BUNĚČNÉ MECHANIZMY SVALOVÉ ATROFIE

metabolismus/výživa

BUNĚČNÉ MECHANIZMY SVALOVÉ ATROFIE CELLULAR MECHANISMS OF MUSCLE ATROPHY JAN GOJDA, JAN TRNKA, MICHAL ANDĚL Centrum pro výzkum diabetu, metabolismu a výživy a 2. interní klinika 3. lékařské fakulty UK a FNKV, Praha

SOUHRN Článek shrnuje současné poznání v oblasti signalizace a výkonu svalové atrofie. Hlavními spouštěcími faktory, které inhibují růst či aktivují rozklad svalového proteinu, jsou zánětlivé mediátory, hypoxie, inaktivita, deplece energetických substrátů a oxidační stres, z humorálních vlivů potom myostatin, inzulín, glukokortikoidy, katecholaminy a tyreoidální hormony. Jejich intracelulární signalizace konverguje na dvou hlavních transkripčních faktorech, NF-κB a FoxO. Aktivací těchto faktorů je potom spuštěna transkripční odpověď spočívající v expresi atrogenů, genů pro samotné enyzmy proteolytických komplexů. Centrálním z nich, který zastává také funkci v regulaci proteolytické odpovědi, je ubikvitin-proteasomový systém. Dalšími systémy podílejícími se na degradaci myofibrilárních proteinů jsou kalpainy, kaspázy a katepsiny. Svalové proteiny jsou degradovány až na elementární aminokyseliny, které jsou ještě ve svalu transaminovány a uvolněny ve formě glutaminu a alaninu do cirkulace. Tyto jsou použity jako alternativní energetické substráty či jako prekurzory proteinů akutní fáze. Klíčová slova: sval, atrofie, kachexie, proteolýza, proteosyntéza SUMMARY The article summarizes our actual knowledge of muscle atrophy, its signalling and execution. Among the main triggers that inhibit growth or activate degradation of the muscle there are inflammatory cytokines, hypoxia, inactivity, depletion of energetic substrates and oxidation stress, the humoral triggers are myostatin, insulin, glucocorticoids, catecholamines and thyroidal hormones. Their intracelullar signalling converges on two main transcription factors, NF-κB and FoxO. Their activation leads to an expression of atrogenes. Products of these genes are enzymes of proteolytic complexes themselves. Ubiquitin-proteasom system represents the central role in the regulation of interaction beteween other proteolytic systems. Myofibrilar proteins are decomposed to elementar amino acids, which are then released to circulation. In that form they can be used as an alternative energy source or as acute-phase proten precursors. Key words: muscle, atrophy, cachexia, proteolysis, proteosynthesis

ÚVOD Svalová atrofie přitahuje poslední dekádu značnou pozornost vědecké komunity. Je to pochopitelné, pokud si uvědomíme, že úbytek kosterní svalové hmoty je společný mnoha patologickým i fyziologickým stavům. Článek se zaměřuje zejména na mechanizmus účinku jednotlivých spouštěcích faktorů, jejich subcelulární signalizaci a na proces samotné proteolýzy. Zvláštní pozornost je věnována právě klíčovým systémům, které se účastní regulace tohoto procesu. Jejich farmakologické ovlivnění se zdá být slibným způsobem, jak často zhoubný proces svalové atrofie zvrátit. Kosterní sval je největším tělesným orgánem. U dospělého člověka představuje až 40 % z celkové tělesné hmotnosti. Jako takový je také hlavním tělesným rezervoárem proteinů. Za fyziologických podmínek odpovídá obrat svalového proteinu zhruba 1–1,5 kg svalu za den (Mitch et al., 2003). Tak vysoký obrat zajišťuje substráty pro náhradu poškozených

146

a chybně syntetizovaných strukturálních proteinů či enzymů zajišťujících kritické buněčné regulace ve svalu i jiných orgánech (Price, 2003). Svalové proteiny mohou být za různých katabolických stavů mobilizovány a poskytovat tak volné aminokyseliny. Mezi stavy vedoucí ke zvýšené mobilizaci svalového proteinu patří zejména: inaktivita, hladovění, diabetes, kachexie, sepse, AIDS, popáleniny, renální selhání či trauma (Lecker et al., 2006). Dokud je tato reakce přechodná, je adaptivní a prospěšná. Umožňuje organizmu rychle zvýšit dostupnost volných aminokyselin (aminokyselinový „pool“), které pak mohou být dle potřeby utilizovány. Schopnost efektivně mobilizovat aminokyselinové zásoby v minulosti poskytovala svým nositelům silnou evoluční výhodu a kaskády těchto proteokatabolických stresových odpovědí jsou evolučně velice robustní (Price et al., 2003). Na druhou stranu však má tato zbraň i své druhé ostří. V případě akutního stresového hladovění či protrahovaného DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

metabolismus/výživa

Obr. 1: Souhrn signalizace protelýzy. Souhrn jednotlivých spouštěcích faktorů, jejich signálních kaskád a transkripční odpovědi na příslušné proteolytické systémy.

katabolického stavu dochází k excesivní degradaci svalového proteinu, úbytku svalové hmoty a ztrátě její funkce, což je spojeno s přímým dopadem na možnost překonání stresového inzultu, a tedy i prognózu nemocného, vyšší morbiditu i mortalitu (Roubenoff et al., 2000; Lee et al., 2007; Ventadour et al., 2006; Lowry et al., 2009) . Bez ohledu na vyvolávající faktor, je atrofie kosterního svalu definována snížením obsahu proteinů ve svalu, zmenšením průměru svalového vlákna, snížením svalové síly a odolnosti k únavě (Jackman et al., 2004; Zhang et al., 2007). Celkové množství myocytů zůstává zachováno, avšak dochází k apoptotické redukci počtu jejich jader (Thornell et al., 2011). Svalová atrofie je aktivní, vysoce organizovaný proces, který vyžaduje komplexní transkripční regulaci (Sandri, 2008). Je výslednicí akcelerované proteolýzy a inhibované proteosyntézy. Oba procesy vyžadují energii ve formě ATP, a energetický stav svalu je jedním z regulačních mechanizmů obratu proteinů. Volné aminokyseliny se stávají alternativními zdroji energetických substrátů během stresového stavu. Ve svalu dochází primárně k degradaci aminokyselin s větveným řetězcem (valin, leucin, izoleucin). Jejich uhlíkové skelety směřují k oxidativní fosforylaci přímo ve svalu a aminoskupiny jsou reutilizovány k syntéze alaninu a glutaminu. Tyto aminokyseliny jsou vyplavovány do cirkulace a stávají se substráty pro glukoneogenezu v hepatocytech (alanin) a renálních tubulárních epiteliích (glutamin). Glukóza je směřována k  udržení energetické homeostázy v glukóza-dependentních tkáních. Volné aminokyseliny jsou dále utilizovány k udržení obligátní proteosyntézy (v orgánech, jako je mozek či srdce) či jako prekurzory proteinů akutní fáze. Základními pracemi, které odstartovaly studium molekulárních podkladů procesu svalové atrofie, byly práce dvou na sobě nezávislých kolektivů Goldberga a Glasse (Bodine et al., 2001a; Gomes et al., 2001; Glass, 2005). Principem jejich studií bylo za pomocí microarray porovnat genové exprese DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

myocytu u animálního modelu svalové atrofie. U všech stavů, kterým je společná svalová atrofie (nádorová kachexie, diabetes, chronická renální insuficience, hladovění, denervace), se zjistilo, že je v myocytu významně zvýšena exprese určité skupiny genů. Míra jejich aktivace pozitivně korelovala se svalovou atrofií, a byly proto nazvány s atrofií spojené geny (atrophy-related genes), neboli atrogeny. Postupem času se ukázalo, že produkty atrogenů jsou ubikvitin ligázy, enzymy ubikvitin-proteasomového proteolytického systému (dále UPS). Po jejich identifikaci se další výzkum ubíral směrem k identifikaci ostatních proteolytických systémů myocytu, mediátorů a signálních drah, které regulují expresi atrogenů a mechanizmu, jakým jsou tyto proteolytické systémy aktivovány známými induktory svalové atrofie. Mezi hlavní vyvolávající faktory, které inhibují růst či aktivují rozklad svalového proteinu a mají tak vliv na obrat aminokyselin, se řadí zánětlivé mediátory, hypoxie, inaktivita, deplece energetických substrátů a oxidační stres, z humorálních vlivů potom myostatin, inzulín, glukokortikoidy, katecholaminy a tyreoidální hormony. Všechny z nich, ať už přímo či nepřímo, mají značný klinický význam. Aktivují příslušnou signální kaskádu a transkripční faktor. Dva hlavní transkripční faktory, které regulují expresi atrogenů jsou NF-κB a FoxO. Produkty těchto genů jsou klíčovými enzymy proteolytických systémů, které jsou pak samotnými efektory degradace sarkomerických proteinů. Z didaktických důvodů začínáme právě posledním krokem v celém průběhu proteolýzy, tak aby bylo možné do detailů porozumět mechanizmu účinku jednotlivých spouštěčů.

MYOCYTÁRNÍ

PROTEOLYTICKÉ SYSTÉMY

Na degradaci proteinů v kosterním svalu se podílejí čtyři hlavní proteolytické systémy: ubikvitin-proteasomový systém (UPS), cytosolické kalcium-dependentní kalpainy, lyzozomální proteázy (katepsiny) a kaspázy.

147

metabolismus/výživa

Lyzozomální

Obr. 2: Hlavní proteolytické systémy svalu a jejich vzájemná spolupráce při degradaci sarkomerických proteinů. Kalcium-dependentní kalpainový systém a kaspáza-3 degradují sarkomerické spojující proteiny (vinkulin, titin etc.), čímž vedou k rozpadu aktin-myozinového komplexu. Lyzozomální proteolýza (katepsiny) je zodpovědná jednak za degradaci membránových regulačních proteinů a jednak za degradaci agregátů sarkomerických proteinů. Oba tyto systémy následně poskytují jednotlivé sarkomerické proteiny ke konečné hydrolýze v ubikvitin-proteasomovém systému.

Degradace myofibrilárních proteinů vyžaduje vzájemnou integraci všech těchto systémů. Iniciálním krokem svalové proteolýzy, a taktéž krokem limitujícím její rychlost, je desintegrace sarkomery zprostředkovaná kalpainy a rozštěpení aktin-myosinového komplexu kaspázami. Izolované myofibrilární proteiny se potom stávají substráty pro UPS. V lyzozomech jsou degradovány membránové proteiny, tedy zejména receptory a ligandy účastnící se v regulaci proteoýzy a pravděpodobně taktéž agregované sarkomerické komplexy.

UBIKVITIN-PROTEASOMOVÝ

SYSTÉM

Ubikvitin-proteasomový systém (UPS) představuje konečnou část degradace sarkomery. Zpracovává již jednotlivé fibrilární proteiny uvolněné ze sarkomery pomocí kalpainů, kaspáz či lyzozomálních katepsinů. Proteolýza přes UPS je dvoustupňový proces, zahrnující „označení“ proteinu určeného k degradaci vazbou signálního polyubikvitinového řetězce, který je následně rozpoznán 26S proetasomem, který rozštěpí protein na peptidy. První krok, polyubikvitinace, je realizována sekvenční vazbou ubikvitin-aktivujícího enzymu (E1), ubikvitin-konjugujícího enzymu (E2) a ubikvitin-protein ligázy (E3) na protein. E3 enzym je substrát specifický, ubikvitinuje specifické třídy proteinů a hraje tedy důležitou roli v určování, které proteiny budou přes UPS degradovány, a tedy klíčovou regulační roli v celém UPS (přehled v: Lecker et al., 2006). Jejich úloha

148

spočívá zřejmě také v regulaci ostatních proteolytických systémů. Odhaduje se, že v savčích buňkách se nachází okolo tisíce izoenzymů E3. (Ventadour, 2006). Proteiny štěpené UPS jsou degradovány na polypetidové řetězce. Jejich dalším osudem je hydrolýza cytoplazmatickým enzymem tripeptidyl-peptidázou II (TPP-II). Následně vzniklé tripeptidy jsou pak štěpeny příslušnými aminopetidázami až na jednotlivé aminokyseliny (Ventadour et al., 2006). Atrogeny, jejichž exprese byla v experimentech nejvýraznější a byla přítomna univerzálně ve všech modelech indukované atrofie, byly geny pro ubikvitin ligázy, atrogin-1/ MAFbx (muscle atrophy F-box protein, lokalizace u člověka 8q24.13) a MuRF1 (muscle RING finger-1 protein, lokalizace u člověka 1p34-p33). Obě tyto ligázy jsou specifické pro sval a jsou odpovědné za akcelerovanou proteolýzu přes ubikvitin-proteasomový systém. Experimentální overexprese MAFbx vedla u myši ke svalové atrofii (Bodine et al., 2001). Oba geny byly zvýšenou měrou exprimovány ve svalu u zvířecího modelu sepse (Wray, 2003) či při aplikaci dexametasonu (Sacheck et al., 2004) nebo TNF-α (Li et al., 2005). Bylo tedy postulováno, že u katabolických stavů indukovaných různými mechanizmy je shodná výsledná transkripční odpověď. Jsou aktivovány stejné geny pro různé kroky v UPS mediované proteolýze. (Lecker et al., 2004). Dlouhou dobu nebylo jasné, co přesně je substrátem pro svalový UPS. Recentní data však ukazují, že ubikvitin-protein DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

metabolismus/výživa Zkratky 4EBP1 – represor cap-binding proteinu eIF4E, Akt – proteinkináza B, AMP – adenosin monofosfát, AMPK – AMP-aktivovaná protein kináza, DGC – dystrofin gylkoproteinový komplex, FoxO – forkhead rodina transkripčních faktorů, IGF-1R – receptor pro insulin-like growth faktor, IKK – IκB kinázový komplex, IR – inzulínový receptor, mTOR – mammalian target of rapamycin, MuRF-1 – muscle ring finger-1 protein, NF-κB – nukleární faktory κB, nNOS – neuronální syntáza oxidu dusnatého, PGC-1α - peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α, PI3K – fosfatidyl inositol trifosfát kináza, ROS – radical oxygen species, volné kyslíkové radikály, S6K1 – kináza S6, Smad – intracelulární transkripční faktory pro TGF-β, TGF-β – transforming growth faktor β, TNF-α – tumor necorsis faktor α Obr. 3: Zjednodušené schéma hlavních regulačních kaskád obratu svalového proteinu, jejich vzájemné interakce a výsledná transkripční odpověď ve smyslu proteosyntézy, respektive proteolýzy. Mezi zde prezentované spouštěče dějů aktivujících proteolytické kaskády patří: deplece energetických substrátů, inaktivita, TNF- α, myostatin a TGF- β. Jako negativní spouštěč, jehož nedostatek aktivuje proteolytické kaskády, je uveden inzulín/IGF-1.

ligáza MuRF1 se podílí na ubikvitinaci a degradaci těžkých myosinových řetězců (Fielitz et al., 2007; Clarke et al., 2007), i když aktin-myosinový komplex štěpit schopna není (Du et al., 2004).

KALCIUM-DEPENDENTNÍ

KALPAINOVÝ SYSTÉM A KASPÁZY

Kalpainy jsou ubikvitérní kalcium dependentní cytoplazmatické proteázy. V kosterním svalu štěpí sarkomerické proteiny zodpovědné za strukturu a soudržnost myofibril, jako například titin, vinculin či nebulin. Naopak se vůbec nepodílejí na degradaci aktinu či myosinu. Jejich aktivita je regulována intracelulární koncentrací kalcia. Kalpainy jsou proteázy, které rozkládají sarkomery, dezintegrují Z-linii a vedou k uvolnění myofilament u zvířecího modelu sepse (Williams et al., 1999). Jsou tedy zodpovědné za iniciální rozklad sarkomery a uvolnění myofilamentárních proteinů k polyubikvitinaci a degradaci přes UPS. Přidání kalcia do myocytární kultury indukuje svalovou atrofii a naopak ošetření antagonisty kalciových kanálů, respektive inhibitorem kalpainu – kalpastatinem vedlo k prevenci rozvoje proteolýzy v UPS (přehled v: Smith et al., 2008; Salazar et al., 2010). Dalšími proteázami podílejícími se obdobným mechanizmem na iniciaci proteolýzy ve svalu jsou některé proapoptotické kaspázy. Kaspáza-3 v myocytární kultuře s nedostatkem kultivačního media (nedostatkem energetických substrátů) štěpila aktin-myozinové komplexy a zvyšovala dostupnost štěpů k degradaci v UPS. Přidání inhibitoru kaspázy stav zvrátilo (Du et al., 2004).

úkolem je degradovat membránové proteiny – receptory, ligandy, transportéry a kanály (Jackman et al., 2004). I když in vitro štěpí hydrolyzáty myofibrilárních proteinů, jejich úloha v proteolýze těchto substrátů in vivo není zcela jasná, přesto je známo, že velké proteinové agregáty jsou pomocí autofagie lyzovány (Bechet et al., 2005). Samotná lyzozomální proteolýza, autofagie, je iniciována sekvestrací části buňky do vakuolárního systému lyzozomu s následnou hydrolýzou jeho obsahu lyzozomálními hydrolázami – katepsiny. Bylo prokázáno, že právě katepsiny jsou ve větší míře exprimovány v různých modelech svalové atrofie. Zvýšená míra autofagie ve svalu byla prokázána v průběhu hladovění (Mizhushima et al., 2004) či denervací indukované atrofie (Furuno et al., 1990). U modelu septických krys byla zvýšena úrověň transkripce mRNA pro katepsin-L (Ctsl) a míra aktivity exprese korelovala s mírou degradace proteinu. Stejně tak expresi katepsinů zvyšovalo podání dexamethasonu, TNF-α (Duval et al., 2001), diabetes 2. typu, nádorový proces či inaktivita (přehled v: Bechet et al., 2005). I když se podle dostupných dat zdá, že proteolýza pomocí katepsinů se pravděpodobně nepodílí výrazně na celkovém objemu degradovaných myofibril, mohla by se podílet na degradaci klíčových regulačních membránových proteinů. Ve zvířecím modelu podvýživou indukované svalové atrofie bylo prokázáno, že gen pro svalový Ctsl je regulován transkripčním faktorem FoxO1 (Yamazaki et al., 2010). Lze se tedy domnívat, že prokázaná zvýšená aktivita Ctsl u svalové atrofie indukované ve zvířecím modelu inaktivitou (Stevenson et al., 2003) může být pod transkripční kontrolou FoxO (viz níže).

TRANSKRIPČNÍ LYZOZOMÁLNÍ

PROTEOLYTICKÝ SYSTÉM

Za fyziologických podmínek se na proteolýze ve svalu podílí také lyzozomální proteázy. Soudí se, že jejich hlavním DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

FAKTORY

ATROGENŮ A JEJICH SIGNÁLNÍ KASKÁDY

Aktivita proteolytických systémů je regulována příslušnými signálními kaskádami transkripčních faktorů.

149

metabolismus/výživa IGF-1/AKT/FOXO

SIGNÁLNÍ DRÁHA

Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) a inzulín jsou jedněmi z nejlépe definovaných růstových faktorů pro kosterní sval. Oba sdílejí obdobnou intracelulární signalizaci. IGF-1 je syntetizován pod kontrolou růstového hormonu převážně játry a následně vyplaven do cirkulace, inzulín je naproti tomu secernován β-buňkami pankreatických ostrůvků. Je známo, že signalizace IGF-1/inzulín stimuluje anabolizmus, tedy i proteosyntézu. Vazbou inzulínu nebo IGF-1 na příslušný receptor (inzulínový receptor, resp. IGF-1R), který má vlastní tyrozin-kinázovou aktivitu, dochází k fosforylaci substrátů inzulínového receptoru (adaptorový protein IRS), štěpení membránového fosfatidylinositol bisfosfátu na diacylglycerol a inositol trifosfát. Posledně jmenovaný je druhým poslem, který spouští příslušné kaskády. Ve vztahu k obratu proteinů je signální dráha kinázy Akt (neboli proteinkináza B). Signální dráha IGF-1/PI3K/Akt je klíčovým intracelulárním regulátorem svalové hypertrofie (Glass, 2005). Za normálních okolností IGF-1/PI3K/Akt dráha stimuluje proteosyntézu a suprimuje expresi atrogenů, a tedy proteolýzu. Naopak za okolností kachexigenních je signální dráha IGF-1/PI3K/Akt blokována. Po proudu pod kinázou Akt se kaskáda rozpadá na tři hlavní větve. (1) Akt/ mTOR (mammalian target of rapamycin) má úlohu v aktivaci proteosyntézy. (2) Akt/GSK 3β (glykogen syntáza kináza 3β) a (3) Akt/FoxO kontrolují degradaci proteinů, jejich aktivita podporuje katabolizmus. Aktivace kaskády IGF-1/PI3K/Akt stimuluje anabolizmus aktivací mTOR a inhibicí FoxO a GSK 3β. (1) Akt/FoxO. Pod kinázou Akt se v regulační kaskádě svalové atrofie nachází proteiny FoxO, podskupina transkripčních faktorů z rodiny Forkhead. Jedná se evolučně vysoce konzervované regulátory genů pro metabolizmus, apoptózu a buněčný růst (Tran et al., 2003). Aktivovaná proteinkináza Akt fosforyluje FoxO na několika místech, což vede k jejich zadržení v cytoplazmě a k inhibici jejich transkripční aktivity (Sandri et al., 2004). Naopak není-li Akt kináza aktivována, dochází k defosforylaci FoxO faktorů, jejich translokaci do jádra myocytu a inhibici růstu a apoptózu. Navíc FoxO1 transgenní myši vykazovaly v experimentu významnou redukci svalové hmoty a atrofii (Southgate et al., 2007) a FoxO3 instilovaný do svalu in vivo zvyšoval expresi atroginu-1 (Sandri et al., 2004). (2) Akt/mTOR. Kromě FoxO, jak již bylo zmíněno, je dalším enzymem v signální dráze pod Akt mTOR. Kináza mTOR je klíčovým regulátorem buněčného růstu, který integruje signály růstových faktorů a energetického stavu. Aktivace Akt/mTOR je odpovědná za IGF-1 zprostředkované transkripční změny ve smyslu hypertrofie kosterního svalu. Role mTOR ve svalové hypertrofii byla prokázána pokusy in vivo, kdy rapamycin (inhibitor mTOR) blokoval regeneraci svalu a hypertrofickou odpověď na zátěž, aniž by však způsoboval atrofii svalu (Bodine et al., 2001b). (3) Akt/GSK 3β. GSK 3β je negativním proteosyntetickým regulátorem. Inhibuje transkripční faktory podílející se na diferenciaci myoblastů a proteoanabolizmu. Inhibice GSK 3β v  experimentu aktivuje diferenciaci, vede k  hypertrofii

150

myocytu a přispívá k celkovým účinkům IGF-1 (přehled v: Schakman et al., 2008). Zdá se tedy, že jak Akt/ FoxO, tak Akt/mTOR a Akt/GSK 3β dráhy jsou odpovědné za indukci transkripčních změn podílejících se na kontrole růstu, resp. atrofie svalu (Zhang et al., 2007). Výslednicí absence signalizace IGF-1/PI3K/Akt je tedy inhibice hypertrofizujících účinků mTOR a desinhibice účinků atrofizujících, které představují kaskády FoxO/atrogin-1 a FoxO/MuRF1 směřující k proteolýze přes UPS.

NF-ΚB

SIGNÁLNÍ DRÁHA

Vývojově stará rodina transkripčních faktorů NF-κB zastává klíčovou úlohu v aktivaci imunitní a zánětlivé odpovědi organizmu na infekční, mitogenní, růstové, oxidativní a biomechanické inzulty (přehled v: Li et al., 2008; Ghosh et al., 1998). Tyto faktory jsou přítomny v cytoplazmě myocytu v neaktivní formě jako homo- resp. heterodimery, a jsou vázány na inhibiční IκB. Stimuly aktivující NF-κB pochází z různých signálních drah. Mezi nimi například NIK (NF-κB -inducing kináza), mitogen-activated protein kináza, Akt kináza, IL-1 receptor asociované kinázy, MyD 88, TNFR (receptor TNF-α), PKC, TGF-β aktivovaná kináza a další (Li et al., 2008). Všechny tyto indukující faktory konvergují na IκB kinázovém komplexu (IKK), který fosforyluje IκB. Fosforylace inhibičního IκB má za následek jeho polyubikvitinaci a degradaci v UPS. Dochází k desinhibici NF-κB a odhalení nukleárního lokalizujícího signálu na molekule. Celý protein je následně translokován do jádra, kde se váže na příslušná místa DNA a reguluje transkripci cílových genů (Zhang et al., 2007). Důsledkem aktivace NF-κB ve svalu je iniciace mechanizmů vedoucích k degradaci svalového proteinu. Jsou studovány tři možné mechanizmy, jakými se NF-κB podílí na regulaci svalové hmoty: (1) Aktivace kaskád NF-κB vede ke zvýšení exprese enzymů UPS, (2) ke zvýšení produkce prozánětlivých cytokinů (TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, TWEAK) a (3) inhibuje myogenezu a interaguje tak s reparačními mechanizmy myoctu (Li, 2008). Na výkonu degradace svalového proteinu spouštěného IKKβ/NF-κB se podílí ubikvitin-proteasomový systém. Transgenní myši se zvýšeně exprimovaným svalovým IKKβ vykazovaly těžkou sarkopenii, která byla zprostředkována zvýšenou expresí MuRF1, nikoli však atrogin-1/MAFbx (Cai et al., 2004). Naopak delece svalově-specifické IKKβ u myši vedla ke snížení exprese MuRF1 a bránila tak rozvoj arteficiální denervační atrofie (Mourkitoti et al., 2006). Tyto výsledky ukazují, že aktivace IKKβ/NF-κB vede ke katabolizmu svalu cestou zvýšení exprese ligázy MuRF1, jako klíčového enzymu v proteolýze přes UPS. Myogeneza svalu je regulovaný proces, který zahrnuje přeměnu progenitorových mezodermálních buněk v myoblasty, jejich únik z buněčného cyklu a fúzi se svalovými vlákny. Myogeneza není limitována pouze na růst, ale slouží také k údržbě a reparaci myocytů. Regenerace svalu je jakousi rekapitulací vývoje svalu v postnatálním kontextu (Kollias et al., 2008). NF-κB v experimentu in vitro inhibuje diferenciaci myocytů. Předpokládá se proto, že NF- κB zprostředkované omezení reparace a regenerace myocytu se může podílet na procesu svalové atrofie. Děje se tak pravděpodobně DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

metabolismus/výživa posttranslační modifikací a inhibicí MyoD. MyoD je hlavním myogenním transkripčním faktorem, který aktivuje svalové progenitorové buňky a vede k přesmyku směrem k diferenciaci a fúzi myoblastů (přehled v: Li et al., 2008).

STUDOVANÉ

SPOUŠTĚCÍ MECHANIZMY SVALOVÉ ATROFIE

Katabolických stavů spojených se ztrátou hmoty kosterního svalstva existuje v klinické praxi celá řada. Jsou charakterizovány zvýšenou poptávkou po svalových aminokyselinách na úrovni celého organizmu a jejich zvýšeným obratem v kosterního svalu, což má za následek jeho degradaci se všemi důsledky na možnost přežití stresového inzultu. Většina těchto stavů je charakterizována spolupůsobením několika spouštěcích mechanizmů. V následujícím přehledu jsou představeny základní studované mechanizmy, které aktivují signální kaskády vedoucí k proteolýze ve svalu.

ZÁNĚTLIVÉ

MEDIÁTORY

Systémová zánětlivá odpověď je jednou z častých příčin katabolického stavu. Prozánětlivé cytokiny jako IL-1β, IL-6 či TNF-α jsou prokázanými iniciátory degradace svalového proteinu (reviewed in Spate et al., 2004). Svalová atrofie spouštěná cytokiny (malignita, srdeční selhání, renální selhání, kritický stav atd.) je součástí kompelxní metabolické poruchy a nově se klasifikuje termínem kachexie (Cruz-Jentoft et al., 2010). Studovaných patogenetických mechanizmů je hned několik. TNF-α a IL-1β inhibují aktivitu růstového hormonu a IGF-1, tedy tlumí jejich hypertrofizující efekt (inhibice kaskády IGF-1/Akt). Zvýšují expresi chemokinů a adhezivních molekul a zvyšují infiltraci svalu imunokompetentními buňkami, což vede k aktivaci extracelulárních proteáz a nastartování oxidačního stresu. Cytokiny samy také přímo aktivují IKK/NF-κB kaskádu. Zvýšená aktivita NF-κB byla prokázána in vitro u myocytu v katabolickém stavu indukovaném TNF-α (Li et al., 2000). Dochází ke zvýšení exprese ligázy MuRF-1 a zahájení proteolýzy v UPS. Dále NF-κB faktory samy regulují expresi cytokinů, chemokinů, adhezních molekul a enzymů podílejících se na buněčné desintegraci, jako například proteázy MMP (matrix metaloproteinázy) (přehled v: Li et al., 2008).

FYZICKÁ

INAKTIVITA

Fyzická inaktivita je známým stavem zodpovědným za ztrátu svalové hmoty. Není-li kosterní sval funkčně zatěžován, je z adaptačního hlediska nepotřebný a propadá atrofii. V klinické praxi tento stav provází jak sedavý způsob života, zejména ve stáří, tak například upoutání na lůžko během akutního onemocnění. Samotná desetidenní imobilizace u zdravých lidí vyššího věku vede ke ztrátě přibližně jednoho kilogramu kosterního svalu (Kortebein et al., 2007). Zatímco u kachexie je spouštěcí úloha cytokinů zřejmá, při svalové atrofii indukované inaktivitou se pravděpodobně cytokiny neuplatňují. Byla však prokázána stejná transkripční odpověď zprostředkovaná NF-κB. Nedostatečná funkční stimulace svalu je spojena s aktivací tzv. alternativní NF-κB DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

dráhy (Hunter et al., 2002; Jackman et al., 2004). Mechanizmus, jakým je však tato dráha při inaktivitě spouštěna, zůstává předmětem výzkumu. Jeden z možných faktorů však přitahuje větší pozornost. Dystrofin glykoproteinový komplex (DGC) spojuje cytoskelet s buněčnou membránou. V kosterním svalu jeho význam spočívá v přenosu tažných sil aktin-myozinových komplexů na extracelulární matrix. Vrozené defekty v dystrofinu (Duchennova svalová dystrofie) vedou k poruše tolerance mechanického stresu a k degeneraci myocytu. Bylo prokázáno, že defekt v dystrofinu je přítomen také u různých modelů svalové atrofie. Součástí širšího komplexu DGC na membráně jsou neuronální syntázy oxidu dusnatého (nNOS). Jak u  dystrofického svalu, tak během atrofie byla prokázána porušená vazba nNOS na DGC. Volné nNOS se přesouvají do cytoplazmy, kde aktivují FoxO-3 dependentní transkripci příslušných atrogenů. Dalším mechanizmem, který může přispívat k atrofii, je také tvorba ROS spuštěná nNOS/NO mediovanou nitrozylací. Předpokládá se tedy, že DGC je jakýmsi mechanickým senzorem a zprostředkovává adaptaci svalu na inaktivitu. Při nedostatečné mechanické stimulaci dochází k poruše vazby nNOS na DGC, nNOS jednak aktivuje v cytoplazmě FoxO-3, jehož transkripční odpovědí je exprese atrogenů, a jednak tvorbou NO vede ke zvýšené produkci ROS (přehled v: Acharyya et al., 2007; Sandri, 2008).

NEDOSTATEK

PŘÍMÝCH ENERGETICKÝCH SUBSTRÁTŮ

Dostupnost přímých energetických substrátů je podmínkou buněčného anabolizmu, syntézy makromolekul. Je tedy jasné, že stav opačný, deplece substrátů, je jedním ze spouštěcích mechanizmů katabolizmu. Kritickou úlohu v odpovědi buňky na snížený energetický stav má kináza AMPK (AMP-activated protein kinase). Přepíná z energii konzumujících drah na dráhy energii produkující (Greer et al., 2007). Energetický stres myocytu rezultuje u animálního modelu ve zvýšení poměru AMP/ATP, aktivaci AMPK, zvýšenou utilizaci intramyocelulárně deponovaných lipidů a degradaci myofibrilárního proteinu s následnou svalovou atrofií. Recentní data ukazují vazbu mezi AMPK a FoxO3 a tedy i přímý efekt AMPK na indukci buněčného katabolizmu. AMPK fosforyluje Akt-independentní místa FoxO3 a stimuluje tak jeho transkripční aktivitu (Greer et al., 2007). Kromě tohoto katabolického působení stimulovaná AMPK inhibuje buněčné anabolické dráhy. V atrofující svalové buňce dochází k adaptačním změnám spočívajícím ve snížené regulaci exprese genů pro enzymy glykolýzy a oxidativní fosforylace (Lecker et al., 2004). Tento anti-anabolický efekt je spojen s inhibicí mTOR komplexu a PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α). PGC-1α je významný transkripční koaktivátor regulující mitochondriální biogenezu. Jeho gen je down-regulován u různých modelů svalové atrofie. Deplece dostupných energetických substrátů v myocytu tedy aktivuje adaptační změny (down-regulace biogeneze mitochondrií via PGC-1α, inhibice anabolických efektů mTOR a aktivace UPS via signální kaskádu AMPK/FoxO-3), jejichž cílem je navodit proteokatabolizmus.

151

metabolismus/výživa GLUKOKORTIKOIDY Glukokortikoidy jsou významnými kontraregulačními hormony. Hrají roli při hladovění a odpovědi organizmu na stres. Hladina glukokortikoidů je zvýšena při mnohých patologických stavech spojených s úbytkem svalové hmoty. Dexametason je standardně používán k indukci svalové proteolýzy u animálních modelů (Hasselgren, 1999). Mechanizmy, kterými glukokortikoidy aktivují katabolické kaskády ve svalu, stále nejsou zcela zřejmé. V několika studijích dexametasonem indukované svalové atrofie byla prokázána zvýšená exprese jak atrogin-1, tak MuRF1 (Clarke et al., 2007), což odpovídá aktivaci degradace svalového proteinu cestou UPS. Blokováním jednotlivých svalových proteolytických systému bylo prokázáno, že je také aktivní lyzozomální i kalpainový systém (Hasselgren, 1999). , že je také aktivní lyzozomální i kalpainový systém (Hasselgren, 1999). Hlavní úlohu ve zprostředkování odpovědi myocytu na aktivaci glukokortikoidního receptoru mají pravděpodobně FoxO transkripční faktory (přehled v: Schakman et al., 2008). Kromě toho podání dexametasonu také stimulovalo aktivitu svalového myostatinu, jehož gen má ve svém promotoru mnohočetné glukokortikoidní responsivní elementy (GRE) (Ma et al., 2001), a na výsledném katabolickém obrazu se tedy podílí také desinhibice myostatinu (viz níže). Doposud nebyl identifikován žádný atrogen, který by byl přímo regulován glukokortikoidy, ani nebyl identifikován glukokortikoidní responsivní element na promotorech atrogenů (Lecker et al., 2004). Proto se předpokládá, že jejich efekt je spíše nepřímý, převážně přes výše popsané signální dráhy (Sandri, 2008). Glukokortikoidy mají také významný anti-anabolický efekt. Interferují s diferenciací progenitorových buněk a myogenezí. Snižují vstup aminokyselin do svalu a snižují aktivitu IGF-1/Akt signální kaskády (přehled v: Schakman et al., 2008). Dále glukokortikoidy zvyšují expresi REDD1, represoru mTOR (Wang et al., 2006).

KATECHOLAMINY Katecholaminergní (KA) odpověď sympatoadrenálního systému doprovází fyzickou zátěž a stresovou odpověď organizmu. V kosterním svalu jsou exprimovány zejména β2-receptory. Vazba ligandu aktivuje membránově vázanou adenylátcyklázu, dochází ke štěpení ATP na cAMP, který funguje jako druhý posel, aktivuje PKA/CREB (protein kináza A/cAMP responsive element binding protein) a expresi příslušných genů. Kromě toho má stimulace β2-receptorů také svoje negenomické efekty spočívající v ovlivnění aktivity příslušných enzymů. Odpověď metabolizmu myocytu na KA stimuly je proteoanabolická. Je známo, že β2-agonisté (clenbuterol) stimulují růst svalu. Stimulace β2-receptorů vede k přestavbě struktury vláken ve prospěch rychlých glykolytických (Kim et al., 1992; Spurlock et al., 2006). KA také působí přímo indukcí IGF-1/mTOR. Rapamycin (inhibitor mTOR) blokoval v experimentu efekty stimulace β-adrenergních receptorů clenbuterolem (Kline et al., 2007). Stimulace β-adrenergních receptorů tedy vede ke snížení aktivity UPS a tedy i úrovně proteolýzy (přehled v: Gonçalves et al., 2009). Na

152

druhou stranu bylo prokázáno, že neselektivní beta-adrenergní blokáda může tlumit hyperkatabolickou odpověď a  bránit tak rozvoji kachexie u popáleninových pacientů (Pereira et al., 2005).

TYREOIDÁLNÍ

HORMONY

Tyreoidální hormony jsou na systémové úrovni jedněmi z významných regulátorů růstu, vývoje a metabolických dějů. Jsou produkovány folikulárními buňkami štítnice pod kontrolou hypothalamo-hypofyzární osy TRH-TSH. Na periferii dochází k jejich modifikaci příslušnými dejodázami. Účinným působkem je trijódtyronin (T3), jehož receptory se nacházejí prakticky ve všech tkáních. T3 jako lipofilní hormon prostupuje volně buněčnou membránou do cytoplazmy. Jeho účinky jsou genomické a negenomické. Prvně jmenované jsou zprostředkovány vazbou T3 na specifický nukleární receptor (TR α1, β1, β2), translokace vzniklého komplexu do jádra a vazba na tyroidální responsivní element (TRE) na promotoru příslušného genu. Vzhledem k  pleiotropním efektům tyroidálních hormonů je exprimovaných genů celá řada a většina z nich není doposud známa. Z nejvýznamnějších poznaných genů, které hrají svou úlohu v regulaci množství svalové hmoty, uveďme MHC (geny pro těžké myosinové řetězce – viz dále), HIF-1α a geny regulující metabolizmus glukózy (GLUT-1 receptory, vychytávání glukózy), PFKP (platelet-derived fosfofrukokináza – glykolýza); MCT-4, (monocarboxylate transporter – export laktátu) či beta-adrenergní receptory ve svalu (Martin et al., 1992). T3  cestou aktivace HIF-1α zvyšuje citlivost buňky na hypoxii a odpřahuje tvorbu ATP ve svalu pomocí aktivace uncoupling proteinů a následně zvýšené termogenezy (Mitchell et al., 2010; Flandin et al., 2009). Negenomické efekty jsou dány aktivací membránových receptorů či vazbou T3 na cytozolické enzymy a změnou jejich aktivity. Takto T3 reguluje intracelulární hladinu Ca2+ a aktivitu PKC. Vazbou na membránový integrin αVβ3 aktivuje MAPK kinázovou kaskádu. Oba tyto mechanizmy vedou k aktivaci angiogenezy a buněčného růstu. Dalším mechanizmem negenomického účinku je interakce komplexu T3-TR β1 s aktivační podjednotkou PI3K (inositol trifosfát kinázy). Toto vede k její aktivaci a spuštění kaskády PI3K/Akt/ mTOR (přehled v: Moeller et al., 2006). Podání T3 vedlo v kosterním svalu k signifikantnímu zvýšení úrovně fosforylace a inhibice AMPK (Irrcher et al., 2008), což dokládá, že jedním z negenomických účinků T3 je také upřednostnění drah produkujících energii. Za fyziologických podmínek vede tedy stimulace svalu tyroidálními hormony k růstu a vývoji, k akceleraci proteosyntézy. Ve svalu se podílí na jeho plasticitě regulací exprese MHC genů, genů pro těžké řetězce myosinu. Vzhledem k těsné korelaci aktivity tyreoidální stimulace a stimulace mechanickou zátěží se dokonce soudilo, že tyreoidální hormony zprostředkovávají adaptaci svalu na fyzickou aktivitu/inaktivitu (přehled v: Kenneth et al., 2001). Ve svalu, který je nadměrně stimulován T3 (hypertyreóza) dochází k syntéze příslušné izoformy MHC s vyšší ATPázovou aktivitou – zvýšenému podílu rychlých (glykolytických) nad pomalými (oxidativními) svalovými vlákny. Dále je zvýšený obrat svalových proteinů, s převažující proteolýzou. DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

metabolismus/výživa Hypermetabolický stav indukovaný nadměrnou stimulací T3 vede k zvýšené lokální produkci ROS. Jedná se o následek akcelerované aktivity elektronových nosičů respiračního cyklu v hypertyreoidní tkáni. K akcelerované proteolýze tedy přispívá také nepřímo cestou katabolických kaskád ROS (Venditti et al., 2006). Naopak hypotyreóza vede ke zvýšení podílu pomalých vláken. Dochází ke snížení obratu svalových proteinů, a tedy k nedostatečnému zajištění údržby a obnovy svalu. Snižuje se intenzita kontrakce a relaxace myofibrily. Dále je snížená exprese β-adrenergních receptorů a limitována mitochondriální oxidativní kapacita. To vše vede k rozvoji klinického obrazu hypotyreoidní myopatie.

MYOSTATIN

A

TGF-Β

Myostatin je protein, člen TGF-β rodiny syntetizovaný přímo v kosterním svalu. Pro jeho prokázaný inhibiční vliv na svalový růst se řadí mezi tzv. negativní růstové faktory. Jeho úloha pravděpodobně tkví v regulaci odpovědi na prorůstové stimuly, jako například zátěž či naopak inaktivitu, i když důkazy zatím chybí. Inaktivující mutace v genu pro myostatin (loss-of-function modely) vedly v experimentu k hypertrofickému (hypermuskulárnímu) fenotypu u myši, ovce a dobytka. Nulové mutace byly pospány i u lidí s hypermuskulárním fenotypem (Schuelke et al., 2004). Nárůst svalové hmoty byl dán jak hypertrofií myocytů, tak jejich hyperplázií (Valdivia et al., 2009). Obdobný efekt na sval má také cirkulující TGF-β1. Bylo opakovaně prokázáno, že hladina mRNA myostatinu je snížena v odpovědi na fyzickou zátěž (přehled v: Kollias, 2008). Role myostatinu v indukci svalové atrofie však zcela zřejmá není. Na tkáňových kulturách myostatin blokoval IGF1/PI3K/Akt a aktivoval FoxO1, což vedlo ke zvýšené expresi atroginu-1 (McFarlane et al., 2006). Tento mechanizmus účinku se však doposud nepodařilo potvrdit ve studiích in vivo. Další otázkou zůstává, co jsou cílové transkripční faktory pro myostatin. Zatímco je známo, že TGF-β1 aktivuje Smad transkripční faktory (které jsou společné pro celou TGF-β rodinu) a reguluje tak expresi myogenních genů, jako např. MyoD, jak vypadá signální kaskáda pod myostatinem zůstává stále předmětem výzkumu (Kollias et al., 2008).

OXIDAČNÍ

STRES

Volné kyslíkové radikály (reactive oxygen species, ROS) jsou dalšími studovanými induktory svalové atrofie. Podílí se na jejím rozvoji jak v případě oxidativního stresu způsobeného patologickými stavy spojenými s cirkulujícími cytokiny, tak inaktivitou. Za normálních okolností se redoxní rovnováha podílí i na udržení homeostázy myocytu. ROS konstitutivně vznikají, fungují jako transduktory v různých signálních drahách a jsou eliminovány. ROS jsou ve svalu kupříkladu nezbytné pro aktivitu IGF-1/Akt. Zvýšení obratu svalového proteinu je iniciováno překonáním antioxidačních kapacit organizmu, nepoměrem produkce a eliminace ROS. Inaktivita u zvířecího modelu vedla ke zvýšené expresi Cu a Zn-superoxid dismutázy a zároveň ke snížené aktivitě enzymů glutation-peroxidázy a katalázy. To vše s následkem narušení antioxidačních mechanizmů, elevace DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

hydroperoxidů a tedy i míry oxidativního stresu (Lawler et al., 2003). Další studie potvrdily, že efekt ROS je zprostředkován UPS (Li et al., 2003) a že k jeho zvýšené expresi dochází cestou jak NF-κB, tak FoxO (přehled v: Jackman et al., 2004; Dodd et al., 2010). ROS jsou také jedním z mechanizmů rozvoje cytokiny (zánětem) indukované svalové atrofie. Myocyty stimulované TNF-α vykazovaly vyšší hladiny ROS, uvolněné pravděpodobně z mitochondrií. Přidání H2O2 vedlo k aktivaci NF-κB nezávisle na stimulaci TNF-α (Li, 1998). Stále není jasné, zda ROS jsou primárním iniciátorem proteolytických kaskád, nebo jsou jen následkem aktivované proteolýzy a jejich úloha je spíše v modulaci jiných signálních drah (Brocca et al., 2010).

HYPOXIE V oxidativních tkáních je energie získávána ve formě ATP v procesu oxidativní fosforylace na vnitřní mitochondriální membráně. Aby byly mitochondrie schopny udržet tuto produkci ATP, potřebují kontinuální přísun energetických substrátů a kyslíku. Kyslík je konečným akceptorem elektronů v respiračním řetězci a myocyt má vzhledem ke svým funkcím vysoké nároky na jeho přísun k produkci ATP. Fakt, že hypoxie indukuje svalovou atrofii, je empirickou zkušeností prověřenou léty studia adaptace organizmu na vysokou nadmořskou výšku, tedy na hypobarickou hypoxii. Primární transkripční odpověď na hypoxický inzult je zprostředkována hypoxií-indukovaným faktorem (HIF-1). Jeho molekula se skládá ze dvou podjednotek. HIF-1α je v cytoplazmě myocytu kontinuálně syntetizován a za normoxických podmínek je post-translačně modifikován O2 a inaktivován. Avšak v podmínkách hypoxických se HIF-1α akumuluje v buňce a je translokován do jádra, kde se naváže na přítomnou HIF-1β podjednotku. Takto vzniklý heterodimer se pak váže na HRE (hypoxia responsive element) region příslušného genu. Dochází ke (1) zvýšené expresi proteinů asociovaných se zlepšením dodávky O2 tkáním (VEGF, EPO ad.), (2) zvýšené autofagii mitochondrií jakožto prevenci poškození ROS a (3) snížení úrovně proteosyntézy zprostředkované AMPK (přehled v: Murray et al., 2009). Posledně jmenovaný mechanizmus hraje zřejmě zásadní roli ve svalové atrofii – snížením proteosyntézy. Lidé krátkodobě aklimatizovaní na nadmořskou výšku měli sníženou hladinu mTOR ve svalové tkáni (Vigano et al., 2008), což je v souladu s tímto předpokladem.

ZÁVĚR Svalová atrofie přitahuje poslední dobou velkou pozornost vědecké komunity. Je to logické, když si uvědomíme, že je to problematika společná pokročilým stavům různých nemocí, kachexii, stárnutí či fyzické inaktivitě. Během posledních dekád byl učiněn významný pokrok v poznání subcelulárních mechanizmů patogeneze svalové atrofie s cílem získat patofyziologické podklady pro farmakologický vývoj. Klinických stavů vedoucích k svalové atrofii je celá řada. Je jim společný akcelerovaný katabolizmus svalových proteinů mající za cíl zajistit dostatek volných aminokyselin k udržení kritických stresových odpovědí tak, aby organizmus mohl

153

metabolismus/výživa takový stav překonat. Na buněčné úrovni jsou proteokatabolické signály zprostředkovány příslušnými signálními kaskádami, které konvergují na dvou základních transkripčních faktorech NF-κB a FoxO. Jejich aktivace spouští expresi atroginů, jejichž produkty jsou regulační enzymy myocytárních proteolytických systémů. Ústřední úlohu ve výkonu svalové atrofie hraje ubikvitin-proteasomový systém. V současnosti neexistují žádné farmakologické možnosti, jak často zhoubný průběh svalové atrofie, resp. kachektizace zvrátit. Další studium spouštěcích mechanizmů, signálních molekul a cílových efektorových systémů nám může pomoci k vyvinutí prostředků, jak úbytek svalové tkáně zpomalit či úplně zastavit.

LITERATURA 1. Acharyya S, Butchbach MER, Sahenk Z, Wang H, Saji M, Carathers M, Ringel MD, Skipworth RJE, Fearon KCH, Hollingsworth MA, Muscarella P, Burghes AHM, Rafael-Fortney JA, Guttridge DC. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell 2005;8(5):421-432. 2. Acharyya S, Guttridge DC. Cancer cachexia signaling pathways continue to emerge yet much still points to the proteasome. Clin Cancer Res 2007;13(5):1356-1361. 3. Baldwin KM, Haddad F. Effects of different activity and inactivity paradigms on myosin heavy chain gene expression in striated muscle. J Appl Physiol 2001;90(1):345-357. 4. Bechet D, Tassa A, Taillandier D, Combaret L, Attaix D. Lysosomal proteolysis in skeletal muscle. Int J Biochem Cell Biol 2005; 37(10):2098-2114. 5. Bingwen J, Yi-Ping L. Nitric Oxide does not mediate Atrogin-1/ MAFbx upregulation byinflammatory mediators‘, Basic Applied Myology (2008);18 (5): 127-130. 6. Bodine SC, Latres E, Baumhueter S, Lai VK, Nunez L, Clarke BA, Poueymirou WT, Panaro FJ, Na E, Dharmarajan K, Pan ZQ, Valenzuela DM, DeChiara TM, Stitt TN, Yancopoulos GD, Glass DJ. Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy. Science 2001;294(5547):1704-1708. 7. Bodine SC, Stitt TN, Gonzalez M, Kline WO, Stover GL, Bauerlein R, Zlotchenko E, Scrimgeour A, Lawrence JC, Glass DJ, Yancopoulos GD. Akt/mTOR pathway is a crucial regulator of skeletal muscle hypertrophy and can prevent muscle atrophy in vivo. Nat Cell Biol 2001;3(11):1014-1019. 8. Brocca L, Pellegrino MA, Desaphy JF, Pierno S, Camerino DC, Bottinelli R. Is oxidative stress a cause or consequence of disuse muscle atrophy in mice? A proteomic approach in hindlimb-unloaded mice. Exp Physiol 2010;95(2):331-350. 9. Cai D, Frantz JD, Tawa NE, Melendez PA, Oh BC, Lidov HGW, Hasselgren PO, Frontera WR, Lee J, Glass DJ, Shoelson SE. IKKbeta/NF-kappaB activation causes severe muscle wasting in mice. Cell 2004;119(2):285-298. 10. Clarke BA, Drujan D, Willis MS, Murphy LO, Corpina RA, Burova E, Rakhilin SV, Stitt TN, Patterson C, Latres E, Glass DJ. The E3 Ligase MuRF1 degrades myosin heavy chain protein in dexamethasone-treated skeletal muscle. Cell Metab 2007;6(5):376-385.

154

11. Cruz-Jentoft AJ, Baeyens JP, Bauer JM, Boirie Y, Cederholm T, Landi F, Martin FC, Michel JP, Rolland Y, Schneider SM, Topinková E, Vandewoude M, Zamboni M, on Sarcopenia in Older People EWG. Sarcopenia: European consensus on definition and diagnosis: Report of the European Working Group on Sarcopenia in Older People. Age Ageing 2010;39(4):412-423. 12. Deval C, Mordier S, Obled C, Bechet D, Combaret L, Attaix D, Ferrara M. Identification of cathepsin L as a differentially expressed message associated with skeletal muscle wasting. Biochem J 2001;360(Pt 1):143-150. 13. Dodd SL, Gagnon BJ, Senf SM, Hain BA, Judge AR. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle Nerve 2010;41(1):110-113. 14. Du J, Wang X, Miereles C, Bailey JL, Debigare R, Zheng B, Price SR, Mitch WE. Activation of caspase-3 is an initial step triggering accelerated muscle proteolysis in catabolic conditions. J Clin Invest 2004;113(1):115-123. 15. Fielitz J, Kim MS, Shelton JM, Latif S, Spencer JA, Glass DJ, Richardson JA, Bassel-Duby R, Olson EN. Myosin accumulation and striated muscle myopathy result from the loss of muscle RING finger 1 and 3. J Clin Invest 2007;117(9):2486-2495. 16. Flandin P, Lehr L, Asensio C, Giacobino JP, Rohner-Jeanrenaud, F, Muzzin P, Jimenez M. Uncoupling protein-3 as a molecular determinant of the action of 3,5,3‘-triiodothyronine on energy metabolism. Endocrine 2009;36(2):246-254. 17. Furuno K, Goodman MN, Goldberg AL. Role of different proteolytic systems in the degradation of muscle proteins during denervation atrophy. J Biol Chem 1990;265(15):8550-8557. 18. Ghosh S, May MJ, Kopp EB. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol 1998;16:225-260. 19. Glass DJ. Skeletal muscle hypertrophy and atrophy signaling pathways. Int J Biochem Cell Biol 2005;37(10):1974-1984. 20. Gomes MD, Lecker SH, Jagoe RT, Navon A, Goldberg AL. ‚Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98(25):1444014445. 21. Gordon ES, Dressman HAG, Hoffman EP. The genetics of muscle atrophy and growth: the impact and implications of polymorphisms in animals and humans. Int J Biochem Cell Biol 2005;37(10):2064-2074. 22. Greenhaff PL, Karagounis LG, Peirce N, Simpson EJ, Hazell M, Layfield R, Wackerhage H, Smith K, Atherton P, Selby A, Rennie MJ. Disassociation between the effects of amino acids and insulin on signaling, ubiquitin ligases, and protein turnover in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab 2008;295(3):E595-E604. 23. Greer EL, Oskoui PR, Banko MR, Maniar JM, Gygi MP, Gygi SP, Brunet A. The energy sensor AMP-activated protein kinase directly regulates the mammalian FOXO3 transcription factor. J Biol Chem 2007;282(41):30107-30119. 24. Ichi Hanai J, Cao P, Tanksale P, Imamura S, Koshimizu E, Zhao J, Kishi S, Yamashita M, Phillips PS, Sukhatme VP, Lecker SH. The muscle-specific ubiquitin ligase atrogin-1/MAFbx mediates statin-induced muscle toxicity. J Clin Invest 2007;117(12):39403951. 25. Hasselgren PO. Glucocorticoids and muscle catabolism.‘, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 1999;2(3):201-205. 26. Hermans G, Jonghe BD, Bruyninckx F, den Berghe GV. Clinical review: Critical illness polyneuropathy and myopathy. Crit Care 2008;12(6):238.

DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

metabolismus/výživa 27. Holzbaur ELF, Howland DS, Weber N, Wallace K, She Y, Kwak S, Tchistiakova LA, Murphy E, Hinson J, Karim R, Tan XY, Kelley P, McGill KC, Williams G, Hobbs C, Doherty P, Zaleska MM, Pangalos MN, Walsh FS. Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis 2006;23(3):697-707. 28. Hunter RB, Stevenson E, Koncarevic A, Mitchell-Felton H, Essig DA, Kandarian SC. Activation of an alternative NF-kappaB pathway in skeletal muscle during disuse atrophy. FASEB J 2002;16(6):529-538. 29. Irrcher I, Walkinshaw DR, Sheehan TE, Hood DA. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol 2008;104(1):178-185. 30. Jackman RW, Kandarian SC. The molecular basis of skeletal muscle atrophy‘, Am J Physiol Cell Physiol 2004;287:834-843. 31. Kim YS, Sainz RD. Beta-adrenergic agonists and hypertrophy of skeletal muscles. Life Sci 1992;50(6):397-407. 32. Kline WO, Panaro FJ, Yang H, Bodine SC. Rapamycin inhibits the growth and muscle-sparing effects of clenbuterol. J Appl Physiol 2007;102(2):740-747. 33. Kollias HD, McDermott JC. Transforming growth factor-beta and myostatin signaling in skeletal muscle. J Appl Physiol 2008; 104(3):579-587. 34. Kortebein P, Ferrando A, Lombeida J, Wolfe R, Evans WJ. Effect of 10 days of bed rest on skeletal muscle in healthy older adults. JAMA 2007;297:1772-1774 35. Lawler JM, Song W, Demaree SR. Hindlimb unloading increases oxidative stress and disrupts antioxidant capacity in skeletal muscle. Free Radic Biol Med 2003;35(1):9-16. 36. Lecker SH, Goldberg AL, Mitch WE. Protein degradation by the ubiquitin-proteasome pathway in normal and disease states. J Am Soc Nephrol 2006;17(7):1807-1819. 37. Lecker SH, Jagoe RT, Gilbert A, Gomes M, Baracos V, Bailey J, Price SR, Mitch WE, Goldberg AL. Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression. FASEB J 2004;18(1):39-51. 38. Lee CE, McArdle A, Griffiths RD. The role of hormones, cytokines and heat shock proteins during age-related muscle loss. Clin Nutr 2007;26(5):524-534. 39. Li H, Malhotra S, Kumar A. Nuclear factor-kappa B signaling in skeletal muscle atrophy.‘, J Mol Med 2008;86(10):1113-1126. 40. Li YP, Reid MB. NF-kappaB mediates the protein loss induced by TNF-alpha in differentiated skeletal muscle myotubes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2000;279(4):R1165-R1170. 41. Li YP, Schwartz RJ, Waddell ID, Holloway BR, Reid MB. Skeletal muscle myocytes undergo protein loss and reactive oxygen-mediated NF-kappaB activation in response to tumor necrosis factor alpha. FASEB J 1998;12(10):871-880. 42. Li YP, Chen Y, John J, Moylan J, Jin B, Mann DL, Reid MB. TNF-alpha acts via p38 MAPK to stimulate expression of the ubiquitin ligase atrogin1/MAFbx in skeletal muscle.‘, FASEB J 2005; 19(3):362-370. 43. Li YP, Chen Y, Li AS, Reid MB. Hydrogen peroxide stimulates ubiquitin-conjugating activity and expression of genes for specific E2 and E3 proteins in skeletal muscle myotubes. Am J Physiol Cell Physiol 2003;285(4):C806-C812. 44. Lim CT, Kola B, Korbonits M. AMPK as a mediator of hormonal signalling. J Mol Endocrinol 2010;44(2):87-97. 45. Liu Z, Long W, Fryburg DA, Barrett EJ. The regulation of body and skeletal muscle protein metabolism by hormones and amino acids.‘, J Nutr 2006;136(1 Suppl):212S-217S.

DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3

46. Luigi de Palma, Mario Marinelli MPAO. Ubiquitin ligases MuRF1 and MAFbx in humanskeletal muscle atrophy‘, Revue du Rhumatisme 2008;75:56-60. 47. Ma K, Mallidis C, Artaza J, Taylor W, Gonzalez-Cadavid N, Bhasin S. Characterization of 5‘-regulatory region of human myostatin gene: regulation by dexamethasone in vitro.‘, Am J Physiol Endocrinol Metab 2001;281(6):E1128-E1136. 48. Martin WH, Korte E, Tolley TK, Saffitz JE. Skeletal muscle beta-adrenoceptor distribution and responses to isoproterenol in hyperthyroidism.‘, Am J Physiol 1992;262(4 Pt 1):E504-E510. 49. Marzetti E, Hwang JCY, Lees HA, Wohlgemuth SE, Dupont-Versteegden EE, Carter CS, Bernabei R, Leeuwenburgh C. Mitochondrial death effectors: Relevance to sarcopenia and disuse muscle atrophy.‘, Biochim Biophys Acta 2010;1800(3):235-244. 50. McFarlane C, Plummer E, Thomas M, Hennebry A, Ashby M, Ling N, Smith H, Sharma M, Kambadur R. Myostatin induces cachexia by activating the ubiquitin proteolytic system through an NF-kappaB-independent, FoxO1-dependent mechanism. J Cell Physiol 2006;209(2):501-514. 51. Mehrotra R, Kopple JD. Nutritional management of maintenance dialysis patients: why aren‘t we doing better? Annu Rev Nutr 2001;21:343-379. 52. Mitch WE, Price SR. Mechanisms activating proteolysis to cause muscle atrophy in catabolic conditions. J Ren Nutr 2003; 13(2):149-152. 53. Mitchell CS, Savage DB, Dufour S, Schoenmakers N, Murgatroyd P, Befroy D, Halsall D, Northcott S, Raymond-Barker P, Curran S, Henning E, Keogh J, Owen P, Lazarus J, Rothman DL, Farooqi IS, Shulman GI, Chatterjee K, Petersen KF. Resistance to thyroid hormone is associated with raised energy expenditure, muscle mitochondrial uncoupling, and hyperphagia. J Clin Invest 2010;120(4):1345-1354. 54. Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T, Ohsumi Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell 2004;15(3):1101-1111. 55. Moeller LC, Cao X, Dumitrescu AM, Seo H, Refetoff S. Thyroid hormone mediated changes in gene expression can be initiated by cytosolic action of the thyroid hormone receptor beta through the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Nucl Recept Signal 2006;4:e020. 56. Mourkioti F, Kratsios P, Luedde T, Song YH, Delafontaine P, Adami R, Parente V, Bottinelli R, Pasparakis M, Rosenthal N. Targeted ablation of IKK2 improves skeletal muscle strength, maintains mass, and promotes regeneration. J Clin Invest 2006;116(11):2945-2954. 57. Murray AJ. Metabolic adaptation of skeletal muscle to high altitude hypoxia: how new technologies could resolve the controversies. Genome Med 2009;1(12):117. 58. Muscaritoli M, Anker SD, Argilés J, Aversa Z, Bauer JM, Biolo G, Boirie Y, Bosaeus I, Cederholm T, Costelli P, Fearon KC, Laviano A, Maggio M, Fanelli FR, Schneider SM, Schols A, Sieber CC. Consensus definition of sarcopenia, cachexia and pre-cachexia: Joint document elaborated by Special Interest Groups (SIG) „cachexia-anorexia in chronic wasting diseases“ and „nutrition in geriatrics“ Clin Nutr., 2010. 59. Pereira CT, Herndon DN. The pharmacologic modulation of the hypermetabolic response to burns. Adv Surg 2005;39:245-261. 60. Price SR. Increased transcription of ubiquitin-proteasome system components: molecular responses associated with muscle atrophy. Int J Biochem Cell Biol 2003;35(5):617-628.

155

metabolismus/výživa 61. Reid MB, Li YP. Tumor necrosis factor-alpha and muscle wasting: a cellular perspective. Respir Res 2001;2(5):269-272. 62. Sacheck JM, Ohtsuka A, McLary SC, Goldberg AL. IGF-I stimulates muscle growth by suppressing protein breakdown and expression of atrophy-related ubiquitin ligases, atrogin-1 and MuRF1. Am J Physiol Endocrinol Metab 2004; 287(4): E591-E601. 63. Salazar JJ, Michele DE, Brooks SV. Inhibition of calpain prevents muscle weakness and disruption of sarcomere structure during hindlimb suspension. J Appl Physiol 2010;108(1):120-127. 64. Sandri M. Signaling in muscle atrophy and hypertrophy.‘, Physiology (Bethesda) 2008;23:160-170. 65. Sandri M, Lin J, Handschin C, Yang W, Arany ZP, Lecker SH, Goldberg AL, Spiegelman BM. PGC-1alpha protects skeletal muscle from atrophy by suppressing FoxO3 action and atrophy-specific gene transcription. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103(44):1626016265. 66. Sandri M, Sandri C, Gilbert A, Skurk C, Calabria E, Picard A, Walsh K, Schiaffino S, Lecker SH, Goldberg AL. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy. Cell 2004;117(3):399-412. 67. Schakman O, Gilson H, Thissen JP. Mechanisms of glucocorticoid-induced myopathy. J Endocrinol 2008;197(1):1-10. 68. Schuelke M, Wagner KR, Stolz LE, Hübner C, Riebel T, Kömen W, Braun T, Tobin JF, Lee SJ. Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child.‘, N Engl J Med 2004;350(26):2682-2688. 69. Smith IJ, Lecker SH, Hasselgren PO. Calpain activity and muscle wasting in sepsis. Am J Physiol Endocrinol Metab 2008;295(4):E762-E771. 70. Southgate RJ, Neill B, Prelovsek O, El-Osta A, Kamei Y, Miura S, Ezaki O, McLoughlin TJ, Zhang W, Unterman TG, Febbraio MA. FOXO1 regulates the expression of 4E-BP1 and inhibits mTOR signaling in mammalian skeletal muscle. J Biol Chem 2007;282(29): 21176-21186. 71. Spurlock DM, McDaneld TG, McIntyre LM. Changes in skeletal muscle gene expression following clenbuterol administration. BMC Genomics 2006;7:320. 72. Späte U, Schulze PC. Proinflammatory cytokines and skeletal muscle. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2004;7(3):265-269. 73. Stevenson EJ, Giresi PG, Koncarevic A, Kandarian SC. Global analysis of gene expression patterns during disuse atrophy in rat skeletal muscle. J Physiol 2003;551(Pt 1):33-48. 74. Suzuki N, Motohashi N, Uezumi A, ichiro Fukada S, Yoshimura T, Itoyama Y, Aoki M, Miyagoe-Suzuki Y, Takeda S. NO production results in suspension-induced muscle atrophy through dislocation of neuronal NOS. J Clin Invest 2007;117(9):2468-2476.

156

75. Taillandier D, Combaret L, Pouch MN, Samuels SE, Béchet D, Attaix D. The role of ubiquitin-proteasome-dependent proteolysis in the remodelling of skeletal muscle. Proc Nutr Soc 2004; 63(2):357-361. 76. Thornell LE. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle.‘, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2011;14(1):22-27. 77. Tran H, Brunet A, Griffith EC, Greenberg ME. The many forks in FOXO‘s road. Sci STKE 2003;(172):RE5. 78. Valdivia HH. Take it to heart: myostatin inhibition, mighty mouse and the quest for a competitive edge. J Physiol 2009; 587(Pt 21):5005. 79. Venditti P, Meo SD. Thyroid hormone-induced oxidative stress. Cell Mol Life Sci 2006;63(4):414-434. 80. Ventadour S, Attaix D. Mechanisms of skeletal muscle atrophy.‘, Curr Opin Rheumatol 2006;18(6):631-635. 81. Vigan A, Ripamonti M, Palma SD, Capitanio D, Vasso M, Wait R, Lundby C, Cerretelli P, Gelfi C. Proteins modulation in human skeletal muscle in the early phase of adaptation to hypobaric hypoxia.‘, Proteomics 2008;8(22):4668-4679. 82. Wang H, Kubica N, Ellisen LW, Jefferson LS, Kimball SR. Dexamethasone represses signaling through the mammalian target of rapamycin in muscle cells by enhancing expression of REDD1. J Biol Chem 2006;281(51):39128-39134. 83. Williams AB, Decourten-Myers GM, Fischer JE, Luo G, Sun X, Hasselgren PO. Sepsis stimulates release of myofilaments in skeletal muscle by a calcium-dependent mechanism. FASEB J 1999; 13(11):1435-1443. 84. Wray CJ, Mammen JMV, Hershko DD, Hasselgren PO. Sepsis upregulates the gene expression of multiple ubiquitin ligases in skeletal muscle.‘, Int J Biochem Cell Biol 2003;35(5):698-705. 85. Yamazaki Y, Kamei Y, Sugita S, Akaike F, Kanai S, Miura S, Hirata Y, Troen BR, Kitamura T, Nishino I, Suganami T, Ezaki O, Ogawa Y. The cathepsin L gene is a direct target of FOXO1 in skeletal muscle. Biochem J 2010;427(1):171-178. 86. Zhang P, Chen X, Fan M. Signaling mechanisms involved in disuse muscle atrophy. Med Hypotheses 2007;69(2):310-321. 87. Zhao J, Brault JJ, Schild A, Goldberg AL. Coordinate activation of autophagy and the proteasome pathway by FoxO transcription factor. Autophagy 2008;4(3):378-380.

MUDr. Jan Gojda Centrum pro výzkum diabetu, metabolismu a výživy a 2. interní klinika 3. lékařské fakulty UK a FNKV Šrobárova 50 100 00 Praha 10 e-mail: [email protected]

DMEV • ROČNÍK 14 • 2011 • ČÍSLO 3