Biodegradace polymerů a polymerních materiálů

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta chemická

doc. Mgr. Marek Koutný, Ph.D.

Biodegradace polymerů a polymerních materiálů Biodegradation of polymers and polymeric materials TEZE PŘEDNÁŠKY K PROFESORSKÉMU JMENOVACÍMU ŘÍZENÍ V OBORU Chemie a technologie životního prostředí

Brno 2014

KLÍČOVÁ SLOVA Biodegradabilní polymer, biodegradace, aerobní procesy, anaerobní procesy, kompostování, polyester, polyetylen, kyselina polymléčná, polybutandioladipát-co-tereftalát, polyvinylalkohol.

KEYWORDS Biodegradable polymer, biodegradation, aerobic processes, anaerobic processes, composting, polyester, polyethylene, polylactic acid, polybutandiol adipate-co-terephtalate, polyvinyl alcohol.

© Marek Koutný, 2014 ISBN 978-80-214-5085-1 ISSN 1213-418X

OBSAH PŘEDSTAVENÍ AUTORA ............................................................................................................... 4 1 ÚVOD ........................................................................................................................................... 6 2 ÚVOD DO PROBLEMATIKY BIODEGRADABILNÍCH POLYMERŮ.................................. 7 3 BIODEGRADACE POLYMERNÍCH MATERIÁLŮ ................................................................. 9 3.1 3.2 3.3

Mobilita polymerních řetězců .............................................................................................. 9 Abiotická degradace molekul polymerů .............................................................................. 9 Bioenergetika biodegradace polymerů ............................................................................... 10

4 PROOXIDANTY PRO KONVENČNÍ POLYMERY ............................................................... 12 4.1 Studium biodegradace polyetylenu s prooxidanty ............................................................. 12 4.2 Studium biodegradace PE s definovanými mikrobiálními kmeny..................................... 12 4.3 Biodegradace polyetylenu v komplexních prostředích ...................................................... 13 Publikace autora vztahující se k dané problematice .................................................................... 14 5 KYSELINA POLYMLÉČNÁ..................................................................................................... 15 Publikace autora vztahující se k dané problematice .................................................................... 16 6 POLYVINYL ALKOHOL .......................................................................................................... 18 Publikace autora vztahující se k dané problematice .................................................................... 19 7 AROMATICKO-ALIFATICKÉ POLYESTERY ...................................................................... 20 Publikace autora vztahující se k dané problematice .................................................................... 21 8 APLIKACE MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝCH METOD VE STUDIU BIODEGRADACE POLYMERŮ ............................................................................................................................... 22 Publikace autora vztahující se k dané problematice .................................................................... 22 9 ZÁVĚR ........................................................................................................................................ 24 LITERATURA................................................................................................................................. 25 SEZNAM ZKRATEK...................................................................................................................... 28 ABSTRAKT..................................................................................................................................... 29 ŽIVOTOPIS ..................................................................................................................................... 30

3

PŘEDSTAVENÍ AUTORA Vystudoval jsem biochemii na přírodovědecké fakultě Masarykovy University v Brně, kde, jak se domnívám, se mi dostalo velmi dobrého vzdělání a následně pokračoval na stejném oboru v doktorském studiu zaměřeném na studium denitrifikačních enzymů a transportu elektronů při bakteriální denitrifikaci pod vedením prof. Igora Kučery. Již v průběhu doktorského studia jsem měl příležitost vycestovat do zahraničí, konkrétně na Free University do Amsterdamu, což na mě udělalo velký dojem. Pochopil jsem, že naše tehdejší zaostávání za špičkovou vědou není dáno jen chronickým podfinancováním, což byl v té době populární názor, ale také tím, že špičková zahraniční pracoviště na své kvalitě dlouhodobě systematicky pracují v oblasti organizace, sběru informací, personalistice, řízeny ambiciózními a motivovanými lidmi. V tomto ohledu máme stále co dohánět, i když se jinak materiální zázemí naší práce výrazně zlepšilo. Po dokončení doktorátu v roce 1999 jsem více-méně náhodou zaplnil volné místo na Zlínské fakultě technologické na tehdejší Katedře životního prostředí a chemie a stal se zaměstnancem VUT Brno. Pod vedením prof. Vondrušky jsem se začal zabývat problematikou ekotoxikologického hodnocení odpadů, byl zapojen do řešení grantových projektů a samozřejmě jsem velmi intenzivně participoval na pedagogickém úsilí katedry. Podařilo se mi také získat postdoktorský grant GAČR týkající se právě hodnocení odpadů. Z tohoto období pocházejí některé mé práce, které se právě odpady zabývají. V roce 2000 jsem se vlivem dějinných zvratů stal zaměstnancem University Tomáše Bati ve Zlíně a jsem jím doposud. Zlomem v mé akademické kariéře byl roční post doktorský pobyt na Blaise Pascal University v Clermont-Ferrand ve Francii (2004-2005). Během tohoto pobytu jsem pracoval na projektu Neosac, jehož cílem byl vývoj a testování degradabilní polyethylenové folie s přídavkem foto a termooxidačních aditiv. Projekt sám byl zajímavý spoluprací mezi sdružením soukromých výrobních společností, privátní výzkumné a testovací laboratoře CNEP (Centrum National pour Evaluation de Photoprotection) a státní university. V rámci projektu se nám podařilo vyvinout inovativní metodu hodnocení dlouhodobých experimentů biodegradace polyetylenu pomocí měření viability přítomných mikroorganismů založenou na stanovení obsahu ATP a ADP. Metoda je v laboratoři nadále používána. Zmíněný postdoktorský pobyt byl velmi cený z hlediska získání zkušeností a také byl velmi dobře zhodnocen publikačně. Po návratu na fakultu jsem se rozhodl pokračovat v tematice výzkumu procesů biodegradace polymerních materiálů, která mi připadala perspektivní. Především jsem si uvědomil, že se jedná o interdisciplinární téma zahrnující aspekty mikrobiologie, vědy o polymerech a materiálech obecně, případně biochemie, a že většina autorů přistupuje prozatím k tematice pouze jednostranně, z hlediska jediné specializace. Ve spolupráci s doc. Hoffmannem jsem na katedře zavedl a zdokonalil metodu sledování aerobních i anaerobních biodegradačních procesů pomocí plynové chromatografie. Metoda umožňuje sledovat vývoj procesu biodegradace a hodnotit míru mineralizace uhlíku z materiálu. Její hlavní předností oproti konkurenčním systémům je možnost sledovat velkou řadu paralelních vzorků v jediném experimentu. To představuje radikální výhodu oproti systémům provozovaných v jiných laboratořích využívajících respirometrických principů. Metodicky jsem laboratoř dále obohatil o použití molekulárně biologických metod konkrétně PCR, kvantitativního PCR a gelové elektroforesy v teplotním gradientu (TGGE), které umožňují relativně nedestruktivní analýzu vývoje mikrobiálního společenstva s možností identifikace zúčastněných mikroorganismů a sledování jejich dynamiky. S využitím popsaného metodického rozvoje se mi podařilo získat grant GAČR, který jsem úspěšně řešil a obhájil, přičemž se nám povedlo získat některé nové zajímavé poznatky o biodegradaci některých polymerů. V roce 2007 jsem se úspěšně habilitoval s prací zaměřenou na biodegradabilní polymery a procesy jejich biodegradace v oboru „Technologie makromolekulárních látek“ na fakultě technologické UTB.

4

S Blaise Pascal University jsem zůstal i nadále v kontaktu přičemž tato spolupráce je, co se týká poznatků i publikačních výstupů, mimořádně plodná. Se svými kolegy se při různých příležitostech pravidelně navštěvujeme, například v rámci programu Erasmus. Již dvakrát se mi zde také podařilo obstát ve výběrovém řízení a získat měsíční pozici „Invited professor“. Další velmi plodnou spolupráci jsem navázal s kolegy s Ústavu polymerov Slovenské akademie věd, v rámci které jsme do tematiky biodegradace polymerů zapojili metody sledování chemiluminiscence materiálů za různých podmínek. Také tato spolupráce byla publikačně úspěšná a stále pokračuje a rozvíjí se. Popsanou a zavedenou metodickou základnu se snažíme dále aplikovat v dalších oblastech environmentální mikrobiologie a ve spolupráci s kolegy z Ústavu technologie potravin na problematiku mikrobiálních procesů v technologii fermentovaných mléčných výrobků. V současné době se chystáme popsané metody uplatnit také v projektu TAČR, který jsme získali. V roce 2012 jsem byl jmenován do funkce ředitele Ústavu inženýrství ochrany životního prostředí, ve které jsem doposud. V rámci svého pedagogického působení jsem byl od počátku byl nucen se přizpůsobovat potřebám fakulty a oboru. Na počátku jsem působil jako odborný asistent především při výuce analytické chemie, měl jsem na starosti laboratorní cvičení a výpočtové semináře, později mi přibyl předmět Instrumentální analýza, který jsem zajišťoval samostatně. Od počátku své pedagogické práce jsem vnímal, že pro uplatnění našich absolventů je důležitá znalost legislativy v oblasti životního prostředí. Proto jsem z vlastní iniciativy začal tuto náročnou oblast v podstatě od nuly studovat a asi po dvou letech jsem byl schopen zavést do výuky související předmět, který vyučuji dodnes. Vzhledem k rychlým změnám, které tato oblast neustále prodělává, se jedná o patrně nejnáročnější předmět, který vyučuji. Postupem času jsem se nakonec dostal k výuce biochemie a v současné době jsem garantem předmětů Biochemie I a II. Dále se podílím na výuce předmětu Technická mikrobiologie, k jehož vývoji jsem také přispěl několika laboratorními úlohami. Ke všem uvedeným předmětům vypracovávám a průběžně aktualizuji elektronické opory, které jsou našim studentům k dispozici na internetu. Od počátku jsem se rovněž zapojil do vedení studentů při práci na jejich absolventských pracích. Každý rok svého působení na vysoké škole jsem vedl nejméně jednu, zpravidla dvě, diplomové a po jejich zavedení též bakalářské práce. Některé z těchto prací získaly různá ocenění ať už na různých domácích přehlídkách absolventských prací tak v rámci interní soutěže studentské vědecké činnosti. Po roce 2005 jsem se začal věnovat také výchově studentů doktorského studia nejprve jako školitel specialista a později též v roli školitele. Vždy jsem se snažil a snažím, aby doktorské studium splnilo všechny aspekty, které má mít, a za které považuji, prostor pro tvořivou práci a iniciativu studenta, finanční a materiální zabezpečení studia, plnění časového plánu a přiměřeně dlouhý pobyt studenta na zahraničním partnerském pracovišti.

5

1 ÚVOD Následující text přináší přehled problematiky biodegradabilních polymerů a studia jejich biodegradace za různých podmínek. Text je členěn do kapitol, které přináší úvod do problematiky a dále odpovídají jednotlivým studovaným materiálům, přičemž pozornost je věnována pouze materiálům se kterými autor textu přímo pracoval. Text tedy zároveň přináší přehled témat souvisejících s procesy biodegradace polymerů studovaných autorem v průběhu jeho akademické kariéry. U každé kapitoly je navíc na závěr shrnut příspěvek autora k dané dílčí problematice.

6

2 ÚVOD DO PROBLEMATIKY BIODEGRADABILNÍCH POLYMERŮ Především ve druhé polovině dvacátého století byla historie technologického pokroku výrazně ovlivněna rozvojem možností v oblasti vývoje a výroby polymerních materiálů, které postupně pronikly snad do všech oblastí. Některé z polymerních materiálů označované jako komoditní plasty se pak vyrábí opravdu v obrovském objemu (polyetylen, polypropylen, polyvinylchlorid, polystyren,…), například v roce 2008 čísla hovoří o celkové světové roční produkci dosahující 245 miliónů tun [1]. Zatímco na počátku své historie byly polymerní materiály vnímány a používány jako často neplnohodnotná levná náhrada materiálů klasických, dnes jsou ceněny a využívány především pro své unikátní vlastnosti. V souvislosti s vysokým objemem produkce, dostupnou cenou, a jak bylo zmíněno unikátními vlastnostmi, pronikly polymerní materiály velmi výrazně také do obalových aplikací, což jsou ve své podstatě výrobky poměrně krátkého životního cyklu. Následkem tohoto vývoje se postupně začal objevovat palčivý problém plastového odpadu. Problematika plastového odpadu je u nás poměrně skrytá, vzhledem k vysoce propracovanému a poměrně funkčnímu systému odpadového hospodářství a relativně dobře fungující restrikci; především dané právními předpisy hlavně zákona o odpadech a zákona o obalech. Naopak očividné jsou popsané problémy v zemích s méně rozvinutým systémem nakládání s odpady, například v zemích rozvojových, kde plastový odpad často končí přímo na ulici či v přírodě a na některých místech může tvořit v podstatě souvislý pokryv. Paradoxně k tomu přispěl i technologický pokrok, kdy na počátku ve venkovních podmínkách poměrně málo trvanlivé materiály byly postupně vybaveny stabilizačními aditivy, které jim spolu s jejich přirozenými fyzikálně chemickými vlastnostmi daly nebývalou stabilitu [2]. Specifická je problematika plastového odpadu, který se nachází v moři. První část tohoto odpadu tvoří klasický plastový odpad, který v závislosti na své hustotě plave na hladině či klesá ke dnu. Hlavně plovoucí odpad a jeho úlomky pak mohou vstupovat do potravinového řetězce a mechanicky působit zdravotní problémy či smrt volně žijících živočichů. Známým se stal pojem „The great pacifik garbage patch“, což je prostor v severním pacifiku, kde se vlivem mořského proudění úlomky plovoucího plastového odpadu přirozeně shromažďují. Vážnější problémy působí zbytky rybářských sítí, které představují pro velké mořské živočichy bezprostřední smrtelné nebezpečí. Tato problematika se v současné době již intenzivně řeší a mnoho států již přijalo legislativní opatření přikazující použití sítí z degradabilních materiálů [3]. Tato problematika je v posledních letech v centru pozornosti pochopitelně převážně přímořských států a na její řešení a výzkum s tím související jsou vynakládány nemalé prostředky, mimo jiné prostřednictvím evropských fondů, a je tedy stále velmi perspektivní. Existuje pochopitelně více cest řešení problematiky odpadů z polymerních materiálů. Primárním cílem by jistě měla být snaha o prevenci produkce odpadu u zdroje, tj. například omezení často nesmyslné produkce několikanásobných obalů. Pravdou ovšem zůstává, že ačkoli je tato zásada vtělena i do naší legislativy, její praktické prosazení je pravděpodobně do důsledků nemožné. Další velice perspektivním směrem, který přispívá k omezené produkci odpadů z plastů, je materiálová recyklace. Jedná se o velmi komplexní problematiku, jejímuž výzkumu se věnuje již řadu let nemalé úsilí. Postupem času se bohužel ukazuje, že vzhledem k vysoce sofistikovaným a vysoce výkonným zpracovatelským technologiím je použití recyklovaných materiálů omezené především na výrobky s nižší technologickou náročností a tedy logicky nižší přidanou hodnotou a tudíž často není ekonomicky výhodné. Není možno zavrhovat ani možnost takzvané energetické recyklace tj. spálení odpadů ve spalovně pevných odpadů a získání energie. Plasty všeobecně, ve srovnání s jinými typy odpadů a za dodržení technologických předpokladů, mohou být spalovány, nepředstavují při spalování

7

nebezpečí a mají poměrně vysokou výhřevnost. Určitá opatrnost je na místě při spalování PVC. Energetická recyklace se v kontextu ostatních možností jeví jako bezpečnější a k životnímu prostředí šetrnější alternativa než skládkování. Vlivem politických rozhodnutí je však tento způsob využívání tuhých odpadů u nás minoritní, vzhledem k nízké kapacitě spaloven, a tento stav se nezmění bez zásahu vlády a legislativních změn. Konečně, jedním z přístupů, které mohou alespoň pro vybrané aplikace přispět k řešení problematiky plastového odpadu je vývoj, výroba a použití biodegradabilních polymerů. Je nutné zdůraznit, že biodegradabilní polymerní matriály jsou a budou vhodné jen pro vybrané aplikace s ohledem na specifické vlastnosti daného materiálu, které se mohou zásadně lišit, a není univerzálním řešením problematiky plastového odpadu (Obr. 1).

Obr. 1. Aplikace polymerních umlčovacích filmů na povrch půdy Existuje několik přístupů, které mohou v principu k získání biodegradabilního materiálu vést. Je to úprava chemické struktury konvenčního polymeru [4], nebo jeho aditivace [5], případně cílené hledání a syntéza vhodné chemické struktury biodegradabilního polymeru [6] Samostatnou problematikou v poslední době stále více populární je pak získávání materiálů z takzvaných obnovitelných zdrojů. I když zde existuje určitý průnik s množinou biodegradabilních materiálů, nesouvisí tyto dvě skupiny materiálů přímo. Naopak existují pokusy produkovat z obnovitelných zdrojů i konvenční polymery a obecně materiály, které jsou dlouhodobě stabilní a jsou proto použitelné v odpovídajících aplikacích, jako je stavebnictví, nebo automobilový průmysl [7].

8

3 BIODEGRADACE POLYMERNÍCH MATERIÁLŮ S přibývající sumou znalostí o povaze a schopnostech mikroorganismů se zdá, že téměř jakákoli organická molekula může v přírodě podlehnout biodegradaci. Syntetické polymery představují většinou struktury, které nejsou po chemické stránce příliš komplikované a u nichž je cesta biodegradace poměrně dobře představitelná. Přesto jsou polymerní materiály často velmi stabilní a jejich biodegradace je obtížná. Příčinou tohoto jevu jsou spíše než chemické strukturní vlastnosti molekul polymerů některé jejich vlastnosti fyzikálního charakteru, které biodegradaci brání. Pevné ve vodě nerozpustné polymerní materiály mají jednotlivé molekuly těsně uspořádány, k jejich mechanickým vlastnostem významně přispívá propletení jednotlivých mimořádně dlouhých molekul. Je tedy velmi obtížné jednotlivé molekuly oddělit a přístup k jejich vazbám a ataku na ně je ztížen. Enzymatický atak tak probíhá pouze na povrchu materiálu a jen na omezeném počtu přístupných vazeb. 3.1

MOBILITA POLYMERNÍCH ŘETĚZCŮ

Mobilita polymerních řetězců je rozhodující pro umožnění enzymatického ataku vhodných vazeb. Je rovněž důležitá pro umožnění pronikání malých molekul do nitra materiálu, přičemž tyto malé molekuly jsou faktory chemické/abiotické degradace materiálu. Parametrem, který globálně charakterizuje mobilitu řetězců určitého polymeru je jeho teplota skelného přechodu. Dá se konstatovat, že biodegradace daného materiálu je usnadněna pokud probíhá nad teplotou skelného přechodu materiálu [8]. Zároveň je třeba vzít do úvahy teplotní optimum funkce daného biologického činitele. Popsané faktory mohou být důležité například v případě biodegradace PLA, kde je teplota skelného přechodu cca. 58 °C blízká biodegradaci za termofilních kompostovacích podmínek. S uspořádáním polymerních řetězců souvisí i semikrystalický charakter některých polymerů. Dlouhé polymerní řetězce mají obecně díky svému propletení problém vůči sobě zaujmout pravidelné uspořádání. Pro některé polymery, jejichž molekulární struktura to umožňuje, je charakteristické, že v části objemu je takové pravidelné uspořádání, které se blíží uspořádání krystalickému, dosaženo. Má se za to, že tyto krystalické domény jsou zvláště odolné vůči degradaci, neboť polymerní řetězce v nich mají obzvláště malou pohyblivost a jsou těsně uspořádány, což dále znesnadňuje difuzi nízkomolekulárních látek do polymeru a atak vazeb [9]. V případě semikrystalických polymerů jsou patrně přednostně atakovány domény amorfní, což následně může vést reorganizaci uspořádání řetězců. Tento jev může vysvětlit v některých případech pozorovaný nárůst krystalinity v průběhu biodegradace. 3.2

ABIOTICKÁ DEGRADACE MOLEKUL POLYMERŮ

Polymery přirozeně podléhají degradaci, která vede ke štěpení jejich řetězců a změnám jejich vlastností. Podle charakteru polymerní molekuly se v případě polymerů s uhlíkovým páteřním řetězcem jedná o reakce oxidační, které zpravidla mají radikálový charakter a mohou být iniciovány UV zářením, či teplem a významně ovlivněny přítomností stop nečistot (např. přechodných kovů jako reziduí katalytických systémů použitých při výrobě), případně defektů v polymerním řetězci. V případě polymerů s heteroatomem v hlavním řetězci přichází do úvahy i hydrolytické štěpení přítomnými molekulami vody. V průběhu historického vývoje polymerních materiálů se poměrně záhy objevila potřeba polymery proti degradaci chránit a to jednak v průběhu zpracování taveniny polymeru za poměrně vysokých teplot, tak posléze v průběhu užitné doby daného materiálu. V případě biodegradabilních materiálů se otázka použití stabilizátorů doposud nezdála být důležitou, neboť byly prozatím zamýšleny především pro aplikace s krátkým životním cyklem, s vývojem poznání se však objevují myšlenky na přípravu

9

materiálů s programovatelnou délkou životního cyklu, případně využití materiálů pocházejících s obnovitelných zdrojů k přípravě materiálů pro trvanlivé aplikace [10,11]. Obecně se dá konstatovat, že abiotická degradace polymerů, vždy do určité míry předchází a provází degradaci biologickou a oba mechanismy koexistují a mohou se v závislosti na situaci doplňovat, nebo i podmiňovat. Pro iniciaci biodegradace je často důležité uvolnění ve vodě rozpustných oligomerů z hmoty polymeru. Významným faktorem může být rovněž narušení povrchu tělesa polymerního materiálu vedoucí ke zvětšení aktivního povrchu, či zvýšení hydrofilicity povrchu opět zpravidla podporují biologický atak. Reálné polymerní materiály (i ty zamýšlené jako biodegradabilní) jsou často směsí několika polymerů s přídavkem dalších aditiv, kde složení takového materiálu je motivováno především ekonomickými faktory, zajištěním dobré zpracovatelnosti materiálu a uspokojivých mechanických vlastností výsledného produktu. Tyto další faktory následně ovlivňují biodegradabilitu i abiotickou oxidaci materiálu. 3.3

BIOENERGETIKA BIODEGRADACE POLYMERŮ

V principu je degradace polymerů pro mikroorganismy způsobem získávání energie. Polymer slouží v tomto případě jako substrát, jehož oxidací jsou získány elektrony, které jsou dále transportovány na vhodný akceptor za konzervace využitelné energie. Proto, aby tento proces mohl je fungovat, je nutné, aby polymer, nebo jeho fragmenty dosáhli reakčních center enzymů zapojených do příslušných řetězců přenosu elektronů. Takové enzymy z principu nemohou být extracelulární, mohou se nalézat v periplasmatickém prostoru, cytoplasmatické membráně eventuálně v cytoplasmě. Substrát tedy musí překonat minimálně buněčnou stěnu (eventuelně vnější membránu), aby mohl mikroorganismu přinést nějaký energetický zisk. Principálně je možné si představit dva mechanismy, které k tomu mohou vézt (obr. 2).

Chemické a fyzikální faktory Specifické extracelulární enzymy Nespecifické extracelulární enzymy

Buňka

Nepolární polymer Polární polymer Degradační produkty Obr. 2.: Mechanismus degradace a asimilace makromolekuly polymeru mikroorganismy

10

V případě ve vodě rozpustných polymerů lze předpokládat, že se volný pohyblivý hydrofilní konec řetězce, nebo smyčka řetězce, prosmýkne hydrofilním pórem v buněčné stěně do periplasmatického prostoru a tam může být atakován periplasmatickými enzymy napojenými na dýchací řetězec. Takový mechanismus se předpokládá u degradace PVA a PEG gram-negativními bakteriemi. Specifický mechanismus můžeme najít v případě degradace alginátu bakteriemi rodu Sfingomonas, které vytvářejí specifický proteinový komplex schopný transportovat volný konec řetězce přes obě membrány až do cytoplasmy, kde je poté štěpen. Popisovaná struktura je vskutku výjimečná, je dokonce tak velká, že je viditelná i elektronovým mikroskopem. U nepolárních ve vodě nerozpustných polymerů se nedá předpokládat, že by jejich řetězec mohli buněčnou stěnou proniknout a bude zde asi nutné působení extracelulárních enzymů, nebo abiotických procesů, které zajistí tvorbu menších fragmentů schopných proniknout barierami buňky. Teoreticky je možno také předpokládat mechanismus, který by se dal označit za kometabolický rozklad polymerů. Mikroorganismy schopné rozkládat lignocelulosový materiál produkují řadu velmi účinných extracelulárních enzymů se širokou substrátovou specificitou a enzymových systémů produkujících silně oxidující molekuly a radikály. Někteří autoři předpokládají, že se takové mikroorganismy mohou takto nespecificky účastnit degradace polymerů [12], nicméně takový předpoklad nelze za současného stavu poznání označit za dostatečně prokázaný.

11

4 PROOXIDANTY PRO KONVENČNÍ POLYMERY Na první pohled patrná část komunálního a průmyslového odpadu je tvořena polyethylenovými (PE) fóliemi, které jsou produkovány v masivním množství jako obalový materiál, kde typickým příkladem pro konečného uživatele jsou nákupní tašky a všemožné sáčky. Polyethylen je také používán ve velkém množství v zemědělství pro konstrukci fóliovníků, nebo se přímo aplikuje na povrch půdy, jako tzv. mulčovací filmy, a proto panují určité obavy, zda obsah PE nemůže ohrozit kvalitu půdy. V průběhu času se objevily dva možné přístupy k řešení [13]. První z nich je založen na zavedení karbonylové skupiny přímo do hlavního řetězce PE, nebo na pozicích krátkých větví (proces Guillet) přímo při výrobě PE pomocí kopolymerace s vhodnou molekulou. Karbonylové skupiny pak slouží jako reaktivní centra pro fotolytického štěpení řetězce polymeru. Přístup, který nejlépe respektuje současnou technologii zpracování, spočívá v použití speciálních aditiv tzv. prooxidantů. Těmito látkami mohou být různé komplexy přechodných kovů zejména Fe, Co [14] a Mn [15], které zvyšují rychlost oxidace vzdušným kyslíkem a štěpení PE řetězů pod vlivem světla a / nebo tepla. Uvedený přístup má rovněž za následek fragmentaci PE fólie a řeší problém vizuálního znečištění (Obr. 3.)

Obr. 3. Zjednodušené schéma abiotické degradace PE s obsahem prooxidantů působením vzdušného kyslíku, světla a / nebo tepla. PH, polymerní řetězce; L, vhodný ligand. 4.1

STUDIUM BIODEGRADACE POLYETYLENU S PROOXIDANTY

Existují v zásadě dva přístupy k experimentům studujícím biodegradaci PE. První využívá přírodní komplexní média obsahující smíšená mikrobiální společenstva napodobující biodegradaci in situ, jako například v půdě nebo v kompostu. Druhou možností je práce s definovanými mikrobiálními kmeny v syntetickém médium, kde mohou být experimenty přesně kontrolovány a reprodukovány. 4.2 STUDIUM BIODEGRADACE PE S DEFINOVANÝMI MIKROBIÁLNÍMI KMENY Přes značný počet pokusů s různými mikroorganismy a vzorky PE různými způsoby upravené, je třeba přiznat, že biodegradace nějaké podstatné části hmoty PE nebyla dosud spolehlivě prokázána. Bylo naproti tomu prokázáno, že mikroorganismy mohou růst na povrchu materiálu (Obr. 4) a konzumovat nízkomolekulární sloučeniny vytvářené abiotickou oxidací [16,17,18]. Někteří autoři pozorovali na vzorcích známky bioeroze [13,14]. Ve většině studií autoři pozorovali období rychlého růstu na začátku inkubace v důsledku konzumace případných aditiv a / nebo nízkomolekulárních oxidačních produktů. Po této počáteční fázi metabolická aktivita klesla a další

12

postup biodegradace je poměrně nesnadné odhalit. S pomocí stanovení ATP a ADP bylo prokázáno, že v průběhu mnoha měsíců po počátečním rychlém období růstu mikroorganismy stále získávají energii z oxidované PE fólie, nicméně v poměrně omezené míře [18].

Obr. 4. SEM snímky testovaných materiálů po přibližně 100 dnech inkubace s uvedenými mikroorganismy a kontrolními vzorky inkubovanými bez mikroorganismů (abiotické). (a) Oxidovaný HDPE, abiotická kontrola; (b) oxidovaný HDPE s R. rhodochrous; (c) oxidovaný LDPE s M. alpina; (d) oxidovaný LDPE s N. asteroides; (e) oxidovaný LDPE s R. rhodochrous; (f) oxidovaný LDPE abiotická kontrola [18]. 4.3

BIODEGRADACE POLYETYLENU V KOMPLEXNÍCH PROSTŘEDÍCH

Zatímco experimenty s definovanými kmeny v syntetických médiích nepřinesly nesporný kvantitativní důkaz biodegradace, některé výsledky získané během experimentů v prostředí půdy,

13

nebo v kompostovacích podmínkách byly povzbudivé. Chiellini [19] sledoval vývoj oxidu uhličitého při biodegradaci LDPE s prooxidanty. Před zkouškou biologické rozložitelnosti byl materiál inkubován 44 dnů při teplotě 55 °C, přičemž tato thermo-oxidace způsobila pokles MW na 6,7 kDa. Vzorky byly poté smíchány s inertním materiálem, lesní půdou nebo vyzrálým kompostem jakožto mikrobiálním inokulem a byly inkubovány při 55 °C. Za zhruba jeden rok dosáhl rozsah mineralizace 50-60 %, v případě půdních podmínek více než 80 %. Další kompostovací experiment je popsán v práci Jakubowicz [15]. Jeho LDPE fólie s prooxidanty byla také tepelně předem ošetřena do té míry, že průměrná MW klesla na méně než 5000 Da. Ihned poté byl zahájen experiment a byl zaznamenáván vývoj CO2, který během následující šesti měsíců dosáhl úrovně odpovídající 60 % mineralizace. Potvrdil se rovněž význam typu PE, kde míra biodegradace LDPE byla vždy významně vyšší ve srovnání s HDPE [20]. Výsledky z uvedených prací poskytují významné důkazy podporující myšlenku o biologické rozložitelnost zkoumaného materiálu také proto, že experimenty jsou dobře dokumentovány a důkladně srovnány s kontrolními experimenty. PUBLIKACE AUTORA VZTAHUJÍCÍ SE K DANÉ PROBLEMATICE Husarova, L., Machovsky, M., Gerych, P., Houser, J., Koutny, M. Aerobic biodegradation of calcium carbonate filled polyethylene film containing pro-oxidant additives (2010) Polymer Degradation and Stability, 95 (9), pp. 1794-1799. Fontanella, S., Bonhomme, S., Koutny, M., Husarova, L., Brusson, J.-M., Courdavault, J.-P., Pitteri, S., Samuel, G., Pichon, G., Lemaire, J., Delort, A.-M. Comparison of the biodegradability of various polyethylene films containing pro-oxidant additives (2010) Polymer Degradation and Stability, 95 (6), pp. 1011-1021. Koutny, M., Amato, P., Muchova, M., Ruzicka, J., Delort, A.-M. Soil bacterial strains able to grow on the surface of oxidized polyethylene film containing prooxidant additives (2009) International Biodeterioration and Biodegradation, 63 (3), pp. 354-357. Lehocký, M., Sťahel, P., Koutný, M., Čech, J., Institoris, J., Mráček, A. Adhesion of Rhodococcus sp. S3E2 and Rhodococcus sp. S3E3 to plasma prepared Teflon-like and organosilicon surfaces (2009) Journal of Materials Processing Technology, 209 (6), pp. 28712875. Koutný, M., Václavková, T., Matisová-Rychlá, L., Rychlý, J. Characterization of oxidation progress by chemiluminescence: A study of polyethylene with pro-oxidant additives (2008) Polymer Degradation and Stability, 93 (8), pp. 1515-1519. Koutny, M., Lemaire, J., Delort, A.-M. Biodegradation of polyethylene films with prooxidant additives (2006) Chemosphere, 64 (8), pp. 1243-1252. Koutny, M., Sancelme, M., Dabin, C., Pichon, N., Delort, A.-M., Lemaire, J. Acquired biodegradability of polyethylenes containing pro-oxidant additives (2006) Polymer Degradation and Stability, 91 (7), pp. 1495-1503.

14

5 KYSELINA POLYMLÉČNÁ Kyselina polymléčná (PLA) je lineární alifatický termoplastický polyester (Obr. 5)

Obrázek 5: Chemická struktura PLA PLA může být vyrobena buď polykondenzací kyseliny mléčné, nebo ring-opening polymerizací laktidu [8], případně kombinací obou postupů [21]. Kyselina mléčná sama je připravována mikrobiální fermentací sacharidů získaných ze zemědělských produktů například kukuřice a jedná se tedy o materiál, který je získáván z obnovitelných zdrojů [8]. PLA je vysoce transparentní, bezbarvý termoplast s dobrou zpracovatelností, v mnoha aspektech podobný polystyrenu [21]. Vlastnosti PLA mohou být ovlivněny mnoha faktory, včetně zastoupení optických izomerů monomeru, molekulové hmotnosti a podmínek zpracování. Optická čistota polymeru má významný vliv na teplotu tání, rychlost krystalizace a stupeň krystalinity [9]. Je možno připravit PLA amorfní nebo semikrystalickou, kdy opticky čisté polymery se zastoupením D-monomeru do 5 % mají tendenci být semikrystalické, zatímco materiály s nižší optickou čistotou jsou amorfní [15]. Pro stupeň krystalinity jsou důležité rovněž podmínky zpracování, tvorba krystalitů vyžaduje poměrně dlouhou dobu a proto je pro přípravu semikrystalické PLA nutné zajistit pomalé chlazení. PLA má dobrou pevnost v tahu, ale velmi malou pružnost, modul pružnosti je přibližně 4,8 GPa, teplotu skelného přechodu asi 58 °C a teplotu tání přibližně 175 °C [21]. PLA je dobře biodegradovatelná v prostředí kompostu, tendence k biodegradaci za nižších teplot, například v prostředí půdy, je ve srovnání s dalšími alifatickými polyestery, jako je PCL, PHB a PBS nižší [4]. Mechanismus biodegradace PLA zahrnuje nejprve hydrolýzu esterové vazby, po které následuje mikrobiální asimilace ve vodě rozpustných produktů [22]. Obecně platí, že rychlost hydrolýzy se zvyšuje s teplotou, amorfní domény PLA jsou náchylnější k degradaci než krystalické a PLA s nízkou molekulovou hmotností, je degradována snadněji než vysokomolekulární polymer. Na biodegradaci PLA v prostředí kompostu se podílejí především zástupci termofilních aktinomycet (Obr. 6) [23].

Obr 6. Skanovací elektronová mikroskopie PLA na počátku (A) a po 55 dnech (B) inkubace v kompostu při 58 °C.

15

V půdě v reálných podmínkách je biodegradace PLA poměrně pomalá. Příčinou tohoto jevu je patrně pomalá rychlost abiotické hydrolýzy materiálu při nižších teplotách (Obr. 7). Dá se předpokládat a v naší laboratoři jsme k tomu získaly některá podpůrná data, že mikrobiální enzymy obvykle nepůsobí přímo na materiál a nemohou tudíž urychlit depolymeraci materiálu. Mikroorganismy patrně spotřebovávají až následné produkty abiotické hydrolýzy. Určující může být i důležitost termofilních aktinomycet a jejich nízká aktivita za normální teploty v půdě [24,25]. Byly nicméně izolovány i některé mezofilní organismy, které jsou schopné degradace PLA, jedná se zejména o některé gram-negativní bakterie [26].

120

PLA1 58 C PLA1 37 C

100

PLA1 25 C

80 % , a s y l o r 60 d y H 40

20

0 0

20

40

60

80

Dny

Obr. 7. Hydrolýza PLA ve vodném prostředí pH 7 za různých teplot.

PUBLIKACE AUTORA VZTAHUJÍCÍ SE K DANÉ PROBLEMATICE Husárová, L., Pekařová, S., Stloukal, P., Kucharzcyk, P., Verney, V., Commereuc, S., Ramone, A., Koutny, M. Identification of important abiotic and biotic factors in the biodegradation of poly(l-lactic acid) (2014) International Journal of Biological Macromolecules. Article in Press. Pavelkova, A., Kucharczyk, P., Stloukal, P., Koutny, M., Sedlarik, V. Novel poly(lactic acid)poly(ethylene oxide) chain-linked copolymer and its application in nano-encapsulation (2014) Polymers for Advanced Technologies. Article in Press. Rychlý, J., Rychlá, L., Stloukal, P., Koutný, M., Pekařová, S., Verney, V., Fiedlerová, A. UV initiated oxidation and chemiluminescence from aromatic-aliphatic co-polyesters and polylactic acid (2013) Polymer Degradation and Stability, 98 (12), pp. 2556-2563.

16

Stloukal, P., Koutny, M., Sedlarik, V., Kucharczyk, P. Biodegradation of high molecular weight polylactic acid (2012) AIP Conference Proceedings, 1459 (1), pp. 20-22. Stloukal, P., Verney, V., Commereuc, S., Rychly, J., Matisova-Rychlá, L., Pis, V., Koutny, M. Assessment of the interrelation between photooxidation and biodegradation of selected polyesters after artificial weathering (2012) Chemosphere, 88 (10), pp. 1214-1219. Stloukal, P., Kucharczyk, P., Sedlarik, V., Bazant, P., Koutny, M. Low molecular weight poly(lactic acid) microparticles for controlled release of the herbicide metazachlor: Preparation, morphology, and release kinetics (2012) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60 (16), pp. 4111-4119. Kucharczyk, P., Sedlarik, V., Kitano, T., Machovsky, M., Barak, M., Koutny, M., Stloukal, P., Saha, P. Characterization of partially biodegradable poly(L-lactic acid)/Poly(methyl methacrylate) blends as potential biomaterials (2011) Recent Researches in Geography, Geology, Energy, Environment and Biomedicine - Proc. of the 4th WSEAS Int. Conf. on EMESEG'11, 2nd Int. Conf. on WORLD-GEO'11, 5th Int. Conf. on EDEB'11, pp. 341-346.

17

6 POLYVINYL ALKOHOL Polyvinyl alkohol (PVA) je ve vodě rozpustný polymer s čistě uhlíkovým páteřním řetězcem. PVA se vyrábí polymerací vinylacetátu a následnou hydrolýzou vzniklého polyvinylacetátu. Vzhledem k tomu že hydrolýza není záměrně kompletní, vyskytují i v komerčně dodávaném PVA na určitém procentu hydroxylů acetátové skupiny (Obr. 8). Vhodný stupeň acetylace má pozitivní vliv na některé zpracovatelské vlastnosti např. rozpustnost ve vodě. Vzhledem k tomu, že páteřní řetězec PVA je tvořen pouze uhlíkovými atomy, je možná pouze oxidativní cesta jeho štěpení.

Obr. 8. Chemická struktura PVA se zbytkovými acetátovými skupinami. Jsou popsány dvě možné cesty oxidace a štěpení uhlíkového řetězce PVA mikroorganismy [27]. Vzhledem k relativně omezenému úsilí, které bylo věnováno studiu tohoto procesu nelze mít, dle mého názoru, stoprocentní jistotu, že se ve skutečnosti nejedná o mechanismus jeden a předpokládaný druhý mechanismus je jen artefaktem.

2e-

2e-

Obr. 9. Enzymatická oxidace PVA.

18

Prvním krokem je oxidasová, nebo dehydrogenasová reakce na hydroxylové skupině vedoucí k její transformaci na skupinu karbonylovou a opakování oxidace na vedlejší hydroxylové za tvorby diketonu a jeho následné štěpení (Obr. 9). Pro biodegradaci PVA jsou tedy zapotřebí poměrně unikátní enzymové systémy. V případě dehydrogenasové reakce enzym obsahuje jako kofaktor pyrrolochinolinochinon a je pravděpodobné, že se tato reakce odehrává v periplasmě bakterie a je napojena na dýchací řetězec. Potřeba méně obvyklého kofaktoru je také častou příčinou symbiotického charakteru biodegradace, kdy jeden z partnerů disponuje enzymovým systémem pro využívání PVA a druhý má schopnost syntetizovat příslušný kofaktor. V naší laboratoři jsme však pozorovali i symbiotickou degradaci PVA, která nebyla založena na výměně pyrrolochinolinochinonu [28]. Poměrně unikátní enzymový systém nutný pro degradaci PVA je také pravděpodobně příčinou relativně řídkého výskytu PVA degradujících bakterií. Je tedy možno pozorovat, že biodegradace PVA nastává zpravidla v prostředích, kde je možno očekávat vysokou diverzitu a prostorovou mobilitu mikroorganismů. Typicky dochází ke spolehlivé biodegradaci PVA v prostředí aktivovaného kalu, naopak v půdním prostředí, nebo prostředí kompostu s omezenou diverzitou a pohyblivostí mikroorganismů nebývá biodegradace pozorována. Pravděpodobné napojení PVA dehydrogenasy na dýchací řetězec rovněž naznačuje, že by při biodegradaci PVA mohly být využívány i jiné terminální akceptory elektronů než kyslík, a že by tedy biodegradace PVA mohla probíhat i za anaerobních podmínek. Tuto hypotézu se nám podařilo potvrdit a identifikovat příslušný mikroorganismus [29]. PUBLIKACE AUTORA VZTAHUJÍCÍ SE K DANÉ PROBLEMATICE Marušincová, H., Husárová, L., Růžička, J., Ingr, M., Navrátil, V., Buňková, L., Koutny, M. Polyvinyl alcohol biodegradation under denitrifying conditions (2013) International Biodeterioration and Biodegradation, 84, pp. 21-28. Kopčilová, M., Hubáčková, J., Růžička, J., Dvořáčková, M., Julinová, M., Koutný, M., Tomalová, M., Alexy, P., Bugaj, P., Filip, J. Biodegradability and Mechanical Properties of Poly(vinyl alcohol)-Based Blend Plastics Prepared Through Extrusion Method (2013) Journal of Polymers and the Environment, 21 (1), pp. 88-94. Husarova, L., Ruzicka, J., Marusincova, H., Koutny, M. Use of temperature gradient gel electrophoresis for the investigation of poly(vinyl alcohol) biodegradation (2010) International Conference on Development, Energy, Environment, Economics - Proceedings, pp. 157-159. Vaclavkova, T., Ruzicka, J., Julinova, M., Vicha, R., Koutny, M. Novel aspects of symbiotic (polyvinyl alcohol) biodegradation (2007) Applied Microbiology and Biotechnology, 76 (4), pp. 911-917.

19

7 AROMATICKO-ALIFATICKÉ POLYESTERY Jedná se o celou škálu kopolyesterů, kde jsou jako stavební prvky využívány 1,4-butandiol, kyselina tereftalová a kyselina adipová (Obr. 10). Obsah aromatické složky se může teoreticky pohybovat od nuly do 100 %. Několik světových výrobců vyvinulo na tomto základě v podstatě velmi podobný materiál, kde se obsah aromatické složky pohybuje kolem 23%. Takovýto materiál je také často označován jako PBAT (polybutylenadipát-co-butylentereftalát). Proces optimalizace obsahu aromatické složky se v zásadě se dá popsat tak, že obsah alifatické části zlepšuje biodegradabilitu materiálu, zatímco zvýšením obsahu aromatických bloků je možné zlepšit mechanické vlastnosti materiálu a také jeho vlastnosti zpracovatelské [30]. Výsledný materiál má velmi dobré mechanické vlastnosti, je zpracovatelný za podmínek a na zařízeních pro zpracování polyetylenu. Je to rovněž velmi pravděpodobná součást mnoha komerčních biodegradabilních materiálů, u kterých významně zlepšuje mechanické vlastnosti a zpracovatelnost. PBAT může být zařazen mezi materiály získávané z petrochemických zdrojů, i když přinejmenším některé z jeho stavebních bloků mohou být získány i ze zdrojů obnovitelných.

Obr. 10. Chemická struktura PBAT PBAT podléhá biologickému rozkladu za aerobních termofilních podmínek odpovídajících kompostování. Polymer je vzhledem ke své teplotě skelného přechodu v plastickém stavu v celém rozsahu teplot, za kterých může biologická degradace probíhat. Abiotická hydrolýza esterových vazeb u něj na rozdíl od PLA probíhá jen nevýznamnou rychlostí. Pro biodegradaci je patrně kritická přítomnost specifických esteras, které jsou zdá se výlučné pro mikroorganismy patřící do taxonomické skupiny termofilních aktinomycet. Protože se metabolická aktivita těchto mikroorganismů výrazně projevuje až za vyšších teplot (nad 45 °C), je možno významnou biodegradaci PBAT pozorovat až za podmínek odpovídající termofilní fázi kompostování. Naopak se zdá, že mikroorganismy disponující těmito enzymovými aktivitami jsou velmi široce rozšířeny v prostředí. Například náš screening asi 50 půd ukázal přítomnost degradační potenciálu pro PBAT ve všech zkoumaných půdách, lišily se koncentrace těchto specifických mikroorganismů. Podařilo se nám také najít psychrofilní mikroorganismus schopný depolymerace polymeru za laboratorní teploty, což by byl v rámci studia tohoto polymeru unikát. Výzkum tohoto kmene stále pokračuje. Jednou z perspektivních a logických aplikací biodegradabilních polymerů je jejich použití na výrobu polymerních filmů určených pro zemědělské aplikace, například umlčovacích fólií, nebo konstrukčních filmů pro fóliovníky. Vzhledem ke svým vynikajícím mechanickým vlastnostem je PBAT jedním z materiálů vhodných pro tyto aplikace ať jako základní materiál, tak jako složka směsí s dalšími biodegradabilními polymery. Ve venkovním prostředí může vlivem slunečního UV záření docházet k tvorbě radikálů a následným reakcím, které mohou vést k síťování, nebo naopak štěpení polymerních řetězců. Tyto změny mohou rovněž následně ovlivnit biodegradaci materiálu. Ukazuje se, že v případě PBAT převládají vlivem přítomnosti aromatické složky reakce, které vedou k síťování. To způsobuje tvorbu nerozpustného polymerního gelu, jehož frakce, v závislosti na dávce UV záření, může i v přírodních podmínkách obsáhnout v podstatě veškerý materiál. Na rozdíl od původního předpokladu a údajů v literatuře [31] bylo v naší laboratoři ve spolupráci s francouzskými kolegy prokázáno, že takové síťování nemá negativní vliv na biodegradabilitu materiálu. I přes výraznou tvorbu gelové frakce je v materiálu stále o mnoho řádů

20

více štěpitelných esterových vazeb, než příčných síťujících vazeb mezi řetězci polymeru [32,33,34]. Bylo rovněž zjištěno, že na biodegradabilitu tohoto polymeru má kritický vliv morfologie vzorku, přesněji řečeno velikost specifického povrchu vzorku [35,36]. Vzhledem k tomu, že mechanismem biodegradace je v tomto případě enzymatický atak povrchu tohoto ve vodě nerozpustného materiálu, je velikost specifického povrchu pro rychlost procesu rozhodují. Z praktického pohledu to znamená, že dostatečně rychlá bude pouze biodegradace výrobků z PBAT ve formě tenkých filmů, pro jiné výrobky bude vhodné PBAT míchat s dalšími biodegradabilními polymery s rychlejším rozkladem jako je PLA, nebo termoplastických škrob. Degradace domén těchto polymerů totiž povede ke zvýšení velikosti specifického přístupného povrchu PBAT a umožní jeho biodegradaci. PUBLIKACE AUTORA VZTAHUJÍCÍ SE K DANÉ PROBLEMATICE Rychlý, J., Rychlá, L., Stloukal, P., Koutný, M., Pekařová, S., Verney, V., Fiedlerová, A. UV initiated oxidation and chemiluminescence from aromatic-aliphatic co-polyesters and polylactic acid (2013) Polymer Degradation and Stability, 98 (12), pp. 2556-2563. Stloukal, P., Verney, V., Commereuc, S., Rychly, J., Matisova-Rychlá, L., Pis, V., Koutny, M. Assessment of the interrelation between photooxidation and biodegradation of selected polyesters after artificial weathering (2012) Chemosphere, 88 (10), pp. 1214-1219. Dvorackova, M., Stloukal, P., Koutný, M., Gregovska, M. Biodegradability of aliphaticaromatic copolyester in aqueous anaerobic and aerobic environments (2011) Recent Advances in Environment, Energy Systems and Naval Science - Proc. of the 4th Int. Conf. on Environmental and Geological Science and Engineering, EG'11, ICESEEI'11, MN'11, pp. 141-146. Stloukal, P., Sedlarik, V., Husarova, L., Kasparkova, V., Koutny, M. Preparation of submicroparticles based on biodegradable co-polyester (2010) International Conference on Development, Energy, Environment, Economics - Proceedings, pp. 122-127. Stloukal, P., Jandak, J., Husarova, L., Koutny, M., Commereuc, S., Verney, V. Identification of several factors affecting biodegradation of aromatic-aliphatic copolyester (2010) International Conference on Development, Energy, Environment, Economics - Proceedings, pp. 118-121.

21

8 APLIKACE MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝCH METOD VE STUDIU BIODEGRADACE POLYMERŮ Reálně probíhá biodegradace polymerů v komplexních prostředích jako půda, prostředí kompostu, nebo prostředí vodní, kde musíme uvažovat přítomnost komplexního společenstva mikroorganismů. Je nutno předpokládat, že na vlastním procesu biodegradace spolupracuje několik, či dokonce větší množství, druhů mikroorganismů, které jsou v tomto procesu svázány symbiotickými vztahy. Dosavadní informace o detailech mikrobiologie biodegradace polymerů byly naopak zpravidla získány v laboratorních podmínkách pomocí experimentů s jednotlivými čistými mikrobiálními kmeny, případně s velmi jednoduchými konsorcii. Tyto poznatky jsou nepochybně velmi cenné a ukázaly, jaké mikroorganismy se v principu na procesech mohou podílet, na druhou stranu v sobě mohou skrývat přílišná zjednodušení, nebo dokonce být v rozporu s tím, jak daný proces probíhá v reálných podmínkách. V uplynulých asi 15 letech zaznamenaly v environmentální mikrobiologii značný rozmach metody založené na analýze DNA přítomných mikroorganismů. Tyto metody umožňují detekovat, eventuelně i kvantifikovat jednotlivé mikroorganismy, nebo taxonomické skupiny a sledovat jejich vývoj v čase a prostoru a reakce jejich zastoupení na vnesené podněty. V principu jsou takové metody tzv. nezávislé na kultivaci, to znamená, že mohou postihnout i mikroorganismy klasickými mikrobiologickými metodami nezaznamenatelné. Uvádí se, že v závislosti na prostředí je přes 90 % přítomných mikroorganismů nekultivovatelných. V naší laboratoři jsme se rozhodli některé vybrané metody aplikovat na problematiku biodegradace polymerů v komplexních prostředích a pokusit se získat některé relevantní informace o mikrobiologii těchto procesů. První aplikovanou metodou bylo dělení fragmentů DNA pomocí elektroforesy v teplotním gradientu (TGGE). Tato metoda umožňuje vizualizovat komplexní mikrobiální společenstvo a sledovat jeho odpověď na přítomnost polymeru a dynamiku v čase. Jako určitý doplněk bylo dále použito klonování těchto DNA fragmentů a jejich sekvenace. Ke kvantifikaci a sledování koncentrace DNA sekvence související s určitým vybraným mikroorganismem byla použita metoda kvantitativní řetězové polymerázové reakce (qPCR). Uvedené na analýze DNA založené a na kultivaci nezávislé metody byly zatím v naší laboratoři použity ve studii zkoumající mikrobiologii PVA za denitrifikačních podmínek (Obr. 11) [36] a ve studii biodegradace PLA za kompostovacích podmínek [24]. V obou případech tyto metody poskytly zajímavé nové informace, nebo upřesnění dříve postulovaných předpokladů. PUBLIKACE AUTORA VZTAHUJÍCÍ SE K DANÉ PROBLEMATICE Husárová, L., Pekařová, S., Stloukal, P., Kucharzcyk, P., Verney, V., Commereuc, S., Ramone, A., Koutny, M. Identification of important abiotic and biotic factors in the biodegradation of poly(l-lactic acid) (2014) International Journal of Biological Macromolecules. Article in Press. Marušincová, H., Husárová, L., Růžička, J., Ingr, M., Navrátil, V., Buňková, L., Koutny, M. Polyvinyl alcohol biodegradation under denitrifying conditions (2013) International Biodeterioration and Biodegradation, 84, pp. 21-28.

22

Obr. 11. TGGE profily mikrobiálního společenstva degradujícího PLA. M, DNA marker; čísla na horním okraji gelu znamenají dny od počátku degradačního eventuelně kontrolního experimentu. B a D, mikrobiální společenstva z kultur, které byly sekvencí přeočkování obohaceny o degradéra PVA. Mikroorganismy odpovídající očíslovaným proužkům byly identifikovány.

23

9 ZÁVĚR V oblasti výzkumu biodegradace polymerů se za posledních asi dvacet let podařilo ustavit několik základních obecněji platných představ, avšak na druhou stranu je zřejmé, že každý polymer, případně polymerní matriál je nutno zkoumat individuálně bez generalizujících zobecnění a zjednodušení. Mnoho otázek zvláště v oblasti mikrobiologie biodegradace a vztahu fyzikálních a biologických procesů musí být dále zkoumáno a upřesněno. Cílem je přinést větší kontrolu do řízení doby života materiálů v konkrétních aplikacích při zachování, nebo i vylepšení uživatelských vlastností daných materiálů. Takové poznatky nepochybně přinesou i rozšíření stávajících a objeveních zcela nových aplikací biodegradabilních polymerů.

24

LITERATURA 1.

Compelling facts about plastics; An analysis of European plastics production, demand and recovery for 2008, Plastics Europe.

2.

Webb, H.K., Arnott, J., Crawford, R.J., Ivanova, E.P. Anthony L. Andrady Plastics and the Environment John Wiley & Sons, 2003 ISBN 0471095206.

3.

Plastic degradation and its environmental implications with special reference to poly(ethylene terephthalate). Polymers 2013, 5, 1-18.

4.

Shah, A.A., Hasan, F., Hameed, A., Ahmed, S. Biological degradation of plastics: A comprehensive review. Biotechnology Advances 2008, 26, 246-265.

5.

Koutny, M., Lemaire, J., Delort, A.-M. Biodegradation of polyethylene films with prooxidant additives. Chemosphere 2006, 64, 1243-1252.

6.

Okada, M., Chemical syntheses of biodegradable polymers. Progress in Polymer Science 2002, 27, 87-133.

7.

Kobayashi, S. Green polymer chemistry: Recent developments. Advances in Polymer Science 2013, 262, 141-166.

8.

Ammala, A., Bateman, S., Dean, K., Petinakis, E., Sangwan, P., Wong, S., Yuan, Q., Yu, L., Patrick C., Leong, K.H. An overview of the recent developments in polylactide (PLA) research. Progress in Polymer Science 2011, 36, 1015-1049.

9.

Y. Tokiwa, A. Jarerat. Biodegradation of poly ( L -lactide). Biotechnology Letters 2004, 26, 771-777.

10.

L. Yang, X. Chen, X. Jing. Stabilization of poly(lactic acid) by polycarbodiimide. Polymer Degradation Stability 2008, 93, 1923-1929.

11.

J. A. Cicero, J. R. Dorgan, S. F. Dec, D. M. Knauss. Phosphite stabilization effects on twostep melt-spun fibers of polylactide. Polymer Degradation Stability 2002, 78, 95-105.

12.

Foust, C.J., Mills, R.R., Haas, T., Castevens, C., Ottenbrite, R.M. Biodegradation of LDPE/cellulose blends by common fungi. Macromolecular Symposia 1997, 123, 1-8.

13.

Arnaud, R., Dabin, P., Lemaire, J., Al-Malaika, S., Chohan, S., Coker, M., Scott, G., Fauve, A., Maaroufi, A., Photooxidation and biodegradation of commercial photodegradable polyethylenes. Polymer degradation and Stability 1994, 46, 211-224.

14.

Weiland, M., Daro, A., David, C., Biodegradation of thermally oxidized polyethylene. Polymer degradation and Stability 1995, 48, 275-289.

15.

Jakubowicz, I., Evaluation of degradability of biodegradace polyethylene (PE). Polymer degradation and Stability 2003, 80, 39-43.

16.

Albertsson, A.-C., Erlandsson, B., Hakkarainen, M., Karlsson, S., Molecular weight changes and polymeric matrix changes correlated with the formation of degradation products in biodegraded polyethylene. Journal of Polymers and the Environment 1998, 6, 187-195.

17.

Bonhomme, S., Cuer, A., Delort, A.-M., Lemaire, J., Sancelme, M., Scott, G., Environmental biodegradation of polyethylene. Polymer degradation and Stability 2003, 81, 441-452.

25

18.

Koutny, M., Sancelme, M., Dabin, C., Pichon, N., Delort, A.-M., Lemaire, J., Acquired biodegradability of polyethylenes containing prooxidant additives. Polymer degradation and Stability 2006, 91, 1495-1503.

19.

Chiellini, E., Corti, A., Swift, G., 2003. Biodegradation of thermally oxidized, fragmented low density polyethylenes. Polymer degradation and Stability 2003, 81, 341-351.

20.

Fontanella, S., Bonhomme, S., Koutny, M., Lemaire, J., Delort, A.-M. Comparison of the biodegradability of various polyethylene films containing pro-oxidant additives. Polymer Degradation and Stability 2010, 95, 1011-1021.

21.

Gruber, P. and O'Brien, M. 2005. Polylactides “NatureWorks® PLA”. Biopolymers Online. 4.

22.

Itavaara, M., Karjomaa, S., Selin, J.F. Biodegradation of polylactide in aerobic and anaerobic thermophilic conditions. Chemosphere 2002, 46, 879-85.

23.

Tomita, K., Nakajima, T., Kikuchi, Y., Miwa, N. Degradation of poly(L-lactic acid) by a newly isolated thermophile. Polymer Degradation and Stability 2004, 84, 433-438.

24.

L. Husárova, S. Pekařová, P. Stloukal, P. Kucharzcyk, V. Verney, S. Commereuc, A. Ramone, M. Koutny. Identification of important abiotic and biotic factors in the biodegradation of poly(L-lactic acid). International Journal of Biological Macromolecules, In Press.

25.

Rudnik, E., Briassoulis, D. Degradation behaviour of poly(lactic acid) films and fibres in soil under mediterranean field conditions and laboratory simulations testing. Industrial Crops and Products 2011, 33, 648-658.

26.

Kim, M.N., Park, S. T. Degradation of Poly(L-lactide) by a mesophilic bacterium. Journal of Applied Polymer Science 2010, 117, 67-74.

27.

Emo Chiellini, Andrea Corti, Salvatore D’Antone, Roberto Solaro Biodegradation of poly (vinyl alcohol) based materials Progress in Polymer Science 2003, 28, 963-1014.

28.

Vaclavkova, T., Ruzicka, J., Julinova, M., Vicha, R., Koutny, M. Novel aspects of symbiotic (polyvinyl alcohol) biodegradation. Applied Microbiology and Biotechnology 2007, 76, 911-917.

29.

Marušincová, H., Husárová, L., Růžička, J., Ingr, M., Navrátil, V., Buňková, L., Koutny, M. Polyvinyl alcohol biodegradation under denitrifying conditions. International Biodeterioration and Biodegradation 2013, 84, 21-28.

30.

R. J. Mueller. Biological degradation of synthetic polyesters—Enzymesas potential catalysts for polyester recycling. Process Biochemistry 2006, 41, 2124-2128.

31.

Kijchavengkul, T., Auras, R., Rubino, M., Ngouajio, M., Fernandez, R.T. Assessment of aliphatic-aromatic copolyester biodegradable mulch films. Part II: Laboratory simulated conditions. Chemosphere 2008, 71, 1607-1616.

32.

Verney, V., Commereuc, S., Askanian, H., Collin, S., Koutny, M., Stloukal, P., Perchet, G., Sanvoisin, J., Troquet, J. Interrelation between photodegradation and biodegradation of environmentally degradable polymers (PLA and PBAT). Frontiers in Polymer Science, 2931.5.2011. Lyon, France.

33.

Stloukal, P., Verney, V., Commereuc, S., Rychly, J, Matisova-Rychlá, L., Pis, V., Koutny, M. Assessment of the interrelation between photooxidation and biodegradation of selected polyesters after artificial weathering. Chemosphere 2012, 88, 1214-1219.

26

34.

Rychlý, J., Rychlá, L., Stloukal, P., Koutný, M., Pekařová, S., Verney, V., Fiedlerová, A. UV initiated oxidation and chemiluminescence from aromatic-aliphatic co-polyesters and polylactic acid. Polymer Degradation and Stability 2013, 98, 2556-2563.

35.

Stloukal, P., Jandak, J., Husarova, L., Koutny, M., Commereuc, M., Verney, V. Identification of several factors affecting biodegradation of aromatic-aliphatic copolyester. DEEE 2010 WSEAS conference, Puerto de la Cruz, Tenerife.

36.

Marušincová, H., Husárová, L., Růžička, J., Ingr, M., Navrátil, V., Buňková, L., Koutny, M. Polyvinyl alcohol biodegradation under denitrifying conditions. International Biodeterioration and Biodegradation 2013, 84, 21-28.

27

SEZNAM ZKRATEK MW, molecular weight, molekulová hmotnost PE, polyethylen PLA, kyselina polymléčná PBAT, polybutandioladipát-co-tereftalát PVA, polyvinylalkohol PEG, polyethylenglykol TGGE, temperature gradient gel electrophoresis, gelová elektroforesa v teplotním gradientu PCR, polymerase chain reaction, polymerasová řetězová reakce qPCR, quantitative polymerase chain reaction, kvantitativní polymerasová řetězová reakce

28

ABSTRAKT Byla studována biodegradace vybraných polymerů s ohledem na mikrobiologii tohoto procesu a vztahů mezi fyzikálními a chemickými procesy, vlastnostmi materiálů a rychlostí jejich biodegradace v různých prostředích. Snahou bylo získat informace, které co nejvíce odpovídají reálným podmínkám, za kterých biodegradace v přírodě probíhá. Podařilo se získat řadu poznatků o vztahu biodegradace a abiotické degradace způsobené UV zářením a chemickou hydrolýzou v případě polyethylenu s prooxidačními aditivy, kyseliny polymléčné a aromaticko-alifatických polyesterů. V případě polyvinyl alkoholu byla poprvé prokázána biodegradace za anaerobních denitrifikačních podmínek a byl identifikován příslušný degradující mikroorganismus. Konečnou snahou je větší kontrola životního cyklu polymerních materiálů s ohledem na konkrétní aplikaci.

ABSTRACT The biodegradation of selected polymer was studied with respect their microbiology and relationship between physical and chemical processes, properties of the materials and rates of their biodegradation in various environments. The goal of these studies was to gain information relevant to the real conditions of the biodegradation in different natural environments. Some new findings were gathered about the relationship between the biodegradation and the abiotic degradation promoted with UV irradiation and chemical hydrolysis in cases of polyethylene with prooxidant additives, polylactic acid, and aromatic-aliphatic polyesters. In the case polyvinyl alcohol the biodegradation was described for the first time under anaerobic denitrification conditions and the degrading microbial strain was identified. The ultimate goal of this research effort was to achieve a better control over the life cycle of the polymeric materials with respect to the given application.

29

ŽIVOTOPIS Doc. Mgr. Marek Koutny, Ph.D. Osobní údaje Narozen: Adresa: Národnost: Stav: Telefon: Email:

27.3.1973 ve Zlíně K dálnici 362, 76001 Zlín česká ženatý +420 604 559 681 [email protected]

Vzdělání 1990-1996 Masarykova Universita, Brno, Česká republika, Mgr., biochemie 1996-1999 Masarykova Universita, Brno, Česká republika, Ph.D., biochemie Profesionální a zahraniční zkušenosti 10/1996 Micro-methods of protein purification course, Bayreuth University, Německo 11-12/1998 Výzkumný pobyt, Free University of Amsterdam, Netherlands 1999 -2007 Odborný asistent, VUT Brno, Fakulta technologická, později Universita Tomáše Bati ve Zlíně 5-6/2001 Výzkumný pobyt, Free University of Amsterdam, Netherlands. 2004-2005 Postdoc výzkumný pobyt Blaise Pascal University a CNEP ClermontFerrand, Francie 2007-dosud Docent, Fakulta technologická, později Universita Tomáše Bati ve Zlíně 9/2008 Erasmus (mobilita učitelů), ENSC, Clermont-Ferrand, Francie. 5/2010 „Invited professor“, ENSC, Clermont-Ferrand, Francie. 2/2012 „Invited professor“, Blaise Pascal University, Clermont-Ferrand, Francie. 7/2013 Výuka předmětu „Composting“ v rámci programu Master on the topics of Green Chemistry, University of Sassari, Sardinia, Italy Současná pozice Docent a ředitel Ústavu inženýrství technologie životního prostředí, Fakulta technologická, Universita Tomáše Bati ve Zlíně. Zaměření Biodegradace polymerních materiálů, aplikace molekulárně biologických metod do studia biodegradace, pokročilá respirometrie, výuka, přednášková činnost. Publikační aktivita 32 prací v impaktovaných vědeckých časopisech 270 citací (Scopus) Více než 35 příspěvků na mezinárodních konferencích 2 vyzvané přednášky na mezinárodních konferencích h-index 11 Jazykové znalosti Angličtina, Francouzština, Ruština

30