UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOSIE 2011
BIOLOGICKÉ ÚČINKY FLAVONOIDŮ DIPLOMOVÁ PRÁCE
VYPRACOVALA: PAVLÍNA VLČKOVÁ VEDOUCÍ PRÁCE: Doc. RNDr. JIŘINA SPILKOVÁ, CSc. OPONENT: ZADÁNO: 18. 12. 2009 ODEVZDÁNO: 13. 5. 2011 DATUM OBHAJOBY: 2. 6. 2011
Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného kvalifikačního titulu.
Datum: 13. 5. 2011
podpis -2-
Děkuji Doc. RNDr. Jiřině Spilkové, CSc. za odborné vedení při zpracování této diplomové práce. -3-
OBSAH 1 Úvod .............................................................................................. 9 2 Cíl diplomové práce ................................................................... 10 3 Teoretická část ............................................................................ 10 3.1 Základní charakteristika flavonoidů .................................................. 10 3.2 Výskyt .................................................................................................... 10 3.3 Chemická struktura .............................................................................. 11 3.4 Biosyntéza flavonoidů .......................................................................... 12 3.5 Fyzikálně-chemické vlastnosti ............................................................. 13
4 Kvercetin ..................................................................................... 13 4.1 Metabolismus ........................................................................................ 13 4.2 Biologické účinky kvercetinu .............................................................. 13 4.2.1 Antioxidační působení ................................................................ 13 4.2.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 15 4.2.3 Cytoprotektivní působení ........................................................... 17 4.2.4 Protinádorové působení .............................................................. 18 4.2.5 Hepatoprotektivní působení ....................................................... 22 4.2.6 Působení na kardiovaskulární systém ........................................ 23 4.2.7 Působení na nervový systém ...................................................... 25 4.2.8 Hypoglykemické působení ......................................................... 26 4.3 Biologické účinky extraktů obsahujících kvercetin .......................... 27 4.3.1 Antioxidační působení ................................................................ 27 4.3.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 28 4.3.3 Protinádorové působení .............................................................. 28 4.3.4 Působení na nervový systém ...................................................... 28 4.3.5 Hypoglykemické působení ......................................................... 29 4.3.6 Antifungální a antimikrobní působení ........................................ 29
5 Rutin ............................................................................................ 30 5.1 Metabolismus ........................................................................................ 30 5.2 Biologické účinky rutinu ...................................................................... 30 5.2.1 Antioxidační působení ................................................................ 30 5.2.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 31 5.2.3 Cytoprotektivní působení ........................................................... 31 5.2.4 Protinádorové působení .............................................................. 33 5.2.5 Působení na kardiovaskulární systém ........................................ 33 5.2.6 Působení na nervový systém ...................................................... 34 5.2.7 Hypoglykemické působení ......................................................... 35 5.3 Biologické účinky extraktů obsahujících rutin .................................. 36 5.3.1 Antioxidační působení ................................................................ 36 5.3.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 38 5.3.3 Cytoprotektivní působení ........................................................... 39 5.3.4 Protinádorové působení .............................................................. 40 -4-
5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.3.8 5.3.9 5.3.10
Působení na kardiovaskulární systém ........................................ 41 Působení na nervový systém ...................................................... 42 Hypoglykemické působení ......................................................... 42 Hypolipidemické ........................................................................ 43 Působení na gastrointestinální trakt ............................................ 43 Antiparazitární a antibakteriální působení ................................. 45
6 Hesperidin .................................................................................. 46 6.1 Metabolismus ........................................................................................ 46 6.2 Biologické účinky hesperidinu ............................................................ 46 6.2.1 Antioxidační působení ................................................................ 46 6.2.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 46 6.2.3 Cytoprotektivní působení ........................................................... 47 6.2.4 Protinádorové působení .............................................................. 49 6.2.5 Hepatoprotektivní působení ....................................................... 50 6.2.6 Působení na kardiovaskulární systém ......................................... 51 6.2.7 Působení na nervový systém ...................................................... 53 6.2.8 Hypoglykemické působení ......................................................... 54 6.2.9 Hypolipidemické ........................................................................ 55 6.2.10 Působení na gastrointestinální trakt ............................................ 56 6.2.11 Jiné působení .............................................................................. 56 6.3 Biologické účinky extraktů obsahujících hesperidin ........................ 57 6.3.1 Antioxidační působení ............................................................... 57 6.3.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 58 6.3.3 Působení na nervový systém ...................................................... 58 6.3.4 Hepatoprotektivní působení ....................................................... 59 6.3.5 Hypoglykemické působení ......................................................... 59 6.3.6 Působení na gastrointestinální trakt ............................................ 59
7 Diosmin ........................................................................................ 60 7.1 Metabolismus ........................................................................................ 60 7.2 Biologické účinky diosminu ................................................................. 61 7.2.1 Protinádorové působení .............................................................. 61 7.2.2 Hypoglykemické působení ......................................................... 61 7.2.3 Venoaktivní působení ................................................................. 61 7.2.4 Jiné působení .............................................................................. 63 7.3 Biologické účinky extraktů obsahujících diosmin ............................. 63 7.3.1 Antioxidační působení ................................................................ 63 7.3.2 Protizánětlivé působení .............................................................. 64 7.3.3 Protinádorové působení .............................................................. 64 7.3.4 Působení na nervový systém ...................................................... 65 7.3.5 Jiné působení .............................................................................. 66 7.4 Diosmin a hesperidin ............................................................................ 67 7.4.1 Venoaktivní působení ................................................................. 67 7.4.2 Působení na kardiovaskulární systém ........................................ 68 -5-
7.4.3 7.4.4 7.4.5
Hypoglykemické působení ......................................................... 69 Působení na gastrointestinální trakt ............................................ 69 Cytoprotektivní působení ........................................................... 70
8 Diskuze ........................................................................................ 71 9 Závěr ............................................................................................ 79 10 Použitá literatura ....................................................................... 80
-6-
Abstrakt Pavlína Vlčková Biologické účinky flavonoidů Diplomová práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Farmacie
Flavonoidy jsou v širším slova smyslu všudypřítomné rostlinné pigmenty. Jsou to nejvíce
zastoupené antioxidanty v běžné potravě. Nacházejí se např. v cibuli, jablcích, čokoládě, čaji a víně. Tato práce byla zaměřena na shromáždění nových poznatků o biologické aktivitě a mechanismech působení nejčastěji se vyskytujících flavonoidů: flavonolu kvercetinu, jeho glykosidu rutinu a flavanonových glykosidů hesperidinu a diosminu a extraktů tyto flavonoidy obsahujícíh. Kromě antioxidačního působení jsou flavonoidy velmi dobrými inhibitory apoptózy a vykazují tak silné cytoprotektivní působení a jsou schopny potlačit různé druhy nádorového bujení. Dále mohou být využívány k léčbě diabetu mellitu, kardiovaskulárních onemocnění, onemocnění jater, nervových poruch, při GIT potížích a bakteriálních, virových, fungálních a parazitárních infekcí. Účinky se liší podle konkrétního typu flavonoidu. Kvercetin by podle výsledků mnoha studií mohl mít potenciál v léčbě různých typů rakoviny. Rutin je skvělý antioxidant a je využitelný v léčbě běžně se vyskytujících onemocnění jako diabetes a žaludeční vředy. Diosmin a hesperidin jsou nejúčinnější v kombinaci, což bylo potvrzeno v několika klinických studiích zaměřených na terapii žilních onemocnění.
-7-
Abstract Pavlína Vlčková Biologické účinky flavonoidů Diplomová práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Farmacie
Flavonoids in the broad sense of the term are ubiquitous plant pigments. They are the most represented antioxidants in common diet. Flavonoids are found, for example in the onions, apples, chocolate, tea and wine. This work was aimed at gathering new findings on biological activity and mechanism of action of the most frequently occurring flavonoids: the flavonol quercetin, its glycoside rutin and flavanone glycosides hesperidin and diosmin and extracts containing these flavonoids. In addition to the antioxidant activity, flavonoids are very good inhibitors of apoptosis show a strong cytoprotective activity and are able to suppress various kinds of cancerous growth. They may also be used in diabetes mellitus therapy, therapy of cardiovascular and hepatic diseases, neural and GIT disorders and bacterial, viral, fungal and parasitic infections. The effects differ according to a particular type of flavonoids. Quercetin, according to the results of many studies, could have potential in the treatment of different types of cancer. Rutin is a great antioxidant and is featured in the treatment of commonly encountered diseases such as diabetes and gastric ulcers. Diosmin and hesperidin are most effective in combination, which was confirmed in several clinical studies aimed at therapy of venous disorders.
-8-
1 Úvod Flavonoidy jsou benzopyranové deriváty vyskytující se ve fotosyntetizujícíh buňkách. Jsou to nejvíce zastoupené antioxidanty v běžné potravě. Bylo identifikováno přes 4000 flavonoidů a mezi jejich hlavní zdroje v potravě patří jablka, cibule, brusinky, moruše, čokoláda, červené ovoce, citrusy, ořechy a pochutiny jako čaj, pivo a víno. Denní příjem flavonoidů se pohybuje mezi 3 až 70mg v závislosti na složení potravy a regionu, odkud jedinec pochází (1). V rostlinách se vyskytují většinou v glykosidické formě s navázaným cukerným zbytkem, ale účinné jsou i aglykony. Flavonoidy jsou obecně považovány za prospěšné a mají prokázané četné biologické a terapeutické účinky. Využití flavonoidů se zakládá na schopnosti normalizovat permeabilitu a lámavost kapilár a na antihemoragickém a antiedematózním působení. Dále jsou inhibitory hyaluronidázy, brání rozšiřování mikrobiálních toxinů tkáněmi a jsou proto podpůrnými prostředky při léčbě infekčních onemocnění. Některé působí také diureticky, rozšiřují cévy a snižují krevní tlak. S vápenatými ionty tvoří komplexní soli, čímž brání srážení krve a uplatňují se při kardiovaskulárních potížích. Flavonoidy potencují účinek vitamínu C, jak při posílení imunity tak při zvyšování antioxidační aktivity. Mají rovněž účinky choleretické, cholagogické a spasmolytické, z čehož vyplývá hepatoprotektivní působení flavonoidů (2). Účinky flavonoidů na žilní systém jsou natolik prozkoumány a doloženy (i v klinických studiích), že se flavonoidy staly hlavními účinnými složkami několika léčivých přípravků a celé řady potravinových doplňků. Používají se hlavně k léčbě žilní nedostatečnosti, k léčbě hemoroidů, krvácivých stavů, ke zlepšení propustnosti a snížení lámavosti kapilár. Mezi nejběžnější přípravky patří Ascorutin® (Zentiva, a.s.), který obsahuje flavonoidní glykosid rutin a kyselinu askorbovou. Rutin se dále nachází v přípravku Anavenol®(Zentiva, k.s.) a v polosyntetické formě jako troxerutin v přípravku Cilkanol® (Zentiva, k.s.) a jako oxerutin (Venoruton Forte®, Novartis s.r.o.) Flavonoidy diosmin a hesperidin jsou hlavními složkami léčivého přípravku Detralex® (Les Laboratoires Servier Industrie, Bidy), který je velmi často předepisován jako doplňková léčba při kardiovaskulárních onemocnění a hesperidin a rutin
přípravku
Cyclo 3 Fort® (Pierre Fabre Medicament, Bolougne). V potravinových doplňcích je rutin přítomen např. v přípravku Celaskon Limetka spolu s vitamínem C a hesperidin a diosmin v přípravcích Mobiven Micro, Vitavenon a Valoven Elastic, Hemodin, Hemostop Probio a dalších. -9-
2 Cíl diplomové práce Cílem diplomové práce bylo zpracování nových poznatků o biologických účincích flavonoidů publikovaných v odborné literatuře v období od r. 2008 do r. 2010. Pozornost byla zaměřena na biologickou aktivitu kvercetinu, rutinu, hesperidinu a diosminu a aktivitu extraktů obsahujících tyto flavonoidy. Nashromážděné údaje byly v textu rozděleny podle jednotlivých látek a jejich terapeutických vlastností.
3 Teoretická část 3.1 Základní charakteristika flavonoidů Flavonoidy jsou v širším slova smyslu všudypřítomné rostlinné pigmenty. Jsou téměř vždy rozpustné ve vodě a způsobují zbarvení květů, plodů a někdy i listů, např. žluté flavonoidy (chalkony, aurony a žluté flavanoly) a červené, modré nebo nachové antokyany. Mohou být i bezbarvé, v tomto případě přispívají k výslednému zbarvení jako kopigmenty , např. kopigmenty flavonu a flavanolu stabilizují nachovou barvu antokyanů. Některé molekuly flavonoidů absorbují UV záření a jsou rozeznatelné pouze hmyzem. Flavonoidy se nacházejí také v kutikule listů a epidermálních buňkách, kde zajišťují ochranu tkání před ničivým působením UV záření. Všechny flavonoidy -asi 4000 - mají společný biosyntetický původ, a proto obsahují stejný základní strukturní element, 2-fenylchromanový skelet. Podle stupně oxidace centrálního pyranového kruhu, který může být i otevřený nebo recyklizovaný na furanový kruh (dihydrofuranony)se flavonoidy dělí do více než deseti skupin: deriváty 2-fenylbenzopyrilia, 2-fenylchromony, 2-fenylchromany, chalkony, dihydrochalkony a 2-benylidenkumaranony (aurony). Tato diplomová práce je zaměřena na deriváty 2-fenylchromonu: flavanoly a flavanony (3).
3.2 Výskyt Flavonoidy se vyskytují téměř ve všech rostlinách. Dosud nebyly nalezeny žádné flavonoidy v řasách. Běžný je výskyt v meších (Bryophytes), kapraďorostech (Pteridophytes), přesličkách (Equisetales). V nahosemenných rostlinách (Gymnospermae) se distribuují podle funkce orgánu (dřevo, kůra, list). U krytosemenných rostlin (Angiospermae) se nacházejí strukturně rozmanitější flavonoidy.
- 10 -
Ve vodě rozpustné flavonoidní glykosidy se akumulují ve vakuolách, u některých druhů také v epidermis listů nebo v epidermis a mezofylu. V květech se koncentrují v epidermálních buňkách. Volné aglykony, jejichž lipofilita je zvýšená parciální neb úplnou methylací hydroxylových skupin, se nacházejí především v kutikule listů. Týká se to převážně rostlin rostoucích v suchých a polosuchých oblastech, které mají sekreční orgány (3).
3.3 Chemická struktura Většinu flavonoidů reprezentují flavony a flavonoly (kvercetin a rutin). Kruh A mají na C5 a C7 substituovaný hydroxylovými skupinami, které mohou být volné, eterifikované nebo glykosidicky vázané. Kruh B je často 4'-substituovaný, 3',4'-disubstituovaný nebo 3',4',5'-trisubstituovaný hydroxylovými či methoxylovými skupinami. Pro flavanony (hesperidin a diosmin) a dihydroflavonoly je typická absence 2,3-dvojné vazby a přítomnost alespoň jednoho asymetrického centra. Přírodní flavanony mají na C2 konfiguraci 2S, zatímco u dihydroflavonolů mohou existovat čtyři izomery. Spojením dvou reaktivních center na C6 a C8 jednotlivých flavonoidů vznikají biflavonoidy. Obě biflavonoidové jednotky mohou a nemusí být stejného strukturního typu. Většinou se jedná o dimery flavonů a flavanonů, které jsou 5,7,4'-trisubstituované a jsou spojeny
vazbou
C-C
(amentoflavon)
nebo
C-O-C
(hinokiflavon).
Jsou
typické
pro nahosemenné rostliny. Chalkony neobsahují centrální heterocykl a mají tříuhlíkatý řetězec s keto skupinou, který je v poloze α a β nenasycený. Pro aurony je charakteristická struktura 2-benzylidenkumaranonu. Flavonoidní glykosidy obsahují cukerný zbytek, který může být tvořen mono-, di- nebo trisacharidem. Mezi monosacharidy se nejčastěji objevuje D-glukóza, D-galaktóza, D-allóza, L-arabinóza, L-rhamnóza, D-xylóza
a D-glukuronová nebo D-galakturonová
kyselina. Cukr se může vázat na jakoukoli hydroxylovou skupinu aglykonu, u flavonů je to nejčastěji poloha 7, u flavonolů poloha 3 nebo se váže přímo na aglykon vazbou C-C a vznikají tak C-glykosidy (3).
- 11 -
3.4 Biosyntéza flavonoidů Chalkony vznikají kondenzací tří jednotek acetátu (kruh A) a kyseliny skořicové (kruh B) působením enzymu chalkon syntázy. Následnou cyklizací za přispění chalkon izomerázy se formuje centrální pyranový kruh. Tato hypotéza byla potvrzena experimenty s radioaktivně - 12 -
značenými prekurzory a s enzymy v tkáňových kulturách a rostlinách. Chalkony spontánně izomerizují na racemické flavanony, z kterých se dále působením různých enzymů syntetizují jednotlivé flavonoidy.
3.5 Fyzikálně-chemické vlastnosti Většina glykosidů je dobře rozpustná ve vodě i v etanolu, výjimkou je rutin a hesperidin. Aglykony jsou rozpustné v nepolárních organických rozpouštědlech. Pokud obsahují alespoň jednu fenolickou skupinu, rozpouštějí se v alkalickém roztoku hydroxidu. Lipofilní flavonoidy se extrahují středně polárními rozpouštědly, glykosidy za zvýšené teploty acetonem nebo vodnými alkoholy. Flavonoidy se separují a čistí chromatografickými metodami (3).
4 Kvercetin 4.1 Metabolismus: Kvercetin, 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavon patřící do skupiny flavon-3-olů, se běžně vyskytuje v ovoci a zelenině. Jako aglykon je méně hydrofilní a tudíž se vstřebává pasivní difúzí přes endoteliální membránu gastrointestinálního traktu. Po absorpci se kvercetin metabolizuje v různých orgánech, např. v tenkém střevě, tlustém střevě, játrech a ledvinách. Metabolity vznikající v tenkém střevě a játrech jsou výsledkem působení biotransformačních enzymů a proto zahrnují methylované, sulfatované a glukuronidované formy. Kvercetin a jeho metabolity se nejvíce kumulují v játrech, ledvinách a v plicích (u potkanů) (4).
4.2 Biologické účinky kvercetinu 4.2.1 Antioxidační působení Antioxidačním působením kvercetinu došlo k inaktivaci lipoxygenázy-1, enzymu důležitého v zánětlivém procesu. Enzym byl inaktivován redukcí železitých iontů na ionty železnaté a to chelatací železa v aktivním místě enzymu. Vyřazením enzymu z činnosti se snížila peroxidace kyseliny linoleové (5). Kvercetin chrání červené krvinky před hemolýzou prostřednictvím zhášení volných radikálů. Dvacet minut po inkubaci krvinek kvercetinem byla pozorována inhibice oxidačního - 13 -
vzplanutí neutrofilů a inhibice 2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydrochloridem (AAPH) indukované oxidační hemolýzy. Kvercetin zesiluje rezistenci buněčné membrány proti destrukci volnými radikály (6). Antioxidační aktivitu kvercetinu lze využít v prevenci ztráty svalové hmoty a potlačení rozvoje svalové atrofie. U myší, které podstoupily test zavěšení za ocas, došlo nepoužíváním svaloviny k atrofii. Biochemické testy prokázaly zvýšení peroxidace lipidů v atrofických svalech a zvýšenou expresi ubikvitin ligázy, která aktivuje ubikvitinem stimulovanou degradaci proteinů. Kvercetin oba tyto nežádoucí jevy potlačuje a zabraňuje tak ubývání svalové hmoty (7). U potkanů s diabetem indukovaným streptozotocinem měl kvercetin pozitivní vliv na spermatogenezi a oxidační stres. Změny v antioxidační kapacitě jsou typickým projevem chronického diabetu a ve velké míře ovlivňují také vývoj a životaschopnost spermií. Po léčbě kvercetinem byl zaznamenán nárůst počtu a věší odolnost a pohyblivost spermií, zvýšená hladina sérového testosteronu, zlepšení degeneračních a zánětlivých projevů ve varlatech a zmenšení hmotnosti varlat. Kvercetin zlepšuje reprodukční funkce u diabetických potkanů (8). Kvercetin také dokázal odvrátit negativní dopady dietylstilbesterolu na spermatogenní buňky křečků. Účinek spočívá v potlačení působení oxidačního stresu zvýšením hladin enzymových antioxidantů (superoxid dizmutázy a glutationperoxidázy). Kvercetin zvýšil životaschopnost spermatogenních buněk a zeslabil reprodukční toxicitu syntetických estrogenů z prostředí (9). Na modelu embryí kuřat vystavených působení 4-nitro-3-fenylfenolu, vznikajícího při spalování nafty, neprokázal kvercetin žádné toxické účinky na spermatogenní buňky, naopak zvýšil životaschopnost testikulárních buněk a snížil kondenzaci jader a vakuol v plazmě. Dále snížil peroxidaci lipidů a zvýšil hladiny endogenních antioxidantů, jako glutation peroxidázy a superoxid dizmutázy. Kvercetin zvrátil všechny nežádoucí dopady oxidačního stresu na testikulární buňky (10). Protektivní aktivita kvercetinu byla prokázána na modelu poškození plic potkanů indukovaným paraquatem, neselektivním herbicidem. Paraquat (50 mg/kg) podaný intraperitoneálně
potkanům
vyvolal
zvýšení
hladiny
malondialdehydu
a
exprese
hemoxygenázy-1 a snížení celkové radikálové zhášecí kapacity. Aplikace kvercetinu v jedné denní dávce po dobu 14 dnů po instilaci paraquatu potlačila všechny předešlé změny a navíc zmírnila zvýšenou distribuci fibroblastů a depozici kolagenu v plicích vznikající jako důsledek poškození plic (11). - 14 -
Nejen kvercetin, ale i jeho glykosid rutin má prokázanou antioxidační aktivitu. Ta byla měřena spektrofotometricky na modelu homogenního roztoku a micelárního systému cetyltrimethylamonium chloridu. Volné radikály byly produkovány rozkladem azo-sloučenin AAPH (2,2'-azobis-(2-methyl-propanimidamid dihydrochlorid)) a AIBN (2,2′-azobis(2methylpropionitril)) a aktivita flavonoidů byla určena stupněm formace volných radikálů za použití cetyltriamonium chloridu jako katalyzátoru. Bylo prokázáno, že rutin je 4-10 krát slabší antioxidant než kvercetin (12). Na modelu nativních a cholesterolem modifikovaných erytrocytů vystavených tercbutylhydroperoxidu byla prokázána antioxidační aktivita kvercetinu a rutinu. Protektivní účinek obou látek je závislý na membránovém obsahu cholesterolu. Výsledky prokázaly, že kvercetin poskytuje lepší ochranu než rutin proti lipidové peroxidaci, proti vytvoření reaktivních kyslíkových radikálů, erytrofagocytóze a buněčné nestabilitě v oxidovaných erytrocytech s normálním a modifikovaným obsahem cholesterolu. Deplece cholesterolu snižuje ochranu poskytovanou oběma antioxidanty proti vmezeření fosfatidylserinu, erytrofagocytóze a hemolýze. Tento nižší stupeň ochrany pravděpodobně odpovídá nízkému obsahu antioxidantů v erytrocytární membráně způsobené deplecí cholesterolu, nebo dokonce nižší účinnosti antioxidantů v modifikovaném lipidovém prostředí (13). Antioxidační aktivita rutinu je uvedena v kapitole 5.2.1.
4.2.2 Protizánětlivé působení Kvercetin a jeho deriváty vykazují inhibiční potenciál vůči indukovatelné syntáze oxidu dusnatého, isoenzymu zodpovědného za tvorbu oxidu dusnatého jako obranného mechanismu při zánětlivé reakci. Za použití „docking testu”, který pomocí výpočtů simuluje preferovanou vzájemnou polohu dvou molekul před vytvořením vzájemných vazeb a formováním stabilního komplexu, bylo zjištěno, že vodíkové vazby mezi kvercetinem a indukovatelnou
syntázou
jsou
vždy
tvořeny
amidovou
skupinou
z glycinových
a trypsinových zbytků v aktivním místě syntázy a 4-karbonylovou skupinou flavonoidů. Vznikem stabilního komplexu mezi flavonoidem a syntázou, dojde k inaktivaci enzymu a následné inhibici tvorby oxidu dusnatého a tím i inhibici zánětlivé reakce (14). Inhibicí peroxidace linolové kyseliny katalyzované lipoxygenázou ze sojových bobů potvrdil kvercetin protizánětlivé účinky. Lipoxygenáza-1, enzym hrající důležitou roli v zánětlivém procesu, byla inaktivována redukcí železitých iontů na ionty železnaté a to chelatací železa v aktivním místě enzymu. V pseudoperoxidázovém testu byl kvercetin - 15 -
pomalu oxidován hydroperoxidem na poměrně stabilní intermediát, který také inhibuje enzymovou oxidaci linolové kyseliny, pravděpodobně jako chelátor (5). Na modelu lidských adipocytů vystavených působení tumor nekrotizujícího faktoru α, zánětlivého cytokinu, jehož hladina je zvýšená u obézních a diabetických jedinců, prokázal kvercetin uplatnění v zánětlivém procesu. Kvercetin potlačil expresi zánětlivých genů (interleukinu-6, -1β, -8 a monocytárního chemoatrakčního proteinu 1), stejně jako sekreci zánětlivých látek (interleukinů), vyvolanou tumor nekrotizujícím faktorem. Dále snížil transkripční aktivitu nukleárního faktoru κB, prozánětlivého proteinu, a zabránil fosforylaci serinu v inzulinovém receptoru (15). Kvercetin také inhibuje oxidační a zánětlivé působení ko-planárních polychlorovaných bifenylů, široce rozšířených kontaminant životního prostředí. Vystavení buněk chlorovaným bifenylům vede k aktivaci aryl-uhlovodíkového receptoru a následné indukci exprese responzivních genů zodpovědných za zánětlivou reakci. Kvercetin blokuje indukci cytochromu P450 1A1 a snižuje expresi proteinu caveolinu-1, sloužícího k transdukci signálu a indukci zánětlivých parametrů (16). Na modelu potkanů s kompresním poraněním míchy se zjistil protizánětlivý a následný neuroprotektivní účinek kvercetinu. Kvercetinem léčení potkani vykazovali snížení aktivity myeloperoxidázy a nižší počet bílých krvinek v žilní krvi, což signalizuje potlačení zánětlivé reakce v místě poškození. Kvercetin by mohl mít význam v léčbě zánětlivých poškození míchy (17). Kvercetin v dávce 20 mg/kg podaný potkanům s experimentální autoimunní myokarditidou, vyvolanou injekcí prasečího srdečního myosinu, zmírnil dopady této nemoci. Snížil poměr hmotnosti srdce a celého těla a zlepšil mikroskopické a makroskopické nálezy. Dále snížil incidenci myokarditidy potlačením produkce prozánětlivých cytokinů (tumor nekrotizujícího faktoru α, interleukinu-12 a -17) a zvýšením sekrece protizánětlivých látek (interleukin-10) (18). Kvercetin působil protizánětlivě na modelu experimentální periodontální destrukce u potkanů.
Tato
destrukce
byla
vyvolána
injekcí
lipopolysacharidu
(endotoxinu
gramnegativních bakterií) v dávce 5 mg/ml. Následně podaný kvercetin (75 mg/kg) snížil lipopolysacharidem indukované zvýšení tvorby osteoklastů, snížil zánětlivou buněčnou infiltraci pojivové tkáně. Kvercetin také snížil ligaturou zvýšený zánět periodontu a ztráty kosti (19). K dosažení účinku na modelu bleomycinem vyvolané fibrózy byly použity lipozómy s kvercetinem. Lipozómy zlepšují rozpustnost kvercetinu ve vodě a umožňují selektivní - 16 -
akumulaci v plicní tkáni. Injekční aplikace lipozómů jeden den před vyvoláním fibrózy a poté další čtyři týdny vedla ke snížení exprese zánětlivých cytokinů (tumor nekrotizujícího faktoru α, interleukinu-1β a -6) v bronchoalveolární tekutině a ke snížení počtu makrofágů a neutrofilních lymfocytů. Léčba kvercetinem zmenšila rozsah postižených míst fibrózou a depozici kolagenu související se sníženou expresí transformujícího růstového faktoru β1 (TGF-β1) (20).
4.2.3. Cytoprotektivní působení Kvercetin ochránil ledviny před nefrotoxicitou vyvolanou chloridem kademnatým (5 mg/kg). Kadmium způsobuje poškození ledvin, které se projevuje zvýšenou hladinou sérové močoviny, kyseliny močové a kreatininu a sníženou clearence kreatininu. Dále indukuje oxidační stres v ledvinné tkáni projevující se zvýšením markerů lipidové peroxidace, snížením hladiny neenzymatických a enzymatických antioxidantů. Navíc vyvolává nekrózu tubulů, degeneraci, dilataci a ztenčení bazální membrány. Kvercetin zmírňuje kadmiem indukované biochemické změny v séru, moči i renální tkáni a rovněž potlačuje patologické projevy toxicity (21). Na modelu potkanů vystavených působení olova prokázal kvercetin cytoprotektivní působení detekovatelné pomocí „ tunel testu”, sloužícího k určení fragmentů DNA vznikajících při poškození. Olovo výrazně poškozuje buňky ledvin a vyvolává zvýšení reaktivních forem kyslíku a snížení enzymových antioxidantů v ledvinách, což následně vede k poškození a apoptóze ledvinných buněk. Kvercetin jako silný antioxidant redukuje přítomné volné radikály a zvyšuje poměr funkčních antioxidantů, čímž současně zlepšuje funkci ledvin a potlačuje vzniklé histopatologické změny (22). V in vitro studiích na modelu PC12 buněk feochromocytomu z ledvinné dřeně potkanů bylo zjištěno, že kvercetin zvyšuje odolnost a přežívání buněk v přítomnosti peroxidu vodíku a terc-butylhydroperoxidu (23). Předléčení kvercetinem (50 nebo 100 mg/kg) významně snížilo klastogenenezi a apoptózu
kostní dřeně u myší indukovanou cytostatikem cisplatinou. Kvercetin díky
antioxidační aktivitě zamezil peroxidaci lipidů a zvýšil hladinu glutationu, čímž zabránil poškození buněk kostní tkáně (24). Kvercetin má cytoprotektivní účinek na normální a glukózo-6-fosfát-deficitní erytrocyty. V erytrocytech vystavených působení peroxidu vodíků byl zaznamenán nárůst hladiny reaktivních substancí s kyselinou thiobarbiturovou a pokles hladiny glutationu. - 17 -
Po aplikaci kvercetinu v rozmezí koncentrací 15-75 mM se hladiny těchto složek vrátily k normálu, což dokazuje, že kvercetin chrání buňky před působením volných radikálů a oxidačního stresu (25). Kvercetinu ochránil DNA před poškozením vyvolaným idarubicinem, antracyklinovou protirakovinnou látkou, která může působit genotoxicky a způsobit zlomy vláken DNA. Na modelu plasmidové DNA (pBR322) za využití bezbuněčné gelové elektroforézy (založené na pohybu molekul nukleových kyselin v elektrickém poli) se zjistilo, že kvercetin výrazně snížil rozsah zlomů DNA v závislosti na dávce, přičemž koncentrace 100 µM kvercetinu tyto změny téměř kompletně potlačila (26). Předléčení jednovrstvých buněk ECV304 kvercetinem (10 µmol/l) výrazně snížilo poškození „tight junction” neboli těsných spojení mezi buňkami způsobené neletální koncentrací peroxidu vodíku (100 µmol/l). Těsné spoje jsou důležitou kontrolní strukturou paracelulárního transportu přes epiteliální/endotelovou bariéru. Kvercetin potlačuje nežádoucí účinky peroxidu vodíků a zvyšuje expresi proteinů potřebných pro vytvoření těsných spojů, proteiny zonula occludens a occludin a inhibuje aktivitu mitogen-aktivované proteinkinázy (27). Na modelu myší vystavených UV-B záření se zjistila fotochemoprotektivní aktivita kvercetinu. Mikroemulze (voda v oleji, v/o) s kvercetinem aplikovaná před a 15 dní po působení záření snížila výskyt histopatologických změn na kůži, hlavně poškození pojivové tkáně. Na modelu myších buněk L929 byla potvrzena bezpečnost kvercetinu, stejně jako pozitvní vliv na infitraci zánětlivými buňkami a ovlivnění tloušťky epidermis (28).
4.2.4 Protinádorové působení Silná protirakovinná aktivita kvercetinu byla potvrzena na několika modelech buněk rakoviny tlustého střeva (29), (30) a (31). Kvercetin inhibuje růst DLD-1 buněk rakoviny tlustého střeva dvěma mechanismy. Prvním je inhibice aktivity ornitindekarboxylázy, enzymu účastnícího se syntézy polyaminů, které jsou zapojené do buněčného růstu a diferenciace. K potlačení aktivity enzymu stačí koncentrace ≥50 µM kvercetinu. Koncentrace ≥70 µM způsobuje významnou redukci přeměny MTT tetrazoliové soli (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu) a inkorporaci [ 3H]-thymidinu, značící sníženou proliferaci buněk. Druhý mechanismus účinku kvercetinu na rakovinné buňky je vyvolání apoptózy (29).
- 18 -
Na modelu buněk rakoviny tlustého střeva HT-29 se zjistilo, že podání kvercetinu významně snížilo životaschopnost buněk zastavením buněčného cyklu ve fázi G1 a zvýšením množství apoptózu-vyvolávajích proteinů, jako je p53, AMPK (adenosinmonofosfátemaktivovaná proteinkináza, fyziologický senzor buněčné energie) a p21 (30). Protirakovinné působení kvercetinu na rakovinné buňky tlustého střeva se ještě zvyšuje po jeho glykosidaci. Bylo to prokázáno na modelu buněk Caco-2. Kvercetin-3glukosid (isokvercitrin) zvyšuje aktivitu diferenciačních markerů, alkalické fosfatázy a dipeptidylpeptidázy, mnohem více než samotný kvercetin a tím je účinnější v inhibici růstu a diferenciace rakovinných buněk (31). Kvercetin působí i na jiné typy rakovinného bujení. Navozuje apoptózu rakovinných buněk prostaty PC-3 potlačením aktivity růstových faktorů podobných insulinu a zvýšením aktivity
kaspázy
3,
pro-apoptického
proteinu.
Apoptóza
byla
potvrzena
ztrátou
mitochondriálního membránového potenciálu a hladiny apoptických proteinů analytickou metodou western blot, používanou k detekci specifických proteinů ve směsi. Kvercetin může být velmi důležitý v léčbě androgen independentní rakoviny prostaty (32). Spolu s epigalokatechingalátem působí synergicky na eliminaci kmenových buněk rakoviny prostaty, které jsou zodpovědné za růst a invazi rakoviny. Obě látky potlačují sebeobnovovací schopnost kmenových buněk, indukují apoptózu a blokují migraci a invazi buněk aktivací kaspáz a inhibicí exprese Bcl-2 proteinů. Kvercetin s epigalokatechingalátem by tak mohl sloužit k prevenci a léčbě rakoviny prostaty (33). Mezi další typy hormonálně dependentních tumorů patří karcinom prsu a děložního hrdla (34), (35) a (36). Kvercetin vyvolává apoptózu buněk rakoviny prsu MCF-7 v závislosti na době působení a na dávce. Rakovinné buňky byly vystaveny působení kvercetinu po dobu 24 a 48 hodin v koncentraci 10-175 µM. Kvercetin snížil počet životaschopných buněk, zastavil buněčný cyklus v S-fázi snížením exprese proteinu CDK2 a zvýšením proteinu p53, spouštějícího apoptózu. Předešlá 48 hod inkubace buněk prokázala zvýšení apoptického proteinu Bcl-2 a zvýšení aktivace kaspáz (34). Buňky MCF-7 rezistentní na tamoxifen, antagonistu estrogenových receptorů vykazují zvýšenou angiogenní činnost, což má za následek rychlejší vývoj nemoci. Kvercetin potlačuje angiogenezi inhibicí zvýšené sekrece vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) prostřednictvím inhibice sekrece Pin-1, peptidyl-prolyl cis/trans isomerázy, jejíž deregulace způsobuje rakovinné bujení. Kvercetin by mohl být využitelný v léčbě tamoxifen rezistentního karcinomu prsu (35). - 19 -
Na modelu lidských buněk rakoviny děložního hrdla (HeLa buněk) potlačil kvercetin životaschopnost HeLa buněk zastavením buněčného cyklu ve fázi G2/M. Následovala apoptóza mitochondrií prostřednictvím indukce proteinu p53, zabraňujícího vzniku nádorů, a inhibice nukleárního faktoru κB, zodpovědného za rozvoj rakoviny. Tato indukce, resp. inhibice měla za následek změny v morfologii jádra, v tvorbě fosfatidylserinu, up regulaci proapoptických proteinů z rodiny Bcl-2 a down regulaci antiapoptických proteinů. Z výsledků vyplývá, že kvercetin působí antiproliferativně a apopticky (36). U lidských buněk karcinomu jater HepG2 zastavil kvercetin buněčný cyklus indukcí exprese inhibitoru cyklu p21WAF a indukcí exprese a aktivity HIF-1α (hypoxiíindukovatelného faktoru). Kvercetin rovněž prodloužil biologický poločas tohoto faktoru a potlačil hydroxylaci prolinu v transaktivační doméně faktoru, která vede k jeho destabilizaci a tím podporuje jeho působení na zastavení buněčného cyklu (37). Antiproliferativní účinek kvercetinu na karcinom pankreatu se zvyšuje současným podáním dalších látek. Spolu s daunorubicinem působil apopticky na dvě použité buněčné linie, jednu na daunorubicin senzitivní, druhou rezistentní. Pomocí sulforodaminu B (jaderného barviva) bylo prokázáno, že kvercetin vykazuje cytotoxické účinky na oba typy buněk a u buněk rezistentních na daunorubicin zvyšuje citlivost na tuto látku. Obě látky působí synergicky, což umožňuje snížení dávky daunorubicinu a následné snížení nežádoucích a toxických účinků (38). Redukce sebeobnovovací schopnosti kmenových buněk rakoviny slinivky a tím i působení proti růstu a proliferaci rakovinných buněk byla rovněž podpořena přidáním další látky, konkrétně sulforafanu, isothiokyanátu izolovaného ze zeleniny. Kvercetin potlačil aktivitu aldehyddehydrogenázy a snižil rezistenci buněk k apoptóze. Navíc se prokázalo, že kvercetin spolu se sulforafanem mají synergické účinky na apoptózu, proliferaci a angiogenezi v nádorových buňkách a že tato ko-inkubace nemá žádné toxické účinky na normální buňky myší (39). Sulforafan nemá synergické účinky s kvercetinem jen na buňky rakoviny slinivky. Stejně působí i na buňky maligního melanomu myší. Obě látky mají protirakovinnou aktivitu a regulují růst, invazi a metastázy rakovinných buněk prostřednictvím ovlivnění exprese matrixových
metaloproteináz,
extracelulárních
matrixových
degradačních
enzymů.
Nejvýznamnější roli hraje metaloproteináza 9, jejíž expresi jak kvercetin tak sulforafan potlačují. Kombinace obou látek je účinnější než kvercetin a sulforafan samotný (40). Kvercetin zvyšuje citlivost primárních buněk chronické lymfatické leukemie na buněčný receptor „ death receptor” (povrchový receptor spouštějící apoptózu), na cytokin - 20 -
TRAIL
(TNF-related-apopstosis-inducing
s glykoproteinem
CD95
vyvolávající
ligand),
apoptózu)
a
anti-CD95
(protilátku
fludarabin,
široce
reagující
používaného
chemoterapeutika. Předléčení kvercetinem zvýšilo buněčnou smrt, aktivitu kaspázy 3 a 9 a apoptickou odpověď buněk leukemie na fludarabin, čímž se zvýšila jeho účinnost. Kvercetin jako netoxická látka by mohl být využitelný v léčbě leukémie (41). Na modelu štěpu z cizí tkáně U937 lidské leukémie vyvolal kvercetin apoptózu spojenou s down regulací Mcl-1, proteinu bránící apoptóze, konformační změnu Bax, proteinu zvyšujícího apoptózu a mitochondriální translokaci, která způsobila uvolnění cytochromu C z buněk. Kvercetin potlačil růst rakovinných buněk (42). Kvercetin dokázal ovlivnit i rozvoj nádorového bujení v mozku, konkrétně na modelu buněk lidského gliomu. K dosažení cílových buněk musel kvercetin přestoupit přes hematoencefalickou bariéru, což bylo potvrzeno na modelu bariéry vytvořené z primárních buněk mozkových endoteliálních mikrocév a buněk astroglií. Kvercetin zastavil buněčný cyklus buněk U251 ve fázi G2/M, zastavil tak proliferaci buněk a spustil jejich apoptózu (43). Spolu v kombinaci s temozolomidem (alkylačním cytostatikem) silněji potlačoval buněčný cyklus a navozoval buněčnou smrt v lidských buňkách astrocytomu. Kvercetin podněcuje nekrózu v rakovinných buňkách a temozolomid indukuje autofagii. V kombinaci dochází k potenciaci účinku obou látek a ke snížení toxicity a nežádoucích účinků. Apoptóza je v buňkách vyvolána mitochondriální cestou prostřednictvím aktivace kaspázy-3 a uvolněním cytochromu C z buněk (44). Kvercetin zastavil proliferaci a snížil viabilitu rakovinných buněk (HCT116). V závislosti na dávce (12,5-50µM) navozuje v buňkách apoptózu a zastavuje buněčný cyklus ve fázi G2/M. Kvercetin inhibuje působení taxolu a nokodazolu a obnovuje životaschopnost léčených buněk po 72 hod. Antagonický účinek látek je spojen se zastavením progrese buněčného cyklu a inhibicí nahromadění cyklinu-B1v organizačních centrech mikrotubulů léčených buněk. Z výsledků vyplývá, že dlouhodobé působení kvercetinu může zastavit proliferaci rakovinných buněk a zároveň snížit účinek některých protirakovinných léčivých látek (45). Kvercetin nemusí působit jen na zastavení rakovinného bujení. Hsieh a spol. vyslovili podezření, že kvercetin díky prooxidační aktivitě může stimulovat a zhoršovat rakovinu ledvin u dlouholetých diabetiků. Na modelu potkanů se streptozotocinem-indukovaným diabetem 2. typu po 28 týdnech nemoci bylo prokázáno, že kvercetin neovlivňuje glykémii, ale zvyšuje incidenci katarakt, poškození glomerulů a výskyt rakovinných buněk ledvin. - 21 -
Jeho negativní působení spočívá v prooxidačních vlastnostech, v ovlivnění sekreci inzulinu a kompetetivní a nekompetetivní inhibici O-metyltransferázy, což vede k zesílení estradiolemindukované tumorgeneze (46).
4.2.5 Hepatoprotektivní působení Kvercetin dokáže ochránit jaterní buňky i před jiným druhem poškození než je rakovinné bujení (37). Hepatoprotektivní aktivita kvercetinu spočívá v prevenci cytotoxického působení oxidu dusnatého, volných radikálů a cytokinů. Hepatotoxicita u potkanů byla vyvolána intraperitoneální aplikací 1 mg/kg lipopolysacharidu, endotoxinu z gramnegativních bakterií a způsobila rozvrat v normálních hladinách jaterních enzymů. Kvercetin jako antioxidant potlačil důsledky oxidačního stresu, zvýšil hladiny endogenních jaterních antioxidantů (redukovaného glutationu a superoxid dismutázy) a snížil hladiny jaterních enzymů alaninaminotransferázy, aspartátaminotransferázy a substancí s thiobarbiturovou kyselinou, značících poškození jater (47). Na modelu potkanů s poškozením jater vyvolaným obstrukcí žlučových cest zmírnil kvercetin (15 mg/kg) histologické změny jater a potlačil proliferaci a fibrózu portálního traktu a infiltraci neutrofily a mononukleárními buňkami prostřednictvím zmírnění následků oxidačního stresu (48). Jaterní buňky HepG2 ochránil před poškozením vyvolaným aflatoxinem 1. Jeho účinek spočíval v inhibici produkce reaktivních forem kyslíku, potlačení cytotoxicity a blokování snížení hladin enzymových antioxidantů (redukovaného glutationu). Orální léčba kvercetinem snížila hladinu sérové laktát dehydrogenázy a snížila lipidovou peroxidaci v játrech i ledvinách (49). Chemoprotektivní účinky kvercetinu, rutinu a ursolové kyseliny na poškození DNA v lidské jaterní buněčné linii HepG2 indukované terc-butylhydroperoxidem (TBHP) byly studovány pomocí kometového testu. Výsledky ukázaly, že kvercetin a ursolová kyselina chrání DNA před poškozením a mají antiproliferativní účinky v buňkách HepG2, což potvrzuje antikancerogenní účinek těchto látek. Protektivní účinek kvercetinu proti poškození DNA způsobené terc-butylhydroperoxidem je pravděpodobné dán přímým působením na TBHP potencováním buněčné antioxidační ochrany. Ursolová kyselina uplatňuje pouze buněčně zprostředkovaný mechanismus, dokonce ani nemá ochranné účinky v souběžné inkubaci. Kvercetin a ursolová kyselina také vykazují zvýšení počtu oprav DNA. Rutin neměl
- 22 -
žádné účinky. Tyto výsledky, získané z jaterních buněk, zdůrazňují a potvrzují chemoprotektivní potenciál kvercetinu a ursolové kyseliny, látek, které mohou pomoci vysvětlit nižší incidenci rakoviny v lidské populaci v oblastech s vysokým příjmem ovoce a zeleniny v potravě. Tyto výsledky také demonstrují, že Hsp70 (heat shock protein) není zapojen do pozorovaného vlivu na HepG2 buňky (50). Kvercetin
potlačuje
toxicitu
paracetamolu.
Současné
podávání
kvercetinu
s paracetamolem, analgetikem a antipyretikem, mělo pozitivní vliv na tkáň ledvin a jater. Paracetamol v těchto tkáních zvyšuje množství reaktivních substancí thiobarbiturové kyseliny, markeru lipidové peroxidace, a snižuje hladiny enzymových antioxidantů (glutationperoxidázy, glutation-S-transferázy, superoxid dismutázy a katalázy) a obsah glutationu. To má za následek oxidační poškození spojené s hematotoxicitou, nekrózou jater prokázanou histopatologickým nálezem a snížením hladin plazmatické transaminázy, globulinu a zvýšením hladin bilirubinu, kreatininu a močoviny. Kvercetin potlačuje peroxidaci lipidů a zvyšuje aktivitu antioxidantů v tkáních. Dále chrání buňky jater před poškozením a obnovuje funkci jater a ledvin (51).
4.2.6 Působení na kardiovaskulární systém Vazodilatační působení kvercetinu spočívá ve zlepšení funkce endotelu. Na modelu aorty potkanů zesílil kvercetin relaxaci aorty a na modelu kravských aortálních endoteliálních buněk prokázal, že zvyšuje intracelulární koncentraci vápenatých iontů a zesiluje stimulaci fosforylace endoteliální syntázy oxidu dusnatého doprovázenou zvýšením produkce oxidu dusnatého, který má vazodilatační účinky. Z výsledků vyplývá, že kvercetin mám významné vazoprotektivní vlastnosti a může mít důležitou roli v léčbě a prevenci vaskulárních onemocnění (52). Spolu s melatoninem vykázal vazoprotektivní vlastnosti u potkanů léčených cisplatinou. Cisplatina, cytostatikum používané k léčbě mnoha typů nádorů, způsobuje u potkanů zúžení lumen aorty, což může mít za následek tromboembolické poškození cév. Kvercetin s melatoninem tuto oblast rozšiřují prostřednictvím vychytávání volných radikálů (53). S dilatací cévního řečiště je spojen i antihypertenzivní účinek. Kvercetin (v dávce 10 mg/kg/den) na modelu potkanů s renovaskulární hypertenzí zvýšil tvorbu oxidu dusnatého, který působí dilatačně na cévy a zlepšil funkci endotelu. Dále významně snížil systolický
- 23 -
krevní tlak a množství přítomných dusitanových a nitroso-forem volných radikálů. Antihypertenzivní účinek spočívá v antioxidační aktivitě kvercetinu (54). Kvercetin podaný lidem a zvířatům trpících hypertenzí (systolický tlak >140 mm Hg a diastolický tlak >90 mm Hg) významně snížil hodnoty krevního tlaku. Účinek je opět zprostředkován snížením oxidačního stresu a dále inhibicí aktivity angiotensin konvertujícího enzymu, zlepšením endoteliální funkce, přímým vlivem na hladkou svalovinu cév a modulací buněčné signalizace a genové exprese (55). Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím správnou činnost kardiovaskulárního systému je rozvoj aterosklerotických změn. Ateroskleróza je velmi častou příčinou vzniku kardiovaskulárních poškození a onemocnění. Antiaterogenní aktivita kvercetinu byla prokázána na modelu HuH7 buněk jater. Léčba kvercetinem (20 µmol/l) zvýšila paraoxonázovou mRNA o 75% spolu se zvýšením aktivity paraoxonázy 1, enzymu podílejícího se na tvorbě HDL-cholesterolu a inhibujícího oxidaci LDL-cholesterolu, a 60% navýšením hladiny proteinu paraoxonázy 1. Dále kvercetin zvýšil translokaci sterol-regulačního elementu vázajícího protein (SREBP2), modulujícího lipidovou homeostázu, z endoplazmatického retikula do buněčného jádra, kde se navázal na element podobný sterol responzivnímu elementu, který je součástí promotoru paraoxonázy 1 a tím zvýšil expresi genu tohoto enzymu. (56). Pozitivní vliv pití alkoholu, konkrétně vína, obsahujícího kvercetin, na aterosklerotické změny byl prokázán na modelu myšího LDL receptoru, zodpovědného za ukládání cholesterolu v buňkách. Jak kvercetin, tak přítomný etanol snižují tvorbu aterosklerotických lézí v aortě up regulací genu jaterní paraoxonázy 1 a následným zvýšením aktivity paraoxonázy 1 v séru. Kvercetin s etanolem zabraňují progresi aterosklerózy (57). Nejen kvercetin potlačuje rozvoj aterosklerózy. I další flavonoidy jako rutin, luteolin, myricetin a kemferol snižují neenzymovou karbamylaci nízko denzitního lipoproteinu (LDL) v závislosti na dávce. Karbamylovaný LDL, vznikající modifikací apolipoproteinu B jako výsledek kondenzace lyzinových zbytků a kyanatanu z močoviny, je hůře rozeznáván receptory a více se ukládá v cévách. Zvyšuje tak riziko vzniku aterosklerózy u pacientů s poškozenými ledvinami. Kvercetin dokáže karbamylaci potlačit pravděpodobně vychytáním kyanatanových iontů a mohl by tak zmírňovat riziko aterosklerózy u pacientů s onemocněním ledvin (58).
- 24 -
4.2.7 Působení na nervový systém Kvercetinu působil neuroprotektivně ve studiích in vitro i in vivo. U buněk gliomu zmírňuje
kvercetin
dopady
oxidačního
stresu
indukovaného
peroxidem
vodíku
a interleukinem-1β. In vivo testy potvrdily vliv kvercetinu na neurodegenarativní poškození zaměřené hlavně na poškození kognitivních funkcí, na ischemické stavy a traumatické úrazy. Kvercetin působí neuroprotektivně při podání kolchicinu a zabraňuje tak kognitivnímu poškození. Na jiném modelu, simulace okluzivní ischemie cerebrální arterie u potkanů snížil kvercetin rozsah ischemických lézí a potlačil zánik hipokampálních neuronů (59). Na modelu neuronálních buněčných kultur se zjistilo, že předléčení kvercetinem vyvolalo zvýšení hladiny celkového glutationu, ale neovlivnilo hladinu mitochondriálního thioredoxinu Trx2, který chrání buňky před oxidačním a redukčním stresem. Translokací nukleárního faktoru Nrf2 a významným zvýšením γ-glutamát-cysteinligázové katalytické podjednotky, enzymu limitujícího rychlost syntézy glutationu, se zvýšila antioxidační obrana buněk. Po kultivaci buněk s peroxidem vodíku nebyl ani kvercetin ani jeho metabolity v buňkách detekovány, ale buňky byly chráněny před neuronální smrtí způsobenou oxidačním stresem (60). Kvercetin podaný myším v dávce 2,5, 5 a 10 mg/kg zmírnil dopady působení streptozotocinu na cerebrální krevní průtok a poškození paměti. Kvercetin obnovil snížený průtok krve mozkovou tkání a zvýšil obsah ATP. Dále snížil hladiny malondialdehydu a dusitanu a zvýšil hladinu glutationu jako důsledek potlačení oxidačního stresu. Kvercetin rovněž potlačil zvýšenou acetylcholinesterázovou aktivitu. Z výsledků vyplývá, že konzumace potravin bohatých na kvercetin může odvrátit demenci spojenou s vaskulárním a neurodegenerativním poškozením (61). Na jiném modelu myší působil kvercetin (v dávce 20 - 40 mg/kg) anxiolyticky a antidepresivně. Účinek kvercetinu spočívá v ovlivnění exprese kortikotropin uvolňujícího faktoru v mozku, jehož hladina je během depresivních a úzkostných stavů zvýšená, což se projevuje změnami chování. Myši byly vystaveny testu nuceného plavání a výsledky prokázaly, že předléčení kvercetinem zlepšilo sociální interakce u myší a snížilo dobu nepohyblivosti v důsledku vyvolaného stresu. Kvercetin antagonizuje depresivní a anxiolytické působení kortikotropin uvolňujícího faktoru (62). Intraperitoneální aplikace kvercetinu potkanům (200 mg/kg) ovlivňuje cyklus spánku a probuzení. Kvercetin významně prodlužuje dobu trvání non REM fáze spánku (non rapid eye movements), při které se snižuje krevní tlak a zpomaluje se dýchání a naopak zkracuje - 25 -
REM fázi spánku (rapid eye movements), ve které se zdají sny a tep a tlak je nepravidelný. Zkrácení REM fáze je možné blokovat intracerebroventrikulární injekcí alkaloidu bikukulinu, antagonisty GABA(A) receptoru (receptoru γ-aminomáselné kyseliny typu A). Z výsledků vyplývá, že kvercetin ovlivňuje spánkový cyklus částečně změnou aktivity GABA(A) receptoru (63). Nazální aplikace lipozomů s kvercetinem zlepšuje kognitivní funkce u dospělých potkanů. Samotný kvercetin je příliš rychle metabolizován a jen obtížně přechází přes hematoencefalicko bariéru. Upravení kvercetinu do lipozómů a nazální aplikace tyto překážky odstraňuje. Léčba kvercetinem (0,5 mg kvercetinu ve 20 µl) v jedné denní dávce po dobu čtyř týdnů způsobila výrazné zlepšení kognitivních funkcí, schopnosti učení se, paměti a také zvýšila hustotu cholinergních neuronů v hipokampu (64). Neuroprotektivní aktivita kvercetinu in vitro a in vivo byla prokázána i na modelu vajíček obojživelníka rodu Xenopus (drápatka). AMPA receptor (receptor α-amino-3hydroxy-5-metyl-4-isoxazolpropionové kyseliny) je jeden z excitačních receptorů hrající roli v postsynaptické neurotransmisi a nadměrná neurostimulace glutamátového receptoru zahrnujícího i AMPA receptor vede k excitační neurotoxicitě. Kvercetin ve vajíčkách injikovaných cyklickou RNA kódující AMPA receptor a stargazin, vedlejší podjednotku AMPA receptoru, inhiboval glutamátem indukovaný vnitřní proud, což mělo za následek sníženou nervovou stimulaci. Účinek kvercetinu je oslabován zvyšující se koncentrací glutamátu a je závislý na membránovém zadržovacím potenciálu (65).
4.2.8 Hypoglykemické působení Antidiabetický účinek kvercetinu byl prokázán na modelu pankreatických buněk INS1. Kvercetin snižuje hladinu glukózy v plazmě, normalizuje glukózovou toleranci a udržuje integritu pankreatických buněk. Dále potencuje účinek glukózy a glibenklamidu (syntetického antidiabetika) na sekreci inzulínu prostřednictvím fosforylace extracelulární kinázy ERK1/2 a chrání pankreatické buňky před oxidačním stresem navozeným peroxidem vodíku (66). Kvercetin zvyšuje sekreci adiponektinu u potkanů krmených stravou bohatou na lipidy. Adiponektin je proteinový hormon účastnící se regulace glukózového a lipidového metabolismu, který hraje důležitou roli při potlačení metabolických rozvratů vedoucích k rozvoji onemocněné jako diabetes mellitus 2. typu, obezita a ateroskleróza. Strava bohatá
- 26 -
na lipidy způsobuje u potkanů zvýšení hladiny glukózy v krvi a vznik oxidačního stresu. Kvercetin jako silný antioxidant redukuje volné radikály a zvyšuje expresi adiponektinu, čímž snižuje hladinu glukózy (67). Na modelu lidských adipocytů vystavených působení tumor nekrotizujícího faktoru α, zánětlivého cytokinu, jehož hladina je zvýšená o obézních a diabetických jedinců potlačil kvercetin expresi zánětlivých genů (interleukinu -6, -1β, -8 a monocytárního chemoatrakčního proteinu 1), stejně jako sekreci zánětlivých látek (interleukinů). Dále zabránil fosforylaci serinu v inzulinovém receptoru a zvýšil příjem glukózy stimulovaný inzulinem, čímž snížil inzulinovou rezistenci častou u obézních a diabetických jedinců (15).
4.3 Biologické účinky extraktů obsahujících kvercetin 4.3.1 Antioxidační působení Vodně alkoholový extrakt z nadzemních částí rostliny Leontodon hispidus (Asteraceae), je bohatým zdrojem flavonoidů, obzvláště kvercetinu. Tento flavonoid je také zodpovědný za antioxidační aktivitu extraktu, která byla prokázána na modelu DPPH radikálu, určením redukční síly s použitím vitaminu C jako pozitivní kontroly a pomocí chelatační aktivity železnatých iontů (měřené spektrofotometricky). Extrakt také prokázal dobrou antihemolytickou aktivitu proti hemolýze způsobené peroxidem vodíku (68). Stejný antihemolytický účinek měl i kvercetin obsažený v obilných otrubách. Antioxidační aktivita byla prokázána modelu DPPH radikálu, na vychytávání oxidu dusnatého a peroxidu vodíku a redukční síle. Antihemolytické působení bylo potvrzeno inhibicí peroxidem indukované hemolýzy erytrocytů u potkanů a v testu hemoglobinem indukované peroxidace linolové kyseliny (69). Extrakt z oddenku rostliny Muscari comosum (Hyacinthaceae) má antioxidační, chelatační a hypoglykemické účinky. Obsahuje flavonoidy, hlavně kvercetin, dále polyfenolické látky a mastné kyseliny. Antioxidační aktivita byla prokázána na modelu DPPH radikálu a redukční schopností železitých iontů (70). Extrakt získaný ze slupek a semen deseti domácích toskánských a mezinárodních odrůd révy Vitis vinifera (Vitaceae) byl zkoumán pro možné antioxidační účinky a celkový obsah fenolických látek a antokyanů (katechinu a epikatechinu v semenech a kvercetinu, rutinu a resveratrolu ve slupkách). Antioxidační aktivita extraktu a čistých látek byla měřena dvěma různými in vitro testy: zhášení stabilního DPPH radikálu a peroxynitritu. Všechny extrakty mají významnou radikálovou kapacitu: slupka z odrůdy Merlot vykázala největší - 27 -
aktivivitu vůči oběma radikálům. Největší aktivitu měly kvercetin, katechin a epikatechin. Mezi kvercetinem, rutinem a resveratrolem byl zjištěn synergický efekt na peroxynitrit, u katechinu a epikatechinu byl efekt aditivní (71).
4.3.2 Protizánětlivé působení Fermentované
matoliny
z hroznů
rostliny
Vitis
vinifera
(Vitaceae)
působí
antialergicky. Hlavní obsahová látka, kvercetin, potlačuje antigenem vyvolanou degranulaci a fosforylaci slezinné tyrosin kinázy (Syk), čímž ji deaktivuje a zabraňuje tak rozvoji hematopoetických malignit a aktivaci zánětlivé reakce (72).
4.3.3 Protinádorové působení Na ovlivnění rozvoje rakoviny orgánu trávicího ústrojí se podílí kvercetin izolovaný z rostliny Gynostemma pentaphyllum (Cucurbitaceae). Kvercetin zastavil buněčný cyklus buněk karcinomu jater Hep3B ve fázi G0/G1 a prostřednictvím ovlivnění uvolnění cytochromu C z mitochondrií vyvolal apoptózu buněk (73). Polyfenoly (kvercetin, resveratrol, kyselina galová) obsažené v červeném víně z rostliny Vitis vinifera (Vitaceae) působí příznivě na kardiovaskulární onemocnění a rakovinné bujení. Rostlinné polyfenoly nepůsobí jen jako antioxidanty, ale také jako prooxidanty katalyzující degradaci DNA v přítomnosti kovových iontů, např. mědi, která je důležitou součástí chromatinu a DNA báze guaninu. Kvercetin a resveratrol jsou schopné vázat měďnaté ionty a redukovat je na ionty meďné, jejichž reoxidace v přítomnosti molekulárního kyslíku vede ke vzniku různých reaktivních kyslíkových forem, které se mohou podílet na degradaci DNA a protirakovinném působení např. v lymfocytech. Antitumorová aktivita polyfenolů spočívá v prooxidační aktivitě a mobilizaci endogenní mědi (74).
4.3.4 Působení na nervový systém Kvercetin, ve vysoké koncentraci obsažený v černém a zeleném čaji (Camellia sinensis, Theaceae), chrání proti cholesterolem indukované neurotoxicitě. Poruchy běžného metabolismu cholesterolu v mozku mohou vést k rozvoji Alzheimerovy choroby a poškození paměti a schopnosti učení v důsledku zvýšené depozice fibrilárního peptidu amyloidu β, zvýšené zánětlivé odpovědi a apoptózy v nervových buňkách. Kvercetin prostřednictvím - 28 -
aktivace AMP (adenosinmonofosfát) - aktivované proteinkinázy reguluje metabolismu lipidů, snižuje syntézu cholesterolu a lipolýzu a chrání tak nervové buňky před poškozením (75).
4.3.5 Hypoglykemické působení Kvercetin 3 - (6-malonyl) glukosid izolovaný jako hlavní obsahová látka z rostliny Morus alba (Moraceae) zlepšuje hyperglykémii a oxidační stres v játrech u obézních myší. Dávka 3mg/kg u myší krmených stravou bohatou na lipidy snížila hladinu glukózy v krvi, zvýšila expresi genů ovlivňujících glykolýzu a snížila koncentraci reaktivních substancí thiobarbiturové kyseliny v játrech a tím i peroxidaci lipidů. Kvercetin 3 - (6-malonyl) glukosid má antidiabetickou a antioxidační aktivitu (76). Extrakt z oddenku rostliny Muscari comosum (Hyacinthaceae) má také antioxidační a hypoglykemické účinky. Obsahuje flavonoidy, hlavně kvercetin, dále polyfenolické látky a mastné kyseliny. Extrakt normalizuje hladinu glukózy v krvi prostřednictvím inhibice sacharidových trávicích enzymů, α-amylázy a α-glukosidázy (77).
4.3.6 Antifungální a antimikrobní působení Kvercetin, epikatechin a taxifolin izolované z listů rostliny Mangifera indica (Anacardiaceae) vykazují antifungální aktivitu vůči pěti druhům hub (Alternarai alternata, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Macrophomina phaseolina a Penicilluimm citrii). Všechny látky použité v různých koncentracích, 100, 300, 500, 700, 900 a 1000 ppm potlačily růst hub, přičemž s rostoucí koncentrací se zvyšovala i antifungální aktivita s poklesem růstu v rozmezí 56-99%, lišící se podle druhu houby (78). Flavonoidy (kvercetin, luteolin, chrysin, isorhamnetin, aj.) izolované z nadzemních částí rostliny Halostachys caspica (Chenopodiaceae) mají antimikrobní a antibakteriální aktivitu. Přičemž aglykony s relativně nízkou polaritou jsou účinnější než jejich glykosidy. Všechny tyto flavonoidy mohou být využity k vývoji antimikrobních a antioxidačních prostředků (79).
- 29 -
5. Rutin 5.1 Metabolismus Rutin, kvercetin-3-O-glukosid, se skládá z aglykonu kvercetinu a disacharidu rutinózy, která je tvořená monosacharidy rhamnózou a glukózou. Poprvé byl izolován z listů routy vonné, Ruta graveolens (Rutaceae), odkud pochází i jeho název (2). Jen malá část
rutinu se absorbuje, protože většina přijatého
flavonoidu
je metabolizována střevní mikroflórou tlustého střeva na různé sloučeniny zahrnující kvercetinové a fenolické deriváty, např. 3,4-dihydroxyfenyloctovou kyselinu (DHPAA), 3,4-dihydroxytoluen (DHT), 3-hydroxyfenyloctovou kyselinu (HPAA). Díky hydrofilnímu charakteru se většina metabolitů vylučuje močí (80).
5.2 Biologické účinky rutinu 5.2.1 Antioxidační působení Reaktivní kyslíkové radikály hrají důležitou roli při poškození ledvin vyvolané ischemií a následnou reperfúzí. Rutin vykazuje protektivní vlastnosti, pravděpodobně inhibicí radikálů a antioxidační aktivitou. Při testování byli požiti potkani (Wistar albino), kterým byla jednostranně odstraněna ledvina, a za dva týdny byli podrobeni 45 minut trvajícímu uzavření levé ledvinné pánvičky následované 3h reperfúzí. Jednu hodinu před navozením ischémie jim byl podáván buď rutin (1g/kg) nebo solný roztok. Na konci reperfúzní periody, jim byly odebrány vzorky ledvin k určení hladin malodialdehydu a glutationu, aktivity manganázsuperoxid dismutázy (Mn SOD) a k histologickému vyšetření. K určení renálních funkcí se měřily koncentrace sérového kreatininu, dusíku z krevní močoviny a laktát dehydrogenázy. Proces ischemie/reperfúze způsobil výrazné snížení hladiny glutationu a aktivity manganáz-superoxid
dismutázy,
což
následně
způsobilo
výrazné
zvýšení
hladiny
malondialdehydu v renální tkáni. Podobně se zvýšily také hladiny sérového kreatininu, dusíku a laktát dehydrogenázy ve srovnání s kontrolní skupinou. Podání rutinu před zákrokem významně zmírnilo renální dysfunkci, potlačilo zvýšenou hladinu malondialdehydu a obnovilo vyčerpanou aktivitu Mn SOD a hladinu glutationu. Tyto prospěšné změny v biochemických parametrech byly také spojeny se změnami v histopatologických nálezech (81).
- 30 -
Zpracování rutinu do vodné nanostrukturované dispreze přineslo zlepšení fotostability a prodloužení in vitro antioxidační aktivity. Antioxidační aktivita byla hodnocena formací hydroxidového radikálu vzniklého po vystavení hydrogenperoxidu UV záření. Nanostruktury s rutinem se méně rozkládaly v porovnání s etanolovým roztokem rutinu. Pro prodloužení antioxidační aktivity je důležitá přítomnost polymerní vrstvy v nanočásticích (82).
5.2.2 Protizánětlivé působení Rutinu dokáže odvrátit negativní dopady septické artritidy způsobené kvasinkou Candida albicans, hlavním patogenem způsobujícím fungální artritidu. Rutin (1 mg) byl podáván intraperitoneálně ve třech denních dávkách 24 h po infikování. Edém packy byl měřen 17 dní. Výsledky prokázaly, že rutin zmenšil edém o 45% v 11. den. Po dalších 6 dnech došlo k dalšímu zmenšení o 35%. Zjistilo se, že anti-artitická aktivita rutinu je způsobena jeho schopností inhibovat produkci oxidu dusnatého z proliferujících se makrofágů a T-lymfocytů. Tento flavonoid také inhibuje růst kvasinkových buněk Candidy albicans a nezpůsobuje hemolýzu. Tyto údaje značí, že rutin, jež má vlastnosti jak antiartritické, tak antifungální, může být bezpečně podáván do krevního oběhu k léčbě septické artritidy (83). S věkem dochází ve svalech k úbytku leucinu, aminokyseliny, která stimuluje syntézu proteinů. Rutin a další antioxidanty zmírňují zánět a zlepšují anabolickou odpověď ve svalech. Ve studii na 20 potkanech (Wistar), kterým byl podáván rutin, vitamín E, vitamín A, zinek a selen po dobu 7 týdnů bylo zjištěno, že podané antioxidanty neovlivnily přímo svalovou tkáň, ale zvýšily antioxidační a protizánětlivou ochranu v jiných orgánech, např. játrech a slezině a tím došlo ke zlepšení oxidačního stavu ve svalech (84).
5.2.3 Cytoprotektivní působení Bifentrin, syntetický pyrethroid se širokým spektrem insekticidní aktivity, vyvolává oxidační stres v lidských erytrocytech. V in vitro studii byl prokázán antioxidační účinek kvercetinu a rutinu. Inkubace erytrocytů s bifentrinem (42,2; 211 a 1055 ppm) způsobila zvýšení hladiny malondialdehydu a zvýšení peroxidace lipidů a snížila aktivitu superoxid dizmutázy a katalázy. Rutin (80 µM) aplikovaný před bifentrinem potlačil zvýšenou hladinu malondialdehydu. Spolu s kvercetinem (80 µM) zvrátily inhibiční vliv na aktivitu katalázy. Na aktivitu superoxid dizmutázy měl větší vliv samotný kvercetin (85). - 31 -
Účinek rutinu byl sledován i na erytrocytech vystavených působení jiného často využívaného pyretroidu, β-cyflutrinu. Erytrocyty byly inkubovány se třemi koncentracemi pyretroidu (0,43; 215 a 1075 ppm) nebo nejdříve s flavonoidy a poté s β-cyflutrinem. Všechny koncentrace β-cyflutrinu potlačily aktivitu katalázy, aktivitu superoxid dizmutázy významně snížila jen nejvyšší koncentrace látky, která také způsobila hemolýzu 36% erytrocytů. Rutin a kvercetin potlačily hemolýzu a zvýšily hladiny antioxidačních enzymů (86). Při zkoušení vlivu rutinu na peroxidem-indukovanou apoptózu u endoteliálních buněk pupečníkové žíly bylo zjištěno, že preventivním podáním rutinu se výrazně zmírnila peroxidem vyvolaná apoptóza. Bylo prokázáno, že předléčení rutinem výrazně snížilo vytvoření reaktivních forem kyslíku v endoteliálních buňkách vystavených působení peroxidu vodíku. Dále rutin brání zvyšující se formaci fragmentů DNA, depleci glutationu a inhibici kolapsu mitochondriální membrány, která chrání pupečníkovou žílu před oxidativním poškozením a pomáhá rychleji obnovovat její integritu. Rutin (50 µM) blokuje apoptózu snížením reaktivních kyslíkových radikálů, zvýšením glutationu, obnovením napětí mitochondriální membrány a tím zabraňuje poškození DNA (87). Launaea procumbens (Asteracea) se používá k léčbě renálních onemocnění, revmatismu a bolestivého močení. Proti nefrotoxicitě způsobené tetrachlórmetanem u potkanů byly zkoušeny metanolová, chloroformová, ethylacetátová a n-hexanová frakce extraktu. Potkanům rozdělených do 16 skupin byl podán tetrachlórmetan v dávce 3 ml/kg tělesné hmotnosti (30% v olivovém oleji, i.p.) dvakrát týdně po dobu 4 týdnů. Dalším skupinám byl orálně podán extrakt (100, 200 mg/kg tělesné hmotnosti) nebo rutin (50 mg/kg) 48h po aplikaci tetrachlórmetanu nebo 200 mg/kg extraktu bez tetrachlórmetanu opět dvakrát týdně po 4 týdny. Působením tetrachlórmetanu došlo k významnému vytvoření oxidačního stresu v ledvinách. Extrakt a rutin a potlačily důsledky působení oxidačního stresu a zvýšily hladiny enzymových antioxidantů (katalázy, superoxid dizmutázy a glutationu). Pozitivní vliv frakcí extraktu a rutinu byl také zaznamenán na funkci ledvin a na snížení hladiny urobilinogenu, močoviny, albuminu, kreatininu v moči a na histopatologických nálezech snížením glomerulární atrofie, tubulární degenerace, ucpávání krevních kapilár, nekrózy epitelu a otoku (88).
- 32 -
5.2.4 Protinádorové působení Reaktivní formy kyslíku jsou silnými induktory angiogenního hormonu vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF). Ačkoli rutin v kombinaci s vitaminem E vykazují synergické působení na inhibici oxidativního poškození, je nejasné, jestli kombinace těchto dvou látek inhibuje sekreci VEGF v nádorových buňkách. Za použití buněčné linie lidské promyelocytární leukémie (HL-60), bylo prokázáno, že rutin v kombinaci s vitaminem E, vykazují antikancerogenní účinky potlačením vaskularizace nádorových buněk, synergicky snižují expresi VEGF proteinů a mRNA. Dále bylo prokázáno, že tyto látky významně snižují vazebnou kapacitu nukleárního faktoru AP-1 (activator protein-1) k promotoru genu pro VEGF a rovněž snižují expresi proteinu cJun. Dále působí synergicky na redukci exprese proteinu IRS-1 (insulin receptor substrate-1) v buňkách HL-60. Tyto výsledky dokazují, že rutin sám i v kombinaci s vitaminem E má antikancerogenní účinky (89). Rutin indukuje apoptózu v rakovinných buňkách leukemie WEHI-3 u myší BALB/c. Pro tento typ rakoviny je typické zvětšení sleziny. Rutin snižuje procentuální zastoupení markeru Mac-3, ukazujícího, že byla inhibována diferenciace prekurzorů makrofágů a T-buněk imunitního systému a snižuje hmotnost sleziny. Rutin podporuje aktivitu makrofágové fagocytózy (90).
5.2.5 Působení na kardiovaskulární systém U potkanů s kardiotoxicitou vyvolanou isoproterenolem byl studován vliv rutinu na lyzosomální enzymy. Samcům potkanů druhu Wistar, byl předem podán rutin v dávce 80mg/kg jednou denně po 42 dní. Po této době jim byl subkutánně injikován isoproterenol v dávce 100mg/kg každých 24 hodin dva dny po sobě. Byla sledována aktivita sérové kreatin kinasy-MB a hladina sérového troponinu T a aktivity sérových a srdečních lyzosomálních enzymů (β-glukuronidasy, β-N-acetylglukosaminidasy, β-galaktosidasy, katepsinu-B a D), všechny tyto látky měly významně zvýšenou aktivitu a hladiny u potkanů s kardiotoxicitou. Experimentálně vyvolaná kardiotoxicita u potkanů také vedla ke snížení stability membrán, což se odráželo snížením aktivity β-glukuronidasy a katepsinu-D v mitochondriální, jaderné, lyzosomální a mikrosomální frakci.
- 33 -
Podání rutinu před podáním isoproterenolu u potkanů předchází změnám v aktivitě těchto enzymů. Mechanismus působení rutinu spočívá v ochraně lysosomální membrány proti isoproterenolem navozenému srdečnímu poškození a vyplývá ze schopnosti rutinu vychytávat volné radikály, působit antioxidačně a stabilizovat membrány (91).
5.2.6 Působení na nervový systém Schopnost rutinu bránit neurodegeneraci a ovlivnit paměť byla testována na potkanech. K posouzení účinku rutinu byl použit Morrisův vodní labyrint, což je kulatý bazén o průměru 145 cm a výšce 45 cm naplněný vodou do výšky 32 cm a rozdělený na 4 kvadranty. Sledovala se prostorová orientace a schopnost zapamatování si trasy. Ztráta prostorové paměti a ztráta CA3 pyramidálních neuronů v hipokampu byla potkanům vyvolána podáním jedné dávky trimethyltinu (8,5 mg/kg) perorálně. Aplikace rutinu významně zvrátila poškození paměti a zničení pyramidových neuronů v CA3b regionu hipokampu (92). Během ischemicko-reperfúzního poškození mozku dochází vlivem volných radikálů k poškození nervů. Tento stav byl u potkanů navozen uzavřením střední cerebrální arterie Na 2 h a následnou 22 h reperfúzí. Rutin byl podáván v dávce 25 mg/kg jednou denně po dobu 21 dnů před uzavřením arterie. Na potkanech bylo zjištěno, že podáním rutinu se omezila ischemická apoptóza nervů snížením exprese proteinu p53. Pozorováno bylo zabránění morfologickým změnám a zvýšení endogenní antioxidační enzymatické aktivity. Podle autorů práce je rutin perspektivní látkou při snižování rizika nebo zlepšování funkce mozku při obtížích navozených ischémií a reperfúzí (93). Antikonvulsivní efekt rutinu byl studován na potkanech léčených pentylentetrazolem (90 mg/kg, i.p.). Při testování byl zvířatům podáván vodný roztok, rutin a diazepam. Účinek rutinu je závislý na dávce (byl podáván v koncentracích 25, 50, 150 µM), nejlepší výsledky měl rutin v koncentraci 150 µM, to nejvíce oddálil začátek záchvatů ve srovnání s vodným roztokem. Podání flumazenilu (5 µM) zrušilo antikonvulzivní účinek rutinu. Tyto výsledky prokazují,
že
rutin
vykazuje
antikonvulzivní
účinek
prostřednictvím
GABAA–
benzodiazepinového receptorového komplexu. Je možné, že rutin je ligandem pro benzodiazepinový receptor (94). Demografické stárnutí způsobuje nárůst populace s deficity kognitivních funkcí a poruch chování spojených s věkem, což může být spojováno se zvyšující se prevalencí neurodegenerativních poruch, jako Alzheimerova choroba. Při této nemoci, byl pozorován pokles v cholinergním systému, který má hlavní roli při formování paměti. Na modelu ryb - 34 -
Danio rerio (Danio pruhované) s amnézií vyvolanou skopolaminem nebo přerušením cholinergní neurotransmise byla pozorována protektivní úloha kvercetinu a rutinu. Podání flavonoidů zabránilo porušení paměti vyvolané skopolaminem. Ani jedna z těchto látek neovlivnila pohyblivost testovaných ryb. Z výsledků vyplývá, že tyto látky by mohly mít perspektivní využití v léčně neurodegenerativní nemocí (95.)
5.2.7 Hypoglykemické působení Antidiabetické působení rutinu bylo testováno na dospělých potkanech. Diabetes byl navozen intraperitoneálním podáním streptozotocinu (STZ) v dávce 60 mg/kg tělesné hmotnosti rozpuštěného v 0,01M citrátovém pufru. 48h po podání STZ byla změřena glykémie glukometrem a pouze jedinci s glykémií nad 250 mg/dL byli zařazeni do studie. Po 7 dnech byl podáván rutin v roztoku propylenglykolu intraperitoneálně v jedné týdenní dávce 50 mg/kg, po dobu 45 dnů. Rutin byl podáván potkanům bez diabetu a s navozeným diabetem. Podávání rutinu výrazně snížilo hyperglykemii u diabetických potkanů. Hladina celkového cholesterolu, LDL triacylgylceridů byla snížena na původní hodnotu, hladina HDL cholesterolu se zvýšila (96). V jiné studii na potkanech (Wistar), u kterých byl diabetes mellitus způsoben podáním streptozocinu, byl rutin podáván kontrolním potkanům a potkanům trpícím diabetem po dobu 45 dní v dávkách 25, 50 a 100 mg/kg. Sledovaly se hladiny plazmatické glukózy na lačno, glykovaného hemoglobinu, thiobarbiturové kyseliny a jejích reaktivních substancí, lipidové peroxidace, hladina insulinu, C-peptidu, celkového hemoglobinu, proteinů, neenzymových antioxidantů. Po podání rutinu diabetickým potkanům došlo k výraznému zvýšení tělesné hmotnosti. Na zdravé jedince rutin tento efekt neměl. V porovnání s chováním kontrolní diabetické skupiny vykazovala skupina s rutinem snížený příjem potravy a vody, opět nebyly pozorovány žádné výrazné změny u normálních jedinců s rutinem. Rutin podaný ve třech zmíněných koncentracích nemocným jedincům způsobil pokles plazmatické glukózy o 44,36%, 50,92%, 62,73%. Podání stejných dávek zdravým jedincům bylo bez výrazného výsledku. Z těchto závěrů vyplývá, že největší účinek vyvolal rutin v dávce 100mg/kg. Dále rutin zvýšil hladinu plazmatického inzulinu, C-peptidu, celkových proteinů, celkového hemoglobinu a snížil hladinu glykovaného hemoglobinu v porovnání s diabetickými kontrolními krysami.
- 35 -
Rutin se hypoglykemickým a antioxidačním působením výraznou měrou podílí na oddálení pozdních komplikací diabetu, plynoucí ze zvýšených hladin glukózy v krvi a následného vzniku oxidačních a glykosylačních produktů (97).
5.3 Biologické účinky extraktů obsahujících rutin 5.3.1 Antioxidační působení Extrakty z plodů rostliny Aristotelia chilensis (Elaeocarpaceae) byly zkoumány pro své antioxidační působení. Analýzou se zjistilo, že extrakty obsahují rutin, katechin, myricetin, epikatechin, katechin, fenolické kyseliny a antokyanidiny. Všechny vzorky byly porovnávány s aktivitou proti butylhydroxytoluenu (BTH) za použití kvercetinu a tokoferolu jako vzorových látek. Nejvyšší aktivitu prokázal etanolový extrakt a acetonová frakce. Extrakt chrání buňky proti oxidačnímu stresu a lipidové peroxidaci (98). Adaptogenní aktivita vodného extraktu z plodů rakytníku (Hippophae rhamnoides L., Eleagnaceae) byla studována na potkanech vystavených vysokohorským podmínkám. V jedné ze studií byly potkanům podávány různé dávky extraktu (25, 50, 75, 100 a 200 mg/kg tělesné hmotnosti) půl hodiny před vystavením nízkým teplotám a vysoké nadmořské výšce. Maximální efektivní adaptogenní dávka extraktu byla 75 mg/kg. V další studii byl testován vliv na peroxidaci lipidů a antioxidační stav u potkanů vystavených vysokohorským podmínkámbez podání nebo s podáním extraktu. Suplementace extraktem zmírňuje změny v hladinách
malondialdehydu
a
redukovaném
glutationu
a
změny
v aktivitě
glutationperoxidázy, glutationreduktázy, superoxid dismutázy a katalázy. Výsledky prokázaly, že extrakt má schopnost zvyšovat adaptogenní aktivitu (99). Extrakt z plodů a jehličí jalovce Juniperus sibirica. (Cupressaceae) obsahující luteolin-7-O-glukosid, apigenin-7-O-glukosid, luteolin, apigenin, rutin a kvercetin, prokázal antioxidační efekt (vychytávání volných radikálů: DPPH, hydroxylového, superoxidového aniontu a oxidu dusnatého) ve srovnání s butylhydroxytoluenem, známým syntetickým antioxidantem. Dále byla také pozorována protizánětlivá aktivita vzhledem k inhibici COX-1 a 12-LOX (100). Crocus sativus (Iridaceae) se široce využívá jako koření, léčivá rostlina a potravní doplněk ve středomořských a subtropických státech. Antioxidační aktivita tohoto koření je přičítána hlavně obsahu fenolických a flavonoidních látek. Byla zkoumána aktivita extraktu připraveného za použití různých rozpouštědel. Nejvyšší zhášecí radikálovou a chelatační - 36 -
aktivitu vykázal metanolový extrakt z blizen šafránu v koncentraci 300 µg/ml v porovnání s horkou vodou nebo etanolem, ale aktivita byla menší než u použitých antioxidačních standardů, butylhydroxytoluenu a α-tokoferolu. Metanolový extrakt rovněž obsahoval nejvíce fenolických a flavonoidních sloučenin (101). Antioxidační účinek extraktu z listů olivovníku připravený ze tří kultivarů za použití rozpouštědel se vzrůstající polaritou (petroléter, dichlormethan, metanol, metanol/voda 60:40) byl zjišťován na modelu DPPH radikálu. Dále byla také pozorována schopnost fenolických sloučenin inhibovat aktivitu lipoxygenázy. Hlavními obsahovými látkami extraktu jsou rutin, oleuropein, luteolin-7-glukosid, kvercetin a verbaskosid. Polarita rozpouštědla ovlivnila podíl fenolických sloučenin.
Mezi všemi extrakty vykázal největší antioxidační aktivitu
metanol/vodný extrakt (102). Rutin a jiné flavonoidy (apigenin, 3′,6- dimethoxyapigenin a 4′,7- dimethoxyapigenin) byly izolovány z rostliny Teucrium polium L. (Lamiaceae), rostoucí v oblasti Íránu, kde se hojně využívá v tradiční medicíně, pro přípravu čajů a nálevů s účinkém protizánětlivým, antibakteriálním, antihypertenzivním, hypolipidemickým, antirevmatickým a hypoglykemickým. K testování antioxidační aktivity byl použit relativně stabilní organický radikál DPPH a metanolový extrakt z rostliny. Celkový extrakt i rutin samotný vykázaly v testu antioxidační aktivitu. Mechanismus reakce mezi DPPH a antioxidanty je závislý na strukturní konformaci antioxidantů. Největší aktivitu vykazují látky s volnou hydroxylovou skupinou v poloze 3 a 3′,4′ katecholu. K dalšímu testování aktivity rutinu se použil modelový systém β-karoten/linolová kyselina. β-karoten bez přítomnosti antioxidantů rychle podléhá odbarvení. Přítomnost rutinu toto odbarvení výrazně potlačila (103). Antioxidační aktivita vzorků bílé a celozrnné pohankové a pšeničné mouky byla pozorována na modelu DPPH, hydroxylového a superoxidového radikálu, redukční aktivity a chelatační aktivity železnatých iontů. Rutin, kvercetin a ferulová kyselina byly izolovány v obou vzorcích pohankové mouky, zatímco ferulová kyselina v celozrnné pšeničné mouce. Výrazně vyšší obsah fenolů a tokoferolů byl nalezen v pohankové mouce v porovnání s moukou pšeničnou. Pohanková mouka nabízí lepší zhášecí schopnosti na DPPH, hydroxylový a superoxidový radikál, stejně jako lepší redukční aktivitu. Zatímco pšeničná mouka vykazuje lepší chelatační schopnosti. Výsledky potvrdily možnost zlepšení antioxidačních vlastností produktů z pšeničné mouky přidáním mouky pohankové (104). Extrakt z celé rostliny Mucuna pruriens (Fabaceae) prokázal své antioxidační účinky na modelu DPPH radikálu, superoxidového radikálu a chelatační aktivity kovů. Tento extrakt bohatý na rutin a kvercetin vykázal největší aktivitu při použití etylacetátu jako rozpouštědla. - 37 -
Metanolový a petroléterový extrakt prokázaly zhášecí aktivitu nižší. V chelatační aktivitě byl nejúčinnější metanolový extrakt. Lze říci, že extrakt z celé rostliny vykazuje silný antioxidační a zhášecí aktivitu (105). Z listů rostliny Persea americana (Lauraceae) byly izolovány bioaktivní sloučeniny jako rutin, isorhamnetin, luteolin, kvercetin a apigenin. Všechny tyto sloučeniny prokázaly antioxidační aktivitu na modelech DPPH a peroxidovém radikálu. IC50 rutinu byla 1.37 × 10-4 mg/ml, kvercetinu 4.82 × 10-5 mg/ml, luteolinu 3.34 × 10-4 and isorhamnetinu 4.41 × 10-4. Ze studie vyplývá, že listy této rostliny mají antioxidační aktivitu a mohou být prospěšné v prevenci vzniku různých onemocněních souvisejících s oxidačním stresem (106). Na tomtéž modelovém DPPH radikálu prokázaly zhášecí schopnost i extrakty z plodů rostliny Trapa natans L. (Lythraceae), který obsahuje hlavně rutin a kyselinu gallovou (107), rostliny Gynostemma pentaphyllum (Cucurbitaceae) bohaté na flavonoidy (rutin, kvercetin) (108), plodů Prunus armeniaca (Rosaceae), který dále zabraňuje peroxidaci nenasycených mastných kyselin a je bohatý na fruktózu, glukózu, β-sitosterol, α-tokoferol, vitamín D, vitamín K, ergosterol, katechin a myricetin (109), listů rostliny Jacaranda puberta (Bignoniaceae) (110), plodů rostliny Citrus reticulata (Rutaceae) (111), rostliny Salvia pisidica (Lamiaceae) domácí v Turecku a obsahující rutin, katechin a kyselinu gallovou (112) a rostliny Caragana sinica (Fabaceae), která se v Číně používá jako zelenina posilující zdraví (113).
5.3.2 Protizánětlivé působení Použití
extraktu
z listů
rostliny
Tripondanthus
acutifolius
(Loranthaceae)
má dlouholetou tradici při léčbě zánětů. Sloučeniny izolované z tohoto extraktu (rutin, hyperosid, isokvercetin, nikotiflorin, tripodantosidy) mají prokázanou účinnost v inhibici klíčových enzymů zánětlivého procesu. Antioxidační účinek byl dokázán na modelu zhášení DPPH volného radikálu, superoxidového aniontu a inhibicí lipidové peroxidace. Rutin a další flavonoidy přítomné v extraktu vykázaly vysokou schopnost inhibovat aktivitu hyaluronidázy a cyklooxygenázy důležitých enzymů v zánětlivém procesu. Při zkoumání protizánětlivého působení, byla hodnocena i toxicita extraktu. V testu genotoxity na modelu Bacillus subtilis nebyla prokázána žádná buněčná toxicita (114). Dimorphandra mollis (Fabaceae) je rostlina běžně rostoucí ve střední Brazílii a využívající se pro své antioxidační, antiagregační a vazoprotektivní vlastnosti, za což vděčí
- 38 -
hlavní obsahové látce, rutinu. Z této rostliny byl připraven standardizovaný suchý extrakt s obsahem 76, 0±3% rutinu a ten byl podáván potkanům v dávkách 1000 a 2000 mg/kg. U potkanů bylo pozorováno zvýšení výskytu eozinofilů, jinak nebyly pozorovány žádné změny v biochemických a hematologických parametrech. U skupiny dostávající 2000 mg/kg extraktu byla zjištěna hyperaktivita malpigických tělísek a snížení hladiny imunoglobulinu G. Po podání suchého extraktu v dávce 1000 mg/kg nebyla zjištěna žádná toxicita (115). Extrakt z rostliny Hypericum perforatum (Hypericaceae) je známý v tradiční medicíně pro své protizánětlivé účinky, které se využívají v léčbě různých poranění. Aktivita extraktu obsahujícího rutin, isokvercetin, epikatechin byla zkoumána na modelech excize a řezných ran in vivo, antioxidační působení na modelu in vivo založeném na inhibici nárůstu kapilární permeability vyvolané kyselinou octovou. Výsledky potvrdily hojivé působení na rány a protizánětlivou aktivitu extraktu z třezalky (116). Podání polyfenolů (rutinu, kurkuminu, kvercetinu, katechinu, kyseliny ellagové) potkanům krmených stravou bohatou na tuky ovlivnilo hladinu střevního imunoglobulinu A a mucinu. Studie potvrdila, že příjem těchto látek v potravě významně zvyšuje hladinu imunoglobulinu A ve střevech a ve stolici. Dále bylo potvrzeno, že tyto látky neovlivňují hladinu imunoglobulinů u potkanů krmených nízkotučnou stravou (117). Květy rostliny Calendula officinalis (Asteraceae) mají dlouholetou tradici v lidové medicíně. Mezi hlavní využití lze zahrnout léčba popálenin, modřin, kožních a vnitřních zánětlivých onemocnění různého původu. V této studii byl prokázán jejich účinek při ochraně kůže před oxidačním stresem vyvolaným UV-zářením. Obsažené polyfenoly a flavonoidy (rutin a narcisin) prokázaly na dávce závislý antioxidační účinek za použití různých metod in vitro. Orální aplikace extraktu potkanům bez srsti udržela hladinu glutationu blízko hladině kontrolní neozářené skupiny. Navíc extrakt ovlivnil sekreci matrixové metaloproteinázy 2 a 9 stimulovanou expozicí UVB záření a potlačil tak apoptózu buněk. Cytotoxické testy na buněčných kulturách L929 a HepG2 prokázaly, že extrakt není toxický v koncentraci menší než 15 mg/ml, u koncentrací vyšších než 30 mg/ml již byla toxicita pozorována (118).
5.3.3 Cytoprotektivní působení Potenciální protektivní účinek tří flavonoidů (myricetinu, myricitrinu a rutinu) získaných z léčivých rostlin byl zjišťován na modelu mitochondriální dysfunkce způsobené metylrtutí. Inkubace mitochondrií myšího mozku s metylrtutí vyvolala významné snížení
- 39 -
mitochondriální funkce, což také koreluje se snížením hladiny glutationu a zvýšením vzniku reaktivních forem kyslíku a lipidové peroxidace. Inkubace myších mozkových mitochondrií s myricetinem a myricitrinem vedla ke snížení mitochondriální dysfunkce a oxidačního stresu v závislosti na koncentraci. Mezi těmito třemi testovanými flavonoidy, byl myricetin nejúčinnější v ochraně proti poškození mitochondrií. Navíc myricetin kompletně zablokoval vytvoření reaktivních forem kyslíku a peroxidaci lipidů a částečně zabránil depleci glutatinonu způsobené metylrtutí. Schopnost myricetinu zmírňovat poškození mitochondrií a oxidační stres se přičítá jeho vysoké vychytávací kapacitě v porovnání s myricitrinem a rutinem. Výsledky také potvrdily, že mitotoxicita způsobená methylrtutí je spojená se vznikem oxidačního stresu (119). Alkoholové extrakty ze šesti druhů rostliny Tanacetum (T. budjnurdense, T. hololeucum, T., chiliophylum, T. sonboli, T. tabrisianum, T. kotschyi) (Asteraceae) prokázaly antioxidační účinek na modelu DPPH radikálu. HPLC analýzou byly identifikovány obsahové látky extraktu, mezi nimi i rutin, apigenin, luteolin, kyselina kávová a ferulová. Tyto obsahové látky se zasloužily za největší aktivitu druhu T. hololeucum, jehož aktivita byla třikrát větší než u ostatních druhů. Předléčení buněk K562 různými koncentracemi extraktů (10-100 µg/ml) po dobu 16 hodin zabránilo poškození buněk a zvýšilo aktivitu antioxidačních enzymů indukovaných aplikací peroxidu vodíku. Navíc byla obnovena nižší hladina glutationu vyvolaná peroxidem vodíku v K562 buňkách po aplikaci extraktu. To vše potvrdilo významnou protektivní úlohu proti oxidačnímu stresu v buňkách (120).
5.3.4 Protinádorové působení Z etylacetátové frakce ze semen rostliny Alpinia katsumadai (Zingiberaceae) bylo izolováno 12 sloučenin, mezi nimi rutin, chrysin, katechin, naringenin, pinostrobin a další. Tyto látky prokázaly inhibiční efekt na NF-κB, toxický účinek na buňky leukemie K562 a lidské buňky hematomu linie SMM-7721. Tyto účinky souvisejí s protirakovinným působením tohoto extraktu (121). Extrakt z listů rostliny Morus alba (Moraceae) prokázal protirakovinné působení na modelu lidských jaterních buněk HepG2 hepatocelulárního karcinomu. K extrahování látek byla použita čtyři různá rozpouštědla (100 % metanol, 50 % metanol, 1-butanol a vroucí voda) a podle toho se lišil i obsah fenolických látek. V metanolových a butanolovém extraktu - 40 -
byly hlavními látkami rutin, isokvercetin a různé deriváty kemferolu a kvercetinových glykosidů. Extrakty prokázaly antioxidační aktivitu na modelu DPPH radikálu a inhibice proliferace HepG2 buněk. Metanolový extrakt způsobil zastavení buněčného cyklu ve fázi G2/M a indukoval kaskádu kaspázy a apoptózu, ale vodný extrakt prokázal jen minimální účinek na buněčný cyklus. Metanolový extrakt dále snížil hladinu topoisomerázy IIα. Dále bylo potvrzeno, že extrakt inhibuje růst jaterních HepG2buněk prostřednictvím koordinace akcí indukujících zastavení buněčného cyklu, inhibujících aktivitu topoisomerázy IIα a indukujících apoptózu aktivací kaspázy (122).
5.3.5 Působení na kardiovaskulární systém Rutin izolovaný ze sušených listů a květů pohanky Fagopyrum esculentum (Polygonaceae) prokázal vliv na hypertofii srdečních myocytů a proliferaci srdečních fibroblastů navozenou angiotensinem II. Ve studii byly použity nově narození potkani, u kterých byl analyzován buněčný povrch, měřena syntéza proteinů prostřednictvím inkorporace H-3-leucinu a použita kolorimetrická MTT metoda, měřící aktivitu enzymů redukujících
žlutý
3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium
bromid
nachový
formazan. Největší efekt na inhibici hypertrofie a proliferace prokázal rutin v koncentraci od 0,8-8,0mg/l (123). Actinostemma lobatum (Cucurbitaceae) obsahující rutin a další flavonoidy se využívá jako tradiční lék na artritidu a kardiovaskulární choroby. Ve studii byl pozorován efekt butanolové frakce extraktu na agregaci destiček. Lidské destičky byly pre-inkubovány s různými koncentracemi extraktu (50, 100 a 200) a poté vystaveny působení kolagenu (1µg/ml), ADP (50µg/ml) nebo trombinu (0,1 µg/ml). Extrakt výrazně inhiboval agregaci destiček indukovanou kolagenem v koncentraci 200 µg/ml. Inhibiční účinek na ADP-indukovanou agregaci byl závislý na dávce. Vliv na trombinem vyvolanou agregaci se projevil ve dvou fázích. Extrakt významně inhibuje zabudování fibrinogenu na glykoproteinový receptor GP IIb/IIIa na povrchu destiček v závislosti na koncentraci. Také redukuje hladinu tromboxanu A2 a výrazně prodlužuje protrombinový čas a aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT). Tyto výsledky potvrzují, že butanolová frakce extraktu z Actinostemma lobatum vykazuje antitrombotickou a antikoagulační aktivitu (124).
- 41 -
5.3.6 Působení na nervový systém Farmakologické studie s extraktem z rostliny Schinus molle (Anacardiaceae) prokázaly, že tato rostlina vykazuje různé biologické aktivity (antioxidační, protizánětlivá, antibakteriální) a je tradičně využívána k léčbě depresí. Etanolový extrakt (v dávce 600-1000 mg/kg, p.o.) a rutin (v dávce 0,3-3 mg/kg) podaný myším vystavených stresovým podmínkám (vynucené plavání, pověšení za ocas) zkrátily dobu trvání imobility vyvolané stresem. Podávání inhibitorů syntézy serotoninu a noradrenalinu, p-chlorfenylalaninmetylesteru a α- metyl-p-tyrosinu, mělo na imobilitu účinek opačný. Antidepresivní aktivita extraktu je pravděpodobně závislá na přítomnosti rutinu, který interaguje se serotogenním, noradrenergním a dopaminergním systémem (125).
5.3.7 Hypoglykemické působení Antidiabetický účinek extraktu z listů rostliny Zizyphus spina-christi (Rhamnaceae) v dávce 200 mg/kg tělesné hmotnosti byl prokázán na modelu potkanů s diabetem vyvolaným streptozotocinem. Výsledky prokázaly, že orální podání extraktu z této rostliny snížilo hladinu glukózy v krvi s významným zvýšením hladiny sérového inzulinu a C-peptidu. Dále bylo zaznamenáno výrazné zvýšení celkové antioxidační kapacity (zvýšení hladin enzymových a neenzymových antioxidantů) s normalizací procentuálního zastoupení glykovaného hemoglobinu. Extrakt navíc potlačil zvýšenou hladinu laktátu v krvi a zvýšit snížený obsah pyruvátu v krvi u diabetických potkanů. Mimo zlepšení diabetického stavu dokázal tento extrakt obnovit obsah jaterního a svalového glykogenu dohromady s významným snížením jaterní glukózo-6-fosfatázy a zvýšením aktivity glukózo-6-fosfátdehydrogenázy. In vitro testy ukázaly na dávce závislou inhibiční aktivitu extraktu ze Zizyphus spinachristi vůči α-amyláze. Tyto závěry byly podpořeny in vivo zastavením trávení škrobu a absorpce extraktu u normálních potkanů. Tento extrakt zlepšuje utilizaci glukózy u potkanů s diabetem zvýšením sekrece inzulinu a kontroluje hyperglykémii snížením absorpce glukózy získané z potravy (126).
- 42 -
5.3.8 Hypolipidemické působení Obsahové látky z rostliny Forsythia (Oleaceae) byly zkoumány na antioxidační aktivitu a na snižování hladiny krevních lipidů in vitro a peroxidace lipidů in vivo. Intragastrické podání rutinu (70 mg/kg) skupině myší s hyperlipidémií po dobu 10 dnů významně snížilo hladinu triglyceridů v krvi a hladinu LDL cholesterolu v séru. Ale hladina HDL cholesterolu ve stejné skupině se snížila jen mírně. Hladina jaterního malondialdehydu (indexu peroxidace lipidů) byla testována ke zjištění mechanismu působení fenolických látek v suspenzi. V podmínkách hyperlipidémie se hladina malondialdehydu zvýšila. Po intragastrické aplikaci alkoholového extraktu a rutinu se hladina jaterního malondialdehydu významně snížila. Výsledky potvrdily, že rutin a další látky z alkoholového extraktu mají vysoké hypolipidemické schopnosti a tato aktivita může být připisována jejich antioxidačnímu potenciálu (127). Rutin izolovaný z rostliny Dimorphandra mollis (Fabaceae), snižuje plazmatickou hladinu triglyceridů u hypercholesterolémie způsobené špatnou životosprávou u křečků (Golden Syrian hamster), a zároveň nemění hladinu celkového cholesterolu a HDL cholesterolu. Navíc dieta doplněná rutinem neprokázala žádný imunotoxický efekt, ani výrazné změny v celkovém počtu bílých krvinek, granulocytů ani monocytů, stejně jako u neutrofilů ve srovnání s neléčenými jedinci. Z toho vyplývá, že rutin by mohl být selektivní a netoxický modulátor hypercholesterolémie (128). Rutin a kvercetin regulují dysfunkci leptinu (cytokinu hrajícího roli v řízení příjmu potravy a energetickém metabolismu) u potkanů krmených fruktózou. Konzumace fruktózy významně zvyšuje hladinu kyseliny močové v séru, hladinu insulinu a leptinu a způsobuje velký nárůst leptinové sekrece up regulací genové exprese v tukové tkáni. Oba flavonoidy snižují hladinu inzulinu a sekreci leptinu v tukové tkáni a tím přispívají ke správné regulaci metabolismu sacharidů a tuků v organizmu (129).
5.3.9 Působení na gastrointestinální trakt Rutin chrání žaludeční mukózu před negativním působení indometacinu, nesteroidního antiflogistika. Indometacin zvyšuje gastrický vředový index, aktivitu myeloperoxidázy, aciditu a obsah reaktivních substancí s thiobarbiturovou kyselinou a snižuje hladinu glutationu a aktivitu superoxid dizmutázy. Rutin (200 mg/kg) podaný potkanům 1 hodinu před indometacinem ochránil žaludek před degenerativními změnami, což bylo prokázáno snížením vředového indexu a posílením antioxidační aktivity (130). - 43 -
Extrakt z rostliny Pithecellobium dulce (Fabaceae) byl zkoumán pro možné antivředové působení. Tento stálezelený strom je domácí v Mexiku a jeho plody jsou konzumovány jako osvěžující ovoce. Listy se používají v tradiční medicíně na bolest uší a zubů, na léčbu lepry, peptických vředů a venerických chorob. Etanolový extrakt z ovoce obsahuje flavonoidy jako kvercetin, rutin, kemferol, naringin, daidzen a další. Protivředové působení spočívá ve schopnosti inhibovat H+, K+-ATPázu, která je důležitá pro přenos protonů do intersticia žaludku a pro tvorbu kyseliny chlorovodíkové, hlavního spouštěče tvorby peptických vředů. Dále se využívá antioxidačního působení flavonoidů a jejich zhášecí schopnosti na volné radikály (prokázán efekt na oxid dusnatý, 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylový radikál, hydroxylový radikál, superoxidový anion a další), které velkou měrou přispívají k oxidačním reakcím v organismu a tím i k jeho poškození. Účinky extraktu jsou srovnatelné s omeprazolem, inhibitorem protonové pumpy a nejúčinnějším lékem při vředové chorobě žaludku (131). Extrakt z jablečných slupek, obsahující rutin a další flavonoidy, prokázal antioxidační aktivitu, která se může uplatnit při ochraně trávicího traktu před gastrointestinálními lézemi vyvolanými nesteroidními antiflogistiky. Účinek byl prokázán na modelu Caco-2 buněk vystavených účinku indometacinu, který působí na buňky cytotoxicky. Byl sledován oxidační stav
(redoxní
stav,
malondialdehyd,
glutation,
hladina
oxidovaného
glutationu,
mitochondriální funkce (ATP a mitochondriální membránový potenciál), buněčná životaschopnost, redukce 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) a laktát dehydrogenáza. Výsledky prokázaly, že v nepřítomnosti extraktu indometacin vyvolal mitochondriální poruchy (snížil ATP a mitochondriálního membránového potenciálu), zvýšil oxidační stav (snížením poměru glutationu/oxidovaného glutationu a zvýšením malondialdehydu), snížení buněčné životaschopnosti (snížení MTT redukce a zvýšení laktát dehydrogenázy). Na druhou stranu ko-inkubace extraktu s indometacinem zabránila mitochondriálním, oxidačním a buněčným změnám. Byla prokázána zhášecí schopnost tohoto extraktu na modelu kyslíkového, hydroxidového a peroxylového radikálu. Také ochranný účinek na trávicí trakt spočívá v antioxidačním působení extraktu a na schopnosti zhášet volné radikály (132).
- 44 -
Bidens pilosa var. radiata (Asteraceae) se využívá v tradiční medicíně a má prokázané antioxidační, protizánětlivé a antialergické vlastnosti. Hlavní obsahovou látkou je rutin. V této studii byl zkoumán jeho účinek na žaludeční léze způsobené kyselinou chlorovodíkovou a etanolem, nesteroidními antiflogistiky a stresem. Orálně podaný výtažek z této rostliny zabránil progresi žaludečních lézí, navíc díky své antioxidační aktivitě inhiboval zvýšení hladiny reaktivních substancí thiobarbiturové kyseliny (133).
5.3.10 Antiparazitární a antibakteriální působení Antifilariální aktivita flavonoidů proti lidskému lymfatickému vlasovcovému parazitovi Brugia malayi byla zkoumána na in vitro motilitním testu s červy a mikrofilariemi, na
biochemickém
testu
na
životaschopnost
na
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
difenyltetrazolium bromidu (MTT)-redukčním testu) a na modelech Meriones unguiculatus (s implantovanými dospělými červy) a Mastomys coucha (přirozená infekce). Z flavonoidů byly požity rutin, naringin, chrysin, hesperetin a naringenin. Všechny tyto látky prokázaly antifilariální aktivitu, přičemž nejúčinnější byl naringenin. Působily jak proti dospělým červům, tak proti mikrofilariím v nejmenších dávkách.
Na modelu
Mastomys byly všechny látky měně účinné, ale při zdvojnásobení dávky se téměř zdvojnásobil i účinek. Toto je první zpráva o možném antifilariální aktivitě flavonoidů (134). Silice z listů rostliny Cinnamomum pubescens (Lauraceae) a z celé rostliny Etlingera elatior (Zingiberaceae) se používá nejen jako přírodní vůně a koření, ale také pro své antioxidační, antibakteriální a fytochemické vlastnosti. Antioxidační aktivita rutinu a dalších obsažených flavonoidů byla měřena na modelu DPPH radikálu, přičemž aktivita silice ze skořice byla vyšší. Antibakteriální aktivita byla zkoumána na methicilin-rezistentním kmenu Satphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa a Salmonella choleraesuis. Pouze methicilin rezistentní Staphylococcus aureus byl vůči skořici citlivý (135).
- 45 -
6 Hesperidin 6.1 Metabolismus Hesperidin, hesperetin-7-O-rutinosid, patří do skupiny flavanonů a nachází se v oplodí nezralých citrusových plodů (v množství až 8%) (2). Flavanonové glykosidy nebyly dosud nalezeny v krevním oběhu ani ve vylučovacích orgánech. Glykosidy jsou v gastrointestinálním traktu hydrolyzovány a vzniklé aglykony poté resorbovány (136). Hesperidin aplikovaný žaludeční sondou králíkům se přeměňuje na 3-hydroxyfenylpropionové kyseliny, hesperetin a hesperetinglukuronid. Po orálním podání byly detekovány i další produkty štěpení kruhu (137).
6.2 Biologické účinky hesperidinu 6.2.1 Antioxidační působení Hesperidin prokázal antioxidační aktivitu na modelu peroxidem vodíku-indukovaném oxidačním poškození pBR322 DNA a RBC buněčné membrány. Z použitých koncentrací hesperidinu (2, 4, 6, 8 a 10 µg/ml) měla nejvyšší zhášecí aktivitu koncentrace 10 µg/ml. Dále se zjistilo, že koncentrace 2 µg/ml hesperidinu dokáže přeměnit otevřenou kruhovou formu pBR322 DNA, která potvrzuje poškození DNA, na super stočenou formu a koncentrace 10 µg/ml brání zničení buněčné membrány. Hesperidin je schopný zabránit negativnímu působení volných radikálů na DNA a buněčnou membránu (138). Na modelu lidských keratinocytů (HaCaT) vystavených působení UVA záření zabránil hesperidin poškození buněk. Toto záření v buňkách spouští tvorbu volných kyslíkových radikálů a oslabuje přirozenou antioxidační obranu buněk. Keratinocyty vystavené jak působení záření tak hesperidinu zaznamenaly zvýšení aktivity superoxid dismutázy, celkové antioxidační kapacity a buněčného membránového potenciálu doprovázené snížením hladiny malondialdehydu a rozsahu apoptózy (139).
6.2.2 Protizánětlivé působení Protizánětlivý účinek hesperidinu byl prokázán na modelu potkanů s adjuvantní artritidou indukovanou Freundovým kompletním adjuvans (roztokem antigenů stimulujících buněčnou imunitu, která vede k potenciaci produkce určitých imunoglobulinů). Mezi měřené - 46 -
parametry patří sekundární otok končetin a index imunitních orgánů a proliferace synoviocytů. Podání hesperidinu v dávce 80 a 160 mg/kg výrazně zmenšilo sekundární otok a obnovilo index imunity. Dále byla ve velké míře potlačena proliferace synoviocytů, což následně vedlo ke snížení transkripce a produkce tumor nekrotizujícího faktoru α (TNF- α) a interleukinu 1b (IL-1b), prozánětlivých markerů. Z výsledků vyplývá, že hesperidin má terapeutický efekt na adjuvantní artritidu a jeho mechanismus spočívá částečně v inhibici aktivity synoviocytů a modulaci produkce zánětlivých cytokinů těmito buňkami (140). Orální nebo systémové podání flavonoidů (hesperidinu, naringinu, genisteinu, kvercetinu, aj.) chrání hlodavce před endotoxinémií a mikrobiální sepsí. Tyto látky snižují mikrovaskulární permeabilitu, infiltraci tkání leukocyty, oxidační a dusíkový stres, poškození tkání, orgánové dysfunkce, vazoplegii, produkci laktátu a mortalitu. Na mechanismu jejich působení se podílí inhibice aktivace nukleárního faktoru-κB (prozánětlivého faktoru), inhibice exprese indukovatelné NO-syntázy, adhezních molekul a tumor nekrotizujícího faktoru-α (mediátorů zánětu). Hesperidin a další flavonoidy mohou být využitelné v prevenci a léčbě sepse (141).
6.2.3 Cytoprotektivní působení Hesperidin v dávce 200 mg/kg zmírnil toxické dopady benzo (a)pyrenu, produktu nedokonalého spalování přítomného v dehtu a cigaretovém kouři na reprodukční systém u samců potkanů (Swiss albino). Podání hesperidinu po dobu 10 dní před desetidenní aplikací benzo (a)pyrenu (50 mg/kg) zvrátilo nežádoucí dopady jako snížení relativní hmotnosti varlat, poškození buněčného jádra, nekrobiotické změny, chromatolýzu v jádrech spermatocytů v chámovodech, zhoršenou funkci nadvarlat projevující se snížením počtu spermií, jejich motility a denní produkce a zvýšilo aktivitu testikulární laktát dehydrogenázy, superoxid dismutázy a glutation-S-transferázy (142). Na modelu lidských lymfocytů inkubovaných s v radioterapii,
99m
Tc-MIBI (technecium využívané
99m
Tc-methoxy-isobutyl-isonitril) v dávce 200 µCi/2 ml byl potvrzena úloha
hesperidinu v ochraně buněk. Lymfocyty byly ještě před tím inkubovány s hesperidinem v dávkách 10, 50 a 100 µmol, což mělo za následek snížení genotoxického účinku technecia, především snížení četnosti výskytu mikrojader. Výsledky potvrzují protektivní roli hesperidinu proti genetickému poškození DNA a vedlejším účinkům vyvolaných podáním radiofarmak (143).
- 47 -
Další radioprotektivní vlastnosti hesperidinu byly prokázány na modelu lymfocytů z lidské periferní krve vystavených působení γ-záření. Ze zkoušených koncentrací (3,27, 6,55, 9,83, 13,10, 16,38 a 19,65 µM) byla nejúčinnější koncentrace 16,38 µM hesperidinu, která nejvíce snížila frekvenci výskytu mikrojader a dicentrické aberace. Použitím kometového testu, prokazujícího míru poškození DNA, se zjistilo, že hesperidin dokáže ochránit DNA před poškozením a rozštěpením snížením tvorby tzv. komet, kde hlava komety představuje nenarušenou DNA a ocas odštěpené fragmenty DNA. Dále předléčení hesperidinem před působením radiace zvýšilo hladiny enzymatických a neenzymatických antioxidantů a lipidové peroxidace. Hesperidin chrání lymfocyty dvojím způsobem, brání genetickému poškození a zvyšuje přirozenou antioxidační aktivitu (144). Stejným mechanismem působil i ve studii na modelu lymfocytů zdravých dobrovolníků. Odebrané krevní vzorky byly v časových intervalech vystaveny γ-záření o síle 150cGy (60Co). Hesperidin v dávce 250 mg snížil výskyt mikrojader a zamezil tak genetickému poškození a vedlejším účinkům radioterapie (145). Orální podání hesperidinu (50 nebo 100 mg/kg) zabránilo buněčnému poškození jater u potkanů způsobeného γ-radiací. Záření způsobilo zvýšení tělesné hmotnosti, zvýšení hmotnosti jater, změnu aktivity jaterních enzymů (ALT, AST, LDH, ALP) a endogenních antioxidantů. Hesperidin zvrátil negativní dopady oxidačního stresu vyvolaného γ-zářením a tím prokázal hepatoprotektivní a antioxidační vlastnosti (146). Hesperidin (50 a 100 mg/kg/den) aplikovaný potkanům (Sprague-Dawley) po 7 denním vystavení radiaci výrazně zmírnil dopady γ-záření na srdeční tkáň a ledviny, což se projevilo snížením hladin sérových markrových enzymů jako alaninaminotransferázy, aspartátaminotransferázy, laktát dehydrogenázy a kreatinfosfokinázy a zvýšením endogenních antioxidantů (superoxid dismutázy, katalázy, redukovaného glutationu). Tím hesperidin zabraňuje rozvinutí oxidačního stresu a peroxidaci lipidů, procesům zodpovědným za poškození a smrt buněk (147). Cytoprotektivní účinek nevykazuje jen samotný hesperidin. Důkazem je studie na dvou ve vodě rozpustných derivátech hesperidinu a rutinu (α-glukosyl hesperidin a α-glukosyl rutin), které dokáží ochránit DNA před zlomením obou řetězců vyvolané působením záření v oblasti viditelného světla a γ-paprsky. Tento jev byl sledován na jednotlivých molekulách pomocí fluorescenční mikroskopie za použití YOYO-1 jako fluorescenčního barviva, které se používá k hodnocení mechanických vlastností DNA. Takovéto poškození DNA může způsobit mutagenní a karcinogenní procesy v živých buňkách. - 48 -
Hesperidin a rutin díky svým antioxidačním vlastnostem dokáží zabránit vzniku reaktivních kyslíkových radikálů a tím zeslabují působení světelného a γ-záření. Vůči světelnému záření je dvakrát více účinný derivát rutinu. U γ záření jsou účinky srovnatelné. Z toho plyne, že antioxidační potenciál flavonoidů je závislý na zdroji záření (148). Apoptické působení derivátu 7,3'-dimetoxyhesperitinu je dokázáno na modelu potkanů s adjuvantní artritidou za použití MTT testu. 7,3'-dimetoxyhesperetin
výrazně
snižuje
proliferaci
fibroblastům-podobných
synoviocytů, zbytkových mezenchymálních buněk, které hrají důležitou roli v rozvoji revmatoidní artritidy. Tyto synoviocyty po léčbě 7,3'-dimetoxyhesperitinem vykazují typické apoptické znaky jako změna tvaru, smršťování jádra a kondenzace chromatinu. V porovnání s kontrolní skupinou došlo k markantnějšímu snížení mRNA exprese Bcl-2 (anti-apoptického proteinu) zatímco exprese Bax (pro-apoptického proteinu) a kaspázy 3 (klíčového mediátoru apoptózy) byla zvýšena. 7,3'-dimetoxyhesperitin tak prokázal svůj léčebný potenciál v terapii revmatoidní artritidy (149). 6.2.4 Protinádorové působení Hesperidin prokázal protirakovinnou aktivitu na modelu myší s indukovanou plicní karcinogenezí. Myším, u kterých byla benzo (a)pyrenem (50 mg/kg) vyvolaná rakovina plic, byl podán hesperidin v dávce 25 mg/kg. Rakovinné bujení vyvolalo u myší zvýšení hustoty žírných buněk, což bylo dokázáno barvením toluidinovou modří, dále se zvýšila exprese COX-2 následovaná zvýšenou expresí matrixové metaloproteinázy-2 a -9. Hesperidin dokázal snížit hustotu žírných buněk a potlačit expresi jak COX-2, tak i obou metaloproteináz. Protirakovinné působení hesperidinu spočívá ve schopnosti měnit expresi cyklooxygenázy-2 a metaloproeinázy-2 a -9 (150). Podání benzo (a)pyrenu dále u myší vyvolalo zvýšení peroxidace lipidů, plicního specifického tumorového markeru- karcinoembryonického antigenu a sérových enzymů jako γ-glytamyl-transpeptidázy, 5'-nukleotidázy a laktát dehydrogenázy se současným snížením hladin tkáňových antioxidantů jako superoxid dismutázy, katalázy, glutation peroxidázy, redukovaného glutationu, vitamínu E a C. Hesperidin potlačil všechny tyto změny a navíc prokázal antiproliferativní efekt potvrzený histopatologickou analýzou a imunologickým zbarvením proliferačního buněčného jaderného antigenu (proteinu důležitého pro syntézu a opravu DNA) (151).
- 49 -
Hesperidin prokázal antiinvazivní a antimetastatickou aktivitu na modelu buněk hepatocelulárního karcinomu HepG2. Tento flavonoid potlačuje buněčnou invazi způsobenou acetaldehydem (152) a 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetátem (TPA), čímž současně inhibuje sekretované a cytosolové formy matrixové metaloproteinázy 9 (MMP-9) v HepG2 buňkách, proteinu zapojeného do zničení extracelulární matrix ve fyziologických i patologických procesech. Hesperidin snížil mRNA hladiny MMP-9 indukované TPA, potlačil transkripci MMP9 inhibicí aktivity nukleárního faktoru κB (transkripčního faktoru vázajícího se na promotor RNA a ovlivňujícího expresi genů) a aktivačního proteinu (AP-1) a zabránil translokaci nukleárního faktoru do jádra stimulovanou TPA. Hesperidin je potenciálním antiinvazivním agens prostřednictvím potlačení enzymové aktivity MMP-9 (153). Účinek hesperidinu na proliferaci rakovinných buněk byl dále prokázán na modelech buněk rakoviny (MCF-7-GFP-Tubulin buňky), buněk androgen-independentních rakoviny prostaty (PC-3 a DU-145) a androgen-dependentní rakoviny prostaty (LNCaP). Hesperidin inhiboval
proliferaci
buněk
rakoviny
prsu
jiným
než
obvyklým
antimitotickým
mechanismem. Dále působil inhibičně na proliferaci obou typů hormon-dependentních rakovinných buněk prostaty indukovanou bazálně nebo testosteronem. Ale na buňky hormonindependentní rakoviny prostaty PC-3 a DU-145 neměl žádný vliv. Hesperidin má potenciál pro využití v léčbě rakovinu prsu a jeho interakce s androgenními receptory vyžadují další zkoumání (154). Protirakovinný účinek má rovněž aglykon hesperidinu, hesperetin. V dávkách 10, 20 a 30 mg/kg podávaný po 16 týdnů potkanům s kolorektálním karcinomem významně snížil incidenci nádoru a počet ložisek abnormálních krypt. Tento typ karcinomu byl vyvolán podáním 1,2-dimethylhydrazinu (20 mg/kg) a způsobil snížení tkáňové peroxidace lipidů a aktivity glutation-S-transferázy, glutationperoxidázy, superoxid dizmutázy a katalázy. Hesperetin zvrátil působení 1,2-dimethylhydrazinu, čímž byl potvrzen významný prospěšný efekt proti chemicky-indukované karcinogenezi tlustého střeva (155).
6.2.5 Hepatoprotektivní působení Cytoprotektivní účinek hesperidinu byl prokázán na modelu lidských jaterních buněk L02. Hesperidin v těchto buňkách zmírnil buněčné poškození způsobené peroxidem vodíku mechanismem zvýšení buněčné antioxidační obrany.
- 50 -
Hesperidin zvýšil expresi isoformy enzymu hemoxygenázy-1 (indukovatelná isoforma vznikající jako odpověď na buněčný stres) a tím ochránil hepatocyty před oxidačním stresem. Dále podpořil jadernou translokaci nukleárního faktoru Nrf2, který hraje důležitou roli v aktivaci transkripce antioxidačních responzivních elementů a aktivoval extracelulární signál-regulující proteinkinázu 1/2 (ERK1/2), čímž spustil buněčnou obranu (156). Na tomtéž modelu jaterních buněk L02 zamezil hesperidin buněčnému poškození vyvolané terc-butylhydroperoxidem rozšířením antioxidační buněčné obrany, stejně jako zabránil vyčerpání mitochondriálního membránového potenciálu a uvolnění laktát dehydrogenázy (enzymu důležitého pro tvorbu energie v buňce). Hesperidin také brání tvorbě indikátorů oxidačního stresu, reaktivním kyslíkovým radikálům a lipidové peroxidaci. Western blot test (analytická metoda využívající gelovou elektroforézu k určení specifických proteinů) ukázal, že hesperidin usnadňuje fosforylaci proteinového řetězce ERK/MAPK, který zprostředkovává komunikaci mezi receptory na povrchu buňky a buněčným jádrem, která je zodpovědná za aktivaci cytoprotektivního proteinu
Nrf2
a
tím
vede
k expresi
cytoprotektivní
hemoxygenázy-1
(enzymu
s protizánětlivými, antiapoptickými a cytoprotektivními vlastnostmi). Z výsledků vyplývá, že hesperidin má terapeutický potenciál v léčbě poškození a dysfunkce jater způsobených oxidačním stresem (157). U jaterních HepG2 buněk potlačil hesperidin buněčnou invazi vyvolanou acetaldehydem
a
inhiboval
sekretované
a
cytosolické
formy
metaloproteinázy-9
prostřednictvím inhibice nukleárního faktoru-κB a inhibicí jeho translokace v jádru a prostřednictvím inhibice aktivačního proteinu-1 (AP-1). Potlačením exprese těchto látek došlo ke snížení tvorby, sekrece a buněčné invaze metaloproteinázy-9 v buňkách hepatocelulárního karcinomu (158).
6.2.6 Kardioprotektivní působení Pozitivní působení hesperidinu na srdeční tkáň bylo prokázáno na modelu in vivo ischemicko-reperfuzního poškození srdce potkanů. Tento flavonoid zmírnil následky poškození, arytmie a rozsah infarktu způsobený přerušením dodávky krve. Také snížil vznik zánětu a apoptózy zvýšením hladiny antioxidačně působících látek a tkáňových dusitanů (159).
- 51 -
Hesperidin podaný v dávkách 100, 200 a 400 mg/kg potkanům s myokardiální ischémií vyvolanou isoproterenol hydrochloridem (85 mg/kg) snížil významně hladiny srdečních markerů typických pro toto onemocnění a charakterizujících srdeční poškození. U potkanů s ischémií se zvýšila hladina aspartát transaminázy, alanin transaminázy, laktát dehydrogenázy, kreatin kinázy, srdeční kreatin kinázy a troponinů ve srovnání s kontrolní skupinou a skupinou léčenou hesperidinem. Dále došlo k nárůstu reaktivních substancí kyseliny thiobarbiturové, lipidové peroxidace, konjugovaných dienů v plazmě zatímco hladina neenzymatických antioxidantů poklesla (vitamín C, vitamín E, redukovaný glutation). Hesperidin vrátil všechny tyto parametry do normálních hodnot. Nejúčinnější byl v dávkách 200 a 400 mg/kg. Hesperidin prokázal kardioprotektivní vlastnosti (160). Streptozotocin (65 mg/kg) a nikotinamid (110 mg/kg) podaný potkanům vyvolal zvýšení hladiny sérové glukózy, glykovaného hemoglobinu, kreatin kinázy, glutamátoxalacetát transferázy, glykogenu a dusitanu. Následně aplikovaný isoproterenol (200 mg/kg) způsobil rozsáhlý infarkt myokardu. Předléčení hesperidinem výrazně snížilo změny glykovaného hemoglobinu a hladiny glukózy, dusitanů, kreatin kinázy a glykogenu. Srdeční infarkt u diabetických potkanů vedl k roztažení svalových vláken, silné neutrofilní infiltraci a buněčnému edému v porovnání s nediabetickými jedinci. Hesperidin podaný diabetickým potkanům zmírnil nekrózu a fragmentaci vláken svaloviny (161). Hesperidin prokázal kardioprotektivní vlastnosti na modelu potkanů s diabetem vyvolaným aplikací injekce streptozotocinu. U těchto potkanů hesperidin (10 mg/kg) po čtyřtýdenním podávání zvýšil srdeční tep, nijak neovlivnil délku QT intervalu a snížil riziko tachyarytmie na 16,7% (oproti 75,0% u diabetické skupiny bez hesperidinu). Analýzou akčního potenciálu svaloviny komor se ukázalo, že u diabetické skupiny došlo ke snížení zbývajícího akčního potenciálu, amplitudy akčního potenciálu a maximální průtokové rychlosti v porovnání s kontrolní skupinou. Hesperidin udržel všechny tyto parametry na srovnatelné úrovni s kontrolní skupinou. Perfúzní testy se dvěma koncentracemi hesperidinu (1 × 10-6 mol/l a 5 × 10-6 mol/l) prokázaly, že perfúze hesperidinu ve vyšší koncentraci poskytuje lepší obnovení akčního potenciálu papilární svaloviny komor u diabetických potkanů. Hesperidin snižuje riziko prevalence arytmií u diabetických potkanů v závislosti na dávce mechanismem zvrácení abnormální elektrofyziologické aktivity (162).
- 52 -
6.2.7 Působení na nervový systém Předléčení hesperidinem (50 a 100 mg/kg tělesné hmotnosti, p.o.) prokazatelně zmírnilo ischemicko-reperfúzní poškození mozku a ztrátu paměti způsobenou oxidem dusnatým. Ve studii byli použiti samci potkanů, kteří byli vystaveni bilaterálnímu uzavření karotické arterie na 30 min a následné 24 hodinové reperfúzi. Poté byly vyhodnoceny testy chování, biochemické parametry (lipidová peroxidace, koncentrace dusitanů, hladina glutationu, superoxid dizmutázy a aktivita katalázy), dysfunkce mitochondriálních enzymových komplexů a histopatologické změny. Po sedmi dnech léčby hesperidinem se výrazně zlepšily neurobehaviorální změny, oxidační ochrana a mitochondriální enzymové komplexy v porovnání s kontrolní skupinou. Předléčení L-argininem (100 mg/kg) oslabilo protektivní účinek nižší dávky hesperidinu ve srovnání s hesperidinem samotným. Na druhou stranu L-nitroarginin metylester účinek hesperidinu potencoval. Studie potvrdila, že L-arginin-NO signalizační cesta je zahrnuto do protektivního působení hesperidinu proti cerebrálnímu poškození a dysfunkci paměti (163). Hesperidin prokázal neuroprotektivní vlastnosti na modelu potkanů s Huntingtonovou chorobou vyvolanou 3-nitropropionovou kyselinou (3-NP). Tato látka je tzv. sebevražedný inhibitor a vyvolává ireverzibilní inhibici sukcinátdehydrogenázy a tím nevratně poškozuje mitochondrie, což vede k striatální degeneraci a projevům neurodegenerativních onemocnění jako jsou snížení lokomoční aktivity, tělesné hmotnosti, síly stisku, oxidační obrany a dysfunkci enzymových mitochondriálních komplexů ve striatu. Předléčení hesperidinem a naringinem významně zmírnilo behaviorální změny, dopady působení oxidačního stresu a zlepšilo funkci mitochondriálních enzymových komplexů. L- arginin přidaný k oběma flavonoidům výrazně oslabil jejich protektivní účinek, zatímco L- NAME (metylester nitroargininu) jejich účinek potencoval a výrazně zvýšil (164). Upravením hesperidinu do rozpustnější formy 4G-α-gluko-pyranosyl hesperidinu (G-hesperidinu) se zvyšuje vliv na aktivitu sympatiku. Sympatická nervová aktivita hnědé tukové tkáně se zvyšuje a sympatická nervová aktivita v kůži u potkanů se snižuje, což má za následek zvýšení periferní tělesné teploty. Dávka 60 mg/kg G-hesperidinu zvýšila produkci tepla a prokrvení kůže projevující se zvýšením tělesné teploty (165).
- 53 -
6.2.8 Hypoglykemické působení Hesperidin snižuje hladinu glukózy v krvi prostřednictvím schopnosti zabránit absorpci glukózy a zlepšením glukózové tolerance. Tento flavonoid zvyšuje využití glukózy v periferních tkáních, reguluje aktivitu enzymů účastnících se metabolismu sacharidů a chová se jako insulinová sekretagoga nebo mimetika. Dále hesperidin snižuje expresi jaterního transportéru glukózy GLUT2, zvyšuje aktivitu jaterní glukokinázy a koncentraci glykogenu. Hespeiridin zlepšuje hyperglykémii regulací aktivity jaterních enzymů zapojených do procesů glykolýzy a glukoneogeneze (166). Ovlivněním aktivity enzymů regulujících koncentraci glukózy a změnou genové exprese snížil hesperidin a klatrát cyklodextrinu a hesperitinu glykémii a celkovou hladinu lipidů u potkanů (Goto-Kakizaki) s diabetem 2. typu. Tyto látky ovlivnily hlavně expresi genů kódujících
enzym
3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym
A
reduktázu
(účastnící
se metabolismu cholesterolu), peroxisomální receptor aktivovaný proliferací a receptor lipoproteinu s nízkou hustotou (LDL) (167). U potkanů s diabetem vyvolaným injekčním podáním streptozotocinu, který mimo zvýšení glukózy v krvi také změnil hladiny sérových a jaterních lipidů, sérového adiponektinu (proteinu produkovaného v tukových buňkách) a inzulinu, snížil hesperidin (10 mg/kg stravy) hladinu glukózy v krvi a normalizoval hladinu lipidů. Jeho účinek spočívá ve změně aktivity glukózuregulujících enzymů. Ve studii bylo také zjištěno, že neovlivňuje markery metabolismu kostí ani úbytek kostní tkáně, který se po injekci streptozotocinu objevuje (168). U březích myší s diabetem indukovaným rovněž streptozotocinem (60 mg/kg) podávaným po dobu tří dnů zmírnil hesperidin hyperglykémii a zabránil embryopatickým změnám. Hesperidin po 18 dnech snížil tělesnou hmotnost a glykémii s největším efektem mezi 11. a 18. dnem aplikace. Dále zvýšil celkový počet plodů a absolutní fetální hmotnost a snížil poměr malformací a resorpcí. Barvením červeným alizarinem byla potvrzena úloha hesperidinu v protekci před skeletálními defekty plodu. Hesperidin má profylaktický efekt na diabetickou embryopatii u myší (169). Hesperidin v dávce 100 mg/kg snížil hladinu glukózy a glykovaného hemoglobinu v krvi, stejně jako potlačil negativní následky srdečního infarktu u potkanů s diabetem. Jeho účinky jsou srovnatelné se syntetickými léčivými látkami jako je pioglitazon (10 mg/kg) a glimepirid (0,5 mg/kg), což jsou perorální antidiabetika. Potvrdila to studie na potkanech, u kterých byl diabetes indukován streptozotocinem (65 mg/kg) a nikotinamidem (12 mg/kg)
- 54 -
a následný infarkt myokardu vyvolán isoproterenolem (200 mg/kg). Tyto látky u potkanů způsobily zvýšení hladiny srdeční tkáňové cholesterol ester syntetázy a výrazné snížení lecitin-cholesterol acyl transferázy a lipoproteinové lipázy. Podání hesperidinu spolu s antidiabetiky vedlo k úpravě hodnot do normálu (170). Dále došlo ke snížení systolického a diastolického krevního tlaku u zdravých i diabetických potkanů (171). V jiné studii na potkanech s diabetem 2. Typu vyvolaným streptozotocinem (65 mg/kg, i.p.) a nikotinamidem (110 mg/kg, i.p.) s následnou aplikací isoproterenolu (200 mg/kg) k vyvolání srdečního infarktu, způsobil hesperidin snížení oxidačního stresu. Streptozotocin a nikotinamid mimo zvýšení sérové glukózy, glykovaného hemoglobinu, malondialdehydu a peroxidace lipidů i snižují aktivitu biomarkerů oxidačního stresu jako je redukovaný glutation, kataláza a superoxid dismutáza. Hesperidin obnovil hladiny těchto markerů a snížil lipidovou peroxidaci v porovnání s kontrolní diabetickou skupinou. Tato studie potvrdila, že hesperidin vykazuje antioxidační aktivitu potlačením oxidačního stresu v srdeční tkáni u diabetických potkanů (172).
6.2.9 Hypolipidemické působení Hesperidin, rutin a 7,8-dihydroxy-3-(4-metylfenyl)kumarin snížily hladiny celkového cholesterolu u hyperlipidemických potkanů. Potkani byli krmeni vysoko-cholesterolovou stravou 17 dní a následně byly změřeny hladiny celkového cholesterolu, triglyceridů, poměr HDL/celkového cholesterolu a hladina malondialdehydu (173). Hesperidin v monoglukosylované formě přidaný do nápoje (340 mg/500 ml nápoje/den) snížil hladinu sérových triglyceridů. Takto upravený nápoj byl konzumován jednou denně po dobu 12 týdnů. Této randomizované dvojitě zaslepené, placebem kontrolované studie se zúčastnilo 112 zdravých dobrovolníků s hladinou sérových triglyceridů v rozmezí od 120 do 200 mg/l. Ve zkoušené skupině se hladiny triglyceridů významně snížily již po 4 týdnech užívání ve srovnání s kontrolní skupinou (s placebem) a nebyly objeveny žádné
nežádoucí
účinky spojené
s užíváním
monoglukosylhesperidinu.
Bezpečnost
hesperidinu byla prokázána ve studii s 99 dobrovolníky s nadměrným příjmem nápoje (1030 mg glukosylhesperidinu/den) po dobu 4 týdnů (174). Příjem glukosyl hesperidinu v potravě snížil tělesnou hmotnost a BMI (index tělesné hmotnosti) u pacientů s rizikem nadváhy a zvýšenou hladinou triglyceridů - 55 -
(BMI 24,5±2,2 kg/m² , TAG 184,1±60,5 mg/dl). Po čtyřtýdenní aplikaci glukosyl hesperidinu (250, 500 a 1000 mg/den) byl zaznamenán úbytek váhy (v průměru o 0,59±0,93 kg) a BMI (o 0,20±0,31 kg/m²) u pacientů léčených 500 mg hesperidinu. Z výsledků vyplývá, že tento derivát hesperidinu dokáže snížit tělesnou hmotnost, ale hladinu triglyceridů neovlivní (175).
6.2.10 Působení na gastrointestinální trakt Podání hesperidinu v dávkách 10, 40 a 80 mg/kg myším s ulcerózní kolitidou vyvolanou sodnou solí dextran sulfátu výrazně zmírnilo průběh tohoto onemocnění. Hesperidin snížil index aktivity nemoci a aktivitu myeloperoxidázy, enzymu přítomného v neutrofilech, kdy snížení jeho aktivity potvrzuje protizánětlivé působení hesperidinu a je spojené se snížením neutrofilní infiltrace. Dále snížil obsah malondialdehydu, který způsobuje buněčnou smrt a hladinu interleukinu-6 v séru, zodpovědného za patogenezi nemoci. Hesperidin se může použít k prevenci a léčbě kolitidy (176).
6.2.11 Jiné působení Hesperidin v komplexu s extraktem z Ruscus aculeatus (Liliaceae), methylchalkonem a kyselinou askorbovou významně zlepšil symptomy a kvalitu života pacientů s chronickým žilním onemocněním. Observační, multicentrická a prospektivní studie zahrnula 917 pacientů trpící touto nemocí a po 12 týdnech léčby komplexním přípravkem s hesperidinem se zjistilo, že se zlepšily všechny symptomy, obvod kotníku, klinické, etiologické, anatomické a patofyziologické parametry. Účinek hesperidinu spočívá ve snížení žilní permeability a posílení cévní stěny (177). Ve vodě rozpustnější derivát hesperidinu, glukosyl hesperidin, připravený selektivní transglykosylací cyklodextrin glukanotransferázou vykazuje inhibiční efekt na virus chřipky typu A (influenaza A virus). Tento jev byl sledován na buňkách ledvin psa MDCK (MadinDarby Canine Kidney), kterým byl podán hesperidin současně s inokulací viru nebo až po inokulaci. Podání hesperidinu před inokulací nemělo žádný účinek. Naproti tomu glukosyl hesperidin zabránil replikaci viru inhibicí virové sialidázy, která je zapojena do stádia prostupu a uvolnění virové infekce. V koncentracích 0-0,25 mM nevykazuje glukosyl hesperidin žádnou cytotoxicitu a tak se stává potenciálním kandidátem využití v prevenci chřipkového onemocnění. (178). Hesperidin (5 nebo 15 mg/kg)v kombinaci s diltiazemem (léčba arteriální hypertenze, anginy pectoris) zvýšil u potkanů biodostupnost léčivé látky a jejího hlavního metabolitu - 56 -
desacetyldiltiazemu prostřednictvím inhibice cytochromu P450 3A nebo P-glykoproteinu. Hesperidin podaný 30 minut před diltiazemem a způsobil zvýšení AUC (plochy pod křivkou určující míru dostupnosti látky) o 48,9-65,3% a hodnotu maximální plazmatické koncentrace (Cmax) o 46.7-62.4%.Také absolutní biodostupnost byla vyšší v porovnání s kontrolní skupinou. Stejný efekt měl i na jeho metabolit desacetyldiltiazem. Ze závěrů vyplývá, že hesperidin zvyšuje intestinální absorpci a redukuje first-pass metabolismus diltiazemu ve střevě a v játrech (179).
6.3 Biologické účinky extraktů obsahující hesperidin 6.3.1 Antioxidační působení Antioxidační aktivita hesperidinu a dalších flavonoidů obsažených v plodech a oplodí citrusů byla prokázána na modelu 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylovém radikálu (DPPH) (180), (181), (182), (183). Hesperidin extrahovaný ze čtyř druhů citrusů: Citrus hystrix, C. aurantifolia, C. microcarpa a C. sinensis (Rutaceae) vykázal antioxidační účinek i ve FRAP testu, využívající schopnost plazmy redukovat železité ionty na železnaté za vzniku barevného železnato-tripyridyltriazinového komplexu. Nejvyšší obsah hesperidinu byl v plodech druhu C. aurantifolia, zatímco nejvyšší obsah všech flavonoidů a současně i nejsilnější antioxidační aktivitu vykázal druh C. hystrix (180). Extrakt z oplodí pomeranče (Citrus sinensis, Rutaceae) v testu Co(II)/EDTA (kobaltnaté
ionty/etylendiamintetraoctovou
kyselinou)
indukované
chemiluminiscence
luminolu, využívaného k monitorování přítomnosti hydroxylových radikálů, prokázal zhášecí schopnost hesperidinu při redukci volných radikálů.(32) Oplodí z plodů dalších tří druhů citrusů, Citrus poonensis, Citrus unshiu, Citrus paradisi (Rutaceae), které je nejen bohatým zdrojem hesperidinu, ale i naringinu, má dlouholetou tradici v čínské medicíně právě pro obsah těchto látek. Tyto flavonoidy mají schopnost redukovat ABTS kationtový radikál a využívají redukční síly železitých iontů ve FRAP testu. Hesperidin a naringin má potenciál v léčbě kardiovaskulárních a dalších onemocněních způsobených působením volných radikálů.(33) Extrakt z plodů Citrus aurantifolia (Rutaceae) prokázal antioxidační aktivitu na modelu DPPH radikálu a ABTS testu (přeměna modrého kationtového radikálu 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonové
kyseliny) - 57 -
na
bezbarvou
2,2'-azino-bis(3-
ethylbenzthiazolin-6-sulfonovou kyselinu)) a antiproliferační působení na modelu buněk rakoviny slinivky Panc-28. Výsledný efekt extraktu a flavonoidů v něm obsažených (hesperidin, neohesperidin, hesperitin, rutin) se lišil podle použitého rozpouštědla. Nejsilnější antioxidační aktivitu vykázal chloroformový extrakt. Antiproliferační působení měly všechny extrakty, ale nejsilněji působil metanolový. Inhibice pankreatických buněk se pohybovala v rozmezí 73-89%. Výsledky prokázaly, že antioxidační účinek extraktu je úměrný obsahu flavonoidů (184).
6.3.2 Protizánětlivé působení Extrakty z oplodí citrusových plodů vykázaly protizánětlivý účinek na modelu lipopylysacharidem-aktivovaných RAW-264.7 buněk. Takto aktivované buňky produkují prozánětlivé mediátory, prostaglandin E2 a oxid dusnatý, jejichž sekreci dokáží flavonoidy z citrusových extraktů potlačovat. Mimo hesperidinu má významnou protizánětlivou aktivitu i polymetoxyflavon nobiletin (185).
6.3.3 Působení na nervový systém Nálev z květů rostliny Citrus sinensis (Rutaceae) se v tradiční mexické medicíně používá jako sedativum při léčbě nespavosti. Hlavním nositelem účinku je hesperidin, který ovlivňuje adenosinové receptory. Sedativní účinek byl prokázán na modelu myší umístěných ve skleněném válci, kde se sledovalo, kolikrát se napřímí v časovém intervalu 5 minut. Ani předléčení atropinem (1 mg/kg, i.p.), flumazenilem (2 mg/kgm i.p.), klonidinem (0,01 mg/kg, i.p.), isoproterenolem (0,3 mg/kg, i.p.), haloperidolem (O,3 mg/kg, i.p.) nezměnilo účinek hesperidinu. Na druhou stranu byl sedativní účinek potencován yohimbinem (1,25 mg/kg, i.p.) a buspironem (1 mg/kg, i.p.) a zvrácen působením fenylxantinu (10, 30 a 54,7 mg/kg, i.p.) (186). Hesperidin (2 mg/kg), identifikován jako látka s centrálním působením v rostlině Valeriana officinalis (Valerianaceae) používané jako přírodní prostředek při léčbě nespavosti a poruchách spánku, má prokázané sedativní účinky. Za sedativní působení hesperidinu je zodpovědná redukce fosforylace extracelulární signál-regulující kinázy 1/2 (ERK 1/2) v mozkové kůře, mozečku a hippokampu, čímž se sníží jeho aktivita (187).
- 58 -
6.3.4 Hepatoprotektivní působení Tradiční čínský odvar Zhi-Zi-Da-Huang používaný v lidovém léčitelství k léčbě akutní hepatitidy a nemocí podobných žloutence se skládá za čtyř rostlin: Gardenia jasminoides (Rubiaceae), Rheum officinale (Polygonaceae), Citrus aurantium (Rutaceae) a semen rostliny Glycine max (Fabaceae) v poměru 3:1:4:8. Odvar je bohatým zdrojem flavonoidů (hesperidinu, naringinu, aj.), které jsou zodpovědné za jeho hepatoprotektivní působení u potkanů. Extrakt podávaný potkanům po 8 dní 2 hod po orálním podání alkoholu (6 g/kg) zvýšil antioxidační obranu zvýšením hladin aspartátaminotransferázy, alaninaminotransferázy, redukovaného glutationu a superoxid dismutázy a tím odvrátil toxické působení alkoholu na jaterní tkáň (188).
6.3.5 Hypoglykemické působení Extrakt z rostliny Danguyja, korejského citrusu Citrus grandis (Rutaceae), je zdrojem flavanových glykosidů hesperidinu, neohesperidinu a naringinu. V přítomnosti plísně Aspergilus saitoi dochází působením naringinázy a hesperidinázy k přeměně na aglykony a následně na jejich hydroxylované formy, které vykazují mnohem vyšší antidiabetickou a antioxidační aktivitu než samotné aglykony nebo původní extrakt, což dokazuje test kyslíkové radikálové absorpční kapacity (zachování fluorescence fluoresceinu v přítomnosti antioxidantů) a test rozštěpení nadšroubovicovitého uspořádání DNA (zhodnocení poškození DNA působením peroxylového radikálu v přítomnosti a bez antioxidantů). Antidiabetické působení prokázala inhibice střevní α-glukosidázy potkanů, což má za následek zpomalení absorpce sacharidů z potravy a inhibice prasečí pankreatické α-amylázy. Takto upravený extrakt je využitelný v léčbě diabetu (189).
6.3.6 Působení na gastrointestinální trakt Sušený extrakt z plodů pomeranče (Fructus Aurantii immaturus, Citrus aurantium, Rutaceae) a kořene pivoňky (radix Paeoniae alba, Paeonia lactiflora, Paeoniaceae) se používá v tradiční čínské medicíně k léčbě gastrointestinálních obtíží. Hlavními obsahovými látkami jsou hesperidin, synefrin a paeoniflorin, které mají dvojí účinek na gastrointestinální trakt způsobený interakcí s odlišnými receptory, jak prokázal test vyprázdnění žaludku, využívající potravu s malým množstvím radioaktivního materiálu - 59 -
ke stanovení motility a vyprazdňování žaludku. Synefrin pohyb trávicího traktu inhibuje prostřednictvím vazby na α-adrenergní receptor, hesperidin naopak stimuluje díky vazbě na H1 histaminový receptor (190). Wei-Chang-An-Wan metanolový extrakt, zdroj hesperidinu, neohesperidinu a naringinu, již po desetiletí používaný v tradiční čínské medicíně k léčbě gastrointestinálních nemocí jako je průjem, enteritis, úplavice, syndromu dráždivého tračníku prokázal své účinky na myších s průjmem (indukovaným ricinovým olejem), na gastrointestinálním průchodu a na kontrakcích izolovaného králičího jejuna. Dávky 400 a 800 mg/kg extraktu významně zabránily vzniku průjmu u myší a snížily množství mokré a tuhé stolice. Zajímavé je, že tento extrakt zrychlil průchod potravy střevy u normálních myší, ale průchod stimulovaný neostigminem zpomalil. Dále zmírnil spontánní kontrakce izolovaného králičího jejuna a také kontrakce vyvolané acetylcholinem a neostigminem. Navíc ani dávka extraktu do 5 g/kg nezpůsobila žádné toxické účinky, z čehož plyne, že je tento extrakt bezpečný a účinný při léčbě průjmů a úpravě střevní motility (191).
7 Diosmin 7.1 Metabolismus Diosmin, diosmetin-7-O-rutinosid, patří rovněž do skupiny flavanonů a nachází se v perikarpu citrusových plodů (3). Ani tento flavanonový glykosid nebyl dosud detekován v krevním oběhu a vylučovacích orgánech (136), resorbován je pouze aglykon diosmetin. Po orálním podání člověku byl v moči nalezen diosmetin ve formě konjugátů. Ačkoli hydrolýza diosminu následovaná resorpcí diosmetinu proběhla velmi rychle, dominantním metabolitem v moči byla 3-hydroxyfenylpropionová kyselina (192).
- 60 -
7.2 Biologické účinky diosminu 7.2.1 Protinádorové působení Protirakovinné působení diosminu bylo prokázáno na myším modelu metastazujícího melanomu B16F10. Diosmin spolu s interferonem-α vykázal synergický účinek v léčbě melanomu. Obě tyto látky působí antiinvazivně a antiproliferativně, přičemž účinek interferonu-α je závislý na dávce. S vyšší dávkou interferonu se zvyšuje i jeho toxicita. Výsledky byly prokázány jak makroskopicky (počítáním subpleurálních uzlin), tak mikroskopicky (pozorováním umístění a velikosti uzlin). Jako nejúčinnější se projevila kombinace diosminu s nejnižší dávkou interferonu-α (600000 IU), která se ukázala být stejně účinná jako samotný interferon v nejvyšší dávce (1200000 IU). Tato kombinace snížila počet uzlin o 77,38% (193).
7.2.2 Hypoglykemické působení Podání diosminu v různých dávkách (25, 50, 100 mg/kg tělesné hmotnosti) potkanům s diabetem, který byl způsoben aplikací streptozotocinu, významně snížilo hladinu glukózy v plasmě v porovnání s kontrolní skupinou. Diosmin v dávce 100 mg/kg výrazně snížil glykovaný hemoglobin a zvýšil hladinu hemoglobinu a inzulinu v plazmě. Aktivita klíčových jaterních enzymů metabolismu sacharidů, hexokinázy a glukózo-6-fosfátdehydrogenázy, se významně zvýšila, kdežto aktivita glukózo-6-fofatázy
a fruktózo-1, 6 -bisfosfatázy se rapidně snížila. Navíc byla
pozorovaná ochrana před ztrátou hmotnosti u diabetických potkanů. Výsledky prokázaly, že diosmin má potenciální antihyperglykemickou aktivitu u potkanů s diabetem indukovaným streptozotocin-nikotinamidem (194).
7.2.3 Venoaktivní působení Jedním z hlavních účinků diosminu je pozitivní vliv na žilní systém. V této indikaci se diosmin používá častěji ve směsi s dalšími flavonoidy, ale i samotný dokáže zvrátit nežádoucí účinky hormonální terapie (testosteronu) na žíly. Podání diosminu pacientům léčených hormonální terapií (testosteronem) zvrátilo nežádoucí účinky této léčby na žilní systém. Ve studii prováděné na 32 mužích ve věku 48-60 let rozdělených do dvou skupin (skupinu 1 tvořili muži s křečovými žilami (17 jedinců) - 61 -
a skupinu 2 muži bez předešlých komplikací (15 jedinců)) se zjistilo, že diosmin zmenšuje průměr žil a snižuje výskyt refluxů. Flebologický vliv byl zkoumán klinicky (stupněm chronické žilní insuficience) a duplexním ultrazvukem. Výsledkem léčby bylo zlepšení a obnovení původních parametrů získaných duplexní sonografií a klinické zlepšení příznaků (195). Venoprotektivní účinek byl prokázán i u semisyntetického diosminu v prospektivní studii na 80 pacientech s chronickým žilním onemocněním, kterým nepomohla jiná aplikovaná léčba. Všichni pacienti byli podrobeni komplexnímu vyšetření, aby se určily klinické příznaky, kvalita života a lokální biochemické parametry. Tato vyšetření proběhla před a 30 dní po léčbě přípravkem Phlebodia 600 (semisyntetický diosmin). Vyhodnocením výsledků se zjistilo, že tímto onemocněním trpí častěji ženy než muži, že bývá častěji postižena levá končetina a věkové rozmezí je 52,3± 10,5 let. Klinické zlepšení symptomů nastalo u 65 pacientů z 80, týkalo se to hlavně zmenšení otoku, bolesti, zmírnění pocitu těžkých nohou a napětí. Také se výrazně zlepšily parametry fyzické, sociální a psychologické kvality života spojené s poklesem skóre podle CEAP klasifikace žilních onemocnění (196). Tento přípravek byl podáván i ve studii na 37 ženách ve věku od 45 až 68 let s diagnostikovanou žilní nedostatečností a preskripcí hormonální substituční terapie. Z těchto žen si 31 pacientek stěžovalo na nepříjemné pocity a pocit dilatace ve stehenní oblasti, sevření, křeče bolest a pocit těžkých nohou po 4 měsíční léčbě hormonální terapií. Z toho 11 žen nemělo před léčbou žádné podobné příznaky. Srovnávací studie za použití duplexního screeningu žil dolních končetin před a po čtyřměsíční léčbě odhalila zvětšení lumen femorální, holenní a velké stehenní žíly stejně jako zvýšení incidence reflexů podél femorální a velké stehenní žíly. Ženám byl po čtyřech měsících léčby podáván přípravek Phlebodia 600 v dávce 1 tablety denně po dva měsíce. Výsledky ukázaly snížení obtěžujících symptomů jako pocit těžkých a unavených nohou, bolesti a dilatace u 31 žen po 7 až 10 dnech terapie. 81,0% žen shledalo léčbu za dobrou, 13,5% za dostačující a uspokojivou a 5,4% nezaznamenalo žádný pozitivní efekt. Duplexní vyšetření po dvou měsících ukázalo snížení lumen žil stejně jako snížení ortostatického gradientu žilního průměru. Také byl pozorován pokles refluxů podél stehenních žil s vymizením klinických symptomů a zlepšením života žen.
- 62 -
Výsledky potvrdily, že hormonální substituční substitu ní terapie trvající déle než čtyři týdny vede k rozvinutí flebopatie způsobenou způsobenou ortostázou, vedoucí ke snížení žilního tonu a rozvoji refluxů. Podání diosminu v pravidelné dávce po dobu dvou měsíců ě ů znamenalo výrazné snížení intenzity jak subjektivních, tak objektivních příznaků p ů a symptomů symptom flebopatie způsobené dlouhodobou louhodobou hormonální léčbou lé (197).
7.2.4 Jiné působení Mezi další potencionální využití diosminu se dá počítat po ítat jeho účinek úč jako UV-filtr v kosmetických přípravcích. ípravcích. Účinek Úč byl prokázán metodou in vitro založenou na měření m transmitance po rozptýlení ýlení buď jen v emulzi olej ve vodě obsahující flavonoidy, polyfenoly nebo polymetakryláty. Mezi nejúčinnější nejú UV-filtry patří i kyselina elina chlorgenová a apigenin (198). Diosmin také může ůže ovliňovat ovliň dostupnost jiných látek. Předléčení ř čení diosminem v dávce 500 mg pod dobu 9 dní před řed ed chlorzoxazonem (centrální myorelaxans) výrazně výrazn prodloužilo účinek tohoto léku prostřednictvím řednictvím ednictvím inhibice cytochromu P450 2E1. Ve studii byl nejdříve nejd podáván pouze chlorzoxazon v dávce 250 mg 12 dobrovolníkům, v určitých čitých intervalech jim byly odebrány vzorky krve a moči. mo i. Poté po 7 denní pauze byl 9 dní aplikován diosmin a 10. den opětt chlorzoxazon. Vzorky byly odebrány stejným způsobem zp sobem a zhodnoceny. Předléčení ení diosminem výrazně výrazn zvýšilo AUC, neboli plochu pod křivkou, k která vyjadřuje koncentraci léčiva čiva v plazmě,, dále zvýšilo maximální koncentraci léčiva léč v plazmě a biologický poločas as (dobu, kdy se koncentrace léčiva lé v plazmě sníží na polovinu). Dále byla snížena exkrece chlorzoxazonu močí mo a hladina nezměněného ného chlorzoxazonu byla zvýšená přess 8 h. Došlo ke snížení celkového vylučování vylu této látky. Z výsledkůů vyplývá, že diosmin dokáže inhibovat mikrozomální CYP2E1 způsobenou zp hydroxylaci chlorzoxazonu (199).
7.3 Biologické účinky činky extraktů extrakt obsahujících diosmin 7.3.1 Antioxidační působení ůsobení Diosmin, didymin, isorhoifolin a naringin extrahované z flaveda 21 druhů druh citrusových plodů mají prokázanou antioxidační antioxida aktivitu v testech měření ěření antioxidační antioxida kapacity ekvivalentní troloxu (TEAC), antioxidační antioxida kapacity v testu redukce železa (FRAP) a testu zhášecí aktivity kyseliny chlorné. TEAC test měří m í relativní schopnost antioxidační antioxida látky zhášet radikálový anion 2,2'--azino-bis(3-etylbenzthiazilin-6-sulfonové sulfonové kyseliny) (ABTS - 63 -
+
)
v porovnání se syntetickým antioxidantem troloxem, ve vodě rozpustným analogem vitaminu E. FRAP test využívá schopnost substancí redukovat Fe(III)-2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) komplex na Fe(II)-TPTZ komplex, projevující se výrazným modrým zbarvením, jehož intenzita koreluje s obsahem antioxidantu (redukčního činidla). Obsah jednotlivých flavonoidů v extraktech se liší podle druhu citrusu, např. naringin je přítomný pouze v mandarinkách, diosmin, narirutin, didymin jsou ve všech testovaných extraktech (200).
7.3.2 Protizánětlivé působení Diosmin a flavonoidy obecně mají prokázaný protizánětlivý účinek. Diosmin a hesperidin ukázaly významnou inhibici prostaglandinů ve studiích in vivo. Výsledky dokazují, že diosmin má velký potenciál v léčbě zánětlivých onemocnění Mechanismus účinku spočívá hlavně v inhibici enzymů tvořících eikosanoidy, jako je fosfolipáza A2, cyklooxygenáza a lipoxygenáza, čímž dochází ke snížení koncentrace leukotrienů a prostanoidů, hlavních mediátorů zánětu. Dalším mechanismem je inhibice uvolňování histaminu, fosfodiesterázy, proteinkinázy a aktivace transkriptázy (201). Protizánětlivé působení vykázal diosmin s dalšími flavonoidy i na několika modelech lidských a potkaních intestinálních epiteliálních buněk (Caco-2, HT29, HCT116, IEC ModeK, IEC-6 a dalších). V těchto buňkách byla zánětlivá reakce vyvolána cytokiny samotnými nebo jejich směsí (interleukin-6, IL-1β, tumor nekrotizující faktor-α). Polyfenolické látky byly aplikovány v různých koncentracích (0,1-370µM) buď před vlastní aplikací zánětlivých mediátorů, nebo společně se zánětlivým stimulem. Účinek flavonoidů spočívá ve schopnosti modulovat intracelulární signální zánětlivé kaskády ve střevních buňkách (inhibice nukleárního faktoru-κB, ovlivnění MAPK signalizační kaskády aj.) (202).
7.3.3 Protinádorové působení Diosmin, katechin, daidzen a další flavonoidy získané z potravy inhibují aktivaci nukleárního faktoru κB a tím působí protizánětlivě a mohou tak zabránit rozvoji rakoviny. Je potvrzeno, že regulace aktivace zánětlivých pochodů může ovlivnit průběh rakoviny a že transkripční faktor NF-κB zprostředkovává zánětlivou reakci, buněčnou transformaci, přežívání rakovinných buněk, proliferaci, invazi a angiogenezi (203). Methanolový extrakt z listů, nati a oddenku rostlin druhu Boesenbergia (B. rotunda, - 64 -
B. pulchella var attenuata, B. armeniaca) (Zingiberaceae) má prokázané antioxidační a protirakovinné působení na různých modelech rakovinných buněk. Tento extrakt je bohatým zdrojem polyfenolů, jako je kvercetin, rutin, diosmin, luteolin, naringin, hesperidin a dalších. Nejvyšší
cytotoxickou
aktivitu
vykázal
druh
B.
rotunda,
který
působil
antiproliferativně proti pěti rakovinným buněčným liniím: buňkám rakoviny ovárií (CaOV 3), rakoviny prsu (MDA-MB-231 a MCF-7), děložního čípku (HeLa) a rakoviny tlustého střeva (HT-29). Proti buňkám rakoviny prsu MCF-7 také působil extrakt z oddenku zbylých dvou druhů a tak se dá usuzovat, že tato rostlina je potenciálním prostředkem k terapii rakoviny prsu (204). Květy rostliny Chrysanthemum morifolium (Asteraceae) jsou zdrojem flavonoidů a mají prokázaný cytotoxický účinek na modelu buněk rakoviny tlustého střeva Colon205. Účinek diosminu, luteolinu, diosmetinu, diosmetin 7-O-D-glukopyranosidu a skolimosidu byly potvrzeny pomocí MTT testu (205). Extrakt ze semen rostliny Mangifera pajang (Anacardiaceae), zdroj fenolických sloučenin a flavonoidů (diosmin, hesperidin, rutin, luteolin, naringin), působí cytotoxicky na buňky MCF-7 (buňky hormonálně-dependentní rakoviny prsu) a buňky MDA-MB-231 (buňky nehormonálně-dependentní rakoviny prsu) s hodnotami IC50 23 resp. 30,5 µg/ml. Extrakt ze semen vyvolává zastavení buněčného cyklu u buněk MCF-7 v sub-G1 (apoptické) fázi buněčného cyklu. U druhého typu buněk MDA-MB-231 způsobil zastavení cyklu ve fázi G2-M za 24 hod, což vyústilo v uzamčení cyklu v sub-G1 fázi za 48 a 72 hod po inkubaci. Chemickým barvením se odhalilo, že apoptóza se u obou typů buněk objevila brzy, u MCF-7 buněk za 36 hod u MDA-MDB-231 za 24 hod. Ukázalo se, že apoptóza je závislá na kaspáze-2 a 3 u MCF-7 buněk a kaspáze-2, 3 a 9 u druhého typu buněk. Extrakt z této rostliny je potenciálním cytotoxickým agens (206).
7.3.4 Působení na nervový systém Diosmin a luteolin, citrusové bioflavonoidy, prokázaly své neuroprotektivní vlastnosti na modelu Tg2576 myší trpících Alzheimerovou chorobou. Obě tyto látky jsou schopny redukovat vznik β-amyloidu, který je hlavním patologickým znakem této nemoci. β-amyloid vzniká dysregulací glykogensyntázy-kinázy-3 (GSK-3). Diosmin a luteolin působí jako inhibitory tohoto enzymu a zabraňují tak amyliodové γ-sekretáze rozštěpit prekurzorový protein amyloidu. Dále také podporují fosforylaci presenilinu-1, který se pak nemůže spojit - 65 -
s prekurzorovým proteinem amyloidu. Diosmin s luteolinem snížil u myší hladinu β-amyloidu, potlačil aktivitu GSK-3 a přerušil spojení presenilinu-1a proteinového prekurzoru (207). Stejné flavonoidy z citrusů mohou ovlivňovat i sociální chování. Bylo to prokázáno ve studii, kde byly tyto flavonoidy podávány těhotným ženám. Tyto látky jsou schopny inhibovat interleukin-6 (IL-6) v mateřském séru, který hraje klíčovou roli při vývoji mozku plodu a může tak poškodit sociální chování. Výsledky potvrdily, že flavonoidy mají vliv na interleukinem-6 indukovanou fosforylaci JAK2/STAT3 (Janusova tyrosinkináza-2/signální přenašeč a aktivátor transkripce) a signalizaci. Diosmin a luteolin inhibují neuronální fosforylaci jak in vitro, tak in vivo. Dále je potvrzeno, že podání diosminu v dávce 10 mg/kg/den je schopné blokovat STAT3 signální cestu, která významně antagonizuje abnormální chování u potomků indukované aktivací mateřské imunity a interleukinem-6 (208).
7.3.5 Jiné působení Schopnost inhibovat ATP syntázu prokázala celá řada bioflavonoidů, které jsou běžně přijímány v potravě (209) např. diosmin, apigenin, chrysin, luteolin, naringin, hesperidin, kemferol, daidzen a další. ATP syntáza je pro buňky životně důležitý enzym, protože je schopen přeměnit vodíkové protony na využitelnou energii ve formě ATP a jeho inhibicí dochází k poškození a zániku buněk (210). Byl pozorován vliv jak na purifikovanou F1 nebo membránově vázanou E. coli F1Fo ATP syntázu. Účinek jednotlivých látek se lišil podle uspořádání hlavního skeletu, velikosti, tvaru, geometrie a pozice jednotlivých funkčních skupin. Některé flavonoidy inhibují oba typy ATP syntáz kompletně, některé, mezi nimi i diosmin, inhibují syntézu jen parciálně v rozsahu 40-60%. Ve všech případech byla tato inhibice plně reverzibilní (209).
- 66 -
7.4 Diosmin a hesperidin 7.4.1 Venoaktivní působení Účinek na chronické žilní onemocnění prokázal Daflon® 500 (Les Laboratoires Servier France, Gidy) (450 mg diosminu a 50 mg hesperidinu) ve studii na leukocytech. Tato směs má schopnost redukovat interakce leukocytů s endotelem, jako je adheze leukocytů, jejich aktivace a migrace a spojení s poškozením chlopní, což jsou hlavní mechanismy vzniku žilního onemocnění (211). Daflon podávaný pacientům s žilními otoky přinesl zlepšení klinických symptomů. Přípravek byl podáván lidem starších 18 let s otoky bez kožních změn, hodnocenými 4 až 10 cm na vizuální analogové škále bolesti, stěžujících si na nejméně tři z následujících symptomů: bolest, těžkost, pocit zduření, pocit napětí a neklidné končetiny. Daflon jim byl dáván v dávce dvou tablet denně po dobu 6 měsíců. Již po 2 měsících léčby se snížil u pacientů obvod a objem končetiny a došlo i k výraznému zlepšení symptomů jako je zduření, napětí bolest a neklidnost končetin (212). V jiné studii byl kromě Daflonu (v dávce 1 tablety dvakrát denně) podáván ještě Diosmin® 1 g, obsahující 900 mg diosminu a 100 mg hesperidinu (v dávce 1 sáček denně). Pacienti byli rozděleni do tří skupin podle aplikovaného přípravku. U pacientů byla sledována bolest pomocí vizuální analogové škály a měřena průchodnost cév a krevní oběh. Výsledky potvrdily, že ve všech skupinách došlo k výraznému snížení výsledků naměřených vizuální analogovou škálou bolesti, ale že nebyly markantnější rozdíly mezi účinností a bezpečností jednotlivých podávaných kombinovaných přípravků. Oba přípravky zlepšily prokrvení a snížily bolestivost a otoky dolních končetin u pacientů s chronickou žilní nedostatečností (213). Protizánětlivé a antiedematózní působení frakce bylo pozorováno na modelu potkanů s adjuvantní artritidou. Tentokrát byl diosmin s hesperidinem podávaný v přípravku Detralex® (450 mg diosminu a 50 mg hesperidinu). Dále byl aplikován metotrexát nebo kombinace obou látek. V jednotlivých skupinách pak byly po 50 dnech pozorovány parametry jako otok zadních končetin, artritické skóre, hladina sérového albuminu koncentrace sérových dusitanů/dusičnanů a celková hustota kostní tkáně. Podávání metotrexátu v dávkách 0,6 mg/kg/týden výrazně inhibovalo jak zánětlivé tak artritické markery. Samostatně podávaný Detralex (20 mg/kg/den) zlepšil otoky končetin a artritické skóre jen nepatrně. Jako nejúčinnější se ukázala kombinace obou látek. Detralex - 67 -
potencoval prospěšné působení metotrexátu, což vedlo k výraznému snížení otoků zadních končetin, zlepšení artritického skóre a zlepšení poměru sérových dusitanů/dusičnanů. Dokonce i výrazné snížení kostní hustoty způsobené artritidou bylo u potkanů léčených oběma látkami nižší (214). Detralex může také pozitivně ovlivnit proces koagulace a fibrinolýzy. Tento jev byl prokázán ve studii s 51 pacienty trpících žilním onemocněním s progresí C0-C2 podle CEAP klasifikace (Clinical- Etiology- Anatomy- Patophysiology), což znamená, že pacienti jsou bez nebo jen s mírnými příznaky žilního poškození, s 55 pacienty se stupněm progrese C5-C6 (žilní vředy) a s 53 pacienty jako kontrolní skupinou. Detralex jim byl podáván v denní dávce 1000 mg po 14 dní. Výsledky prokázaly výrazně zvýšenou aktivitu antitrombinu III u nemocných jedinců v porovnání s kontrolní skupinou. V závislosti na míře postižení způsobuje Detralex snížení koncentrace fibrinogenu, zkrácení aktivovaného parciálního tromboplastinového času (času nutného ke sražení krve), snížení aktivity antitrombinu
III, hladiny trombin - antitrombinového komplexu
a protrombinového času. Ze studie vyplývá, že Detralex díky svému antitrombotickému působení může normalizovat některé parametry koagulace a fibrinolýzy (215). Daflon také snižuje hyperpermeabilitu cév. Na modelu křečků rozdělených do osmi skupin podle medikace se zjistilo, že podání Daflonu nebo samotného diosminu 15 min před anestézií nezpůsobilo žádné změny v krevním tlaku. Dávky 10 nebo 30 mg/kg obou látek výrazně snížily propustnost kapilár způsobenou ischemií a následnou reperfúzí, ale efekt frakce byl markantnější ( 39±1% a 52±1%) než u diosminu (18±1% and 37±3%). Z výsledků vyplývá, že celá frakce snížila permeabilitu cév více než její jednotlivé součásti (216).
7.4.2 Působení na kardiovaskulární systém Působení Daflonu lze využít i při kardiovaskulárních onemocněních. Orální podání přípravku pacientům před operací trpících poškozením levé ventrikulární ejekční frakce přineslo výrazné zlepšení určitých markerů, charakterizujících srdeční poškození. Účinek byl pozorován v prospektivní randomizované klinické studii na 43 pacientech trpících srdečním poškozením a zařazených do kategorie 2,30 ± 0,74 dle NYHA (New York heart Association), kterým byl doporučen koronární bypass. 21 pacientům byl podáván Daflon před operací a následně byla hodnocena hemodynamická data, inotropní podmínky, morbidita, úmrtí, srdeční ischémie a různé markery. Ve skupině s Daflonem bylo pozorováno jen jedno úmrtí a hladiny troponinu I a laktát dehydrogenázy se významně snížily. Dále - 68 -
se výrazně zlepšil stav pacientů a zařazení do kategorie dle NYHA. Orální podání Daflonu by mohlo poskytnout lepší výsledky operací pro pacienty se srdečním poškozením (217). Daflon je také schopen oddálit rozvoj refluxů a potlačit poškození chlopenních struktur. Tento účinek byl prokázán na modelu potkanů s žilní hypertenzí. Potkanům byla uměle vytvořena stehenní arteriovenózní fistula a poté byly měřeny parametry jako krevní průtok, infiltrace leukocytů, gelatinázová aktivita, vzniklý otok a reflux a eventuální ztráta nepropustnosti chlopní. Daflon jim byla podáván v dávce 100 mg/kg tělesné hmotnosti a vyvolal zmenšení otoku a refluxu. Dále bylo pozorováno snížení hladiny granulocytů a infiltrace makrofágů v porovnání s neléčenými jedinci (218).
7.4.3 Hypoglykemické působení Mikronizovaná frakce prokázala účinek i v léčbě diabetu. Daflon podávaný dvakrát denně po dobu 45 dní spolu nebo bez orálních antidiabetik snížil hladinu glukózy a kardiovaskulární riziko u pacientek trpících diabetem 2. typu. Výsledky neprokázaly žádné vedlejší účinky a testy jaterních a ledvinných funkcí byly v normálních mezích bez výrazných změn před a po léčbě. Na druhou stranu došlo u pacientek k markantnímu snížení hladin sérové glukózy, fruktózaminu, celkového cholesterolu, LDL-cholesterolu, triglyceridů, malondialdehydu (indexu lipidové peroxidace) a C reaktivního proteinu. Studií bylo potvrzeno, že diosmin a hesperidin mají hypoglykemické a kardioprotektivní vlastnosti (219).
7.4.4 Působení na gastrointestinální trakt Frakce flavonoidů v dávce 80 mg/kg/den působila pozitivně na poškození sleziny a ilea způsobené ischemií a následnou reperfúzí.
Purifikovaná frakce byla aplikována
potkanům 3 dny před operací, 30 min před ischemií a těsně před reperfúzí. Poté byly odebrány vzorky a byla určena celková antioxidační kapacita, kataláza, celkový oxidační stav, index oxidačního stresu a hladina myeloperoxidázy. Ve srovnání s kontrolní skupinou, bylo u potkanů léčených diosminem pozorováno výrazné zvýšení celkové antioxidační kapacity v tkáních sleziny a tenkého střeva, na druhou stranu oxidační kapacita, index oxidačního stresu a hladina myeloperoxidázy se výrazně snížila. Také histologické poškození střevní tkáně bylo mírnější u léčené skupiny (220).
- 69 -
7.4.5 Cytoprotektivní působení Radioprotektivní účinek Daflonu byl prokázán na modelu kultury lidských lymfocytů in vivo a in vitro. Vzorky periferní krve dobrovolníků byly sbírány 10 minut před a pak 1, 2 a 3 hodiny po perorální aplikaci 1000 mg Daflonu a následně byly vystaveny γ záření. Výsledky ukázaly výrazné zvýšení výskytu mikrojadérek po expozici záření ve srovnání s kontrolní skupinou. Již 1 hod po podání daflonu se významně snížila incidence mikrojader a v této době byl také efekt nejsilnější (snížení frekvence výskytu o 40%). To dokázalo, že flavonoidy ochraňují lidské lymfocyty před genetickým poškozením a vedlejšími účinky vyvolanými γ zářením (221).
- 70 -
8 Diskuze Flavonoidy obecně mají prokázané četné biologické účinky. Nejznámější jsou asi pro antioxidační a protizánětlivé působení a pro schopnost zlepšovat stav cévního systému (působí proti lámavosti kapilár, snižují propustnost cév, používají se k léčbě chronického žilního onemocnění, otoků a bolestí končetin) (2). Při zpracování práce jsem zjistila, že to není zdaleka jejich jedinné uplatnění. Flavonoidy jsou velmi dobrými inhibitory apoptózy a vykazují tak silné cytoprotektivní působení (21-28), (86-88), (142-149) a jsou schopny potlačit různé druhy nádorového bujení (29-46), (89-90), (121-122), (150-155). Dále mohou být využívány k léčbě diabetu mellitu (15), (96-97), kardiovaskulárních onemocnění (52-58), (123-124), onemocnění jater (47), (48), (51), nervových poruch (59-65), (125) při GIT potížích (130-133) a bakteriálních, virových, fungálních a parazitárních infekcí (78-79) a (134-135). Účinky se liší podle konkrétního typu flavonoidu. Kvercetin Kvercetin patří k nejsilnějším antioxidačním agens. Největší zhášecí aktivitu vykazuje vůči reaktivním formám kyslíku, hlavně peroxidu vodíku a z dusíkových radikálů vůči oxidu dusnatému a peroxynitritu. Antioxidační kapacita kvercetinu je přičítána přítomnosti dvou antioxidačních farmakoforů (souborů prostorových a elektrostatických vlastností nezbytných pro zajištění optimálních supramolekulárních interakcí) v molekule, např. katecholová skupina na kruhu B a hydroxy skupina v pozici 3 na kruzích A a C. Navíc kvercetin zvyšuje aktivitu i endogenních antioxidantů běžně přítomných v buňkách (4). Dalším prospěšným účinkem kvercetinu je protizánětlivá aktivita. Kvercetin dokáže inhibovat produkci zánětlivých cytokinů (interleukinů, tumor nekrotizujícího faktoru α) (15) a (18). Jeho účinek se dá vysvětlit součinností mezi oxidačním stresem a zánětlivým procesem. Reaktivní kyslíkové formy nejsou zapojeny jen do vyvolání oxidačního stresu, ale podílejí se i na rozvoji zánětlivé reakce, hlavně prostřednictvím aktivace transkripce nukleárního faktoru κB a aktivačního proteinu-1 (4). Kvercetin a jeho deriváty vykazují inhibiční potenciál vůči indukovatelné syntáze oxidu dusnatého, isoenzymu zodpovědného za tvorbu oxidu dusnatého jako obranného mechanismu při zánětlivé reakci. Bylo zjištěno, že vodíkové vazby mezi kvercetinem a indukovatelnou
syntázou
jsou
vždy
tvořeny
amidovou
skupinou
z glycinových
a trypsinových zbytků v aktivním místě syntázy a 4-karbonylovou skupinou flavonoidů.
- 71 -
Vznikem stabilního komplexu mezi flavonoidem a syntázou, dojde k inaktivaci enzymu a následné inhibici tvorby oxidu dusnatého a tím i inhibici zánětlivé reakce (14). Inaktivací lipoxygenázy-1, enzymu hrajícího důležitou roli v zánětlivém procesu, která byla inaktivována redukcí železitých iontů na ionty železnaté a to chelatací železa v aktivním místě enzymu, došlo k inhibici peroxidace linoleové kyseliny a tím i k zastavení zánětlivé reakce (5). Cytoprotektivní aktivita kvercetinu spočívá hlavně v jeho antioxidačním působení. Potlačením oxidačního stresu způsobeného vlivem různých látek, např. kadmiem (21), olovem (22), peroxidem vodíku (23), (27), dochází k zastavení apoptózy. Kvercetin prokázal ochranný účinek na různých buněčných kulturách (jednovrstvé buňky ECV304 (27), ledvinné buňky (21-22)) a zvířecích modelech (potkanech (22), (23) a myších (24) a (28)). Mechanismus působení kvercetinu na rakovinné buňky byl vysvětlen na buněčné linii DLD-1 rakoviny tlustého střeva. Kvercetin inhiboval růst těchto buněk dvěma způsoby. Prvním byla inhibice aktivity ornitindekarboxylázy, enzymu účastnícího se syntézy polyaminů, které jsou zapojené do buněčného růstu a diferenciace. Druhý mechanismus účinku bylo vyvolání apoptózy (29). Na buněčných kulturách buněk HT-29, HepG2, HeLa buněk se zjistilo, že kvercetin dokáže zastavit buněčný cyklus v různých fázích, a to prostřednictvím aktivace apoptózu-vyvolávajících proteinů a enzymů (p53, AMPK) (30), (36), (37), (43-45). Kvercetin chrání buňky jater nejen zastavením buněčného cyklu při rakovinném bujení (37), ale hlavně potlačením tvorby volných radikálů (47-51). Pozitivní vliv kvercetinu na cévní systém spočívá ve zlepšení funkce endotelu. Kvercetin zvyšuje intracelulární koncentraci vápenatých iontů a zesiluje stimulaci fosforylace endoteliální syntázy oxidu dusnatého doprovázenou zvýšením produkce oxidu dusnatého, který má vazodilatační účinky (52) a (54). Ovlivněním aktivity paraoxonázy 1, enzymu podílejícího se na tvorbě HDL-cholesterolu a inhibujícího oxidaci LDL-cholesterolu, je kvercetin schopen zabránit vzniku aterosklerotických lézí (56-57). V in vitro a in vivo studiích byl prokázán neuroprotektivní účinek kvercetinu na buňky gliomu (59) a na modelu vajíček obojživelníka rodu Xenopus (65). Kvercetin zlepšuje kognitivní funkce u jedinců trpících neurodegenerativním onemocněním (59), (61) a (64) a inhibicí exprese kortikotropin uvolňujícího faktoru v mozku u myší prokázal anxiolytické a antidepresivní působení (62). Rutin - 72 -
Rutin je také velmi silný antioxidant. Antioxidační aktivita byla prokázána hlavně u extraktů obsahujících rutin, kde se aktivita lišila zejména podle použitého rozpouštědla (98-113). Rutin zháší volné radikály (nejčastěji byla zaznamenána aktivita vůči DPPH radikálu (106-113)), zabraňuje peroxidaci lipidů (99) a vykazuje chelatační potenciál (101), (104-105). Inhibicí zánětlivých cytokinů se rutin podílí na protizánětlivé aktivitě (114). Negativní dopady septické artritidy způsobené kvasinkou Candida albicans odvrátil rutin inhibicí produkce oxidu dusnatého z proliferujících se makrofágů a T-lymfocytů a inhibicí růstu kvasinkových buněk (83). Jako nositel účinku extraktu z Hypericum perforatum (Hypericaceae) prokázal hojivé účinky ve studii in vivo na modelech excize a řezných ran (116). S antioxidační aktivitou rutinu souvisí i jeho schopnost chránit buňky před toxickým působením různých látek. Ve studiích se syntetickými pyretroidy potlačil rutin oxidační stres a zabránil tak hemolýze erytrocytů (85-86). Také ochránil buňky ledvin před toxickým působením tetrachlórmetanu (88). Významný je také vliv rutinu na žaludeční mukózu, která je velmi citlivá na působení některých látek, zejména nesteroidních antiflogistik. Ty zvyšují gastrický vředový index, aktivitu myeloperoxidázy, aciditu a obsah reaktivních substancí s thiobarbiturovou kyselinou a snižují hladinu glutationu a aktivitu superoxid dizmutázy (130). Protivředové působení spočívá ve schopnosti inhibovat H+, K+-ATPázu, která je důležitá pro přenos protonů do intersticia žaludku a pro tvorbu kyseliny chlorovodíkové, hlavního spouštěče tvorby peptických vředů. Dále se využívá antioxidačního působení flavonoidů a jejich zhášecí schopnosti. Účinky extraktu jsou srovnatelné s omeprazolem, inhibitorem protonové pumpy a nejúčinnějším lékem při vředové chorobě žaludku (131). Za použití buněčné linie lidské promyelocytární leukémie (HL-60), bylo prokázáno, že rutin v kombinaci s vitaminem E, vykazují antikancerogenní účinky potlačením vaskularizace nádorových buněk, synergicky snižují expresi VEGF proteinů a mRNA. Dále bylo prokázáno, že tyto látky významně snižují vazebnou kapacitu nukleárního faktoru AP-1 (activator protein-1) k promotoru genu pro VEGF a rovněž snižují expresi proteinu c-Jun (89). Rutin indukuje apoptózu v rakovinných buňkách leukemie WEHI-3 u myší BALB/c a snižuje procentuální zastoupení markeru Mac-3, ukazujícího, že byla inhibována diferenciace prekurzorů makrofágů a T-buněk imunitního systému. Rutin podporuje aktivitu makrofágové fagocytózy (90).
- 73 -
Rutin snižuje hladinu glukózy v krvi u potkanů s diabetem vyvolaným podáním streptozotocinu (96-97), (126). Dále snižuje hladinu glykovaného hemoglobinu, zvyšuje hladinu plazmatického inzulinu a C-peptidu (97) a (126). Rutin se podílí na oddálení pozdních komplikací diabetu, plynoucí ze zvýšených hladin glukózy v krvi a následného vzniku oxidačních a glykosylačních produktů (97). Mechanismus antiagregačního působení byl objasněn na modelu lidských erytrocytů za použití extraktu z Actinostemma lobatum (Cucurbitaceae) obsahujícího rutin. Extrakt významně inhibuje zabudování fibrinogenu na glykoproteinový receptor GP IIb/IIIa na povrchu destiček v závislosti na koncentraci, redukuje hladinu tromboxanu A2 a výrazně prodlužuje protrombinový čas a aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT) (124). Antidepresivní aktivita extraktu z rostliny Schinus molle L. (Anacardiaceae) je pravděpodobně závislá na přítomnosti rutinu, který interaguje se serotogenním, noradrenergním a dopaminergním systémem (125). Hesperidin Antioxidační aktivita hesperidinu a extraktů obsahujících hesperidin je opět spojena s celou řadou dalších biologických aktivit. Antioxidačního působení lze využít v léčbě zánětu, kde hesperidin a další flavonoidy snižují oxidační a dusíkový stres. Na mechanismu jejich působení se podílí inhibice aktivace nukleárního faktoru-κB (prozánětlivého faktoru), inhibice exprese indukovatelné NO-syntázy, adhezních molekul a tumor nekrotizujícího faktoru-α (mediátorů zánětu) (141). Hesperidin a rutin díky svým antioxidačním vlastnostem dokáží zabránit vzniku reaktivních kyslíkových radikálů a tím zeslabují působení světelného a γ-záření. Vůči světelnému záření je dvakrát více účinný derivát rutinu. U γ záření jsou účinky srovnatelné. Z toho plyne, že antioxidační potenciál flavonoidů je závislý na zdroji záření (148). Použitím kometového testu, prokazujícího míru poškození DNA, se zjistilo, že hesperidin dokáže ochránit DNA před poškozením a rozštěpením snížením tvorby tzv. komet, kde hlava komety představuje nenarušenou DNA a ocas odštěpené fragmenty DNA. Hesperidin chrání lymfocyty dvojím způsobem, brání genetickému poškození a zvyšuje přirozenou antioxidační aktivitu (144-145). Hesperidin zvýšením exprese isoformy enzymu hemoxygenázy-1 (indukovatelná isoforma vznikající jako odpověď na buněčný stres) ochránil hepatocyty před oxidačním stresem. Dále podpořil jadernou translokaci nukleárního faktoru Nrf2, který hraje důležitou roli v aktivaci transkripce antioxidačních responzivních elementů a aktivoval extracelulární - 74 -
signál-regulující proteinkinázu 1/2 (ERK1/2), čímž spustil buněčnou obranu (156). Western blot test (analytická metoda využívající gelovou elektroforézu k určení specifických proteinů) ukázal,
že
hesperidin
usnadňuje
fosforylaci
proteinového
řetězce
ERK/MAPK
(zprostředkovává komunikaci mezi receptory na povrchu buňky a buněčným jádrem), která je zodpovědná za aktivaci cytoprotektivního proteinu Nrf2 (157). Protinádorové
působení
hesperidinu
spočívá
ve
schopnosti
měnit
expresi
cyklooxygenázy-2 a metaloproeinázy-2 a -9 (150). Transkripce MMP-9 je potlačována inhibicí aktivity nukleárního faktoru κB (transkripčního faktoru vázajícího se na promotor RNA a ovlivňujícího expresi genů) a aktivačního proteinu (AP-1) (153). Hesperidin prokázal kardioprotektivní vlastnosti na modelu potkanů s diabetem vyvolaným aplikací injekce streptozotocinu. U těchto potkanů hesperidin (10 mg/kg) po čtyřtýdenním podávání zvýšil srdeční tep, nijak neovlivnil délku QT intervalu a snížil riziko tachyarytmie. Perfúzní testy prokázaly, že hesperidin obnovuje akční potenciál papilární svaloviny komor u diabetických potkanů. Hesperidin snižuje riziko prevalence arytmií u diabetických potkanů v závislosti na dávce mechanismem zvrácení abnormální elektrofyziologické aktivity (162). Potenciální přínos hesperidinu při léčbě Huntingtonovy choroby byl potvzren u potkanů s touto chorobou vyvolanou 3-nitropropionovou kyselinou (3-NP). Tato látka je tzv. sebevražedný inhibitor a vyvolává ireverzibilní inhibici sukcinátdehydrogenázy a tím nevratně
poškozuje
mitochondrie,
což
vede
k striatální
degeneraci
a
projevům
neurodegenerativních onemocnění jako jsou snížení lokomoční aktivity, tělesné hmotnosti, síly stisku, oxidační obrany a dysfunkci enzymových mitochondriálních komplexů ve striatu. Předléčení hesperidinem významně zmírnilo behaviorální změny, dopady působení oxidačního stresu a zlepšilo funkci mitochondriálních enzymových komplexů (164). Hypoglykemické působení bylo prokázáno na zvířecích modelech (potkanech (167168), (172) a myších (169)). Hesperidin snižuje hladinu glukózy v krvi prostřednictvím schopnosti zabránit absorpci glukózy a zlepšením glukózové tolerance. Dále zvyšuje využití glukózy v periferních tkáních, reguluje aktivitu enzymů účastnících se metabolismu sacharidů a chová se jako insulinová sekretagoga nebo mimetika. Hesperidin snižuje expresi jaterního transportéru glukózy GLUT2, zvyšuje aktivitu jaterní glukokinázy a koncentraci glykogenu (166). V randomizované dvojitě zaslepené, placebem kontrolované studii se 112 zdravými dobrovolníky s hladinou sérových triglyceridů v rozmezí od 120 do 200 mg/l bylo zjištěno, že hesperidin v monoglukosylované formě přidaný do nápoje (340 mg/500 ml nápoje/den) - 75 -
snížil hladinu sérových triglyceridů. Bezpečnost hesperidinu byla prokázána ve studii s 99 dobrovolníky s nadměrným příjmem nápoje (1030 mg glukosylhesperidinu/den) po dobu 4 týdnů (174). Diosmin Diosmin je znám hlavně pro své venoaktivní působení. Jeho účinky byly prokázány v klinických studiích na lidských dobrovolnících se žilním onemocněním (195-197). Vyhodnocením výsledků se zjistilo, že tímto onemocněním trpí častěji ženy než muži, že bývá častěji postižena levá končetina a věkové rozmezí je 52,3± 10,5 let (196). Ve studii prováděné na 32 mužích ve věku 48-60 let se zjistilo, že diosmin zmenšuje průměr žil a snižuje výskyt refluxů. Flebologický vliv byl zkoumán klinicky (stupněm chronické žilní insuficience) a duplexním ultrazvukem (195). V prospektivní studii na 80 pacientech s chronickým žilním onemocněním, kterým nepomohla jiná aplikovaná léčba, byl podán semisynteticky připravený diosmin v přípravku Phlebodia 600. Klinické zlepšení symptomů nastalo u 65 pacientů z 80, týkalo se to hlavně zmenšení otoku, bolesti, zmírnění pocitu těžkých nohou a napětí. Také se výrazně zlepšily parametry fyzické, sociální a psychologické kvality života spojené s poklesem skóre podle CEAP klasifikace žilních onemocnění (196). V jiné studii na 37 ženách ve věku od 45 až 68 let s diagnostikovanou žilní nedostatečností a preskripcí hormonální substituční terapie takto upravený diosmin snížil intenzitu jak subjektivních, tak objektivních příznaků a symptomů flebopatie způsobené dlouhodobou hormonální léčbou (197). Také diosmin vykazuje antioxidační (200) a protizánětlivou aktivitu (201-202). Protinádorové působení spočívá inhibici aktivace nukleárního faktoru κB. Je potvrzeno, že regulace aktivace zánětlivých pochodů může ovlivnit průběh rakoviny a že transkripční faktor NF-κB zprostředkovává zánětlivou reakci, buněčnou transformaci, přežívání rakovinných buněk, proliferaci, invazi a angiogenezi (203). Významné by také mohlo být využití diosminu při léčbě Alzheimerovy choroby. NA modelu myších buněk Tg2576 se zjistilo, že diosmin a luteolin redukují vznik β-amyloidu, který je hlavním patologickým znakem této nemoci. β-amyloid vzniká dysregulací glykogensyntázy-kinázy-3 (GSK-3). Diosmin a luteolin působí jako inhibitory tohoto enzymu a zabraňují tak amyliodové γ-sekretáze rozštěpit prekurzorový protein amyloidu. Dále také podporují fosforylaci presenilinu-1, který se pak nemůže spojit s prekurzorovým proteinem amyloidu (207). - 76 -
Diosmin a hesperidin Kombinace diosminu s hesperidinem má natolik prokázáné biologické účinky v klinických studiích, že se stala hlavní účinnou složkou několika léčivých přípravků registrovaných u nás i ve světě. V minulém roce proběhlo nejvíce studií s přípravky Daflon® a Detralex® (212-213), (217). Po 6 měsíční terapii Daflonem podávaným lidem starších 18 let s otoky bez kožních změn, hodnocenými 4 až 10 cm na vizuální analogové škále bolesti, stěžujících se na nejméně tři z následujících symptomů: bolest, těžkost, pocit zduření, pocit napětí a neklidné končetiny, došlo ke snížení obvodu a objemu končetin a k výraznému zlepšení symptomů jako je zduření, napětí bolest a neklidnost končetin (212). V jiné studii Daflon zlepšil prokrvení končetin (213). Detralex ve studii s 51 pacienty trpících žilním onemocněním snížil koncentraci fibrinogenu, zkrátil aktivovaný parciální tromboplastinový čas (čas nutný ke sražení krve), snížil aktivitu antitrombinu III, hladinu trombin-antitrombinového komplexu a protrombinový čas (215). V prospektivní randomizované klinické studii na 43 pacientech trpících srdečním poškozením a zařazených do kategorie 2,30 ± 0,74 dle NYHA (New York heart Association), kterým byl doporučen koronární bypass, byl před operací podáván Daflon. Ve skupině s Daflonem bylo pozorováno jen jedno úmrtí a hladiny troponinu I a laktát dehydrogenázy se významně snížily. Dále se výrazně zlepšil stav pacientů a zařazení do kategorie dle NYHA. Orální podání Daflonu by mohlo poskytnout lepší výsledky operací pro pacienty se srdečním poškozením (217). Mikronizovaná frakce prokázala účinek i v léčbě diabetu. Daflon podávaný dvakrát denně po dobu 45 dní spolu nebo bez orálních antidiabetik snížil hladinu glukózy a kardiovaskulární riziko u pacientek trpících diabetem 2. typu. Výsledky neprokázaly žádné vedlejší účinky a testy jaterních a ledvinných funkcí byly v normálních mezích bez výrazných změn před a po léčbě (219). Oba přípravky byly také testovány na zvířecích modelech (214), (216) a (218). Detralex byl podáván potkanů s adjuvantní artritidou. Dále byl aplikován metotrexát nebo kombinace obou látek. Podávání metotrexátu v dávkách 0,6 mg/kg/týden výrazně inhibovalo
jak
zánětlivé
tak
artritické
markery.
Samostatně
podávaný
Detralex
(20 mg/kg/den) zlepšil otoky končetin a artritické skóre jen nepatrně. Detralex potencoval
- 77 -
prospěšné působení metotrexátu, což vedlo k výraznému snížení otoků zadních končetin, zlepšení artritického skóre a zlepšení koncentrace sérových dusitanů/dusičnanů (214). Na modelu křečků se zjistilo, že kombinace flavonoidů snižuje permeabilitu cév více než její jednotlivé součásti (216). Daflon je také schopen oddálit rozvoj refluxů a potlačit poškození chlopenních struktur. Potkanům byla uměle vytvořena stehenní arteriovenózní fistula a poté byly měřeny parametry jako krevní průtok, infiltrace leukocytů, gelatinázová aktivita, vzniklý otok a reflux a eventuální ztráta nepropustnosti chlopní. Daflon způsobil zmenšení otoku a refluxu a snížení hladiny granulocytů a infiltraci makrofágů v porovnání s neléčenými jedinci (218).
- 78 -
9 Závěr V diplomové práci jsou zpracovány informace o biologické aktivitě flavonoidů publikované v odborných časopisech v letech 2008-2010. Pozornost byla zaměřena na nejčastěji se vyskytující se flavonoidy: kvercetin, rutin, hesperidin a diosmin, jejich kombinace a extrakty tyto flavonoidy obsahující. Všechny látky mají prokázanou aktivitu antioxidační, která je často spojena i s dalším terapeutickým využitím, aktivitu protizánětlivou, cytoprotektivní, protinádorovou, hypoglykemickou a působí na nervový a kardiovaskulární systém. U některých bylo dále zjištěno působení na gastrointestinální trakt, působení hepatoprotektivní, hypolipidemické, venoaktivní, antivirové, antiparazitární, antibakteriální, antifungální a jiné. S rozvojem výzkumných metod byly odhaleny mechanismy působení, díky kterým se flavonoidy zařazují do klinického hodnocení a jsou testovány na zdravých i nemocných dobrovolnících. Výsledky ze studií na zvířecích modelech prokázaly možné využití kvercetinu v terapii nádorového bujení. Rutin se ukázal jako velmi silný antioxidant a zajímavé byly jeho účinky na gastrointestinální trakt a metabolická onemocnění. Hesperidin a diosmin by také mohly mít široké uplatnění, nejvíce jsou prozkoumány jejich účinky na žilní systém.
- 79 -
10 Použitá literatura 1.
MLADĚNKA, P., ZATLOUKALOVÁ, L., FILIPSKÝ, T., HRDINA, R. Cardiovascular effects of flavonoids are not caused only by direct antioxidant activity. Free Radical Biol. Med., 2010; 49, 963-975.
2.
TOMKO, J. a kol. Farmakognózia. Učebnica pre farmaceutické fakulty. Martin: Osveta, 1989; 181-184.
3.
BRUNETON, J. Pharmacognosy, Phytochemistry Medical Plants. Paris Cedex 08: Lavoisier publishing, 1999; 309-351.
4.
BOOTS, A. W., HAENEN G. R., BAST A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur. J. Pharmacol. 2008; 582, 325-337.
5.
HA, T. J., SHIMIZU, K., OGURA, T., KUBO, I. Inhibition mode of soybean lipoxygenase-1 by quercetin. Chem. Biodivers., 2010; 7, 1893-1903.
6.
HAPNER, C. D., DEUSTER, P., CHEN, Y. Inhibition of oxidative hemolysis by quercetin, but not other antioxidants. Chem.-Biol. Interact., 2010, 186, 275-279.
7.
MUKAI, R., NAKAO, R., YAMAMOTO, H., NIKAWA, T., TAKEDA, E., TERAO, J. Quercetin prevents unloading-derived difused muscle atrophy by attenuating the induction of ubiquitin ligases in tail-suspension mice. J. Nat. Prod., 2010; 73, 1708-1710.
8.
KHAKI, A., FATHIAZED, F., NOURI, M., KHAKI, A., MALEKI, N. A., KHAMNEI, H. J., AHMADI, P. Beneficial effects of quercetin on sperm parameters in streptozotocin- induced diabetic male rats. Phytotherapy Res., 2010; 24, 12851291.
9.
LI, G., MA, A., SHI, W., ZHONG, X. H. Quercetin protects hamster spermatogenic cells from oxidative damage induced by diethylstilbesterol. Andrologia, 2010; 42, 285-290.
10.
MI, Y., ZHANG, C., LI, C., TANEDA, S., WATANABE, G., SUZUKI, A. K., TAYA, K. Quercetin attenuates oxidative damage induced by treatment of embryonic chicken spermatogonial cells with 4-nitro-3-phenylphenol in diesel exhaust particles. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010; 74, 934-938.
11.
PARK, H. K., KIM, S. J., KWON, D. Y., PARK, J. H., KIM, Y. C. Protective effect of quercetin against paraquat-induced lung injury in rats. Life Sci., 2010; 87, 181186. - 80 -
12.
KASAIKINA, O. T., KARTASHEVA, Z. S., KANCHEVA, V. D., YANISHLIEVA, N. V., TOTSEVA, I. R. Consumption of quercetin and rutin in reactions with free radicals. Bulg. Chem. Commun., 2010; 42, 153-160.
13.
SÁNCHEZ-GALLEGO, J. I., LÓPEZ-REVUELTA, A., SARDINA, J. L., HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ, A., SÁNCHEZ-YAGUE, J., LLANILLO, M. Membrane-cholesterol contents modify the protective effects of quercetin and rutin on integrity and cellular viability in oxidized erythrocytes. Free Radical Biol. Med., 2010; 48, 1444-1454.
14.
KARTASASMITA, R. E., HEROWATI, R., GUSDINAR, T. Docking study of quercetin derivates on inducible Nitric Oxide Synthase and prediction of their absorption and distribution properties. J. Appl. Sci., 2010; 10, 3098-3104.
15.
CHUANG, C. -C., MARTINEZ, K., XIE, G., KENNEDY, A., BUMRUNGPERT, A., OVERMAN, A., JIA, W., MVINTOSH, M. K. Quercetin is equally or more effective than resveratrol in attenuating tumor necrosis factor-α-mediated inflammation and insulin resistence in primary human adipocytes. Am. J. Clin. Nutr., 2010; 92, 1511-1521.
16.
CHOI, Y. J., ARZUAGA, X., KLUEMPER, C. T., CARABALLO, A., TOBOREK, M., HENNIG, B. Quercetin blocks caveolae-dependent pro-inflammatory responses induced by co-planar PCBs. Environ. Int., 2010; 36, 931-934.
17.
SCHÜLTKE, E., GRIEBEl, R. W., JUURLINK, B. H. J. Quercetin attenuates inflammatory processes after spinal cord injury in an animal model. Spinal Cord, 2010; 48, 857-861.
18.
MARINA, M., NEVENA, A., ZORICA, S., BILJANA, B., DRAGANA, V., IVAN, J. Quercetin ameliorates experimental autoimmune myocarditis in rats. J Pharm. Pharm. Sci.s, 2010; 13. 311-319.
19.
CHENG, W. -C., HUANG, R. -Y., CHIANG, C. -Y., CHEN, J. -K., liu, C. -H., CHU, C. -L., FU, E. Ameliorative effect of quercetin on destruction caused by experimental periodontitis in rats. J. Periodont. Res., 2010; 45, 788-795.
20.
BAOWEN, Q., YULIN, Z., XIN, W., WENJING, X., HAO, Z., ZHIZI, C., XINGMEJ, D., LIJUAN, C. A further investigation concerning correlation between anti-fibrotic effect of liposomal quercetin and inflammatory cytokines in pulmonary fibrosis. Eur. J. Pharmacol., 2010; 642, 134-139.
- 81 -
21.
RENUGADEVI, J., MILTON PRABU, S. Quercetin protects against oxidative stress-related renal dysfunction by cadmium in rats. Exp. Toxicol. Pathol., 2010; 62, 471-481.
22.
LIU, C. -M., MA, J. -Q., SUN, Y. -Z. Quercetin protects the rat kidney against oxidative stress-mediated DNA damage and apoptosis induced by lead. Environ. Toxicol. Pharmacol., 2010; 30, 264-271.
23.
KELSEY, N. A., WILKINS, H. M., LINSEMAN, D. A. Nutraceutical antioxidants as novel neuroprotective agents. Molecules, 2010; 15, 7792-7814.
24.
ATTIA, S. M. The impact of quercetin on cisplatin-induced clastogenesis and apoptosis in murine marrow cells. Mutagenesis, 2010; 25, 281-288.
25.
JAMSHIDAZDEH, A., MEHRABADI, A. R. Protective effect of quercetin on oxidative stress in glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient erythrocytes in vitro. Iran. J. Pharm.l Res., 2010; 9, 169-175.
26.
Çelic, H., Arinç, E. Evaluation of the protective effects of quercetin, rutin, resveratrol, naringin and trolox against idarubicin-induced DNA damage. J. Pharm. Pharm. Sci., 2010; 13, 231-241.
27.
CHUENKITIYANON, S., PENGSUPARP, T., JIANMONGKOL, S. Protective effect of quercetin on hydrogen peroxide-induced tight junction disruption. Int. J. Toxicol., 2010; 29, 418-424.
28.
VICENTINI, F. T. M. C., FONSECA, Y. M., PITOL, D. L., IYOMASA, M. M., BENTLEY, M. V. L. B., FONSECA, M. J. V. Evaluation of protective effect of water-in-oil microemulsion incorporating quercetin against UVB-induced damage in hairless mice skin. J. Pharm. Pharm Sci., 2010; 13, 274-285.
29.
LINSALATA, M., ORLANDO, A., MESSA, C., REFOLA, M. G., RUSSO, F. Quercetin inhibits human DLD-1 colon cancer cell growth and polyamin biosynthesis. Anticancer Res., 2010; 30, 3501-3507.
30.
KIM, H. -J., KIM, S. -K., KIM, B. -S., LEE, S. -H., PARK, Y. -S., PARK, B. -K., et al. Apoptic effect of quercetin on HT-29 colon cancer cells via the AMPK signaling pathway. J. Agric. Food Chem., 2010; 58, 8643-8650.
31.
LEA, M. A., IBEH, C., DEUTSCH, J. K., HAMID, I., DESBORDES, C. Inhibition of growth and induction of alkaline phosphatase in colon cancer cells by flavonols and flavonol glycosides. Anticancer Res., 200; 30, 3629-3635.
- 82 -
32.
SENHILKUMAR, K., ELUMALAI, P., ARUNKUMAR, R., BANUDEVI, S., GUNADHARINI, N. D., SHARMILA, G., SELVAKUMAR, K., ARUNAKARAN, J. Quercetin regulates insulin like growth factor signaling and induces intrinsic and extrinsic pathway mediated apoptosis in androgen independent prostate cancer cells (PC-3). Mol. Cell. Biochem., 2010; 344, 173-184.
33.
TANG, S. -N., SINGH, C., NALL, D., MEEKER, D., SHANKAR, S., SRIVASTAVA, R. K. The dietary bioflavonoid quercetin synergizes with epigallocatechin gallate (EGCG) to inhibit prostate cancer stem cell characteristics, invasion, migration and epithelial-mesenchymal transition. J. Mol. Sign., 2010; 5, art. no. 14.
34.
CHOU, C. -C., YANG, J. -S., LU, H. -F., IP, S. -W., LO, C., WU, C. -C., LIN, J. P., CHEN, D. -R. Quercetin-mediated cell cycle arrest and apoptosis involving activation of caspase cascade trough the mitochondrial pathway in human breast cancer MCF-7 cells. Arch. Pharmacal Res., 2010; 33, 1181-1191.
35.
OH, S. J., KIM, O., LEE, J. S., KIM, J.-A., KIM, M. R., CHOI, H. S., SHIM, J.-H., KIM, Y. C. Inhibition of angiogenesis by quercetin in tamoxifen-resistant breast cancer cells. Food Chem. Toxicol., 2010; 48, 3227-3234.
36.
VIDYA PRIYADARSINI, R., SENTHIL MURUGAN, R., MAITREYI, S., RAMALINGAM, K., KARUNAGARAN, D., NAGINI, S. The flavonoid quercetin induces cell cycle arrest and mitochindria-mediated apoptosis in human cervical cancer (HeLa) cells thruogh p53 induction and NF-κB inhibition. Eur. J. Pharmacol., 2010; 649, 84-91.
37.
BACH, A., BENDER-SIGEl, J., SCHRENK, D., FLÜGEL, D., KIETZMANN, T. The antioxidant quercetin inhibits cellular proliferation via HIF-1-dependent induction of p21WAF. Antioxidants and Redox Signaling, 2010; 13, 437-448.
38.
WYSOCKA, T., SOPEL, M., DUMANSKA, M., ZABEL, M., DZIEGEL, P. Antiproliferative and pro-apoptic effects of quercetin on human pancreatic carcinoma cell. Folia Histochem. Cyto., 2010; 48, 222-229.
39.
ZHOU, W., KALLIFATIDIS, G., BAUMANN, B., RAUSH, V., MATTERN, J., GLADKICH, J., GIESE, N., HERR, I. Dietary polyphenols quercetin targets pancreatic stem cells. Int.J. Oncol., 2010; 37, 551-561.
- 83 -
40.
PRADHAN, S. J., MISHRA, R., SHARMA, P., KUNDU, G. C. Quercetin and sulforaphan in combination supress the progression of melanoma through the downregulation of matrix metalloproeinase-9. Exp. Therap. Med., 2010; 1, 915-920.
41.
RUSSO, M., SPAGNUOLO, C., VOLPE, S., MUPO, A., TEDESCO, I., RUSSO, G. -L. Quercetin induced apoptosis in association with death receptors and fludarabine in cell isolated from chronic lymphocytic leukaemia patients. Brit. J. Cancer, 2010; 103, 642-648.
42.
CHENG, S., GAO, N., ZHANG, Z., CHEN, G., BUDHRAJA, A., KE, Z., SON, Y.O., SHI, X. Quercetin induces tumor-selective apoptosis through downregulation of Mcl-1 and activation of Bax. Clinical Cancer Research, 2010; 16, 5679-5691.
43.
REN, S.-C., SUO, Q.-F., DU, W.-T., PAN, H., YANG, M.-M., WANG, R.-H., LIU, J. Quercetin permeability across blood-brain barrier and its effect on the viability of U251 cells. Journal of Sichuan University (Medical Science Edition), 2010; 41, 751754+759.
44.
JAKUBOWICZ-GIL, J., LANGNER, E., WERTEL, I., PIERSIAK, T., RZESKI, W. Temozolomid, quercetin and cell death in the MOGGCCM astrocytoma cell line. Chem.-Biol.l Interact., 2010; 188, 190-203.
45.
SAMUEl, T., FADLALLA, K., TURNER, T., YEHUALAESHET, T. E. The flavonoid quercetin transiently inhibits the activity of taxol and nocodazole trough interference with the cell cycle. Nutr. Cancer, 2010; 62, 1025-1035.
46.
HSIEH, C.-L., PENG, C.-C., CHENG, Y.-M., LIN, L.-Y., KER, Y.-B., CHANG, C.-H., CHEN, K.-C., PENG, R. Y. Quercetin and ferulic acid aggravate renal carcinoma in long-term diabetic victims. J. Agr. Food Chem., 2010; 58, 9273-9280.
47.
PIKHWAL, S., TIRKEY, N., KUHAD, A., CHOPRA, K. Effect of bioflavonoid Quercetin on endotoxin-induced hepatotoxicity and oxidative stress in rat liver. Pharmacol. Therapeut., 2010; 9, 47-53.
48.
KANTER, M. Protective effect of quercetin on liver damage induced by biliary obstruction in rats. J. Mol. Histol., 2010; 41, 395-402.
49.
CHOI, K.-C., CHUNG, W.-T., KWON, J.-K., YU, J.-Y., JANG, Y.-S., PARK, S.M., LEE, S.-Y., LEE, J.-C. Inhibitory effects of quercetin on aflatoxin B1-induced hepatic damage in mice. Food Chem. Toxicol., 2010; 48, 2747-2753. 49. RAMOS, A. A.,
- 84 -
50.
LIMA, C. F., PEREIRA, M. L., FERNANDES-FERREIRA, M., PEREIRAWILSON, C. Antigenotoxic effect of quercetin, rutin and ursolic acid on HepG2 cells: Evaluation by the comet assay. Toxicol. Lett., 2008; 177, 66-73.
51.
YOUSEF, M. I., OMAR, S. A. M., EL-GUENDI, M. I., ABDELMEGID, L. A. Potential protective effects of quercetin and curcumin on paracetamol-induced histological changes, oxidative stress, impaired liver and kidney functions and haematotoxicity in rat. Food Chem. Toxicol., 2010; 48, 3246-3261.
52.
KHOO, N. K. H., WHITE, C. R., POZZO-MILLER, L., ZHOU, F., CONSTANCE, C., INOUE, T., PATEL, R. P., PARKS, D. A. Dietary flavonoid quercetin stimulates vasorelaxation in aortic vessels. Free Radical Biol. Med., 2010; 49, 339-347.
53.
ATALIK, K. E., KELEŞ, B., UYAR, Y., DÜNDAR, M. A., ÖZ, M., ESEN, H. H. Vasoprotection by melatonin and quercetin in rats treated with cisplatin. Indian J. Exp. Biol., 2010; 48, 1188-1193.
54.
MONTENEGRO, M. F., NETO-NEVES, E. M., DIAS-JUNIOR, C. A., CERON, C. S., CASTRO, M. M., GOMES, V. A., KANASHIRO, A., TANUS-SANTOS, J. E. Quercetin restores plasma nitrite and nitroso species levels in renovascular hypertension. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology, 2010; 382, 293301.
55.
LARSON, A. J., SYMONS, J. D., JALILI, T. Quercetin: A treatment for hypertension? – A review of efficacy and mechanisms. Pharmaceuticals, 2010; 3, 237-250.
56.
GARIGE, M., GONG, M., VARATHARAJALU, R., LAKSHMAN, M. R. Quercetin up-regulates paraoxonase 1 gene expression via sterol regulatory element binding protein 2 that translocates from the endoplasmis reticulum to the nucleus where it specifically interacts with sterol responsive element-like sequence in paroxonase 1 promoter in HuH7 liver cells. Metabolism, 2010; 59, 1372-1378.
57.
LECKEY, L. C., GARIGE, M., VARATHARAJALU, R., GONG, M., NAGATA, T., SPURNEY, C. F., LAKSHMAN, R. M. Quercetin and ethanol attenuate the progression of atherosclerotic plaques with concomitant up regulation of paraoxonase 1 (PON1) gene expression and PON1 activity in LDLR-/- mice. Alcohol. Clin. Exp. Res., 2010; 34, 1535-1542.
58.
GHAFFARI, M. A., SHANAKI, M. Evaluation of in vitro effect of flavonoids on human low-density lipoprotein carbamylation. Iran. J. Pharm.l Res., 2010; 9, 67-74.
- 85 -
59.
KELSEY, N. A., WILKINS, H. M., LINSEMAN, D. A. Nutraceutical antioxidants as novel neuroprotective agents. Molecules, 2010; 15, 7792-7814.
60.
ARREDONDO, F., ECHEVERRY, C., ABIN-CARRIQUIRY, J. A., BLASINA, F., ANTÚNEZ, K., JONES, D. P., GO, Y. -M., DAJAS, F. After cellular internalization, quercetin causes Nrf2 nuclear translocation, increases glutathione levels, and prevents neuronal death against an oxidative insult. Free Radical Biol. Med., 2010; 49, 738-747.
61.
TOTA, S., AWASTHI, H., KAMAT, P. K., NATH, C., HANIF, K. Protective effect of quercetin against intracerebral streptozotocin induced reduction in cerebral blood flow and impairment of memory in mice. Behav. Brain Res., 2010; 209, 7379.
62.
BHUTADA, P., MUNDHADA, Y., BANSOD, K., UBGADE, A., QUAZI, M., UMATHE, S., MUNDHADAm D. Reversal by quercetin of corticotrophin releasing factor induced anxiety- and depression-like effect in mice. Progr. Neuro-Psychoph., 2010; 34, 955-960.
63.
KAMBE, D., KOTANI, M., YOSHIMOTO, M., KAKU, S., CHAKI, S., HONDA, K. Effects of quercetin on the sleep-wake cycle in rats: Involvement of gammaaminobutyric acid receptor type A in regulation of rapid eye movement sleep. Brain Res., 2010; 1330, 83-88.
64.
TING-UN, T., MUCHIMAPURA, S., PHACHONPAI, W., WATTANATHORN, J. Effects of quercetin encapsulated liposomes via nasal administration: A novel cognitive enhancer. Am. J. Appl. Sci., 2010; 7, 893-900.
65.
SHIN, T. -J., CHOI, S. -H., LEE, B. -H., PYO, M. K., HWANG, S. -H., KIM, B. R., LEE, S. -M., NAH, S. -Y. Effects of quercetin on human α-Amino-3-Hydroxy-5methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor-mediated ion currents. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2010; 33, 1615-1619.
66.
YOUL, E., BARDY, G., MAGOUS, R., CROS, G., SEJALON, F., VIRSOLVY, A., RICHARD, S., OIRY, C. Quercetin potentiates insulin secretion and protects INS-1 pancreatic-cells against oxidative damage via the ERK1/2 pathway. Brit. J. Pharmacol.2010; 161, 799-814.
67.
WEIN, S., BEHM, N., PETERSEN, R. K., KRISTIANSEN, K., WOLFFRAM, S. Quercetin enhances adiponectin secretion by a PPAR-γ independent mechanism. Pharm. Sc.ences, 2010; 41, 16-22.
- 86 -
68.
EBRAHIMZADEH, M. A., ESLAMI, S., NABAVI, S. M., NABAVI, S. F., ESLAMI, B. Antioxidant and antihemolytic activities of Leontodon hispidus. Biotechnol. Biotec. Eq.t, 2010; 24, 2127-2131.
69.
NABAVI, S. F., NABAVI, S. M., EBRAHIMZADEH, M. A. In vitro antioxidant and antihemolytic activities of Grain Bran. Pharmacologyonline, 2010; 3, 52-59.
70.
LOIZZO, M. R., TUNDIS, R., MENICHINI, F., PUGLIESE, A., BONESI, M., SOLIMENE, U., MENICHINI, F. Chelating, antioxidant and hypoglycaemic potential of Muscari comosum (L.) Mill. Bulb extracts. Int. J. Food Sci. Nutr., 2010; 61, 780-791.
71.
IACOPINI, P., BALDI, P., STORCHI, L., SEBASTIANI, L.Catechin, epicatechin, quercetin, rutin and resveratrol in red grape: Content, in vitro antioxidant activity and interactions. J. Food Comp. Anal., 2008; 21, 589-598.
72.
KANEKO, M., KANESAKA, M., YONEYAMA, M., TOMINAGA, T., JIRILLO, E., KUMAZAWA, Y. Inhibitory effects of fermented grape marc from Vitis vinifera Negroamaro on antigen-induced degranulation. Immunopharm. Immunot., 2010; 32, 454-461.
73.
TSAI, Y. C., LIN, C. L., CHEN, B. H. Preparative chromatography of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum and their antiproliferation effect on hepatoma cell. Phytomedicine, 2010; 18, 2-10.
74.
HADI, S. M., ULLAH, M. F., SHAMIN, U., HANIF, S., AZMI, A. S., BHAT, S. H. A prooxidant mechanism of red wine polyphenols in chemoprevention of cancer. Int. J. Cancer Prevent., 2010; 3, 175-186.
75.
MARTÍNEZ DE MORENTIN, P. B., GONZÁLES, C. R., LÓPEZ, M. AMPactivated protein kinase: A cup of tea against cholesterol-induced neurotoxicity. J. Pathol., 2010; 222, 329-334.
76.
KATSUBE, T., YAMASAKI, M., SHIWAKU, K., ISHIJIMA, T., MATSUMOTO, I., ABE, K., YAMASAKI, Y. Effect of flavonol glycoside in mulberry (Morus alba L.) leaf on glucose metabolism and oxidative stress in liver in diet-induced obese mice. J. Sci. Food Agr., 2010; 90, 2386-2392.
77.
LOIZZO, M. R., TUNDIS, R., MENICHINI, F., PUGLIESE, A., BONESI, M., SOLIMENE, U., MENICHINI, F. Chelating, antioxidant and hypoglycaemic potential of Muscari comosum (L.) Mill. Bulb extracts. Int. J. Food Sci. Nutr., 2010; 61, 780-791.
- 87 -
78.
KANWAL, Q., HUSSAIN, I., LATIF SIDDIQUI, H., JAVAID, A. Antifungal activity of flavonoids isolated from mango (Mangifera indica L.) leaves. Nat. Prod. Res.h, 2010; 24, 1907-1914.
79.
LIU, H., MOU, Y., ZHAO, J., WANG, J., ZHOU, L., WANG, M., WANG, D., YANG, F. Flavonoids from Halostachys caspica and their antimicrobial and antioxidant activities. Molecules, 2010; 15, 7933-7945.
80.
81.
PASHIKANTI, S., DE ALBA, D. R., BOISSONNEAULT, G. A., CERVANTESLAUREN, D. Rutin metabolites: Novel inhibitors of nonoxidative advanced glycation and products. Free Radical Biol. Med., 2010; 48, 656-663. KORKMAZ, A., KOLANKAYA, D. Protective effect of rutin on the ischemia/reperfusion induced damage in rat kidney. J. Surg.Res., 2010; 164, 309315.
82.
ALMEIDA, J. S., LIMA, F., ROS, S. D., BULHOES, L. O. S., DE CARVALHO, L. M., BECK, R. C. R. Nanostructured System Containing Rutin: In Vitro Antioxidant Activity and Photostability Studies. Nanoscale Res. Lett., 2010; 5, 1603-1610.
83.
HAN, Y.: Rutin has therapeutic effect on septic arthritis caused by Candida albicans, Int. Immunopharmacol., 2009; 9, 207-211.
84.
MOSONI, L., BALAGE, M., VAZEILLE, E., COMBARET, L., MORAND, CH., ZAGOL-IKAPITTE, I., BOUTAUD, O., MARZANI, B., PAPET, I., DARDEVET, D. Antioxidant supplementation had positive effects in old rat muscle, but through better oxidative status in other organs. Nutrition, 2010; 26, 1157-1162.
85.
SADOWSKA-WODA, I., POPOWICZ, D., KAROWIVZ-BILIŃSKA, A. Bifentrininduced oxidative stress in human erythrocytes in vitro and protective effect of selected flavonols. Toxicology, 2010; 24, 460-464.
86.
SADOWSKA-WODA, I., WÓJCIK, N., KAROWICZ-BILIŃSKA, A., BIESZCZAD-BEDREJCZUK, E. Effect of selected antioxidants in β-cyfluthrininduced oxidative stress in human erythrocytes in vitro. Toxicology, 2010; 24, 879884.
87.
Cytoprot rutin GONG, G., QIN, Y., HUANG, W., ZHOU, S., YANG, X., LI, D. Rutin inhibits hydrogen peroxide-induced apoptosis through regulating reactive oxygen species mediated mitochondrial dysfunction pathway in human umbilical vein endothelial cells. Eur. J. Pharmacol., 2010; 628, 27-35.
88.
KHAN, R. A., KHAN, M. R., SAHREEN, S. Evaluation of Launea procumbens use in renal disorders: A rat model. J. Ethnopharmacol, 2010; 128, 452-461. - 88 -
89.
CHUANG, Ch., HUANG, CH. S., HU, M. -L: Vitamin E and rutin synergistically inhibit expression of vascular endothelial growth factor through down-regulation of binding activity of activator protein-1 in human promyelocytic leukemia (HL-60) cells, Chem.-Biol. Interact., 2010; 183, 434-441.
90.
LIN, J. P., YANG, J. S., LU, CH. CH., CHIANG, J. H., WU, CH. L., LIN, J. J., LIN, H. L., YANG, M. D., LIU, K., CH., CHIU, T., H., CHUNG, J. G. Rutin inhibits the proliferation of murine leukemia WEHI-3 cells in vivo and promotes immune response in vivo. Leukemia Res., 2009; 33, 823-828.
91.
Srdce rutin PRINCE, P. S. M., PRIYA, S. Preventive effects of rutin on lysosomal enzymes in isoproterenol induced cardio toxic rats: Biochemical, histological and in vitro evidences. Eur. J. Pharmacol., 2010; 649, 229-235.
92.
KODA, T., KURIDA, Y., IMAI, H. Protective effect of rutin against spatial memory impairment induced by trimethyltin in rats. Nutr. Res., 2008; 28, 629-634.
93.
KHAN, M. M., AHMAD, A., ISHRAT, T., KHUWAJA, G., SRIVASTAWA, P., KHAN, M. B., RAZA, S. S., JAVED, H., VAIBHAV, K., KHAN, A., ISLAM, F. Rutin protects the neural damage induced by transient focal ischemia in rats. Brain Res., 2009; 1292, 123-135.
94.
ASL, M. N., SHARIATI-RAD, S., ZAMANSOLTANI, F. Anticonvulsive effects of intracerebroventricular administration of rutin on rats. Prog Neuro-Psychoph., 2008; 32, 989-993.
95.
RICHETTI, S. K., BLANK, M., CAPIOTTI, K. M., PIATO, A. L., BOGO, M. R., VIANNA, M. R., BONAN, C. D. Quercetin and rutin prevent scopolamin-induced memory impairment in zebrafish. Behav. Brain Res., 2011;217, 10-5.
96.
FERNANDES, A. A. H., NOVELLI, E. L. B., OKOSHI, K., OKOSHI, M. P., DI MUZIO, B. P., GUIMARAES, J. F. C., FERNANDES, A. Influence of rutin treatment on biochemical alterations in experimental diabetes. Biomed. Pharmacother., 2010; 64, 214-219.
97.
KAMALAKKANNAN, N., PRINCE, P. S. M. Antihyperglycaemic and antioxidant effect of rutin, a polyphenolic flavonoid, in streptozocin-induced diabetic Wistar rats, Basic Clin. Parmacol. Toxicol.,2006;98, 97-103.
98.
CÉSPEDES, C. L., VALDEZ-MORALES, M., AVILA, J. G., EL-HAFIDI, M., ALARCÓN, J., PAREDES-LÓPEZ, O. Phytochemical profile and the antioxidant activity of Chilean wild black-berry fruits, Aristotelia chilensis (Mol) Stuntz (Elaeocarpaceae). Food Chem., 2010; 119, 886-895. - 89 -
99.
TULSAWANI, R., SHARMA, P., DIVEKAR, H. M., MEENA, R. N., SINGH, M., KUMAR, R. Supplementation of fruit extract of Hippophae rhamnoides speeds adaptation to simulated high altitude stressors in rats. Journal of Complementary and Integrative medicine, 2010; 7, art. No. 30.
100. LESJAK, M. M., BEARA, I. N., ORCIC, D. Z., et al. Juniperus sibirica Burgsdorf. as a novel source of antioxidant and anti-inflammatory agents. Food Chem., 2011; 124, 850-856. 101. KARIMI, E., OSKUEIAN, E., HENDRA, R., JAAFAR, H. Z. E. Evaluation of Crocus sativus L. stigma phenolic and flavonoid compounds and its antioxidant activity. Molecules, 2010; 15, 6244-6256. 102. KIRITSAKIS, K., KONTOMINAS, M. G., KONTOGIORGIS, C., HADIIPAVLOU-LITINA, D., MOUSTAKAS, A., KIRITSAKIS, A. Composition and antioxidant activity of olive leaf extracts from Greek olive cultivars. JAOCS., 2010; 87, 369-376. 103. SHARIFIFAR, F., DEHGHN-NUDEH, G., MIRTAJALDINI, M. Major flavonoids with antioxidant activity from Teucrium polium L. Food Chem., 2009; 112, 885-888. 104. SEDEJ, I., MANDIĆ, A., SAKAČ, M., MIŠAN, A., TUMBA, V. Comparison of antioxidant components and activity of buckwheat and wheat flours. Cereal Chem., 2010; 87, 387-392. 105. SATHEES KUMAR, D., KOTTAI MUTHU, A., ANTON SMITH, A., MANAVALAN, R. In vitro antioxidant activity of various extracts of whole plant Mucuna pruriens (Linn). International Journal of PharmTech Research, 2010; 2, 2063-2070. 106. OWOLAI, M. A., COKER, H. A. B., JAJA, S. I. Bioactivity of the phytoconstituents of the leaves of Persea americana. J. Med. Plant Res., 2010;4, 1130-1135. 107. Extrakt MALVIYA, N., JAIN, S., JAIN, A., JAIN, S., GURJAR, R. Evaluation of in vitro antioxidant potential of aqueous extract of Trapa natans L. fruits. Acta Pol. Pharm.-Drug Res., 2010; 67, 391-396. 108. XIE, Z., HUANG, H., SLAVIN, M., ZHAO, Y., WHENT, M., BLACKFORD, J., JU, L. Chemical composition of five commercial Gynostemma pentaphyllum samples and their radical scavenging antiproliferative, and antiinflammatory properties. J. Agr. Food Chem., 2010; 58, 11243-11249.
- 90 -
109. Extrakt OZAHIN, A. D., YILMAZ, O. Prunus armeniaca L. cv. hacihaliliglu fruits extracts prevent lipid peroxidation and protect the unsaturated fatty acids in the fenton reagent environment. Asian J. Chem., 2010; 22, 8022-8032. 110. DOS-SANTOS, P. M. L., JAPP, A. S., LIMA, L. G., SCHRIPSEMA, J., MENEZES, F. S., KUSTER, R. M. Antioxidant activity from the leaf extracts of Jacaranda puberula CHam., Bignoniaceae, a brazilian medicinal plant used for blood depuration.Rev. Bras. Farmacogn., 2010; 20, 147-153. 111. CHEN, X., YAUN, K., LIU, H. Phenolic contents and antioxidant activities in ethanol extracts of Citrus reticulata Blanco cv. Ougan fruit. J. Food Agr. Environ., 2010; 8, 150-155. 112. OZKAN, G., SAGDIC, O., GOKTURK, R. S., UNAL, O., ALBAYRAK, S. Study on chemical composition and biological activities of essential oil and extract from Salvia pisidica. LWT – Food Sci. Technol., 2010; 43, 186-190. 113. TAI, Z. –G., CAI, L., DAI, L., SUN, W. –J., ZHE, W., YANG, Y. –B., CAO, Q. – E., DING, Z. –T. Antioxidant activities of Caragana sinica flower extracts and their main chemical constituents. Molecules, 2010; 15, 6722-6732. 114. Extrakt SOBERÓN, J. R., SQARIQLIA, M. A., SAMPIETRO, D. A., QUIROQA, E. N., VATTUONE, M. A. Free radical scavenging activities and inhibition of inflammatory enzymes of phenolics isolated from Tripondanthus acutifolius. J. Ethnopharmacol, 2010, 130, 329-333. 115. FERES, C. A. O., TOLEDO, V. P. C. P. TAGLIATI, C. A., PIEDADE, J. B., HERMONT, F., ROCHA, O. A. A. Evaluation of the immunotoxicological effects of Dimorphandra mollis Benth., Fabaceae, in rats, Rev. Bras. Farmacogn., 2010; 20, 607-614. 116. SUNTAR, I. P., AKKOL, E. K., YILMAZER, D., BAYKAL, T., KIRMIZIBEKMEZ, H., ALPER, M., YESILADA, E. Investigation on the in vivo wound healing potential of Hypericum perforatum L. J. Ethnopharmacol, 2010, 127, 468-477. 117. OKAZAKI, Y., HAN, Y., KAYAHARA, M., WATANABE, T., ARISHIGE, H., KATO, N. Consumption of curcumin elevates fecal immunoglobulin A, an index of intestinal immune function, in rats fed a high-fat diet. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 2010, 56, 68-71.
- 91 -
118. FONSECA, Y. M., CATINI, C. D., VICENTINI, F. T. M. C., NOMIZO, A., GERLACH, R. F., FONSECA, M. J. V. Protective effect of Calendula oficinalis extract against UVB-induced oxidative stress in skin: Evaluation of reduced glutathione levels and matrix metalloproteinase secretion. J. Ethnopharmacol, 2010; 127, 596-601. 119. FRANCO, J. L., POSSER, T., MISSAU, F., PIZZOLATTI, G., SANTOS, A. R. S., SOUZA, D. O., ASCHNER, M., ROCHA, J. B. T., DAFRE, A. L., FARINA, M. Structure-activity relationship of flavonoids derived from medicinal plants in preventing methylmercury-induced mitochondrial dysfunction. Environ. Toxicol.y Phar., 2010; 30, 272-278. 120. ESMAEILI, M. A., SONBOLI, A., AYYARI NOUSHABADI, M. Antioxidant and protective properties of six Tanacetum species against hydrogen peroxide-induced oxidative sterss in K562 cell line: A comparative study. Food Chem., 2010; 121, 148-155. 121. TANG, J., LI, N., DAI, H., WANG, K. Chemical constituents from seeds of Alpinia katsumadai, inhibition on NF- κB activation and anti-tumor effect. Zhongguo Zhongyao Zazhi, 2010; 35, 1710-1714. 122. NAOWARATWATTANA, W., DE-EKNAMKUL, W., DE MEJIA, E. G. Phenolic containing organic extracts of mulberry (Morus alba L.) leaves inhibit HepG2 hepatoma cells trough G2/M phase arrest and inhibition of topoisomerase IIα activity. J. Med. Food, 2010; 13, 1045-1056. 123. HAN, S. Y., CHU, J. X., LI, G, ZHU, L, SHI, R: Effect of rutin from leaves and flowers of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) on angiotensin II-induced hypertrophy of cardiac myocytes and proliferation of fibroblasts, Lat. Am. J. Pharm., 2010; 29, 137-140. 124. KIM, KH., LEE, HJ., LEE, JH., JANG, YS., KIM, DK:, SHIM BS., CHO, KH:, KO, SG., AHN, KS., KIM, SH.: Blockade of glycoprotein IIb/IIIa mediates the antithrombotic activity of butanol fraction of Actinostemma lobatum Maxim, J. Etnopharmacol., 2008; 116, 431-438. 125. MACHADO, D. G., BETTIO, L. E. B., CUNHA, M. P., SANTOS, A. R. S., PIZZOLATTI, M. G., BRIGHENTE, M. C., RODRIGUES, A. L. S. Antidepressantlike effect of rutin isolated from the ethanolic extract from Schinus molle L. in mice: Evidence for the involvement of the serotonergic and noradrenergic system. Eur. J. Pharmacol., 2008; 587, 163-168. - 92 -
126. MICHEL, C. G., NESSEEM, D. I., ISMAIL, M. F. Anti-diabetic activity and stability study of the formulated leaf extract of Zizyphus spina-christi (L.) Wild with the influence of seasonal variation. J. Ethnopharmacol, 2010; 127, 596-601. 127. KANG, W., WANG, J. In vitro antioxidant properties and in vivo lowering blood lipid of Forsythia suspense leaves. Med. Chem. Res., 2010; 19, 617-628. 128. KANASHIRO, A., ANDRADE, D.C.O., KABEYA, L. M., TURATO, W.M., FACCIOLI, L.H., UYEMURA, S.A., LUCISANO-VALIM, Y.M. : Modulatory effects of rutin on biochemical and hematological parameters in hypercholesterolemic Golden Syrian hamsters. Anais da Academia Brasileira de Ciencias, 2009; 81, 67-72. 129. LI, J. M., WANG, CH., HU, Q., H., KONG, L. D. Fructose-induced leptin dysfunction and improvement by quercetin and rutin in rats. Chin. J. Nat. Med., 2008; 6, 466-473. 130. ABDEL-RAHEEM, I. T. Gastroprotective effect of rutin against indomethacininduced ulcers in rats. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2010; 107, 742-750. 131. MEGALA, J., GEETHA, A. Free radical-scavenging and H+, K+-ATPase inhibition activities of Pithecellobium dulce, Food Chem., 2010; 121, 1120-1128. 132. CARRASCO-POZO, C., GOTTELAND, M., SPEISKY, H. Protection by apple peel polyphenols against indometacin-induced oxidative stress, mitochondrial damage and cytotoxicity in Caco-2 cells. J. Pharm. Pharmacol., 2010; 62, 943-950. 133. HORIUCHI, M., WACHI, H., SEVAMA, Y. Effects of Biden pilosa L. var. radiata Scherff on experimental gastric lesion. J. Nat. Med., 2010; 64, 430-435. 134. LAKSHMI, V., JOSEPH, S. K., SRIVASTAVA, S., VERMA, S. K., SAHOO, M. K., DUBE, V., MISHRA, S. K. MURTHY, P. K. Antifiliar activity in vitro and in vivo of some flavonoids tested against Brugia Malayi. Acta Trop., 2010; 116, 127133. 135. ABDELWAHAB, S. I., ZAMAN, F. Q., MARIOD, A. A., YAACOB, M., AHMED-ABDELMAGEED, A. H., KHAMIS, S. Chemical composition, antioxidant and antibacterial properties of the essential oils of Etlingera elatior and Cinnamomum pubescens Kochummen. J. Sci. Food Agr., 2010; 90, 2682-2688. 136. BOOTH, A. N. JONES, F. T. DE EDS, F. Metabolic and glucosuria studies on naringin and phloridzin. J. Biol. Chem., 1958; 233, 280-282. 137. BOOTH, A. N. JONES, F. T. DE EDS, F. Metabolic fate of hesperidin, eriodictyol, homoeriodictyol and diosmin. J. Biol. Chem.,1958; 230, 661-668. - 93 -
138. KALPANA, K. B., SRINIVASAN, M., MENON, V. P. Evaluation of antioxidant activity of hesperidin and its protective effect on H2O2 induced oxidative damage on pBR322 DNA a RBC cellular membrane. Mol. Cell. Biochem., 2009; 323, 21-29. 139. LI, M., ZHU, W.-Y., LUO, D. Hesperidin inhibiting UVA-induced oxidative damage and apoptosis of cultured human keratinocytes. J. Clin. Derm., 2009; 38,. 571-574. 140. LI, R., CAI, L., XIE, X. -F., YANG, F., LI, J. Hesperidin supresses adjuvant arthritis in rats by inhibiting synoviocyte activity. Phytotherapy Res., 2010; 24, 71-76. 141. SHAPIRO, H., LEV, S., COHEN, J., SINGER, P. Polyphenols in the prevention and treatment of sepsis syndromes: Rationale and preclinical evidence. Nutrition, 2009; 25, 981-997. 142. ARAFA, H. M. M., ALY, H. A. A., ABD-ELLAH, M. F., AL-REFAEY, H. M. Hesperidin attenuates benzo(a)pyrene-induced testicular toxicity in rats via regulation of oxidant/antioxidant balance. Toxicol. Ind. Health, 2009; 25, 417-427. 143. HOSSEINIMEHR, S. J., AHMADI, A., BEIKI, D., HABIBI, E., MAHMOUDZADEH, A. Protective effects of hesperidin against genotoxicity induced by 99mTc-MIBI in human cultured lymphocyte cells. Nucl. Med. Biol., 2009; 36, 863-867. 144. KALPANA, K. B., DEVIPRIYA, N., SRINIVASAN, M., MENON, V. P. Invetigation of the radioprotective efficacy of hesperidin against gamma-radiation induced cellular damage in cultured human peripheral blood lymphocytes. Mutat. Res. - Gen. Tox. En., 2009; 676, 54-61. 145. HOSSEINNIMEHR, S. J., MAHMOUDZADEH, A., AHMADI, A., MOHAMADIFAR, S., AKHLAGHPOOR, S. Radioprotective effects of hesperidin against genotoxicity induced by γ-irradiation in human lymphocytes. Mutagennesis, 2009; 24, 223-235. 146. PRADEEP, K., PARK, S. H., KO, K. C. Hesperidin a flavanoglycone protects against γ-irradiation induced hepatocellular damage and oxidative stress in SpragueDawley rats. Eur. J. Pharmacol., 2008; 587, 273-280. 147. PARK, S. H., PRADEEP, K., KO, K. C. Protective effect of hesperidin against γradiation induced oxidative stress in Sprague-Dawley rats. Pharm. Biol., 2009; 47, 940-947.
- 94 -
148. YOSHIKAWA, Y., MORI, T., SUZUKI, M., IMANAKA, T., YOSHIKAWA, K. Comparative study of kinetics on DNA double-strand break induced by photo- and gamma-irradiation: Protective effect of water soluble flavonoids. Chem. Phys. Lett., 2010; 501, 146-151. 149. LI, R., CAI, L., XIE, X.-F., PENG, L., LI, J. 7,3'-dimethoxy hesperetin induces apoptosis of fibroblast-like synoviocytes in rats with adjuvant arthritis through caspase 3. Phytotherapy Res., 2010; 24, 1850-1856. 150. KAMARAJ, S., ANANDAKUMAR, P., JAGAN, S., RAMAKRISHNAN, G., DEVAKI, T. Modulatory effect of hesperidin on benzo(a)pyrene induced experimental lung carcinogenesis with reference to COX-2, MMP-2 and MMP-9. Eur. J. Pharmacol., 2010; 649, 320-327. 151. KAMARAJ, S., RAMAKRISHNAN, G., ANANDAKUMAR, P., JAGAN, S., DEVAKI, T. Antioxidant and anticancer efficacy of hesperidin in benzo(a)pyrene induced lung carcinogenesis in mice. Invest. New Drug., 2009; 27, 214-222. 152. YEH, M.-H., KAO, S.-T., HUNG, C.-M., LIU, C.-J., LEE, K.-H., YEH, C.-C. Hesperidin inhibited acetaldehyde-induced matrix metalloproteinase-9 gene expression in human hepatocellular carcinoma cells. Toxicol. Lett., 2009; 184, 204210. 153. LEE, K. -H., YEH, M. -H., KAO, S. -T., HUNG, C. -M., LIU, C. -J., HUANG, Y. Y., YEH, C. -C. The inhibitory effect of hesperidin on tumour cell invasiveness occurs via suppression of activator protein 1 and nuclear factor-kappaB in human hepatocellular carcinoma cells. Toxicol. Lett., 2010; 194, 42-49. 154. LEE, C. J., WILSON, L., JORDAN, M. A., NGUYEN, V., TANG, J., SMIYUN, G. Hesperidin supressed proliferation of both breast cancer and androgen-dependent prostate cancer cells. Phytotherapy Res., 2010; 24, 15-19. 155. ARANGANATHAN, S., PANNEER SELVAM, J., NALINI, N. Hesperetin exerts dose dependent chemopreventive effect against 1,2-dimethylhydrazine induced rat colon carcinogenesis. Invest. New Drug., 2009; 27, 203-213. 156. CHEN, M.-C., YE, Y. I.-Y. I., GUANG, J. I., JIAN-WEN, L. I. U. Hesperidin upregulates heme oxygenase-1 to attenuate hydrogen peroxide-induced cell damage in hepatic L02 cells. J. Agr. Food Chem., 2010; 58, 3330-3335. 157. CHEN, M., GU, H., YE, Y., LIN, B., SUN, L., DENG, W., ZHANG, J., LIU, J. Protective effect of hesperidin against oxidative stress of terc-butyl hydroperoxide in human hepatocytes. Food Chem. Toxicol., 2010; 48, 2980-2987. - 95 -
158. MING-HSIEn, Y., SHUNG-TE, K., CHE-MING, H., CHING-JU, L., KUO-HUA, L., CHIA-CHOU, Y. Hesperidin inhibited acetaldehyd-induced matrix metalloproteinase-9 gene expression in human hepatocellular carcinoma cells. Toxicol. Lett., 2009; 184, 204-210. 159. GANDHI, C., UPAGANALAWAR, A., BALARAMAN, R. Protection against in vivo focal myocardial ischemia/reperfusion injury-induced arrythmias and apoptosis by hesperidin. Free Radical Res., 2009; 43, 817-827. 160. SELVARAJ, P., PUGALENDI, K. V. Hesperidin, a flavanone glycoside, on lipid and antioxidant status in experimental myocardial ischemic rats. Redox Rep., 2010; 15, 217-223. 161. KAKADIYA, J., SHAH, N. Effect of hesperidin on cardiovascular complication in streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetic rats. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2010; 2, 165-169. 162. WANG, W., CAO, J. M., YANG, Z. F., WANG, H. W., ZHANG, Y., ZHAO, Y. J., LI, C. Z. Effects of hesperidin on cardiac electrophysiology of diabetic rats. Journal of Shanghai Jiaotong University (Med. Sci.), 2010; 30, 310-313. 163. GAUR, V., KUMAR, A. Hesperidin pre-teratment attenuates NO-mediated cerebral ischemic reperfusion injury and memory dysfunction. Pharmacol.l Rep., 2010; 62, 635-648. 164. KUMAR, P., KUMAR, A. Protective effect of hesperidin and naringin against 3nitropropionic acid induced Huntington's like symptoms in rats: Possible role of nitric oxide. Behav. Brain Res., 2010; 206, 38-46. 165. SHEN, J., NAKAMURA, H., FUJISAKI, Y., TANIDA, M., HORII, Y., FUYUKI, R., TAKUMI, H., NAGAI, K. Effect of 4G-α-glucopyranosyl hesperidin on brown fat adipose tissue- and cutaneous-sympathetic nerve activity and peripherial body temperature. Neurosci. Lett., 2009; 461, 30-35. 166. CAZAROLLI, L. H., ZANATTA, L., ALBERTON, E. H., FIGUEIREDO, M. S. R. B., FOLADOR, P., DAMAZIO, R. G., PIZZOLATTI, M. G., SILVA, F. R. M. B. Flavonoids: Cellular and molecular mechanism of action in glucose homeostasis. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2008; 8, 1032-1038. 167. AKIYAMA, S., KATSUMATA, S.-I., SUZUKI, K., NAKAYA, Y., ISHIMI, Y., UEHARA, M. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of hesperidin and cyclodextrin-clathrated hesperetin in Goto-Kakizaki rats with type 2 diabetes. Biosci.Biotechnol. Biochem., 2009; 73, 2779-2782. - 96 -
168. AKIYAMA, S., KATSUMATA, S.-J., SUZUKI, K., ISHIMI, Y:, WU, J., UEHARA, M. Dietary hesperidin exerts hypoglycemic and hypolipidemic effects in streptozotocin-induced marginal type 1 diabetic rats. J. Clin. Biochem. Nutr., 2010; 46, 87-92. 169. TOUMI, M. L., MERZOUG, S., BOUTEFNOUCHET, A., TAHRAOUI, A., OUALI, K., GUELLATI, M. A. Hesperidin, a natural citrus flavanone, alleviates hyperglycaemic state and attenuates embryopathies in pregnant diabetic mice. J. Med. Plant Res., 2009; 3, 862-869. 170. KAKADIYA, J., SHAH, N. Effects of Pioglitazone, Glimepiride, Nobivolol, Valsartan and hesperidine on serum diabetic marker and lipid metabolizing enzymes in isoproterenol induced myocardial infarction in normal and diabetic rats. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 2010; 1, 158-162. 171. KAKADIYA, J., BRAHMBHATT, J., SHAH, N. Investigation effect of pioglitazone, glimepiride, nobivolol, valsartan and hesperidine on glucose, HbA1c and blood pressure in experimentally induced myocardial infarction in type 2 diabetic rats. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 2010; 1, 232-238. 172. JAGDISH, K., MEHUL, S., NEHAL, S. Effect of hesperidin on serum glucose, HbA1c and oxidative stress in myocardial tissue in experimentally induced infarction in diabetic rats. Pharmacognosy Journal, 2010; 185-189. 173. YUCE, B., DANIS, O., OGAN, A., SENER, G., BULUT, M., YARAT, A. Antioxidative and lipid lowering effects of 7,8-dihydroxy-3-(4-methylphenyl) kumarin in hyperlipidemic rats. Arzneimittel-Forschung/Drug Res., 2009; 59, 129134. 174. TANAKA, Y., IMATOMI, H., TAKAHIRA, T., ABE, Y., TAKANO, K., USUDA, S., NOGUCHI, K. Effects of glucosyl hesperidin on serum triglyceride and its safety in beverage. Japanese Pharmacology and Therapeutics, 2010; 38, 553-568. 175. HANAWA, M., MOROMOTO, Y., YOKOMIZO, A., AKAOGI, I., MAFUNE, E., TSUNODA, K., AZUMA, M., KAJIMOTO, Y. Effect of intake of the tablet containing glucosyl hesperidin on body weight and serum triglyceride levels in humans – A dose-finding study. Japanese Pharmacology and Therapeutics, 2008; 36, 1141-1158.
- 97 -
176. XU, L., YANG, Z. -J., LI, P., ZHOU, Y. -Q. Modulating effect of hesperidin on experimental murine colitis induced by dextran sulfate sodium. Phytomedicine, 2009; 16, 989-995. 177. GUEX, J. J., ENRIQUEZ VEGA, D. M. E., AVRIL, L., BOUSSETTA, S., TAIEB, C. Assessment of quality of live in Mexican patients suffering from chronic venous disorder – Impact of oral Ruscus aculeatus-hesperidin-methylchalcon-ascosrbic acid treatment - 'Quality study'. Phlebology, 2009; 24, 157-165. 178. SAHA, R. K., TAKAHASHI, T., SUZUKI, T. Glucosyl hespridin prevents influenza replication in vitro by inhibition of viral sialidase. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2009; 32, 1188-1192. 179. CHO, Y. -A., CHOI, D. -H., CHOI, J. -S. Effect of hesperidin on the oral phamacokinetics of diltiazem and its main metabolite, desacetyldiltiazem, in rats. J. Pharm. Pharmacol., 2009; 61, 825-829. 180. ABD GHAFAR, M. F., PRASAD, K. N., WENG, K. K., ISMAIL, A. Flavonoid, hesperidine, total phenolic contents and antioxidant activities from Citrus species. Afr. J. Biotechnol., 2010; 9, 326-330. 181. TUMBAS, V. T., ĆETKOVIĆ, G. S., DJILAS, S. M., ČANADANOVIĆ-BRUNET, J. M., VULIĆ, J. J., KNÉZ, Ž., ŠKERGET, M. Antioxidant activity of mandarin (Citrus reticulata) peel. Acta Periodica Technologica, 2010; 41, 195-203. 182. KANAZE, F. I., TERMENTZI, A., GABRIELI, C., NIOPAS, I., GEORGARAKIS, M., KOKKALOU, E. The phytochemical analysis and antioxidant activity assesment of orange peel (Citrus sinensis) cultivated in Greece-Crete indicates a new commercial source of hesperidin. Biomed. Chromatogr., 2009; 23, 239-249. 183. XU, G., LIU, D., CHEN, J., YE, X., SHI, J. Composition of major flavanone glycosides and antioxidant capacity of three citrus varieties. J. Food Biochem., 2009; 33, 453-469. 184. PATIL, J. R., CHIDAMBARA MURTHY, K. N., JAYAPRAKASHA, G. K., CHETTI, M. B., PATIL, B. S. Bioactive compounds from mexican lime (Citrus aurantifolia juice induce apoptosis in human pancreatic cells. J. Agr. Food Chem., 2009; 57, 10933-10942. 185. HUANG, Y. -S., HO, S. -C. Polymethoxy flavones are responsible for the antiinflammatory activity of citrus fruit peel. Food Chem., 2010; 119, 868-873.
- 98 -
186. GUZMÁN-GUTIERREZ, S. L., NAVARRETE, A. Pharmacological exploration of the sedative mechanism of hesperidin identified as the active principle of Citrus sinensis flowers. Planta Med., 2009; 295-301. 187. MARTÍNEZ, M. C., FERNANDEZ, S. P., LOSCALZO, L. M., WASOWSKI, C., PALADINI, A. C., MARDER, M., MEDINA, J. H., VIOLA, H. Hepseridin, a flavonoid glycoside with sedative effect, decrease brain pERK1/2 levels in mice. Pharmacol. Biochem. Be., 2009; 92, 291-296. 188. WANG, H., FENG, F., ZHUANG, B. Y., SUN, Y. Evaluation of hepatoprotective effect of Zhi-Zi.Da-Huang decoction and its two fractions against acute alcoholinduced liver injury in rats. J. Ethnopharmacol, 2009; 126, 273-279. 189. KIM, G. N., SHIN, J. G., JANG, H. D. Antioxidant and antidiabetic activity of Danguyja (Citrus grandis Osbeck) extract treated with Aspergillus saitoi. Food Chem., 2009; 117, 35-41. 190. FANG, Y. -S., SHAN, D. -M., LIU, J. -W., XU, W., LI, C. -L., WU, H. -Z., JI, G. Effect of constituents from Fructus Aurantii Immaturus and Radix Paeinoae Alba on gastrointestinal movement. Planta Med., 2009; 75, 24-31. 191. HU, J., GAO, W. -Y., LING, N. -S., LIU, C. -X. Antidiarrhoeal and intestinal modulatory activities of Wei-Chang-An-Wan extract. J. Ethnopharmacol, 2009; 125, 450-455. 192. BOUTIN, J. A., MEUNIER, F., LAMBERT, P. H. In vivo and in vitro glucuronidation of the flavonoid diosmetin in rats. Drug Metab. Dispos., 1993; 21, 1157-1156. 193. ALVAREZ, N., VICENTE, V., MARTÍNEZ, C. Synergistic effect of diosmin and interferon-α on metastatic pulmonary melanoma. Cancer Biother. Radio., 2009; 24, 347-352. 194. PARI, L., SRINIVASAN, S. Antihyperglycemic effect of diosmin on hepatic key enzymes of carbohydrate metabolism in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetic rats. Biomed. Pharmacother., 2010; 64, 477-481. 195. TSUKANOV, A. Prevention of the negative phlebological influence prevention due testosterone therapy of the latest-onset hypogonadism. Journal of Men's Health, 2010; 321.
- 99 -
196. MAKSIMOVIĆ, Z. V., MAKSIMOVIĆ, M., JADRANIN, D., KUZMANOVIĆ, I., ADONOVIĆ, O. Medicamentous treatment of chronic venous insufficiency using semisynthetic diosmin - a prospective study. Acta chirurgica Iugoslavica, 2008; 55, 53-59. 197. TSUKANOV, I. T., TSUKANOV, A. I., BAZHENOV, V. N., KORNIENKO, I. F., VASILEVICH, V. V. Drug-mediated correction of negative phlebotropic effects of hormone replacement therapy in women. Angiology and Vascular Surgery, 2009; 15, 87-91. 198. CHOQUENET, B., COUTAU, C., PAPARIS, E., COIFFARD, L. J. M. Flavonoids and polyphenols, molecular families with sunscreen potential: Determining effectiveness with an in vitro method. Nat. Prod.Commun., 2009; 4, 227-230. 199. RANARAYANA, K., VENKATESHAM, A., NAGULU, M., SRINIVAS, M., KRISHNA, D. R. Influence of diosmin pretreatment on the pharmacokinetics of chlorzoxazone in healthy male volunteers. Drug Metabolism and Drug Interaction, 2008; 23, 311-322. 200. RAMFUL, D., BAHORUN, T., BOURDON, E., TARNUS, E., ARUOMA, O. I. Bioactive phenolics and antioxidant properties of flavedo extracts of Mauritian citrus fruits: Potential prophylactic ingredients for functional food aplication. Toxicology. 2010; 278, 75-87. 201. RATHEE, P., CHAUDHARY, H., RATHEE, D., KUMAR, V., KOHLI, K. Mechanism of action of flavonoids as anti-inflammatory agents: A rewiew. Inflammation and Allergy- Drug Targets, 2009; 8, 229-235. 202. ROMIER, B., SCHNEIDER, Y. -J., LARONDELLE, Y., DURING, A. Dietary polyphenols can modulated the intestinal inflammatory response. Nutr. Rev., 2009; 67, 363-378. 203. PRASAD, S., PHROMNOI, K., YADAV, V. R., CHATUVEDI, M. M., AGGARWAL, B. B. Targeting inflammatory pathways by flavonoids for prevention and treatment of cancer. Planta Med., 2010; 76, 1044-1063. 204. JING, L. J., MOHAMED, M., RAHMAT, A., BAKAR, M. F. A. Phytochemicals, antioxidant properties and anticancer investigations of the different parts of several gingers species (Boesenbergia rotunda, Boesenbergia pulchella var attenuata and Boesenbergia armeniaca). J. Med. Plants Res., 2010; 4, 027-032.
- 100 -
205. XIE, Y. Y. YUAN, D., YANG, J. Y., WANG, L. H., WU, C. F. Cytotoxic activity of flavonoids from the flowers of Chrysanthemum morifolium on human colon cancer Colon205 cells. J. Asian Nat. Prod. Res., 2009; 11, 771-778. 206. ABU BAKAR, M. F., MOHAMAD, M., RAHMAT, A., BURR, S. A., FRY, J. R. Cytotoxicity, cell arrest, and apoptosis in breast cancer cell lines exposed to an extract of the seed kernel of Mangifera pajang (bambangan). Food Chem. Toxicol., 2010; 48, 1688-1697. 207. REZAI-ZADEH, K., DOUGLAS SHYTLE, R., BAI, Y., TIAN, J., HOU, H., MORI, T., ZENG, J., TAN, J. Flavonoid-mediated presenilin-1 phosphorylation reduces Alzheimer's disease β-amyloid production. J. Cell. Mol. Med., 2009; 13, 574-588. 208. PARKER-ATHILL, E., LUO, D., BAILEY, A., GIUNTA, B., TIAN, J., SHYTLE, R. D., MURPHY, T., TAN, J. Flavonoids, a prenatal prophylaxis via targeting JAK2/STAT3 signaling to oppose IL-6/MIA associated autism. J. Neuroimmunol., 2009; 217, 20-27. 209. CHINNAM, N., DADI, P. K., SABRI, S. A., AHMAD, M., KABIR, M. A., AHMAD, Z. Dietary bioflavonoids inhibit Escherichia coli ATP synthase in a different manner. Int. J. Biol. Macromol., 2010; 46, 478-486. 210. AHMAD, Z., LAUGHLIN, T. F. Medicinal chemistry of ATP synthase: A potential drug target of dietary polyphenols and amphibian antimicrobial peptides. Curr. Med. Chem. , 2010; 17, 2822-2836. 211. RAMELET, A. A. Management of chronic venous disease: The example of Daflon 500 mg. Phlebolymphology, 2009; 16, 321-330. 212. NAVRÁTILOVÁ, Z. Efficacy of a 6-month treatment with daflon 500 mg in patients with venous edema (efficacy of daflon 500 mg in edema treatment, EDET). Phlebolymphology, 2010; 17, 137-143. 213. STREFEZZA, E. F. Comparative study of the formulation of diosmin/hesperidin and sachet in the treatment of the pain and edema of inferior members in the chronic venous disease. Rev. Bras. Med., 2010; 67, 21-31. 214. ROVENSKÝ, J., STANČÍKOVÁ, M., ROVENSKÁ, E., ŠTVRTINA, S., ŠTVRTINOVÁ, V., ŠVÍK, K. Treatment of rat adjuvant arthritis with flavonoid (Detralex®), methotrexate, and their combination. Ann. NY Acad Sci., 2009; 1173, 798-804.
- 101 -
215. KASZUBA, A., KISIEL, K., JAROSIŃSKI, D., ZACZYŃSKA-JANECZKO, J., KOZLOWSKA, M. The assessement of selected coagulation and fibrinolysis markers in the course of chronic venous insuficiency treated by micronized flavonoid fraction. Postep. Derm. Alergol., 2010; 27, 18-24. 216. PAYSANT, J., SANSILVESTRI-MOREL, P., BOUSKELA, E., VERBEUREN, T. J. Different flavonoids present in the micronized purified flavonoid fraction (Daflon® 500 mg) contribute to its anti-hyperpermeability effect in the hamster cheek pouch microcirculation. Int. Angiol., 2008; 27, 81-85. 217. SRILAK, M., AKAR, A. R., ERYILMAZ, S., CETINKANAT, E. K., OZCINAR, E., KAYA, B., ELHAN, A. H., OZYURDA, U. Micronized purified flavonoid fraction in pretreating CABG patients. Tex. Heart I. J., 2010; 37, 172-177. 218. PASCARELLA, L., LULIC, D., PENN, A. H., ALSAIGH, T., LEE, J., SHIN, H., KAPUR, V. Mechanisms in Experimental Venous Valve Failure and their Modification by Daflon© 500 mg. Eur. J. Vasc. Endovas. Surg., 2008; 35, 102-110. 219. RIZK, S. M., SABRI, N. A. Evaluation of clinical activity and safety of Daflon 500 mg in type 2 diabetic female patients. Saudi Pharm. J., 2009; 17, 199-207. 220. YILDIZ, F., TERZI, A., COBAN, S., BITIREN, M., CELIK, H., AKSOV, N., OZDOGAN, M. K., CAKIR, H. Purified micronized flavonoid fraction ameliorates the injury of spleen and ileum secondary to hepatic ischaemia-reperfusion in rats. Dig. Dis. Sci., 2010; 55, 2237-2243. 221. HOSSEINIMEHR, S. J., AHMADI, A., MAHMOUDZADEH, A., MOHAMADIFAR, S. Radioprotective effect of Daflon against genotoxicity induced by gamma irradiation in human cultured lymphocytes. Environ. Mol. Mutagen., 2009; 50, 749-752.
- 102 -
