BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou

BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou

20 AK

→

2018 variant pro peptid složený z 20 AK!!!

Průměrná bílkovina ≈ 300 AK Relativní molekulová hmotnost (bezrozměrné číslo) Molární hmotnost (g/mol) Molekulová hmotnost (MW) - jednotka Dalton (Da) resp. kDa

Klasifikace proteinů 1. 2. 3.

Funkce – specifické, obecné Chemické složení Tvar

1. Funkce obecné:   

zdroj energie a dusíku Účinné pufry (krev, cytosol) Přispívají významně k udržení osmotického tlaku vně i uvnitř buněk

1. Specifické funkce proteinů Typ proteinu

Příklad

Výskyt & funkce

Katalytické (enzymy)

Trypsin DNA polymerasa

Hydrolysa peptidové vazby Synthesa DNA

Regulační (hormony)

Insulin Růstový hormon

Stimulace metabolismu glc Stimulace růstu kostí

Ochranné

Protilátky Interferon

Vazba na cizorodé látky Brání replikaci virů

Skladovací

Kasein Ferritin

Mléčná bílkovina Zásoba Fe v játrech

transportní

Hemoglobin Myoglobin

Transport O2 v krvi Transport/skladování O2 ve svalu

Strukturní

Kolagen Ribosomální proteiny

Vláknité pojivové tkáně Ribosomy

Kontraktilní

Myosin Actin

Svalová vlákna

Genetické funkční proteiny

Histony Represory

Asociace s DNA v chromosomech Blokují expresi genu

Toxické proteiny

Ricin Cholera toxin

Toxický protein z Ricinus communis Bakteriální toxin

2. Chemické složení • Jednoduché • Složené – polypeptidová + neproteinová část     

Metaloproteiny Fosfoproteiny Glykoproteiny Lipoproteiny Nukleoproteiny

Prosthetické skupiny

3. Rozdělení proteinů podle tvaru molekul • Globulární • Fibrilární • Membránové Další možné způsoby dělení proteinů: Podle lokalizace nebo dějů ve kterých působí:  Krevní bílkoviny  Mléčné bílkoviny  Membránové receptory  Elektrontransportní systémy

Primární struktura bílkovin pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci zápis: od N-konce k C-konci N-konec

C-konec

Primární struktura determinuje prostorové uspořádání a funkci proteinů ZÁKONITOSTI: • Primární struktura je zapsána v DNA (gen) • Neexistuje společná sekvence, ani částečně • Kombinace AK bez omezení • Proteiny se stejnou funkcí z jedinců jednoho druhu jsou identické • Polymorfismus bílkovin ("isobílkoviny") - Zákon isopolárních záměn. • Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie)

Homologie proteinů

% identity

% podobnosti

URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY A. Aminokyselinové složení - určení počtu jednotlivých AK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, 100 – 110 ºC, 24 h)

B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. 2 nezávislá specifická štěpení  isolovat štěpy (peptidy) 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců

2. Určení N-koncové AK např.: - DNF - dansyl chlorid

2. Určení C-koncové AK • Specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy)

• Redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu • Hydrazinolýza (NH2-NH2) – aminoacyl hydrazidy AK



3. Edmanova reakce určení pořadí AK v kratších úsecích (peptidech) - reakce s fenylisothiokyanátem

příslušné AK



4. Specifické štěpení polypeptidového řetězce Trypsin – štěpí specificky za basickými aminokyselinami Lys, Arg Chymotrypsin – štěpí za aromatickými aminokyselinami (Phe, Tyr, Trp)

(CNBr – štěpí za Met) •Separace peptidů (chromatografie) •Určení sekvence – Edmanovo odbourání N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑ ↑

leu-val-phe-asp-lys

Leu-Val-Phe

Glu-tyr-gly-ile-arg

Asp-Lys-Glu-Tyr

Ser-phe –thr-lys

Gly-Ile-Arg-Ser-Phe

Cys-pro-ala-trp-lys

Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp

His-met-arg

Lys-His-Met-Arg-Trp

Trp-gly

Gly

↑ ↑



6. Sestavení primární struktury – hledání překrývajících se sekvencí peptidů

N-Leu-Val-Phe-Asp-Lys-Glu-Tyr-Gly-Ile-Arg-Ser-Phe-Thr-Lys-Cys-Pro-Ala-Trp-Lys-His-Met-Arg-Trp-Gly-C

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑ ↑


B. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce (redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním (kam až to jde) 4. 2 nezávislá specifická štěpení  isolovat štěpy (peptidy) 5. Opakovat bod 3 6. Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců (disulfidické vazby)

Kovalentní struktura ( primární struktura + posttranslační modifikace) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Propojení řetězců kovalentními vazbami, disulfidové můstky Odštěpení částí řetězců Úpravy postranních řetězců aminokyselin – nekódované AK Připojení mastných kyselin Glykosylace (Asn, Ser/Thr) Fosforylace (dočasné či trvalé) Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) Metaloproteiny (koordinačně kovalentní vazby různé síly)

1 - 3: jednoduché bílkoviny 4 - 8: složené bílkoviny

2. Odštěpení částí řetězců - příklad

Obecné znaky prostorového uspořádání proteinů (obecně „organisovaných“ biopolymerů) •Nativní struktura (konformace) - prostorové uspořádání, jež umožňuje biopolymeru vykonávat biologickou funkci 1. Nativní struktura odpovídá minimu Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí 2. Nativní struktura je určena kovalentní strukturou 3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. 4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické (primární, kovalentní, sekundární, terciární, kvarterní struktura) 5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformačně dynamické systémy) 6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

Prostorové uspořádání proteinů je dáno primární (kovalentní) strukturou : - Charakter peptidové vazby – planární uspořádání!! - Vlastnosti postranních řetězců

60%

40%

trans konfigurace

Konformace peptidového řetězce

•Torzní úhly Φ a Ψ

Plně natažený polypeptidový řetězec, trans konfigurace – Φ=Ψ=180º až -180 º Sterická omezení

•Ramachandranův diagram – povolené kombinace torzních úhlů

Polyala

polygly

Stericky zakázané jsou takové konformace, v nichž kterákoli nevazebná vzdálenost mezi atomy je menší než odpovídá van der Waalsovým meziatomovým vzdálenostem

Prostorové uspořádání bílkovin je fixováno nekovalentními interakcemi Příklad

Typ interakce

vodíkové vazby:

voda (led) peptidové vazby

neutrální a nabitá skupina elektrostat. interakce* ion-ion

*Vazebná

energie (kJ/mol)

-O-H...O=

17

=N-H...O=C

15

-COO-...HO-CH2-

15

-COO-...+H3N-

20-30

interakce dvou permanentních dipolù

  C+=O-...C+=O-

Londonovy dispersní interakce

mezi dvěma alifatickými atomy C

0,11

mezi dvěma aromatickými kruhy Phe

6

mezi dvěma methylovými skupinami

1,2

mezi dvěma postranními řetězci valinu

6

patrové interakce??

hydrofobní interakce **



2



Sekundární struktura proteinů obecné charakteristiky Linus Pauling, Robert Corey (1951) 

Pravidelné nebo periodické uspořádání polypeptidového řetězce



Vzájemné prostorové uspořádání blízkých částí řetězce



Fixovány především vodíkovými můstky NH …..CO

Předpoklady: • Peptidová vazba a okolní atomy Cα tvoří planární útvar a jsou v trans konfiguraci • Vazebné úhly a meziatomové vzdálenosti v proteinech odpovídají těmto veličinám v malých organických molekulách • Prostorové uspořádání proteinů vyžaduje tvorbu maximálního počtu vodíkových můstků

α-helix a β-struktury

α- helix pravotočivá šroubovice

parametry: Stoupání závitu: 0.54 nm 3,6 Ak zbytku/závit Počet atomů 11

Ochota polypeptidového řetězce tvořit helikální struktury závisí na:

a) Přítomnosti AK zabraňujících tvorbě α-helixu – prolin, hydroxyprolin b) AK s objemnými postranními řetězci c) Iontové interakce – závisí na pH – př. polylys, polyglu

Skládaný list (β-struktura)

Další pravidelné struktury

β-ohyby: -X-gly-pro-YX,Y – polární AK

Pozor: Pravidelné sekundární struktury netvoří celý řetězec

Vyšší pravidelné struktury - motivy

Triosafosfát isomerasa

Terciární struktura Prostorové uspořádání vzdálených částí řetězce Fixace disulfidovými můstky a nekovalentními interakcemi!!

Terciární struktura •Prostorové uspořádání všech částí •Správné uspořádání je podmínkou funkce (biologické aktivity) •Zahrnuje: nevazebné interakce

disulfidové můstky nebílkovinné složky rentgenostrukturní analysa Domény Karbonanhydrasa

• globulární – nižší obsah sek. struktur, core x obal, • fibrilární – vláknité, tyčovité, dlouhé úseky sekundárních struktur

Domény

Kvarterní struktura uspořádání podjednotek

Kvarterní struktura hemoglobinu

Příklady bílkovin s kvarterní strukturou Bílkovina

Rel.mol.hm oligomeru (Da)

Počet podjednotek

hemoglobin (lidský)

64 500

4

2 + 2 podjednotky dvou typů (22 tetramer), přenos kyslíku

-amylasa (lidská)

97 600

2

identické podjednotky, enzym (hydrolytické štěpení škrobu)

alkoholdehydrogenasa (kvasinky)

150 000

4

enzym (katalysuje redukci acetaldehydu na ethanol)

ferritin (lidský)

480 000

20

skladování železitých iontů

glutaminsynthetasa (E.coli)

592 000

12

enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité podjednotky tvoří 2 šestiúhelníky umístěné nad sebou

pyruvátdekarboxylasa (E.coli)

4 400 000

72

enzymový komplex, podjednotky 3 typů, každá katalysuje jednu dílčí reakci

hemocyanin (plži)

8 000 000

160

metaloprotein obsahující Cu2+; přenos O2; dutý válec 40x40 nm

virus tabákové mozaiky

39 300 000

2130

helikálně uspořádané identické podjednotky (rel.m.h. 17 500) tvořící komplex s RNA

Charakter, funkce

Skládání (svinování) proteinů

Levinthal‘s Paradox: We assume that there are three conformations for each amino acid (ex. α-helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is 3100 = 515377520732011331036461129765621272702107522001 ≒ 5 x 1047. If 100 psec (10-10 sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require 5 x 1047 x 10-10 sec ≒ 1.6 x 1030 years. However, folding of proteins takes place in msec to sec order. Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process.

Skládání (svinování) proteinů - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně: 1. malé dočasné periodické struktury 2. supersekundární struktury, strukturní domény a "roztavená" glubule 3. Nativní struktura - závěrečné úpravy za účasti enzymů (peptidylprolin-cis-transisomerasa, proteindisulfid-isomerasa) -

Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky? Chaperony

Vlastnosti proteinů Jsou málo stabilní - denaturují

 Nábojové vlastnosti  Rozpustnost – v závislosti na pI  Denaturace – ztráta nativní konformace  Kooperativita (denaturační přechod)

Příklad: teplotní denaturace Faktory způsobující denaturaci

[] [deg.cm2.dmol-1 ]

-3500

•Fyzikální – teplo, záření

FD

-4500

•Chemické – organická rozpouštědla, soli, kyseliny, zásady, chaotropní činidla (močovina, quanidin HCl), detergenty

-5500 -6500 -7500

FN

-8500

20

30

40

50

teplota [°C]

60

70

80

Kooperativita (příklad hemoglobin x myoglobin) aneb jak struktura ovlivňuje funkci proteinů

Symetrický model popisuje chování hemoglobinu Kooperativní vazba O2 na Hb je řízena allosterickým efektem  vazba jednoho ligandu je ovlivněna vazbou dalšího ligandu (efektoru, modulátoru) o protein je oligomer

o protein existuje ve dvou stavech R a T o T stav má nižší afinitu k ligandu

Příklady struktury některých proteinů •Imunoglobuliny = protilátky

•Funkce – obraný, imunitní systém

•Základní pojmy: antigen, hapten, epitop

Myosin – molekulární motor

α-Keratin

Gly, ser, cys •Protofibrily propojeny S-S můstky

β-keratin (fibroin z hedvábí)

Kolagen • 1/3 Gly, 1/5 Pro or Hyp • Triplet Gly-X-Pro (nebo Gly-X-Hyp) se často opakuje • Levotočivá šroubovice, 3 AK zbytky /otáčku • Superšroubovice pravotočivá ze 3 levotočivých helixů

LH

RH

BÍLKOVINY = PROTEINY Polymery aminokyselin propojených peptidovou vazbou

Recommend Documents