organisation Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press. Lyon 2001.
Posters, “grey literature”, presentations 41) Brouwers A. CAT: Flowcytometrische analyse van het TCR-Vβ repertoire. 2005.
APPRAISAL 1) Analytische performantiekarakteristieken 1.1 Preanalytische beschouwingen Testaanvraag Bij patiënten met lymfadenopathieën verdacht voor een lymfoproliferatief proces kan flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel aangevraagd worden. Collectiemateriaal Volgens de NCCLS guideline [5] moet lymfeklierweefsel bekomen via chirurgische biopsie beschermd worden tegen dehydratatie. Dit kan gebeuren door het stukje weefsel in te wikkelen in een met fysiologisch water gedrenkt gaas en zo in een steriele container te transporteren. Lymfeklierweefsel bekomen via fijne naald aspiratie wordt best direct ingespoten in een tube gevuld met een kleine hoeveelheid isotoon medium (RPMI of PBS) en zo naar het laboratorium getransporteerd. Klinische inlichtingen op de aanvraagbon zijn vereist. Staalstabiliteit Om de intactheid van de cellen te garanderen, wordt idealiter onmiddellijk na afname flowcytometre ingezet. Stalen voor flowcytometrische immunofenotypering worden
pagina 7/20 best binnen de 24 uur geanalyseerd. Transport en bewaring van stalen gebeuren best op kamertemperatuur [5]. Staalvoorbehandeling Flowcytometrie vereist suspensies van afzonderlijke intacte cellen. Zulke suspensies kunnen uit weefsels bekomen worden door mechanische (afschrapen, fijnhakken, aspireren met een fijne naald, vortexen) of enzymatische desaggregatie. Ingeval van bloederige stalen worden best de aanwezige RBC gelyseerd. Fijne naald aspiraten zijn meestal reeds suspensies van afzonderlijke cellen. Om celclusters en residueel bindweefsel te verwijderen dienen de suspensies gefiltreerd te worden. Dit kan gebeuren over een nylonmembraan met een poriëngrootte van 50µm [5]. Meestal worden ongeveer 1 miljoen cellen per tube gekleurd (4 monoclonale antilichamen per tube). Een minimun aantal cellen van ongeveer 50 000 cellen per tube is nodig om 10 000 events te kunnen analyseren. Indien het staal een zuivere lymfoompopulatie bevat kunnen lagere aantallen volstaan [10].
1.2 Analytische beschouwingen Bij de initiële invoering van flowcytometrische immunofenotypering op LAG werd er geen validatierapport opgesteld. We beschikken bijgevolg niet over duidelijke analytische gegevens. Er is enkel een validatie gebeurt bij de overschakeling van de 3kleuren naar de 4-kleuren flowcytometer. Sánchez et al. [32] bestudeerde de analytische sensitiviteit voor het detecteren van leukemische B-cellen in perifeer bloed en beenmergstalen gebruikmakend van verschillende panels bestaande uit 4 monoclonale antilichamen. Eén aberrante cel op 10 000 à 100 000 normale hematopoïetische cellen kon gedetecteerd worden.
1.3 Testprincipe De te onderzoeken cellen worden tevoren geïncubeerd met meerdere monoclonale antilichamen waaraan een fluorochroom is gekoppeld. Voor de labeling wordt onder andere gebruik gemaakt van fluoresceïne-isothyocyanaat (FITC), phyco-erythrine (PE), peridinine-chlorophyl (PerCP) en allophycocyanin (APC), die ieder afzonderlijk fluoresceren in een voor het betreffende fluorochroom karakteristiek golflengtegebied. In de flowcytometer stromen de gelabelde cellen in suspensie door een meetkamer. Hierin worden alle langskomende cellen, stuk voor stuk, met een laserstraal belicht en wordt de fluorescentie-emissie gemeten. De cellen worden in het apparaat elektronisch gerangschikt naar golflengte, afhankelijk van het gebruikte fluorochroom, en naar de sterkte van het fluorescentiesignaal. Op deze wijze wordt van elke cel de expressie van de met monoclonale antilichamen onderzochte antigenen bepaald. Eveneens wordt de voorwaartse lichtverstrooiing (forward scatter (FSC); maat voor celgrootte) en de zijwaartse lichtverstrooiing (side scatter (SSC); maat voor granulariteit) gemeten. De verkregen informatie wordt grafisch als een puntenwolk in histogrammen weergegeven. Op basis van de ligging van een celcluster op het CD45 SCC histogram kunnen de verschillende types leucocyten onderscheiden worden. Het CD45 antigen wordt door alle types leucocyten in min of meerdere mate geëxprimeerd. Celclusters kunnen elektronisch afgegrendeld worden (‘gating’) en onderzocht worden
pagina 8/20 op expressie van antigenen waartegen de gebruikte monoclonale antilichamen gericht zijn. Immunofenotypering speelt een belangrijk rol bij de diagnosestelling en classificatie van het merendeel van de lymfoproliferatieve aandoeningen [8, 9]. Vandaag bestaat er echter geen enkel antigen specifiek voor een bepaalde maligne lymfoïde cel. Het komt er op aan combinaties van antigenexpressie te interpreteren. Verschillende panels met antilichamen worden gebruikt om de cellijn, differentiatiestadium en klonaliteit (vooral voor B-cellen) aan te tonen. B-cel lymfoproliferatieve aandoeningen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van B-cel specifieke antigenen en Ig-lichte keten restrictie (Igκ of Igλ). Classificatie gebeurt aan de hand van het patroon van antigenexpressie. De immunofenotypische diagnose van T-cel lymfoproliferatieve aandoeningen is moeilijker aangezien T-cel monoclonaliteit niet zo eenvoudig vastgesteld kan worden. Vele T-cel maligniteiten vertonen atypische T-cel fenotypes, zoals aberrant verlies van een of meer pan T-cel markers (meestal CD5 of CD7), en verlies of coëxpressie van CD4- of CD8-antigenen. Detectie van een aberrant T-cel fenotype kan gebruikt worden als indicator voor maligniteit. Sinds enkele jaren kan T-cel klonaliteit flowcytometrisch aangetoond worden met behulp van anti-TCR Vβ antilichamen die ongeveer 70% van alle TCR Vβ domeinen kunnen herkennen [41].
1.4 Monoclonale antilichamen Een eerste onderzoek van een verdachte celpopulatie wordt verricht met een panel antilichamen waarmee een combinatie van diverse celmarkers wordt gemeten zodat de cellijn enerzijds en monoclonaliteit anderzijds kan vastgesteld worden. Wanneer er een aberrante celpopulatie aanwezig is, wordt een vervolgpanel ingezet voor verdere typering [3]. Dezelfde panels met monoclonalen die gebruikt worden voor perifeer bloed en beenmergaspiraten voor diagnose en follow-up van een NHL zouden gebruikt kunnen worden voor lymfeklierweefsel (zie SOP-090 Bijlage 1).
1.5 Kwaliteitscontrole In ons laboratorium wordt gewerkt met een 4 kleuren flowcytometer (BD FACSCalibur™ System). De interne kwaliteitscontrole wordt dagelijks uitgevoerd (éénmaal bij opstarten en éénmaal bij afsluiten). Met behulp van beads wordt dan de positionering van de analysevensters en de sensitiviteit van de flowcytometer voor fluorescentiemetingen gecontroleerd. Er wordt tevens gekeken naar het patroon van de CD4/CD8 histogram (zie SOP-090 Bijlage 5). Er wordt geen specifieke interne kwaliteitscontrole voor lymfoproliferatieve aandoeningen uitgevoerd. Er wordt eveneens deelgenomen aan een extern kwaliteitscontroleprogramma van de Stichting Immunofenotypering Hematologische Oncologie in Nederland (SIHON): het laboratorium ontvangt tweemaal per jaar drie stalen met een onbekende hematologische maligniteit om flowcytometrisch te analyseren. SIHON en United Kingdom National External Quality Assessment Service (UKNEQAS) organiseren geen extern kwaliteitscontroleprogramma voor flowcytometrie op klierweefsel.
pagina 9/20 1.6 Turn around time (TAT) Flowcytometrische immunofenotypering wordt op LAG elke werkdag uitgevoerd. In het weekend wordt flowcytometrie niet uitgevoerd. De totale analyseduur zal minder dan 3 uur bedragen. De verwachte TAT bedraagt dus minder dan 72 uur.
1.7 Referentiewaarden Grote studies over immunofenotypering van lymfocytenpopulaties in normale lymfeklieren zijn schaars omwille van ethische redenen. De meeste informatie is beschikbaar voor reactieve of neoplastische lymfeklieren [8, 27]. Battaglia et al. [27] bestudeerden de lymfocytensubsets van lymfeklieren van 4 patiënten met goedaardige ziekten en van 19 patiënten in een vroeg stadium van cervix- of endometriumkanker. Volgens deze studie vertegenwoordigen B-cellen in tegenstelling tot de perifeer bloedwaarden bijna de helft van de lymfocyten (+/- 40%), terwijl het T-cel overwicht minder duidelijk is (+/- 55%). Ongeveer een derde van de B-cellen (gelokaliseerd in de folliculaire mantelzone) exprimeren het CD5-antigen. B-cellen in het follikelcentrum hebben zwakke CD10 expressie. Voor de T-cellen (CD3+) is het overwicht van CD4 meer uitgesproken dan in perifeer bloed met een gemiddelde CD4/CD8 ratio rond 4.5. NK-cellen zijn in lage aantallen aanwezig in lymfeklieren (+/- 1%). 2) Diagnostische performantie
Flowcytometrie op weefselbiopsies Slechts enkele grotere studies onderzochten de waarde van flowcytometrie bij de analyse van chirurgische biopsies van lymfeklieren of extranodale lokalisaties [25, 28, 36]: •
•
Ravoet et al. [25] bestudeerden retrospectief de bijdrage van 4-kleuren flowcytometrie bij de analyse van lymfeklierbiopsies. In 87.9% (102/116) van de stalen kwam flowcytometrie overeen met de histologische diagnose: 88.3% (38/43) van de goedaardige lymfeklieren, 96.7% (30/31) van de NHL en 100% (18/18) van de carcinoma’s. Van de NHL konden echter 22.6% (7/31) niet verder geclassificeerd worden. Bij 3 van de 5 discordante stalen die volgens histologie initieel als goedaardig werden gecatalogeerd, bleek de flowcytometrische diagnose van een lymfoom correct te zijn. Flowcytometrie werd ook toegepast op 15 Hodgkin lymfoom stalen: 6 stalen toonden > 1/10000 cellen met een ReedSternberg fenotype (CD15+/CD30+) in combinatie met < 1/1000 cellen positief voor epitheliale merkers en werden beschouwd als sterk verdacht voor een Hodgkin lymfoom. Dit criterium bleek echter onvoldoende specifiek voor Hodgkinlymfomen. Martinez et al. [28] onderzocht 422 consecutieve biopsies (lymfeklieren en extranodaal weefsel) gebruik makend van morfologie, immunohistochemie en 3kleuren flowcytometrie. De resultaten van flowcytometrie werden onafhankelijk van morfologie en immunohistochemie geïnterpreteerd. Met behulp van morfologie eventueel aangevuld met immunohistochemie werden in 314 gevallen
pagina 10/20
•
maligniteiten (waarvan 278 hematologische) gedetecteerd. Voor flowcytometrie kwamen 377 stalen met voldoende cellulariteit in aanmerking. Het immunofenotype werd beschouwd als normaal in 155 gevallen, abnormaal in 211 gevallen en niet conclusief in 11 gevallen. Een goede correlatie werd gevonden tussen morfologie/immunohistochemie en flowcytometrie, behalve voor Hodgkin lymfomen. Een sensitiviteit van 72% (zonder Hodgkin 90%) en een specificiteit van 100% werd gevonden, met een voorspellende predictieve waarde van 100% en een negatieve predictieve waarde van 52% (zonder Hodgkin 79%). Voor het aantonen van Ig-lichte ketenexpressie bleek flowcytometrie superieur te zijn ten opzichte van immunohistochemie. Ig-lichte ketenexpressie werd onderzocht in 91 gevallen met zowel immunohistochemie als met flowcytometrie. In slechts 42% (38/91) van de gevallen was het mogelijk om met immunohistochemie Iglichte ketenexpressie te interpreteren, terwijl in alle gevallen met flowcytometrie. Dunphy [36] bestudeerde retrospectief 373 weefselstalen (278 lymfeklier- en 95 extranodale weefsels) waarvan volledige histologische, flowcytometrische (2kleuren) en immunohistochemische data beschikbaar waren. In de meerderheid (94%) van de stalen was er goede correlatie tussen flowcytometrie en histologie. In 7% van de NHL was flowcytometrie vals negatief.
Flowcytometrie op fijne naald aspiraten Lymfeklierweefsel kan ook verkregen worden via fijne naald aspiratie. Oppervlakkig gelegen palpabele lymfeklieren kunnen direct worden gepuncteerd, terwijl diep gelegen vergrote lymfeklieren met behulp van echografie of CT worden aangeprikt. Talrijke studies onderzochten de waarde van flowcytometrische immunofenotypering op fijne naald aspiraten [20, 21, 22, 23, 24, 26, 29, 30, 34, 35, 37, 38]. Deze studies besluiten dat cytologisch onderzoek en flowcytometrie hand in hand gaan. Het stellen van de diagnose van een lymfoom is mogelijk in ongeveer 75% tot 95% van de gevallen, terwijl volledige classificatie mogelijk is in ongeveer 70% tot 80% van de positieve gevallen.
Flowcytometrische probleemgevallen Uit de vermelde studies met lymfeklierbiopsies en met fijne naald aspiraten blijkt dat regelmatig vals negatieve flowcytometrische resultaten gevonden worden (ongeveer in 15% van de gevallen). Mogelijke oorzaken zijn: • sampling error (onvoldoende of niet representatieve staalname) • partiële lymfoominfiltratie van de lymfeklier • weefselsclerosis (optimale staalname onmogelijk en optreden van fragmentatie en vervorming van de diagnostische cellen) • fragiliteit van sommige types van lymfoomcellen • afwezigheid van surface lichte ketens op lymfoomcellen van B-cel oorsprong • geen CD45-expressie op de lymfoomcellen • lage aanwezigheid van maligne cellen op een reactieve achtergrond Diffuse grootcellige B-cel lymfomen vormen de grootste groep binnen de NHL (ongeveer 30%). Het is een heterogene groep van agressieve lymfomen zonder specifiek antigenprofiel. Grootcellige B-cel lymfomen geven echter vaker vals negatieve flowcytometrische resultaten (tot 27%) dan andere B-cel lymfomen [31,33]. Dit komt
pagina 11/20 omdat deze lymfomen vaker gepaard gaan met weefselsclerosis (vooral de extranodale lokalisaties) en grootcellige lymfoomcellen van nature fragieler zijn waardoor ze gemakkelijker beschadigd worden tijdens fijne naald aspiratie of tijdens de voorbehandelingstappen voor flowcytometrie. Daarom is het noodzakelijk om altijd de celcluster van celresten (apoptotische cellen) op het CD45-SCC histogram te bekijken. Afwezigheid van surface lichte ketens komt eveneens vaker voor bij diffuse grootcellige B-cel lymfomen dan bij de andere B-cel lymfomen. In vele negatieve flowcytometrische gevallen blijkt echter cytologisch onderzoek de lymfoomcellen wel gemakkelijk te detecteren. Hodgkin lymfomen stellen eveneens flowcytometrisch een probleem. In vele gevallen zijn er te weinig maligne cellen aanwezig in een fijne naald aspiraat of in biopsiemateriaal. Dit komt door de cellulaire samenstelling van Hodgkin lymfomen, waarbij een achtergrond van inflammatoire lymfocyten de Reed-Sternbergcellen 10-100x overtreffen. Bovendien zijn de Reed-Sternbergcellen zeer fragiel en vaak aanwezig in fibreus weefsel hetgeen cellulaire dispersie bemoeilijkt. Er bestaat eveneens geen consensus over een diagnostisch antigenprofiel van zulke cellen. Een gestegen CD4/CD8 verhouding wordt teruggevonden bij een groot aantal Hodgkin lymfomen in een aantal studies. Dit is echter een weinig specifiek kenmerk. Het is dus onmogelijk om een Hodgkin lymfoom te detecteren/diagnosticeren met flowcytometrie. Hodgkin lymfomen vormen echter een belangrijke groep binnen de lymfomen (ongeveer 15% van alle lymfomen).
Immunofenotypering: flowcytometrie versus immunohistochemie Immunofenotypering kan uitgevoerd worden met immunohistochemie of flowcytometrie. De literatuur [7, 9, 10, 12, 13, 14] vermeldt volgende voordelen van flowcytometrie ten opzichte van immunohistochemie: • simultane detectie van meerdere antigenen per cel met meerkleuren flowcytometrie • kortere TAT • kwantitatieve interpretatie van resultaten waardoor interpretatie minder subjectief • hogere sensitiviteit voor de detectie van kleine monoclonale populaties • uitgebreider aanbod monoclonale antilichamen beschikbaar voor vers materiaal (flowcytometrie) dan voor gefixeerd materiaal (immunohistochemie) • lichte ketenexpressie beter aantoonbaar met flowcytometrie (het is moeilijk om lichte ketenexpressie aan te tonen met immunohistochemie op in paraffine ingebed weefsel wegens achtergrondkleuring) • slechts zeer kleine hoeveelheden staal vereist voor flowcytometrie (bijvoorbeeld kleine mucosale biopsies van de maag) Nadelen van flowcytometrie ten opzichte van immunohistochemie zijn: • onmogelijkheid om de morfologie van een cel te beoordelen en direct te correleren met antigendetectie • verlies van informatie over het patroon van tumorgroei binnen de lymfeklieren of extranodaal weefsel (nodulair of diffuus) • flowcytometrie enkel mogelijk op vers staal
pagina 12/20
Besluit: Indien een positief flowcytometrisch resultaat gevonden wordt (monoclonale Bcel populatie aangetoond), is er quasi zeker een lymfoproliferatieve aandoening aanwezig. Bij een negatief flowcytometrisch resultaat kan een maligniteit niet uitgesloten worden. Histologisch of cytologisch onderzoek moet altijd verricht worden. Diffuse grootcellige B-cellymfomen geven vaak een vals negatief flowcytometrisch resultaat. Hodgkin lymfomen kunnen moeilijk aangetoond worden met flowcytometrie. Flowcytometrie is superieur ten opzichte van immunohistochemie voor het aantonen van lichte ketenrestrictie bij B-cel lymfomen. 3) Klinische impact
3.1 Diagnostisch aspect Lymfomen worden volgens de WHO geclassificeerd op grond van een karakteristieke verzameling van klinische, morfologische, immunologische en moleculair genetische kenmerken [18, 40]. Een WHO-diagnose veronderstelt dus de integratie van klinische, morfologische, immunologische en moleculair genetische deeldiagnosen die geïntegreerd moeten worden tot een volledige diagnose. Een WHO-diagnose kan vrijwel nooit op basis van één enkel type diagnostisch onderzoek gesteld worden. Het aantonen van een monoclonale lymfoïde populatie in lymfeklierweefsel met behulp van flowcytometrische immunofenotypering kan een doorslaggevend argument vormen in de diagnosestelling. Anderzijds kan het aantonen van een monoclonale lymfoïde populatie zonder andere argumenten voor maligniteit, een belangrijke trigger zijn om een patiënt strikt op te volgen. Wanneer echter een negatief flowcytometrisch resultaat op lymfeklierweefsel gevonden wordt, kan een lymfoproliferatieve aandoening niet uitgesloten worden wegens het hoog percentage vals negatieven. Als op basis van histologisch onderzoek de definitieve diagnose reeds gesteld kan worden, heeft flowcytometrische immunofenotypering slechts een beperkte aanvullende waarde (slechts bevestigen van de diagnose). Bij onduidelijkheid over de definitieve diagnose kan flowcytometrisch onderzoek eventueel uitsluitsel geven.
3.2 Behandeling/Follow-up Het aantonen van een monoclonale lymfoïde populatie heeft impact op de behandeling van de patiënt aangezien dit kan bijdragen tot de diagnosestelling en classificatie en zo eventuele therapie kan initiëren. De therapiekeuze hangt af van het type lymfoom (indolent of agressief) en het stadium. Bepaalde therapieën werken in op een bepaald antigen aanwezig op de celmembraan van lymfoïde cellen (vb. rituximab dat het CD20-antigen herkent aan het oppervlak van B-lymfocyten). De expressie van zulke targetantigenen kan met flowcytometrische immunofenotypering nagekeken worden.
pagina 13/20 3.3 Health outcome Ingeval een lymfoom op een fijne naald aspiraat gediagnosticeerd kan worden, kunnen eventueel verdere meer invasieve investigaties (chirurgische biopsies) vermeden worden. Vooral voor recidieven van reeds gekende NHL zou de diagnose op basis van een fijne naald aspiraat kunnen gebeuren. Echter het gebruik van fijne naald aspiratie als diagnostische techniek wordt niet algemeen aanvaard. 4) Organisatorische impact 4.1 Impact in het ziekenhuis Flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel zou kunnen leiden tot het sneller stellen van een definitieve diagnose en starten van therapie. Dit zou kunnen leiden tot kortere hospitalisatieduur en minder opnames. Indien de dienst LAG flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklieren zou gaan uitvoeren, moet met de dienst pathologische ontleedkunde overeengekomen worden dat er een deel van de lymfeklier voor flowcytometrie naar LAG komt.
4.2 Werd de test reeds opgenomen in (inter)nationale guidelines/zorgpaden? De European Society for Medical Oncology (ESMO) [1] neemt flowcytometrische immunofenotypering niet op in haar aanbevelingen omtrent diagnose, behandeling en follow-up van een folliculair lymfoom of een grootcellig NHL. Ze vermelden wel dat diagnose van een folliculair lymfoom of een grootcellig NHL gebaseerd moet zijn op histologisch onderzoek van een lymfeklier verkregen via chirurgische excisiebiopsie. Fijne naald aspiraten en holle naald biopsies kunnen enkel gebruikt worden voor zeldzame patiënten waarbij spoedtherapie vereist is. CD20-expressie moet bepaald worden voor grootcellige NHL met behulp van immunohistochemie. De British Committee for Standards in Haematology (BCSH) raadt in zijn guideline “Diagnosis and therapy for nodal non-Hodgkin's lymphoma” [2] aan om eerst op perifeer bloed cytologisch onderzoek en flowcytometrie uit te voeren alvorens over te gaan tot een klierbiopsie, dit ter voorkoming van onnodige biopsies bij patiënten met CLL of (minder frequent) acute leukemie. Voor het verkrijgen van lymfeklierweefsel gaat de voorkeur naar lymfeklierexcisiebiopsie. Fijne naald aspiraten worden afgeraden. Immunofenotypering kan uitgevoerd worden door gebruik te maken van flowcytometrie of immunohistochemie. De WHO-classificatie moet als basis dienen voor diagnose. The Belgian consensus recommendations for flowcytometric immunophenotyping [4] vermelden geen aanbeveling voor flowcytometrie op lymfeklierweefsel. De US-Canadian Consensus Recommendations on immunophenotypic analysis [6] stelt dat immunofenotypering uitgevoerd moet worden op lymfeklierbiopsies bij patiënten verdacht voor een lymfoom. Dit kan gebeuren met ofwel flowcytometrie ofwel immunohistochemie. Flowcytometrie is gelijkwaardig met immunohistochemie
pagina 14/20 en in de meerderheid van de gevallen zelfs superieur omwille van een lagere detectielimiet, objectiviteit en snelheid. Flowcytometrie is geen goede methode voor het stellen van de diagnose van een Hodgkin lymfoom. Fijne naald aspiraten worden niet algemeen aanvaard. 5) Kost impact: binnen en buiten het laboratorium 5.1 Reële productiekost • • •
Consumables/test = 10.18 € x het aantal gebruikte antilichamen Task unit & labor/test = 6.14 € Overhead/test = 1.77 €
De totale kost is afhankelijk van het aantal antilichamen dat gebruikt wordt. Indien bijvoorbeeld 10 antilichamen gebruikt worden, kost de analyse 109.71 €. Deze berekening is gebaseerd op de kosten van de werkpost ‘immunofenotypering: diagnose en MRD’.
5.2 Nomenclatuur Flowcytometrische immunofenotypering op bloed kan aangerekend worden met: • RIZIV nummer 555730-555741 (Hematopoiëtische cellen - identificatie van een receptor- of een membraan- of cytoplasma- of nucleair antigeen, exclusief de antigenen van het HLA systeem. Het eerste antigeen) • RIZIV nummer 556474-556485 (Hematopoiëtische celen - identificatie van een receptor- of een membraan- of cytoplasma- of nucleair antigeen, exclusief de antigenen van het HLA systeem. De volgende antigenen, elk met een maximum van 12). De verstrekking 555730-555741 mag enkel worden aangerekend voor het typeren van hematologische maligniteiten of in geval van congenitale of levensbedreigende verworven immunodeficiënties (diagnoseregel 43). De verstrekking 556474-556485 mag enkel worden aangerekend voor de diagnose en follow-up van hematologische maligniteiten en voor de diagnose van congenitale immuno-deficiënties (diagnoseregel 69). Het betreft hier respectievelijk een B500 (aan 100% = 14.31€) en een B400 (aan 100% = 11.45€). Aangezien het hier over lymfeklierweefsel gaat, kunnen strikt genomen deze nummers niet gebruikt worden. Deze analyse valt echter ook niet onder de RIZIV nummers 588070-588081 van de anatomo-pathologen (Immunohistologische onderzoeken (max. vier per afname), voor het aantonen van antigenen in de coupes, na incubatie met antisera, per anatomisch orgaan, per gebruikt antiserum).
5.3 Winst elders in het ziekenhuis Er bestaan geen publicaties over kosten-batenanalyses van flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel.
pagina 15/20 6) Decision making 6.1 Impact van de flowcytometrische analyse op lymfeklierweefsel op het beslissingsproces van de clinicus en het patiëntenmanagement Zoals reeds vermeld kan het aantonen van een monoclonale lymfoïde celpopulatie met behulp van immunofenotypering een doorslaggevend argument vormen in de diagnosestelling van een NHL en helpen bij de classificatie.
6.2 Overgebruik/ondergebruik van de flowcytometrische analyse op lymfeklierweefsel Aangezien deze analyse momenteel nog niet uitgevoerd wordt, kan er misschien gesproken worden van een ondergebruik. COMMENTS •
Is er (voldoende) interesse vanuit de kliniek voor deze analyse? Hoe staan de clinici tegenover fijne naald aspiraten? Dr. Ann. Janssens (hematoloog UZ Gasthuisberg): In Gent gebruikte ik veel meer klieraspiraten voor diagnostiek en eventuele follow-up dan hier in Leuven. Dit wil niet zeggen dat het aspiraat niet gevolgd moest worden door een biopsie voor de exacte morfologie en eventuele genetica. Mijn indicaties zouden zijn: o nieuwe klieren waar een aspiraat eventueel de diagnose kan stellen tussen reactieve en pathologische klier. Hier dient natuurlijk het resultaat van de cytologie en de merkers naast elkaar gelegd te worden. Wanneer beide pleiten voor reactief kan een afwachtende houding aangenomen worden terwijl bij een monoclonale populatie een biopsie dient te gebeuren. o Bij gekend klierprobleem dat terug klieren ontwikkeld: punctie om te zien of het dezelfde ziekte is waardoor sneller therapie gestart kan worden. In Gent werd van elk klierbiopsie een deel naar de flow gestuurd voor diagnostische uitwerking. (ook deps voor cytologie, deel naar genetica en moleculaire diagnostiek). Eerst werd gekeken naar aanwezigheid van een monoclonale fractie en zo aanwezig verder uitgewerkt (als kleincellig CLL-panel, als grootcellig aangepast panel). Hierdoor hadden we sneller resultaten van de flow dan van de histologie. Meestal correleerden de merkers van de immunohistochemie behoorlijk met die van de flow. In Gent hadden ze wel een probleem immunohistochemisch met Ig-lichte ketens kappa en lambda waardoor de flow hiervoor zeer belangrijk was. Ik heb dus zeker interesse maar dan moet ook de cytologie hier bekeken worden. Enkel de manier van staalafnames moet gestandaardiseerd worden (in welk medium materiaal inspuiten). Prof. Gregor Verhoef (hematoloog UZ Gasthuisberg): G. Verhoef is ook zeker geïnteresseerd in flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierweefsel, alleen is de nood volgens hem minder groot in ons ziekenhuis dan in andere ziekenhuizen omwille van de zeer goede expertise van onze anatomopatholoog.
pagina 16/20 Hij vindt het zeker interessant om bij recidieven een fijne naald aspiraat af te nemen en op te sturen voor flowcytometrie. •
Wat is de mening van de anatomopathologen in ons ziekenhuis over het gebruik van flowcytometrie op klierweefsel? Wat is hun ervaring met fijne-naald aspiraten? Prof. C. Peeters (anatomopatholoog UZ Gasthuisberg): C. Peeters is bereid om ons een deel van hun ontvangen lymfeklieren ter beschikking te stellen voor flowcytometrisch onderzoek indien er voldoende materiaal voor handen is. Echter in de meeste gevallen ontvangen ze relatief kleine lymfeklieren (+/- 2 cm³) die ze volledig nodig hebben voor diagnostische doeleinden (cytogenetica inclusief). Omwille van het verlies van weefselarchitectuur worden op basis van fijne naald aspiraten of holle naald biopsies geen definitieve diagnoses gesteld. Histomorfologisch onderzoek wordt altijd gecombineerd met immunohistochemie, immers hoe meer argumenten voor een lymfoproliferatieve aandoening, hoe beter. De keuze van de antilichamen (beperkt tot 4 door de nomenclatuur) wordt bepaald door de bevindingen van het histomorfologisch onderzoek. Immunohistochemie is belangrijk voor het aantonen van de cellijn (B- of T-cel), de differentieel diagnose van kleincellige B-cel lymfomen (SLL-MCL-FL) en voor de diagnose van Hodgkin lymfomen. Regelmatig is het moeilijk om de expressie van Ig-lichte ketens immunohistochemisch te beoordelen. In zulke gevallen wordt er PCR uitgevoerd gevolgd door elektroforese van de PCRfragmenten voor het aantonen van identieke Ig-zware keten genherschikkingen. Diffuse grootcellige B-cel lymfomen kunnen gemakkelijk gediagnosticeerd worden op basis van histologisch onderzoek.
•
Gebeurt er in andere centra flowcytometrische analyse op lymfeklierweefsel bij diagnose en follow-up van lymfoproliferatieve aandoeningen? Deze analyse wordt onder andere uitgevoerd door AZ Sint-Jan Brugge, OLV ziekenhuis Aalst, Virga Jesse Hasselt, UZ Gent en Erasmus Rotterdam.
•
Wat zijn de argumenten voor/tegen het invoeren van de flowcytometrische analyse op lymfeklierweefsel? Argumenten pro o de voordelen van flowcytometrie ten opzichte van immunohistochemie (cfr. supra) o de combinatie van verschillende testen kan leiden tot een betere diagnostische accuraatheid: flowcytometrie kan een bijkomend argument opleveren voor de diagnose en classificatie van een lymfoproliferatief proces Argumenten contra o de nadelen van flowcytometrie ten opzichte van immunohistochemie (cfr. supra) o relatief grote kans op een vals negatief flowcytometrische resultaat (crf. supra) o geen RIZIV-terugbetaling voor flowcytometrie op klierweefsel
pagina 17/20 o vermoedelijk lage testfrequentie aangezien meestal reeds het volledige biopsiestaal nodig is voor histologisch en cytogenetisch onderzoek o fijne naald aspiratie is geen algemeen aanvaarde diagnostische techniek TO DO/ACTIONS 1) Het al dan niet invoeren van flowcytometrische immunofenotypering op klierweefsel in de routine in overleg met de hematologen en anatomopathologen Indien we beslissen om de test in te voeren: 2) Valideren van deze analyse 3) Opstellen van een SOP 4) Aanvragen van RIZIV-terugbetaling 5) Organiseren van overleg tussen klinisch biologen, anatomopathologen en hematologen om elkaars bevindingen met elkaar te correleren
pagina 18/20 ATTACHMENTS Attachment 1: Proposed WHO Classification of Lymphoid Neoplasms [18].
pagina 19/20 Attachment 2: Major clinical presentations of mature B-cell and T/NK-cell neoplasms [40] Mature B-cell neoplasms Predominantly disseminated lymphoma/leukaemia These tumours usually present with involvement of bone marrow, with or without peripheral blood and solid tissues such as lymph nodes and spleen. B-cell neoplasms include chronic lymphocytic leukaemia (CLL), lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstrom’s macroglobulinemia, hairy cell leukaemia, splenic marginal zone lymphoma, and plasma cell myeloma. In general, the disseminated B-cell neoplasms are relatively indolent. Primary extranodal lymphomas These are lymphomas that virtually always present in extranodal sites, and appear to correspond to normal lymphoid cells specific for extranodal immunologic reactions. In the B-cell neoplasms, this category is represented by extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucasa-associated lymphoid tissue (MALT lymphoma). Because its clinical presentation and treatment options differ dramatically from the more common nodal or leukemic lymphoid neoplasms, it is considered in a distinct clinical category. MALT lymphomas are less likely to disseminate, and when they do, it is more often to other extranodal sites than to lymph nodes and bone marrow. Predominantly nodal lymphomas Two B cell neoplasms comprise the majority of nodal small B-cell lymphomas: follicular lymphoma and mantle cell lymphoma. A third type, nodal marginal zone B-cell lymphoma, is rare, but appears to behave similarly to other indolent nodal lymphomas. These neoplasms typically present with disseminated disease involving predominantly lymph nodes, but with frequent involvement of bone marrow, spleen, and liver; the may involve other extranodal sites as part of disseminated disease, but rarely present with localised extranodal disease. Diffuse large B-cell lymphoma is the most common lymphoma worldwide, accounting for about 30% of the cases. It may involve lymph nodes or extranodal sites; patients typically present with rapidly growing masses at a localised nodal or extranodal site.
Mature T-cell and NK-cell neoplasms Leukemic or disseminated T-cell prolymphocytic leukaemia T-cell granular lymphocytic leukaemia Aggressive NK-cell leukaemia Adult T-cell lymphoma/leukaemia Cutaneous Blastic NK-cell lymphoma Mycosis fungoides/Sezary syndrome Primary cutaneous anaplastic large cell lymphoma Other extranodal Extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type Enteropathy-type T-cell lymphoma Hepatosplenic T-cell lymphoma Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma Nodal Peripheral T-cell lymphoma, unspecified Angioimmunoblastic T-cell lymphoma Anaplastic large cell lymphoma
pagina 20/20 Attachment 3: Frequency of B and T/NK cell lymphomas [39]
