BIOLOGICKÉ, CHEMICKÉ A FYZIKÁLNÍ METODY PRO CHARAKTERIZACI BAKTERIÁLNÍCH KULTUR Dagmar CHUDOBOVÁ1 1
Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, 613 00 Brno, Czech Republic
1. LITERÁRNÍ REŠERŠE Bakterie byly mezi prvními životními formami objevenými na Zemi a jsou přítomny ve většině lokalit na světě [1, 2]. Bakterie tvoří velkou doménu prokaryotických mikroorganismů. Typické bakterie jsou několik mikrometrů dlouhé a jsou rozmanitě tvarované. Většina bakterií není charakterizována, a jen asi polovina kmenů bakterií zahrnuje druhy, které mohou být kultivovány v laboratoři. Bakteriální buňky neobsahují jádro a zřídka membránově vázané organely [3, 4]. Drtivá většina bakterií v těle ničí obranné mechanismy imunitního systému, některé z nich však mohou být prospěšné. Několik druhů bakterií je patogenních a mohou způsobovat infekční onemocnění, včetně cholery, syfilisu, antraxu, malomocenství, dýmějového moru a tuberkulózy [5-7]. V průmyslu jsou bakterie důležité při čištění odpadních vod, zneškodňování olejových skvrn, výrobě sýrů a jogurtů při procesu kvašení, přečišťování zlata, palladia, mědi a dalších kovů v těžebním sektoru, v oblasti biotechnologie, při výrobě antibiotik a jiných chemických látek [8, 9]. Mikrobiální kultury jsou základem pro diagnostické metody používané jako výzkumný nástroj v molekulární biologii. Často je nezbytná izolace čisté kultury mikroorganismů. Izolace je jednou ze základních diagnostických metod v mikrobiologii a je využívána jako nástroj k určení příčiny infekčních onemocnění tím, že dochází k množení v předem určeném médiu [10]. Staphylococcus aureus je grampozitivní bakterie tvořící nepravidelné shluky, které v důsledku buněčného dělení tvoří více rovin. Je kataláza pozitivní, oxidáza negativní a fakultativně anaerobní. Roste na pevných médiích, kolonie mají zlatou nebo žlutou barvu, výrazná je jeho schopnost růstu v médiích s vysokým obsahem soli (5-7,5 %), což je důvodem využití této vlastnosti při izolaci. Nejčastěji se vyskytuje na kůži, ve sliznici a žlázách teplokrevných živočichů. Výskyt velkého množství těchto bakterií ve výrobku značí nepřiměřenou hygienu čištění, dezinfekci nebo nesprávnou regulaci teploty [11, 12]. Významem těchto bakterií je jejich schopnost produkovat enterotoxiny, které jsou odolné proti střevním proteázám a termosetům. Při požití způsobují gastroenteritidy s nevolnostmi, zvracením, průjmy a celkovou slabostí, způsobující otravy vzniklé množením bakterií [13].
Staphylococcus aureus je detekován klasickými mikrobiologickými analýzami, kultivován v selektivních médiích jako jsou manitolové soli, poté se provádí izolace a identifikace. Existují komerční metody pro identifikaci a detekci toxin specifických protilátek. Nejčastějším postupem k potvrzení stafylokoků je koagulázový test [14, 15]. Stejně jako u bakteriální klasifikace, k identifikaci bakterií se stále více využívají molekulární metody. Diagnostika využívá metody založené na DNA, jako je například polymerázová řetězová reakce (PCR). Tyto metody jsou stále populárnější díky své specifičnosti a rychlosti, v porovnání s kulturně založenými metodami [16, 17].
Postupy při charakterizaci bakterií Při identifikaci popisujeme jeden objekt a podle vlastností jej zařazujeme do skupiny objektů, které jsou vymezené klasifikací, tj. do určitého rodu a druhu [18]. Mezi základní postupy pro charakterizaci bakterií patří
zkoumání morfologických vlastností. O tvaru, velikosti a seskupení buněk se lze nejsnadněji přesvědčit pomocí pozorování bakteriální kultury ve formě preparátu pod mikroskopem. Významným barvením usnadňujícím identifikaci a charakterizaci bakteriálních kultur je Gramovo barvení, které má značný diferenciační význam, jelikož rozděluje bakteriální kmeny na grampozitivní a gramnegativní[18]. kultivační charakteristika – Kulturu lze také pozorovat jako kolonie pouhým okem na kultivačních agarových půdách. Obecně platí, že vzhled kolonie je také výrazně ovlivněn stářím kultury, kultivačními podmínkami nebo složením kultivačního média [19]. Většina bakteriálních kmenů má v prostředí agarové půdy svůj typický a charakteristický vzhled, který zároveň vyloučí možnost záměny s jiným kmenem. pozorování fyziologických vlastností – mezi tyto vlastnosti běžně patří: teplotní rozmezí kultury (psychrofilní, mezofilní nebo termofilní bakterie), vztah ke kyslíku (aerobní, obligátně anaerobní či fakultativně anaerobní bakterie), pH (zda bakterie lépe rostou v kyselém, neutrálním nebo zásaditém prostředí), tolerance k NaCl (např. náš kmen Staphylococcus aureus je schopen růstu v médiích s až 15 % NaCl, zatímco jiné grampozitivní koky nikoliv) [18], stanovení pohyblivosti mikroorganismů, růstové schopnosti [19] biochemické testy – např. tvorba H2S, testy na průkaz katalázy, oxidázy, přítomnost ureázy aj. (např. komerčně vyráběný STAPHYtest 24 při posouzení biochemických vlastností této kultury), test na redukci nitrátů [19] serologická typizace (imunologické a imunochemické metody) – aglutinační reakce, precipitační reakce, imunochromatografie, ELISA, ELFA, imunomagnetická separace důkaz patogenity – provádí se pouze v případě, že byla kultura izolována z infekčního procesu člověka a zvířat, jedná se o vyšetření patogenity kultury pro laboratorní zvířata doplňující testy – provádí se zejména při popisování nového druhu bakterií
Figure 1: Základní testy používané při identifikaci bakterií [18]
Zásady a metody pro kultivaci a identifikaci bakterií Kultivace je proces, při kterém mikroorganismy mohou růst ve speciálním syntetickém médiu (in vitro), po pomnožení bakterií (in vivo) není přechod z in vivo na in vitro příliš snadný, protože bakterie používají různé složité metabolické a fyziologické cesty [20]. Přežití bakterií v kulturách in vitro závisí na dostupnosti základních živin a na okolních podmínkách. Růstové médium pro bakterie mohou být kapaliny (bujón) a pevné médium (agar). Kapalná média vyžadují 106 bakterií na mililitr bujónu pro dodržení turbidity. V pevném médiu, kde bakterie rostou jako bakteriální populace, se tyto bakterie nazývají kolonie [21]. Nejdůležitějšími faktory životního prostředí, které je nutné posoudit, je dostupnost kyslíku, oxidu uhličitého, teplota, pH, vlhkost daného média a atmosféra. Makronutrienty vyžadované mikroorganismy jsou Ca, Na, K a Mg a jsou ve formě solí. Stopové prvky zahrnují Cu, Zn, Mo, Mn, Cr, Fe, atd. Jsou k dispozici v kultivačním médiu přidáním roztoku stopových prvků [22, 23].
Existuje několik způsobů, jak kvantifikovat mikrobiální populace, jedná se o přímé a nepřímé metody. Přímé metody: ty, které odhadují přímo počet buněk ve vzorku Stanovení mokré hmotnosti Je získána ze zváženého vzorku v suspenzi po separaci filtrací nebo odstředěním, k tomuto účelu je zkumavka napřed vytárována a po odstranění supernatantu se zváží pelety. Nevýhodou je, že kapalina obsahuje mezibuněčné prostory a tudíž tato kapalina obsažená v mezibuněčných prostorách přispívá k celkové hmotnosti buněčné hmoty [24]. Stanovení sušiny Vypočte se sušením objemu bakteriální kultury v sušárně při teplotě 105 ° C přes noc do konstantní hmotnosti. Nevýhodou je, že sušením dojde ke ztrátě těkavých látek z buňky a také ke zhoršení vlastností [25] Stanovení celkového dusíku (metoda dle Kjeldahla). Skládá se ze stanovení celkového dusíku pomocí třífázového postupu a zahrnuje neutralizaci vzorku s H2SO4 při teplotě 338 ° C, což odpovídá bodu varu H2SO4. Dojde k rozkladu vzorku a dusík je převeden do amonné formy a zachycen ve formě síranu ((NH4)2SO4), po tomto je přidán NaOH, který destilací uvolňuje NH3. Následně dochází k titraci HCl, a stanovuje se množství NH3, proto stanovení celkového dusíku [26]. Stanovení charakteristických složek Skládá se z určení množství peptidoglykanu, DNA, RNA, proteinů, ergosterolu, ATP, atd. Nejčastější je ATP, protože hraje klíčovou roli v metabolismu a je přítomen ve vysokých koncentracích [27]. Nepřímé metody: stanovení pomocí parametrů, kterými jsou počet buněk, ale i další parametry, jako je suchá hmotnost, množství bílkovin, množství chlorofylu, měření příjmu živin nebo produkce metabolitů za jednotku času, spotřeba kyslíku, kyselin, uvolnění kyslíku [28]. V těchto studiích je velmi důležité vědět, kolik mikroorganismů je ve vzorku. Mikrobiologové běžně používají termín kolonie tvořící jednotky (CFU), když mikroorganismus je schopen vytvořit kolonie na pevném kultivačním médiu [29]. V závislosti na složení kultivačního média rozlišujeme různé skupiny kultivačních médií pro bakterie [30]:
Syntetická média: taková média, která obsahují přesné množství čistých organických a anorganických látek rozpuštěných v destilované vodě. Komplexní média: média obsahující vysoce výživné látky, ale neurčité složení. Obvykle se jedná o látky jako masové extrakty, pepton, kvasničný extrakt. Výhodou
tohoto média je, že obsahuje řadu růstových faktorů, takže v něm může růst velký počet mikroorganismů (např. námi používané Luria Bertani (LB) médium) Média bohatá na živiny: některé mikroorganismy jsou schopny růstu v normálních růstových médiích. Ke kultivaci mikroorganismů, které potřebují vysoce výživné látky, je nutné k médiu přidat látky jako je krev, sérum nebo extrakty ze tkání zvířat. Selektivní média: obsahují jednu nebo více sloučenin, které inhibují růst určitého druhu mikroorganismu a nemají vliv na ostatní druhy. Diferenciační média: obsahující různé chemické látky nebo ukazatele, díky kterým mikroorganismy získávají určité specifické barvy nebo reagují určitým způsobem. Čisté kultury: čistou kulturou je ta, která obsahuje pouze jeden druh mikroorganismu.
Metody uchování bakteriálních kultur [31]
Chlazení: 4 °C. Není na dlouho, uchování jen po dobu týdne nebo dvou. Hluboké zmrazení: -50 °C / -90 °C nebo -196 °C. Mikroorganismy jsou zamraženy v glycerolu, který pomáhá zabránit poškození buněk. Lyofilizace: střední zmrazení na teplotu mezi -20 °C a -70 °C a dehydratace ve vakuu.
Metody sterilizace k odstranění mikroorganismů [32]
Tepelná sterilizace: autoklávování: 12 °C po dobu 15 minut. Médium je bez mikroorganismů a spor. Tyndalizace: tři cykly při 100 °C k rozvoji spor mezi dvěma po sobě jdoucími cykly, takže je možné je zabít. Filtrování je používáno u termolabilních sloučenin. 0,22 μm membrány umožňují průchod bakterií, ale ne kvasinek a plísní. Horký vzduch: v místnostech a pecích při vysokých teplotách. Cykly probíhají při 170 °C po dobu 90 minut. Chemikálie: polystyrenové plastové materiály se sterilizují chemickými látkami. UV-A záření a gama záření: ke sterilizaci povrchů nebo se používají pro balené léky nebo produkty.
Charakteristiky často používané pro diferenciaci a identifikaci mikroorganismů jsou externí morfologické, strukturální, fyziologické a imunologické vlastnosti. Biochemické testy také poukazují na metabolické dráhy mikroorganismů [33]. Mikroskopické techniky se používají především ke třem věcem: k popisu mikroorganismů na základě jejich morfologie, struktury a rozdělení, k detekci specifických mikroorganismů pro klinickou diagnostiku a klasifikaci mikroorganismů podle jejich barvicích vlastností [34, 35].
Existují dva typy barvení
jednoduché, pomocí jediného barviva rozpuštěného ve vodném nebo alkoholickém roztoku, které slouží k zobrazení morfologie mikroorganismů, tvořících shluky mezi nimi a ostatními buňkami a složité, používající více než jedno barvivo, barví různé buňky nebo různé druhy (např. barvení dle Grama).
Elektronová mikroskopie je další technikou sloužící k zobrazení vnitřních struktur a ultrastruktur v případě transmisivní elektronové mikroskopie (TEM), zatímco elektronová mikroskopie (SEM) ukazuje trojrozměrný pohled na vnější strukturu organismu [36]. V souvislosti s TEM probíhá tzv. kryofrakce, která se skládá ze zmrazení a zlomení mikroorganismu k zobrazení vnitřku buněčných struktur. Díky tomu jsou viditelné vnitřní organely [37]. Rychlý pokrok v molekulární biologii umožnil detekci a identifikaci mikroorganismů. Bakteriální identifikační systémy jsou založeny na genotypových a fenotypových charakteristikách [9].
Používanými fenotypickými kritérii jsou mikroskopická morfologie, požadavky na růst, rezistence nebo antimikrobiální citlivost, nutriční požadavky a metabolické vlastnosti [38]. Genotypová kritéria pro bakteriální identifikaci jsou založena na molekulární biologii, Southern blot, ELISA, PCR, real-time PCR, pulzní gelové elektroforéze (PFGE), imunoanalýze, denaturační gradientové gelové elektroforéze (DGGE) a fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) [16, 39, 40].
- DGGE je rychlá a jednoduchá metoda, která poskytuje charakteristické modely pro různé vzorky, což umožňuje rychlé ukázkové profilování, při současném zachování možnosti důkladnější genetické analýzy sekvenováním jednotlivých bandů. Jedná se o laboratorní proces, který umožňuje zařadit specifický mikroorganismus do rodu nebo druhu dle homologie bází. Záporně nabitá DNA je umístěna do elektroforetického pole, ve kterém probíhá proud. Tímto způsobem je DNA denaturována a rozdělena na bandy a je analyzována a sekvenována. Opakováním testu s primery různých bakterií, archea a eukaryot se porovnává rychlost denaturace a uspořádání bandů s databází. Když máme homologii 97 % nebo vyšší, můžeme říci, že se jedná o stejný druh, když vyšší než 93 %, lze říci, že mikroorganismy jsou stejného rodu [41, 42]. - FISH umožňuje identifikaci mikroorganismů v jakékoliv požadované taxonomické úrovni, v závislosti na specifičnosti použité sondy. Je pouze kvantitativní molekulární biologickou technikou. Kombinace s konfokálním laserově-skenovacím mikroskopem umožňuje vizualizaci trojrozměrných mikrobiálních struktur (zrnek, biofilmů). Ve vzorku jsou pak pozorovány všechny
mikroorganismy. Žíháním vzorku a lehkým filtrováním lze pozorovat pouze ty mikroorganismy, které jsou hybridizované a objevují se v jiné barvě. Kvantifikace byla stanovena na základě porovnání s těmi, kteří byli z celkového počtu hybridizováni [40, 41]. Mikrobiální molekulární genetika umožnila vývoj sofistikovaných postupů pro izolaci, manipulaci a expresi genetického materiálu, také nazývaným genetické inženýrství [43].
2. VÝSLEDKY Naše mikrobiologická laboratoř je zaměřena zejména na kultivaci bakteriálních nebo virových kmenů (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bakteriofág λ) v tekutých (LB médium) nebo pevných (LB agar) půdách. Základní charakteristika těchto kmenů probíhala buď pozorováním preparátu pod mikroskopem, kdy byla pozorována typická struktura těchto mikroorganismů (např. S.aureus – koky, E.coli – tyčinky) nebo kultivací kultur na Petriho miskách v termostatu nastaveném na 37 °C po dobu 24 hodin, poté je dle typického vzhledu narostlých kolonií určen druh mikroorganismu.
Figure 2: Pozorování grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus v rozdílných koncentracích (8.107, 4.107, 2.107, 1.107, 5.106, 2,5.106 KTJ/1ml) pod fluorescenčním mikroskopem při 40ti násobném zvětšení.
Figure 3: Bakteriální kultura Staphylococcus aureus po 24 hodinové inkubaci při 37 °C v termostatu, kultivovaná na Luria Bertani agaru složeném z tryptonu, kvasničného extraktu a NaCl [44]. Dalšími významnými testy pro charakterizaci bakterií jsou tzv. STAPHYtesty 24(Erba Lachema, Brno, Česká republika), které charakterizují bakteriální kultury dle jejich biochemických vlastností, jako např. schopnosti tvorby sirovodíku, testů na průkazu katalázy, oxidázy atd. Na základě těchto charakteristických parametrů můžeme testované kmeny zcela přesně určit. Toto testování probíhalo na přístroji Multiskan EX (Thermo Fischer Scientific, Německo), kdy je do jednotlivých jamek komerční mikrodestičky napipetována testovaná bakteriální kultura do celkového objemu 300 μl. Dno každé jamky je pokryté jinou látkou (ureáza, arginin, ornitin, β-galaktosidáza, β-glukuronidáza, β-glukosidáza, fosfatáza, eskulin, Nacetyl-β-D glukosamin, sacharóza, manitol, xylóza, galaktóza, trehalóza, maltóza, manóza, laktóza, sorbitol, ribóza, fruktóza, celobióza, arabinóza, xylitol a rafinóza) se kterou bakteriální kultura reaguje a v průběhu času se projevuje změnou zabarvení jamky a zároveň změnou naměřené hodnoty absorbance. Měření probíhá při vlnové délce 620 nm v čase 0 a pak vždy po půlhodinových intervalech do celkového času 24 hodin. Výsledky jsou poté zpracovány formou růstových křivek, že kterých je patrné, jestli daná látka na dně jamky bakteriální kulturu v růstu podporovala (vyživovala se jí), popř. byl její růst potlačen, inhibován.
Figure 4: Bakteriální kultura Staphylococcus aureus testovaná z hlediska biochemických vlastností využitím komerčně vyráběného testu STAPHYtest 24. Další námi používanou metodou pro charakterizaci bakterií bylo měření impedance růstu bakteriální kultury za pomoci přístroje xCELLigence RTCA DP (Roche, Česká republika). Tento přístroj umožňuje životaschopnost buňky monitorovat jako změnu impedance v reálném čase [45-50].
Figure 5: Měření impedance bakteriální kultury Staphylococcus aureus (množství buněk 8.107, 4.107, 2.107, 1.107, 5.106, 2.5.106/1 ml) v čase.
References 1.
2. 3. 4.
5. 6. 7.
8. 9. 10. 11. 12. 13.
14.
15.
16. 17.
18. 19. 20. 21.
Lage, C.A.S., et al., Mini-Review: Probing the limits of extremophilic life in extraterrestrial environment-simulated experiments. International Journal of Astrobiology, 2012. 11(4): p. 251-256. Seager, S., M. Schrenk, and W. Bains, An Astrophysical View of Earth-Based Metabolic Biosignature Gases. Astrobiology, 2012. 12(1): p. 61-82. Diekmann, Y. and J.B. Pereira-Leal, Evolution of intracellular compartmentalization. Biochemical Journal, 2013. 449: p. 319-331. Tan, D.X., et al., Mitochondria and chloroplasts as the original sites of melatonin synthesis: a hypothesis related to melatonin's primary function and evolution in eukaryotes. Journal of Pineal Research, 2013. 54(2): p. 127-138. Adkins, I., et al., Bacteria and their Toxins Tamed for Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2012. 13(8): p. 1446-1473. Singh, A.E. and B. Romanowski, Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiologic, and some biologic features. Clinical Microbiology Reviews, 1999. 12(2): p. 187-+. Duncan, M.C., R.G. Linington, and V. Auerbuch, Chemical Inhibitors of the Type Three Secretion System: Disarming Bacterial Pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012. 56(11): p. 5433-5441. van Dijl, J.M. and M. Hecker, Bacillus subtilis: from soil bacterium to super-secreting cell factory. Microbial Cell Factories, 2013. 12. Stefanis, C., et al., Principal methods for isolation and identification of soil microbial communities. Folia Microbiologica, 2013. 58(1): p. 61-68. Konieczna, I., et al., Bacterial Urease and its Role in Long-Lasting Human Diseases. Current Protein & Peptide Science, 2012. 13(8): p. 789-806. Vanderpool, C.K., D. Balasubramanian, and C.R. Lloyd, Dual-function RNA regulators in bacteria. Biochimie, 2011. 93(11): p. 1943-1949. Vengadesan, K. and S.V.L. Narayana, Structural biology of Gram-positive bacterial adhesins. Protein Science, 2011. 20(5): p. 759-772. Hunt, K., et al., Classical enterotoxins of coagulase-positive Staphylococcus aureus isolates from raw milk and products for raw milk cheese production in Ireland. Dairy Science & Technology, 2012. 92(5): p. 487-499. Karakulska, J., et al., Identification and Methicillin Resistance of Coagulase-Negative Staphylococci Isolated from Nasal Cavity of Healthy Horses. Journal of Microbiology, 2012. 50(3): p. 444-451. Huang, F.Y., et al., Isolation and identification of multidrug-resistant Staphylococcus haemolyticus from a laboratory-breeding mouse. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2011. 4(6): p. 421-425. Boyer, M. and J. Combrisson, Analytical opportunities of quantitative polymerase chain reaction in dairy microbiology. International Dairy Journal, 2013. 30(1): p. 45-52. Basu, S., et al., Potential application of superparamagnetic nanoparticles for extraction of bacterial genomic DNA from contaminated food and environmental samples. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013. 93(4): p. 788-793. Rosypal, S., Hoďák, K, Martinec, T., Kocur, M., Obecná bakteriologie. 1981: p. 749. Cupáková, Š., Dušková, M., Karpíšková, R., Mikrobiologie potravin Praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie. 2008: p. 55. Bermudez-Brito, M., et al., In vitro cell and tissue models for studying host-microbe interactions: a review. British Journal of Nutrition, 2013. 109: p. S27-S34. Vartoukian, S.R., R.M. Palmer, and W.G. Wade, Strategies for culture of 'unculturable' bacteria. Fems Microbiology Letters, 2010. 309(1): p. 1-7.
22. 23. 24.
25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34.
35. 36. 37.
38. 39. 40. 41. 42. 43. 44.
Jefferson, B., et al., Nutrient addition to enhance biological treatment of greywater. Water Research, 2001. 35(11): p. 2702-2710. Puertollano, M.A., et al., Dietary Antioxidants: Immunity and Host Defense. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2011. 11(14): p. 1752-1766. Hayashi, H., M. Sakamoto, and Y. Benno, Phylogenetic analysis of the human gut microbiota using 16S rDNA clone libraries and strictly anaerobic culture-based methods. Microbiology and Immunology, 2002. 46(8): p. 535-548. Romanova, N.D. and A.F. Sazhin, Relationships between the cell volume and the carbon content of bacteria. Oceanology, 2010. 50(4): p. 522-530. Ye, Z.F., et al., Treatment of landfill leachate by immobilized microorganisms. Science in China Series B-Chemistry, 2008. 51(10): p. 1014-1020. Oto, N., et al., Non-destructive evaluation of ATP content and plate count on pork meat surface by fluorescence spectroscopy. Meat Science, 2013. 93(3): p. 579-585. Valgas, C., et al., Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology, 2007. 38(2): p. 369-380. Snowdon, J.A. and D.O. Cliver, Microorganisms in honey. International Journal of Food Microbiology, 1996. 31(1-3): p. 1-26. Singh, S., et al., Axenic culture of fastidious and intracellular bacteria. Trends in Microbiology, 2013. 21(2): p. 92-99. Costa, C.P. and M.C. Ferreira, PRESERVATION OF MICROORGANISMS - A REVIEW. Revista De Microbiologia, 1991. 22(3): p. 263-268. Perrut, M., Sterilization and virus inactivation by supercritical fluids (a review). Journal of Supercritical Fluids, 2012. 66: p. 359-371. Wang, T.W., et al., Overview of Regulatory Strategies and Molecular Elements in Metabolic Engineering of Bacteria. Molecular Biotechnology, 2012. 52(3): p. 300-308. Barnett, M.J., D.A. Pearce, and D.C. Cullen, Advances in the In-Field Detection of Microorganisms in Ice, in Advances in Applied Microbiology, Vol 81, S. Sariaslani and G.M. Gadd, Editors. 2012, Elsevier Academic Press Inc: San Diego. p. 133-167. Osumi, M., Visualization of yeast cells by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy, 2012. 61(6): p. 343-365. Moczydlowska, M. and S. Willman, Ultrastructure of cell walls in ancient microfossils as a proxy to their biological affinities. Precambrian Research, 2009. 173(1-4): p. 27-38. Speranza, M., et al., Towards a more realistic picture of in situ biocide actions: Combining physiological and microscopy techniques. Science of the Total Environment, 2012. 439: p. 114-122. Miedzobrodzki, J., et al., Differentiation of Staphylococcus aureus isolates based on phenotypical characters. Postepy Higieny I Medycyny Doswiadczalnej, 2008. 62: p. 322-327. Maurin, M., Real-time PCR as a diagnostic tool for bacterial diseases. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2012. 12(7): p. 731-754. Lopez, M.M., et al., Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bacteria. International Microbiology, 2003. 6(4): p. 233-243. Sanz, J.L. and T. Kochling, Molecular biology techniques used in wastewater treatment: An overview. Process Biochemistry, 2007. 42(2): p. 119-133. Suda, W., et al., A Direct Method to Isolate DNA from Phyllosphere Microbial Communities without Disrupting Leaf Tissues. Microbes and Environments, 2008. 23(3): p. 248-252. Middelberg, A.P.J., PROCESS-SCALE DISRUPTION OF MICROORGANISMS. Biotechnology Advances, 1995. 13(3): p. 491-551. Melter, O., J. Tkadlec, and I. Sedlacek, A simple and cost-effective cover-glass test for the differentiation between staphylococci and micrococci in clinical laboratory. Journal of Microbiological Methods, 2012. 89(3): p. 213-215.
45.
46. 47.
48. 49. 50.
Limame, R., et al., Comparative Analysis of Dynamic Cell Viability, Migration and Invasion Assessments by Novel Real-Time Technology and Classic Endpoint Assays. Plos One, 2012. 7(10). Ke, N., X. Wand, and X. Yama, The xCELLigence System for Real-Time and Label-Free Monitoring of Cell Viability. Methods in Molecular Biology, 2011. 740: p. 33-43. Rajaraman, G., et al., Optimization and Scale-up Culture of Human Endometrial Multipotent Mesenchymal Stromal Cells: Potential for Clinical Application. Tissue Engineering Part CMethods, 2013. 19(1). Kaitu'u-Lino, T.J., et al., Targeted Nanoparticle Delivery of Doxorubicin Into Placental Tissues to Treat Ectopic Pregnancies. Endocrinology, 2013. 154(2): p. 911-919. Redova, M., et al., MiR-210 expression in tumor tissue and in vitro effects of its silencing in renal cell carcinoma. Tumor Biology, 2013. 34(1): p. 481-491. Pileczki, V., et al., TNF-alpha Gene Knockout in Triple Negative Breast Cancer Cell Line Induces Apoptosis. International Journal of Molecular Sciences, 2013. 14(1): p. 411-420.
