Susan Peters, MSc
Biotechnologische behandelingen in ontwikkeling De gezondheidszorg zal door de medische biotechnologie ingrijpend veranderen. Kennis over DNA schept mogelijkheden om heel gericht eigenschappen van cellen te beïnvloeden. Met biotechnologie kan men organismen stoffen laten produceren die ze van nature niet kunnen produceren. Hiermee is het mogelijk zeer complexe moleculen te maken, in grote hoeveelheden. Vaak gaat het om stoffen die normaal in kleine hoeveelheden in het lichaam worden aangemaakt. Deze kunnen dienen als basis voor medicijnen. Met recombinante-DNA-technologie worden technieken bedoeld om op een gecontroleerde manier de genetische informatie te veranderen. Er wordt dan DNA verwijderd, er wordt nieuw DNA geïntroduceerd of een bepaald deel van het DNA wordt vermeerderd. Dit noemen we recombineren. Door middel van recombinant-DNA-technologie kunnen sommige barrières tussen soorten overbrugd worden, wat via de natuurlijke voortplanting niet mogelijk is. Het basisprincipe is dat een gen van het ene organisme in het DNA van een ander organisme gebracht wordt. We spreken van een transgeen organisme wanneer alle lichaamscellen een stukje ‘vreemd’ DNA bevatten, bijvoorbeeld een muis met een ingebouwd menselijk gen.
Eiwitten Als een ziekte wordt veroorzaakt door een afwijking in het gen voor een stofwisselingseiwit, kan dat in enkele gevallen behandeld worden door toediening van het ontbrekende eiwit. Deze benadering wordt momenteel onderzocht voor de ziekte van Pompe, waarbij patiënten te weinig van het eiwit alfa-glucosidase aanmaken. Helaas is deze wijze van eiwitvervanging alleen toepasbaar als het eiwit makkelijk de juiste plaats van bestemming kan bereiken. Bij de ziekte van Pompe moet het ontbrekende eiwit in de lysosomen (inwendige celonderdelen) komen. Het bereiken hiervan is relatief makkelijk; vanuit bloedbaan komt het via de natuurlijke weg in de lysosomen. Veel ingewikkelder wordt het voor ziekten waarbij het vervangende eiwit terecht moet komen bij moeilijk bereikbare celonderdelen. De mitochondriën (zoals bij de ataxie van Friedreich en sommige (encephalo)myopathieën) zijn hier een voorbeeld van. Bij spierdystrofieën moet het vervangende eiwit ingebouwd worden in een bepaald gedeelte van de spiercel. Ook dat maakt het erg lastig. Hetzelfde geldt voor
1
neuromusculaire ziekten waar het eiwit naar de motorneuronen (in het ruggenmerg), zoals spinale spieratrofie of naar de zenuwen (HMSN) gestuurd moet worden. Daarnaast bestaan er neuromusculaire ziekten (onder andere myotone dystrofie en FSHD) met weliswaar een kenmerkende DNA-verandering, maar zonder een directe link naar een bepaald aangetast eiwit.
Recombinante eiwitten uit cel/bacteriekweek Eiwitproductie kan plaatsvinden in gisten, bacteriën of schimmels. Deze groeien snel en het vreemde gen is makkelijk in te bouwen. Dit gen zorgt dan voor uitscheiding van het gewenste eiwit. Aan deze methode kleeft echter een groot nadeel. Omdat het DNA in deze micro-organismen anders wordt afgelezen dan het DNA van zoogdieren, is er wat meer ‘gesleutel’ aan het transgen nodig. Na het aflezen van de genetische code worden er altijd nog suikers aan een eiwit gehangen. Dit gebeurt niet in elk soort organisme op dezelfde wijze, waardoor de eiwitten vaak onvoldoende op elkaar lijken. Een menselijk gen hoeft daardoor in een bacterie ook niet altijd een menselijk eiwit op te leveren.
Melk van transgene dieren Dieren kunnen ingewikkelder eiwitten maken dan bacteriën of schimmels. Voor de productie van sommige typen eiwitten zijn dus dieren nodig. Transgene dieren worden gemaakt door een menselijk gen te injecteren in een bevruchte eicel van een zoogdier. De eicel wordt in vitro verder gekweekt en dan ingebracht bij een draagmoeder. Het dier dat daaruit wordt geboren is transgeen; het heeft een ingebouwde menselijke genetische eigenschap. Het eerste transgene dier was een in 1981 gemaakte muis. Wanneer zoogdieren een menselijk gen ingebouwd krijgen en daarmee een menselijk eiwit maken, kan dat eiwit als medicijn gebruikt worden. Om dat eiwit te kunnen verzamelen, moet het eiwit bijvoorbeeld worden uitgescheiden in de melk van het dier. In onderzoek worden vaak muizen gebruikt, maar deze maken erg weinig melk. Een productielijn met grotere zoogdieren, zoals koeien die veel van het medicijn kunnen leveren, duurt lang om te ontwikkelen. Kleinere dieren (zoals konijnen) zijn daarentegen makkelijker en sneller te fokken. Mutaties in het gen voor het enzym alfa-glucosidase kunnen de ziekte van Pompe veroorzaken. Het gen voor menselijk alfa-glucosidase is ingebouwd in konijnen. Via de
2
moedermelk wordt het eiwit verkregen dat na zuivering kan worden gebruikt als medicijn. De enzymtherapie lijkt goed te werken voor patiënten die lijden aan de ziekte van Pompe.
Figuur 1 Voorbeeld van een transgene muis, deze ziet er van buiten hetzelfde uit als een normale muis. Bij sommige ingebouwde genen is het mogelijk wel aan de buitenkant te zien, afhankelijk van de functie.
Dierlijke cellijnen Een alternatief is eiwitten in het laboratorium te laten produceren door transgene dierlijke cellen. Er worden cellen uit een (zoog)dier gehaald en daar wordt vervolgens het gewenste gen ingebouwd. Daarmee wordt een zogenaamde cellijn opgezet. Een cellijn bestaat uit een verzameling gelijke cellen en kan bijna net zo makkelijk gekweekt en gehanteerd worden als een bacteriecultuur. Het is dus minder bewerkelijk en kostbaar dan het werken met dieren. Zo is bijvoorbeeld een cellijn ontwikkeld uit ovariumcellen van de Chinese hamster (de CHO cellijn). Deze cellijn wordt nu gebruikt voor verschillende toepassingen. Hiermee kan onder andere etanercept of alfa-glucosidase geproduceerd worden. Etanercept kan mogelijk het ongewenste afweerproces bij myasthenia gravis patiënten afremmen.
DNA en RNA Zoals in de tekst ‘Spierziekten en Genetica’ staat beschreven, worden erfelijke eigenschappen bepaald door onze genen. Genen bestaan uit DNA (DesoxyriboNucleic Acid). Wanneer hier een mutatie (een foutje) in voorkomt, kan dat tot ziekte leiden. DNA wordt door RNA (RiboNucleic Acid) overgeschreven. Zowel DNA als RNA kunnen als aanknopingspunt dienen voor biotechnologie, zoals voor gentherapie.
3
Gentherapie heeft de potentie om zowel bepaalde erfelijke ziekten als later ontstane aandoeningen (zoals kanker, vasculaire en neurologische aandoeningen) te behandelen. Gentherapie kan worden onderverdeeld in ‘in vivo’ en ‘ex vivo’ therapie. In het eerste geval wordt het therapeutische gen direct bij de patiënt ingebracht. In het tweede geval worden de cellen waar het om gaat eerst uit het lichaam van de patiënt gehaald. Deze cellen laat men dan in vitro verder groeien. Daarna wordt het therapeutische gen erin geplaatst en zet men de cellen terug in het lichaam. Om een genetische verandering bij in vivo therapie op de juiste plaats te krijgen, is een vector (drager) nodig. Voorbeelden van natuurlijke vectoren die daarvoor kunnen dienen zijn: virussen, plasmiden, liposomen en oligonucleotiden. Op dit moment is gentherapie nog niet toepasbaar in de praktijk. Daarvoor bestaan nog te veel onzekere factoren. Het onderzoek bevindt zich nu voornamelijk op het niveau van proefdieren en cellen. Eerst moet de efficiëntie worden verbeterd en moet toepassing veilig zijn. Verderop in de tekst worden de bestaande problemen nader uitgelegd.
Virale vectoren Virussen zijn erg goed in het naar binnen smokkelen van erfelijk materiaal in cellen van een gastheer. In de natuur zijn zij daarvan afhankelijk voor hun eigen vermenigvuldiging. Van deze eigenschap kan men dus gebruik maken bij het invoeren van erfelijk materiaal in een vreemde cel. Het gaat hierbij om zowel DNA als RNA. Hier wordt het uitgelegd voor DNA. Virussen worden, voordat ze als vector worden gebruikt, ontdaan van zoveel mogelijk schadelijke eigenschappen. Ook zorgt men ervoor dat ze niet meer in staat zijn zichzelf te vermenigvuldigen. In het virus-DNA, dat nu vector-DNA wordt genoemd, plaatst men vervolgens het DNA van het relevante gen. Het virus wordt toegediend in het te behandelen weefsel. Daar hecht het virus zich daar aan de gastheercel en injecteert het DNA met het kunstmatig ingebrachte normale gen. Eenmaal in de cel, integreert het vector-DNA in het DNA van de gastheercel. Virussen zijn relatief efficiënte DNA-transporteurs. De efficiëntie wordt echter wel verlaagd doordat een viraal ingebracht gen vaak last heeft van uitdoving. Het werkt dan maar tijdelijk omdat het wordt uitgeschakeld of omdat de ‘genezen’ cellen delen en zo het gen wordt verdund. Probleem is ook dat het lichaam een virus als indringer kan beschouwen en het kan afstoten. Dit verlaagt de efficiëntie en kan zelfs gevaarlijk zijn. Bovendien kan het onschadelijk gemaakte vectorvirus in contact komen met andere virussen in het lichaam, materiaal uitwisselen, en zo weer actief worden. Bijkomend gevaar is dat virussen
4
belangrijke normale genen in het cellulaire DNA kunnen veranderen. Ten slotte zijn virussen over het algemeen alleen in staat om DNA in te brengen in delende cellen. Zij werken daarom niet in bijvoorbeeld zenuwweefsel, omdat dat niet uit delende cellen bestaat.
Plasmiden Een plasmide is een rond stukje DNA dat onder andere in bacteriën voorkomt. Het DNA in de plasmide heet ‘naakt’ omdat het niet in eiwitten is verpakt. In het laboratorium wordt naakt DNA gebruikt om nieuwe eigenschappen aan een (micro)organisme toe te voegen. Een aantal jaren geleden ontdekte men dat gezuiverd plasmide-DNA ook door cellen in het menselijk lichaam kan worden opgenomen. Hoe die opname precies gebeurt, is nog niet opgehelderd. Wel is duidelijk geworden dat het naakte DNA in het cytoplasma (celvloeistof) van de cel terechtkomt en daar de blauwdruk vormt voor de eiwitproductie. Dit gegeven is van groot belang voor toepassingen, onder meer in vaccins: naakt DNA kan worden gebruikt om lichaamscellen van de patiënt bepaalde (therapeutische) eiwitten te laten produceren. Het effect is echter tijdelijk. Transport van naakt DNA vanuit het cytoplasma naar de celkern is bijzonder inefficiënt. Naakt DNA wordt dan ook vrijwel niet ingebouwd in menselijke chromosomen. Bovendien wordt het in het cytoplasma vrij snel afgebroken. De productie van de therapeutische eiwitten is daarom van korte duur.
Figuur 2 Schematische weergave van een bacterie met daarin zijn chromosomale DNA (groen) en enkele plasmiden (rood).
Antisense-therapie en exon skipping Sommige genen zijn zo groot dat ze moeilijk in een virus passen, bijvoorbeeld het dystrofinegen voor Duchenne patiënten. Bovendien wil je soms dat genen in spiercellen terechtkomen, die vanwege het omhulsel van de spier moeilijk bereikbaar zijn. Er moet dan naar een andere strategie gezocht worden, bijvoorbeeld de antisense-techniek. Daarbij gaat het om
5
het uitschakelen van een bepaald gen of een deel daarvan. Niet al het DNA in een gen codeert ook daadwerkelijk voor een eiwit. Een intron is een stukje DNA dat niet gebruikt wordt. Alleen de informatie van een exon wordt gebruikt. Exons en introns wisselen elkaar af in een gen. Daar kan gebruik van worden gemaakt. De antisense benadering is interessant voor ziekten waarbij het ‘overslaan’ van een stuk DNA een beter eiwit op kan leveren, of waarbij een ‘ongewenst’ stuk DNA niet afgelezen zou moeten worden. Deze techniek maakt gebruik van oligonucleotiden; korte stukjes DNA of RNA van minimaal dertien tot zeventien basen lang. De basenvolgorde is tegengesteld aan de coderende DNA- of RNA-streng. De antisense-moleculen zijn dus stukjes erfelijk materiaal die de tegenpool zijn van een stuk erfelijk materiaal in de cel. De oligonucleotiden blokkeren de genwerking door zich aan de coderende DNA-streng te binden. Daardoor kan het DNA niet meer afgelezen worden. Eén van de meest veelbelovende strategieën is ‘exon-skipping’. Deze aanpak heeft als doel om de mutatie in het dystrofine gen, dat de vertaling naar het eiwit verstoort, over te slaan. Dus het ‘skippen’ van een exon. Hierdoor zou een Becker-achtig, deels functionerend dystrofine-eiwit gemaakt kunnen worden. Met tijdige behandeling zou het ernstige Duchenne-fenotype misschien achterwege blijven ten gunste van het mildere Beckerfenotype. De toepassing van antisense-therapie wordt echter nog gehinderd doordat de moleculen weer snel worden afgebroken en er nogal wat bijwerkingen zijn. De antisense-moleculen blijken namelijk aanzienlijk minder specifiek dan werd gehoopt. Onbedoeld worden ook andere genen dan de doelgenen uitgeschakeld. Bovendien is het effectief transporteren van de AONs de spiercellen in nog een lastig punt. Gezocht wordt naar methoden met zo min mogelijk toxische bijeffecten.
6
Figuur 3 Schematische weergave van de werking van een antisense oligonucleotide. Hij stopt het verder aflezen van het gen.
Liposomen DNA kan ook ingepakt worden in liposomen om zo de cel binnen te dringen. Liposomen zijn (kunstmatig gemaakte) vetbolletjes en kunnen zeer grote DNA-fragmenten overbrengen zonder dat een immuunreactie te verwachten is. Bovendien beschermen ze het DNA zodat het minder snel wordt afgebroken door het lichaam. In vivo blijken liposomen na injectie in de bloedbaan voornamelijk in longen en lever effectief te zijn. Toch kunnen ze ook zo geconstrueerd worden dat ze doelgericht werken in een bepaald orgaan of celtype. Groot nadeel van deze methode is de inefficiëntie. Liposomen maken geen onderscheid tussen te behandelen en niet te behandelen cellen. Als de genoverdracht al lukt, werkt het therapeutische gen slechts een beperkte tijd. Na verloop van tijd breekt de cel de rondzwevende genen af. In de delende cellen raakt het bovendien verdund, doordat de ingebrachte genen zich verdelen over de dochtercellen.
7
RNA interferentie RNA interferentie is een natuurlijk voorkomend fenomeen in het dieren- en plantenrijk. Het betreft processen waarbij RNA een remmende werking heeft op eiwitvorming. Mogelijk leidt meer kennis over dit mechanisme tot een nieuwe invalshoek voor behandeling van diverse (spier)ziekten. (link ‘RNA interferentie: een nieuwe weg naar therapie?’)
Problemen en de toekomst van biotechnologie De regelgeving omtrent biotechnologie is vooral gebaseerd op het waarborgen van de veiligheid van mens, dier en milieu. In Nederland is een vergunning vereist om met transgene organismen te mogen werken. Onder organismen vallen zowel dieren als ook planten, schimmels, bacteriën etc. Verantwoordelijk voor het verlenen van deze vergunningen is het ministerie van VROM. Zoals eerder beschreven, wordt gentherapie vooralsnog niet in de praktijk toegepast. Eerst moeten een aantal grote praktische moeilijkheden worden opgelost, vooral ten behoeve van de efficiëntie en de veiligheid. Eén van de problemen bij de ontwikkeling van gentherapie voor spierziekten is dat veel verschillende spieren gecorrigeerd moeten worden. Bijvoorbeeld naakt DNA, dat in huid of spierweefsel van proefdieren wordt ingespoten, werkt alleen op de plaats van toediening. Het is onmogelijk alle spieren te injecteren met het therapeutische gen. Daarom wordt er gezocht naar mogelijkheden voor zogenaamde systemische toediening. Het moet dan op één plaats in de bloedbaan worden gespoten en van daaruit in vele spieren terechtkomen. Zoals beschreven verloopt ook het transport van de therapeutische genen naar de cellen niet altijd even efficiënt. Niet elke vector bouwt het gen in het DNA van de gastheercel en soms worden de genen afgebroken waardoor ze slechts korte tijd effectief zijn. Daarnaast bestaat bij de meeste methoden het probleem van uitdoving. Door celdelingen wordt de hoeveelheid therapeutische genen verdund en verzwakt het effect. Belangrijk probleem wat de veiligheid van gentherapie betreft, is de mogelijkheid van een afstotingsreactie. Dit gebeurt vooral bij virale vectoren. De virussen kunnen ook weer actief worden of normale genen veranderen. Bij de antisense methode speelt mee dat soms ook andere genen dan de doelgenen worden uitgeschakeld.
8
Ten slotte is het onbekend of toegediende genen invloed hebben op het nageslacht. Het is namelijk niet uitgesloten dat het nieuwe gen niet alleen in de doelwitcellen terechtkomt, maar ook in de voortplantingscellen. We weten niet hoe de genen zich dan gaan gedragen. Er is daarom nog een lange weg te gaan voordat al deze technieken op grote schaal zullen worden toegepast.
Bij het schrijven van deze tekst is gebruik gemaakt van onderstaande literatuur: -
Contact; febr 2002; Plakken en knippen in spiercellen
-
Development of an antisense-mediated exon skipping therapy for Duchenne muscular dystrophy. A. Aartsma-Rus
-
Breekveldt, J. and Jongerden, J. (1998), "Transgenic Animals in Pharmaceutical Production." Biotechnology and Development Monitor, No. 36, p. 19-22.
-
‘DNA-molekulen zijn geen organisme’, Mediator – juni 2004 – jaargang 15 – nummer 4
-
e ‘Genen in beweging Erfelijkheid in de 21 eeuw’, Elsevier
-
Stephanie Weinreich; Contact; ….. 2005; RNA interferentie: een nieuwe weg naar therapie?
-
www.kennislink.nl
9
