ÖBLÍTÉSRE SZÁNT GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK cikkely változásai:

ÖBLÍTÉSRE SZÁNT GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK cikkely változásai: 704. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:1116 A „Definíció” rész 2. bekezdésének utolsó mondata helyesen: „Az öblítésre szánt oldatokat rendszerint úgy állítják be, hogy a vérrel izotóniás készítményt nyerjenek.” 705. oldal Az „Előállítás” rész a következő bekezdéssel bővült: „A fejlesztés során igazolni kell, hogy a készítmény a névleges tartalomnak megfelelő mennyiségben kivehető a tartályból.” A „Vizsgálatok” rész „Kivehető tömeg vagy térfogat” pontja törlésre került.

2.4.22

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.6 - 1

01/2007:20422

2.4.22. ZSÍRSAVÖSSZETÉTEL GÁZKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA Az idegen olajok vizsgálatát gázkromatográfiásan végezzük (2.2.28), és ehhez a vizsgálandó olajban található zsírsavakat metil-észterekké alakítjuk. „A” MÓDSZER E módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, ciklopropil- vagy ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei találhatók, sem olyanokra, amelyek nagy arányban tartalmaznak nyolc szénatomnál rövidebb láncú zsírsavakat és olyanokra sem, amelyeknek savszáma nagyobb, mint 2,0. Vizsgálati oldat. Amennyiben a cikkely előírja, metilezés előtt megszárítjuk a vizsgálandó olajat. Ezután 1,0 g olajat visszafolyóhűtővel és gázbevezető csővel ellátott, 25 ml-es csiszolatos gömblombikba mérünk. 10 ml R vízmentes metanolt és R kálium-hidroxid R metanolos, 60 g/l töménységű oldatából 0,2 ml-t elegyítünk hozzá. Felszereljük a visszafolyóhűtőt, az elegyen mintegy 50 ml/perc sebességgel R nitrogént áramoltatunk, az oldatot összerázzuk, és forrásig melegítjük. Az oldat feltisztulásától számítva (ami kb. 10 percet vesz igénybe), a melegítést további 5 percig folytatjuk. Ezután az oldatot folyó vízzel lehűtjük, majd választótölcsérbe visszük. A lombikot 5 ml R heptánnal átmossuk és ezt a mosófolyadékot is a választótölcsérbe öntjük. A választótölcsérben lévő oldatot R nátrium-klorid 200 g/l töménységű oldatának 10 ml-ével erőteljesen összerázzuk. A fázisok elkülönülése után a szerves fázist R vízmentes nátrium-szulfátot tartalmazó edénykébe visszük át, és állás után megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). Ezen fejezetnek egyik – az egyedi cikkely által előírt – táblázata alapján 0,50 g kalibráló keveréket készítünk. (Amennyiben a cikkely nem ír elő speciális oldatot, a 2.4.22.-1. táblázat szerinti összetételt alkalmazzuk.) A keveréket R heptánnal 50,0 ml-re oldjuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml a) összehasonlító oldatot R heptánnal 10,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 0,50 g zsírsav-metilészter keveréket készítünk, melynek összetétele megfelel a vizsgálandó anyag cikkelyében feltüntetett zsírsav-

2.4.22


összetételnek. Az elegyet R heptánnal 50,0 ml-re oldjuk. A kereskedelemben kapható zsírsav-metilészter elegyek is felhasználhatók. Oszlop:

− anyaga: kvarcüveg, üveg vagy kvarc; − méretei: l = 10 – 30 m, Ø = 0,2 – 0,8 mm; − állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,1 – 0,5 μm) vagy egyéb, megfelelő állófázis. Vivőgáz: R gázkromatográfiás célra szánt hélium vagy R gázkromatográfiás célra szánt hidrogén. Áramlási sebesség: 1,3 ml/perc (ha az oszlop belső átmérője 0,32 mm). Mintaáram-elosztási arány: 1:100 vagy kisebb, az adott oszlop belső átmérőjéhez igazodva; pl. ha az oszlop belső átmérője 0,32 mm, akkor 1:50. Hőmérséklet:

− oszlop: izoterm körülmények között 160–200 °C; ezen belül az oszlop hosszához és típusához kell igazodni; ha például az oszlop hossza 30 m, bevonata pedig R makrogol 20 000, akkor a hőmérséklet 200 °C; ha lineáris hőmérséklet-programozásra van szükség, akkor a 30 m-es oszlop hőmérsékletét percenként 3 °C-kal 170 °C-ról 230 °C-ra emeljük;

− injektor: 250 °C; − detektor: 250 °C. Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 1 μl. Érzékenység: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs magassága érje el a regisztráló teljes skálaszélességének 50–70 %-át. Rendszeralkalmasság, ha a 2.4.22.-1. vagy a 2.4.22.-3. táblázat kalibráló elegyét használjuk:

2.4.22


− csúcsfelbontás: legalább 1,8, a metil-oleát és a metil-sztearát között az a) összehasonlító oldat kromatogramján;

− jel/zaj viszony: legalább 5, a metil-mirisztát csúcsra számolva a b) összehasonlító oldat kromatogramján;

− elméleti tányérszám: legalább 30 000, a metil-sztearát csúcsra számolva az a) összehasonlító oldat kromatogramján. Rendszeralkalmasság, ha a 2.4.22.-2. táblázat kalibráló elegyét használjuk:

− csúcsfelbontás: legalább 4,0, a metil-kaprilát és a metil-dekanoát között az a) összehasonlító oldat kromatogramján;

− jel/zaj viszony: legalább 5, a metil-kaproát csúcsra számolva a b) összehasonlító oldat kromatogramján;

− elméleti tányérszám: legalább 15 000, a metil-dekanoát csúcsra számolva az a) összehasonlító oldat kromatogramján. A KROMATOGRAMOK ÉRTÉKELÉSE A vizsgálati körülményeket úgy kell megválasztani, hogy ne keletkezhessenek elfedett csúcsok (egymástól kevéssé eltérő retenciós idejű összetevők, például linolénsav és arachinsav egyidejű jelenléte esetén). Kvalitatív értékelés. A csúcsokat a c) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk (akár izoterm vizsgálati körülményeket, akár lineáris hőmérsékleti programozást alkalmaztunk). Izoterm kromatografálás esetében a csúcsokat úgy is azonosíthatjuk, hogy az a) összehasonlító oldat kromatogramja, valamint a 2.4.22.-1., a 2.4.22.-2, ill. a 2.4.22.-3. táblázat adatatai alapján kalibrációs görbéket szerkesztünk. 2.4.22.-1. táblázat – Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.)

2.4.22

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.6 - 4 A keveréket alkotó kalibráló anyagok R metil-laurát R metil-mirisztát R metil-palmitát R metil-sztearát R metil-arachinát R metil-oleát

Összetétel (% m/m) 5 5 10 20 40 20

2.4.22.-2. táblázat – Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.) A keveréket alkotó kalibráló anyagok R metil-kaproát R metil-kaprilát R metil-dekanoát R metil-laurát R metil-mirisztát

Összetétel (% m/m) 10 10 20 20 40

2.4.22.-3. táblázat – Kalibráló keverék. (Kapilláris oszloppal és mintaadagolórendszerrel működtetett gázkromatográf alkalmazása esetén, ha a kvalitatív értékelést kalibráló görbék segítségével végezzük, célszerű a vizsgálandó keverék leghosszabb szénláncú összetevőjét hozzáadni a kalibráló keverékhez.) A keveréket alkotó kalibráló anyagok R metil-mirisztát R metil-palmitát R metil-sztearát R metil-arachinát R metil-oleát R metil-ejkozenoát

Összetétel (% m/m) 5 10 15 20 20 10

2.4.22

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.6 - 5 R metil-behenát R metil-lignocerát

10 10

Az a) összehasonlító oldat kromatogramján lemérjük valamennyi csúcs redukált retenciós idejét (t’R). A redukált retenciós idő nem az injektálás időpontjától, hanem az oldószer-csúcstól mért retenciós idő. Felvesszük a kalibrációs görbét: log( t’R) = f (szénlánchossz-egyenérték) Telítetlen savak log t’R értékei e görbének olyan pontjain helyezkednek el, amelyek nem egész számú „szénlánchossz-egyenértéknek” felelnek meg; a „szénlánchosszegyenérték” annak az elméleti telített szénláncnak a hossza, amelynek t’R értéke megegyezne az azonosítandó zsírsavéval. Például, a linolsav t’R értéke egy elméletileg 18,8 szénatomszámú, telített zsírsavéval egyezik meg. A vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő csúcsokat a kalibrációs görbe és a redukált retenciós idők felhasználásával azonosítjuk. A szénlánchosszegyenértékeket a 2.4.22-4. táblázat foglalja össze. 2.4.22.-4. táblázat. – Szénlánchossz-egyenértékek. (Ezen értékek, melyeket kalibrációs görbe alapján kell kiszámolni, példaként szerepelnek, és R makrogol 20 000-rel bevont oszlopra vonatkoznak.) Zsírsav Kapronsav Kaprilsav Kaprinsav Laurinsav Mirisztinsav Palmitinsav Palmitoleinsav Margarinsav Sztearinsav Olajsav Linolsav Gamma-linolénsav Alfa-linolénsav Arachinsav Ejkozénsav Arachidonsav Behensav Erukasav 12-Oxosztearinsav

Szénlánchossz-egyenérték 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 16,3 17,0 18,0 18,3 18,8 19,0 19,2 20,0 20,2 21,2 22,0 22,2 22,7

2.4.22

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.6 - 6 Ricinolsav 12-Hidroxisztearinsav Lignocerinsav Nervonsav

23,9 23,9 24,0 24,2

Kvantitatív értékelés. Általában a normalizációs eljárást alkalmazzuk, melynek során a kromatogramon megjelenő csúcsok területösszegét – az oldószercsúcsok területét figyelmen kívül hagyva – 100%-nak tekintjük. Egy-egy összetevő mennyiségét úgy számítjuk ki, hogy meghatározzuk az illető csúcs területének a csúcsok területösszegéhez viszonyított százalékos arányát. Azokat a csúcsokat, amelyeknek területe kisebb, mint a csúcsok területösszegének 0,05%-a, nem vesszük figyelembe. Az egyedi cikkely esetenként, például tizenkét szénatomos vagy ennél rövidebb láncú zsírsavak jelenléte esetén, átszámítási faktorokat ad meg a csúcsterületek átszámításához m/m százalékra. „B” MÓDSZER Ez a módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, ciklopropil- vagy ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei találhatók és olyan olajokra sem, amelyeknek savszáma nagyobb, mint 2,0. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,100 g-ját csavaros kupakkal ellátott, 10 ml-es centrifugacsőbe mérjük, 1 ml R heptán és 1 ml R dimetil-karbonát segítségével oldjuk és enyhe melegítés (50–60 °C) közben erőteljesen keverjük. Ezután hozzáadjuk R nátrium R vízmentes metanolos, a szükséges óvintézkedések figyelembevételével készített, még meleg, 12 g/l-es oldatának 1 ml-ét. Az elegyet kb. 5 percig erőteljesen keverjük. Ezután 3 ml R desztillált vizet adunk hozzá, és kb. 30 másodperces, erőteljesen keverés után 1500 g-vel 15 percig centrifugáljuk. A szerves fázisból 1 μl-t injektálunk. Összehasonlító oldatok és a kromatogramok értékelése. Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz speciális előírást, a továbbiakban az „A” módszerben előírtak szerint járunk el. Oszlop:

− anyaga: kvarcüveg; − méretei: l = 0,30 m, Ø = 0,25 mm;

2.4.22


− állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,25 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium. Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc. Mintaáram-elosztási arány: 1:100. Hőmérséklet:

Oszlop Injektor Detektor

Idő (perc)

Hőmérséklet (°C)

0 – 15 15 – 36 36 – 61

100 100 → 225 225 250 250

Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 1 μl. „C” MÓDSZER Ez a módszer nem alkalmazható olyan olajokra, amelyekben epoxi-, hidroepoxi-, hidroperoxi-, aldehid-, keton-, ciklopropil- és ciklopropenil-csoportot tartalmazó zsírsavak gliceridjei, továbbá konjugált, többszörösen telítetlen és acetilén-kötést tartalmazó vegyületek találhatók, mivel ezen csoportok részben vagy teljesen elbomlanak. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,10 g-ját 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban R nátrium-hidroxid R metanollal készült, 20 g/l töménységű oldatának 2 ml-ében oldjuk, és az oldatot visszafolyóhűtő alkalmazásával 30 percig forraljuk. Ezután a hűtőn keresztül 2,0 ml R metanolos bór-trifluorid–oldatot juttatunk hozzá, és 30 percig forraljuk, majd – ismét a hűtőn keresztül – 4 ml R heptánt juttatunk hozzá, és 5 percig forraljuk. Lehűtés után 10,0 ml R telített nátrium-klorid–oldattal kb. 15 másodpercig rázzuk, majd még annyi R telített nátrium-klorid–oldatot adunk hozzá, hogy a felső fázis a lombik nyakába kerüljön. A felső fázis 2 ml-ét kivesszük, 3×2 ml R vízzel mossuk, és R vízmentes nátrium-szulfáttal megszárítjuk.

2.4.22


Összehasonlító oldatok, kromatográfiás vizsgálat és a kromatogramok értékelése. Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz speciális előírást, a továbbiakban az „A” módszerben előírtak szerint járunk el.

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata

Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. – 1

01/2007:20612

2.6.12. NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: ÖSSZES ÉLETKÉPES AEROB MIKROORGANIZMUSSZÁM Ez az általános fejezet két vizsgálatcsoportot foglal magában. Az 1. csoport a cikkelyeknek való megfelelés megállapítására szolgáló referenciamódszereket tartalmaz. Ezért amennyiben egy cikkely jelen fejezetre hivatkozik, úgy a hivatkozás az 1. csoport követelményeinek való megfelelésre vonatkozik, hacsak a 2. csoport vizsgálatait nem engedélyezték. A 2. csoportban közölt vizsgálatok szintén az Európai Gyógyszerkönyv részét képezik, tehát ilyen értelemben lehet rájuk hivatkozni, különösen forgalomba hozatali engedéllyel kapcsolatos eljárás esetén. A tervek szerint az érintett cikkelyek felülvizsgálata során az 1. csoport vizsgálatai helyébe a 2. csoport vizsgálatai lépnek. A 2. csoport vizsgálati módszereit a Japán Gyógyszerkönyvvel és az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvével (USP) együttműködésben fejlesztették ki, a követelményrendszer harmonizálása céljából. A.. AZ EURÓPAI GYÓGYSZERKÖNYV MÓDSZERE Az itt ismertetett vizsgálatok aerob körülmények között szaporodó mezofil baktériumok, valamint gombák számának meghatározására szolgálnak. A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy adott – a Gyógyszerkönyvben hivatalos – termékrõl megállapítható legyen, megfelel-e azoknak a mikrobiológiai követelményeknek, amelyeket a vonatkozó cikkely előír. Amennyiben vizsgálatainkkal ezt kívánjuk megállapítani, az alábbi útmutatások szerint járunk el, beleértve a mintavételek számát és az eredmények értékelését is. Ugyanezeket a vizsgálatokat alkalmazhatjuk A mikrobiológiai tartósítás hatékonyságának vizsgálatára (5.1.3), továbbá a kiindulási anyagok minőségellenőrzésére, valamint a mikrobiológiai tisztaságra megadott irányelvekkel összefüggésben is (5.1.4). Amennyiben a vizsgálat ilyen célokat szolgál, pl. a gyártó ellenőrizni kívánja a kiindulási anyagokat és/vagy a késztermékeket, vagy eljárásvalidálást végez, a vizsgálatok menete – beleértve a vizsgálandó minták számát, valamint az eredmények értékelését – a gyártó és az illetékes hatóságok közötti megegyezés tárgyát képezi. A meghatározást olyan körülmények között végezzük, hogy a vizsgálandó termék véletlen szennyeződését kizárjuk. A szennyeződés elkerülésére tett



elővigyázatossági intézkedések csak olyanok lehetnek, amelyek nem hatnak a kimutatandó mikroorganizmusokra. Amennyiben a vizsgálandó termék antimikrobás hatással rendelkezik, azt megfelelő módon semlegesíteni kell. Ha erre a célra inaktiváló szereket használunk, ezek hatékonyságát és azt, hogy a mikroorganizmusokkal szemben nem toxikusak, bizonyítani kell. Az összes életképes aerob mikroorganizmusszámot membránszűréssel vagy lemezen számlálással határozzuk meg, aszerint, hogy a vonatkozó cikkely melyik módszert írja elő. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN = Most Probable Number) módszert csak olyan esetekben alkalmazzuk, amikor más módszer nem használható. A módszer megválasztásakor pl. a termék sajátosságait és a várható mikroorganizmusszámot vehetjük alapul. A választott módszert megfelelően validálni kell. Amennyiben a vizsgálatot az 5.1.3. vagy az 5.1.4. fejezetben előírtakhoz kapcsolódva végezzük, akkor a lemezöntés, a felületi szélesztés és a membránszűrés módszereit alkalmazhatjuk. A MINTA ELÕKÉSZÍTÉSE Mintavételi terv. A mintavételt pontosan meghatározott terv szerint kell végezni. A mintavételi tervet olyan tényezők figyelembevételével kell kialakítani, mint pl. a gyártási tétel nagysága vagy az elfogadhatatlan mértékben szennyezett termékek felhasználásával járó egészségügyi kockázat, továbbá a termék sajátosságai, valamint a szennyezettség várható mértéke. Ha más előírás nincs, a fentiekben említett elővigyázatossági szempontokat figyelembevéve 10 g-os vagy 10 ml-es mintá(ka)t veszünk a vizsgálandó anyagból vagy készítményből. A mintá(ka)t véletlenszerűen választjuk az ömlesztett anyagból vagy a készítmény tartályaiból. Amennyiben szükséges – a vizsgálandó anyag vagy termék sajátosságaitól függően – a mintákhoz előírt anyagmennyiség biztosításához több tartály tartalmát kell homogenizálni. Mikrobiológiailag inhomogén termékek esetében például a háromfokozatú mintavételi terv alkalmazható. Ebben az esetben minden gyártási tételből öt mintát veszünk, és ezeket külön-külön vizsgáljuk. A három fokozat a következõ: (i.) elfogadható minták; ezekben a telepképző egységek száma (CFU = Colony Forming Units) grammonként, illetve milliliterenként kisebb, mint m, ahol m a megfelelő cikkelyben megadott határérték,


(ii.)


az elfogadhatóság határán lévő minták; ezekben a telepképző egységek száma grammonként, illetve milliliterenként nagyobb, mint m, de kisebb, mint 10m,

(iii.) nem elfogadható minták; ezekben a telepképző egységek grammonként, illetve milliliterenként nagyobb, mint 10m.

száma

Vízben oldódó termékek. A vizsgálandó termék 10 g-ját (vagy 10 ml-ét) nátriumklorid–pepton–tompítóoldatban (pH 7,0) vagy más alkalmas folyadékban oldjuk, illetve hígítjuk. Általában tízszeres hígítást készítünk, de ha a termék sajátosságai vagy az érzékenységre vonatkozó követelmények szükségessé teszik, más hígítási arányokat is alkalmazhatunk. Ha olyan terméket vizsgálunk, amelynek antimikrobás hatása ismert, inaktiváló szert adhatunk a hígító folyadékhoz. Ha szükséges, az oldat pH-értékét kb. 7-re állítjuk és a hígító folyadékkal további tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Vízben nem oldódó, nem zsírnemű termékek. A vizsgálandó termék 10 g-ját (vagy 10 ml-ét) nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatban (pH 7,0) vagy más alkalmas folyadékban szuszpendáljuk. Általában tízszeres hígítást készítünk, de a termék sajátosságaitól függően nagyobb hígításra is szükség lehet. Rosszul nedvesedő anyagok szuszpendálását megfelelő felületaktív anyag – pl. literenként 1 g poliszorbát 80 – hozzáadásával segíthetjük elő. Ha olyan terméket vizsgálunk, amely antimikrobás hatású, inaktiváló szert adhatunk a hígító folyadékhoz. Ha szükséges, az oldat pH-értékét kb. 7-re állítjuk és ugyanazon hígító folyadékkal további tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Zsírnemű termékek. A vizsgálandó termék 10 g-ját (vagy 10 ml-ét) legfeljebb fele mennyiségű, steril poliszorbát 80-nal vagy más megfelelő steril felületaktív anyaggal szükség esetén legfeljebb 40 °C-ra, illetve kivételes esetekben maximum 45 °C-ra melegítve homogenizáljuk. A homogenizálást óvatos keveréssel végezzük és ha szükséges, a kívánt hőmérsékletet – vízfürdőben vagy termosztátban – biztosítjuk. Ezután annyi előmelegített nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatot (pH 7,0) adunk a keverékhez, amennyi – az eredeti termékre vonatkoztatott – tízszeres hígításhoz szükséges. A keverést – változatlan hőmérsékleten – az emulzióképződéshez szükséges legrövidebb ideig, de legfeljebb 30 percig óvatosan folytatjuk. Megfelelő mennyiségű, steril poliszorbát 80-at vagy más steril felületaktív anyagot tartalmazó nátrium-klorid–pepton–tompítóoldattal (pH 7,0) további tízszeres hígításokból álló sorozatot készíthetünk. Transzdermális tapaszok. Tíz tapaszról steril csipesz segítségével eltávolítjuk a védőréteget, majd öntapadó oldalukkal felfelé, steril üveg- vagy műanyaglapokra



helyezzük. Az öntapadó felületet, ha szükséges, steril gézzel (vagy szövött-szűrő típusú, egyszálas műanyaghálóval) befedjük, és a tíz tapaszt legalább 500 ml, megfelelő inaktivátorokat, pl. poliszorbát 80-at és/vagy lecitint tartalmazó nátriumklorid–pepton–tompítóoldatba (pH 7,0) helyezzük. Az oldatot a tapaszokkal legalább 30 percig erõteljesen rázatjuk („A” kivonat). További tíz, ugyanilyen módon elõkészített tapaszt legalább 500 ml „D” folyékony táptalajba helyezünk és a táptalajt a tapaszokkal legalább 30 percig erõteljesen rázatjuk („B” kivonat). A MINTA VIZSGÁLATA Membránszűrés. Olyan membránszűrőket használunk, amelyeknek névleges pórusmérete legfeljebb 0,45 μm és baktérium-visszatartó képességük bizonyított. A szűrő anyagát úgy választjuk meg, hogy baktérium-visszatartó képességét a vizsgálandó minta összetevői ne befolyásolják. Például vizes, olajos és híg alkoholos oldatokhoz cellulóz-nitrát szűrőket, tömény alkoholos oldatokhoz cellulóz-acetát szűrőket használhatunk. A szűrőberendezés kialakítása olyan legyen, hogy a szűrőt áthelyezhessük a táptalajba. „A minta előkészítése” c. részben előírtak szerint előkészített mintából mindkét membránszűrőre megfelelő mennyiséget viszünk fel (1–1 g terméknek megfelelõ mennyiség javasolt, vagy ha nagy telepszám várható, akkor ennél kevesebb) és haladéktalanul megszűrjük. A szűrőket alkalmas folyadék, pl. nátrium-klorid– pepton–tompítóoldat (pH 7,0) kb. 100 ml-es részleteivel háromszor átmossuk. Ehhez a folyadékhoz felületaktív anyagokat, pl. poliszorbát 80-at vagy antimikrobás szereket inaktiváló anyagokat is adhatunk. Háromnál kevesebb mosás is megengedett akkor, ha ezt validálással alátámasztjuk. Azt a membránszűrőt, amelyet elsősorban baktériumok számlálására szánunk, megfelelő agar-táptalaj (pl. „B” táptalaj) felületére, azt pedig, amelyet elsősorban gombák számlálására szánunk, ennek megfelelő agar-táptalaj (pl. „C” táptalaj) felületére helyezzük. A „B” agar-táptalaj lemezt 30–35°C-on, a „C” agar- táptalaj lemezt 20–25 °C-on inkubáljuk 5 napon át, hacsak ennél rövidebb időn belül nem kapunk megbízható mikroorganizmusszámot. Ezután kiválogatjuk azokat a lemezeket, amelyeken a legnagyobb, de 100-nál kisebb a telepszám, és kiszámoljuk a termék 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkoztatott telepképző egységek számát. Transzdermális tapaszok vizsgálatához két steril membránszűrőn külön-külön leszűrünk 50 ml A kivonatot. Az egyik membránt az összes aerob baktérium szám meghatározására „B”, a másik membránt a gombák számlálására „C” agartáptalajra helyezzük.



A lemezen számlálás módszerei a. Lemezöntéses módszer. „A minta előkészítése” c. részben leírtak szerint előkészített mintából 1–1 ml-t 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe mérünk és mindegyikhez 15–20 ml baktériumtenyésztésre alkalmas felolvasztott agar-táptalajt (pl. „B” táptalajt) vagy 15–20 ml gombatenyésztésre alkalmas felolvasztott agartáptalajt (pl. „C” táptalajt) öntünk; a táptalajok hőmérséklete legfeljebb 45 °C lehet. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agar-táptalaj mennyiségét ezzel arányosan növeljük. Táptalajonként legalább két Petri-csészével dolgozunk minden hígítási fokozatban. A lemezeket 30–35°C-on (gombák esetében 20–25 °C-on) inkubáljuk 5 napon át, hacsak ennél rövidebb időn belül nem kapunk megbízható mikroorganizmusszámot. Ezután kiválasztjuk az azon hígításhoz tartozó lemezeket, amelyeken a telepszám a legnagyobb, de még nem éri el a 300-at (gombák esetében a 100-at). A telepszámok számtani átlagából kiszámoljuk a készítmény 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkoztatott telepképző egységek számát. b. Felületi szélesztéses módszer. 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe 15–20 ml baktériumtenyésztésre alkalmas felolvasztott agar-táptalajt (pl. „B” táptalajt) vagy 15–20 ml gombatenyésztésre alkalmas felolvasztott agar-táptalajt (pl. „C” táptalajt) öntünk, majd a táptalajokat hagyjuk megszilárdulni. A felolvasztott táptalajok hőmérséklete kb. 45 °C legyen. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agartáptalaj térfogatát ezzel arányosan növeljük. A lemezeket – pl. lamináris áramlást biztosító fülkében vagy inkubátorban – megszárítjuk. „A minta előkészítése” c. részben leírtak szerint előkészített minta mért – legalább 0,1 ml – térfogatát szélesztjük a táptalaj felületén. Táptalajonként legalább két Petri-csészével dolgozunk minden hígítási fokozatban. Az inkubálást és a telepképző egységek számának meghatározását a lemezöntéses módszernél leírt módon végezzük. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszere A legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer torzításmentessége és pontossága kisebb, mint a membránszűréses vagy a lemezen számlálásos módszeré. Az eredmények, különösen penészgombákra, nem eléggé megbízhatóak. Ezért az MPN-módszert csak baktériumszámlálásra alkalmazzuk, olyan esetekben, amikor más módszer nem alkalmazható. Ha a módszer használata indokolt, az alábbiak szerint járunk el. 2.6.12.-1. táblázat – A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (Most-probablenumber – MPN) Minden hígításhoz 3 kémcső

2.6.12. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Pozitív kémcsövek száma

Besorolás*

MPN/g

0,1 g

0,01 g

0,001 g

0

0

0

<3

0

1

0

3

1

0

0

3

1

0

1

7

1

1

0

7

1

2

0

11

2

0

0

9

2

0

1

14

2

1

0

15

2

1

1

20

2

2

0

21

3

0

0

3

0

3


1

95%-os konfidenciahatárok 2 –

–

<1

17

1

21

2

27

2

28

4

35

2

38

5

48

5

50

8

61

x

8

63

23

x

7

129

1

38

x

10

180

1

0

43

x

20

210

3

1

1

75

x

20

280

3

2

0

93

x

30

390

3

2

1

150

x

50

510

3

2

2

210

80

640

3

3

0

240

x

100

1400

3

3

1

460

x

200

2400

3

3

2

1100

x

300

4800

3

3

3

>1100

–

–

x x x x x x x x x

x

*

1. kategória: normálisnak tekinthető (elfogadható)eredmények; az esetek 95%-ában fordulnak elő

2. kategória: kevésbé valószínű (kevésbé elfogadható) eredmények; mindössze az esetk 4%-ában fordulnak elő. Fontos döntéseknél nem használhatók! A 2. kategóriánál kevésbé valószínű eredmények a táblázatban nem szerepelnek és soha nem tekinthetők elfogadhatónak.

A termékből „A minta előkészítése” c. részben előírtak szerint legalább háromtagú, egymást követő tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Mindegyik hígítási fokozatból három 1 g-os (vagy 1 ml-es) részlettel beoltunk három kémcsövet,



amelyek 9–10 ml-t tartalmaznak a megfelelő folyékony táptalajból (pl. „A” folyékony táptalajból). Szükség esetén felületaktív anyagot, pl. poliszorbát 80-at vagy antimikrobás szereket inaktiváló anyagokat is adhatunk a táptalajhoz. Tehát, ha három hígítási fokozatból álló sorozatot állítottunk elő, akkor kilenc kémcsövet oltunk be. A kémcsöveket 5 napon át 30–35°C-on inkubáljuk. Feljegyezzük, hogy hígítási fokozatonként hány kémcsőben észlelhető mikroorganizmus-növekedés. Amennyiben az eredmények – a vizsgálandó termék sajátosságai miatt – nehezen vagy bizonytalanul értékelhetők, ugyanazon táptalajba vagy megfelelő agartáptalajra (pl. „B” agar-táptalajra) átoltásokat végzünk. Az ennek során beoltott táptalajokat 18–24 órán át, az előbbivel azonos hőmérsékleten inkubáljuk. Az így nyert eredményeket vesszük figyelembe. A vizsgálandó készítmény 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkozó legvalószínűbb baktériumszámot a 2.6.12.-1. táblázat alapján határozzuk meg. A TÁPTALAJOK HATÉKONYSÁGA ÉS A MIKROORGANIZMUSSZÁMLÁLÁS MÓDSZEREINEK ÉRVÉNYESSÉGE A baktérium-referenciatörzseket külön-külön, megfelelő folyékony táptalajt (pl. „A” folyékony táptalajt) tartalmazó tartályokban, 18–24 órán át, 30–35 °C-on inkubáljuk. A gomba-referenciatörzseket szintén külön-külön, megfelelõ agartáptalajban (pl. antibiotikumokat nem tartalmazó „C” táptalajban) 20–25 °C-on inkubáljuk, Candida albicans esetében 48 órán át, Aspergillus niger esetében pedig 7 napon át. Staphylococcus aureus

pl. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83)

Escherichia coli

pl. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126)

Bacillus subtilis

pl. ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62)

Candida albicans

pl. ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72)

Aspergillus niger

pl. ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83)

Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) felhasználásával milliliterenként kb. 100 telepképző egységet (CFU) tartalmazó referenciaszuszpenziókat készítünk. A számlálási módszerek ellenőrzéséhez minden mikroorganizmus referenciaszuszpenzióját külön-külön használjuk, a vizsgálandó termék jelenlétében és távollétében is. Ha a membránszűréses vagy a lemezen számlálásos módszert ellenőrizzük, a referencia-mikroorganizmus számlálásának eredménye és az inokulumból számított érték – bármelyik mikroorganizmusról is legyen szó – legfeljebb ötös faktorral térhet el egymástól. Ha a legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszerét ellenőrizzük, az inokulumból számított értéknek az eredmények 95%-os konfidencia-határain belül kell lennie. Ha a táptalaj és a hígító



folyadék sterilitását, valamint az eljárás aszeptikus kivitelezését ellenőrizzük, vizsgálandó készítményként steril nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatot (pH 7,0) alkalmazunk; ez esetben mikroorganizmus-növekedés nem mutatkozhat. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE Baktériumszámnak nevezzük a „B” agar-táptalajon talált telepképző egységek átlagos számát. Gombaszámnak nevezzük a „C” agar-táptalajon megjelenő telepképző egységek átlagos számát. Az összes életképes mikroorganizmus szám az így definiált baktériumszám és gombaszám összege. Ha kiderül, hogy a két táptalajon elszaporodott mikroorganizmusok típusa azonos, ezt figyelembe vehetjük. Ha a legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszerét alkalmazzuk, a számított érték a baktériumszám lesz. Ha a vonatkozó cikkely határértéket ír elő, azt a következőképpen kell értelmezni: – 102 mikroorganizmus: az elfogadhatóság felső határa: 5×102, – 103 mikroorganizmus: az elfogadhatóság felső határa: 5×103, és így tovább. Ha például háromfokozatú mintavételi tervet alkalmazunk, a következőképpen járunk el: Mind az öt mintára külön-külön kiszámoljuk az összes életképes mikroorganizmus számot. Az anyag vagy készítmény a következõ feltételek teljesülése esetén megfelel a vizsgálatnak: (i.) az összes életképes aerob mikroorganizmus szám egyik mintában sem haladja meg az előírt határérték tízszeresét (azaz nem lehetnek köztük „nem elfogadható minták”), és (ii.) az összes életképes aerob mikroorganizmus szám legfeljebb két mintában esik az előírt határérték és annak tízszerese közé (azaz legfeljebb két, elfogadhatóság határán lévõ minta fordulhat elő köztük). Az ajánlott oldatok és táptalajok leírását a 2.6.13. általános fejezet tartalmazza. B. A HARMONIZÁLT MÓDSZER: NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: A MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁT MEGHATÁROZÓ VIZSGÁLATOK



1. BEVEZETÉS Az itt ismertetett vizsgálatok aerob körülmények között szaporodó mezofil baktériumok és gombák számának meghatározására szolgálnak. A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy egy adott anyagról vagy termékről megállapítható legyen: megfelel-e a mikrobiológiai minőségre megállapított követelménynek. Amennyiben a vizsgálatokat ebből a célból végezzük, az alábbi útmutatások szerint járjunk el, figyelembe véve a minták számát is, és az eredményeket a következők szerint értlemezzük. A módszerek nem alkalmazhatók életképes mikroorganizmusokat hatóanyagként tartalmazó termékekre. Más mikrobiológiai eljárások, beleértve az automatizált módszereket, is használhatók, amennyiben igazolták, hogy egyenértékűek a Gyógyszerkönyvben leírt módszerrel. 2. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁSOK A meghatározás körülményeit úgy kell kialakítani, hogy a vizsgálandó termék külső eredetű mikrobiológiai szennyeződését elkerüljük. Az óvintézkedések megtételekor ugyanakkor ügyelni kell arra, hogy azok a vizsgálat során kimutatandó mikroorganizmusokra ne legyenek kihatással. A termék esetleges antimikrobás hatását – adott esetben – amennyire lehetséges meg kell szüntetni vagy semlegesíteni kell. Ha erre a célra inaktiválószereket használunk, igazolni kell azok hatékonyságát, továbbá azt, hogy a mikroorganizmusokra nem toxikusak. Amennyiben a mintaelőkészítés során felületaktív anyagokat használunk, igazolni kell, hogy a mikroorganizmusokra nem toxikusak, továbbá hogy az inaktiválószerekkel nem összeférhetetlenek. 3. A MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁT MEGHATÁROZÓ MÓDSZEREK Az előírás alapján a membránszűrés vagy a lemezen számlálás módszerét használjuk. Noha a legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer a legkevésbé pontos



a mikroorganizmusok számának megállapítására, egyes csekély mikrobiológiai szennyezettségű termékcsoportok esetében a legalkalmasabb módszer lehet. A módszer kiválasztása például olyan tényezőktől függ, mint a termék sajátosságai és a mikroorganizmusszámra előírt határérték. A kiválasztott módszernek olyannak kell lennie, amely lehetővé teszi megfelelő nagyságú minta vizsgálatát az előírt követelményeknek való megfelelés megállapításához. A választott módszer alkalmasságát bizonyítani kell. 4. A MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉS ELŐSEGÍTÉSÉNEK VIZSGÁLATA ÉS A SZÁMLÁLÓMÓDSZER ALKALMASSÁGA 4-1. ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK Meg kell állapítani, hogy a vizsgálat alkalmas-e mikroorganizmusok kimutatására a vizsgálandó termék jelenlétében. A módszer alkalmasságát újból igazolni kell, ha a módszerben vagy a termékben olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. 4-2. REFERENCIATÖRZSEK KÉSZÍTÉSE A referenciatörzsek stabilizált szuszpenzióit használjuk, illetve az alábbiak szerint referenciatörzseket készítünk. Oltócsíra-tenyészetet fenntartó módszereket (oltócsírarendszerek) alkalmazunk, oly módon, hogy a beoltáshoz használt életképes mikroorganizmusok az oltócsíra-törzstételhez képest legfeljebb 5 átoltásból származzanak. Az egyes baktérium- és gomba-referenciatörzseket külön-külön, a 2.6.12.-2. táblázatban leírtak szerint tenyésztjük. A referencia szuszpenziók készítéséhez nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatot (pH 7,0) vagy foszfát–tompítóoldatot (pH 7,2) használunk. Az A. niger spórák szuszpendálásakor a tompítóoldathoz 0,05% poliszorbát 80 adható. A szuszpenziókat 2 órán belül, illetve ha 2–8 °C-on tároltuk 24 órán belül felhasználjuk. A vizsgálat során beoltásra – az A. niger vagy B. subtilis vegetatív sejtjeiből készített és hígított friss szuszpenzió alternatívájaként – megfelelő térfogatú stabil spóraszuszpenzió is használható. A stabil szuszpenzió 2–8 °C-on megfelelően igazolt időtartamig eltartható.



2.6.12.-2. táblázat – A referencia-mikroorganizmusok előkészítése és használata Mikroorganizmus-növekedés elősegítése Mikroorganizmus

A referencia-törzs készítése

Staphylococcus aureus pl. ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP 4.83 NBRC 13276

Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 30–35 °C 18–24 óra

Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj ≤100 CFU 30–35 °C ≤ 3 nap

Pseudomonas aeruginosa pl. ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC 13275

Szója-kazein-agar vagy szója-kazein folyékony táptalaj 30–35 °C 18–24 óra


Bacillus subtilis pl. ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC 3134

Szója-kazein-agar vagyszója-kazein folyékony táptalaj 30–35 °C 18–24 óra

Candida albicans pl. ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48.72 NBRC 1594 Aspergillus niger pl. ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455

Teljes aerob mikroorganizmussz ám

Teljes élesztő- és penészgombaszám

A számlálómódszer alkalmassága a termék jelenlétében Teljes aerob Teljes élesztő- és mikroorganizmussz penészgombaszám ám

–

Szója-kazeinagar/MPN szójakazein foly. táptalaj ≤100 CFU 30–35 °C ≤ 3 nap

–

–


–


–


–

Sabouraud-glükóz-agar vagySabouraud-glükóz folyékony táptalaj 20–25 °C 2–3 nap

Szója-kazein-agar táptalaj ≤100 CFU 30–35 °C ≤ 5 nap

Sabouraud-glükózagar ≤100 CFU 20–25 °C ≤ 5 nap

Szója-kazein-agar táptalaj ≤100 CFU 30–35 °C ≤ 5 nap MPN: nem alkalmas


Sabouraud-glükóz-agar vagyburgonya-glükóz-agar 20–25 °C 5–7 nap vagy megfelelő spóraképződésig

Szója-kazein-agar táptalaj ≤100 CFU 30 – 35 °C ≤ 5 nap


Szója-kazein-agar táptalaj ≤100 CFU 30–35 °C ≤ 5 nap MPN: nem alkalmas




4-3. NEGATÍV KONTROLL A vizsgálati körülmények ellenőrzésére negatív kontroll vizsgálatot végzünk, melynek során a vizsgálandó készítmény helyett a választott hígítófolyadékot alkalmazzuk. Ebben mikroorganizmus-növekedés nem következhet be. 4-4. A TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ HATÁSA A kész táptalajok, valamint a szárított táptalajból vagy az összetevőiből készített táptalajok minden gyártási tételét vizsgáljuk. Szója-kazein folyékony táptalaj vagy szója-kazein-agar táptalaj adagokat/lemezeket a 2.6.12-2. táblázatban feltüntett mikroorganizmusok kis mennyiségével (legfeljebb 100 CFU) beoltunk. Minden mikroorganizmus esetében külön táptalajrészletet (adagot/lemezt) használunk. Sabouraud-glükóz-agar táptalaj-lemezeket a 2.6.12-2. táblázatban feltüntett mikroorganizmusok kis mennyiségével (legfeljebb 100 CFU) beoltunk. Minden mikroorganizmus esetében külön táptalaj-lemezt használunk. Az inkubálást a 2.6.12.-2. táblázatban megadott körülmények között végezzük. Szilárd táptalajok esetén a növekedés nem térhet el a kétszeresnél nagyobb mértékben a standardizált inokulumra számított értéktől. Frissen készített inokulum esetén a mikroorganizmus-szaporodás hasonló mértékű a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételével. Folyékony táptalaj akkor alkalmazható, ha a mikroorganizmus-növekedés hasonló mértékű a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételével. 4-5. A MIKROORGANIZMUSSZÁMLÁLÁS MÓDSZERÉNEK MEGFELELŐSÉGE A TERMÉK JELENLÉTÉBEN 4-5-1. Mintaelőkészítés. A minta előkészítésének módszere a vizsgálandó termék fizikai sajátságaitól függ. Amennyiben az alábbi eljárások egyike sem bizonyul megfelelőnek, úgy más eljárást kell kifejleszteni. Vízben oldódó termékek. A vizsgálandó terméket nátrium-klorid–pepton– tompítóoldatban (pH 7,0), foszfát–tompítóoldatban (pH 7,2) vagy szója-kazein folyékony táptalajban oldjuk vagy hígítjuk (általában tízszeres hígítást készítünk). Szükség esetén a pH-t 6–8 értékre állítjuk be. Szükség esetén ugyanazon hígítószerrel további hígításokat készítünk.



Vízben nem oldódó, nem zsírnemű termékek. A vizsgálandó terméket (általában tízszeres hígítást készítünk) nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatban (pH 7,0), foszfát–tompítóoldatban (pH 7,2) vagy szója-kazein folyékony táptalajban szuszpendáljuk. Rosszul nedvesedő anyagok szuszpendálását megfelelő felületaktív anyag – pl. literenként 1 g poliszorbát 80 – hozzáadásával segíthetjük elő. Szükség esetén a pH-t 6–8 értékre állítjuk be. Szükség esetén ugyanazon hígítószerrel további hígításokat készítünk. Zsírnemű termékek. A vizsgálandó terméket szűréssel sterilezett izopropilmirisztátban oldjuk, vagy steril poliszorbát 80 vagy más megfelelő steril felületaktív anyag legkisebb szükséges mennyiségével elegyítjük. Az elegyet szükség esetén legfeljebb 40 °C-ra, illetve kivételes esetekben maximum 45 °C-ra melegítve homogenizáljuk. A homogenizálást óvatos keveréssel végezzük, és ha szükséges, a kívánt hőmérsékletet vízfürdő alkalmazásával tartjuk fenn. Ezután az előmelegített hígítószerből annyit adunk a keverékhez, hogy az eredeti termékre vonatkoztatva tízszeres hígítást kapjunk. A keverést változatlan hőmérsékleten, az emulzióképződéshez szükséges legrövidebb ideig óvatosan folytatjuk. Megfelelő mennyiségű steril poliszorbát 80-at vagy más steril felületaktív anyagot tartalmazó hígítószerrel további tízszeres hígításokból álló sorozatot készíthetünk. Folyékony vagy szilárd aeroszolok. A további mintavételhez a terméket aszeptikus körülmények között membránszűrős készülékbe vagy steril tartályba visszük át. A tartályokból vagy a teljes tartalmat, vagy meghatározott számú, pontosan mért adagot használnuk fel. Transzdermális tapaszok. Tíz tapaszról steril csipesz segítségével eltávolítjuk a védőréteget, majd öntapadó oldalukkal felfelé, steril üveg- vagy műanyaglapokra helyezzük. Az öntapadó felületet steril porózus anyaggal, pl. steril gézzel befedjük, hogy elkerüljük a tapaszok összetapadását, és a tíz tapaszt a megfelelő mennyiségű kiválasztott hígítószerbe helyezzük. A hígító folyadék megfelelő inaktivátorokat, pl. poliszorbát 80-at és/vagy lecitint tartalmaz. A tapaszokat legalább 30 percig erõteljesen rázatjuk. 4-5-2. Beoltás és hígítás. A 4-5-1. pont szerint előkészített mintához, valamint egy konrollkészítményhez (nem tartalmazza a vizsgálandó anyagot) mikroorganizmusszuszpenziót adunk olyan mennyiségben, hogy a kapott inokulum legfeljebb 100 CFU-t tartalmazzon. Az inokulum-szuszpenzió térfogata nem haladhatja meg a hígított termék térfogatának 1%-át. Az elfogadható mikroorganizmus-visszanyerés igazolása érdekében a minta lehető legkisebb hígítását használjuk a vizsgálathoz. Ahol ez az antimikrobás hatás vagy a



rossz oldékonyság miatt nem lehetséges, további megfelelő előírásokat kell kidolgozni. Ha a növekedés minta által okozott gátlása másképp nem kerülhető el, a mikroorganizmus-szuszpenziót semlegesítés, hígítás vagy szűrés után adjuk a mintához. 4-5-3. Az antimikrobás hatás semlegesítése/megszüntetése. Az előkészített mintából a 4-5-2. pont szerinti hígítás és a 4-5-4. pontban leírt inkubálás után mért mikroorganizmusszámot összevetjük a kontrollból kimutatott mikroorganizmusszámmal. Ha a szaporodás gátolt (2-nél nagyobb faktor szerinti csökkenés), módosítjuk az adott mikroorganizmusszám meghatározó eljárást az eredmények érvényességének biztosítása céljából. Az eljárást pl. a következőképpen módosíthatjuk: (1) a hígító folyadék vagy a táptalaj térfogatának növelése; (2) specifikus vagy általános semlegesítőszerek elegyítése a hígító folyadékba; (3) membránszűrés; (4) a fenti eljárások kombinálása. Semlegesítőszerek. Az antimikrobás anyagok hatásának közömbösítése céljából semlegesítőszerek alkalmazhatók (2.6.12.-3. táblázat), amelyeket célszerűen a sterilezést megelőzően adunk a hígítószerhez vagy a táptalajhoz. Amennyiben semlegesítőszereket használunk, üres kísérlettel (semlegesítőszer alkalmazása a termék távollétében) igazolni kell azok hatékonyságát, továbbá azt, hogy a mikroorganizmusokra nem toxikusak. 2.6.12.-3. táblázat – Szokásos semlegesítőszerek a zavaró anyagok kiküszöbölésére Zavaró anyag

Lehetséges semlegesítő

Glutáraldehid, higanyvegyületek

Nátrium-hidrogénszulfit (nátriumbiszulfit)

Fenolok, alkohol, aldehidek, szorbátok

Hígítás

Aldehidek

Glicin

Kvaterner ammónium-vegyületek (KAV), para-hidroxibenzoátok (parabének), bisz-biguanidok

Lecitin

KAV, jód, parabének

Poliszorbátok

Higanyvegyületek

Tioglikolátok

Higanyvegyületek, halogének, aldehidek

Tioszulfátok

EDTA (edetátok)

Mg2+ vagy Ca2+ ionok



Ha nem találunk megfelelő semlegesítő módszert, akkor feltételezhető, hogy a beoltott mikroorganizmus izolálása azért nem sikerült, mert maga a termék mikrobaölő aktivitással rendelkezik. Ez az információ arra utal, hogy a termék valószínűleg nem szennyeződhet az adott mikroorganizmussal. Mindazonáltal lehetséges, hogy a termék csak néhány itt megadott mikroorganizmus növekedését gátolja, ugyanakkor nem gátol olyanokat, amelyek nincsenek megadva a referenciatörzsek között, illetve amelyekre nézve a referenciatörzsek nem reprezentatívak. Ilyen esetben a vizsgálatot azzal a legnagyobb hígítással végezzük, amely a mikroorganizmus növekedésével és a specifikus elfogadási követelményeknek megfelel. 4-5-4. Mikroorganizmusok kimutatása a termék jelenlétében. A felsorolt mikroorganizmusok mindegyikét külön-külön vizsgáljuk. Csak a hozzáadott referenciatörzs mikroorganizmusait számláljuk meg. 4-5-4-1. Membránszűrés. Legfeljebb 0,45 μm névleges pórusmérettel rendelkező membránszűrőket használunk. A szűrő anyagát úgy választjuk meg, hogy baktériumvisszatartó képességét a vizsgálandó minta komponensei ne befolyásolják. A felsorolt mikroorganizmusok mindegyikére egy membránszűrőt használunk. A 4-5-1.–4-5-3. pontban leírt módon előkészített minta megfelelő mennyiségét (lehetőleg a termék 1 g-jának megfelelő, vagy ha nagy telepszám várható, annál kisebb mennyiségét) a membránszűrőre visszük, késedelem nélkül szűrjük és a szűrőt megfelelő mennyiségű hígítószerrel mossuk. A teljes aerob mikroorganizmusszám (TAMC – total aerobic micro-organism count) meghatározásához a membránszűrőt szója-kazein-agar táptalaj felületére helyezzük. A teljes élesztőgomba-/penészgombaszám (TYMC – total yeasts/moulds count) meghatározásához a szűrőt Sabouraud-glükóz-agar táptalajra helyezzük. A lemezeket a 2.6.12.-2. táblázat szerint inkubáljuk, majd elvégezzük a számlálást. 4-5-4-2. A lemezen számlálás módszerei. A lemezen számlálást mindegyik táptalaj esetében legalább két párhuzamosban végezzük és az eredmények átlagát használjuk. 4-5-4-2-1. Lemezöntéses módszer A 4-5-1.–4-5-3. pontokban leírt módon előkészített mintából 1–1 ml-t 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe mérünk és mindegyikhez 15–20 ml szója-kazein-agar táptalajt vagy Sabouraud-glükóz-agar táptalajt adunk; a táptalajok hőmérséklete legfeljebb 45 °C lehet. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agar-táptalajok



mennyiségét ezzel arányosan növeljük. A 2.6.12-2. táblázatban felsorolt minden egyes mikroorganizmusnál legalább két Petri-csészével dolgozunk. Az inkubálást a 2.6.16.-2. táblázat szerint végezzük. A táptalajonként kapott mikroorganizmusszámok számtani átlagából kiszámoljuk az eredeti inokulumban található telepképző egységek (CFU) számát. 4-5-4-2-2. Felületi szélesztés. 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe 15–20 ml, legfeljebb 45 °C hőmérsékletű szójakazein-agar táptalajt vagy Sabouraud-glükóz-agar táptalajt adunk, majd a hagyjuk őket megszilárdulni. Ha nagyobb Petri-csészéket használunk, az agar-táptalajok térfogatát ezzel arányosan növeljük. A lemezeket – pl. lamináris áramlást biztosító fülkében vagy inkubátorban – megszárítjuk. A 2.6.12-2. táblázatban felsorolt minden egyes mikroorganizmusnál legalább két Petri-csészével dolgozunk. A 4-51.–4-5-3. pontokban leírt módon előkészített minta mért – legalább 0,1 ml – térfogatát szélesztjük a táptalaj felületén. Táptalajonként legalább két Petri-csészével dolgozunk minden hígítási fokozatban. Az inkubálást és a telepképző egységek számának meghatározását a 4-5-4-2-1. pontban leírt módon végezzük. 4-5-4-3. Legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer torzításmentessége és pontossága kisebb, mint a membránszűrésé vagy a lemezen számlálásé. Az eredmények, különösen penészgombákra, nem eléggé megbízhatóak. Ezért az MPN-módszert csak TAMCmeghatározásra alkalmazzuk, olyan esetekben, amikor más módszer nem alkalmazható. Ha a módszer használata indokolt, az alábbiak szerint járunk el. A termékből 4-5-1.–4-5-3. pontokban előírtak szerint legalább háromtagú, egymást követő tízszeres hígításokból álló sorozatot készítünk. Mindegyik hígítási fokozatból három 1 g-os (vagy 1 ml-es) részlettel beoltunk három kémcsövet, amelyek 9–10 ml szója-kazein folyékony táptalajt tartalmaznak. Szükség esetén felületaktív anyagot, pl. poliszorbát 80-at vagy antimikrobás szereket inaktiváló anyagokat is adhatunk a táptalajhoz. Tehát, ha három hígítási fokozatból álló sorozatot állítottunk elő, akkor kilenc kémcsövet oltunk be. A kémcsöveket legfeljebb 3 napon át 30–35°C-on inkubáljuk. Amennyiben az eredmények – a vizsgálandó termék sajátosságai miatt – nehezen vagy bizonytalanul értékelhetők, ugyanazon táptalajba vagy szója-kazein-agar táptalajra átoltásokat végzünk. Az átoltott táptalajokat 1–2 napig, az előbbivel azonos hőmérsékleten inkubáljuk, és az így nyert eredményeket vesszük figyelembe. A vizsgálandó készítmény 1 g-jára (vagy 1 ml-ére) vonatkozó legvalószínűbb baktériumszámot a 2.6.12.-4. táblázat alapján határozzuk meg.



2.6.12.-4. táblázat – A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (MPN) Az egyes sorozatokban mikroorganizmus-növekedést mutató kémcsövek számának kombinációi A termék mennyisége a kémcsövekben (g vagy ml) 0,1 0,01 0,001 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 1 2 0 1 2 1 1 3 0 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 3 0 2 3 1 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3

MPN/g vagy MPN/ml

95%-os konfidenciahatár

<3 3 3 6,1 6,2 9,4 3,6 7,2 11 7,4 11 11 15 16 9,2 14 20 15 20 27 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100

0–9,4 0,1–9,5 0,1–10 1,2–17 1,2–17 3,5–35 0,2–17 1,2–17 4–35 1,3–20 4–35 4–35 5–38 5–38 1,5–35 4–35 5–38 4–38 5–38 9–94 5–40 9–94 9–94 9–94 9–94 5–94 9–104 16–181 9–181 17–199 30–360 30–380 18–360 30–380 30–400 90–990 40–990 90–1980 200–4000



4-6. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK A membránszűrés vagy a lemezen számlálás módszere alkalmasságának igazolása során a vizsgált mikroorganizmusokra kapott számok átlagértékei legfeljebb 2-es faktor értékkel térhetnek el a 4-5-2. pontban definiált kontrollra (termék nincs jelen) kapott eredménytől. Az legvalószínűbb mikroorganizmusszám (MPN) módszer alkalmasságának igazolása során az inokulumból számított értéknek a kontrollra kapott eredmények 95%-os konfidencia-határain belül kell lennie. Ha a fenti kritériumok egy vagy több, a fent leírt módszerek bármelyikével vizsgált mikroorganizmusra nem teljesülnek, úgy a termék vizsgálatára olyan körülményeket és olyan módszert alkalmazunk, amely(ek)kel a kritériumok a lehető legjobban teljesülnek. 5. A TERMÉKEK VIZSGÁLATA 5-1. A VIZSGÁLT TERMÉKMENNYISÉG Ha más előírás nincs, a vizsgálandó termék 10 g-ját vagy 10 ml-ét használjuk, a fent említett óvintézkedések alkalmazása mellett. A folyékony és szilárd aeroszolok esetében 10 tartályból veszünk mintát. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor 10 tapaszt veszünk mintának. A vizsgált minta mennyisége csökkenthető olyan hatóanyagok esetén, amelyeket a következőképpen formulálnak: az adagolási egység (pl. tabletta, kapszula injekció) hatóanyagtartalma kisebb, mint 1 mg, illetve (adagolási egység nélküli gyógyszerformák esetén) a grammonkénti/milliliterenkénti hatóanyag-tartalom kisebb, mint 1 mg. Ezekben az esetekben a vizsgálandó mintamennyiség legalább a 10 adagolási egységben, illetve a termék 10 g-jában vagy 10 ml-ében jelenlevő hatóanyagnak megfelelő mennyiség legyen. Az olyan hatóanyagok esetében, amelyeknek mennyisége korlátozott vagy a gyártási tételek nagysága nagyon kicsi (ti. kevesebb, mint 1000 ml vagy 1000 g), a gyártási tétel 1%-át használjuk, kivéve, ha kisebb mennyiséget írtak elő, illetve ha annak használata indokolt és engedélyezett. Olyan termékeknél, ahol a gyártási tételben található egységek száma kisebb, mint 200 (pl. klinikai vizsgálatok esetén), a mintamennyiség 2 egységre csökkenthető, illetve – ha a gyártási tétel egységeinek száma kevesebb, mint 100 – 1 egység vizsgálata is lehetséges.



A mintá(ka)t az ömlesztett anyagból vagy a készítmény rendelkezésre álló tartályaiból véletlenszerűen vesszük. A kívánt mennyiség kinyerése érdekében megfelelő számú tartály tartalmát összekeverjük. 5-2. A TERMÉK VIZSGÁLATA 5-2-1. Membránszűrés. Olyan szűrőkészüléket használunk, amelynek szűrőlemezre táptalajra áthelyezhető. A terméket olyan módszerrel készítjük elő, amelynek alkalmasságát a 4. részben leírtak alapján igazolták, majd a megfelelő mennyiséget külön-külön 2 membránszűrőre visszük és késedelem nélkül megszűrjük. A szűrőket alkalmas eljárással mossuk. A teljes aerob mikroorganizmusszám (TAMC) meghatározásához az egyik membránszűrőt szója-kazein-agar táptalaj felületére helyezzük. A teljes élesztőgomba-/penészgombaszám meghatározásához (TYMC) a másik szűrőt Sabouraud-glükóz-agar táptalaj felületére helyezzük. A szója-kazein-agar táptalajt 30–35 °C-on 3–5 napig, a Sabouraud-glükóz-agar táptalajt 20–25 °C-on 5–7 napig inkubáljuk. Kiszámítjuk a termék 1 g-jára vagy 1 ml-ére vonatkoztatott telepképző egységek (CFU) számát. Transzdermális tapaszok vizsgálata esetén a 4-5-1. pontban leírt készítmény térfogatának 10%-át külön-külön két membránszűrőn megszűrjük. Az egyik membránszűrőt szója-kazein-agar táptalaj, a másikat Sabouraud-glükóz-agar táptalaj felületére helyezzük. 5-2-2. Lemezen számlálás. 5-2-2-1. Lemezöntéses módszer. A terméket olyan módszerrel készítjük elő, amelynek alkalmasságát a 4. rész alapján igazolták. Minden táptalaj számára legalább 2 Petri-csészét készítünk, minden hígítás esetében. A szója-kazein-agar táptalajt 30–35 °C-on 3–5 napig, a Sabouraud-glükózagar táptalajt 20–25 °C-on 5–7 napig inkubáljuk. Ezután kiválasztjuk azon hígításnak megfelelő lemezeket, amelyen a TAMC érték a legnagyobb (de kevesebb, mint 250), illetve a TYMC érték a legnagyobb (de kevesebb, mint 50). Táptalajonként a számértékek számtani közepét véve kiszámítjuk a termék 1 g-jára vagy 1 ml-ére vonatkoztatott telepképző egységek (CFU) számát.



5-2-2-2. Felületi szélesztés módszere. A terméket olyan módszerrel készítjük elő, amelynek alkalmasságát a 4. rész alapján igazolták. Minden táptalaj esetében legalább 2 Petri-csészét készítünk, minden hígításhoz. Az inkubálást és a telepképző egységek (CFU) számának kiszámítását illetően a „Lemezöntéses módszer” pontban leírtakkal megyező módon járunk el. 5-2-2-3. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám. A terméket olyan módszerrel készítjük elő, illetve hígítjuk, amelynek alkalmasságát a 4. rész alapján igazolták. A kémcsöveket 30–35 °C-on 3–5 napig inkubáljuk. Szükség esetén alkalmas módszerrel átoltást végzünk. Minden hígítás esetében feljegyezzük azon kémcsövek számát, amelyekben mikroorganizmus-növekedés észlelhető. A 2.6.12.-4. táblázat alapján meghatározzuk a termék 1 g-jára vagy 1 mlére vonatkoztatott legvalószínűbb mikroorganizmusszámot. 5-3. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE A teljes aerob mikroorganizmusszámot (TAMC) egyenlőnek tekintjük a szójakazein-agar táptalajon megjelenő telepképző egységek (CFU) számával. A táptalajon esetlegesen megjelenő gombatelepek a TAMC részét képezik. A teljes élesztőgomba-/penészgombaszámot (TYMC) egyenlőnek tekintjük a Sabouraudglükóz-agar táptalajon megjelenő telepképző egységek (CFU) számával. A táptalajon esetlegesen megjelenő baktériumtelepek a TYMC részét képezik. Ha a TYMC értéke a baktériumok elszaporodása miatt várhatóan túllépi az elfogadható határértéket, akkor antibiotikumot tartalmazó Sabouraud-glükóz-agar táptalajt használhatunk. A legvalószínűbb mikroorganizmusszám módszer alkalmazása esetén a kapott érték a TAMC lesz. Ha a mikrobiológiai minőséget illetően követelményeket írtak elő, azt a következőképpen kell értelmezni: – 101 CFU: az elfogadhatóság felső határa: 20, – 102 CFU: az elfogadhatóság felső határa: 200, – 103 CFU: az elfogadhatóság felső határa: 2000, és így tovább. Az ajánlott oldatok és táptalajok leírását a 2.6.13. általános fejezet („B. A harmonizált módszer”) tartalmazza.



01/2007:20613

2.6.13. NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: VIZSGÁLAT MEGHATÁROZOTT MIKROORGANIZMUSOKRA Ez az általános fejezet két vizsgálatcsoportot foglal magában. Az 1. csoport a cikkelyeknek való megfelelés meghatározására szolgáló referenciamódszereket tartalmazza. Ezért amennyiben egy cikkely jelen fejezetre hivatkozik, úgy a hivatkozás az 1. csoport követelményeinek való megfelelésre vonatkozik, hacsak a 2. csoport vizsgálatait nem engedélyezték. A 2. csoportban közölt vizsgálatok szintén az Európai Gyógyszerkönyv részét képezik, tehát ilyen értelemben lehet rájuk hivatkozni, különösen forgalomba hozatali engedéllyel kapcsolatos eljárás esetén. A tervek szerint az érintett cikkelyek felülvizsgálata során az 1. csoport vizsgálatai helyébe a 2. csoport vizsgálatai lépnek. A 2. csoport vizsgálati módszereit a Japán Gygyszerkönyvvel és az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvével (USP) együttműködésben fejlesztették ki, a követelményrendszer harmonizálása céljából. A. AZ EURÓPAI GYÓGYSZERKÖNYV MÓDSZERE Ebben az általános módszerben bizonyos szelektív táptalajok használata javasolt. Szelektív táptalajok felhasználásával általában szubletálisan károsodott mikroorganizmusok nem mutathatók ki. Minthogy a szubletálisan károsodott mikroorganizmusok jelentősen befolyásolják a termékek minőségét, a szelektív táptalajokon végzett vizsgálatoknak reaktiválási eljárást is kell tartalmazniuk. Amennyiben a vizsgálandó termék antimikrobás hatással rendelkezik, ezt megfelelő módon semlegesíteni kell. Enterobaktériumok és néhány más Gram-negatív baktérium Noha a vizsgálatot az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok kimutatására dolgozták ki, ismeretes, hogy a vizsgálattal más típusú mikroorganizmusok (pl. Aeromonas, Pseudomonas) is kimutathatók. A baktériumok kimutatása. A vizsgálandó terméket a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítjük elő, azzal a különbséggel, hogy nátrium-klorid–pepton– tompítóoldat (pH 7,0) helyett „D” folyékony táptalajt használunk. A keveréket homogenizáljuk, majd 35–37 °C-on annyi ideig inkubáljuk, amennyi a baktériumok reaktiválásához elegendő, de szaporodásukhoz nem (ez általában 2 óra, de legfeljebb



5 óra). A keveréket tartalmazó tartályt felrázzuk („A” homogenizátum), kiveszünk belőle a termék 1 g-jának (vagy 1 ml-ének) megfelelő részletet, ezt 100 ml „E” dúsító táptalajba visszük és 18-48 órán keresztül 35–37 °C-on inkubáljuk. A dúsító táptalajból ezután „F” agar táptalaj-lemezekre oltunk. Az inkubálás 18-24 órán keresztül 35-37 °C-on történik. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha egyetlen lemezen sem fejlődnek ki Gram-negatív baktériumtelepek. Mennyiségi értékelés. Az „E” folyékony dúsító táptalaj megfelelő mennyiségeit beoltjuk „A” homogenizátummal és/vagy ennek hígításaival, amelyek 0,1, 0,01, ill. 0,001 g-ot (vagy 0,1, 0,01, ill. 0,001 ml-t) tartalmaznak a vizsgálandó termékből. A beoltott táptalajokat 24-48 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. A szelektív izoláció érdekében mindegyik tenyészetet átoltjuk „F” agar táptalaj-lemezre, és 1824 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Jól kifejlett, általában vörös vagy vöröses Gram-negatív baktériumtelepek megjelenése pozitív eredményt jelent. A terméknek azt a legkisebb mennyiségét, amely pozitív eredményt ad és azt a legnagyobb mennyiségét, amely negatív eredményt ad, feljegyezzük. A 2.6.13.-1. táblázat alapján megállapítjuk a valószínű baktériumokszámot. 2.6.13.-1. táblázat Az egyes termékmennyiségek esetén kapott eredmények 0,1 g vagy 0,1 ml

0,01 g vagy 0,01 ml

0,001 g vagy 0,001 ml

Valószínű baktériumszám 1 g termékre vonatkoztatva

+

+

+

>103

+

+

–

>102 és <103

+

–

–

>10 és <102

–

–

–

<10

Transzdermális tapaszok vizsgálatakor 50 ml B-kivonatot (amelyet a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítettünk elő) steril membránszűrőn megszűrünk, a membránt 100 ml „E” folyékony dúsító táptalajba helyezzük és 18-24 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után enterobaktériumok és más Gram-negatív mikroorganizmusok kimutatása céljából „F” agar táptalajon szélesztjük.



Escherichia coli A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml „A” folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk és 18-48 órán keresztül 3537 °C-on inkubáljuk. A tartályt összerázzuk, tartalmából 1 ml-t 100 ml „G” folyékony táptalajba oltunk át és 18-24 órán keresztül 43-45 °C-on inkubáljuk. „H” agar táptalaj-lemezekre átoltva 18-72 órán keresztül 35-37 °C-on folytatjuk a tenyésztést. Vörös, nem-mukoid Gram-negatív pálcákból álló baktériumtelepek keletkezése E. coli jelenlétére utal, amit megfelelő biokémiai vizsgálatokkal, pl. indol-reakcióval megerősítünk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha az említett telepek nem láthatók, vagy ha a megerősítő biokémiai reakciók negatívak. Salmonella A vizsgálandó terméket a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítjük elő, azzal a különbséggel, hogy nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) helyett „A” folyékony táptalajt használunk. A beoltott táptalajt homogenizáljuk, majd 18-24 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. A dúsított tenyészet 1 ml-ét 10 ml „I” folyékony táptalajba oltjuk át és 18-24 órán keresztül 41-43 °C-on inkubáljuk. Három agar-táptalaj („J”, „K” és „L”) közül legalább két különbözőre továbboltunk és ezeket 18-72 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Salmonella-baktériumok valószínű jelenlétére utal a következő telepek megjelenése: – „J” agar-táptalajon: jól kifejlődött, színtelen telepek, – „K” agar-táptalajon: jól kifejlődött, vörös telepek, fekete középponttal vagy anélkül, – „L” agar-táptalajon: kicsi, áttetsző, színtelen vagy rózsaszínű, máskor átlátszatlan, fehér telepek, melyeket gyakran rózsaszínű vagy vörös zóna övez. Néhány gyanús telepet, felületi és mély beoltást alkalmazva, külön-külön átoltunk kémcsövekben lévő „M” agar-táptalajra. szalmonellák jelenlétének gyanúját ideiglenesen megerősíti, ha a szín a mélykultúrában vörösről sárgára változik (a felületi tenyészetben azonban nem), miközben az agarban rendszerint gázfejlődés tapasztalható, hidrogén-szulfid képződésével vagy anélkül. Biztos igazolást megfelelő biokémiai és szerológiai vizsgálatokkal nyerhetünk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a fent leírt típusnak megfelelő telepek nem jelennek meg, vagy ha az igazoló biokémiai és szerológiai próbák negatívak.



Pseudomonas aeruginosa A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml „A” folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk, majd 18-48 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Ezután átoltjuk „N” agar-táptalaj-lemezre, és 18-72 órán keresztül 35-37 °C-on tovább inkubáljuk. Amennyiben mikroorganizmus-növekedés nem észlelhető, a termék megfelel a vizsgálat követelményének. Ha Gram-negatív pálcák szaporodását észleljük, néhány morfológiailag eltérő izolált telepet átoltunk „A” folyékony táptalajba és 18-24 órán keresztül 41-43 °C-on inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha 41-43 °C-on a baktériumtelepek nem észlelhetők. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített A-kivonat 50 ml-ét steril membránszűrőn megszűrjük, a membránt 100 ml „A” folyékony táptalajba helyezzük és 18-48 órán keresztül 3537 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után „N” agar táptalajon szélesztjük. Staphylococcus aureus A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml „A” folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk és 18-48 órán keresztül 3537 °C-on inkubáljuk. Ezután átoltjuk „O” agar táptalaj-lemezre és 18-72 órán keresztül 35-37 °C-on tovább inkubáljuk. Jól látható zónával körülvett, Gram-pozitív coccusokból álló fekete telepek S. aureus jelenlétére utalnak. Ezt megfelelő biokémiai próbákkal, pl. koaguláz- és dezoxiribonukleáz-próbával erősíthetjük meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt típusú telepek „O” agartáptalajon nem észlelhetők, vagy ha az igazoló biokémiai próbák negatívak. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített A-kivonat 50 ml-ét steril membránszűrőn megszűrjük, a membránt 100 ml „A” folyékony táptalajba helyezzük és 18-48 órán keresztül 3537 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után „O” agar táptalajon szélesztjük. A táptalajok mikroorganizmus-növekedést elősegítő képessége és szelektív tulajdonságai; a vizsgálat érvényessége A dehidratált táptalaj-készítmények minden egyes gyártási tételét alá kell vetni a következőkben leírt vizsgálatoknak.



A következőképpen járunk el: az alább felsorolt referenciatörzseket a megfelelő (pl. az itt megadott) táptalajt tartalmazó kémcsövekben külön-külön 18-24 órán át 3035 °C-on inkubáljuk. Staphylococcus aureus

pl. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83): „A” folyékony táptalajban,

Pseudomonas aeruginosa


Escherichia coli


Salmonella typhimurium

nincs ajánlott referencia-törzsszám (emberre ártalmatlan Salmonella, pl. Salmonella abony [NCTC 6017, CIP 80.39] is használható): „A” folyékony táptalajban.

Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldattal (pH 7,0) hígítva mindegyik tenyészetből milliliterenként kb. 1000 életképes mikroorganizmust tartalmazó referenciaszuszpenziót készítünk. A S. aureus, P. aeruginosa, E .coli és Salmonella baktériumszuszpenziók azonos térfogatú részleteiből keveréket készítünk, melynek 0,4 ml-ét használjuk inokulumként (törzsenként kb. 100 mikroorganizmus) a vizsgálandó termék jelenlétében és anélkül is. A megfelelő mikroorganizmusokra pozitív eredményt kell kapnunk. Clostridiumok Az alább leírt vizsgálatok célja különböző. Az első módszer olyan termékek ellenőrzésére szolgál, amelyeknél a patogén clostridiumokat feltétlenül ki kell zárni, és ellenőrizni kell, hogy a termék mentes-e ezektől. Az ilyen termékekben általában alacsony az összes mikroorganizmus-szám. A második módszer félkvantitatív vizsgálat Clostridium perfringensre, és olyan termékek vizsgálatára szolgál, amelyeknél az e fajhoz tartozó mikroorganizmusok száma minőségi követelmény. 1. Vizsgálat Clostridiumokra A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék két egyenlő (1-1 g-jának vagy 1-1 ml-ének megfelelő) részletét vizsgáljuk. Az egyik részletet 10 percig 80 °C-on melegítjük, majd gyorsan lehűtjük. A másik részletet nem melegítjük. A két homogenizált részlet 10-10 ml-ét két olyan 38×200 mm-es tartályba vagy más alkalmas edénybe töltjük, amelyek mindegyike 100 ml „P” táptalajt tartalmaz; ezeket 48 órán át 35-37 °C-on anaerob körülmények között inkubáljuk. Inkubálás után mindegyik edényből „Q” táptalajra oltunk át, amelyhez



előzetesen gentamicint adtunk, majd a táptalajt 48 órán át 35-37 °C-on anaerob körülmények között inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálatnak, ha mikroorganizmus-növekedés nem észlelhető. Ha mikroorganizmus-növekedés észlelhető, minden eltérő formájú telepből gentamicint nem tartalmazó „Q” táptalajra oltunk át, és ezeket mind aerob, mind anaerob körülmények között inkubáljuk. A csak anaerob körülmények között növekedő, negatív kataláz-próbát adó Gram-pozitív bacillusok megjelenése (endospórával vagy anélkül) Clostridium fajok jelenlétére utal. Szükség esetén összehasonlítjuk a két lemezen kialakult telep morfológiáját és kataláz-próbát végzünk, hogy kizárjuk a pozitív kataláz-próbát adó aerob és fakultatív anaerob Bacillus fajokat. A kataláz-próba – amelyet egy csepp R hígított hidrogén-peroxid– oldat hozzáadásával végzünk – alkalmas különálló telepek vizsgálatára közvetlenül az agar-lemezen vagy indirekt módon, tárgylemezre vitel után. Gázbuborékok képződése pozitív kataláz-próbát jelez. 2. Clostridium perfringens-szám A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termékből nátrium-klorid–pepton–tompítóoldattal (pH 7,0) 1:100 és 1:1000 hígításokat készítünk. Az összes életképes aerob mikroorganizmus-számot tárgyaló 2.6.12 fejezetben leírtak szerint, kis Durham-csövekkel ellátott kémcsövekbe vagy más alkalmas edényekbe töltött „R” táptalajon meghatározzuk a legvalószínűbb baktériumszámot. A keverést a lehető legkevesebb rázással, az inkubálást 24-48 órán át 45,5-46,5 °C-on végezzük. Ha vas-szulfidtól eredő feketedés mutatkozik és a Durham-csövekben bőséges (a térfogat legalább tizedrészének megfelelő) gázfejlődést észlelünk, ez Cl. perfringens jelenlétére utal. A legvalószínűbb Cl. perfringens számot a 2.6.13.-2. táblázat segítségével állapítjuk meg. Ellenőrzés. A következő törzseket használjuk: Az 1. módszerhez: Clostridium sporogenes, pl. ATCC 19404 (NCTC 532) vagy CIP 79.3; A 2. módszerhez: Clostridium perfringens, pl. ATCC 13124 (NCIMB 6125, NCTC 8237, CIP 103409). Szükség esetén Cl. sporogenesszel együtt alkalmazzuk, a szelektivitás és az anaerob körülmények ellenőrzésére.



2.6.13.-2. táblázat – A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (Most-probablenumber – MPN) Minden hígításhoz 3 kémcső Pozitív kémcsövek száma

MPN/g

0,1 g

0,01 g

0,001 g

0

0

0

<3

0

1

0

3

1

0

0

3

1

0

1

7

1

1

0

7

1

2

0

11

2

0

0

9

2

0

1

14

2

1

0

15

2

1

1

20

2

2

0

21

3

0

0

3

0

3

Besorolás* 1

2

95%-os konfidenciahatárok –

–

<1

17

1

21

2

27

2

28

4

35

2

38

5

48

5

50

8

61

x

8

63

23

x

7

129

1

38

x

10

180

1

0

43

x

20

210

3

1

1

75

x

20

280

3

2

0

93

x

30

390

3

2

1

150

x

50

510

3

2

2

210

80

640

3

3

0

240

x

100

1400

3

3

1

460

x

200

2400

3

3

2

1100

x

300

4800

3

3

3

>1100

–

–

x x x x x x x x x

x

*

1. kategória: normálisnak tekinthető (elfogadható) eredmények; az esetek 95%-ában fordulnak elő.

2. kategória: kevésbé valószínű (kevésbé elfogadható) eredmények; mindössze az esetk 4%-ában fordulnak elő. Fontos döntéseknél nem használhatók! A 2. kategóriánál kevésbé valószínű eredmények a táblázatban nem szerepelnek és soha nem tekinthetők elfogadhatónak.



A fejezet következő része tájékoztató jellegű. AJÁNLOTT OLDAT ÉS TÁPTALAJOK A következő oldat és táptalajok bizonyultak alkalmasnak a mikrobiológiai szennyezésekre előírt gyógyszerkönyvi vizsgálatokhoz. Más táptalajok is használhatók, ha a vizsgálandó mikroorganizmusokra nézve hasonló növekedést elősegítő és szelektív tulajdonságokkal rendelkeznek. Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát

3,6 g 7,2 g; 0,067 M foszfáttal egyenértékű

Nátrium-klorid

4,3 g

Pepton (hús- vagy kazeinpepton)

1,0 g

Tisztított víz

1000 ml

Az oldathoz felületaktív anyagokat vagy antimikrobás szereket semlegesítő inaktivátorokat adhatunk, mint pl.: Poliszorbát 80

1–10 g/l

Az oldatot autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „A” folyékony táptalaj (szója-kazein folyékony táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

17,0 g

Szójapepton (papain-hidrolizátum)

3,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Dikálium-hidrogén-foszfát

2,5 g

Glükóz-monohidrát

2,5 g

Tisztított víz

1000 ml



A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „B” agar-táptalaj (szója-kazein agar-táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

15,0 g


5,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar Tisztított víz

15,0 g 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „C” agar-táptalaj (antibiotikum-tartalmú Sabouraud-glükóz-agar) Pepton (hús- és kazeinpepton)

10,0 g


40,0 g

Agar

15,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. Közvetlenül felhasználás előtt a táptalajhoz literenként 0,10 g benzilpenicillin-nátrium és 0,10 g tetraciklin steril oldatát elegyítjük, vagy a sterilezés előtt literenként 50 mg klóramfenikolt keverünk a táptalajhoz. „D” folyékony táptalaj (laktóz-tartalmú folyékony táptalaj) Marhahúskivonat

3,0 g

Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

5,0 g

Laktóz-monohidrát

5,0 g



Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,9 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd azonnal lehűtjük. „E” folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumok vizsgálatához)

(Mossel-féle

folyékony

dúsító


táptalaj

10,0 g


5,0 g

Szárított marhaepe

20,0 g

Kálium-dihidrogén-foszfát

2,0 g

Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát

8,0 g

Brillantzöld

15 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke a melegítés után 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt 100 °C-on 30 percen át melegítjük, majd azonnal lehűtjük. „F” agar-táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar glükózzal) Élesztőkivonat

3,0 g


7,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Laktóz-monohidrát Nátrium-klorid

10,0 g 5,0 g


10,0 g

Agar

15,0 g

Neutrálvörös

30 mg



Kristályibolya Tisztított víz

2 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Autoklávban nem szabad hevíteni. „G” folyékony táptalaj (MacConkey folyékony táptalaj) Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

20,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g


5,0 g

Brómkrezolbíbor Tisztított víz

10 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „H” agar-táptalaj (MacConkey agar) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Pepton (hús- és kazeinpepton) Laktóz-monohidrát

17,0 g 3,0 g 10,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Agar Neutrálvörös Kristályibolya Tisztított víz

13,5 g 30,0 mg 1 mg 1000 ml



A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,1 ± 0,2 legyen. A táptalajt állandó rázogatás közben 1 percen át forraljuk, majd autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „I” folyékony táptalaj (tetrationát-epe-brillantzöld-táptalaj) Pepton

8,6 g


8,0 g

Nátrium-klorid

6,4 g

Kalcium-karbonát

20,0 g

Kálium-tetrationát

20,0 g

Brillantzöld

70 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,0 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Újramelegíteni nem szabad. „J” agar-táptalaj (dezoxikolát-citrát-agar) Marhahúskivonat

10,0 g

Húspepton

10,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g

Nátrium-citrát

20,0 g

Vas(III)-citrát

1,0 g

Nátrium-dezoxikolát

5,0 g

Agar

13,5 g

Neutrálvörös

20 mg

Tisztított víz

1000 ml



A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt óvatosan forrásig melegítjük, 1 percen át forraljuk, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. „K” agar-táptalaj (xilóz-lizin-dezoxikolát-agar) Xilóz

3,5 g

L-lizin

5,0 g

Laktóz-monohidrát

7,5 g

Szacharóz

7,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Fenolvörös

80 mg

Agar

13,5 g


2,5 g

Nátrium-tioszulfát

6,8 g

Ammónium-vas(III)-citrát

0,8 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. „L” agar-táptalaj (brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz-agar) Pepton (hús- és kazeinpepton)

10,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g



Laktóz-monohidrát

10,0g

Szacharóz

10,0 g

Agar

20,0 g

Fenolvörös

80 mg

Brillantzöld

12,5 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,9 ± 0,2 legyen. Közvetlenül felhasználás előtt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd 50 °C-ra lehűtve Petricsészékbe osztjuk szét. „M” agar-táptalaj (vas(III)-három cukor-agar) Marhahúskivonat

3,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Pepton (kazein- és marhahús-pepton) Nátrium-klorid

20,0 g 5,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g

Szacharóz

10,0 g


1,0 g

Vas(III)-ammónium-citrát

0,3 g


0,3 g

Fenolvörös

25 mg

Agar

12,0 g

Tisztított víz

1000 ml



Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,4 ± 0,2 legyen. A kémcsöveket magasságuk egyharmadáig töltjük táptalajjal, autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd olyan helyzetben hagyjuk lehűlni, hogy mély réteg és ferde felszín keletkezzék. „N” agar-táptalaj (cetrimid-agar) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Magnézium-klorid Kálium-szulfát Cetrimid Agar

20,0 g 1,4 g 10,0 g 0,3 g 13,6 g

Tisztított víz

1000 ml

Glicerin

10,0 ml

Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „O” agar-táptalaj (Baird-Parker-agar) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g

Marhahúskivonat

5,0 g

Élesztőkivonat

1,0 g

Lítium-klorid

5,0g

Agar

20,0 g

Glicin

12,0 g

Nátrium-piruvát

10,0 g

Tisztított víz

950 ml



Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,8 ± 0,2 legyen. A táptalajt ezután autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd 45-50 °C-ra lehűtjük és 10 ml steril, 10 g/l töménységű kálium-tellurit–oldatot, valamint 50 ml tojássárgájaemulziót elegyítünk hozzá. „P” táptalaj (folyékony megerősített táptalaj clostridiumokhoz) Marhahúskivonat

10,0 g

Pepton

10,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Oldható keményítő

1,0 g


5,0 g

Cisztein-hidroklorid

0,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Nátrium-acetát

3,0 g

Agar

0,5 g

Tisztított víz

1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után kb. 6,8 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „Q” táptalaj (Columbia-agar) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g

Húspepton (pepszin-hidrolizátum)

5,0 g

Szívpepton (pankreász-hidrolizátum)

3,0 g

Élesztőkivonat

5,0 g



Kukoricakeményítő

1,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar (gélképző-képességtől függően) Tisztított víz

10,0–15,0 g 1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. Autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd 45-50 °C-ig hagyjuk lehűlni. A táptalajhoz szükség esetén 20 mg gentamicinbázisnak megfelelő mennyiségű gentamicin-szulfátot adunk, majd Petri-csészékbe osztjuk szét. „R” táptalaj (folyékony laktóz–szulfit táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

5,0 g

Élesztőkivonat

2,5 g

Nátrium-klorid

2,5 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g


0,3 g

Tisztított víz

1000 ml

Az alkotórészek oldása után az oldat pH-ját 7,1 ± 0,1 értékre beállítjuk. A táptalaj 8 ml-es részleteit kis Durham-csövet tartalmazó, 16 × 160 mm méretű kémcsövekbe töltjük, majd autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük és 4 °C-on tároljuk. A táptalajt felhasználás előtt 5 percig vízfürdőben melegítjük, majd lehűtjük. Mindegyik kémcsőbe 0,5 ml-t mérünk R nátrium-diszulfit 12 g/l töménységű oldatából és 0,5 ml-t ammónium-vas(III)-citrát 10 g/l töménységű oldatából. Mindkét oldatot frissen készítjük és membránszűrőn szűrjük (pórusméret: 0,45 µm). „S” agar-táptalaj (R2A-táptalaj)) Élesztőkivonat

0,5 g



Proteáz pepton

0,5 g

Kazein-hidrolizátum

0,5 g

Glükóz

0,5 g

Keményítő

0,5 g


0,3 g

Magnézium-szulfát (vízmentes) Nátrium-piruvát Agar Tisztított víz

0,024 g 0,3 g 15,0 g 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke a sterilezés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. SEMLEGESÍTŐSZEREK A semlegesítőszereket antimikrobás szerek hatásának semlegesítésére használhatjuk. Ezeket, célszerűen még a sterilezés előtt, a nátrium-klorid–pepton–tompítóoldathoz (pH 7,0) keverjük. Használatuk esetén bizonyítani kell hatékonyságukat és azt, hogy a mikroorganizmusokkal szemben nem toxikusak. Egy tipikus semlegesítő folyadék összetétele a következő: Poliszorbát 80

30 g

Lecitin (tojásból)

3g

Hisztidin-hidroklorid

1g


1g

Nátrium-klorid

4,3 g


3,6 g




7,2 g

Tisztított víz

1000 ml

A keveréket autoklávban 121 °C-on 15 percig sterilezzük. Amennyiben az oldat semlegesítő hatékonysága nem kielégítő, megnövelhetjük a poliszorbát 80 vagy a lecitin koncentrációját. Úgy is eljárhatunk, hogy a 2.6.13.-3. táblázatban feltüntetett semlegesítőszereket használjuk. 2.6.13.-3. táblázat Antimikrobás szerek hatását megszüntető szerek (inaktivátorok), amelyeket a nátrium-klorid–pepton–tompítóoldathoz (pH 7,0) adunk Az antimikrobás szer típusa

Inaktivátor

Koncentráció

Megjegyzés

fenolok

nátrium-lauril-szulfát

4 g/l

A nátrium-klorid–

poliszorbát 80 és lecitin

30 g/l és 3 g/l

tojássárgája

5–50 ml/l

szerves higanyvegyületek

nátrium-tioglikolát

0,5–5 g/l

halogének

nátrium-tioszulfát

5 g/l

pepton–tompítóoldat (pH 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz

A nátrium-klorid– kvaterner ammóniumvegyületek

tojássárgája

5–50 ml/l

pepton–tompítóoldat (pH 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz

B. A HARMONIZÁLT MÓDSZER 1. BEVEZETÉS Az alábbiakban leírt vizsgálatok lehetővé teszik az adott körülmények között kimutatható, meghatározott mikroorganizmusok távollétének vagy korlátozott jelenlétének megállapítását.



A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy egy adott anyagról vagy termékről megállapítható legyen: megfelel-e a mikrobiológiai minőségre megállapított követelménynek. Amennyiben a vizsgálatokat ebből a célból végezzük, az alábbi útmutatások szerint járjunk el, az előírt mintaszámot is figyelembe véve, és az eredményeket a következők szerint értelmezzük. Más mikrobiológiai eljárások, például automatizált módszerek is használhatók, amennyiben igazolták, hogy egyenértékűek a Gyógyszerkönyvben leírt módszerrel. 2. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁSOK A mintákat a 2.6.12 általános fejezetben („B. A harmonizált módszer”) leírtak szerint készítjük elő. A termék esetleges antimikrobás hatását – adott esetben – amennyire lehetséges meg kell szüntetni vagy semlegesíteni kell, a 2.6.12. általános fejezetben („B. A harmonizált módszer”) leírtak szerint. Amennyiben a mintaelőkészítésnél felületaktív anyagokat használunk, úgy a 2.6.12 általános fejezetben („B. A harmonizált módszer”) leírtak szerint igazolni kell, hogy a mikroorganizusokra nem toxikusak és az inaktiválószerekkel nem összeférhetetlenek. 3. A TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ ÉS GÁTLÓ TULAJDONSÁGAI ÉS A VIZSGÁLAT ALKALMASSÁGA Meg kell állapítani, hogy a vizsgálat alkalmas-e mikroorganizmusok kimutatására a vizsgálandó termék jelenlétében. A módszer alkalmasságát újra igazolni kell, ha a módszerben vagy a termékben olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. 3-1. REFERENCIATÖRZSEK KÉSZÍTÉSE A referenciatörzsek stabilizált szuszpenzióit használjuk, illetve az alábbiak szerint referenciatörzseket készítünk. Oltócsíra-tenyészetet fenntartó módszereket (oltócsírarendszerek) alkalmazunk, oly módon, hogy a beoltáshoz használt életképes mikroorganizmusok az oltócsíra-törzstételhez képest legfeljebb 5 átoltásból származzanak. 3-1-1. Aerob mikroorganizmusok. Az egyes baktérium referenciatörzseket különkülön folyékony szója-kazein táptalajon vagy szója-kazein-agar táptalajon 30–35 °C-



on 18–24 órán át inkubáljuk. A Candida albicans referenciatörzset külön Sabouraudglükóz-agar táptalajon vagy folyékony Sabouraud-glükóz táptalajon 20–25 °C-on 2– 3 napig inkubáljuk. – Staphylococcus aureus pl. ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 vagy NBRC 13276; – Pseudomonas aeruginosa pl. ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 vagy NBRC 13275; – Escherichia coli pl. ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 vagy NBRC 3972; – Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus, pl. ATCC 14028, vagy más lehetőségként Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus, pl. NCTC 6017 vagy CIP 80.39; – Candida albicans pl. ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 vagy NBRC 1594. A szuszpenziók készítéséhez nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatot (pH 7,0) vagy foszfát–tompítóoldatot (pH 7,2) használunk. A szuszpenziókat 2 órán belül, illetve ha 2–8 °C-on tároltuk 24 órán belül felhasználjuk. 3-1-2. Clostridiumok. A Clostridium sporogenes következő törzseit használjuk: pl. ATCC 11473 vagy ATCC 19404 (NCTC 532 vagy CIP 79.03) vagy NBRC 14293. A clostridium-referenciatörzset anaerob körülmények között, clostridiumokhoz készült megerősített táptalajon 30–35 °C-on 24–48 órán át szaporítjuk. A vizsgálati beoltásra – a Cl. sporogenes vegetatív sejtjei friss szuszpenziójának készítése és azt követő hígítása alternatívájaként – stabil spóraszuszpenzió is használható. A stabil szuszpenzió 2–8 °C-on egy validált időtartamig eltartható. 3-2. NEGATÍV KONTROLL A vizsgálati körülmények ellenőrzésére negatív kontroll vizsgálatot végzünk, melynek során a vizsgálandó készítmény helyett a választott hígítófolyadékot alkalmazzuk. Ebben mikroorganizmus-növekedés nem következhet be. 3-3. TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST GÁTLÓ TULAJDONSÁGAI

ELŐSEGÍTŐ

ÉS

A kész táptalajok, valamint a szárított táptalajból vagy az összetevőiből készített táptalajok minden gyártási tételét vizsgáljuk.



A 2.6.13.-4. táblázat szerint ellenőrizzük a releváns táptalajok megfelelő tulajdonságait. 2.6.13.-4. táblázat – A táptalajok mikroorganizmus-növekedést elősegítő, gátló és jelző tulajdonságai

Vizsgálat epeálló Gram-negatív baktériumokra

Vizsgálat Escherichia coli-ra

Táptalaj

Tulajdonság

Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumokhoz

Szaporodás-serkentő

kristályibolya-neutrálvörösepesavas-agar táptalaj glükózzal MacConkey-féle folyékony táptalaj MacConkey-féle agar-táptalaj

Rappaport Vassiliadis-féle folyékony Salmonella-dúsító táptalaj

Xilóz-lizin-dezoxikolát-agar táptalaj

Vizsgálat clostridiumokra Vizsgálat Candida albicans-ra

Szaporodás-serkentő + jelző

E. coli P. aeruginosa


E. coli

Gátló Szaporodás-serkentő + jelző

S. aureus

Cetrimid-agar táptalaj Mannit-nátrium-klorid táptalaj Megerősített táptalaj clostridiumokhoz Columbia-agar táptalaj Sabouraud-glükóz folyékony táptalaj Sabouraud-glükóz-agar táptalaj

E. coli

Jelző

Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus vagy Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus S. aureus Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus vagy Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus E. coli


P. aeruginosa

Gátló

E. coli


Gátló

Vizsgálat Salmonella-ra

Vizsgálat Pseudomonas aeruginosa-ra Vizsgálat Staphylococcus aureus-ra

Gátló

Referenciatörzs E. coli P. aeruginosa S. aureus


Szaporodás-serkentő + jelző Gátló

S. aureus E. coli


Cl. sporogenes


Cl. sporogenes


C. albicans


C. albicans



A mikroorganizmus-növekedést elősegítő tulajdonság vizsgálata folyékony táptalajok esetén: a megfelelő táptalaj adott mennyiségét kisszámú (legfeljebb 100 CFU) megfelelő mikroorganizmussal beoltjuk. A beoltott táptalajt a megadott hőmérsékleten legfeljebb a vizsgálatban megadott legrövidebb időtartamig inkubáljuk. A mikroorganizmus-növekedés tisztán látható legyen, és mértéke hasonló legyen a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. A mikroorganizmus-növekedést elősegítő tulajdonság vizsgálata szilárd táptalajok esetén: a felszíni szélesztéses módszert alkalmazzuk. A lemezeket kisszámú megfelelő mikroorganizmussal (legfeljebb 100 CFU) oltjuk be. A lemezeket a megadott hőmérsékleten legfeljebb a vizsgálatban megadott legrövidebb időtartamig inkubáljuk. A mikroorganizmus-növekedés hasonló mértékű legyen a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. A gátló tulajdonság vizsgálata folyékony vagy szilárd táptalajok esetén: a megfelelő táptalajt a megfelelő mikroorganizmus legalább 100 CFU mennyiségével beoltjuk. A táptalajokat a megadott hőmérsékleten legalább a vizsgálatban megadott leghosszabb időtartamig inkubáljuk. Mikroorganizmus-szaporodás ne legyen megfigyelhető. A jelző tulajdonság vizsgálata: a felszíni szélesztéses módszert alkalmazzuk. A lemezeket kisszámú megfelelő mikroorganizmussal (legfeljebb 100 CFU) oltjuk be. A lemezeket a megadott hőmérsékleten annyi ideig inkubáljuk, ami a vizsgálatban megadott legrövidebb és leghosszabb időtartam közé esik. A mikroorganizmustelepeknek – küllemüket és jelző reakciójukat tekintve – hasonlónak kell lenniük a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. 3-4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALKALMASSÁGA A mintaelőkészítést minden egyes vizsgálandó termék esetében a 4. rész megfelelő pontjában előírtak szerint végezzük el. Az egyes referenciatörzseket keverés közben adjuk az előírt táptalajhoz. A referenciatörzseket egyenként oltjuk be. A beoltott vizsgálati készítményben a mikroorganizmusok legfeljebb 100 CFU-nak megfelelő mennyiségét alkalmazzuk. A vizsgálatot a 4. rész megfelelő pontja szerint végezzük; a legrövidebb előírt inkubálási időt alkalmazzuk. A megadott mikroorganizmusokat a 4. részben előírt jelző reakciókkal kell kimutatni.



A termék bármilyen antimikrobás hatása a vizsgálati módszer változtatását teszi szükségessé [lásd a 2.6.12 általános cikkely 4-5-3. pontját („B. A harmonizált módszer”)]. Amennyiben nem semlegesíthető az adott termék antimikrobás aktivitása a vizsgálandó mirkoorganizmussal szemben, úgy azt kell feltételezni, hogy a gátolt mikroorganizmus nem lesz jelen a termékben. 4. A TERMÉKEK VIZSGÁLATA 4-1. EPEÁLLÓ GRAM-NEGATÍV BAKTÉRIUMOK 4-1-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk, azzal az eltéréssel, hogy hígítófolyadékként szója-kazein folyékony táptalajt használunk. Az összekeverést követően a mintát 20– 25 °C-on annyi ideig inkubáljuk, amely elegendő a baktériumok újraélesztéséhez, szaporodásukhoz azonban nem (általában 2, de legfeljebb 5 óra). 4-1-2. Vizsgálat mikroorganizmus távollétére. Hacsak nincs más előírás. A termék 4-1-1. szerint készített, 1 g-nak megfelelő térfogatát enterobaktériumok dúsítására szánt Mossel-féle táptalajba oltjuk. A beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha telepek nem fejlődnek ki. 4-1-3. Kvantitatív vizsgálat. 4-1-3-1. Kiválasztás és átoltás. A 4-1-1. szerint készített terméket és/vagy annak rendre 0,1, 0,01 és 0,001 g (vagy 0,1, 0,01 és 0,001 ml) terméket tartalmazó hígításait megfelelő mennyiségű enterobaktériumok dúsítására szánt Mossel-féle táptalajba oltjuk. A beoltott táptalajt 30–35 °C-on 24–48 órán át inkubáljuk. Ezt követően a tenyészeteket egyenként glükóztartalmú kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar táptalaj lemezre oltjuk át. A lemezeket 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-1-3-2. Értékelés. A telepek megjelenése pozitív eredményt jelent. Feljegyezzük a termék legkisebb pozitív és a legnagyobb negatív eredményt adó mennyiségét. A 2.6.13.-5. táblázat alapján meghatározzuk a valószínű baktériumszámot.



2.6.13.-5. táblázat – Az eredmények értékelése

0,1 g vagy 0,1 ml

0,01 g vagy 0,01 ml

0,001 g vagy 0,001 ml

Valószínű baktériumszám 1 g termékre vonatkoztatva

+

+

+

>103

+

+

–

>102 és <103

+

–

–

>10 és <102

–

–

–

<10

Az egyes termékmennyiségek esetén kapott eredmények

4-2. ESCHERICHIA COLI 4-2-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szójakazein folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30– 35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-2-2. Kiválasztás és átoltás. A tartály összerázását követően 1 ml szója-kazein folyékony táptalajt 100 ml MacConkey-táptalajba viszünk át, és a keveréket 42–44 °C-on 24–48 órán át inkubáljuk. Ezt követően Mac Conkey-agar-lemezre átoltva a lemezt 30–35 °C-on 18–72 órán át inkubáljuk. 4-2-3. Értékelés. A telepek megjelenése E. coli lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-3. SALMONELLA 4-3-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A minta 10 g, ill. 10 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 34. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk.



4-3-2. Kiválasztás és átoltás. 10 ml szója-kazein folyékony táptalajt 10 ml Salmonella dúsítására szánt Rappaport Vassiliadis-táptalajba viszünk át, és a keveréket 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. Ezt követően xilóz-lizindezoxikolát-agar táptalajra átoltást végzünk, majd a lemezeket 30–35 °C-on 18–48 órán át inkubáljuk. 4-3-3. Értékelés. Jól fejlett, vörös, esetleg fekete centrummal rendelkező telepek megjelenése Salmonella lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 4-4-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szójakazein folyékony táptalajba oltjuk. Amennyiben transzdermális tapaszokat vizsgálunk, a minta 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer” 4-5-1. pont) leírtak alapján készült 1 tapasznak megfelelő térfogatát steril membránszűrőn szűrjük, majd 100 ml szója-kazein folyékony táptalajba visszük. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-4-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás cetrimid-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30–35 °C, időtartama 18–72 óra. 4-4-3. Értékelés. A telepek megjelenése P. aeruginosa lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS 4-5-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szójakazein folyékony táptalajba oltjuk. Amennyiben transzdermális tapaszokat



vizsgálunk, a minta 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer” 4-5-1. pont) leírtak alapján készült 1 tapasznak megfelelő térfogatát steril membránszűrőn szűrjük, majd 100 ml szója-kazein folyékony táptalajba visszük. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-5-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás mannit-nátrium-klorid-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30–35 °C, időtartama 18–72 óra. 4-5-3. Értékelés. Sárga/fehér, sárga zónával körülvett telepek megjelenése S. aureus lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-6. CLOSTRIDIUMOK 4-6-1. Mintaelőkészítés és hőkezelés. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A mintából 2 egyenlő, a vizsgálandó termék 1 g-jának vagy 1 ml-ének megfelelő mennyiségű adagot veszünk., amelyek közül az egyiket 10 percig 80 °C-on melegítjük, majd gyorsan lehűtjük, a másikat viszont nem melegítjük. 4-6-2. Kiválasztás és átoltás. A homogenizált aliquotok 10–10 ml-ét két, egyenként 100 ml clostridiumokhoz készült megerősített táptalajt tartalmazó (38 × 200 mm-es vagy más alkalmas méretű) tartályba visszük. A tartályokat anaerob körülmények között 30–35 °C-on 48 órán át inkubáljuk, majd mindkét edényből Columbia-agar táptalajra átoltást végzünk, amelyet ismét 30–35 °C-on 48 órán át inkubálunk. 4-6-3. Értékelés. Endospórás vagy endospóráktól mentes, negatív kataláz-reakciót adó anaerob pálcák telepeinek megjelenése clostridiumok jelenlétére utal. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a Columbia-agaron nem fejlődnek ki anaerob telepek, vagy ha a kataláz-reakció pozitív. 4-7. CANDIDA ALBICANS 4-7-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy legalább 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét 100 ml Sabouraud-glükóz folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 3–5 napig inkubáljuk.



4-7-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás Sabouraud-glükóz-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30–35 °C, időtartama 24–48 óra. 4-5-3. Értékelés. Fehér telepek megjelenése C. albicans lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. A fejezet következő része tájékoztató jellegű. 5. AJÁNLOTT OLDATOK ÉS TÁPTALAJOK A következő oldatok és táptalajok bizonyultak alkalmasnak a mikrobiológiai szennyezésekre előírt gyógyszerkönyvi vizsgálatokhoz. Más táptalajok is használhatók, ha a vizsgálandó mikroorganizmusokra nézve hasonló növekedéselősegítő és gátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Tompító törzsoldat. Egy 1000 ml-es mérőlombikban 34 g kálium-dihidrogénfoszfátot 500 ml tisztított vízben oldunk. Az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,2 ± 0,2-re állítjuk be, majd térfogatát tisztított vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. Homogenizálást követően a tompítóoldatot tartályokba töltjük, sterilezzük és 2–8 °Con tároljuk. Foszfát–tompítóoldat (pH 7,2). A tompító törzsoldatot tisztított vízzel 1:800 V/V arányban elegyítjük. Az oldatot sterilezzük. Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát

3,6 g 7,2 g; 0,067 M foszfáttal egyenértékű

Nátrium-klorid

4,3 g


1,0 g

Tisztított víz

Az oldatot autoklávban validált ciklust alkalmazva sterilezzük.

1000 ml



Szója-kazein folyékony táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

17,0 g


3,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g


2,5 g


2,5 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Szója-kazein-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

15,0 g


5,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar Tisztított víz

15,0 g 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Sabouraud-glükóz-agar táptalaj Glükóz

40,0 g

Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) és kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) 1:1 arányú elegye

10,0 g

Agar

15,0 g



Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Burgonya-glükóz-agar táptalaj Burgonyafőzet

200 g

Glükóz

20,0 g

Agar

15,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Sabouraud-glükóz folyékony táptalaj Glükóz

20,0 g

Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) és kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) 1:1 arányú elegye

10,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumok vizsgálatához Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g


5,0 g


20,0 g


2,0 g


8,0 g



Brillantzöld

15 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt 100 °C-on 30 percig melegítjük, majd késedelem nélkül lehűtjük. Kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar táptalaj glükózzal Élesztőkivonat

3,0 g


7,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g


10,0 g

Agar

15,0 g

Neutrálvörös

30 mg

Kristályibolya

2 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy melegítés után 25 °C-on mért értéke 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Autoklávban nem szabad hevíteni. MacConkey-féle folyékony táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

20,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g


5,0 g

Brómkrezolbíbor Tisztított víz

10 mg 1000 ml



A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. MacConkey-agar táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Pepton (hús- és kazeinpepton) Laktóz-monohidrát

17,0 g 3,0 g 10,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Agar Neutrálvörös Kristályibolya Tisztított víz

13,5 g 30,0 mg 1 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,1 ± 0,2 legyen. A táptalajt állandó rázogatás közben 1 percen át forraljuk, majd autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Rappaport Vassiliadis folyékony dúsító táptalaj Salmonella-hoz Szójapepton Magnézium-klorid-hexahidrát

4,5 g 29,0 g

Nátrium-klorid

8,0 g

Dikálium-foszfát

0,4 g


0,6 g

Malachitzöld

0,036 g

Tisztított víz

1000 ml



Az oldást enyhe melegítés mellett végezzük. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük, 115 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten. A melegítést és az autoklávozást követően a táptalaj pH-ja 25 °C-on mérve 5,2 ± 0,2 legyen. Xilóz-lizin-dezoxikolát-agar táptalaj Xilóz

3,5 g

L-lizin

5,0 g

Laktóz-monohidrát

7,5 g

Szacharóz

7,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Fenolvörös

80 mg

Agar

13,5 g


2,5 g


6,8 g

Ammónium-vas(III)-citrát

0,8 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy melegítés után 25 °C-on mért értéke 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. Cetrimid-agar táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Magnézium-klorid Kálium-szulfát Cetrimid

20,0 g 1,4 g 10,0 g 0,3 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Agar

Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. – 34 13,6 g

Tisztított víz

1000 ml

Glicerin

10,0 ml

A táptalajt rázogatás közben forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Mannit-nátrium-klorid-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

5,0 g

Állati szövet (pepszin-hidrolizátum)

5,0 g

Marhahúskivonat

1,0 g

D-mannit

10,0 g

Nátrium-klorid

75,0 g

Agar

15,0 g

Fenolvörös

0,025 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalajt rázogatás közben forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Folyékony megerősített táptalaj clostridiumokhoz Marhahúskivonat

10,0 g

Pepton

10,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Oldható keményítő

1,0 g




5,0 g


0,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Nátrium-acetát

3,0 g

Agar

0,5 g

Tisztított víz

1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 6,8 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Columbia-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g

Húspepton (pepszin-hidrolizátum)

5,0 g

Szívpepton (pankreász-hidrolizátum)

3,0 g

Élesztőkivonat

5,0 g

Kukoricakeményítő

1,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar (gélképző-képességtől függően) Tisztított víz

10,0–15,0 g 1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 7,3 ± 0,2 legyen. Autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük, majd 45-50 °C-ig hagyjuk lehűlni. A táptalajhoz szükség esetén 20 mg gentamicinbázisnak megfelelő mennyiségű gentamicin-szulfátot adunk, majd Petricsészékbe osztjuk szét.

2.6.7. Mikoplazmák


01/2007:20607

2.6.7. MIKOPLAZMÁK Ahol a mikoplazmák vizsgálatát törzs-sejtbank, szaporító sejtbank, vírus oltócsíra-tétel vagy kontrollsejtek vizsgálatára írják elő, a tenyésztéses módszert és az indikátoros sejttenyésztéses módszert egyaránt használhatjuk. Amennyiben vírusaratás, letöltés előtti késztermék vakcina vagy kész gyártási tétel vizsgálatát írják elő, a tenyésztéses módszert alkalmazzuk. Az indikátoros sejttenyésztéses módszert, ha szükséges, táptalajok kiválasztásához is alkalmazhatjuk. TENYÉSZTÉSES MÓDSZER A TÁPTALAJ KIVÁLASZTÁSA A vizsgálat során elegendő számú szilárd és folyékony táptalajt használunk annak érdekében, hogy a vizsgálandó termékben esetleg jelen lévő kisszámú mikoplazma növekedését mindenképpen biztosítsuk a választott inkubációs körülmények között. A folyékony táptalajoknak fenolvöröst kell tartalmazniuk. A választott táptalajoknak – legalább az alább felsorolt mikroorganizmusokat illetően – megfelelő mértékű mikroorganizmus-növekedést elősegítő képességgel kell rendelkezniük. Az alább felsorolt mikroorganizmusokra vonatkozó mikroorganizmus-növekedést elősegítő képességet a táptalaj minden új gyártási tételére különkülön igazolni kell. Amikor a terméket mikoplazmákra vizsgáljuk, a következő fajok közül legalább egyet pozitív kontrollként be kell vonni a vizsgálatba: – Acholeplasma laidlawii (ember- és állatgyógyászati vakcinák, ha az előállítás folyamán antibiotikumot használtak); – Mycoplasma gallisepticum (ha az előállítás folyamán madár eredetű anyagot használtak, vagy ha a vakcinát szárnyasok oltására szánják); – Mycoplasma hyorhinis (nem madár eredetű állatgyógyászati vakcinák); – Mycoplasma orale (ember- és állatgyógyászati vakcinák); – Mycoplasma pneumoniae (embergyógyászati vakcinák), vagy más megfelelő D-glükóz fermentáló faj, pl. Mycoplasma fermentans; – Mycoplasma synoviae (ha az előállítás folyamán madár eredetű anyagot használtak, vagy ha a vakcinát szárnyasok oltására szánják). A vizsgálati törzseket természetes környezetből izolálják és korlátozott számú, legfeljebb tizenötszöri átoltás után fagyasztva vagy liofilizálva tárolják. Klónozás után a törzseket pl. az alább felsorolt típusok tenyészeteivel történő összehasonlítás útján azonosítani kell.

2.6.7. Mikoplazmák


A. laidlawii

NCTC 10116

CIP 75.27

ATCC 23206

M. gallisepticum

NCTC 10115

CIP 104967

ATCC 19610

M.fermentans

NCTC 10117

CIP 105680

ATCC 19989

M. hyorhinis

NCTC 10130

CIP 104968

ATCC 17981

M. orale

NCTC 10112

CIP 104969

ATCC 23714

M. pneumoniae

NCTC 10119

CIP 103766

ATCC 15531

M. synoviae

NCTC 10124

CIP 104970

ATCC 25204

AZ INKUBÁLÁS KÖRÜLMÉNYEI A folyékony táptalajokat szorosan lezárt tartályokban 35–38 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A szilárd táptalajokat mikroaerofil körülmények (5–10% szén-dioxidot tartalmazó nitrogén és megfelelő, az agarfelület kiszáradását megakadályozó nedvességtartalom) között 35–38 °C hőmérsékleten inkubáljuk. MIKROORGANIZMUSOK NÖVEKEDÉSÉT ELŐSEGÍTŐ KÉPESSÉG A mikroorganizmusok növekedését elősegítő képesség vizsgálatát a táptalaj minden új tételével el kell végezni. A választott táptalajokat beoltjuk a megfelelő teszt-mikroorganizmusokkal; egy 60 mm átmérőjű, 9 ml szilárd táptalajt tartalmazó lemez, illetve egy megfelelő folyékony táptalajt tartalmazó 100 ml-es tartály beoltásához legfeljebb 100 CFU-t (telepképző egységet) használunk. Mindegyik mikroorganizmus-fajhoz külön lemezt, illetve tartályt használunk. A táptalajokat inkubáljuk és megadott időközönként átoltást végzünk 0,2 ml folyékonyt táptalajjal szilárd táptalajra (lásd alább „A vizsgálandó termék vizsgálata mikoplazmákra” című részt). A szilárd fázis megfelel a vizsgálat követelményének, ha minden teszt-mikroorganizmusból kb. 100 CFU jelenik meg. A folyékony táptalaj megfelel a vizsgálat követelményének, ha a folyékony táptalajból átoltott agarlemezeken minden egyes mikroorganizmus legalább 1 átoltása baktériumszaporodást eredményez. GÁTLÓ HATÁSÚ ANYAGOK A gátló hatású anyagokra vonatkozó vizsgálatot egy adott termék esetében egyszer végezzük el. Amennyiben a gyártási eljárásban olyan változás következik be, amely befolyásolhatja a mikoplazmák kimutatását, a vizsgálatot meg kell ismételni. A gátló hatású anyagok hiányának bizonyítása céljából a termék jelenlétében és távollétében elvégezzük a szaporodást elősegítő képesség vizsgálatát. Ha a mikroorganizmusok szaporodása a termék távollétében több, mint egy átoltással előbb jelenik meg, mint a termék jelenlétében, vagy ha a vizsgálandó termékkel közvetlenül beoltott lemezeken megjelenő mikroorganizmus-telepek száma kevesebb, mint 1/5-e a be nem oltott lemezeken megjelenőknek, akkor gátló hatású anyagok vannak jelen. Ezeket semlegesíteni kell vagy egyéb módszerrel – pl. gátló hatású anyagot

2.6.7. Mikoplazmák


nem tartalmazó anyagba történő átoltással vagy a vizsgálatot megelőzően a táptalaj nagyobb térfogatra hígításával – kell kiküszöbölni. Ha hígítást alkalmazunk, nagyobb táptalaj-térfogatokat használhatunk, vagy az inokulumot több 100 ml-es lombikba oszthatjuk szét. A semlegesítés vagy egyéb eljárás hatékonyságát úgy ellenőrizzük, hogy az eljárást követően megismételjük a gátló hatású anyagokra előírt vizsgálatot. A VIZSGÁLANDÓ TERMÉK MIKOPLAZMA-VIZSGÁLATA Az egyes folyékony táptalajok 100 ml-ét a vizsgálandó termék 10 ml-ével beoltjuk. Amennyiben a termék hozzáadásának hatására jelentős pH-változás figyelhető meg, az eredeti pH-t nátriumhidroxid vagy sósav segítségével újra beállítjuk. Az egyes táptalajlemezekre 0,2–0,2 ml vizsgálandó terméket oltunk. A folyékony táptalajokat 20–21 napig inkubáljuk. A szilárd táptalajok esetén az inkubáció időtartama legalább 14 nap, kivéve a 20–21. napi átoltásának megfelelőket, amelyeknél az inkubálási idő 7 nap. Ezzel egy időben negatív kontrollként valamennyi folyékony táptalaj és agar táptalajlemez 100 ml-ét is inkubáljuk, be nem oltott formában. A beoltást követő 2–4. napon az egyes szilárd táptalajok legalább 1–1 lemezére valamennyi folyékony táptalajból 0,2 ml inokulumot átoltunk. Ezt a műveletet a vizsgálat 6. és 8., 13. és 15., illetve 19. és 21. napja között megismételjük. A folyékony táptalajokat 2–3 naponta megfigyeljük, és amennyiben színváltozást észlelünk, átoltást végzünk. Amennyiben a folyékony táptalajon baktérium- vagy gombaszennyezés fordul elő, a vizsgálat érvénytelen. Ha táptalajonként és beoltási naponként egy vagy több olyan lemez fordul elő, amely nem olvasható le, a vizsgálat szintén érvénytelen. Legalább egy teszt-mikroorganizmus legfeljebb 100 CFU mennyiségének folyékony táptalajba vagy agar táptalajra oltásával a vizsgálatba pozitív kontrollt is beiktatunk. Ahol a mikoplazma-vizsgálatot rendszeresen végzik, ott ajánlatos a tesztmikroorganizmusokat szabályos rotációs rendszerben alkalmazni. A használatos tesztmikroorganizmusokat a „Táptalaj kiválasztása” pont tartalmazza. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE Az előírt inkubációs idő eleteltével minden beoltott szilárd táptalajon mikroszkóp alatt vizsgáljuk a mikoplazmatelepek megjelenését. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha tipikus mikoplazmatelepek nem jelentek meg. Ha bármelyik szilárd táptalajon mikoplazmatelepek figyelhetők meg, a termék nem felel meg a vizsgálat követelményének. A vizsgálat érvénytelen, amennyiben egy vagy több pozitív kontroll nem eredményez mikoplazma-növekedést legalább 1 átoltás-lemezen. A vizsgálat akkor is érvénytelen, ha a negatív kontrollok közül egy vagy több mikoplazma-növekedést eredményez. Ha gyanús telepek figyelhetők meg, megfelelő validált módszert kell használni annak megállapítására, hogy mikoplazmáktól erednek-e. A következő rész tájékoztató jellegű. A TENYÉSZTÉSES MÓDSZERHEZ AJÁNLOTT TÁPTALAJOK A következő táptalajok használata ajánlott. Más táptalajt is használhatunk, feltéve, hogy minden egyes gyártási tétele bizonyítottan képes fenntartani a mikoplazmák szaporodását, a vizsgálandó termék jelenlétében és távollétében egyaránt.

2.6.7. Mikoplazmák


HAYFLICK-TÁPTALAJOK (A MIKOPLAZMÁK ÁLTALÁNOS KIMUTATÁSÁRA AJÁNLOTT) Folyékony táptalaj Szarvasmarhaszív bouillon (1)

90,0 ml

Lószérum (nem hőkezelt)

20,0 ml

Élesztőkivonat (250 g/l)

10,0 ml

Fenolvörös (0,6 g/l töménységű oldat) Penicillin (20000 NE/ml) Dezoxiribonukleinsav (2 g/l töménységű oldat)

5,0 ml 0,25 ml 1,2 ml

A táptalaj pH-ját 7,8-re állítjuk be. Szilárd táptalaj A fenti előirat szerint készítjük, azzal az eltéréssel, hogy szarvasmarhaszív bouillon helyett literenként 15 g agart tartalmazó szarvasmarhaszív bouillon-agart alkalmazunk. FREY-TÁPTALAJOK (M. SYNOVIAE KIMUTATÁSÁRA AJÁNLOTT) Folyékony táptalaj Szarvasmarhaszív bouillon (1) Esszenciális vitaminok (2)

90,0 ml 0,025 ml

Glükóz-monohidrát (500 g/l töménységű oldat)

2,0 ml

Sertésszérum (56 °C-on 30 perc alatt inaktivált)

12,0 ml

β-Nikotinamid-adenin-dinukleotid (10 g/l töménységű oldat)

1,0 ml

Cisztein-hidroklorid (10 g/l töménységű oldat)

1,0 ml

Fenolvörös (0,6 g/l töménységű oldat)

5,0 ml

Penicillin (20000 NE/ml)

0,25 ml

A β-nikotinamid-adenin-dinukleotid és a cisztein-hidroklorid oldatait összekeverjük és 10 perc elteltével adjuk a többi összetevőhöz. A táptalaj pH-ját 7,8-re állítjuk be. Szilárd táptalaj Szarvasmarhaszív bouillon (1) Tisztított agar (3)

90,0 ml 1,4 g

2.6.7. Mikoplazmák


A pH-t 7,8-re beállítjuk, majd autoklávban történő sterilezést követően a következő összetevőket adjuk a keverékhez: Esszenciális vitaminok (2) Glükóz-monohidrát (500 g/l töménységű oldat) Sertésszérum (nem hőkezelt)

0,025 ml 2,0 ml 12,0 ml

β-Nikotinamid-adenin-dinukleotid (10 g/l töménységű oldat)

1,0 ml

Cisztein-hidroklorid (10 g/l töménységű oldat)

1,0 ml

Fenolvörös (0,6 g/l töménységű oldat)

5,0 ml

Penicillin (20000 NE/ml)

0,25 ml

FRIIS-TÁPTALAJOK (NEM MADÁR EREDETŰ MIKPOLAZMÁK KIMUTATÁSÁRA AJÁNLOTT) Folyékony táptalaj Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (módosított) (4)

800 ml

Desztillált víz

67 ml

Agyvelő-szív-főzet

135 ml

PPLO-bouillon (6)

248 ml

Élesztőkivonat (170 g/l)

60 ml

Bacitracin

250 mg

Meticillin

250 mg

Fenolvörös (5 g/l)

4,5 ml

Lószérum

165 ml

Sertésszérum

165 ml

A táptalaj pH-ját 7,40–7,45 értékre állítjuk be. Szilárd táptalaj Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (módosított) (4)

200 ml

DEAE-dextrán

200 mg

Tisztított agar (3)

15,65 g

Alapos összekeverés után a keveréket autoklávban sterilezzük, majd 100 °C-ra hűtjük és a fent előírt táptalaj 1740 ml-éhez elegyítjük.

2.6.7. Mikoplazmák


(1) Szarvasmarhaszív-bouillon Szarvasmarhaszív (bouillon készítéséhez) Pepton Nátrium-klorid Desztillált víz

500 g 10 g 5g ad 1000 ml

A keveréket autoklávban sterilezzük. (2) Esszenciális vitaminok Biotin

100 mg

Kalcium-pantotenát

100 mg

Kolin-klorid

100 mg

Folsav

100 mg

i-Inozit

200 mg

Nikotinamid

100 mg

Piridoxál-hidroklorid

100 mg

Riboflavin Tiamin-hidroklorid Desztillált víz

10 mg 100 mg ad 1000 ml

(3) Tisztított agar Immunológiai és mikrobiológiai célra szánt, különlegesen nagy tisztaságot, átlátszóságot és erős gélképző tulajdonságot eredményező ioncserélő eljárással előállított, nagy tisztaságú agar. Hozzávetőleges összetétele: Víz

12,2%

Hamu

1,5%

Savban oldhatatlan hamu

0,2%

Klór

0

Foszfát (P2O5-ban kifejezve)

0,3%

Összes nitrogén

0,3%

Réz

8 ppm

Vas

170 ppm

Kalcium

0,28%

2.6.7. Mikoplazmák Magnézium

Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6. – 7 0,32%

(4) Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (módosított) Nátrium-klorid

0,4 g

Kálium-klorid

0,32 g

Magnézium-szulfát-heptahidrát

0,08 g

Magnézium-klorid-hexahidrát

0,08 g

Kalcium-klorid, vízmentes Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát Kálium-dihidrogén-foszfát, vízmentes Desztillált víz

0,112 g 0,0596 g 0,048 g ad 800 ml

(5) Agyvelő-szív-főzet Borjú agyvelő-főzet

200 g

Szarvasmarhaszív-főzet

200 g

Proteóz-pepton

10 g


2g

Nátrium-klorid

5g

Dinátrium-hidrogén-foszfát, vízmentes Desztillált víz

2,5 g ad 1000 ml

(6) PPLO bouillon Szarvasmarhaszív-főzet

50 g

Pepton

10 g

Nátrium-klorid Desztillált víz

5g ad 1000 ml

INDIKÁTOROS SEJTTENYÉSZTÉSES MÓDSZER A sejttenyészeteket egy, a DNS-hez kötődő fluoreszkáló festékkel festjük. A mikoplazmákat a sejtek felületén, erősebb mikoplazmaszennyezettség esetén a sejtek környezetében is megjelenő, jellegzetes szemcsés vagy szálas fluoreszcencia-mintázatuk alapján mutatjuk ki. A citoplazma mitokondriumai is színeződhetnek, ezek azonban határozottan megkülönböztethetők a mikoplazmáktól.

2.6.7. Mikoplazmák


Ha vírusszuszpenziók esetében az eredmények értelmezését jelentős sejtkárosító hatások befolyásolják, a vírus semlegesíthető olyan specifikus antiszérummal, amely nem gátolja a mikoplazmákat, illetve olyan sejttenyészet-szubsztrátumot is alkalmazhatunk, amelyben a vírus nem szaporodik. Annak igazolására, hogy a szérum nem rendelkezik gátló hatással, a pozitív kontroll vizsgálatokat az antiszérum jelenlétében és távollétében is elvégezzük. A SZUBSZTRÁTUM ALKALMASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA A mikoplazmák kimutatására Vero sejteket vagy más, azonos hatékonyságú sejttenyészetet (pl. a termelő sejtvonalat) használunk. A felhasznált sejtek hatékonyságát az alább leírt eljárással vizsgáljuk. M. hyorhinis és M. orale megfelelő referenciatörzseiből legfeljebb 100 CFU-nak vagy 100 CFU-analóg egységnek megfelelő mennyiségű mikroorganizmust oltunk be. A következő törzsek alkalmasnak bizonyultak: M. hyorhinis M. orale

ATCC 29052 NCTC 10112

CIP 104969

ATCC 23714

A sejtek abban az esetben alkalmasak, ha mindkét referenciatörzs kimutatható. Az indikátorsejteket a vizsgálatot megelőzően, antibiotikumok alkalmazása nélkül át kell oltani. VIZSGÁLATI MÓDSZER 1. Megfelelő sűrűségű (2×104–2×105 sejt/ml, 4×103–2,5×104 sejt/cm2) sejttenyészetet készítünk, amely 3 nap után a sejtek összefolyását eredményezi. A vizsgálandó termék 1 ml-ét a sejttenyészetet tartalmazó edénybe oltjuk és 35–38 °C-on inkubáljuk. 2. Legalább 3 napos inkubálást követően, amikor a sejtek összefolyása megtörtént, megfelelő tartályokba helyezett fedőlemezekre vagy más alkalmas felületre (pl. üreges lemezre) átoltást végzünk. A sejtekből kis sűrűségű tenyészetet készítünk úgy, hogy 3–5 nap inkubálás után 50%os összefolyást érjünk el. A teljes összefolyást el kell kerülni, mert rontja a mikoplazmák láthatóságát a festést követően. 3. Eltávolítjuk a táptalajt, és az egysejtrétegű idikátorsejt-tenyészetet R sós foszfát–tompítóoldattal (pH 7,4) mossuk, és alkalmas fixálóoldatot adunk hozzá. (Ha R biszbenzimidet használunk festésre, fixáló oldatként 1 térfogat R tömény ecetsav és 3 térfogat R metanol elegye megfelel). 4. A fixálóoldatot eltávolítjuk, és a sejteket steril R vízzel mossuk. A lemezeket – amennyiben a festés több mint 1 óra elteltével történik – teljesen meg kell szárítani. (A szárítást követően festett lemezekre különös figyelmet kell fordítani, az esetlegesen keletkező melléktermékek miatt.) 5. A lemezeket – alkalmas DNS-festék hozzáadását követően – megfelelő ideig állni hagyjuk. (R biszbenzimid–oldat alkalmazása esetén 10 perc megfelelő.)

2.6.7. Mikoplazmák


6. A festéket eltávolítjuk, és a sejtréteget R vízzel mossuk. 7. Adott esetben a fedőlemezekre pl. R glicerin és R foszfát-citrát–tompítóoldat (pH 5,5) 1:1 arányú elegyéből 1–1 cseppet viszünk. Legalább 400-szoros nagyítás mellett fluoreszcenciás kiértékelést végzünk. (Biszbenzimid festék alkalmazásakor 330/380 nm gerjesztő fényszűrő és LP 440 nm záró fényszűrő megfelelő.) 8. A vizsgált tenyészetek sejtmagon kívüli fluoreszcenciájának mikroszkópos képét összehasonlítjuk a negatív és pozitív kontrollokkal. A mikoplazmák pontok vagy szálak formájában jelennek meg az indikátorsejtek citoplazmájában és esetenként a sejtek közötti térben is. A validálás során készült előírás alapján több mikroszkópos teret vizsgálunk. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE A vizsgált termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha mikoplazmára jellemző fluoreszcencia nem jelenik meg. Amennyiben a pozitív kontrollokban nem látható a mikoplazmákra jellemző fluoreszcencia, a vizsgálat nem értékelhető. Nem értékelhető a vizsgálat továbbá akkor sem, ha a negatív kontrollban megjelenik a mikoplazmákra jellemző fluoreszcencia.

„A humán VII. véralvadási faktor hatóértékének meghatározása” (2.7.10) c. fejezet változásai: 213. oldal A fejezet azonosító számot kap: 01/2005:20710 javított 5.6. A cikkely a második és a harmadik bekezdés között új bekezdéssel egészül ki: „A BRP humán VII. véralvadási faktor koncentrátumot – a Nemzetközi Standarddal összehasonlítva – Nemzetközi Egységekre kalibrálják.” A harmadik bekezdés második mondatában az „alkalmas mérési feltételek” szövegrész helyesen: „megfelelő mérési feltételek”. 214. oldal Az első hasáb ötödik sorában a „kedvező esetben 14–70 nmol/l” szövegrész helyesen: „lehetőleg 14– 70 nmol/l”.

Poliomielitisz vakcina (inaktivált) hatóértkének…

Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.6 -1

01/2007:20720

2.7.20. POLIOMIELITISZ VAKCINA (INAKTIVÁLT) HATÓÉRTÉKÉNEK IN VIVO MEGHATÁROZÁSA A vakcina neutralizáló antitestek képződését indukáló képessége in vivo a következő módszerek egyikével határozható meg. VIZSGÁLAT CSIRKÉKEN VAGY TENGERIMALACOKON A vizsgálandó vakcinából megfelelő tompított fiziológiás sóoldattal legalább három oldatból álló hígítási sorozatot készítünk. 250–350 g testtömegű tengerimalacokat vagy háromhetes csirkéket tizes csoportokra osztunk és a vakcinahígításokat egy-egy csoporthoz rendeljük. Valamennyi állatba 0,5 ml-t fecskendezünk intramuszkulárisan a csoportjához rendelt hígításból. Az állatoktól öt-hat nap elteltével vért veszünk és a szérumot elválasztjuk. A szérumokat négyszeres hígításában ellenőrizzük az 1-es, 2-es és 3-as típusú humán poliovírusokat neutralizáló antitestek jelenlétére. A hígított szérumot elkeverjük 100 CCID50 vírussal, a keveréket 37 °C-on 4,5–6 órán át inkubáljuk. Amennyiben szükséges, az adatállandóság érdekében, a szérumokat 12–18 órán át 5 ± 3 °C-on tartjuk. A keverékeket a nem-semlegesített vírusok kimutatása céljából sejttenyészetekbe oltjuk, és az eredményeket a beoltást követő hét napon át követjük. Feljegyezzük, hogy egy-egy állatcsoportban mennyi a neutralizáló antitesteket tartalmazó szérumok száma, és kiszámoljuk azt a vakcinahígítást, amely az állatok 50%-ánál antitest-választ ad. Ezzel egyidejűleg, megfelelő referenciakészítménnyel kontrollvizsgálatot végzünk. A vakcina megfelel a követelményeknek, ha százszoros vagy ennél nagyobb hígításban mindhárom típusú vírusra antitest-választ vált ki az állatok 50%-ánál. VIZSGÁLAT PATKÁNYOKON Megfelelő az olyan in vivo vizsgálati módszer, amelyben a vizsgált vakcina és egy referenciavakcina 3–3 különböző hígítását intramuszkulárisan a patkányok hátsó végtagjába fecskendezzük; a hígítások mindegyikét egy–egy tíz – megfelelő törzsből származó, meghatározott kórokozóktól mentes – patkányból álló csoporthoz rendeljük. Ahhoz, hogy mindhárom szerotípusra értékelhető eredményeket kapjunk, gyakran négy hígításra van szükség. A validitási követelményeknek megfelelő eredmények elérése érdekében egy-egy csoportban megfelelő számú állatnak kell lennie; általában elegendő, ha egy csoportban 10



egyed van, de előfordulhat, hogy kisebb csoportokkal is értékelhető eredményeket kapunk. Amennyiben különböző nemű állatokat használunk, a hímek és nőstények eloszlásának az egyes csoportokban egyenletesnek kell lennie. Az állatok testtömege 175 és 250 g között megfelelőnek tekinthető. Állatonként 0,5 ml vakcinát alkalmazunk. A dózistartományt úgy választjuk meg, hogy mindhárom poliovírus-típusra megfelelő dózis-válasz összefüggést nyerjünk. Az állatoktól 20– 22 nap múlva vért veszünk. A neutralizációs titereket mindhárom típusú poliovírus ellen külön-külön határozzuk meg. A meghatározás során felülfertőző vírusként a Sabin-törzsekből 100 CCID50-t, indikátorsejtekként Vero-t vagy Hep2-t alkalmazunk; a semlegesítési körülmények: 3 órán át 35–37 °C, majd – szükség esetén, az eredmények állandósága érdekében – 18 órán át 2–8 °C. Az eredményeket hétnapos, 35 °C-on történő inkubálást követő fixálás és festés után olvassuk le. Az antitest-meghatározást akkor tekinthetjük érvényesnek, ha a felülfertőző vírusok mindegyikének titere bizonyítottan 10 és 1000 CCID50 közé esik és ha a kontroll-szérum neutralizáló-antitest-titere a szérum-titerek mértani középértékénél legfeljebb két felező hígítási lépéssel tér el. A hatóértéket úgy számítjuk ki, hogy a vizsgálandó vakcinára és a referenciavakcinára válaszoló egyedek arányát a probit-módszer segítségével, vagy – validálás után – a párhuzamos egyenesek módszerével hasonlítjuk össze. Amennyiben a probitmódszert alkalmazzuk, a válaszoló egyed definiálása érdekében, mindegyik poliovírus-típusra meg kell állapítani a válaszhatárnak (cut-off) számító neutralizációs-antitest-titer határértéket. A laboratóriumok közti különbözőségek nem teszik lehetővé olyan határértékek megállapítását, amelyek valamennyi laboratórium számára alkalmazhatók. Ezért a határérték meghatározása minden egyes laboratórium esetében külön történik, oly módon, hogy a referencia-vakcinát egy legalább három vizsgálatból álló vizsgálatsorozatnak vetjük alá. A három, vagy ennél több vizsgálatból álló sorozatban megállapított titerek legkisebb és legnagyobb geometriai középértékének a log2-skálán leolvasott középpontját használjuk válaszhatár értékként. A vakcina hatóértéke egyik poliovírus-típus esetében sem lehet szignifikánsan kisebb, mint a referenciakészítményé. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha

− a vizsgálandó és a referencia-vakcina ED50 értéke a vizsgálat során az állatoknak beadott legkisebb és legnagyobb dózis közé esik,

− a statisztikai analízis nem mutat szignifikáns eltérést a linearitástól, ill. a párhuzamosságtól,

− a megállapított relatív hatóérték megbízhatósági határai (P = 0,95) a becsült hatóérték 25 és 400 %-a közé esnek.



A következő rész tájékoztató jellegű.

Irányelv az inaktivált poliomielitisz vakcina, valamint kombinációi in vivo hatóérték-meghatározásának elhagyásáról Ez az irányelv a poliovírus vad törzseiből származó vakcinákra vonatkozik. Az itt közölt validálást minden termék esetében el kell végezni, mielőtt eltekintenénk az in vivo hatóérték-meghatározástól. Az eljárást minden olyan esetben meg kell ismételni, amikor a gyártási folyamatban olyan változás történt, amely hatással lehet az in vitro vagy az in vivo hatóérték-meghatározásra. A kísérleti és más tudományos célokra felhasznált gerinces állatok védelméről szóló Európai Egyezmény szerint nem végezhetők állatkísérletek abban az esetben, ha tudományos szempontból kielégítő, a gyakorlatban kivitelezhető alternatív lehetőség áll rendelkezésre. Jelen irányelv célja, hogy elősegítse az in vivo hatóérték-meghatározás elhagyását olyankor, amikor egy adott termék esetében az in vitro vizsgálat bizonyíthatóan elegendő mértékben igazolja a kész gyártási tétel megfelelő hatóértékét a rutin ellenőrzés során. In vivo hatóérték-meghatározásra a patkánykísérlet a választandó módszer. Ha egy adott vakcina hatóértékét csirkék vagy tengerimalacok felhasználásával állapítják meg, el lehet tekinteni az in vivo meghatározástól, amennyiben a vakcina előállítása elfogadott előirat szerint történt, továbbá ha a gyártási tételek alább leírt validálási tanulmánya patkánykísérletet is tartalmaz. Az olyan vakcina esetében, amelyet még nem hagytak jóvá, a gyártás állandóságát igazoló adatoknak minden gyártási tételnél tartalmaznia kell a patkánykísérlet eredményét, mielőtt eltekintenénk az in vivo hatóérték-meghatározástól. Miután eltekintettünk az in vivo meghatározástól, a vakcina kész gyártási tételeit az in vitro hatóérték-meghatározás alapján szabadítjuk fel, és az in vivo meghatározást olyan gyártási tétel felszabadításakor sem használhatjuk alternatívaként, amely az in vitro vizsgálat alapján nem bizonyult megfelelőnek. ELJÁRÁS A validációs tanulmány kivitelezése előtt a következő követelményeknek kell megfelelni: –

megfelelő jártasság patkányokon végzett hatóérték-meghatározásban;



–

a D-antigén-meghatározás teljes validációja (linearitás, ismételhetőség, pontosság, torzításmentesség és a mennyiségi meghatározhatóság határértékei);

–

a D-antigén-meghatározás elfogadási követelményeinek rögzítése, megfeleő számú egymást követő kész gyártási tételekre alapozva;

–

az előállítás állandóságának megállapítása a legutóbbi letöltés előtti késztermékek esetében, az újonnan jóváhagyott in vivo hatóértékmeghatározás felhasználásával; a letöltés előtti késztermékeknek meg kell felelniük a D-antigén-maghatározás elfogadási követelményeinek megállapítására használt kész gyártási tételeknek, továbbá reprezentálniuk kell mindhárom poliovírus-típus inaktivált aratását.

A validációs tanulmányt az alábbiakkal kell elvégezni: –

a letöltés előtti késztermék/kész gyártási tétel, amely jellemző a folyamatban lévő előállítási módszerre;

–

két csökentett hatóértékű vakcina; a hatóérték-csökkenést melegítéssel lehet elérni, illetve úgy, hogy a normál vakcinát hőkezelttel elegyítjük; a csökkentett hatóértékű vakcinák várható hatóértéke a letöltés előtti késztermék/kész gyártási tétel hatóértékének kb. fele legyen.

Ezen gyártási tételek hatóértékének meghatározásához referenciastandardként egy homológ gyártási készterméket használunk. A meghatározás a következőképpen történik: –

a vakcina éppen jóváhagyott in vivo meghatározása;

–

patkánykísérlettel, amennyiben az nem azonos a jóváhagyott in vivo meghatározással;

–

D-antigén-meghatározás.

Az in vivo meghatározás abban az esetben hagyható el, ha a letöltés előtti késztermék/kész gyártási tétel megfelel az in vivo és az in vitro meghatározás követelményeinek, és a csökkentett hatóértékű tételek nem felelnek meg a követelményeknek. Amennyiben a csökkentett hatóértékű tétel nem felel meg a Dantigén meghatározás követelmémyének, ugyanakkor megfelel az in vitro meghatározás követelményének, az utóbbi vizsgálat megismételhető.

HEPARIN HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA (2.7.5) c. fejezet változásai: 206. oldal A fejezet cikkelyszámot kap: 01/2007:20705. A 2. bekezdés 1. mondatában a „sertés-bélnyálkahártyájából” kifejezés helyesen „sertésbélnyálkahártyából”. 207. oldal A „Vizsgálat” rész 3. bekezdésének 6–8. („Ezután minden kémcsőbe…” kezdetű rész) mondata a következőképpen változik: „Ezután minden kémcsőbe foszfolipidet és kontakt aktivátort tartalmazó, megfelelő Részlegesen Aktivált Tromboplasztin Idő (APTT) reagens 1,0 ml-ének olyan hígítását mérjük, amely megfelelő, 60 másodpercet meg nem haladó rekalcifikációs időt eredményez a vakpróba esetében. Pontosan 2 perc elteltével a kémcsövek tartalmához R kalcium-klorid 3,7 g/l töménységű, előzetesen 37 ºC-ra melegített oldatából 1– 1 ml-t mérünk, és feljegyezzük az alvadási időt, vagyis azt a másodpercekben kifejezett időtartamot, amely ezen utóbbi reagens hozzáadása és a választott módszer szerint észlelt alvadás kezdete között eltelik.”

Gyógyszeres tartályok (3.2) c. fejezet változásai: 331.oldal A fejezet új azonosító számot kap: 01/2005:30200 javított 5.6

Az „Egyadagos tartály” pont szövege helyesen: Az egyadagos tartály a készítmény teljes egészében vagy részben felhasználásra kerülő, kizárólag egyszeri alkalmazásra szánt mennyiségét tartalmazza.

5.1.4. Gyógyszerkészítmények mikrobiológiai tisztasága


01/2007:50104

5.1.4. GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK MIKROBIOLÓGIAI TISZTASÁGA E fejezet csak tájékoztató, útmató jellegű. Ez az általános fejezet két mikrobiológiai minőségre ajánlott követelményegyüttest tartalmaz. Az első követelményegyüttes megfelel a 2.6.12. és 2.6.13. általános fejezetekben foglalt módszerek 1. csoportjának. Ugyanúgy, ahogy a 2.6.12. és 2.6.13. általános fejezetek 1. csoportjában foglalt vizsgálatokat a jövőben a 2. csoport vizsgálatai váltják fel, a jelen fejezet 1. követelményegyüttesét is a 2. csoport követelményei fogják felváltani. Ahol a hatóság jóváhagyta, ott a 2. követelményegyüttes alkalmazható az első helyett már azelőtt, hogy az utóbbit felváltották volna. A 2. követelményegyüttest a Japán Gyógyszerkönyvvel és az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvével (USP) együttműködésben a harmonizáció megvalósítása céljából fejlesztették ki. A. AZ EURÓPAI GYÓGYSZERKÖNYV MÓDSZERE Az előállítás, a csomagolás, a tárolás és a forgalmazás során megfelelő intézkedéseket kell tenni a készítmények mikrobiológiai tisztaságának biztosítására. A gyógyszerkészítményeknek meg kell felelniük az alábbi követelményeknek. 1. mikrobiológiai tisztasági osztály Ebbe az osztályba azon készítmények sorolhatók, amelyeknél a megfelelő gyógyszerforma cikkely szerint követelmény a sterilitás, továbbá azon egyéb készítmények, amelyek feliratuk (címkéjük) szerint sterilek. – Sterilitási vizsgálat (2.6.1). 2. mikrobiológiai tisztasági osztály Ebbe az osztályba a helyi használatra szánt, valamint a légutakban alkalmazott gyógyszerkészítmények sorolhatók, azon készítmények kivételével, amelyeknél követelmény a sterilitás. Ebbe az osztályba tartoznak a transzdermális tapaszok is. – Összes életképes aerob mikroorganizmusszám (2.6.12). Grammonként vagy milliliterenként, illetve tapaszonként (a ragasztó- és hordozóréteget is beleértve) legfeljebb 102 mikroorganizmus (aerob baktérium és gomba). – Transzdermális tapaszok esetében: egy tapaszt megvizsgálva (a ragasztó- és hordozóréteget is beleértve) enterobaktériumok és bizonyos más Gram-negatív baktériumok nem lehetnek



jelen. Egyéb készítmények esetében: grammonként és milliliterenként legfeljebb 101 enterobaktérium és bizonyos más Gram-negatív baktérium megengedett (2.6.13). – 1 g-ot vagy 1 ml-t, illetve egy tapaszt (a ragasztó- és hordozóréteget is beleértve) megvizsgálva Pseudomonas aeruginosa nem lehet jelen (2.6.13). – 1 g-ot vagy 1 ml-t, illetve egy tapaszt (a ragasztó- és hordozóréteget is beleértve) megvizsgálva Staphylococcus aureus nem lehet jelen (2.6.13). 3. mikrobiológiai tisztasági osztály A. Orálisan és rektálisan alkalmazott gyógyszerkészítmények. – Összes életképes aerob mikroorganizmus-szám (2.6.12). Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 103 baktérium és legfeljebb 102 gomba. – 1 g-ot vagy 1 ml-t megvizsgálva Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13). B. Természetes (állati, növényi vagy ásványi) eredetű kiindulási anyagokat tartalmazó, orális készítmények, melyeknek antimikrobás előkezelése nem lehetséges, és amelyek kiindulási anyagára az illetékes hatóság grammonként vagy milliliterenként 103 életképes mikroorganizmusszámot meghaladó szennyezettséget elfogad. A 4. mikrobiológiai tisztasági osztályba sorolt gyógynövénykészítmények nem tartoznak ide. – Összes életképes aerob mikroorganizmus szám (2.6.12). Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 104 baktérium és legfeljebb 102 gomba. – Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 102 enterobaktérium és bizonyos más Gramnegatív baktérium (2.6.13). – 10 g-ot vagy 10 ml-t megvizsgálva Salmonella nem lehet jelen (2.6.13). – 1 g-ot vagy 1 ml-t megvizsgálva Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13). – 1 g-ot vagy 1 ml-t megvizsgálva Staphylococcus aureus nem lehet jelen (2.6.13). 4. mikrobiológiai tisztasági osztály Ebbe az osztályba azok a gyógynövénykészítmények tartoznak, amelyek kizárólag növényi – egész, aprított vagy porított – drogo(ka)t tartalmaznak. A. Azok a gyógynövénykészítmények, amelyeket felhasználásuk előtt le kell forrázni. – Összes életképes aerob mikroorganizmus szám (2.6.12). Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 107 baktérium és legfeljebb 105 gomba.



– Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 102 Escherichia coli (2.6.13, megfelelő hígításokat alkalmazva). B. Azok a gyógynövénykészítmények, amelyeket nem kell leforrázni felhasználás előtt. – Összes életképes aerob mikroorganizmus szám (2.6.12). Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 105 baktérium és legfeljebb 104 gomba. – Grammonként vagy milliliterenként legfeljebb 103 enterobaktérium és bizonyos más Gramnegatív baktérium (2.6.13). – 1 g-ot vagy 1 ml-t megvizsgálva Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13). – 10 g-ot vagy 10 ml-t megvizsgálva Salmonella nem lehet jelen (2.6.13). B. A HARMONIZÁLT MÓDSZER: NEM STERIL GYÓGYSZERKLSZÍTMÉNYEK ÉS GYÓGYSZERANYAGOK MIKROBIOLÓGIAI TISZTASÁGA Bizonyos mikroorganizmusok jelenléte nem steril készítményekben csökkentheti vagy éppen megszüntetheti a termék terápiás aktivitását és károsan befolyásolhatja a beteg egészségét. A gyártóknak ezért a Helyes Gyártási Gyakorlat (GMP) érvényes irányelveinek betartásával biztosítaniuk kell a kész gyártási tételek alacsony mikrobiológiai terheltségét a gyógyszerkészítmények gyártása, tárolása és forgalmazása során. A nem steril termékek mikrobiológiai ellenőrzését a 2.6.12. és a 2.6.13. általános fejezetekben („B. A harmonizált módszer”) foglalt módszerek szerint kell elvégezni. A nem steril gyógyszerkészítmények összes aerob mikroorganizmusszám (TAMC) és az egyesített összes élesztő-/penészgombaszám (TYMC) meghatározásán alapuló elfogadási követelményeket az 5.1.4-1. és az 5.1.4.-2. táblázat tartalmazza. Az elfogadási követelmények egyedi eredményeken vagy ismételt számlálási eredmények átlagán alapulnak [amennyiben végeztek ismételt számlálásokat (pl. közvetlen lemezes módszerek)]. Az 5.1.4.-1. táblázat azon meghatározott mikroorganizmusok listáját tartalmazza, amelyekre elfogadási követelményeket adtak meg. A lista nem terjed ki szükségszerűen mindenre, és egy adott készítményt szükséges lehet más mikroorganizmusokra (is) megvizsgálni, a kiindulási anyagok természetétől és a gyártási eljárástól függően. Amennyiben bizonyítást nyert, hogy az előírt vizsgálatok egyike sem teszi lehetővé a mikroorganizmusszám meghatározását az előírt szinten, úgy olyan validált módszert kell alkalmazni, amelynek kimutatási határa a lehető legjobban megközelíti a feltüntetett elfogadási követelményt. 5.4.1.-1. táblázat – Nem steril gyógyszerformák mikrobiológiai tisztaságának elfogadási követelményrendszere

5.1.4. Gyógyszerkészítmények mikrobiológiai tisztasága Az alkalmazás módja


TAMC TYMC (CFU/g vagy (CFU/g vagy CFU/ml) CFU/ml)

A meghatározott mikroorganizmusok

Orális alkalmazásra szánt nemvizes készítmények

103

102

Eschericha coli nem lehet jelen (1 gban vagy 1 ml-ben)

Orális alkalmazásra szánt vizes készítmények

102

101

Eschericha coli nem lehet jelen (1 gban vagy 1 ml-ben)

Rektális alkalmazás

103

102

–

Szájnyálkahártyán történő, Fogínyen történő, Bőrön történő, Nazális, Fülészeti alkalmazás

102

101

Staphylococcus aureus és Pseudomonas aeruginosa nem lehet jelen (1 g-ban vagy 1 ml-ben)

Vaginális alkalmazás

102

101

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus és Candida albicans nem lehet jelen (1 g-ban vagy 1 ml-ben)

Transzdermális tapaszok (egy tapaszra vonatkozó határértékek a tapadó- és hordozóréteget is beleértve)

102

101

Staphylococcus aureus és Pseudomonas aeruginosa nem lehet jelen (1 tapaszban)

101

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus és epeálló Gram-negatív baktériumok nem lehetnek jelen (1 g-ban vagy 1 mlben)

104

102

Legfeljebb 102 epetűrő Gram-negatív baktérium lehet jelen (1 g-ban vagy 1 ml-ben) Salmonella nem lehet jelen (10 g-ban vagy 10 ml-ben) Staphylococcus aureus és Escherichia coli nem lehet jelen (1 g-ban vagy 1 ml-ben)

Inhalációs alkalmazás (a porlasztásra szolgéló folyadékokra külön követelmények vannak)

A Ph. Eur. külön követelményei olyan természetes (állati, növényi vagy ásványi) eredetű kiindulási anyagokat tartalmazó orális gyógyszerformákra, amelyeknek antimikrobás előkezelése nem lehetséges, és amelyekre az illetékes hatóság elfogadja, hogy a kiindulási anyag TAMC-értéke meghaladja a 103 CFU/g vagy CFU/mg értéket

102

A Ph. Eur. külön intézkedései olyan gyógynövénykészítményekre, amelyek kizárólag növényi (egész, aprított vagy porított) drogokat tartalmaznak : –

olyan gyógynövénykészítményekre, amelyeket felhasználásuk előtt le kell forrázni

107

105

Legfeljebb 102 CFU Eschericha coli lehet jelen (1 g-ban vagy 1 ml-ben)

–

olyan gyógynövénykészítményekre, amelyeket felhasználásuk előtt nem kell leforrázni

105

104

Legfeljebb 103 epetűrő Gram-negatív baktérium lehet jelen (1 g-ban vagy 1 ml-ben) Eschericha coli nem lehet jelen (1 gban vagy 1 ml-ben) Salmonella nem lehet jelen (10 g-ban vagy 10 ml-ben)



5.1.4.-2. táblázat – Nem steril gyógyszeranyagok mikrobiológiai tisztaságának elfogadási követelményei TAMC (CFU/g vagy CFU/ml)

TYMC (CFU/g vagy CFU/ml)

103

102

Gyógyszeranyagok

Az 5.4.1.-1. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokon kívül mikroorganizmusok jelentősége az alábbi szempontok szerint értékelendő:

kitenyésző

egyéb

– a termék felhasználása: a kockázat az alkalmazási helytől (szem, orr, légutak) függően változik; – a termék sajátsága: mikroorganizmus-növekedést mikrobiológiai tartósítószer jelenléte;

elősegítő

képessége,

megfelelő

– az alkalmazás módja; – a kezelt csoport: a kockázat újszülöttek, csecsemők és legyengültek esetében eltérő lehet; – immunszupresszív szerek, kortikoszteroidok használata; – betegség, sebesült állapot, szervi károsodás. Ahol indokolt, a releváns tényezők kockázat-alapú értékelését mikrobiológiai szakképzettséggel rendelkező és mikrobiológiai adatok értelmezésében járatos személyek végezzék. Nyersanyagok esetén az értékelés során figyelembe kell venni a termék feldolgozását, az adott vizsgálati technológiát és a megkívánt minőségű anyagok hozzáférhetőségét.

ABSINTHII HERBA 1081. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:1380 javított Az „Azonosítás” „C” pontja 2. bekezdésének utolsó sorában „R alkoholban” helyett „R etanolban (96%)” írandó. A „Vizsgálatok” rész „Keserűérték” pontja a következőképpen változik: „Keserűérték (2.8.15): legalább 10 000.”

ACIDUM STEARICUM 1142. oldal

Új cikkelyszám: 01/2007:1474 Az „Azonosítás” B. pontja helyesen: „B. Savszám (2.5.1): 194-212. 0,5 g anyagot vizsgálunk.”

Alcohol cetylicus et stearylicus emulsificans A


01/2007:0801

ALCOHOL CETYLICUS ET STEARYLICUS EMULSIFICANS A A-típusú emulgeáló cetil-sztearil-alkohol DEFINÍCIÓ Cetil-sztearil-alkohol és nátrium-cetil-sztearil-szulfát keveréke. Az anyag megfelelő tompítóanyagot tartalmazhat. Tartalom: –

cetil-sztearil-alkohol: legalább 80,0% (vízmentes anyagra);

–

nátrium-cetil-sztearil-szulfát: legalább 7,0% (vízmentes anyagra).

SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy halványsárga, viasszerű tömeg vagy lemezek, pelyhek, esetenként szemcsék. Oldékonyság: forró vízben opálos oldat képződése közben oldódik; hideg vízben gyakorlatilag nem oldódik; etanolban (96%) kevéssé oldódik. AZONOSÍTÁS Első azonosítás: B, C, D. Második azonosítás: A, C. A. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat (a). 0,1 g vizsgálandó anyagot vízfürdőn melegítve 10 ml R trimetilpentánban oldunk. Az oldatot 2 ml R etanollal (70 %V/V) összerázzuk. A fázisok szétválása után az alsó fázist b) vizsgálati oldatként használjuk fel. A felső fázis 1 ml-ét R trimetilpentánnal 8 ml-re hígítjuk. Vizsgálati oldat (b). Az a) vizsgáltai oldat készítése során nyert alsó fázis.



Összehasonlító oldat (a). 24 mg R cetil-sztearil-alkoholt és 16 mg CRS sztearil-alkoholt 10 ml R trimetilpentánban oldunk. Összehasonlító oldat (b). 20 mg R nátrium-cetil-sztearil-szulfátot vízfürdőn melegítve 10 ml R etanolban (70 %V/V) oldunk. Lemez: R VRK szilanizált szilikagél lemez. Kifejlesztőszer: R víz – R aceton – R metanol (20+40+40 V/V). Felvitel: 2 μl. Kifejlesztés: 12 cm-es fronttávolságig. Szárítás: levegőn. Előhívás: a lemezt R foszfor-molibdénsav R etanollal (96%) készült 50 g/l töménységű oldatával bepermetezzük, és a foltok megjelenéséig (kb. 3 óra) 120 °C-on melegítjük. Értékelés: –

az a) vizsgálati oldat kromatogramján látható 2 főfolt – helyét és színét tekintve – egyezzék meg az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főfoltokkal;

–

a b) vizsgálati oldat kromatogramján kell lennie 2 olyan foltnak, amelyek – helyüket és színüket tekintve – megegyeznek a b) összehasonlító oldat kromtogramjának főfoltjaival.

B. A „Tartalmi meghatározás” során nyert kromatogramokat vizsgáljuk. Értékelés: a b) vizsgálati oldat kromatogramján látható két főcsúcs – retenciós idejét tekintve – egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúccsal. C Az anyag a nem-világító lángot sárgára festi. D. Az anyag 0,3 g-ját 20 ml R etanollal rázogatás közben vízfürdőn forrásig melegítjük. A keveréket késedelem nélkül megszűrjük, a szüredéket szárazra párologtatjuk, és a maradékot 7 ml R vízben felvesszük. A kapott oldat 1 ml-éhez R metilénkék 1 g/l töménységű oldatának 0,1 ml-ét, R hígított kénsav 2 ml-ét és 2 ml R diklórmetánt mérünk. Összerázást követően a folyadék alsó fázisa kékre színeződik.



VIZSGÁLATOK Savszám (2.5.1): legfeljebb 2,0. Jódszám (2.5.4, A-módszer): legfeljebb 3,0. A vizsgálathoz 2,00 g anyagot 25 ml R diklórmetánban oldunk. Szappanszám (2.5.6): legfeljebb 2,0. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 3,0%. 2,50 g anyagot vizsgálunk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Cetil-sztearil-alkohol. Gázkromatográfia (2.2.28). Belső standard oldat. 0,60 g CRS heptadekanolt R etanollal 150 ml-re oldunk. Vizsgálati oldat (a). 0,300 g vizsgálandó anyagot a belső standard oldat 50 mlében oldunk. Az oldathoz 50 ml R vizet elegyítünk, és 4×25 ml R pentánnal kirázzuk. A fázisok szétválásának megkönnyítésére szükség esetén R nátriumkloridot adhatunk a rendszerhez. Az egyesített szerves fázisokat 2×30 ml R vízzel mossuk, R vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd megszűrjük. Vizsgálati oldat (b). 0,300 g vizsgálandó anyagot 50 ml R etanolban oldunk. Az oldathoz 50 ml R vizet adunk, majd 4×25 ml R pentánnal összerázzuk. A fázisok szétválásának megkönnyítésére szükség esetén R nátrium-kloridot használunk. Az egyesített szerves fázisokat 2×30 ml R vízzel mossuk, R vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, végül megszűrjük. Összehasonlító oldat. 50 mg CRS cetil-alkoholt és 50 mg CRS sztearil-alkoholt R etanollal 10 ml-re oldunk. Oszlop: –

anyaga: kvarcüveg;

–

méretei: l = 25 m, Ø = 0,25 mm;

–

állófázis: R poli(dimetil)sziloxán.

Vivógáz: R kromatográfiás célra szánt nitrogén. Áramlási sebesség: 1 ml/perc.



Mintaáram-eloszlási arány: 1:100. Hőmérséklet:

Oszlop

Idő (perc)

Hőmérséklet (°C)

0–20

150 → 250

Injektor

250

Detektor

250

Detektálás: lángionizáció. Elúciós sorrend: cetil-alkohol, heptadekanol, sztearil-alkohol. Az a) és b) vizsgálati oldatokból 1–1 μl-t injektálunk. Ha a b) vizsgálati oldat kromatogramján megjelenik olyan csúcs, amely retenciós idejét tekintve megegyezik az a) vizsgálati oldat kormatogramján megjelenő belső standard csúccsal, az r arányt a következő képlet segítségével számítjuk ki: S ci , Si

ahol Sci = a cetil-alkoholnak megfelelő csúcs területe a b) vizsgálati oldat kromatogramján; Si = azon csúcs területe, amely retenciós idejét tekintve megegyezik az a) vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő, a belső standardnak megfelelő csúccsal. Ha r kisebb, mint 300, az alábbi kifejezés segítségével kiszámítjuk az a) vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő belső standard csúcs korrigált csúcsterületét: S ' Ha −

Si ⋅ Sc , S ci

ahol S’Ha =

a belső standardnak megfelelő csúcs területe az a) vizsgálati oldat kromatogramján;


Sc

=


a cetil-alkoholnak megfelelő csúcs területe az a) vizsgálati oldat kromatogramján.

Azonos körülmények között az összehasonlító oldat és az a) vizsgálati oldat azonos térfogatrészeit injektáljuk. Az a) vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő csúcsokat az összehasonlító oldat kromatogramján látható csúcsok retenciós ideje alapján azonosítjuk, majd meghatározzuk az egyes csúcsok területét. Az anyag százalékos cetil-alkohol-tartalmát az alábbi képlet alapján számítjuk ki:

100m H , S Ha ( korr ) ⋅ m

SA ahol SA

=

a cetil-alkohol csúcsterülete az a) vizsgálati oldat kromatogramján;

mH

=

a belső standard milligrammban;

tömege

az

a)

összehasonlító

oldatban,

SHa(korr) = a belső standard csúcs korrigált csúcsterülete az a) vizsgálati oldat kromatogramján; m

=

a vizsálandó anyag milligrammban.

tömege

az

a)

vizsgálati

oldatban,

Az anyag százalékos sztearil-alkohol-tartalmát az alábbi képlet alapján számítjuk ki: SB

100 m H , S Ha ( korr ) ⋅ m

ahol SB

=

a sztearil-alkohol kromatogramján.

csúcsterülete

az

a)

vizsgálati

oldat

Az anyag százalékos cetil-sztearil-alkohol-tartalma megegyezik a százalékos cetil-alkohol- és sztearil-alkohol-tartalom összegével.



Nátrium-cetil-sztearil-szulfát. 0,300 g anyagot 25 ml R diklórmetnban diszpergálunk. A keverékhez 50 ml R vizet és 10 ml R dimidium-bromidszulfánkék–oldatot adunk, és 0,004 M benzetónium-klorid–mérőoldattal ultrahangos kezelés és melegítés alkalmazása mellett addig titráljuk, amíg az alsó fázis színe rózsaszínről szürkére nem változik. A fázisokat minden egyes mérőoldatrészlet hozzáadása előtt hagyjuk szétválni.

1 ml 0,004 M benzetónium-klorid–mérőoldattal 1,434 mg nátrium-cetilsztearil-szulfát egyenértékű. FELIRAT A feliraton adott esetben fel kell tüntetni a hozzáadott tompítóanyag nevét és koncentrációját.

ALCOHOL CETYLICUS ET STEARYLICUS EMULSIFICANS B 1179. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0802 1180. oldal A „Sajátságok” rész második mondatában az „alkoholban” kifejezés „etanolban (96%)”-ra módosul. Az „Azonosítás” rész „A.” pontjának „Vizsgálati oldat” kezdetű bekezdésében az „R alkohollal (70 %V/V-os)” kifejezés „R etanollal (70 %V/V)”-re módosul. Az „Azonosítás” rész „A.” pontjában az „Összehasonlító oldat (a)” és „Összehasonlító oldat (b)” kezdetű bekezdések a következőképpen módosulnak: „Összehasonlító oldat (a). 24 mg CRS cetil-alkoholt és 16 mg CRS sztearil-alkoholt 10 ml R trimetilpentánban oldunk. Összehasonlító oldat (b). 20 mg CRS nátrium-lauril-szulfátot 10 ml R etanolban (70 %V/V) vízfürdőn melegítve oldunk.” A „Vizsgálatok” rész „Jódszám” pontjának hivatkozása kiegészül: „Jódszám (2.5.4)” helyére „Jódszám (2.5.4, A-módszer)” kerül. A „Vizsgálatok” rész „Víztartalom” pontjából a „félmikro-módszerrel” szövegrész törölve. A „Tartalmi meghatározás” részben a hőmérséklet programot összefoglaló táblázatból a „Megjegyzés” oszlop törölve.

AMISULPRIDUM 1227. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:1490 javított 5.6 1228. oldal A „Vizsgálatok” rész „A-szennyező” vizsgálati pontjában az a) összehasonlító oldat helyesen: „Összehasonlító oldat (a). 5 mg CRS szulpirid-A-szennyezőt R metanollal 25 ml-re oldunk. Az így kpott oldt 2 ml-ét R metanollal 20 ml-re hígítjuk.

Betacarotenum 1343. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:1069 A „Sajátságok” pont második mondata a következőképpen változik: Vízben gyakorlatilag nem oldódik; ciklohexánban kevéssé oldódik; etanolban gyakorlatilag nem oldódik. 1344. oldal A „Vizsgálatok” pont „Rokon vegyületek” alpontja után új bekezdés kerül: A Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely „Rokon vegyületek” alpontjában feltüntetett határértékek (2034.-1 táblázat) nem alkalmazhatók.

BIFONAZOLUM 1360. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:1395 javított 5.6 A „Vizsgálatok” rész „Rokon vegyületek” vizsgálati alpontjának 6. bekezdése helyesen: Összehasonlító oldat (c).5,0 mg CRS bifonazol B-szennyezőt R acetonitrillel 5,0 ml-re oldunk. A „Vizsgálatok” rész „Rokon vegyületek” vizsgálati alpontjának 7. bekezdése helyesen: Összehasonlító oldat (d). 0,25 ml vizsgálati oldat és 0,25 ml c) összehasonlító oldat elegyét a tompítóoldattal (pH 3,2) 50,0 ml-re hígítjuk. A „Vizsgálatok” rész „Rokon vegyületek” vizsgálati alpontjában „ A rendszer érzékenységét úgy állítjuk be,………….” mondatrésszel kézdődő bekezdés törlésre került. Ugyanezen részben a törölt szövegrész alatti bekezdés első mondata helyesen: „ A d) összehasonlító oldatból 50 µl-t injektálunk.” A „Szárítási veszteség” vizsgálati alpont feletti bekezdés 5-8. soráig tartó szövegrész a következőképpen módosult: …..; a B-szennyezőnek megfelelő csúcs területe nem lehet nagyobb, mint a megfelelő csúcs területének háromszorosa az a) összehasonlító oldat kromatogramján (1,5%);

Bisacodylum


01/2007:0595

BISACODYLUM Biszakodil

C22H19NO4

Mr 361,4

DEFINÍCIÓ 4,4’-(Piridin-2-ilmetilén)difenil–diacetát. Tartalom: 98,0–101,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; acetonban oldódik; etanolban (96%) mérsékelten oldódik. Híg ásványi savak oldják. AZONOSÍTÁS Első azonosítás: C. Második azonosítás: A, B, D. A. Olvadáspont (2.2.14): 131–135 °C. B. Ultraibolya és látható spektrofotometria (2.2.25). Vizsgálati oldat. 10,0 mg anyagot R kálium-hidroxid R metanollal készült, 6 g/l töménységű oldatával 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 10,0 ml-ét R kálium-

Bisacodylum


hidroxid R metanollal készült, 6 g/l töménységű oldatával 100,0 ml-re hígítjuk. Színképtartomány: 220–350 nm. Abszorpciós maximum: 248 nm-en. Váll: 290 nm-en. 1% Fajlagos abszorpciós koefficiens az abszorpciós maximumon ( A1cm ): 632–672.

C. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS biszakodillal. Amennyiben a szilárd állapotú anyagokkal nyert spektrumok között eltérés mutatkozik, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön R kloroformban oldjuk, az oldatokat szárazra párologtatjuk és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel. D. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat. 20 mg vizsgálandó anyagot R acetonnal 10 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 20 mg CRS biszakodilt R acetonnal 10 ml-re oldunk. Lemez: R VRK szilikagél GF254 lemez. Kifejlesztőszer: R etil-metil-keton – R xilol (50+50 V/V). Felvitel: 10 µl. Kifejlesztés: 10 cm fronttávolságig. Szárítás: levegőn, szükség esetén 100–105 °C-on melegítve. Előhívás: a lemezt 0,05 M jód–oldat és R hígított kénsav egyenlő térfogatarányú elegyével bepermetezzük. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramjának főfoltja – helyét és méretét tekintve – egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramjának főfoltjával. VIZSGÁLATOK

Bisacodylum


Savasság, lúgosság. 1,0 g anyagot 20 ml R szén-dioxid-mentes vízzel rázogatunk, majd forrásig melegítünk. A lehűtött, csapadékos folyadékot megszűrjük. A szüredékhez 0,2 ml 0,01 M nátrium-hidroxid–mérőoldatot és 0,1 ml R metilvörös– oldatot elegyítünk. Az oldat sárga színű legyen. Legfeljebb 0,4 ml 0,01 M sósav– mérőoldat hozzáadására ez a szín vörösre változzék. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az oldatokat közvetlenül a felhasználás előtt készítjük. Oldószerelegy: R tömény ecetsav – R acetonitril – R víz (4+30+66 V/V). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot 25 ml R acetonitrilben oldunk, majd az oldatot az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt biszakodil (amely A-, B-, C-, D- és E-szennyezőt tartalmaz) egy üvegcséjének tartalmát 1,0 ml R acetonitrilben oldjuk, majd az oldatot 1,0 ml oldószereleggyel elegyítjük. Összehasonlító oldat (c). CRS csúcsazonosítás vizsgálatára szánt biszakodil (amely F-szennyezőt tartalmaz) 5 mg-ját 2,5 ml R acetonitrilben oldjuk, majd az oldatot az oldószereleggyel 5,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: – méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; – állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 µm). Mozgófázis: R acetonitril (45 térfogatrész) és R ammónium-formiát 1,58 g/l töménységű, előzetesen R vízmentes hangysavval pH 5,0 értékre beállított oldatának (55 térfogatrész) elegye. Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 265 nm-en. Injektálás: 20 µl. Kromatografálási idő: a biszakodil retenciós idejének 3,5-szerese.

Bisacodylum


Relatív retenciók a biszakodilra (retenciós ideje kb. 13 perc) vonatkoztatva: Aszennyezö kb. 0,2; B-szennyező kb. 0,4; C-szennyező kb. 0,45; D-szennyező kb. 0,8; E-szennyező kb. 0,9; F-szennyező kb. 2,6. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: – hegy-völgy arány: legalább 1,5, ahol Hp = az E-szennyező csúcsának az alapvonaltól mért magassága és Hv = az E-szennyező csúcsát a biszakodil csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága. Követelmények: – korrekciós faktor: az A-szennyező mennyiségének kiszámításához csúcsterületét 0,7-del szorozzuk; – A- és B-szennyező: egyikük csúcsterülete sem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,1%); – C- és E-szennyző: egyikük csúcsterülete sem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%); – D-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%); – F-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%); – egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: egyikük csúcsterülete sem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); – szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének tízszerese (1,0%); – elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látató főcsúcs területének fele (0,05%). Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 0,500 g-ját szárítószekrényben 100–105 °C-on szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS

Bisacodylum


0,300 g anyagot 60 ml R vízmentes ecetsavban oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 0,1 M perklórsav–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 36,14 mg C22H19NO4 egyenértékű. ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D, E, F.

A. R1 = R3 = OH, R2 = H: 4,4’-(piridin-2-ilmetilén)difenol, B. R1 = H, R2 = R3 = OH: 2-[(RS)-(4-hidroxifenil)(piridin-2-il)metil]fenol, C. R1 = OH, R2 = H, R3 = O-CO-CH3: 4-[(RS)-(4-hidroxifenil)(piridin-2-il) metil]fenil-acetát, E. R1 = H, R2 = R3 = O-CO-CH3: 2-[(RS)-[4-(acetiloxi)-fenil](piridin-2-il) metil]fenil-acetát, D. ismeretlen szerkezetű anyag, F. ismeretlen szerkezetű anyag.

Acidum boricum


01/2007:0879

BROMAZEPAMUM Brómazepám

C14H10BrN3O

Mr 316,2

DEFINÍCIÓ 7-Bróm-5-(piridin-2-il)-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-on. Tartalom: 99,0−101,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy sárgás színű, kristályos por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; etanolban (96%) és diklórmetánban mérsékelten oldódik. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS brómazepámmal.

Acidum boricum


VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Vizsgálati oldat. 10,0 mg vizsgálandó anyagot 1 térfogatrész R acetonitril és 8 térfogatrész R metanol elegyének 9 ml-ében oldunk. Az oldatot R káliumdihidrogén-foszfát 11,33 g/l töménységű, előzetesen R kálium-hidroxid 100 g/l töménységű oldatával pH 7,0-re beállított oldatával 20,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt brómazepám (amely A-, B-, C-, D- és E-szennyezőt tartalmaz) egy üvegcséjének tartalmát 1,0 ml mozgófázisban oldjuk, majd az oldatot kb. 15 percen át ultrahanggal kezeljük. Oszlop: méretei: l = 0,15 m, ∅ = 4,6 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (3,5 μm); hőmérséklet: 50 °C. Mozgófázis: R acetonitril (5 térfogatrész), R metanol (45 térfogatrész) és R káliumdihidrogén-foszfát 11,33 g/l töménységű, előzetesen R kálium-hidroxid 100 g/l töménységű oldatával pH 7,0-re beállított oldatának (50 térfogatrész) elegye. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 235 nm-en. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a brómazepám retenciós idejének négyszerese. Szennyezők azonosítása: az A-, B-, C-, D- és E-szennyező csúcsát a CRS csúcsazonosításra szánt brómazepámhoz mellékelt kromatogram és a b) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk.

Acidum boricum


Relatív retenciók a brómazepámra (retenciós ideje kb. 5 perc) vonatkoztatva: Dszennyező kb. 1,4; A-szennyező kb. 1,5; C-szennyező kb. 1,6; E-szennyező kb. 2,1; B-szennyező kb. 2,2. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: − csúcsfelbontás: legalább 4,0, a brómazepám és a D-szennyező között; legalább 1,2, az A-szennyező és a C-szennyező között. Követelmények: −

korrekciós faktorok: a következő szennyezők mennyiségének kiszámításához csúcsterületüket a megfelelő korrekciós faktorral szorozzuk: A-szennyező 1,3; B-szennyező 1,8; E-szennyező 2,1;

−

A-, B- és E-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,1%);

egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%); − elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%). Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,2%. Az anyag 1,000 g-ját 80 °C-on 2,7 kPa-t meg nem haladó nyomáson 4 órán át szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Az anyag 0,250 g-ját 20 ml R vízmentes ecetsavban oldjuk. Az oldatot 50 ml R ecetsav-anhidriddel elegyítjük, majd potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M perklórsav− mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav−mérőoldattal 31,62 mg C14H10BrN3O egyenértékű.

Acidum boricum


ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, E. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) című általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10) című általános fejezetet): C, D.

A. R = H: (2-amino-5-brómfenil)(piridin-2-il)metanon, B. R = CO-CH2-Cl: N-[4-bróm-2-(piridin-2-ilkarbonil)fenil]-2-klóracetamid, E. R = CO-CH2-Br: 2-bróm- N-[4-bróm-2-(piridin-2-ilkarbonil)fenil]acetamid,

Acidum boricum


C. 7-bróm-5-(6-metilpiridin-2-il)-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-on,

D. 3-amino-6-bróm-4-(piridin-2-il)kinolin-2(1H)-on.

CALCII LEVOFOLINAS PENTAHYDRICUS 1415. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:1606 javított 5.6 1416. oldal A „Vizsgálatok” rész „Fajlagos optikai forgatóképesség” vizsgálati pontja az alábbi mondatrésszel egészül ki: …….., a mérést 25 C0-on végezve. 1417. oldal A „Rokon vegyületek” rész „Platina” vizsgálati pontjában a 10 ppm helyett 10,0 ppm írandó.

CALCII ASCORBAS 1400. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:1182 A „Sajátságok” rész 2. mondatában az „alkoholban” kifejezés helyére „etanolban (96%)” kerül. A „Vizsgálatok” rész – a „Fajlagos optikai forgatóképesség” pontot követően – új ponttal egészül ki: „Rokon vegyületek. A Gyógyszeranyagok (2034) cikkely „Rokon vegyületek” pontjában (2034.-1. táblázat) megadott határértékek erre a cikkelyre nem vonatkoznak.” A „Vizsgálatok” rész „Réz” pontjának követelménye „5 ppm”-ről „5,0 ppm”-re módosul. 1401. oldal A „Vizsgálatok” rész „Vas” pontjának követelménye „2 ppm”-ről „2,0 ppm”-re módosul.

CARBAMAZEPINUM 1431. oldal

Új cikkelyszám: 01/2005:0543 javított 5.6 A „Vizsgálatok” rész „Rokon vegyületek” pontjának 1. bekezdése helyesen: Vizsgálati oldat (a): 60,0 mg vizsgálandó anyagot, ultrahangos kezelést alkalmazva, R2 metanollal 20,0 ml-re oldunk. Ezen oldat 10,0 ml-ét R vízzel 20,0 ml-re hígítjuk. A „Vizsgálatok” rész „Rokon vegyületek” pontjának 4. bekezdése helyesen: Összehasonlító oldat (b): 60,0 mg CRS karbamazepint, ultrahangos kezelést alkalmazva, R2 metanollal 20,0 ml-re oldunk. Ezen oldat 5,0 ml-ét R2 metanol és R víz egyenlő térfogatarányú elegyével 50,0 ml-re hígítunk. A „Rokon vegyületek” „Relatív retenció” pontja helyesen: Relatív retenció a karbamazepinre vonatkoztatva (retenciós idő: kb. 10 perc): A-szennyező: kb. 0,9; E-szennyező kb. 5,1. 1432. oldal A SZENNYEZŐK rész 1. és 2. bekezdése helyesen: Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, E. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb szennyezőkre, illetve a nem-specifikált szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) című általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges azonosítani az anyag megfelelő voltának bizonyításához. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B, C, D, F.

Cholecalciferolum densatum oleosum 1549. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0575 1550. oldal A „Tartalmi meghatározás” pont elé új bekezdés kerül: Rokon vegyületek A „Vizsgálatok” pont „Rokon vegyületek” alpontja után új bekezdés kerül: A Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely „Rokon vegyületek” alpontjában feltüntetett határértékek (2034.-1 táblázat) nem alkalmazhatók. A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt krülményei” bekezdés első mondata a következőképpen változik: – 0,25 m hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű, R kromatográfiás célra szánt szilikagéllel (5 μm) töltött oszlop, A „Tartalmi meghatározás” pontból törlendő mondat (két helyről is): „A rendszer érzékenységét úgy állítjuk be, hogy a főcsúcs magassága elérje a regisztráló teljes skálaszélességének legalább 50%-át.” 1551. oldal A „Szennyezők” pont teljes egészében törölve.

CHYMOTRYPSINUM 1555. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:0476 javított 5.6 Az „Előállítás” rész első mondata helyesen: „A kimotripszin kinyerésére használt állatoknak meg kell felelniük az emberi fogyasztásra alkalmas állatokra vonatkozó egészségügyi előírásoknak, az illetékes hatóság jóváhagyásával.” Az „Előállítás” rész 2. mondatában a „be kell mutatni” kifejezés helyesen: „igazolni kell”. Az „Azonosítás” rész „A.” pontjának „Szubsztrátum oldat” kezdetű bekezdésében az „R alkohol” „R etanol (96%)”-ra módosul. Ugyanezen bekezdés 2. mondatában: a „2 ml R 0,067 M foszfát–tompítóoldatot (pH 7,0)” szövegrész helyesen: „2,0 ml R 0,067 M foszfát–tompítóoldatot (pH 7,0)”, továbbá az „R vízzel 10 ml-re hígítjuk” szövegrész helyesen: „R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk”. Az „Azonosítás” rész „B.” pontjában az „R N-tozil-L-fenilklórmetán” helyesen: „R N-tozil-Lfenilalanilklórmetán”; ugyanitt az „R alkohol” „R etanol (96%)”-ra módosul. A „Vizsgálatok” rész „Abszorbancia” pontjának harmadik mondatában a „fajlagos abszorpció koefficiens” helyesen: „fajlagos abszorpciós koefficiens”. 1556. oldal A „Tartalmi meghatározás” rész „Automatikus…” kezdetű bekezdésének második mondatában az „üveg-kalomel elektródpárral legyen ellátva” szövegrész kiegészül: „üveg-kalomel vagy üveg-ezüstezüst-klorid elektródpárral legyen ellátva”.

COLECALCIFEROLI PULVIS 1545. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0574 1546. oldal A „Tartalmi meghatározás” pont elé új bekezdés kerül: „VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek A Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely „Rokon vegyületek” alpontjában feltüntetett határétékek (2034-1. táblázat) nem alkalmazhatók.” A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének első alpontja a következőképpen módosul: ”– 0,25 m hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű, R kromatográfiás célra szánt szilikagéllel (5 μm) töltött oszlop,” A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének 3. alpontjának 4. mondata törölve. A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének 3. alpontjának 6. mondata helyesen: „A kolekalciferol-válasz relatív szórása legfeljebb 1,0%.” 1547. oldal A „SZENNYEZŐK” pont teljes egészében törölve.

COLECALCIFEROLUM IN AQUA DISPERGIBILE 1551. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0598 1552. oldal A „Tartalmi meghatározás” pont elé úlj bekezdés kerül: „VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek A Góygszeranyagok (2034) általános cikkely „Rokon vegyületek” alpontjában feltüntetett határétékek (2034-1. táblázat) nem alkalmazhatók.” A „Tartalmi meghatározás” pont 3. bekezdésében „R alkohol” helyett „R alkohol (96%)” áll. A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének első alpontja a következőképpen módosul: ”– 0,25 m hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű, R kromatográfiás célra szánt szilikagéllel (5 μm) töltött oszlop,” A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének 3. alpontjának 3. és 4. mondata a következőképpen módosul: „A b) összehasonlító oldat alkalmas mennyiségét 6-szor injektáljuk.” A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének 3. alpontjának 6. mondata helyesen: „A kolekalciferol-válasz relatív szórása legfeljebb 1,0%.” A „Tartalmi meghatározás” pont „A kromatográfiás vizsgálat javasolt körülményei” bekezdésének 3. alpontjának 8. mondata helyesen: „Szükség esetén e felbontás elérésa céljából, módosítjuk a mozgófázis összetevőinek arányát és áramlási sebességét.” 1552. oldal A „SZENNYEZŐK” pont teljes egészében törölve.

CYANOCOBALAMINUM 1645. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0547 A „DEFINÍCIÓ” rész a következő mondattal egészül ki: „A cikkely előírásai a fermentációs úton előállított cianokobalaminra vonatkoznak.”

Diazepamum


01/2007:0022

DIAZEPAMUM Diazepám

C16H13ClN2O

Mr 284,7

DEFINÍCIÓ 7-Klór-1-metil-5-fenil-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-on. Tartalom: 99,0–101,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben alig oldódik; etanolban (96%) oldódik. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS diazepámmal. VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az oldatokat erős fénytől védett helyen készítjük. Vizsgálati oldat. 25,0 mg vizsgálandó anyagot 0,5 ml R acetonitrilben oldunk, majd az oldatot a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk.

Diazepamum


Összehasonlító oldat (a). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt diazepám (amely A-, B- és E-szennyezőt tartalmaz) egy üvegcséjének tartalmát 1,0 ml mozgófázisban oldjuk. Oszlop: – méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm; – állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktilszililezett szilikagél (5 µm-es gömbök); – hőmérséklet: 30 °C. Mozgófázis: R acetonitril (22 térfogatrész), R metanol (34 térfogatrész) és R kálium-dihidrogén-foszfát 3,4 g/l töménységű, előzetesen R hígított nátriumhidroxid–oldattal pH 5,0 értékre beállított oldatának (44 térfogatrész) elegye. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 20 µl. Kromatografálási idő: a diazepám retenciós iejének kb. négyszerese. Szennyezők azonosítása: az A-, a B- és az E-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt diazepámhoz mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenció a diazepámra (retenciós ideje kb. 9 perc) vonatkoztatva: Eszennyező kb. 0,7; A-szennyező kb. 0,8; B-szennyető kb. 1,3. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: – csúcsfelbontás: legalább 2,5, az E- és az A-szennyező között és legalább 6,0, az A-szennyező és a diazepám között. Követelmények: – korrekciós faktorok: a következő szenyezők mennyiségének számításához csúcs-

Diazepamum


területüket a megfelelő korrekciós tényezőkkel szorozzuk: B-szennyező 1,3, Eszennyező 1,3; – A-, B- és E-szennyező: egyikük csúcsterülete sem lehet ngyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,1%); – egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: egyikük csúcsterülete sem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); – szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%); – elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%). Nehézfémek (2.4.8/C): legfeljebb 20 ppm. Az anyag 2,0 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 4 ml R ólom–mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,000 g-ját vákuumban, 60 °C-on, 4 órán át szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,200 g anyagot 50 ml R ecetsav-anhidridben oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 0,1 M perklórsav–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 28,47 mg C16H13ClN2O egyenértékű. ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A ,B, E. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok

Diazepamum


(2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet: C, D, F.

A. 7-klór-5-fenil-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-on (nordiazepám),

B. R = CO-CH2-Cl: 2-klór-N-(4-klór-2-benzoilfenil)-N-metilacetamid, D. R = H: [5-klór-2-(metilamino)fenil]fenilmetanon,

C. 3-amino-6-klór-1-metil-4-fenilkinolin-2(1H)-on,

Diazepamum

E. 6-klór-1-metil-4-fenilkinazolin-2(1H)-on,

F. 7-klór-2-metoxi-5-fenil-3H-1,4-benzodiazepin.


Epirubicini hydrochloridum

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5. - 1

01/2005:1590

EPIRUBICINI HYDROCHLORIDUM Epirubicin-hidroklorid

C27H30ClNO11

Mr 580,0

DEFINÍCIÓ [(8S,10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-tridezoxi-α-L-arabino-hexopiranozil)oxi]6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-7,8,9,10-tetrahidrotetracén-5,12dion]–hidroklorid. A Streptomyces peucetius meghatározott törzsei által termelt anyagból kémiai átalakítással nyerik. Tartalom: 97,0 − 102,0% (vízmentes és acetonmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: narancsvörös színű por. Oldékonyság: vízben és metanolban oldódik; vízmentes etanolban kevéssé oldódik; acetonban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS epirubicin-hidrokloriddal.


Ph.Hg.VIII. – Ph. Eur. 5. - 2

B. A „Tartalmi meghatározás” során nyert kromatogramokat értékeljük. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján látható főcsúcs retenciós ideje egyezzék meg az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós idejével. C. Kb.10 mg anyagot 0,5 ml R tömény salétromsavban oldunk. Az oldatot 0,5 ml R víz hozzáadása után nyílt lángon 2 percen át melegítjük, majd lehűlés után 0,5 ml R1 ezüst-nitrát−oldattal elegyítjük. Fehér csapadék keletkezik. VIZSGÁLATOK pH (2.2.3): 4,0−5,5. A vizsgálathoz 50 mg anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 10 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 25,0 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 25,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 25,0 mozgófázissal 25,0 ml-re oldunk.

mg

CRS

epirubicin-hidrokloridot

a

Összehasonlító oldat (b). 10 mg CRS epirubicin-hidrokloridot és 10 mg CRS doxorubicin-hidrokloridot a mozgófázissal 100 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (c). 10 mg CRS doxorubicin-hidrokloridot 5 ml R víz és 5 ml R tömény foszforsav elegyében oldunk. Az elegyet 30 percig állni hagyjuk, ezután pH-ját R nátrium-hidroxid 80 g/l töménységű oldatával 2,6-re állítjuk be, majd 15 ml R acetonitrilt és 10 ml R metanolt adunk hozzá, és összekeverjük. Összehasonlító oldat (d). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: − méretei: l = 0,25 m; ∅ = 4,6 mm, − állófázis: R kromatográfiás célra szánt trimetilszililezett szilikagél (6 μm), − hőmérséklet: 35˚C.



Mozgófázis: 17 térfogatrész R metanolt, 29 térfogatrész R acetonitrilt és egy olyan oldat 54 térfogatrészét elegyítjük, amely literenként 3,7 g R nátriumlauril-szulfátot és 2,8 %V/V R hígított foszforsavat tartalmaz. Áramlási sebesség: 2,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 10 μl; a vizsgálati oldatot, valamint a b), a c) és a d) összehasonlító oldatot injektáljuk. Kromatografálási idő: az epirubicin retenciós idejének 3,5-szerese. A szennyezők azonosítása: a c) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő második legnagyobb területű csúcs használható az A-szennyező azonosítására. Relatív retenciók az epirubicinre (retenciós ideje kb. 9,5 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,3; B-szennyező kb. 0,4; C-szennyező kb. 0,8; E-szennyező kb. 1,1; D-szennyező kb. 1,5; F-szennyező kb. 1,7; G-szennyező kb. 2,1. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 2,0, a C-szennyező és az epirubicin között.

Követelmények: –

korrekciós faktor: az A-szennyező csúcsterületét 0,7-del szorozzuk,

mennyiségének

számításához

−

A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a főcsúcs területe a d) összehasonlító oldat kromatogramján (1,0%),

−

C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a főcsúcs területe a d) összehasonlító oldat kromatogramján (1,0%),

−

egyéb szennyezők egyenként: csúcsterületük nem lehet nagyobb, mint a d) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,5%),

−

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a d) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs területének kétszerese (2,0%),


−


elhanyagolási határ: a d) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,05-szorosa (0,05%).

Aceton (2.4.24): legfeljebb 1,5%. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 4,0%. Az anyag 0,100 g-ját vizsgáljuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): legfeljebb 1,1 NE/mg. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag − abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást − feleljen meg e vizsgálat követelményének is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29). A „Rokon vegyületek” vizsgálatban előírtak szerint végezzük a meghatározást, az alábbi módosítással. Injektálás: a vizsgálati oldatot és az a) összehasonlító oldatot injektáljuk. Kiszámítjuk a százalékos C27H30ClNO11-tartalmat. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytől védve, 2−8 ˚C-on. Ha az anyag steril, akkor steril, légmentesen záró, garanciazáras tartályban. FELIRAT A feliraton adott esetben fel kell tüntetni, hogy az anyag bakteriális endotoxinoktól mentes. SZENNYEZŐK



A.

R = OH: (8S,10S)-6,8,10,11-tetrahidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi7,8,9,10-tetrahidrotetracén-5,12-dion (doxorubicinon),

B.

R = H: (8S,10S)-8-acetil-6,8,10,11-tetrahidroxi-1-metoxi-7,8,9,10tetrahidrotetracén-5,12-dion (daunorubicinon),

C.

doxorubicin,

D.

daunorubicin,

E.

(8S,10S)-10-[(3-amino-2,3,6-tridezoxi-α-L-lixo-hexopiranozil)oxi]-6,8,11trihidroxi-8-[(1R,S)-1-hidroxietil]-1-metoxi-7,8,9,10-tetrahidrotetracén5,12-dion (dihidrodaunorubicin),

F.

(8S,10S)-8-acetil-10-[(3-amino-2,3,6-tridezoxi-α-L-arabinohexopirazonil)oxi]-6,8,11-trihidroxi-1-metoxi-7,8,9,10-tetrahidrotetracén5,12-dion (epi-daunorubicin),


G.


(8S,8’S,10S,10’S)-10,10’-bisz[(3-amino-2,3,6-tridezoxi-α-L-arabinohexopiranozil)oxi]-6,6’,8,8’,11,11’-hexahidroxi-1,1’-dimetoxi-8,8’[(2R,4R)-4-hidroxi-2-(hidroximetil)-1,3-dioxolán-2,4-diil]bisz[7,8,9,10tetrahidrotetracén-5,12-dion] (epirubicin-dimer).

FENOFIBRATUM 1865. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:1322 javított 5.6 A „Sajátságok” pont második mondatában „alkoholban” helyett „alkoholban (96%)” áll. A „Savasság” bekezdés első mondatában „alkoholban” helyett „alkoholban (96%)” áll. 1866. oldal A „Tartalmi meghatározás” pont 4. bekezdése a következőképpen változik: „Összehasonlító oldat (b): 5,0 mg CRS fenifibrátot, 5,0 mg CRS fenofibrát-Aszennyezőt, 5,0 mg CRS fenofibrát-B-szennyezőt és 10,0 mg CRS fenofibrát-Gszennyezőt a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk.”

FIBRINOGENUM HUMANUM 1879. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0024 Az „Előállítás” rész 1. bekezdése az utolsó mondatot követően a következő szöveggel egészül ki: „A készítményt fagyasztva szárítják.” A „Vizsgálatok” rész „Hepatitisz-B felszíni antigén” pontja törölve.

FLUMEQUINUM 1890. oldal Új cikkelyszám: 01/2002:1517 javított 5.6 A „Sajátságok” pontelső mondata a következőképpen változik: „Mikrokristályos fehér vagy csaknem fehér por.” 1891. oldal Az „Azonosítás” C pontjának 3. bekezdésében „R alkohol” helyett „R alkohol (96%)” áll. A „Rokon vegyületek” pont 3. bekezdése a következőképpen módosult: „Összehasonlító oldat (a): Egy üvegcse CRS flumekin-B-szennyezőt 2,0 ml CRS flumekin R dimetilformamiddal készített 0,05 mg/ml töménységű oldatában oldunk.”

GLYCEROLI MONOOLEATES 1962. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:1430 A „Vizsgálatok” rész 4. bekezdése helyesen: „Szappanszám (2.5.6): 150-175. Az anyag 2,0 g-ját vizsgáljuk. A „Tartalmi meghatározás” rész 1. bekezdése helyesen: „Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30)”

HYDROXOCOBOLAMINI ACETAS 2023. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0913 A „Definíció” pont vége új bekezdéssel egészül ki: „E cikkely előírásai a fermentációval előállított hidroxokobolamin-acetátra érvényesek.” Az „ Azonosítás” B. pontjának 2. és 3. bekezdésében „R alkohol” helyett „R alkohol (96%)” áll.

HYDROXOCOBOLAMINI CHLORIDE 2024. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0915 A „Definíció” pont vége új bekezdéssel egészül ki: „E cikkely előírásai a fermentációval előállított hidroxokobolamin-kloridra érvényesek.” 2025. oldal Az „ Azonosítás” B. pontjának 2. és 3. bekezdésében „R alkohol” helyett „R alkohol (96%)” áll.

HYDROXOCOBOLAMINI SULFAS 2025. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0915 A „Definíció” pont vége új bekezdéssel egészül ki: „E cikkely előírásai a fermentációval előállított hidroxokobolamin-szulfátra érvényesek.” 2026. oldal Az „ Azonosítás” B. pontjának 2. és 3. bekezdésében „R alkohol” helyett „R alkohol (96%)” áll.

MAGNESII OXIDUM LEVE 2192. oldal Új cikkelyszám: 01/2007:0040 A „Sajátságok” rész „Küllem” pontjában „finom, fehér, amorf por” helyett „finom, fehér vagy csaknem fehér, amorf por” írandó. Az „Azonosítás” A pontjában „kb. 150 ml” helyett „legalább 100 ml” írandó. 2193. oldal Az „Izzítási veszteség” pontban „900 ºC-on” helyett „900 ± 25 ºC-on” írandó.

THYMI HERBA 2397. oldal Új cikkelyszám: 01/2005:0865 javított A „Definíció” rész „Tartalom” pontja a következőképpen változik: „Tartalom: –

illóolaj: legalább 12 ml/kg (szárított drogra vonatkoztatva),

–

timol- és karvakroltartalom összesen (mindkettő C10H14O; Mr 150,2): legalább 40% az illóolajban.

2398. oldal A mintakromatogram (0865.-1. ábra) törlendő.

ÖBLÍTÉSRE SZÁNT GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK cikkely változásai:

Recommend Documents