BIOLÓGIA és BIOTECHNOLÓGIA 5. rész Előadó:
Ballagi András, c. egyetemi tanár Richter Gedeon NyRt. - BME
Írásos segédanyag található a: http://oktatas.ch.bme.hu /oktatas /konyvek /mezgaz /Biol-biotech-vegyész-MSc
címen
1
Itt járunk:
2
Enzim mérnöki ismeretek
Zemplén Géza,1915 Az enzimek és gyakorlati alkalmazásuk. A kir.Magyar Term.Tud . Társulat kiadása “Kevés
fejezete van a chemiának, amely a legutolsó néhány év alatt olyan nagyot haladt volna, mint éppen az enzimeké. Éppen ezért a vegyész lépten-nyomon érzi, hogy megismerésük és a velük való bánásmód manapság már nélkülözhetetlen”
3
Enzimek tulajdonságai Csak termodinamikailag lehetséges reakciók (∆G <0) Reverzibilis reakciók (de eltolás. elvétel…) Denaturálhatóak (T, pH, ionerősség, oldószerek) Specifikusak: S-specifitás, csoport-specifitás, sztereo-specifitás Nagyobb reakcióképesség Enyhébb reakciókörülmények Nagyobb reakció specificitás Regulálhatóság
4
Enzimek tulajdonságai Az enzimek NEM változtatják meg az egyensúlyi állandót. Az enzimek NEM befolyásolják a reakcióban felhasznált vagy felszabaduló energia mennyiségét (G) Az enzimek csökkentik a reakciók aktivációs energiáját Az enzimek növelik az egyébként is lezajló reakciók sebességét
5
Kulcs – zár hasonlat
ES komplex S
KULCS
+ ZÁR
szabad E
+ termékek
szabad E
6
Az aktív centrum kialakulása
Ser
Ser
Arg
Thr Glu
7
Enzimes alapfogalmak HOLOENZIM APOENZIM
+
KOFAKTOR
Inaktív fehérje FÉMION Mg,Ca,Zn, Fe,Cu,Mo
KOENZIM
Prosztetikus csoport
Koszubsztrát
stabil kovalens kötés Pl. : FAD(H2), Hem, Piridoxal-P(B6)
Ciklikus regenerálás NAD(H), ATP
8
Itt járunk:
9
Enzimkinetika E + S
E + P
mol/dm3 !
SI rendszerben: 1 Katal az az enzim aktivitás (mennyiség), amely 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt. a hatalmas enzim mennyiség miatt nKat = 10-9 Kat használatos
A gyakorlatban: 1 egység (Unit, azaz U) az az enzim aktivitás (mennyiség), amely: 1 µmol szubsztrátot alakít át, (vagy 1 µmol terméket képez) 1 perc alatt adott reakció körülmények között. 1 Kat = 6*107 U,
E/tf , E/mg
1U =1.6*10-8 Kat,
1U= 1/60 µKat
fajlagos aktivitások, ha az enzim molekulasúlya nem ismert 10
Enzimkinetika: Michaelis – Menten kinetika k
E + S
k
k
1
ES -1
2
k
-2
E + P
feltételezések: • k-2 =0 k1S.E = k-1 (ES) • első lépés gyorsan egyensúlyra jut = Rapid ekv. • stabil ES komplex, EP komplex elhanyagolható k −1 S.E Ks = = • egy aktiv centrum, egy szubsztrát k1 (ES) • aktivitás helyett cc. használható • S> >E0 vagyis E0 / S < <1 az (ES) disszociációs állandója a teljes reakciósebesség:
dP V= = k 2 (ES) dt
anyagmérleg:
E + ( ES ) = E o
osszuk el ezt a kettőt egymással 11
Michaelis – Menten kinetika dP V= = k 2 (ES) dt
E + ( ES ) = E o
Vmax = k 2 E o
V k 2 (ES) = E o E + (ES) S k2 E V Ks = Eo E + S E Ks
Ks =
Rendezzük át!
S V Ks S = = k 2Eo 1 + S Ks + S Ks
k
E + S
k
k −1 S.E = k1 (ES)
k
1
ES -1
V = Vmax
S Ks + S
2
k
-2
E + P
12
Maud Menten 1879-1960
Leonor Michaelis 1875-1949 13
Briggs - Haldane kinetika k
E + S
k
k
1
ES
k
-1
dS = − k1ES + k −1 (ES) dt
2
-2
E + P
S0 S
d (ES) = k1ES − k −1 (ES) − k 2 (ES) dt
P pre-st.st. kvázi st.st. (ES)
dP = k 2 (ES) dt
E0
0
steady state: d(ES)/dt =0
E
S > > Eo vagy Eo / S << 1 és (k1ES > k-1(ES) ill. k1ES >
idõ
k2(ES)) 14
Briggs - Haldane kinetika E + (ES) = E o E = E o − (ES)
d (ES) = k1E. S − k −1 (ES) − k 2 (ES) = 0 dt k1 (E 0 - ES) S − k −1 (ES) − k 2 (ES) = 0 k1E 0S = (k −1 + k 2 )(ES) + k1 (ES) S = 0
V = Vmax
k2Eo S k 2 (ES) = k -1 + k 2 +S k1 S Km + S k
E + S
k
k
1
ES -1
k −1 + k 2 Km = k1 Michaelis állandó
2
k
-2
E + P
15
Az M-M és B-H kinetika diszkussziója
Michaelis –Menten S V = Vmax Ks + S
Briggs-Haldane V = Vmax
S Km + S
k −1 + k 2 k −1 k 2 k2 Km = = + = Ks + k1 k1 k1 k1
ha num(k1)> >num(k2)
a két konst. azonos!
K m = Ks
k
E + S
k
k
1
ES -1
2
k
-2
E + P
16
Diszkusszió V
Vmax= k2EO
V=(Vmax/KS)*S
1.rendû 1.rendû 1. Rendű tartomány tartomány tartomány
Ha S >> Ks derékszögű hiperbola
S << Ks
0. Rendű 0-ad rendû tartomány rendű
tartomány tartomány
S
Km ; KS
V = Vmax
S Km + S
17
Linewaver – Burk ábrázolás
18
Itt járunk:
19
Enzimek elnevezése 1. S – után :
urea + viz
CO2 + 2NH3
ureáz
S-név + áz
2. Reakció (és S) után: EtOH
AcO
alkohol-dehidrogenáz
AcOH (S-név)+reakciónév+ áz
3. Reakció (és P): után Glutamát + ATP + NH3 → Glutamin + ADP + foszfát Glutamin szintetáz 4.Triviális nevek:
(P-név)+reakciónév+ áz
alapnév + -in
pepszin, tripszin, rennin
fehérjebontók 20
Enzimek elnevezése
katalógusszám
koszubsztrát
E.C.1.1.1.49. D-glucose-6P: NADP 1-oxydoreductase
szubsztrát
a támadás helye az 1 C-atomon van
a reakció mibenléte
A glükózoxidáz szisztematikus neve 21
Itt járunk:
22
Kompetitív inhibíció A kompetitív inhibíció egy olyan gátlás amelynél az inhibitor az aktív centrumba kötődik és megakadályozza a szubsztrát bekötődését (és viszont: a szubsztrát az inhibitor bekötődését.) Vmax változatlan, mert sok szubsztrát legyőzi a kevés inhibitort, de a Km nő, mert a szubsztrát enzimhez való kötődése csökken
23
Nem-kompetitív inhibíció Nem-kompetitív inhibíció akkor lép fel, ha az inhibitor ugyanolyan jól kapcsolódik az enzimhez, mint az enzimszubsztrát komplexhez és megakadályozza a termékképződést. Ezáltal csökkenti az enzimaktivitást, de a szubsztráthoz való affinitást nem, mert a szubsztrát zavartalanul be tud kötődni
24
Unkompetitív inhibíció Unkompetitív inhibició, másnéven anti-kompetitív inhibíció az, amikor az inhibitor csak a már kialakult enzim-szubsztrát komplexhez tud kötődni, az egyedül álló enzimhez nem. A maximális enzimaktivitás (Vmax) csökken, mert a termékképzés gátolt, de a szubsztráthoz való affinitás nő (Km csökken), mert a reakció eltolódik ESI irányába, így a szabad ES komplex csökken.
25
ANALÓGIÁK a M-M kinetikára
Kompetitív inhibició
V = Vmax
S I + S K s 1 + Ki
Non-kompetitív inhibició
V = Vmax
S I I K s 1 + + S1 + Ki Ki
Unkompetitiv inhibició
V = Vmax
S I K s + S 1 + Ki 26
Itt járunk:
27
Heterogén fázisú enzimes reakciók Homogén fázisú Enzim reakció
Heterogén fázisú Enzim reakció
Homogenitási a rendszer homogén, az enzim szempont az izolálásán kívül előkészítést nem igényel
Inhomogén rendszer, előkészítést (kémiai kapcsolást) igényel
Gazdasági szempont
Az enzimek drágák, 1-10 $/mg Csak egyszer használhatók fel, a reakció után elvesznek, illetve kinyerésük a reakcióelegyből bonyolult és drága.
Az enzimek ugyan drágák, de többször felhasználhatóak így az egy reakcióra eső költség olcsóbb
Technológiai szempont
szennyezik a terméket, tisztítását nehezítik
Az enzim a reakcióelegyből könnyen eltávolítható
Enzim Immobilizáció története Nelson és Griffin 1916 ban véletlenül fedezte fel, hogy élesztő invertáza aktívszénen adszorbeálódott de megőrizte az aktivitását a szaharóz hidrolízisében. Ipari gyakorlattá illetve kereskedelmivé akkor vált, amikor Grubhofer és Schleith egy sor enzimet rögzítettek: karboxipeptidázt, diasztázt, pepszint és ribonukleázt. Ezeket diazotálással végezték poli-aminosztirol gyantára kovalens kötéssel. Az első ipari alkalmazás Chibata nevéhez fűződik 1969-ben, aki aminoacilázt rögzített DEAE Sephadex-re ionosan és ezt N-acylacyl-D, L L--aminosav rezolválására használták. 29
Enzim Immobilizáció
30
Az enzimrögzítés fizikai módszerei K!!!
F Enzim rögzités üreges szálban (Hollow fibre)
Enzim rögzités fonott szálas anyagban
F
F E M
S E
Enzimbezárás oldhatatlan gél mátrixban
Mikrokapszulázás 31
Az enzimrögzítés kémiai módszerei
M
M=mátrix E E
M
Keresztkötés
KÉMIAI MÓDSZEREK
Enzimkötés hordozóhoz kovalens kötéssel
Enzim keresztkötés multifunkciós reagenssel 32
Az enzimrögzítés kémiai módszerei Kovalens kötés nem esszenciális aminosav-oldallánc(!) és vizben nem oldódó, funkciós csoporttal ellátott hordozó mátrix között X + E
E + X
Hordozó: természetes polimer: agar, agaróz, kitin, cellulóz, kollagén szintetikus polimer: poliuretán, polisztirol, nylon szervetlen hordozók: üveg, alumínium, szilikagél
Kovalens kötés kialakítása:
szabad α-, β- vagy γ-COOH , α -, β –NH2 csoportok fenil-, OH-, SH- vagy imidazol-csoportok Lépések: 1. a hordozó aktiválása ( KAR és -X, reaktiv csoport felvitele), 2. a kovalens kötés létrehozása az enzim és az aktivált hordozó között. Közben aktiv centrum védelme: S v. S-analóg jelenlétével 33
Az enzimrögzítés kémiai módszerei
34
Az enzimrögzítés kémiai módszerei Az enzim fenil-, amin-, szulfhidril- csoportjainak ( ALKILEZÉSE
)
MÁTRIX: METAKRILÁT és CELLULÓZ szármezékok homoés kopolimerjei
O BrCH 2COBr -OH BrCH 2COOH dioxán
-O-C-CH 2-Br
O -O-C-CH 2
E
E 35
Az enzimrögzítés kémiai módszerei POLIFUNKCIÓS KÖTÉS MÁTRIX: -NH 2 csoport : AE-CELLULÓZ, DEAE-CELLULÓZ, KOLLAGÉN, KITIN, NYLON, stb H -NH 2 + OHC-(CH 2)3-CHO
-N
C-(CH 2)3-CHO
GLUTÁRALDEHID H -N
E -NH 2
C-(CH 2)3-CH N- E Schiff-bázis 36
Az enzimrögzítés kémiai módszerei Üvegfelületre rögzítés
3-aminopropyltriethoxy-silane
tiocianát
Tioszénsavdiamid=tiokarbamidszármazék
37
Az enzimrögzítés kémiai módszerei Keresztkötések létrehozása fehérjemolekulák között
38
Itt járunk:
39
Az enzimek osztályozása aktivitásuk alapján
tejsav dehidrogenáz szerin hidroximetil transzferáz ureáz
piruvát dekarboxiláz metil-malonil CoA liáz
piruvát karboxiláz 40
Az enzimek osztályozása aktivitásuk alapján
41
Az enzimek osztályozása aktivitásuk alapján
42
Itt járunk:
43
Enzimek mint termékek Felhasználási terület
Enzim
Mosószerek
proteázok, lipázok, cellulázok
Takarmányok
β-glükanáz, celluláz, fitáz, xylanáz, lipáz
Orvosi alkalmazások/gyógyszerek
proteázok, lipázok, amilázok, βlaktamázok, L-aszparagináz, hyaluronidáz, lizozim, kollagenáz, sztreptokináz
Analitika és diagnosztika
urát oxidáz, L-aminosav oxidáz, penicillináz
44
Enzimek mint segédanyagok
Felhasználási terület
Enzim
Textilipar
amilázok, hemicelluláz, pektinázok
Bőripar
proteázok
Papíripar
hemicelluláz, amilázok, lakkáz
Cukoripar, keményítőipar
α-galaktozidáz, (izo)amilázok, amiloglukozidáz, glukóz izomeráz, ciklodextringlukano-transzferáz, xilanáz.
45
Az élelmiszeripar enzimei Felhasználási terület
Enzim
Tejipar
proteázok, β-galaktozidáz, lizozim, lipázok, észterázok, papain, rennin, glukózoxidáz, kataláz.
Söripar
amilázok, tannáz, β-glukanáz, proteáz, xilanáz
Borászat, gyümöcsléipar
pektinázok, naringináz, celluláz, amiláz
Húsipar, halfeldolgozás
proteázok, papain, glükózoxidáz
Zsír- és olajipar
foszfolipáz, észtrázok
Kávé, tea, kakaó
pektináz, proteáz, glükanáz, tannáz
46
A környezetvédelem enzimei Enzim
Katalitikus lépés
Az enzimet termelő mikroorganizmus
Baktériumokból dehalogenáz
diklórmetán lebontása
Pseudomonas sp
benzol-dioxigenáz
benzol és egyéb aromások lebontása
Pseudomonas putida
kollagenáz
kollagén hidrolízise .
Streptomyces sp.
cianid-hidratáz
cianid detoxifikálás
Stemphylium loti
celluláz, xilanáz
cellulóz hidrolízise/degradációja
Hypocrea sp., Aspergillus sp.
hemicelluláz, pectináz
szalma, egyéb növényi maradvány, papír
Chaetomium sp., Humicola sp.
Gombákból
47
Néhány vegyiparban alkalmazott enzim Enzim
Katalitikus lépés
Termék
Nitril-hidratáz
hidrolízis
akrilamid
Penicillin-aciláz
hidrolízis
6-amino-penicillánsav
Hidantoináz
reszolválás
4-hidroxi-D-fenil-glicin
D-szorbitdehidrogenáz
oxidáció
L-szorbóz
niacin hidroxiláz
hidroxilezés
6-hidroxi-nikotinsav
β-Ketoreduktáz
redukció
(R)-karnitin
piruvát dekarboxiláz
C–C-kötés létrehozása
(R)-fenil-acetil-karbinol
48
Néhány terápiás célra alkalmazott enzim és enzimkészítmény Enzim
Enzimforrás
Gyógyszernév Uricozyme
Mi ellen? Mire?
urát oxidáz
Aspergillus flavus
köszvény, hiperurikémia
lipáz
Rhizopus arrhizus
Pankreatin: pankreász enzimek keveréke: tripszin, kimotripszin, lipáz, α-amiláz)
Sertés pankreász
Cotazym, Kreon, Nutrizym, Pankreon, Panzytrat
emésztést elősegítő készítmények
β-galaktozidáz (Lactase)
Kluyveromyces fragilis, A. oryzae, A.niger
Lactaid, Lactrase, SureLac
laktóz intolerancia
hialuronidáz
Borjú here, rDNS termék
Hylase, Vitrase
szívinfarktus
emésztést elősegítő készítmények
49
Folytatás: néhány, terápiás célra alkalmazott enzim és enzimkészítmény Enzim
Enzimforrás
Gyógyszernév
Mi ellen? Mire?
urokináz
humán vizelet vagy humán vesesejttenyészet
Abbokinase, Actosolv, Alphakinase, Rheothromb
akut szívizominfarktus
VIII véralvadás faktor
rekombináns CHO sejtek
Recombinate, Bioclate
hemofilia A
szöveti plazminogén aktivátor
rekombináns CHO sejttenyészet
Activase, Actilyse
akut szívizominfarktus; akut tüdőembólia; iszkémiás sztrók
dezoxiribonukleáz
rekombináns CHO sejttenyészet
Pulmozyme
krónikus obstruktív tüdőbaj 50
Enzimreakciók az analitikában Az elfogyó szubsztrát vagy a keletkező termék valamilyen mérhető változást okoz (például színváltozást, spektrumváltozást, pH-változást stb.)
V = Vmax
S Km + S
51
Húgysavmeghatározás enzimreakcióval
A képződő allantoin nem nyel el 293 nm-en, így a mérés során jelentkező abszorbanciacsökkenésből az S, azaz a húgysav koncentrációja kiszámítható. 52
Szubsztrátmeghatározás indikátorreakció segítségével
A glükózzal való reakció nem jár mérhető változással, ezért a képződött G6P-ot egy további reakcióban egy további enzimmel, a foszfoglükonátdehidrogenázzal 6-P-glükonáttá oxidáljuk. Eközben a NADP koszubsztrát redukálódik NADPH-vá, aminek elnyelési maximuma van 340 nm-en. (Ez a jellemző mérési módszer minden NADH képződéses reakció esetén). 53
Enzimes indikátorreakció fehérjemeghatározásban
54
Enzim elektródok, bioszenzorok Az enzimelektródokban, bioszenzorokban rögzített enzimeket vagy teljes sejteket alkalmaznak. Az enzimelektródok amperometriás vagy potenciometriás elven működnek. A bioszenzorok általános felépítése:
55
Amperometriás glükózelektród Egy oldott oxigént mérő elektód membránjának felületére van felhordva egy gélben rögzített glükózoxidáz enzim (és kataláz!). Ezt a rögzített enzimet is egy membrán határolja, amely a meghatározandó szubsztrátra, a glükózra és a termék glükonsavra is áteresztő. A reakció során csökken a gélben az oldott oxigén koncentrációja, és ezt a csökkenést detektálja az oxigénelektród 56
A potenciometriás elektródok felépítése
57
