BELSŐ SZERVEK EXTRINSZIK ÉS INTRINSZIK IDEGEINEK INGERÜLETÁTVIVŐ ANYAGAI (FUNKCIONÁLIS BIZONYÍTÉKOK)
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
írta:
Dr. Benkó Rita Gyógyszertudományok Doktori Iskola Vezetője: Dr. Barthó Loránd, egyetemi tanár Program: Vegetatív és szenzoros idegek zsigeri működése és farmakológiája
Program- és témavezető: Dr. Barthó Loránd egyetemi tanár
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar
Pécs, 2006.
2
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke.................................................................................................................................. 4 Általános bevezetés .................................................................................................................................... 5 Az enterális ideghálózatok elrendeződése............................................................................................ 5 Intrinszik neuronok .............................................................................................................................. 7 Extrinszik neuronok ............................................................................................................................. 8 Érző neuronok...................................................................................................................................... 9 Zsigeri szervek (gyomor-béltraktus, urogenitális rendszer) kapszaicin-érzékeny beidegzése ...... 12 A kapszaicin hatása gasztrointesztinális preparátumokon ................................................................. 13 A kapszaicin hatása a vékony- és vastagbélre ............................................................................... 13 A kapszaicin hatása a nyelőcsőre és gyomorra ............................................................................. 15 A kapszaicin hatása az epehólyagra és epevezetékre..................................................................... 15 A kapszaicin hatása a humán gasztrointesztinális simaizomzatra ................................................. 16 A kapszaicin hatása a húgy-ivarszervi simaizomzatra....................................................................... 17 Húgyhólyag és urethra................................................................................................................... 17 Vesemedence és ureter................................................................................................................... 18 Ivarszervek. .................................................................................................................................... 18 Kapszaicinre nem érzékeny zsigeri idegek ........................................................................................ 19 „Purinerg” neurotranszmisszió .......................................................................................................... 19 A „purinerg”neurotranszmisszió farmakológiai vizsgálata .......................................................... 23 Az ATP szerepe az izgató neurotranszmisszióban simaizomzaton ................................................. 24 Az ATP szerepe a gátló neurotranszmisszióban gasztrointesztinális simaizomzaton .................... 26 Az ATP hatása az erekre ................................................................................................................ 27 „Nitrerg” neurotranszmisszió............................................................................................................. 28 Az NO keletkezése .......................................................................................................................... 28 Az NO-okozta hiperpolarizációt és relaxációt kiváltó lehetséges mechanizmusok a gasztrointesztinális rendszerben .................................................................................................... 30 Az NO direkt simaizom-kontraháló hatása .................................................................................... 32 Az NO ko-transzmitter szerepe a NANC gátló válaszban .............................................................. 32 NO és ATP................................................................................................................................. 32 NO és VIP.................................................................................................................................. 34 Célkitűzések.............................................................................................................................................. 35 Kísérletes rész........................................................................................................................................... 37 A nitrogén-monoxid szerepe a kapszaicin által kiváltott mozgásválaszban különféle fajok bél körkörösizom preparátumain............................................................................................................. 37 Bevezetés ........................................................................................................................................... 37 Módszerek és anyagok....................................................................................................................... 38 Statisztikai módszerek ....................................................................................................................... 40 Eredmények ....................................................................................................................................... 40 Megbeszélés....................................................................................................................................... 47
3 “Nitrerg-purinerg” interakciók humán és patkány bélpreparátumokon....................................... 51 Bevezetés ........................................................................................................................................... 51 Módszerek és anyagok....................................................................................................................... 52 Patkány és humán izolált bél készítmények.................................................................................... 52 A kísérletek menete ........................................................................................................................ 52 Statisztikai módszerek .................................................................................................................... 53 Eredmények ....................................................................................................................................... 54 Patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumok ................................................. 54 Humán szigmabél preparátumok ................................................................................................... 58 Megbeszélés....................................................................................................................................... 61 A kísérletes diabétesz hatása az elektromos téringerléssel vagy kapszaicinnel kiváltott kolinerg, “purinerg” és “peptiderg” motoros válaszokra izolált patkány húgyhólyagon ............................. 64 Bevezetés ........................................................................................................................................... 64 Módszerek és anyagok....................................................................................................................... 65 Streptozotocin-kezelés.................................................................................................................... 65 In vitro kísérletek ........................................................................................................................... 65 Az adatok értékelése....................................................................................................................... 67 Eredmények ....................................................................................................................................... 67 Megbeszélés....................................................................................................................................... 74 Összefoglalás ............................................................................................................................................ 77 Irodalomjegyzék ...................................................................................................................................... 80 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények.......................................................................................... 95 A jelölt egyéb közleményei ...................................................................................................................... 96 Kongresszusi szereplések ........................................................................................................................ 97 Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................................... 100
4
Rövidítések jegyzéke ATP
adenozin-5’-trifoszfát
ADPβS
adenozin-5’-O-2-thiodifosztát
α,β-meATP
α,β-metilénadenozin-5’-trifoszfát
CGRP
kalcitonin gén-rokon peptid (calcitonin gene-related peptide)
CO
szén-monoxid
cGMP
ciklikus guanozin-monofoszfát
EDRF
endothelium-derived relaxing factor
EFS
elektromos téringerlés (electrical field stimulation)
EJP
excitátoros junkciós potenciál
IJP
inhibitoros junkciós potenciál
L-NAME
L-nitro-arginin-metil-észter
L-NMMA
NG-monometil-L-arginin
L-NOARG
NG-nitro-L-arginin
NANC
nem-adrenerg, nem-kolinerg
NKA
neurokinin A
NO
nitrogén-monoxid
NOS
nitrogén-monoxid szintáz
nNOS
neurális NOS
eNOS
endotheliális NOS
iNOS
indukálható NOS
ODQ
1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-on
PACAP
pituitaer adenilát ciklázt aktiváló polipeptid
PGF2α
prosztaglandin F2α
PPADS
piridoxál-foszfát-6-azofenil-2’,4’-szulfonsav
TRPV-1
transient receptor potential vanilloid type 1
TTX
tetrodotoxin
VIP
vazoaktív intesztinális polipeptid
5
Általános bevezetés Mind a belső szervek, mind a kültakaró efferens beidegzése két forrásból származik, ezek: a vegetatív idegrendszer, valamint a szomatikus rendszer. Mind a kültakaró, mind a zsigerek tartalmaznak afferens idegeket is. Az ide tartozó kapszaicin-érzékeny érző idegek perifériás végződései is mediátor-felszabadító funkcióval bírnak, így „helyi efferensként” is működnek (Jancsó és mtsai, 1967, 1968; Szolcsányi, 1984; Barthó és mtsai, 2004). A vegetatív idegrendszer két legismertebb alrendszere a szimpatikus és paraszimpatikus idegrendszer, de több érv is alátámasztja azt a tényt, hogy az enterális idegrendszer is a vegetatív idegrendszer önálló egységének tekinthető (Furness és Costa, 1980; Gershon és mtsai, 1994), pl.: (a) viszonylagos függetlensége a központi idegrendszeri kontrolltól számos funkcióra vonatkozóan, azaz: a külső szimpatikus és paraszimpatikus kontroll nélkül is minimális eltérés észlelhető a bélcsatorna nagy részének funkcióiban; (b) komplett reflexívek létezése az enterális idegrendszerben (a perisztaltikus reflex, ill. a vele összefüggő felszálló izgató és leszálló gátló reflex, továbbá a vasodilatator reflex), melyek alkotói enterális érző neuronok, interneuronok és enterális motoneuronok; (c) az enterális idegrendszer igen kiterjedt volta (kb. 107-108 neuront tartalmaz, ami nagyságrendileg a gerincvelői neuronszámhoz hasonlítható). Az enterális ideghálózatok elrendeződése Az enterális idegrendszerben két fő, ganglionokat tartalmazó idegi plexus található (plexus myentericus és plexus submucosus), amelyeken kívül még több kiterjedt ganglion nélküli ideghálózat létezik különösen az izomrétegek között, ill. alatt (ld. összefoglalók: Furness és Costa, 1980; Gabella, 1994; Gershon és mtsai, 1994; Goyal és Hirano, 1996; Hansen, 2002) (1. ábra). A plexus myentericus (Auerbach) a külső hosszanti és a belső körkörös simaizomréteg közt helyezkedik el a gyomor-bélrendszer teljes hosszában a nyelőcsőtől a végbélig. A plexus submucosus (Meissner) a submucosa kötőszövetébe ágyazott ideghálózat ganglionokkal. Ganglion nélküli ideghálózatok a tápcsatorna összes rétegét beidegzik; a ganglionokat idegrostkötegek kapcsolják össze, ezzel egy komplex folyamatos ideghálózatot hozva létre az emésztőrendszerben. Az enterális idegrendszerhez tartozó neuronok megtalálhatók az
6
epehólyag falában, extrahepatikus epeutakban és a pancreasban is (Furness és Costa, 1980; Gershon és mtsai, 1994). A
Plexus myentericus Körkörös izomzat Plexus submucosus
Hosszanti izomzat
Mucosa
B Mesenterialis ideg
Mesenterium
Plexus submucosus
Plexus myentericus
1. ábra. Az enterális idegi plexusok elrendeződése. Az ábra (A) része az idegeket a bél rétegei közt, a (B) része keresztmetszeti képen ábrázolja. (Átvéve módosítással Furness és Costa 1980-as összefoglalójából.)
7
Intrinszik neuronok Az 1960-as években Burnstock és mtsai szolgáltattak elsőként funkcionális bizonyítékot az intrinszik neuronok jelenlétére a bélrendszerben. Tengerimalac coecum taenián kimutattak olyan intrinszik gátló idegeket, melyek teljesen függetlenek voltak a külső adrenerg ill. kolinerg idegektől (Burnstock és mtsai, 1964). Az intrinszik neuronok részint
más
idegsejteket
izgatnak
vagy
gátolnak
a
belőlük
felszabaduló
transzmitteranyagok segítségével, de jelentős részük a (körkörös és/vagy hosszanti) simaizomzatot
kontrahálja
ingerületátvivő
anyagok
vagy
relaxálja
felszabadításával).
(neuromuszkuláris, Ezek
az
enterális
neuroeffektor motoneuronok.
Nyúlványaik mindkét említett izomrétegben megtalálhatók. Egy adott hatást döntően közvetítő anyag (mediátor) vagy anyagok („ko-mediátorok”, „ko-transzmitterek”) mellett még módosító (modulátor) anyagok részvételével is számolni kell a gyomorbélhuzam ingerületáttevődési folyamataiban. A mediátorok és modulátorok közti határvonal nem éles (Furness és Costa, 1980; Kunze és Furness, 1999; Furness, 2000; Hansen, 2002; Lecci és mtsai, 2002). A folyadék- és elektrolit-felszívódás és -szekréció egyensúlya a helyi igényeknek és a teljes szervezet igényeinek függvényében részben idegi kontroll alatt áll. Ezt intrinszik szekretomotoros neuronok szabályozzák helyi reflexíveken keresztül, amelyeket külső szimpatikus idegek is befolyásolnak (Furness, 2000; Furness és mtsai, 2004). Az enterális idegrendszer neuronjainak jelentős részét a szenzoros neuronok és motoneuronok közti kapcsolatot biztosító interneuronok teszik ki (Furness, 2000). Axonjaik gyakran elágaznak, ingerületelosztó szerepük van. Láncolatot alkotnak, melynek iránya lehet orális (felszálló) vagy analis (leszálló). A felszálló kolinerg interneuronok a bél propulzív mozgásában fontos szerepet játszanak. A leszálló interneuronok részt vesznek ezen kívül helyi motilitási reflexekben, a bélrendszer ún. migráló myoelektromos komplexeinek továbbításában és szekretomotoros reflexekben (Kunze és Furness, 1999). Az interneuronok között lehetnek serkentő és gátló szinapszisok egyaránt. A serkentő interneuronok átvivőanyaga lehet acetil-kolin (nikotinos acetil-kolin receptorokon hatva), ATP, glutamát (Galligan, 2002). Gátló transzmitterek/modulátorok lehetnek pl. opioid peptidek, szomatosztatin (Lénárd és mtsai, 1999; ld. Wood, 1994; Furness, 2000 összefoglalók).
8
Extrinszik neuronok Az extrinszik neuronok három esetben közvetlenül látnak el beidegzéssel izomzatot a gyomor-bélhuzamban: (a) vagális motoneuronok a nyelőcső felső szakaszán a harántcsíkolt izomzatot idegzik be; (b) szimpatikus posztganglionáris noradrenerg neuronok a sphinctereket látják el és adrenerg α1 receptorokon hatva kontrakciót okoznak; (c) szimpatikus posztganglionáris noradrenerg neuronok idegzik be a bélfal arterioláit is; itt a noradrenalin mellett az ATP mint ko-transzmitter szabadul fel és együttesen érösszehúzódást okoznak. A bélhuzamot beidegző más extrinszik neuronok hatásai csak indirekt módon jutnak érvényre az enterális intrinszik neuronok és ideghálózatok közvetítésével. A gyomor-bélhuzam a n. vaguson és a sacralis paraszimpatikus ágakon keresztül kap külső paraszimpatikus beidegzést. A nyelőcső felső részének közvetlen beidegzése mellett (ld. fent) a n. vagus a szerv alsó harmadától egészen a haránt vastagbélig küld paraszimpatikus preganglionáris rostokat a tápcsatornához, mely axonok különféle intrinszik motoneuronokat idegeznek be. A tápcsatorna alsó szakaszának extrinszik beidegzése a kismedencei idegi plexusból származik, amely a rectum és vagina mindkét oldalán
elhelyezkedő,
ganglionsejteket
tartalmazó
idegfonat.
Ezekből
a
ganglionsejtekből számos idegrost indul és beidegzi az urogenitalis szerveket és a tápcsatorna aboralis végét. A ganglionsejtek egy része kolinerg, ezek a sacralis paraszimpatikus régióból kapnak praeganglionaris beidegzést. Ezen paraszimpatikus ágak modulálják a tápcsatorna intrinszik reflexeit (Gabella, 1994). A thoracolumbalis gerincszakaszból kiinduló praeganglionaris szimpatikus idegek valamely szimpatikus praevertebralis ganglionban (ganglion coeliacum, ganglion mesentericum superius és inferius) kapcsolódnak át és úgy érik el a tápcsatornát a mesenterialis ereket követve. A postganglionaris rostokból felszabaduló noradrenalin adrenerg α2 receptorokon hatva preszinaptikus, ill. posztszinaptikus gátlás révén befolyásolja az intrinszik enterális reflexeket. Általánosságban a motorikát gátló hatást okoznak (Gabella, 1994) .
9
Érző neuronok Az érző neuronok szintén az intrinszik és extrinszik kategóriákba sorolhatók. A bélfal saját érző neuronjai érzékelik pl. a feszülést vagy más ingert, az ingerületet pedig interneuronoknak és ezek közvetítésével motoneuronoknak adják át, amelyek létrehozzák „a bél törvénye” néven számontartott körkörösizom-összehúzódást az ingertől orálisan és elernyedést az ingertől analisan (Bayliss és Starling, 1899). Az intrinszik primer afferens neuronok sejttestje, nyúlványaik és szinaptikus kapcsolataik a bélfalon belüli területre korlátozódnak (ellentétben az extrinszik primer afferensekkel, melyek axonja elhagyja a béltraktust és sejttestjük a ggl. spinale-ban van) (2. ábra). Az intrinszik afferens neuronok a bélrendszeri reflexívek első neuronjai, mely reflexek a bélmotilitást, mucosalis folyadékszekréciót, a bél lokális véráramlását szabályozzák (Furness és mtsai, 1998; Kunze és Furness, 1999; Furness és mtsai, 2004). Morfológiailag valószínűleg a Dogiel II. típusba sorolhatók (nagy kerek vagy ovális neuronok,
sok nyúlvánnyal) (Brehmer és mtsai, 1999). Szinapszisokat alkotnak
interneuronokkal, motoneuronokkal és más intrinszik primer afferens neuronokkal. Sejttestjük elhelyezkedése alapján két alosztályba sorolhatók: (a) myenterikus intrinszik primer afferens neuronok, melyek nyúlványokat küldenek az izomrétegek közé és a mucosalis felszínre, és érzékelik az izommozgásokat és a béltartalom kémiai összetételének megváltozását; (b) submucosalis intrinszik primer afferens neuronok, melyek érzékelik a mucosa mechanikai disztorzióját, a bolyhok mozgásait, a béltartalom kémiai összetételének megváltozását. Elekrofiziológiailag az utóhiperpolarizáló (AH-típusú) neuronok közé sorolják őket: a Na+ és Ca2+ beáramlás által kiváltott széles akciós potenciált korai és késői utóhiperpolarizáció követi, amelyet különféle K+ csatornák közvetítenek. A gyulladásos mediátorok (pl. hisztamin, prosztaglandinok, leukotriének stb.) izgatják az intrinszik primer afferenseket. Ezek a mediátorok gátolják a normál utóhiperpolarizációt, így növelik a neuron sejttestjének ingerlékenységét. Ez modellezhető állatkísérletben pl. T. spiralis fertőzéssel vagy gyulladáskeltő anyag (TNBS) adásával. Irodalmi adatok szerint az intrinszik primer afferenseknek szerepük van a bél gyulladásos betegségeiben és az irritábilis
bél
szindrómában.
Bélgyulladások
lezajlása
után
kimutathatóan
szenzibilizálódik az afferens jeltovábbítás a bélben (Furness, 2000; Furness és mtsai, 2004).
10
A bélrendszert extrinszik afferensek is beidegzik (2. ábra). A külső érző neuronok (amelyek a n. vagus-szal vagy a gerincvelőből érkeznek) részben tudatosodó érzetek, részben pl. vegetatív reflexek kiindulásai. A gerincvelői szenzoros neuronok különlegessége, hogy belőlük a periférián, így a gyomor-bélhuzamban is transzmitterek szabadulnak fel. Ezek beleszólnak a zsigeri szervek működésébe (Szolcsányi, 1996; Szolcsányi és Barthó, 2001). Biológiailag aktív anyagok felszabadulása az érző neuronok zsigeri végződéseiből viszonylag egyszerűen megközelíthető módját kínálja a szenzoros neurotranszmitterek azonosításának. Ezek az érző neuronok ingerelhetők kapszaicinnel, a csípős paprika szenzoros izgató anyagával (Barthó és mtsai, 2004). A n. vagus rostjainak 80-90 %-a afferens, és köztük sok a kapszaicin-érzékeny rost. Sejttestjük a ggl. nodosumban található, centrális nyúlványaik az agytörzsbe futnak. A spinalis visceralis afferens rostok sejttestje a gerincvelői hátsó gyöki ganglionokban van. Ezek a központi idegrendszer viscero-szenzoros afferenseit képezik. Ugyanakkor axonjaik elágaznak, kollaterálisokat küldenek vissza az enterális idegrendszerbe, így axon-reflexek révén is befolyásolják a gyomor-bélhuzam működését. Modulálják a praevertebralis szimpatikus ganglionokban történő ingerületátvitelt is, szintén kollaterálisok révén (ld. Furness és mtsai, 1998; Berthoud és mtsai, 2004; Gabella, 2004).
11
Agytörzs Gerincvelő
Ganglion nodosum Vagális primer afferens neuron
Hátsógyöki ganglion
Szimpatikus ganglion Intrinszik primer afferens neuronok
Gerincvelői primer afferens neuron
2. ábra. A bélrendszert ellátó érzőidegek sematikus ábrázolása. A vagális és gerincvelői érző neuronok pszeudounipolárisak és kollaterálisokat küldenek a bélrendszeri ganglionsejtekhez. A vagális érzőideg sejttestje a ggl. nodosumban van, míg a gerincvelői érzőidegé a hátsó gyöki ganglionokban. Utóbbi neuronok perifériás nyúlványa keresztülhalad a szimpatikus ganglionokon és úgy éri el a belet. Az intrinszik primer afferensek multipoláris neuronok, nyúlványaik nem hagyják el a bélfalat. LM: hosszanti izomzat; MP: plexus myentericus; CM: körkörös izomzat; SM: submucosa; Muc: mucosa. (Módosítással átvéve: Furness és mtsai, 1998)
12
Zsigeri szervek (gyomor-béltraktus, urogenitális rendszer) kapszaicinérzékeny beidegzése A kapszaicin (3. ábra) a paprika (Capsicum annuum) csípős anyaga, mely egy specifikus, ioncsatornához kötött receptort izgat. Ezt az érző idegvégződéseken elhelyezkedő receptort régebben vanilloid VR1 receptornak, ma „transient receptor potential vanilloid type receptor1”-nek (TRPV1) nevezik (ld. Caterina és Julius, 2001; Clapham és mtsai, 2003). Közismert, hogy a kapszaicin a nyálkahártyákon égő érzést és erythemát okoz. Ha a kapszaicin kötődik a receptorához, a csatorna megnyílik és az idegvégződés (varicositas) depolarizálódik. Ahhoz, hogy a szer ingerelje a szenzoros idegek végződéseit (és belőle biológiailag aktív anyagokat szabadítson fel), nem szükséges
a feszültségfüggő gyors Na+-csatornák működése, így a válaszok
rezisztensek tetrodotoxinra (TTX) és rezisztensek a neuronális feszültségfüggő Ca2+csatornák blokkolására is (ld. Maggi, 1995; Caterina és Julius, 2001). A
zsigeri
szervek
kapszaicin-érzékeny
végződéseiből
felszabaduló
transzmitterek a Dale-elv szerint feltehetően az érző neuron centrális végződéséből is felszabadulnak, vagyis a gerincvelői hátsó szarvban, ahol ezen transzmitterek részt vesznek a nociceptio közvetítésében/modulációjában. A szenzoros neurotranszmitterek azonosításában hasznos eszköz a kapszaicin zsigeri hatásainak tanulmányozása. A kapszaicinnel történő in vitro deszenzitizáció széles körben elterjedt eszközzé vált az izolált szervi vizsgálatokban.
3. ábra. A kapszaicin szerkezeti képlete
13
A kapszaicin hatása gasztrointesztinális preparátumokon
A kapszaicin hatása a vékony- és vastagbélre Immunhisztokémiai módszerekkel bizonyították, hogy patkány, tengerimalac és egér bélben a TRPV1 pozitív idegrostok megtalálhatók az izomzatban, az enterális idegi plexusokban és a mucosában (Patterson és mtsai, 2003; Ward és mtsai, 2003). Ezen szerzők azt találták, hogy az enterális intrinszik neuronok nem TRPV1 pozitívak, amiből azt a következtetést vonták le, hogy TRPV1 pozitív rostként a spinalis afferensek ill. (gyomor esetén) a n. vagus rostjai jelölődtek. Ezzel szemben más kutatók TRPV1-szerű immunreaktivitást mutattak ki tengerimalac, sertés és humán enterális neuronokban (Poonyachoti és mtsai, 2002; Anavi-Goffer és Coutts, 2003; Chan és mtsai, 2003), de még nincs bizonyítva, hogy ez az autentikus TRPV1 vagy a receptor család egy másik tagja (Clapham és mtsai, 2003). Tengerimalac ileum hosszanti izomzatán a kapszaicin ideg-közvetítette kontrakciót hoz létre (ld. többek közt Barthó és Szolcsányi, 1978; Szolcsányi és Barthó, 1978; Barthó és mtsai, 1999c, 2004). Nagy mennyiségű bizonyíték látott napvilágot arra nézve, hogy a kapszaicin olyan szenzoros rostok végződéseit izgatja a bélben, amelyek a belet a mesenteriumon át érik el. Ezek a végződések hozzák ingerületbe az intrinszik kolinerg motoneuronokat, amelyek aztán a simaizomzatot kontrahálják. Kapszaicin hatására tengerimalac ileum hosszanti izom-plexus myentericus készítményekből acetilkolin szabadul fel (Barthó és Vizi, 1985). Jelenleg is kutatás tárgyát képezi, hogy mely transzmitterek szabadulnak fel az érző idegvégződésből kapszaicin hatására tengerimalac vékonybélen és izgatják az intrinszik neuronokat. Az izgató hatásokért a tachykinineket tartják felelősnek. A tachykinin NK1 és NK3 receptor antagonisták együttes alkalmazása jelentős mértékben, de nem teljesen gátolta a kapszaicin-okozta kontrakciót, ugyanakkor az antagonisták egyenként hatástalanok voltak (szupra-additív, potencírozó hatás). A megmaradó válasz transzmitter hátterével kapcsolatban bizonyítva van endogén purinoceptor-izgató anyag (valószínűleg ATP) mediáló szerepe (Barthó és mtsai, 1999b, 2000). Ugyanakkor atropin-kezelt, előkontrahált készítményeken a kapszaicin képes mérsékelt relaxációt is kiváltani (Barthó és mtsai, 1987). A gátló hatások kiváltásáért a kalcitonin gén-rokon peptidet (CGRP) tartják felelősnek. A CGRP a gátló hatását direkt a simaizmon fejti ki (Barthó és mtsai, 1987, 1991, 1992a). Tengerimalac ileum körkörös
14
izom preparátumon a kapszaicin ritmikus ideg-közvetítette
kontrakciókat vált ki,
viszont a spontán mozgásokat gátolja. Utóbbi hatást részben CGRP közvetíti TTX rezisztens módon (Barthó és mtsai, 1991). Tengerimalac ileumon kiváltott perisztaltikus reflexválaszon az alacsony koncentrációjú kapszaicin átmeneti izgatás után specifikus gátló választ vált ki. Ezt a gátló választ a CGRP receptor antagonista hCGRP(8-37) vagy a nitrogén-monoxid szintézis gátlása csökkenti (Barthó és Holzer, 1995). A kapszaicin viszonylag nagy koncentrációban (10-5-10-4 mol/l) alkalmazva tengerimalac ileumon már nem specifikus simaizom elernyedést hoz létre, mely nem mutat tachyphylaxiát (Barthó és mtsai, 1987; Barthó és Holzer, 1995). Lehetséges, hogy ennek a hátterében a feszültségfüggő Ca2+-csatornák blokkolása áll (Sim és mtsai, 2001). Tengerimalac colon hosszanti izomzatán a kapszaicin többféle motoros választ is kivált. A létrejövő kontrakcióban részt vesznek myentericus neuronok is. A sokkal lassabb gátló választ a tetrodotoxin részben gátolja, ami utalhat az intinszik enterális neuronok részvételére ill. axon-reflex kialakulására a kapszaicin-érzékeny neuron aktivációja során (Maggi és mtsai, 1987b). Tengerimalac colon körkörös izomzatán a kapszaicin elernyedést okoz, amelyet részben CGRP közvetít (Maggi és mtsai, 1996). Patkány duodenumon a kapszaicin ideg-közvetítette mechanizmussal elernyedést hoz létre, CGRP vagy ATP tachyphylaxia csökkenti a választ (Maggi és mtsai, 1986). Patkány ileumon mind a kapszaicin (Allescher és mtsai, 1992; Pinna és mtsai, 1995), mind a mesenterialis idegingerlés (Wali, 1985) gyenge izgató hatást vált ki. Ezzel ellentétben mások a kapszaicint hatástalannak találták ugyanezen a szerven (Nocerino és mtsai, 2002). Patkány colonon leírták, hogy a bélfal feszítésével kiváltott motoros reflexválasz afferens szárát kapszaicin gátolja (Grider, 1994). Nyúl colon preparátumon a kapszaicin izgató hatását tachykininek, a gátló hatását CGRP közvetíti (Mayer és mtsai, 1990). A fenti eredmények arra utalnak, hogy tengerimalac bélen a kapszaicin indirekt (intrinszik kolinerg ideg által közvetített) összehúzódást és direkt (CGRP-okozta) simaizom elernyedést okoz. Ugyanakkor patkány bélrendszerén a kapszaicin csak gyenge izgató hatással rendelkezik.
15
A kapszaicin hatása a nyelőcsőre és gyomorra Tengerimalac nyelőcső hosszanti izomzatán a kapszaicin összehúzódást vált ki (Lundberg és mtsai, 1984; Barthó és mtsai, 1999c). A kapszaicin-okozta válasz erősen atropin-érzékeny és tachykinin receptor
antagonistákkal gátolható szupra-additív
módon. Az antagonisták külön-külön nem hatásosak, csak kombinációkban adva. Legjobban a tachykinin NK1 + NK2 vagy az NK1 + NK2 + NK3 receptor antagonisták együttes alkalmazása gátol (Barthó és mtsai, 1999c). A nervus vagus ingerlése is képes kapszaicin-érzékeny kontrakciót kiváltani tengerimalac nyelőcsövön (Kerr és mtsai, 1995). A kapszaicin elernyedést okoz vadászmenyét alsó nyelőcső sphincteren (Smid és mtsai, 1998). Kutya distalis nyelőcsőbe in vivo adott kapszaicin az alsó nyelőcső sphincter összehúzódását okozza, valószínűleg tachykininek-közvetítette helyi reflexek aktivációja következtében (Sandler és mtsai, 1993). Úgy tűnik, távol vagyunk még a kapszaicin-hatás
transzmitter-hátterének
és
a
species-különbségeknek
pontos
ismeretétől nyelőcsövön. Tengerimalac izolált gyomor preparátumon kiváltott adaptív (feszülés-okozta) relaxációt kapszaicin-érzékeny idegek közvetítik; a válaszban az NO szerepet játszik (Uno és mtsai, 1997). Patkány gyomor fundus hosszanti izom csík preparátumon a kapszaicin főként izgató, acetil-kolin- és tachykinin-mediált választ vált ki (Pinna és mtsai, 1995). Patkány gyomor corpus körkörös izom csík készítményen nagyobb koncentrációjú kapszaicin specifikus gátló hatást is kifejt, a válaszban CGRP vagy vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP) szerepét nem tudták kimutatni (Holzer-Petsche és mtsai, 1989). A kapszaicin hatása az epehólyagra és epevezetékre Több emlősfajban kimutattak tachykinin és CGRP tartalmú kapszaicin-érzékeny rostokat az epehólyagban és az epeutakban (ld. Maggi és mtsai, 1989e; Patacchini és mtsai, 1999). A tachykininek jelentős része az intrinszik neuronokban található (Patacchini és mtsai, 1998, 1999). Tengerimalac epehólyagon a kapszaicin simaizom kontrakciót okoz (Lundberg és mtsai, 1984), mely két ellentétes hatás eredőjeként jön létre: a tachykininek kontrakciót, míg a CGRP relaxációt vált ki (Maggi és mtsai, 1989e). Hasonló eredményeket írtak le tengerimalac közös epevezetéken is. Itt a kapszaicin neurogén, acetil-kolin-mediált kontrakciót okoz, melyet a tachykinin NK1, NK2 és NK3 receptor antagonisták kombinációja erőteljesen csökkent (Patacchini és
16
mtsai, 1999). A kapszaicin-okozta összehúzódás nem tachykinin-mediált részének transzmitterét nem ismerjük. Atropin-kezelt, előkontrahált epevezetéken a kapszaicin elernyedést is képes kiváltani. Ezt a hatást endogén CGRP közvetíti [hCGRP(8-37)érzékeny] CGRP1 receptorokon keresztül (Patacchini és mtsai, 1999). A kapszaicin hatása a humán gasztrointesztinális simaizomzatra Humán intesztinális simaizomzaton a kapszaicin legnagyobb részt − talán teljesen − gátló hatást vált ki, ellentétben a tengerimalac gyomor-bél preparátumokkal. Különféle humán vékony- és vastagbél szakaszok hosszanti és körkörös irányú preparátumain kis, specifikus koncentrációjú kapszaicint alkalmazva relaxáló hatás figyelhető meg (Maggi és mtsai, 1988; 1990a,b). Az elernyedés TTX-rezisztens. A CGRP relaxálja a humán intesztinális simaizomzatot, de arra nincs funkcionális (vagy akár neurokémiai) bizonyíték, hogy a CGRP szerepet játszana a kapszaicin-okozta gátló válaszban. Ellenben funkcionális (immun-neutralizációs) és neurokémiai kísérletek a VIP, ill. valamely rokon peptid részvételét látszanak igazolni a kapszaicin hatásában (Maggi és mtsai, 1989c; 1990a,b). A kapszaicin nincs hatással humán nyelőcső alsó sphincter izomzatára in vitro (Smid és Blackshaw, 2000). In vivo egészséges önkénteseken végzett kísérletben kimutatták, hogy a nyelőcsőbe adott kapszaicin oldat fokozza a nyelőcső motilitását és összehúzza az alsó sphinctert (Gonzalez és mtsai, 1998; Király és mtsai, 2001). Ezzel szemben a gyomorürülés megnyúlik, amit a vékonybél fokozott propulziós aktivitása kompenzál, így az orocoecalis tranzit idő nem változik kapszaicin hatására (Horowitz és mtsai, 1992; Gonzalez és mtsai, 1998).
17
A kapszaicin hatása a húgy-ivarszervi simaizomzatra
A kapszaicin-érzékeny primer afferens neuronok perifériás nyúlványai gazdagon beidegzik mind a húgyúti, mind a genitális simaizomzatot számos állatfajban és emberben egyaránt. Ezen szövetek CGRP és tachykinin tartalma ezekből a neuronokból származik (ld. Maggi, 1995; Lecci és Maggi, 2001 összefoglalók). A kapszaicinérzékeny neuronokban egyéb transzmitterek − pl. pituitaer adenilát ciklázt aktiváló polipeptid (PACAP) − is megtalálhatók (Fahrenkrug és Hannibal, 1998). Húgyhólyag és urethra. Patkány, tengerimalac és hörcsög húgyhólyag szövetből tachykininek és/vagy CGRP szabadul fel kapszaicin hatására (Maggi, 1995; Giuliani és mtsai, 2001). A kapszaicin hatására létrejövő motoros válasz függ a vizsgált fajtól, a hólyag régiótól (detrusor izom vagy hólyagalap) és a preparátum tónusától. Patkány hólyag detrusor izomzatán a kapszaicin atropin- és TTX-rezisztens összehúzódást vált ki. Maggi és mtsai kimutatták, hogy a tachykinin receptor antagonista spantide (amely főként NK1 receptorokon hat) szelektíven gátolja a P-anyag ill. az NK2 receptor antagonista L-659 877 vagy MEN 10 376 szelektíven gátolja a neurokinin A (NKA) kontraháló hatásait patkány hólyagon. Ezeknek az antagonistáknak az együttes alkalmazása majdnem teljesen kivédte a kapszaicin hatását, viszont külön-külön csak mérsékelten voltak hatásosak (Maggi és mtsai, 1985, 1991b). Tengerimalac hólyagon a kapszaicin tachykinin-mediált kontrakciót és CGRP-mediált relaxációt okoz. Utóbbi a hólyag nyaki részén sokkal kifejezettebb (ld. Maggi, 1995). Hörcsög hólyagon a relaxáció dominál CGRP közvetítésével (Giuliani és mtsai, 2001). A kapszaicin nem befolyásolja sem a nyúl, sem a humán hólyag detrusor izom tónusát (Maggi és mtsai, 1989b; Maggi, 1995). Patkány hólyagon az elektromos téringerléssel kiváltott kapszaicin-érzékeny izgató motoros választ tachykininek közvetítik (Meini és Maggi, 1994). Hörcsög hólyagon viszont az idegingerlés relaxációt vált ki, melyet CGRP közvetít (Giuliani és mtsai, 2001). Az alsó húgyutakból kapszaicin hatására NO is felszabadulhat, mely részben az urotheliumból származik (Nishizawa és mtsai, 1997; Birder és mtsai, 1998). Több kísérletsorozatban is kimutatták a kapszaicin gátló hatását urethrán vagy urethra külső sphincteren in vitro (Maggi és mtsai, 1989d; Maggi, 1990). Kimutatták, hogy a kapszaicin-okozta gátló választ kutya urethrán NO közvetíti (Nishizawa és mtsai, 1997), míg patkány urethrán nem (Persson és mtsai, 1997).
18
Patkány urethra külső sphincteren a kapszaicin gátló hatását valószínűleg CGRP közvetíti (Parlani és mtsai, 1993). Vesemedence és ureter. A spontán aktív tengerimalac vesemedencén a kapszaicin vagy az elektromos téringerlés NKA-mediált izgató motoros választ vált ki. Tachykinin NK2 receptor antagonista jelenlétében előtérbe kerül a részben CGRPközvetítette gátló válasz is. A kapszaicin előkezelés a teljes választ kivédi (Maggi és mtsai, 1992). Patkány és tengerimalac ureteren idegingerlés és kapszaicin hatására CGRP-mediált gátló választ mutattak ki, míg az exogén tachykinin adás izgató választ okoz (Maggi és mtsai, 1987a; Maggi és Giuliani, 1991). Ivarszervek. Számos faj vas deferens-ét, méhét és méhkürtjeit beidegzik kapszaicin-érzékeny tachykinin és/vagy CGRP tartalmú neuronok (ld. Maggi, 1995). Patkány vas deferensen az idegingerléssel kiváltott kontrakciót a kapszaicin gátolja, feltehetően CGRP közvetítésével (Maggi és mtsai, 1987d; 1991a). Az exogén tachykininek izgató választ váltanak ki különféle fajok vas deferens preparátumain (ld. többek közt Patacchini és mtsai, 1989b), de az endogén felszabaduló tachykininek izgató hatását elfedi a CGRP gátló hatása ezen a szerven. Myometriumon az exogén adott tachykininek izgató, míg a CGRP gátló választ vált ki (Samuelson és mtsai, 1985; Patak és mtsai, 2000). A kapszaicin gátlólag hat az uterus mozgására. A tartós in vitro kapszaicin (0,1-1 µmol/l) kezelés növeli az elektromos téringerléssel kiváltott kontrakció nagyságát patkány uteruson, feltehetően azáltal, hogy a szenzoros idegvégződésekben CGRP depléciót okoz (Klukovits és mtsai, 2004). Nyúl izolált corpus cavernosumon a kapszaicin (3-10 µmol/l) koncentrációfüggő elernyedést okoz, melyet sem a NOS gátló L-NAME, sem a tetrodotoxin nem befolyásol (Teixeira és mtsai, 1998).
19
Kapszaicinre nem érzékeny zsigeri idegek
A simaizomsejteket ellátják izgató kolinerg és gátló adrenerg idegek, melyek a konvencionális neurotranszmittereket (acetil-kolin és noradrenalin) használják. De a simaizom-relaxációban és -kontrakcióban részt vesznek egyéb, nem-adrenerg, nemkolinerg (NANC) transzmitterek is. Ezek szintén lehetnek gátló és izgató neurotranszmitterek. Legismertebb izgató NANC transzmitterek a tachykininek (Panyag és NKA emlős szervezetben) és az ATP. Gátló NANC transzmitterek közé tartozik az NO, ATP, VIP, PACAP, valamint az újabban azonosított szén-monoxid (CO). „Purinerg” neurotranszmisszió
Az ATP a jól ismert, energetikai folyamatokban játszott intracelluláris szerepe mellett a sejtek közötti kommunikációban közreműködve extracelluláris funkciókkal is bír. Az ATP és adenozin extracelluláris hatásait elsőként Drury és Szent-Györgyi írták le szívérrendszeri kísérleteik során 1929-ben. Holton nevéhez fűződik az első utalás az ATP lehetséges neurotranszmitter szerepére vonatkozóan, mely szerint a szenzoros idegek antidrómos ingerlése során ATP szabadul fel (Holton, 1959). Az 1970-es évekből, Burnstock-tól
származik az ún. „purinerg” hipotézis, mely szerint az addig
azonosítatlan NANC idegek transzmitter anyaga az ezen idegekből felszabaduló ATP vagy azzal közeli rokon nukleotid. Hamarosan több állatfaj gasztrointesztinális preparátumain is (tengerimalac taenia coeci, nyúl ileum, béka gyomor stb.) kimutatták, hogy az ATP NANC gátló transzmitterként működik. Nem sokkal ezután az is bebizonyosodott, hogy az ATP NANC izgató válaszokban is részt vesz húgyhólyagon (ld. összefoglalók Burnstock, 1997; 2006). Az ATP ko-transzmitter a noradrenalinnal a szimpatikus idegekben, ill. az acetilkolinnal a paraszimpatikus neuronokban (Burnstock, 2006). A szenzoros idegek a tachykininek és CGRP mellett ATP-t is tartalmaznak és felszabadítanak, így az ATP részt vehet a nociceptio közvetítésében a központi idegrendszer felé, továbbá ezen szenzoros idegek periférián kifejtett effektor funkcióiban is (ld. Barthó és mtsai, 1999b). Az enterális idegrendszerben is bizonyították az ATP ko-transzmitter szerepét a nitrogén-monoxiddal. Munkacsoportunk NOS gátló és P2 purinoceptor antagonista
20
segítségével kimutatta, hogy az ATP és az NO együtt közvetítik a NANC relaxációt tengerimalac colonon és coecum taenián (Barthó és mtsai, 1998; Rózsai és mtsai, 2001). Patkány ileumon ATP-deszenzibilizáció csökkenti a NANC elernyedést (Smits és Lefebvre, 1996). A vegetatív idegrendszer jelentős plaszticitást mutat: a kotranszmitterek és receptorok expressziója változik a fejlődéssel, öregedéssel, kóros állapotokban. Patológiás állapotokban fokozódhat például a húgyhólyag „purinerg” beidegzése (Palea és mtsai, 1993). Az ATP ubikviter molekula, így valószínűleg minden neuronban jelen van. Vezikulákban tárolják azok az idegsejtek, melyek neurotranszmitterként használják. Az ATP tárolásának kimutatására, ill. az ATP lokalizáció meghatározására az uranaffinreakciót és a quinacrine fluoreszcens festéket használják. Pozitív reakciót mutattak ki pl. a vas deferenset ellátó szimpatikus idegvégződésekben, továbbá tengerimalac ileum intrinszik neuronjaiban (Hoyle, 1992). Az ATP extracelluláris térbe történő felszabadulása többféle módon is megtörténhet: (1) az idegsejtekből a vezikulákban tárolt ATP exocitózissal szabadul fel; (2) a nem-neuronális sejtekből transzportereken keresztül történhet az ATP felszabadulása (ABC fehérjecsalád − „ATP-binding cassette proteins); (3) citolízissel, vagyis a sejtek károsodása következtében szabaddá válik ATP (ld. Bodin és Burnstock, 2001; Burnstock, 2006). Ma már ismert, hogy egészséges sejtekből (pl. endothelből), mechanikai hatásra is felszabadulhat ATP élettani körülmények közt (Bodin és mtsai, 1991). Az ATP és rokon vegyületei purinoceptorokon keresztül fejtik ki hatásaikat a szöveteken. Két fő receptor altípust különítettek el, a P1 purinoceptoron hat az adenozin, a P2 purinoceptoron az ATP és ADP. Az ATP ektonukleotidázok hatására bomlik (Zimmermann, 2001), így a keletkező adenozin már P1 purinoceptorokon keresztül is hat (4. ábra). A P2 purinoceptoroknak jelenleg két típusa különíthető el: P2X ligandvezérelt ioncsatorna receptor és P2Y G-protein-kapcsolt receptor (Abbracchio és Burnstock, 1994). Jelenleg a P2X receptoroknak 7, a P2Y receptoroknak 8 altípusa létezik (North és Barnard, 1997; ld. még British J. Pharmacol.: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition, 2006). A P1 purinoceptoroknak 4 altípusát azonosították: A1, A2a, A2b, A3 (Fredholm, 2001; ld. még British J. Pharmacol.: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition, 2006). 1992-ben
találták
az
első
bizonyítékot
az
interneuronális
„purinerg”
neurotranszmisszió létezésére. Kimutatták, hogy patkány agyi és tengerimalac ganglion
21
coeliacum neuronjain kiváltott EPSP-t az exogén ATP utánozza és a P2 purinoceptor antagonista suramin gátolja (Edwards és mtsai, 1992; Evans és mtsai, 1992). Az ATP-nek jelentős szerepe lehet a fájdalom patomechanizmusában. Valószínű, hogy létezik egy nociceptív ATP receptor, melyet P2X2 és P2X3 receptoralegységek alkotnak és primer érző neuronok végződésein helyezkedik el. A fájdalom különböző formáiban szerepe lehet a P2 purinoceptoroknak: szimpatikus, vaszkuláris és tumoros fájdalmakban a szimpatikus idegekből, érendothelből és széteső tumorsejtekből felszabaduló ATP izgatja az érző idegvégződéseken elhelyezkedő P2X2/3 receptorokat és fájdalmat közvetít a központi idegrendszer felé. Ezeknek a purinoceptoroknak a szelektív gátlásával új típusú fájdalomcsillapítók kifejlesztésére is lehetőség nyílik (Burnstock, 1996).
22
4. ábra. „Purinerg” neuroeffector junctio vázlatos ábrázolása. Az ATP vezikulákban tárolódik, exocytosissal ürül ki a varicositasból, postjunctionalisan a simaizmok P2 purinoceptorain hat. A felszabadult ATP extracellulárisan bomlik le enzimatikus hatásra (ekto-ATP-ázok, 5’-nukleotidáz), a végtermék adenozin visszavevődik a varicositasba és újra beléphet az ATP szintézisébe. Az adenozin prejunctionalis P1 purinoceptoron is hatást válthat ki. Az adenozin további bomlástermékét, az inozint a keringés távolítja el a junctioból. (Átvéve: Burnstock, 2006)
23
A „purinerg”neurotranszmisszió farmakológiai vizsgálata A „purinerg” neurotranszmisszió utánzására az ATP metabolikusan stabil analógjait (pl. α,β-meATP) használják. Ezek receptor-spektruma eltérő. Léteznek receptor altípus szelektív agonisták is, ú.m.: β,γ-meATP (P2X1 receptorra), 2-MeSADP (P2Y1, P2Y12 receptorokra), ADPβS (P2Y1 receptorra), UTPγS (P2Y2, P2Y4 receptorokra), stb. (ld. British J. Pharmacol.: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition, 2006). A „purinerg” neurotranszmisszió azonosítására a következő eszközöket használják: (a) Gátlás ATP deszenzibilizáció (ill. tachyphylaxia) segítségével. Hátrányai: nem minden típusú purinoceptor deszenzibilizálódik egyformán; emellett az ATP lebontási termékei (ADP, AMP, adenozin, inozin) is rendelkeznek hatásokkal, részben más receptortípusokon, mint az anyavegyület. Használható a metabolikusan stabilabb, egyben nagyobb altípus-specifikusságú agonistákkal történő deszenzibilizáció (α,βmeATP stb.). (b) Gátlás apaminnal. A méhméregből izolált nagy molekulasúlyú polipeptid gátolja a kis-konduktanciájú K+-csatornákat. Az ATP simaizom-relaxáló hatását nagyrészt ezek a csatornák közvetítik. Újabban azonban kiderült, hogy számos más relaxáló anyag hatása is (részben vagy teljesen) apamin-érzékeny (Huidobro-Toro és Yoshimura, 1983; Schwörer és mtsai, 1992; Kishi és mtsai, 1996; Shan és mtsai, 1996; Zagorodnyuk és mtsai, 1996; Yamaji és mtsai, 2002). Egy apamin-érzéketlen NANC relaxációban tehát ATP valószínűleg nem játszik fontos szerepet, de egy apamin-érzékeny válasz nem föltétlenül „purinerg”. (c) Gátlás antagonisták segítségével. Elvben antagonisták alkalmazása volna a „legtisztább” módszer a „purinerg” válaszok azonosítására, a gyakorlatban azonban ennek is hátrányai vannak (az antagonisták viszonylag kis affinitása, eltérő mértékű hatása a különféle receptor-altípusokon). A “purinerg” transzmisszió részvételének bizonyításához vagy elvetéséhez egy NANC válaszban nincs szükség receptor-altípusspecifikus anyagokra, csak purinoceptor ill. P2 purinoceptor-specifikus antagonistákra. Maga a felszabaduló ATP is valószínűleg számos receptor-altípuson hat egyidejűleg, ha ezek a receptorok a célsejteken jelen vannak. A suramin (Dunn és mtsai, 1988; Hoyle és mtsai, 1990), ill. a valamivel nagyobb hatáserősségű PPADS (Lambrecht és mtsai, 1992) a P2 purinoceptorok viszonylag széles spektrumát képes gátolni. Saját megfigyeléseink szerint a PPADS még igen magas koncentrációban sem rendelkezik nem-specifikus hatásokkal, nem gátolja az
24
acetil-kolin, hisztamin, kolecisztokinin és a tachykinin NK3 receptoragonista senktide kontraháló, valamint az izoprenalin és nátrium-nitroprusszid relaxáló hatását különböző preparátumokon (Barthó és mtsai, 1997; 1998; 2000). Az ATP szerepe az izgató neurotranszmisszióban simaizomzaton Több irodalmi adat is alátámasztja, hogy az ATP közvetíti a gasztrointesztinális simaizomzaton kiváltott excitátoros junkciós potenciál (EJP) és a következményes mechanikus
válasz
nem-kolinerg,
nem-tachykininerg
komponensét.
NANC
körülmények közt és a gátló neurotranszmisszió blokkolása mellett (apamin és NOS inhibitor jelenlétében) az elektromos ingerléssel kétfázisú EJP váltható ki tengerimalac duodenumon. Az EJP lassú komponensét a tachykinin NK1 és NK2 receptor antagonisták kivédik, míg a gyors komponensét a P2 purinoceptor antagonista suramin csökkenti és egy P2Y receptor agonista (ADPβS) utánozza. Hasonló mechanizmust írtak le tengerimalac colonon, ahol az ADPβS-okozta hiperpolarizációt az apamin átfordítja depolarizációba és kontrakciós válaszba. Ezt az izgató választ a P2 purinoceptor antagonista PPADS és suramin kivédi (Zagorodnyuk és mtsai, 1995; Zagorodnyuk és Maggi, 1998). Nyúl gyomor simaizom sejteken az ATP-okozta kontrakciót egy foszfolipáz C inhibitor kivédi és a pertussis toxin csökkenti, ami metabotróp ATP (P2Y) receptorok szerepét támasztja alá (Murthy és Makhlouf, 1998). Az ATP az acetil-kolinnal ko-transzmitterként együttműködve fontos szerepet játszik a húgyhólyag beidegzésében. Számos faj izolált hólyag detrusor izom preparátumon az elektromos ingerlésre kapott válasz természete nagymértékben összefügg az ingerlési paraméterekkel. Az egyes impulzusok tisztán nem-kolinerg választ váltanak ki, a frekvencia növelésével egyre nagyobb részben kolinerg jellegű választ lehet kiváltani (ld. Hoyle, 1994 összefoglaló). Tengerimalac hólyagból elektromos téringerlés hatására ATP szabadul fel, ami gátolható az axonális ingerületvezetést blokkoló tetrodotoxinnal, míg a posztganglionáris szimpatikus neuronok kiiktatása guanethidinnel vagy 6-hidroxidopaminnal nem befolyásolja (Burnstock és mtsai, 1978a,b). Nyúl hólyag izolált detrusor izom készítményen az ATP tachyphylaxia gátolja a nem-kolinerg excitátoros transzmissziót (Levin és mtsai, 1986). Számos faj (patkány, nyúl, tengerimalac, selyemmajom, egér, vadászmenyét) hólyag preparátumain atropin és α,β-meATP tachyphylaxia együtt alkalmazva gátolja a
25
paraszimpatikus posztganglionáris idegingerlés hatását (ld. Hoyle, 1994 összefoglaló). P2 purinoceptor antagonisták segítségével nyert irodalmi adatok is alátámasztják a „purinerg” neurotranszmisszió szerepét hólyagon. Az eredetileg tripanoszóma ellenes szer suramin (mely gátolja a P2 purinoceptorokat) gátolja a nem-kolinerg idegingerlés hatását tengerimalac hólyagon (Hoyle és mtsai, 1990). Egy másik nem szelektív P2 purinoceptor antagonista, a PPADS gátolja az α,β-meATP és a „purinerg” idegingerlés hatását nyúl hólyagon (Ziganshin és mtsai, 1993). Az intramurális idegrostok ingerlése gyors EJP-t vált ki nyúl hólyag detrusor izomzatán, melyet lassú depolarizáció követ. Az EJP nem érzékeny atropinra és megszűnik α,βmeATP deszenzibilizálás után, így feltehetően „purinerg” idegi aktiváció hozza létre. A késői depolarizáció az acetil-kolin felszabadulás következménye. Exogén ATP vagy α,β-meATP adás gyors depolarizációt vált ki, amely a detrusor izom kontrakciójával jár együtt (Creed és mtsai, 1983; Hoyle és Burnstock, 1985). Autoradiográfia segítségével, [3H]-α,β-meATP-t használva radioaktív ligandnak meghatározták a P2X purinoceptorok mennyiségét és elhelyezkedését hólyagban. Fajspecifikus eltérést találtak: legtöbb P2X receptor a patkány hólyagban van, ezt követi a nyúl, majd a tengerimalac. Régiónként is eltér a receptorsűrűség: legtöbb receptor a detrusor izomban található, kevesebb a hólyagnyakban és még kevesebb az urethrában (Bo és Burnstock, 1992). Az elektromos téringerléssel és hólyagtöltéssel kiváltott „purinerg” és kolinerg válasz időbeli lezajlása közt jelentős eltérést tapasztaltak detrusor izom ill. teljes hólyag preparátumokon. A kezdeti izgalmi fázis átmeneti és „purinerg” természetű, míg a tartós izgalmi fázis kolinerg (Krell és mtsai, 1981; Maggi és mtsai, 1987c; Chancellor és mtsai, 1992). Egyes fajoknál a kolinerg és „purinerg” összetevők aránya eltérhet. Úgy tűnik, hogy a vizeletürítés megindításáért inkább a „purinerg” komponens felelős, míg a fenntartásáért a kolinerg (Krell és mtsai, 1981; Maggi és mtsai, 1987c, 1989a). Humán hólyagon a „purinerg” beidegzés kevésbé jelentős, mint rágcsálóknál. Humán hólyag detrusor izom preparátumon az α,β-meATP deszenzibilizáció gátolja az exogén ATP-vel és a nem-kolinerg idegingerléssel kiváltott összehúzódást. Meg kell jegyezni, hogy atropin alkalmazása után nem minden esetben látható reziduális kontrakció (Hoyle és mtsai, 1989). Más kutatók azt találták, hogy az izolált detrusorizom idegingerléssel kiváltott suramin (300 µmol/l) és
kontrakcióját a P2 purinoceptor antagonista
PPADS (30 µmol/l) nem befolyásolja, míg ebben a
26
koncentrációban alakalmazva az exogén ATP hatását kivédik (Tagliani és mtsai, 1997). Humán hólyagon nem valószínű, hogy az ATP jelentős izgató transzmitter funkcióval bír, annak ellenére, hogy az effektorsejteken nagy számban kimutathatók P2 purinoceptorok (O’Reilly és mtsai, 2001). Ezzel szemben patológiás körülmények közt (pl. intersitialis cystitis, hólyag obstructio) és idős korban a „purinerg” beidegzés szerepe fokozódik, esetenként a kolinerg beidegzés csökkenésével párhuzamosan, amire mind funkcionális, mind neurokémiai irodalmi adatok is találhatók (Palea és mtsai, 1993; Bayliss és mtsai, 1999; Yoshida és mtsai, 2001, 2004). Az ATP szerepe a gátló neurotranszmisszióban gasztrointesztinális simaizomzaton A gátló neurotranszmitterek − köztük az ATP − szerepe a perisztaltikus reflexben a leszálló gátlás kiváltása, így a béltartalom továbbítása az anus felé. Meglepő, hogy ha az apamin-érzékeny − részben valószínűleg „purinerg” − gátló mechanizmust kiiktatjuk, a tengerimalac-vékonybél perisztaltikája nem gátlódik, hanem fokozódik (Holzer és mtsai, 1997). A P2 purinoceptor antagonista PPADS hasonló hatású. Az apamin és NOS gátlók együtt már blokkolják a perisztaltikát (inkoordináció), míg a NOS gátló önmagában fokozza (Waterman és Costa, 1994; Barthó és Holzer, 1995; Holzer és mtsai, 1997). Lehetséges tehát, hogy a simaizomzatra kifejtett gátló befolyások gyengítése a perisztaltika bizonyos fokú stimulációját váltja ki, de erős gátlása már rontja annak hatásfokát. Ugyanakkor az alkalmazott szerek prejunkcionális hatásokkal is rendelkezhetnek (Barthó és Lefebvre, 1994b; Hebeiss és Kilbinger, 1996). Az ATP-t tartják az elektromos téringerléssel kiváltott apamin-érzékeny IJP és elernyedés fő mediátorának, de mint már utaltam rá, nem csak az ATP képes apaminérzékeny válasz kiváltására (ld. előrébb). Simaizomzaton kétféle, relaxációt közvetítő P2 purinoceptort különítettek el farmakológiai eszközökkel: az egyik α,β-meATP-vel stimulálható, ill. a PPADS és suramin gátolja, míg a másik ADPβS-sel stimulálható és nem érzékeny PPADS-re és suraminra (Zagorodnyuk és Maggi, 1998). Több bizonyíték is alátámasztja a P2Y receptorok szerepét az alacsony konduktanciájú, Ca2+-aktiválta (apamin-érzékeny) K+- csatornák ATP-okozta aktivációjában és a simaizom relaxációban (Koh és mtsai, 1997; Xue és mtsai, 1999; Bayguinov és mtsai, 2000), de nem minden relaxáló válasz köthető egyértelműen valamely purinoceptor-altípushoz.
27
Az ATP hatása az erekre Az ereket ellátó szimpatikus idegekben a noradrenalin mellett az ATP kotranszmitterként szerepel (ld. Burnstock, 1997). Az egyes érterületeken a „purinerg” és noradrenerg beidegzés aránya változó. Izolált szervi és elektrofiziológiai kísérletekben kimutatták, hogy a „purinerg” komponens aránya a noradrenerghez képest viszonylag kicsi patkány farok artériában (Sneddon és Burnstock, 1984; McLaren és mtsai, 1995). Nyúl arteria saphena-t ellátó szimpatikus idegekből felszabaduló noradrenalin és ATP egyaránt részt vesz az idegingerlésre létrejövő kontrakciós válaszban (Burnstock és Warland, 1987). Nyúl mesenterialis artériáit és tengerimalac bél submucosalis artériáit ellátó szimpatikus idegekből ingerlésre egyaránt felszabadul noradrenalin és ATP, de az érösszehúzó hatásért csak az ATP felelős, míg a noradrenalin preszinaptikusan modulálja az ATP hatását (Ramme és mtsai, 1987; Evans és Surprenant, 1992). Az értónus szabályozásában a perivascularis beidegzés mellett az endothelium is jelentős szerepet játszik. Az érbelhártyából hipoxia és nyíróerők hatására felszabaduló ATP P2Y receptorokon keresztül endothelialis NO termelést indukál, ami értágulatot okoz. Tehát az ATP az ereken kettős hatással rendelkezik: direkt módon (P2X receptorokon keresztül) vasoconstrictiot okoz, indirekt módon pedig (P2Y receptorokon hatva) vasodilatator hatású. Az adenozin szintén értágító hatást okoz mind endothelialis, mind simaizmokon elhelyezkedő P1 purinoceptorokon keresztül (Kennedy és Burnstock, 1985; ld. Burnstock, 1997).
28
„Nitrerg” neurotranszmisszió
Az 1980-as évek végén két kutatócsoport egymástól függetlenül közölte, hogy az „endothelium-derived relaxing factor” (EDRF) − melyet elsőként Furchgott és Zawadzki (1980) fedezett fel − megfelel a nitrogén-monoxidnak (Ignarro és mtsai, 1987; Palmer és mtsai, 1987). Az NO-nak szerepet tulajdonítanak többek közt a vasodilatatioban, a kórokozók elleni védelemben ill. a központi és perifériás idegrendszer működésében. Az NO színtelen, szagtalan, toxikus gáz, mely könnyen képes átdiffundálni lipid membránokon. Igen reakcióképes molekula, mivel páratlan elektronnal rendelkezik. Féléletideje néhány másodperc; gyorsan átalakul, N2O4-en keresztül nitritté és nitráttá oxidálódik. Szuperoxid-anion az NO bomlását fokozza, szuperoxid-dizmutáz kivédi e hatást. Az NO hem-tartalmú proteinekhez erősen kötődik. Az NO aktiválja a szolubilis guanilát-cikláz enzimet és másodlagos hírvívőként cGMP termelést indít el a célsejtben (Murad és mtsai, 1978), ami simaizom relaxációt eredményez (5. ábra). Az NO keletkezése Az NO-t a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) enzim állítja elő, miközben L-argininből (O2 felhasználásával) L-citrullint képez (5. ábra). Az enzim több kofaktort is igényel: tetrahidro-biopterin, flavin adenin dinukleotid (FAD), flavin mononukleotid (FMN), nikotinamid adenin dinukleotid foszfát (NADPH). Két NOS izoforma létezik: indukálható (iNOS) és konstitutív. Utóbbinak két altípusa van: neuronális (nNOS) és endotheliális (eNOS) enzimek. A konstitutív NOS Ca2+ és kalmodulin jelenlétében aktiválható. Az idegi akciós potenciál Ca2+ beáramlást indukál az N-típusú Ca2+csatornákon keresztül, ez előfeltétele a nNOS aktivációjának. Az iNOS-t a sejtek csak citokin vagy endotoxin általi aktiváció hatására termelik (pl. fehérvérsejtekben, endothelsejtekben, májsejtekben), kalcium nem befolyásolja (ill. a nyugalmi [Ca2+]i elegendő a működéséhez), termelődése transzkripcionális szabályozás alatt áll (ld. Whittle, 1994; Rand és Li, 1995 összefoglalók). Az nNOS lehet membrán-kapcsolt vagy citoplazma-enzim, míg az eNOS mindig membránhoz kötött lokalizációjú a sejtben. Az iNOS a citoplazmában található. nNOS-knockout egereken (amelyekben az nNOS membránhoz kötött variánsa hiányzott) megfigyelték, hogy a gyomorürülés súlyosan károsodott (a relaxációs képesség csökkenés és a pylorus stenosis miatt),
29
viszont más bélszakaszokon nem tapasztaltak funkcionális eltérést (Mashimo és Goyal, 1999; Saur és mtsai, 2002).
(-)
(-)
(-)
5. ábra. NO keletkezése L-argininből. A folyamatot a konstitutív NO szintáz enzim katalizálja. A donor sejtben termelődő NO aktiválja a célsejt szolubilis guanilát-cikláz (G Cyclase) enzimét, ennek következtében az intracelluláris cGMP szint megemelkedik. Az NO szintáz gátlói: NG-monometil-L-arginin [L-NMMA], NG-nitro-L-arginin [LNNA], L-nitro-arginin-metil-észter [L-NAME]. A szuperoxid anion (O2-) fokozza az NO lebomlását. Az NO kötődik az oxihemoglobinhoz (OxyHb). (–): gátló mechanizmusok. Felmerült az NO kötött formában való felszabadulása (pl. nitrozovegyület alakjában), amelyből a célszervnél hasadna le. (Ábra átvéve: Whittle, 1994)
30
A NOS gátlók (pl. NG-monometil-L-arginin [L-NMMA], NG-nitro-L-arginin [LNOARG, L-NNA], L-nitro-arginin-metil-észter [L-NAME], L-arginin-etil-észter [LAEE]) bevezetése után bebizonyosodott, hogy az NO a fő gátló transzmitter a musculus anococcygeus, a musculus retractor penis, bizonyos artériák, a bél, a trachea vegetatív efferens ill. enterális idegeiben. Ezeket az idegeket elnevezték „nitrerg” idegeknek (ld. Toda és Herman, 2005). A gasztrointesztinális traktuson belül Bult és mtsai (1990), Toda és mtsai (1990), valamint Li és Rand (1990) elsőként írták le, hogy az NO gátló NANC transzmitter (kutya ileocoecalis junkción, kutya duodenumon, ill. patkány gyomor funduson). Hisztológiai módszerekkel demonstrálták NOS-immunreaktív idegrostok jelenlétét a plexus myentericusban és submucosusban több faj bélrendszerében is. Kimutatták, hogy a NOS-immunreaktivitás és a NADPH-diaforáz pozitivitás kolokalizálódik egyazon neuronokban (Toda és Herman, 2005). A Cajal-féle interszticiális sejtek valószínűleg fontos szerepet játszanak a „nitrerg” neurotranszmisszióban. Ezt bizonyítja, hogy olyan mutáns patkányokban, ahol nincsenek Cajal-sejtek, nem jön létre „nitrerg” gátló válasz (Ward és Sanders, 2001). Az NO-okozta hiperpolarizációt és relaxációt kiváltó lehetséges mechanizmusok a gasztrointesztinális rendszerben A fő mechanizmusok a következők: 1. cGMP-függő intracelluláris szabad Ca2+ szint csökkenés a simaizomsejtben 2. cGMP-függő
apamin-érzékeny
K+-csatorna
megnyílása,
ami
a
simaizommembrán hiperpolarizációjához vezet 3. ritkán cGMP-független mechanizmusok, melyek befolyásolják a simaizom kontraktilitását
(pl.
az
NO
közvetlenül
is
hathat
ioncsatornákra
a
simaizomsejten; 6. ábra) Szolubilis guanilát-cikláz enzimgátlók (metilénkék és ODQ) segítségével bizonyítható a cGMP szerepe az NO-okozta relaxációban a gasztrointesztinális rendszerben. Mérhető a szövetek cGMP tartalma is (ld. Toda és Herman, 2005). Egér gyomor fundus preparátumon elektromos téringerléssel kétfázisú relaxáció (korai gyors és késői lassú) váltható ki. Olyan egértörzsön, ahol a cGMP-dependens protein-kináz I. enzim hiányzik, a relaxáció korai, NO-mediált fázisa nem jön létre (Ny és mtsai, 2000).
31
Az NO (cGMP-n keresztül) megnövelheti a simaizommembránban az apamin-érzékeny K+-csatornák nyitási valószínűségét és hiperpolarizációt okoz. Kutya bél körkörös izomzatán mind az apamin-érzékeny, mind az -érzéketlen IJP-t gátolja az L-NAME (NOS gátló), ami arra utal, hogy az idegekből származó NO Ca2+-aktiválta apaminérzékeny K+-csatornákat és egyéb ioncsatornákat nyit ki és így hoz létre hiperpolarizációt (Christinck és mtsai, 1991). Már ismert, hogy az NO/cGMP jelátviteli út nem az egyetlen lehetőség a „nitrerg” transzmisszió létrejöttére. Leírtak cGMP-független, apamin-érzékeny NOokozta elernyedést patkány duodenumon és distalis colonon (Martins és mtsai, 1995; Borjesson és mtsai, 1997). A Cl--csatornák megnyílása is részt vehet az NO-okozta IJP létrejöttében (Suzuki és mtsai, 2003).
6. ábra. Az NO által közvetített ingerületátvitel lehetséges mechanizmusai a gasztrointesztinális rendszerben (részletesen ld. a szövegben). A folyamatos nyilak izgató, a pontozottak gátló hatást jelölnek. Rövidítések: ω-CT, ω-konotoxin GVIA (Ntípusú Ca2+-csatorna gátló); L-NMMA, NG-monometil-L-arginin; L-NA, NG-nitro-Larginin; α2, prejunctionalis α2 receptor; oxyHb, oxihemoglobin; SOD, szuperoxiddizmutáz; O2-, szuperoxid anion; MB, metilénkék; ODQ, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3a]quinoxalin-1-on. (Ábra átvéve módosítással: Toda és Herman, 2005)
32
Az NO direkt simaizom-kontraháló hatása Patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumon atropin jelenlétében a téringerlés elsődleges összehúzódást okoz, amit relaxáció követ. NOS gátló kivédi a primer kontrakciót; L-arginin felfüggeszti ezt a gátló hatást (D-arginin hatástalan), ami bizonyítja az NO szerepét a kontrakcióban. Az izgató válasz valószínűleg független a guanilát-cikláztól. Az NO gázon kívül összehúzódást hoz létre az NO-donor nátriumnitroprusszid, nitroglicerin és az izoamil-nitrit is (Barthó és mtsai, 1992b, 1994a; Barthó és Lefebvre, 1994; Lefebvre és Barthó, 1997). Oposszum nyelőcső izomzatán is kimutattak elsődleges NO-mediált kontrakciót, ami azonban valószínűleg guanilátcikláz aktivációján keresztül jön létre, mert metilénkék gátolja, és a 8-bromo cGMP (a sejtbe bejutó cGMP analóg) szintén kontrakciót okoz (Saha és mtsai, 1993). Az NO ko-transzmitter szerepe a NANC gátló válaszban NO és ATP Több irodalmi adat utal arra, hogy NANC idegingerlésre az NO mellett más transzmitter(ek) is felszabadulhat(nak) az enterális motoneuronokból és IJP-t és simaizom-elernyedést válthat(nak) ki. ATP-re jellemző fluoreszcens termék és NADPH-diaforáz együttes előfordulását mutatták ki patkány vékony- és vastagbél myentericus neuronjaiban (Belai és Burnstock, 1994). Számos válaszra nézve leírták, hogy az NO-szintézis gátlása vagy az apamin részlegesen, a kettő együtt viszont teljesen vagy igen erősen gátolja. Mint korábban utaltam rá, az apamin-érzékeny válasz közvetítője lehet ATP, de ez korántsem biztos. Az ATP és NO együtt közvetíti a NANC relaxációt különféle fajok gasztrointesztinális preparátumain. A „purinerg” komponens kimutatására többféle farmakológiai eszközt is felhasználtak az egyes kísérletekben (1. táblázat). Tengerimalac coecum taenián az NO és ATP szintén együtt felelős a téringerléssel kiváltott NANC relaxációért. Ezen a preparátumon a VIP/PACAP kismértékben szintén szerepet játszik ebben az elernyedésben, de ez a komponens átfedést mutat a válasz „purinerg” összetevőjével (Barthó és mtsai, 1998; Lénárd és mtsai, 2000).
33
1. táblázat. „Nitrerg” és „purinerg” beidegzés együttes jelenléte különféle fajok gasztrointesztinális preparátumain. IJP: inhibitoros junkciós potenciál; L-NOARG: NGnitro-L-arginin; L-NAME: L-nitro-arginin-metil-észter (nitrogén-monoxid szintézis gátlók); PPADS: piridoxál-foszfát-6-azofenil-2’,4’-szulfonsav (P2 purinoceptor antagonista); Hivatkozások: 1, Barthó és mtsai, 1998; 2, Boeckxstaens és mtsai, 1993; 3, Ishiguchi és mtsai, 2000; 4, Niioka és mtsai, 1997; 5, Pluja és mtsai, 1999; 6, Rózsai és mtsai, 2001; 7, Smits és Lefebvre, 1996; 8, Zagorodnyuk és Maggi, 1994. Faj
Szerv
Farmakológiai bizonyíték
Humán
colon
apamin önmagában részlegesen, LNOARG jelenlétében erőteljesen gátolja a NANC relaxációt
2
colon
apamin önmagában részlegesen gátolja az IJP-t, míg az L-NOARG erősen gátolja a fennmaradó apamin-rezisztens részt
8
colon
PPADS önmagában kb. 30 %-kal gátolja a NANC relaxációt, L-NOARG és PPADS együttes jelenlétében már kb. 60 %-os a gátlás mértéke
6
taenia coeci
PPADS önmagában kb. felére gátolja, NOS gátló (L-NOARG) jelenlétében teljesen kivédi a NANC relaxációt
1
pylorus
PPADS önmagában nem, csak L-NAME jelenlétében gátolja a NANC relaxációt
3
ileum
ATP-deszenzibilizáció részlegesen gátolja a NANC relaxációt, L-NAME jelenlétében nem okoz további gátlást
7
jejunum
apamin önmagában erősen (kb. 70 %-kal) csökkenti a NANC relaxációt, LNOARG jelenlétében teljes gátlást vált ki
4
colon
mind az apamin, mind a suramin csökkenti az IJP amplitúdóját, L-NOARG jelenlétében az IJP amplitúdóját és időtartamát is redukálják
5
Tengerimalac
Hivatkozás
Patkány
34
NO és VIP Hisztokémiai adatok alapján a NOS-immunreaktivitás (vagy NADPH-diaforáz pozitivitás) és a VIP-immunreaktivitás kolokalizálódik a plexus myentericus neuronjaiban (Keef és mtsai, 1994). Li és Rand (1990) patkány gyomor funduson kimutatták, hogy a NANC relaxációt VIP ellenes antitest csökkenteti, a fennmaradó választ egy NOS bénító tovább gátolja. Számos preparátumon az IJP-t és a NANC relaxációt mind az NO, mind a VIP gátlószereivel csökkenteni lehet. Az NO és VIP közti interakciók még vita tárgyát képezik. Két lehetőség is elképzelhető: (1) a „sorba kapcsolt” modellnél a neuronokból felszabaduló VIP NO termelést indukál más idegvégződésekben, simaizomsejtekben vagy a Cajal-féle interszticiális sejtekben ill. az NO is befolyásolhatja a VIP felszabadulását; (2) „párhuzamos” együtthatásnál a VIP és az NO külön hatásmechanizmussal (cAMP-n ill. cGMP-n keresztül), bár esetleg potencírozó viszonyban hoz létre elernyedést (ld. Lecci és mtsai, 2002). NOS és neuropeptid Y kolokalizációt mutattak ki humán bélfalban (Nichols és mtsai, 1994). Patkány vékonybél NANC relaxációjában az NO mellett neurotenzin is közvetítő szerepet játszhat apamin-érzékeny K+-csatornák aktivációján keresztül (Yamaji és mtsai, 2002).
35
Célkitűzések Munkacsoportunk fő profilja a funkcionális zsigeri beidegzés vizsgálata, éspedig mind az extrinszik, kapszaicin-érzékeny (szenzoros) és vegetatív efferens, mind az intrinszik enterális idegekből felszabaduló nem-adrenerg, nem-kolinerg (NANC) ingerületátvivő anyagok mibenlétének, élettani és kórélettani szerepének, valamint a receptoraikon ható vegyületek farmakológiai jelentőségének vizsgálata. Vizsgálatainkban szerettük volna in vitro, izolált szervi kísérletek segítségével minél jobban megismerni a zsigeri szervek (gyomor-bélhuzam, urogenitalis traktus) motoros válaszainak mechanizmusait, hangsúlyt fektetve a kísérleti állatokon kapott eredmények humán preparátumokkal való összevetésére. Minél többet meg kívántunk tudni szenzoros és más eredetű NANC transzmitteranyagok részvételéről a zsigeri válaszokban, interakcióikról és gyógyszeres befolyásolhatóságukról (stimuláció, antagonizmus, moduláció) élettani ill. kóros állapotokban (pl. kísérletes diabétesz). A beidegzett simaizom-preparátumok mozgásválaszainak kiváltására kémiai ingerként a szenzoros izgató kapszaicint vagy az idegek nem-szelektív “tér”-ingerlését használjuk. Az ingerület-átvivő anyagok azonosításának kritériumai közül “a hatás azonosságát” előfeltételnek, „az antagonizmus azonosságát” pedig perdöntőnek tekintjük. Tehát az általunk beadott gyanúba vett transzmitter hatása és specifikus receptoriális gátolhatósága egyezzen meg az ingerléssel létrehozott válasszal, ill. annak gátolhatóságával.
Utóbbival
egyenértékű
argumentumként
kezeljük
bizonyos
transzmitterek (NO) szintézisének gátlását, ill. a genetikailag módosított, génkioltott (KO) állatokon kapott eredményeket. A kísérleti állatok preparátumain végzett vizsgálatok mellett számos kísérletet végeztünk humán, operációs anyagból származó készítményeken. A humán szövetek (vékony és vastagbél, appendix) tanulmányozására egyedülálló lehetőséget nyújt a PTE I. sz. Sebészeti Klinikával folyó kollaborációnk. Kísérleteinkben az alábbi témakörökkel foglalkoztunk: 1. Megvizsgáltuk a kapszaicin hatását és annak mechanizmusát humán bél különböző szakaszainak körkörös izomzatán, külön hangsúlyt fektetve az NO − guanilát-cikláz rendszer gátlóinak hatására. Arra is kerestük a választ, vajon a
36
kapszaicin NO-mediált gátló hatása megfigyelhető-e más fajok (tengerimalac, egér) vastagbél preparátumain is. 2. Vizsgáltuk az endokannabinoid anandamid hatását humán szigmabél preparátumon és lehetséges interakcióját a colon kapszaicin-érzékeny beidegzésével. 3. Két bélpreparátumon (humán szigmabél körkörös izomzat, patkány vékonybél hosszanti izomzat-plexus myentericus csík) megvizsgáltuk egy NO-szintáz bénító és purinoceptor-antagonisták együttes hatását az intrinszik idegek által közvetített NANC relaxációra. 4. Több preparátumon megvizsgáltuk, vajon a NANC válaszokban szerepet játszik-e az NO mellett más olyan anyag , amely a cGMP-n keresztül fejti ki hatását. 5.
A
húgyhólyag
beidegzését
farmakológiai
eszközök
segítségével
tanulmányoztuk. Amennyire lehetséges volt, gyógyszeresen szétválasztottuk egymástól a különböző ingerületátvivők által közvetített válaszokat. 6. In vitro rendszerben megvizsgáltuk a kísérletes diabétesz hatását a patkány húgyhólyag
kapszaicin-érzékeny, kolinerg és “purinerg” idegműködéseire és
ugyanezen a preparátumon a jellemeztük.
kapszaicin-indukálta választ farmakológiailag
37
Kísérletes rész A
nitrogén-monoxid
szerepe
a
kapszaicin
által
kiváltott
mozgásválaszban különféle fajok bél körkörösizom preparátumain Bevezetés A kapszaicin a primer afferensek egy alcsoportját izgatja, amely idegek mind izgató, mind gátló válaszokat közvetítenek különféle fajok különböző gasztrointesztinális preparátumain (Holzer és Barthó, 1996; Barthó és mtsai, 2004). A különféle állatfajok intesztinális preparátumai eltérően reagálnak kapszaicinre (ld. részletesen az Általános bevezetésben). Tengerimalac ileumon a kapszaicin ideg-közvetítette kontrakciót hoz létre (ld. többek közt Barthó és Szolcsányi, 1978; Szolcsányi és Barthó, 1978; Barthó és mtsai, 1994, 1999c, 2000). Ugyanakkor atropin-kezelt, előkontrahált készítményeken a kapszaicin képes relaxációt is kiváltani (Barthó és mtsai, 1987). A gátló hatásokért a CGRP-t tartják felelősnek (Barthó és mtsai, 1987; 1991). A kapszaicin elernyedést hoz létre tengerimalac colon körkörös izomzatán. Ezt a választ nem befolyásolja TTX, viszont egy CGRP receptor antagonista a felére csökkenti, ami arra utal, hogy a kapszaicin-érzékeny idegekből CGRP szabadul fel és ez felelős a relaxációért vagy annak egy részéért (Maggi és mtsai, 1996). Humán bél simaizomzaton a kapszaicin gátló hatást vált ki (Maggi és mtsai, 1988, 1990a,b), amelyért nem a CGRP tehető felelőssé. A kapszaicin-okozta elernyedés TTX-rezisztens. Funkcionális (immun-neutralizációs) és neurokémiai kísérletek a VIP ill. valamely rokon peptid részvételét látszanak igazolni a kapszaicin hatásában (Maggi és mtsai, 1989c, 1990a,b). A nitrogén-monoxid gátló neurotranszmitter a humán gasztrointesztinális rendszerben. A nitrogén-monoxid szintáz gátlói csökkentik vagy kivédik a (NANC) relaxációt sphincter és egyéb simaizom preparátumokon in vitro (Burgleigh, 1992; Tam és Hillier, 1992; Boeckxstaens és mtsai, 1993; McKirdy és mtsai, 1993; O’Kelly és mtsai, 1993; Tottrup és mtsai, 1993). Eddig az NO részvételét a kapszaicin-okozta elernyedésben humán bélen még nem vizsgálták. Hasonlóképpen kevéssé ismert a purinoceptorok által mediált mechanizmusok szerepe ebben a válaszban. A jelen kísérletsorozat célja az volt, hogy megvizsgáljuk a kapszaicin hatását és hatásmechanizmusát humán szigmabél, egyéb humán gasztrointesztinális készítmények,
38
továbbá tengerimalac és egér colon körkörös izomzatán, külön hangsúlyt fektetve az NO-guanilát-cikláz rendszer gátlóinak hatására és a P2 purinoceptorok szerepére. Próbáltunk arra is választ keresni, hogy az endokannabinoid anandamid képes-e utánozni vagy módosítani a kapszaicin hatását ezen a szerven. Irodalmi adatok szerint ugyanis az anandamid képes hatást kiváltani a kapszaicin TRPV1 receptorain (ld. Smart és mtsai, 2000), jóllehet főhatásait kannabinoid receptorokon fejti ki (ld. Szolcsányi, 2000). Módszerek és anyagok A kísérletekhez hím CD-1 vagy C57BL/6 egereket (20-25 g) és mindkét nemű tengerimalacokat (420-500 g) használtunk. Az állatokat telített étergőzben elaltattuk és dekapitációval, ill. elvéreztetéssel leöltük. A megfelelő colonszakaszokat eltávolítottuk, átmostuk Krebs-oldattal és Petri csészébe helyeztük. A tengerimalac proximális colonjából kb. 2 mm széles gyűrűt kivágtunk, a mesenterialis oldalánál felnyitottuk és a nyálkahártyát óvatosan eltávolítottuk (Maggi és mtsai, 1996). Az egér distalis colon kb. 1,5 cm-es darabját a mesenterialis oldalánál felnyitottuk és körkörös irányú, 4-tagú cikkcakk preparátumot készítettünk belőle, amelyről a nyálkahártyát nem távolítottuk el. A humán colont, ileumot és appendixet bélcarcinoma miatt eltávolított bélszakasz marginális, még nem infiltrált részéről kaptuk. A nyálkahártyát eltávolítottuk és az izomrétegekből körkörös irányú kb. 2 x 20 mm-es preparátumokat készítettünk. A preparátumokat 5 ml-es, Krebs-oldatot tartalmazó szervfürdőkbe helyeztük (37°C-on) és folyamatosan oxigenizáltuk 95 % O2 és 5 % CO2 elegyével. A mozgásokat izotóniás jelátalakító (elmozdulásmérő) segítségével, kompenzográfon regisztráltuk (7. ábra). Tengerimalac és egér colon esetén 2 mN, humán preparátumok esetén 10 mN feszítést alkalmaztunk. A kísérleteket 1 óra inkubáció után kezdtük. A következő anyagok voltak jelen a szervfürdőben a kísérletek során: 3µmol/l guanetidin (adrenerg neuronbénító, minden preparátumnál használtuk); atropin (1 µmol/l) + a tachykinin NK1 receptor antgonista SR 140 333 (200 nmol/l) + a tachykinin NK2 receptor antagonista SR 48 968 (200 nmol/l) (Croci és mtsai, 1995) (tengerimalac colon esetén). Ezt az előkezelést előzetes kísérleti eredmények alapján választottuk, mely szerint − hasonlóan tengerimalac ileum körkörös izomzatán kapott eredményekhez (Barthó és mtsai, 1994b) − tengerimalac colonon a kapszaicin által kiváltott atropin-
39
rezisztens kontrakciót a tachykinin antagonisták gátolják, viszont a relaxációt nem befolyásolják. A többi preparátumon nem alkalmaztunk atropin és tachykinin antagonista előkezelést, mivel nem feltételeztük, hogy a kapszaicin izgatná a kolinerg és NANC excitátoros neuronokat, amiről előzetes kísérletek során meg is győződtünk.
7. ábra. Szervfürdő és jelátalakító a felfüggesztett preparátummal.
A kapszaicin-okozta relaxáció hangsúlyozására szubmaximális, tónusos kontrakciót hoztunk létre, kivéve humán appendixen és tengerimalac colonon, melyeknek spazmogének nélkül is magas tónusa volt. Humán colon és ileum esetén acetil-kolint (1 µmol/l), egér colon esetén muszkarint (1 µmol/l) alkalmaztunk. Utóbbinál a muszkarinra azért esett a választás, mert stabilabb tónust eredményezett, mint az acetil-kolin. A válaszokat izoprenalinnal (8 µmol/l) kiváltott maximális elernyedés százalékában adtuk meg. A kapszaicint csak egyszer adtuk minden egyes preparátumnak a tachyphylaxia elkerülése végett. Alkalmazott szerek: acetil-kolin-klorid, atropin-szulfát, anandamid (arachidonylethanolamid), kapszaicin, guanetidin-szulfát, muszkarin-klorid, NG-nitro-L-arginin (LNOARG), L-arginin, nátrium-nitroprusszid, α,β-meATP, piridoxál-foszfát-6-azofenil-
40
2’,4’-szulfonsav (PPADS), tetrodotoxin (TTX) (az eddigi szereket a Sigma-tól szereztük be), 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-on (ODQ; Tocris), D,Lizoprenalin-hidroklorid (Isuprel®, Abbott). A tachykinin receptor antagonista SR 140 333 és SR 48 968 jelű vegyületeket a Sanofitól kaptuk (Montpellier, France). Kontaktusidők: L-NOARG, ODQ, PPADS és TTX esetén 50 perc; L-arginin esetén 60 perc; acetil-kolin és muszkarin esetén 15-20 perc (előkontrakció); kapszaicin, α,β-meATP, nátrium-nitroprusszid, anandamid esetén 10 perc (potenciális relaxánsok), anandamid előkezelésnél 20 ill. 60 perc, izoprenalin esetén 15 perc kontaktusidőt alkalmaztunk; guanetidin végig jelen volt a kísérlet során. Statisztikai módszerek Adatainkat átlag ± SEM formájában adtuk meg. Két független minta esetén a MannWhitney tesztet, 3 független minta esetén a Kruskal-Wallis tesztet és két összefüggő mintánál a Wilcoxon tesztet alkalmaztuk statisztikai összehasonlításra. P<0,05 vagy kisebb valószínűséget fogadtunk el szignifikánsnak. Eredmények Minden preparátum esetén előzetes kísérletekben meghatározott, hatásos de nem túl magas kapszaicin koncentrációt alkalmaztunk a relaxáció kiváltására (humán colon, ileum és appendix esetén 300 nmol/l, egérnél 1 µmol/l, tengerimalacnál 2 µmol/l kapszaicint alkalmaztunk). Ismételt kapszaicin adás (1 órával az első adás után) sokkal kisebb válaszokat eredményezett az elsőhöz képest (n=3-5, az eredményeket nem tüntettük fel), ezért a kapszaicin hatását minden egyes preparátumnál csak egyszer teszteltük. Kontroll válaszokat mutat a 8. ábra. Humán szigmabélen mind a NOS-gátló L-NOARG (100 µmol/l), mind az ODQ jelű szolubilis guanilát-cikláz gátló vegyület (1 µmol/l) szignifikánsan csökkentette a kapszaicin-okozta választ (az L-NOARG kb. 70 %-os, az ODQ kb. 45 %-os gátlást okozott). 5 mmol/l L-arginin a 20 µmol/l koncentrációban alkalmazott L-NOARG hatását teljesen, a 100 µmol/l-ét részben visszaállította (9. ábra). Az L-NOARG (100 µmol/l) nem befolyásolta az izoprenalin (30-240 nmol/l) félmaximális elernyesztő hatását (39,8 ± 8,4 % L-NOARG előtt és 40,2 ± 8,8 % utána; n=5). Az L-NOARG (100
41
µmol/l) nem befolyásolta a nátrium-nitroprusszid (100-500 nmol/l) elernyesztő hatását sem (43,2 ± 6,6 % L-NOARG előtt és 50,2 ± 7,4 % utána; n=5). Az L-NOARG mérsékelt tónusos kontrakciót okozott (51,2 ± 3,5 % a megelőző 1 µmol/l acetil-kolin százalékában kifejezve; n=28), de az azt követő acetil-kolin kontrakció mértékét ez nem befolyásolta. Az ODQ (1 µmol/l) erősen gátolta a nátrium-nitroprusszid (500 nmol/l-1 µmol/l) által kiváltott félmaximális relaxációt (44,7 ± 7,4 %-ról 11,9 ± 7,8 %-ra; p<0,05; n=5). Az ODQ is kontrakciót okozott (43,7 ± 5,2 % az acetil-kolinhoz viszonyítva; n=16), de ez sem befolyásolta az acetil-kolin-okozta összehúzódást. A gyors Na+ csatorna blokkoló TTX (1 µmol/l) nem befolyásolta a kapszaicin-okozta elernyedést (9. ábra). A többi humán preparátumon és az egér colonon a NOS-gátló L-NOARG (100 µmol/l, 50 perc kontaktusidő) szignifikánsan csökkentette a kapszaicin hatását (több mint 70 %-os gátlás humán ileumon és colon ascendensen, teljes gátlás humán appendixen, kb. 50 %-os gátlás egér colonon). Csak a tengerimalac colonon nem gátolta az L-NOARG a kapszaicin-okozta relaxációt (2. táblázat). A TTX (1 µmol/l) nem befolyásolta a kapszaicin-okozta relaxációt tengerimalac colonon és humán preparátumokon, viszont részleges gátlást okozott (kb. 45%) egér colonon. Egér colonon az L-NOARG és TTX kombinált adása sem okozott nagyobb gátlást, mint a két szer külön-külön alkalmazva. Ugyanez a kombináció tengerimalac colonon nem befolyásolta a kapszaicin relaxáló hatását (2. táblázat). Humán szigmabélen a kapszaicin által kiváltott relaxációt nem befolyásolta a P2 purinoceptor antagonista PPADS (50 µmol/l) (9. ábra). A PPADS gátolta az α,βmeATP (10-30 µmol/l)-okozta relaxációt (37,6 ± 5,6 % előtte és 15,5 ± 6,2 % utána; p<0,05, n=6). Az endogén kannabinoid receptor agonista anandamid (1, 10 vagy 100 µmol/l) nem váltott ki relaxációt az előkontrahált szigmabélen (n=6 minden koncentráció esetén), 300 µmol/l anandamid sem volt képes erre (n=3). Az anandamid jelenléte nem befolyásolta a kapszaicin (300 nmol/l) relaxáló hatását. A kontroll preparátumok az anandamid oldószerét, alkoholt (max. 3 µl/ml koncentráció a szervfürdőben) kaptak a kapszaicin adása előtt. Nem találtunk különbséget az anandamid-kezelt és kontroll csoport között a kapszaicin által kiváltott relaxációban még akkor sem, ha az anandamid (100 µmol/l) kontaktusidejét 60 percre növeltük (3. táblázat).
42
Egy külön kísérletsorozatban megvizsgáltuk a kapszaicin (1 µmol/l) hatását vad típusú és TRPV1 receptor knockout C57BL/6 egereken (Davis és mtsai, 2000). A vad típusú egerek colonján a kapszaicin hasonló mértékű relaxációt váltott ki, mint CD-1 egereken, viszont a knockout csoporton minimális elernyedést kaptunk (45,3 ± 5,6 % vad típuson, 5,1 ± 3,3 % knockout állatokon; p<0,001; n=6 ill. 7).
43
Humán szigmabél
Kapszaicin 300 nmol/l
Humán ileum
Humán appendix
Kapszaicin 300 nmol/l
Kapszaicin 300 nmol/l
Egér colon
Kapszaicin 1 µmol/l
Tengerimalac colon
Kapszaicin 2 µmol/l
8. ábra. A kapszaicin relaxáló hatása különféle fajok bél körkörösizom preparátumain. A függőleges kalibráció az izoprenalinnal (8 µmol/l) kiváltott maximális elernyedés, a vízszintes kalibráció 5 perc.
44
Kapszaicin (300 nmol/l)
Kapszaicin (300 nmol/l) L-NOARG (100 µmol/l) + L-arginin (5 mmol/l)
Kontroll
0
0
10
10
20
20
*
30 40
*
50
Relaxáció %
Relaxáció %
Kontroll
L-NOARG (100 µmol/l)
L-NOARG (20 µmol/l) + L-arginin (5 mmol/l)
30
*
40 50
#
60
60
70
70
#
Kapszaicin (300 nmol/l)
Kapszaicin (300 nmol/l) Kontroll
L-NOARG (20 µmol/l)
Kontroll
ODQ (1 µmol/l)
TTX (1 mmol/l)
0
0
10
20
30
*
40
Relaxáció %
Relaxáció %
10
20
30
40 50
50
60
Kapszaicin (300 nmol/l) Kontroll
PPADS (50 µmol/l)
0
Relaxáció %
10
20
30
40
50
60
9. ábra. A kapszaicin (300 nmol/l) által kiváltott relaxációt befolyásoló különféle szerek hatásai humán szigmabél körkörös izomzatán. A preparátumokat acetil-kolinnal (1 µmol/l) szubmaximálisan előkontraháltuk, a válaszokat izoprenalinnal kiváltott maximális elernyedés %-ában adtuk meg. Az oldószeres kontroll preparátumok ugyanazokból a betegekből származtak, mint a hozzájuk tartozó különféle kezelést kapott praparátumok. Két független minta esetén a Mann-Whitney tesztet, 3 független minta esetén a Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztuk statisztikai összehasonlításra. P<0,05 vagy kisebb valószínűséget fogadtunk el szignifikánsnak. * Szignifikáns különbség a kontroll csoporthoz képest; # Szignifikáns különbség az L-NOARG-kezelt csoporthoz képest.
45
2. táblázat. A kapszaicin által kiváltott relaxáció vizsgálata többféle faj intesztinális körkörösizom preparátumain. A kapszaicin koncentrációk a következők voltak: 1 µmol/l egér colon esetén; 2 µmol/l tengerimalac colon esetén; 300 nmol/l a humán preparátumok esetén. Átlag ± SEM. * A kontroll csoporttól (−) való szignifikáns eltérés. P<0,05 vagy kisebb eltérést fogadtunk el szignifikánsnak. Két független minta esetén a Mann-Whitney tesztet, több független minta esetén a Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztuk statisztikai összehasonlításra.
Előkezelés
Kapszaicin relaxáció n
Egér (CD-1) disztális colon − L-NOARG (100 µmol/l) Tetrodotoxin (1 µmol/l)
38,4 ± 3,8 18,0 ± 2,2* 20,8 ± 3,5*
14 10 11
− L-NOARG + Tetrodotoxin Tengerimalac proximális colon
45,0 ± 6,1 16,6 ± 2,5*
8 9
− L-NOARG (100 µmol/l) Tetrodotoxin (1 µmol/l) L-NOARG + Tetrodotoxin Humán ileum
18,1 ± 2,6 14,3 ± 2,7 15,5 ± 3,6 15,0 ± 1,9
13 8 8 9
− L-NOARG (100 µmol/l) Tetrodotoxin (1 µmol/l) Humán colon ascendens
48,2 ± 6,4 7,9 ± 2,3* 38,1 ± 4,2
9 6 5
− L-NOARG (100 µmol/l) Tetrodotoxin (1 µmol/l) Humán appendix
48,2 ± 6,8 10,9 ± 3,3* 49,3 ± 5,8
9 8 7
− L-NOARG (100 µmol/l) Tetrodotoxin (1 µmol/l)
27,5 ± 4,9 0 ± 0* 25,2 ±5,6
10 6 5
46
3. táblázat. Az anandamid hatása a kapszaicin (300 nmol/l) által kiváltott relaxációra humán szigmabél körkörös izomzatán. A preparátumokat acetil-kolinnal (1 µmol/l) szubmaximálisan előkontraháltuk; a válaszokat izoprenalinnal kiváltott maximális elernyedés %-ában adtuk meg. Az oldószeres kontroll preparátumok (−) ugyanazokból a betegekből származtak, mint a hozzájuk tartozó különféle kezelést kapott preparátumok. Átlag ± SEM. A két független minta esetén a Mann-Whitney tesztet alkalmaztuk statisztikai összehasonlításra. P<0,05 vagy kisebb valószínűséget fogadtunk el szignifikánsnak.
Előkezelés
Kapszaicin relaxáció n (300 nmol/l)
− Anandamid (1 µmol/l; 10 min)
63,4 ± 4,0 60,9 ± 6,5
6 6
− Anandamid (10 µmol/l; 10 min)
69,7 ± 5,2 69,6 ± 4,1
5 6
− Anandamid (100 µmol/l; 10 min)
67,9 ± 4,3 62,7 ± 6,5
7 6
− Anandamid (100 µmol/l; 60 min)
63,9 ± 3,5 58,4 ± 5,5
10 9
47
Megbeszélés Eredményeink szerint az NO jelentős szerepet játszik a kapszaicin-okozta elernyedésben humán szigmabél és colon ascendens, humán ileum, humán appendix és egér colon körkörös izomzatán, tehát a kapszaicin-okozta NO-felszabadulás valószínűleg elterjedt jelenség. Az NO az enterális neuronok egyik fontos neurotranszmittere (ld. Whittle, 1994; Rand és Li, 1995). A megfigyelt kapszaicin hatások specifikussága mellett szól a viszonylag alacsony koncentrációk alkalmazása és a tachyphylaxia jelenléte is, továbbá az, hogy a kapszaicin csak minimális hatást váltott ki TRPV1 receptor knockout egereken, de jelentős relaxációt okozott a vad típusú kontroll csoporton. A kísérleteinkben használt L-NOARG ebben a koncentrációban nem okoz nemspecifikus hatásokat (Barthó és mtsai, 1999a), viszont nem tesz különbséget a NOS altípusok között. Bár humán szigmabélen az L-NOARG és az ODQ simaizomtónusemelkedést okozott, nem valószínű, hogy a kapszaicin által kiváltott relaxációra gyakorolt hatásuk ebből a kontraháló hatásból származna, mivel (1) az L-NOARG nem befolyásolta az alacsony koncentrációjú izoprenalin által kiváltott elernyedést és (2) egyik szer sem változtatta meg az acetil-kolin által kiváltott összehúzódás mértékét. Az L-NOARG kontraháló hatását Boeckxstaens és mtsai (1993) már leírták proximális és disztális humán colonra vonatkozóan. Saját eredményeink ezt most kiterjesztik a szigmabélre is, ami azt jelenti, hogy a tónusos “nitrerg” kontroll szerepet játszik ennek a bélszakasznak a működésében. A szigmabél kritikus szerepet játszik a székletformálás ütemében, amiben a körkörös izomzat tónusos gátlása valószínűleg nagy jelentőségű. A fent említett szerzők leírták az L-NOARG (100 µmol/l) specifikus gátló hatását humán colon “nitrerg” mechanizmusaira is (elektromos téringerlés hatására bekövetkező NANC relaxációra vonatkozóan). Viszont az L-NOARG-nak nem volt hatása az exogén ATP, az exogén NO vagy a nitroglycerin által okozott relaxációra (Boeckxstaens és mtsai, 1993). A saját erdményeink szerint az L-NOARG-nak (100 µmol/l) nem volt hatása az izoprenalinnal vagy nátrium-nitroprussziddal kiváltott elernyedésre a szigmabél körkörös izomzatán. Mindezen eredmények és az L-arginin hatása (amely megszüntette az L-NOARG-okozta gátlást) meggyőzött minket az L-NOARG hatás specifikusságáról. A kapszaicin-okozta relaxáció mechanizmusa úgy tűnik némileg különböző az egyes preparátumokon. A gyors Na+ csatorna blokkoló tetrodotoxin szignifikánsan
48
csökkentette a kapszaicin hatását egér colonon, viszont humán preparátumokon nem okozott gátlást. A kapszaicin intesztinális hatásait tekintve ismert, hogy az extrinszik érzőidegeket izgatja a bélrendszerben (ld. Barthó és Szolcsányi, 1978; Holzer, 1991; Holzer és Barthó, 1996; Barthó és mtsai, 2004). Számos bizonyíték található arra nézve, hogy
a
kapszaicin
hatására
történő
transzmitter
felszabadulás
az
érző
idegvégződésekből TTX-rezisztens folyamat (ld. többek közt Barthó és mtsai, 2004), mivel kapszaicin hatására a TRPV1 receptorok (kationcsatornák) megnyílása független a TTX-érzékeny Na+ csatornáktól (ld. Caterina és Julius, 2001). Egér colon esetén azt feltételezzük, hogy a kapszaicin-érzékeny idegvégződések aktiválják az intrinszik enterális neuronokat, így az NO származhat a kapszaicin-érzékeny extrinszik neuronokból, az enterális neuronokból vagy mindkettőből. Az is lehetséges, hogy egy “nitrerg” kapcsolat áll fenn a szenzoros és enterális neuronok közt és az utóbbi más gátló transzmittereket is tartalmazhat. Az NO képes az enterális neuronok aktiválására (Barthó és Lefebvre, 1994b; Hebeiss és Kilbinger, 1996). A harmadik lehetőség, hogy a kapszaicin a szenzoros idegvégződések egy részét direkt módon izgatja (TRPV1 receptorokon keresztül) és ezek aktiválhatnak más további érző idegvégződéseket indirekt úton, axon-reflex közvetítésével (axon-reflex létrejöttéhez szükséges TTXérzékeny ingerületvezetés). Humán preparátumokon a TTX nem gátolta a kapszaicin relaxációt. Mivel az LNOARG jelentős gátlást okozott, legalábbis feltételezhető, hogy az NO a kapszaicinérzékeny érző idegvégződésekből származik. Kimutatták hátsó gyöki ganglionsejtekben a NOS jelenlétét mind tengerimalacban és egérben, mind emberben (Aimi és mtsai, 1991; Terenghi és mtsai, 1993; Farkas-Szállási és mtsai, 1995; Ren és Ruda, 1995; Thippeswamy és Morris, 2002). Mindezidáig nem írtak le olyan zsigeri motoros választ, melyet a szenzoros idegekből felszabaduló NO közvetítene. Humán készítmények esetén a kapszaicin hatására egy alternatív magyarázat is lehetséges, nevezetesen hogy a kapszaicin-érzékeny receptorok (TRPV1 típus, ld. Caterina és Julius, 2001) a myentericus (részben “nitrerg”) neuronokon helyezkednének el, melyre morfológiai adatok is találhatók sertés és tengerimalac ileuma esetén (Poonyachoti és mtsai, 2002; Anavi-Goffer és Coutts, 2003). Viszont ha a TRPV1 receptorok az enterális neuronok sejttestjén helyezkednének el, akkor a kapszaicin relaxáló hatásának TTX-érzékenynek kellene lennie. Ellentétben a fenti adatokkal, több szerző nem tudott kimutatni TRPV1immunreaktivitást sejttesteken, viszont idegvégződések jelölődtek (valószínűleg az extrinszik afferensek végződései; Patterson és mtsai, 2003; Ward és mtsai, 2003). A
49
morfológiai és funkcionális adatok közti látszólagos ellentmondás feloldására és a myentericus neuronokon lévő TRPV1-szerű struktúrák szerepének tisztázására még további kutatások szükségesek. Már hosszú ideje úgy tartják, hogy a “purinerg” mechanizmusoknak szerepe van az érzőideg-működés kapcsán létrejövő “lokális efferens” válaszban (Holton, 1959; Burnstock, 2000; Barthó és mtsai, 1999b; 2000). Indirekt bizonyítékok találhatók erre nézve tengerimalac ileumon (Barthó és mtsai, 1999b; 2000). A jelen kísérletekben alkalmazott P2 purinoceptor antagonista PPADS (Lambrecht és mtsai, 1992; Bültmann és mtsai, 1999) nem befolyásolta a kapszaicin relaxáló hatását humán szigmabél körkörös izomzatán, viszont gátolta az α,β-meATP-vel kiváltott elernyedést. Az α,βmeATP egy metabolikusan aktív ATP analóg agonista, mely bizonyos P2X purinoceptorokon hat (egyes adatok szerint P2Y jellegű purin-receptorokat is izgatni tud). Eredményeink arra utalnak, hogy PPADS-érzékeny purinoceptorok nem vesznek részt a kapszaicin-okozta elernyedésben. Humán bél preparátumokon a VIP is lehetséges transzmitter a kapszaicin-okozta gátló válasz közvetítésében (Maggi és mtsai, 1990a,b). A jelen kísérlet célja nem a VIP szerepének tisztázása volt, annál is inkább, mert nem találtunk olyan szert, mely az exogén VIP hatását megbízhatóan kivédené humán bél készítményeken. A VIP hatására simaizomsejtekből történő NO felszabadulás (ld. Murthy és mtsai, 1995) szintén szerepet játszhat a kapott eredményekben, de a VIP részvétele még további vizsgálatokat igényel. A kapszaicin-okozta gátló válaszban a CGRP részvételére utaló adatok vannak tengerimalac ileumon és colonon (Barthó és mtsai, 1991; Maggi és mtsai, 1996). Ez önmagában még nem zárja ki az NO mediátor szerepét additív módon vagy “sorba kapcsoltan” együttműködve CGRP-vel. A jelen eredmények az NO részvétele ellen szólnak a kapszaicin-okozta relaxációban tengerimalac colonon, mivel az L-NOARG nem gátolta a kapszaicin-okozta választ. Ezen a preparátumon − akárcsak tengerimalac ileumon (ld. Barthó és mtsai, 2004) – a kapszaicin hatására egyaránt felszabadulnak kontraháló és relaxáló neurotranszmitterek a szenzoros idegekből, sőt még az intrinszik izgató enterális neuronok is aktiválódnak a kapszaicin hatás következtében. Az enterális motoneuronokból acetil-kolin szabadul fel, miközben tachykininek liberálódnak mind az enterális motoneuronokból, mind az extrinszik szenzoros neuronokból. Ezért alkalmazzuk a
Maggi és mtsai (1996) által leírt eljárást, hogy zavartalanul
vizsgálhassuk a kapszaicin relaxáló hatását tengerimalac colon preparátumon. Ennek
50
során atropin és tachykinin receptor antagonisták segítségével gátoltuk a kapszaicinokozta kontrakciós választ. Kétoldalú kapcsolatot feltételeznek az endokannabinoid anandamid és a kapszaicin-érzékeny mechanizmusok között. Egyrészről az anandamid stimulálja a TRPV1 kapszaicin receptorokat (de hasonlóan a kapszaicinhez, hosszú ideig, nagy koncentrációban adva gátolja is a TRPV1 receptorokat). Másrészt az anandamid gátolhatja a kapszaicin-érzékeny idegek működését kannabinoid receptorokon keresztül (Smart és mtsai, 2000; Szolcsányi, 2000). Az első esetben az anandamid utánozza a kapszaicin hatását, míg a másikban gátolja. A jelen kísérletben (humán szigmabélen) nem
kaptunk
bizonyítékot
az
anandamid
egyik
hatására
sem,
széles
koncentrációtartomány alkalmazása ellenére. A kapott negatív eredmény magyarázatául szolgálhat, hogy az anandamid felvétele az érző idegvégződésbe nem tökéletes, márpedig ez szükséges ahhoz, hogy a szer kifejtse a hatását a TRPV1 kapszaicin receptorokon (De Petrocellis és mtsai, 2001). Eredményeink viszont nem zárják ki annak a lehetőségét, hogy a kapszaicin-érzékeny idegek más típusú aktivációja (pl. elektromos ingerlés) esetén az anandamid gátolhatja az érző idegek funkcióit. Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az NO jelentős szerepet játszik a kapszaicin-okozta elernyedésben humán szigmabél körkörös izomzatán, ellenben PPADS-szenzitív purinoceptorok szerepét nem sikerült kimutatni. Az endokannabinoid anandamid még nagy koncentrációban alkalmazva sem utánozza a kapszaicin hatását. Az NO részt vesz a kapszaicin-okozta elernyedésben egér distalis colon, humán ileum, appendix és colon ascendens körkörös izom preparátumokon is, tengerimalac colonon viszont nem játszik szerepet a válaszban. A kapszaicin hatására létrejövő NO-mediált relaxáció a humán béltraktus körkörös izomzatán eszerint valószínűleg általánosan elterjedt jelenség, amely rágcsáló béltraktuson is megfigyelhető.
51
“Nitrerg-purinerg” interakciók humán és patkány bélpreparátumokon Bevezetés A gasztrointesztinális simaizomzat NANC válaszait − köztük a nem-szelektív idegingerléssel kiváltott NANC elernyedést − döntő mértékben a bélfal saját (intrinszik) neuronjai közvetítik, amelyek főleg a plexus myentericusban helyezkednek el és nem érzékenyek kapszaicinre. Mind az extracelluláris ATP, mind az NO számontartott NANC transzmitterek a gyomor-bélhuzamban (ld. többek közt Burnstock, 1990, 1997; Lefebvre, 1995; Rand és Li, 1995; Lecci és mtsai, 2002). Bár az ATP ilyen irányú szerepét sokkal régebben kutatják (ld. Burnstock, 1972), az ezzel kapcsolatos ismeretek csak lassan bővülnek, aminek oka pl. a receptorok sokfélesége és a specifikus antagonisták viszonylagos hiánya. Sokkal több adat áll rendelkezésre az NO gátló neuromuszkuláris ingerületátvivő szerepéről (ld. Whittle, 1994; Lefebvre, 1995; Rand és Li, 1995; Lecci és mtsai, 2002). Egyaránt lehetséges, hogy az NO valóban valamivel fontosabb NANC transzmitter, mint az ATP, másrészt az is, hogy az NO-kutatás korai fázisában kifejlesztett specifikus szintézisgátló L-arginin-analógok óriási lendületet adtak az NO-val kapcsolatos funkcionális kutatásoknak. Ilyen hasznos szer a “purinerg” ingerületátvitel területén nem áll rendelkezésünkre. A “purinerg” neurotranszmisszió kiiktatására használható módszer az ATP deszenzibilizáció, az apamin és a purinoceptor antagonisták (pl. PPADS, suramin) alkalmazása (ld. Általános bevezetésben). Különös figyelmet érdemel a két gátló NANC neuroeffektor (ATP, NO) együtthatása. Eddigi adataink szerint az NO és az ATP additív módon közvetíti a tengerimalac taenia coeci (Barthó és mtsai, 1998), ill. a tengerimalac colon elektromos ingerléssel kiváltott NANC relaxációját (Rózsai és mtsai, 2001). Patkány ileum hosszanti izomzat-plexus myentericus csík preparátumon elektromos téringerléssel komplex motoros válasz váltható ki. A válasz egyik jellegzetessége a nitrogén monoxid-okozta primer kontrakció (Barthó és mtsai, 1992; Barthó és Lefebvre, 1994a; Smits és Lefebvre, 1996). Az NO a primer kontrakció mellett a primer relaxáció kiváltásában is szerepet játszik (Barthó és Lefebvre, 1994a; Smits és Lefebvre, 1996). Smits és Lefebvre (1996) eredményei szerint a relaxációt a NOS gátlók és ATP deszenzibilizáció csökkenti, míg purinoceptor antagonisták (reactive blue 2 és suramin) nem befolyásolják. Szerintük az NO és ATP mellett még
52
valamilyen ismeretlen transzmitter is részt vesz az elernyedés létrehozásában ezen a preparátumon. Patkány jejunum NANC relaxációját „nitrerg” és apamin-érzékeny mechanizmusok hozzák létre (Niioka és mtsai, 1997). Más kutatók azt találták, hogy patkány vékonybél NANC relaxációjában az NO mellett neurotenzin is szerepet játszik (Yamaji és mtsai, 2002). A jelen kísérletsorozatok célja az volt, hogy két, jelentős NANC relaxációt mutató bélpreparátumon (humán colon körkörös izomzat, patkány vékonybél hosszanti izomzat-plexus
myentericus
csík)
megvizsgáljuk
egy
NO-szintáz
bénító
és
purinoceptor-antagonisták együttes hatását, továbbá a guanilát-cikláz bénításának befolyását a NANC elernyedésre. A megválaszolandó kérdések: (a) “Purinerg” idegek részt vesznek-e a válasz közvetítésében? (b) Ha igen, mi a viszonyuk a “nitrerg”-idegek szerepéhez, ill. a kettő együtt a válaszok egészét megmagyarázza-e? (c) A “nitrerg” idegek a guanilát-cikláz enzim közvetítésével hatnak-e, ill. részt vesz-e a válaszban más, a guanilát-ciklázon keresztül ható ingerületátvivő anyag? Módszerek és anyagok Patkány és humán izolált bél készítmények Wistar patkányok ileumát (az állatok leölése után) kimetszettük és kb. 3 cm-es darabokból Paton és Vizi (1969) módszerét követve hosszanti izom-plexus myentericus csík preparátumokat készítettünk. A preparátumok elkészítéséhez viszonylag nagy testtömegű patkányok ideálisak, ezért 400-500 g tömegű állatokat használtunk a kísérletekhez. A humán szigmabél preparátumokat carcinoma miatti bélműtéten átesett páciensek eltávolított ép bélszakaszaiból készítettük. Körkörös irányú kb. 2 x 20 mm méretű preparátumokat készítettünk, melyekről a nyálkahártyát lemetszettük. A kísérletek menete A készítményeket 5 ml-es szervfürdőkben, 37 °C-os, oxigenizált (95 % O2 + 5% CO2) Krebs-oldatban függesztettük fel. A mozgásokat izotóniásan regisztráltuk. A patkány ileum preparátumok esetén 2 mN-os, humán szigmabél estén 10 mN-os feszítést alkalmaztunk.
53
Az idegeket elektromos téringerléssel (EFS; Paton és Vizi, 1969) aktiváltuk atropin (1 µmol/l) és guanetidin (3 µmol/l) jelenlétében. Patkány ileum esetén 1 óra inkubációs periódus után a preparátumokat prosztaglandin F2α-val (0,1 µmol/l) szubmaximálisan előkontraháltuk és idegingerlést (EFS) vagy valamilyen relaxáló ágenst (ATP, α,βmeATP, adenozin, nitroglicerin, nátrium-nitroprusszid vagy izoprenalin; kontaktus idő 3 perc) alkalmaztunk. Az EFS paraméterei: amplitúdó 60 V, impulzusszélesség 0,2 ms, 10 Hz-es frekvencia 20 s-ig. A humán szigmabél preparátumokat a szintén 1 óra inkubációs periódus letelte után hisztaminnal (5 µmol/l) előkontraháltuk, majd EFS-t vagy valamely relaxáló anyagot (izoprenalin, α,β-meATP) alkalmaztunk. Az EFS paraméterei: amplitúdó 80 V, impulzus szélesség 0,1 ms, 1 ill. 10 Hz-es frekvencia 20 s-ig. Ezt követően a fürdőben a folyadékot lecseréltük és 40 perces inkubációs idő után a folyamatot ismételtük mindkét preparátum esetén. Az EFS 3 ciklusban ismételhetőnek bizonyult. Alkalmazott szerek: adenozin-hemiszulfát, adenozin-5’-trifoszfát (ATP), α,β-meATP, apamin, atropin-szulfát, guanetidin-szulfát, hisztamin-dihidroklorid, NG-nitro-L-arginin (L-NOARG), prosztaglandin F2α (PGF2α), piridoxál-foszfát-6-azofenil-2’,4’-szulfonsav (PPADS), nátrium-nitroprusszid, suramin, tetrodotoxin (TTX) (az eddig felsorolt anyagokat a Sigma-tól szereztük be), D,L-izoprenalin-hidroklorid (Isuprel®, Abbott), 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-on (ODQ; Tocris), nitroglicerin (gliceriltrinitrát; Nitro-Pohl®, Merck-Pharma). Statisztikai módszerek A válaszok nagyságát a maximális elernyedés %-ában fejeztük ki, melyet a kísérlet végén izoprenalin (8 µmol/l) segítségével váltottunk ki. Adatainkat átlag ± SEM formájában adtuk meg. A statisztikai összehasonlításokat Wilcoxon teszt (két összefüggő minta esetén), Quade teszt (több összefüggő minta esetén) és MannWhitney teszt (két független minta esetén) segítségével végeztük és p<0,05 vagy kisebb valószínűséget tekintettünk szignifikánsnak.
54
Eredmények Patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumok A TTX, az L-NOARG, az apamin és a P2 purinoceptor antagonisták hatása a NANC relaxációra Előkontrahált preparátumokon az EFS gyors relaxációt váltott ki (10. ábra), melyet a TTX (1 µmol/l, 20 perc kontaktusidő, n=4) teljesen kivédett. A relaxációs válasz LNOARG (100 µmol/l) jelenlétében részben megmaradt (L-NOARG előtt 38,2 ± 3,4 %, utána 25,8 ± 1,9 %, n=13). Apamin (0,3 µmol/l) önmagában csak mérsékelt (kb. 30 %os) gátlást okozott (11A ábra). Apamin és L-NOARG kombinált alkalmazása már kb. 85 %-os gátlást eredményezett (11B ábra).
1 min
. . % Relaxáció
0
50
10. ábra. Eredeti regisztrátum patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumon elektromos téringerléssel kiváltott NANC relaxációról (10 Hz 20 s). A pontok az idegingerlés kezdetét és végét jelölik. Kalibrációk: függőleges-izoprenalinnal kiváltott maximális elernyedés 50 %-a; vízszintes-1 perc.
55
A
A
B Kontroll
Apamin
Apamin + L-NOARG
0
0
10
Relaxáció %
10
Relaxáció %
EFS
B
EFS Kontroll
20
30
20
* 30
40
*
40
50
50
60
C
D
EFS
A
L-NOARG
EFS
B
L-NOARG + PPADS
L-NOARG + Suramin
L-NOARG
0
0
* 10
*
Relaxáció %
Relaxáció %
10
20
30
30
E
F
EFS
A
20
Kontroll
PPADS
EFS
B PPADS
PPADS + L-NOARG
0
0
10
* Relaxáció %
Relaxáció %
10
20
30
20
40
* 30
50
11. ábra. A, B: Az apamin (0,3 µmol/l) és az apamin plusz L-NOARG (100 µmol/l) gátló hatása a patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumok elektromos téringerléssel kiváltott NANC relaxációjára a kontroll válaszokhoz képest; C, D: Az L-NOARG plusz PPADS (50 µmol/l) és az L-NOARG plusz suramin (100 µmol/l) gátló hatása a relaxációra az L-NOARG-kezelt csoporthoz képest; E, F: A PPADS és a PPADS plusz L-NOARG gátló hatása a relaxációra kontroll ill. PPADS-kezelt preparátumokon. Átlag ± SEM. * − Szignifikáns különbség, * p<0,05 vagy kisebb (Wilcoxon teszt). Állatszám: n=5−7.
56
Az L-NOARG-kezelt preparátumokon mind a suramin (100 µmol/l), mind a PPADS (50 µmol/l) szinte teljesen kivédte az EFS által kiváltott relaxációt (11C,D ábra). Így már nem meglepő, hogy az L-NOARG plusz PPADS plusz suramin együtt teljes gátlást okozott (n=5, nincs ábrázolva). A PPADS önmagában csak mérsékelt gátlást váltott ki (11E ábra). A PPADS-kezelt preparátumokon az L-NOARG
teljes gátlást
eredményezett (11F ábra). Az ODQ hatása az EFS, nitroglicerin és nátrium-nitroprusszid által kiváltott relaxációra A guanilát-cikláz gátló ODQ (1 µmol/l) nem növelte tovább az L-NOARG (100 µmol/l) gátló hatását az EFS-okozta relaxációra (L-NOARG előtt 40,6 ± 6,4 %, L-NOARG jelenlétében 29,9 ± 2,7 %, L-NOARG plusz ODQ jelenlétében 29,8 ± 5,6 %, n=7). Az ODQ (1 µmol/l) gátolta a nitroglicerin (13 µmol/l) relaxáló hatását (kontroll 43,1 ± 6,0 %, ODQ jelenlétében 6,4 ± 3,5 %, p<0,01, n=5; független mintákon történt a vizsgálat, mivel a nitroglicerin hatása nem volt ismételhető). A nitroglicerin által kiváltott relaxáció lefolyása gyors, ami az EFS-okozta NANC relaxációhoz hasonló. A nátrumnitroprusszid koncentráció-függő, lassú relaxációt hozott létre (10 µmol/l még nem váltott ki következetes hatást, 100 µmol/l 19 %-os, 1 mmol/l 31 %-os elernyedést okozott, n=4−6). 100 µmol/l-es koncentrációnál a válasz ismételhető volt (n=4). A nátrum-nitroprusszid (100 µmol/l) által kiváltott relaxációt az ODQ (1 µmol/l) teljesen kivédte (30 % ODQ előtt és 0 % utána, p<0,05, n=5). A PPADS hatása a purinoceptor agonisták, a nátrium-nitroprusszid és az izoprenalin által kiváltott relaxációra Az ATP (0,1−500 µmol/l) elernyedést okozott. A szer független adásával (1 preparátumnak 1 beadás) nagyjából harang alakú dózis-hatás görbét kaptunk (12A ábra). Az 500 µmol/l-es koncentráció nem vagy csak minimális relaxációt okozott, ezt kontrakciós válasz követte. A PPADS (50 µmol/l) gátolta az ATP (1 µmol/l) relaxáló hatását (13A ábra). Az α,β-meATP szintén koncentráció-függő elernyedést okozott patkány ileumon 1−100 µmol/l-es koncentráció tartományban (12B ábra). Az α,βmeATP (10 µmol/l) relaxáló hatását a PPADS (50 µmol/l) kivédte (13B ábra). Mind az ATP, mind az α,β-meATP relaxáló hatása gyors volt, akárcsak az EFS-okozta elernyedés. A PPADS nem befolyásolta a nátrium-nitroprusszid (100 µmol/l)-okozta relaxációt (23,3 ± 7,4 % PPADS előtt, 25,0 ± 5,7 % utána, n=5). A PPADS (50 µmol/l) plusz
suramin
(100
µmol/l)
együtt
sem
befolyásolta
az
izoprenalin
57
ATP
A -7
0
10 M
-6
10 M
-5
10 M
-4
10 M
-4
α,β -metilén ATP
B
-6
5 x 10 M
10 M
-4
-5
10 M
10 M
0
Relaxáció %
Relaxáció %
10
10
20
20 30
12. ábra. ATP-vel (A) ill. α,β-meATP-vel (B) kiváltott relaxáció patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumon. Minden beadás külön preparátumon történt. n=5−22.
B
A
ATP
PPADS + ATP
α,β -meATP
PPADS + α,β -meATP
0
0
10
*
Relaxáció %
Relaxáció %
*
10
20
20
13. ábra. A PPADS (50 µmol/l) gátló hatása patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumon az (A) ATP-vel (1 µmol/l, n=6) ill. (B) α,β-meATP-vel (10 µmol/l, n=5) kiváltott elernyedésre. Átlag ± SEM; * p<0,05 (Wilcoxon teszt).
58
(5−10 nmol/l) által kiváltott félmaximális elernyedést (49,2 ± 6,9 % purinoceptor antagonisták előtt, 55,5 ± 7,2 % utána, n=4). Az adenozin hatása Az adenozin csak nagy koncentrációban váltott ki relaxációt patkány ileumon. A válasz lefolyása lassú volt (2 perc alatt érte el a hatásmaximumát), nem hasonlított az EFSokozta elernyedésre. 10 µmol/l adenozin 6,2 ± 4,8 %-os, 100 µmol/l adenozin 20,1 ± 7,8 %-os, 1 mmol/l adenozin 55,7 ± 8,7 %-os relaxációt váltott ki (n=4−6). Humán szigmabél preparátumok A hisztaminnal előkontrahált humán szigmabélen elektromos téringerléssel NANC relaxációt váltottunk ki (14. ábra). A relaxációt a TTX (1 µmol/l) mindkét alkalmazott frekvencián (1 és 10 Hz) kivédte (n=5). Az L-NOARG (100 µmol/l) gátolta az idegingerléssel kiváltott NANC relaxációt humán szigmabélen; 1 Hz-en több mint 40 %-os (n=30), 10 Hz-en kb. 50 %-os gátlást okozott (n=31). L-NOARG jelenlétében az idegingerlésre kapott válasz reprodukálhatónak bizonyult. Az L-NOARG-kezelt preparátumokon a purinoceptor antagonista PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) kombinációja jelentős gátlást eredményezett, de ha a két purinoceptor antagonistát külön adtuk a fürdőbe, semmilyen vagy csak minimális hatást észleltünk (5. táblázat). Kontroll preparátumokon a PPADS plusz suramin kombinált adása nem gátolta az 1 ill. 10 Hz-es idegingerléssel kiváltott NANC relaxációt, míg a purinoceptor antagonisták jelenlétében ingerelve az L-NOARG majdnem teljesen kivédte az elernyedést (kb. 80 %-os gátlás 1 Hz-en, 90 %-os gátlás 10 Hz-en) (5. táblázat). A metabolikusan stabil ATP analóg, az α,β-meATP (5 µmol/l)-okozta relaxációt a TTX nem befolyásolta. Az α,β-meATP elernyesztő hatását a PPADS plusz suramin együtt jelentősen gátolta, míg a PPADS önmagában mérsékelt gátlást okozott. A suramin önmagában nem volt hatással a relaxációra (4. táblázat). A purinoceptor antagonisták kombinációja nem befolyásolta az izoprenalinnal (30−200 nmol/l) kiváltott elernyedést (kontroll 52,4 ± 4,6 %, antagonisták után 49,6 ± 2,5 %, n=6). Az antagonisták nem befolyásolták a nifedipinnel (3 µmol/l) kiváltott elernyedést sem. A nifedipin lassú relaxációt váltott ki, mely nem volt ismételhető, ezért független csoporton végeztük ezeket a kísérleteket. A nifedipin-okozta elernyedés átlaga purinoceptor antagonisták nélkül 55%, jelenlétében 52,6 % volt (n=4).
59
A guanilát-cikláz gátló ODQ (3 µmol/l) gátolta a NANC relaxációt. L-NOARGkezelt preparátumokon az ODQ hatástalan volt. Fordított sorrendben alkalmazva, ODQ kezelés után az L-NOARG enyhe gátló hatást váltott ki a NANC relaxációra (5. táblázat).
1 min
% Relaxáció
0
1 Hz 20s
10 Hz 20s
100
14. ábra. Eredeti regisztrátum humán szigmabél körkörös izomzatán elelktromos téringerléssel kiváltott NANC relaxációról (1 és 10 Hz). Függőleges kalibráció: izoprenalinnal kiváltott maximális elernyedés. Vízszintes kalibráció: 1 perc.
4. táblázat. Tetrodotoxin (1 µmol/l), PPADS (50 µmol/l) és suramin (100 µmol/l) hatása az α,β-meATP (5 µM)-okozta elernyedésre humán szigmabél körkörös izomzatán. *: szignifikáns eltérés a kezeletlen kontroll csoporthoz képest (p<0,05; Wilcoxon teszt) Előkezelés ── Tetrodotoxin ── PPADS ── Suramin ── PPADS + Suramin
α,β-meATP-okozta relaxáció 35.0 ± 3.7 36.0 ± 6.2 32.8 ± 4.0 15.1 ± 5.4* 34.1 ± 4.9 29.8 ± 3.0 45.4 ± 4.2 9.0 ± 4.5*
n
5 5 6 8
60
5. táblázat. L-NOARG (100 µmol/l), PPADS (50 µmol/l), suramin (100 µmol/l) és ODQ (3 µmol/l) hatása a NANC relaxációra (1 Hz 20 s és 10 Hz 20 s) humán szigmabél preparátumon. A készítményeket hisztaminnal (5 µmol/l) előkontraháltuk, a válaszokat izoprenalinnal kiváltott maximális elernyedés %-ában adtuk meg. (−): kontroll preparátumok. n: elemszám; mindegyik preparátum külön egyedből származott. Átlag ± SEM. Statisztikai összehasonlításra a Quade tesztet alkalmaztuk. * p<0,05, − a kezeletlen kontroll (−) preparátumokhoz viszonyítva; # p<0,05, − a közvetlenül előtte álló kezelt preparátumokhoz viszonyítva.
Elektromos téringerlés Előkezelés
Elernyedés 1 Hz 20 s
10 Hz 20 s
n
36,4 ± 4,8 24,1 ± 4,8* 27,9 ± 5,6
43,9 ± 3,9 25,2 ± 4,7* 26,6 ± 5,6*
10 10 10
− L-NOARG L-NOARG + PPADS
44,2 ± 3,7 27,4 ± 5,2* 23,2 ± 7,7*
52,8 ± 2,2 29,9 ± 5,2* 21,6 ± 6,5* #
6 6 6
− L-NOARG L-NOARG + suramin
46,9 ± 9,6 16,8 ± 3,1* 17,7 ± 5,0*
58,1 ± 11,5 16,9 ± 3,9* 18,0 ± 5,3*
5 5 5
− L-NOARG L-NOARG + PPADS + suramin
37,3 ± 6,4 24,5 ± 5,0* 8,9 ± 4,6* #
46,8 ± 5,9 26,0 ± 3,6* 11,9 ± 4,6* #
9 9 9
− PPADS + suramin PPADS + suramin + L-NOARG
44,6 ± 6,8 48,8 ± 7,3 10,1 ± 3,1* #
58,4 ± 5,5 61,8 ± 5,2 10,5 ± 2,4* #
7 7 7
− L-NOARG L-NOARG + ODQ
46,5 ± 6,4 26,9 ± 5,2* 30,6 ± 5,1*
55,7 ± 8,0 26,0 ± 9,6* 28,7 ± 6,5*
7 7 7
− ODQ ODQ + L-NOARG
44,0 ± 5,7 27,7 ± 3,4* 24,9 ± 4,3*
54,7 ± 6,3 38,2 ± 4,3* 27,8 ± 5,4* #
9 9 9
− L-NOARG L-NOARG
I. II.
61
Megbeszélés Eredményeink szerint a “nitrerg” és “purinerg” idegek együtt közvetítik az EFS-okozta relaxációt patkány ileum hosszanti izom-plexus myentericus preparátumon. A 10 Hz-es ingerlési frekvenciát előzetes kísérleti eredmények alapján választottuk, mivel alacsonyabb frekvenciákon kapott kisebb válaszok L-NOARG jelenlétében már nehezen értékelhetővé váltak. A P2 purinoceptor antagonista PPADS (Lambrecht és mtsai, 1992) ill. suramin (Dunn és mtsai, 1988; Hoyle és mtsai, 1990) gátolta a NANC relaxáció nem “nitrerg” részét, az L-NOARG pedig kivédte a P2 purinoceptor antagonisták jelenlétében kapott választ. Ez azt is jelenti, hogy az L-NOARG jelenlétében kiváltott válasz teljesen “purinerg” , míg a PPADS jelenlétében kiváltott válasz teljesen “nitrerg” természetű. A PPADS szelektíven gátolta az exogén ATP-vel vagy α,β-meATP-vel kiváltott elernyedést. Smits és Lefebvre (1996) eredményei szerint patkány ileum hosszanti izomzatán az EFS-kiváltotta elernyedést az ATP tachyphylaxia gátolja, és ez a gátló hatás nem adódik hozzá a NOS-gátlóval kiváltott gátláshoz. Arra a következtetésre jutottak, hogy az ATP-n és NO-n kívül még legalább egy másik transzmitter is részt vesz a relaxáció közvetítésében. Sem a CO, sem VIP nem váltott ki elernyedést, így ezeknek az anyagoknak a transzmitter szerepe feltehetően kizárható. Két P2 purinoceptor antagonista (suramin és reactive blue 2) nem gátolta az idegingerléssel kiváltott relaxációt NOS gátlóval előzetesen nem kezelt preparátumokon (Smits és Lefebvre, 1996). Kombinált NOS gátló-purinoceptor antagonista kezelést nem végeztek. Az NO és a “purinerg” transzmitterek közötti szupra-additív (potencírozó) interakcióra utalhat, hogy a P2 purinoceptor antagonisták (NOS gátló jelenlétében) erősen gátolják a NANC relaxációt (jelen kísérletek), míg a suramin csak gyenge gátló hatás fejt ki kezeletlen praparátumokon (Smits és Lefebvre, 1996). Eredményeink szerint azonban a purinoceptor antagonisták nem csak L-NOARG jelenlétében váltottak ki gátló hatást; a PPADS önmagában kb. 30 %-os gátlást eredményezett, ami nem sokkal marad el az L-NOARG által kifejtett gátlástól (ez utóbbi kb. 40 %). A suramin önmagában szintén részleges gátlást hozott létre. A suramin csökkentette a prosztaglandin F2α-val kiváltott előkontrakciót (ld. Smits és Lefebvre, 1996 közleményét is), ezért a továbbiakban csak a PPADS hatását vizsgáltuk. A PPADS
62
specifikusnak bizonyult, nem befolyásolta sem az előkontrakció mértékét, sem a nátrium-nitroprussziddal vagy izoprenalinnal kiváltott elernyedést. Az apamin viszonylag gyenge gátló hatása önmagában, ill. erős gátló hatása LNOARG jelenlétében, úgy tűnik, egybevág az előzőleg említett szupra-additív együtthatással. Az apamin NANC relaxációra kifejtett erős gátló hatása L-NOARG jelenlétében azt jelenti, hogy a válasz “nem-nitrerg” része főként apamin-érzékeny K+ csatornák aktivációján keresztül jön létre. Az apamin-érzékenység mindazonáltal nem azonosítható teljes mértékben a “purinerg” válasszal, pl. több neuropeptid is képes apamin-érzékeny válasz kiváltására (ld. Általános bevezetésben). Sőt patkány duodenumon a bradikinin (Ferrero és mtsai, 1980) és az NO (Martins és mtsai, 1995) is kivált apamin-érzékeny elernyedést. Az exogén adenozin (ATP metabolit) csak gyenge relaxáló hatással rendelkezett a patkány ileum simaizomzatán és a válasz alakja is eltért az ATP-re és EFS-re kapott választól. Így nem valószínű, hogy az adenozinnak szerepe lenne az EFS-okozta relaxációs válaszban. Humán szigmabél körkörös izomzatán kapott eredményeink szerint az ATP vagy valamely rokon vegyület részt vesz az elektromos téringerléssel kiváltott NANC relaxáció közvetítésében. Ez összhangban lehet azzal a megfigyeléssel, hogy az LNOARG plusz apamin együtt jobban gátolják a NANC relaxációt ezen a preparátumon, mint az L-NOARG önmagában (Boecxstaens és mtsai, 1993). Mindazonáltal biztosabb adatok várhatók receptor-antagonisták alkalmazásától. Ezért ezen a preparátumon is megvizsgáltuk a két P2 purinoceptor antagonistának (PPADS és suramin) a NANC relaxáció L-NOARG-rezisztens részére kifejtett hatását, de külön-külön adva csak minimális hatást kaptunk. Meglepetéssel tapasztaltuk, hogy a két antagonista kombinációja viszont erősen gátolta a NANC relaxációt.
Valószínű, hogy a két
antagonista együtt a P2 purinoceptorok szélesebb skáláját gátolja, mint külön-külön alkalmazva őket. Ha a NOS-gátló nélkül vizsgáltuk a két P2 purinoceptor antagonista NANC relaxációra kifejtett hatását, akkor a két szer együtt sem okozott gátlást. Mindebből arra következtettünk, hogy ezen a preparátumon a NOS-gátló L-NOARG és a purinoceptor antagonisták gátló hatása szupra-additív viszonyban áll egymással. A kísérletsorozatban alkalmazott purinoceptor antagonisták (PPADS és suramin) specifikusságát támasztja alá, hogy nem befolyásolták az izoprenalin és nifedipin elernyesztő hatását humán szigmabél preparátumon.
63
A másik kérdés, amire kísérleteink során választ kerestünk, hogy vajon a guanilát-cikláz bénítása ODQ-val befolyásolja-e az L-NOARG-rezisztens NANC relaxációt. Ismert, hogy az NO főként (vagy akár teljes mértékben) a szolubilis guanilátcikláz aktivációján keresztül hozza létre a simaizomzat elernyedését (ld. Schmidt és mtsai, 1993). Más relaxáló transzmitter is stimulálhatja a szolubilis guanilát-ciklázt, pl. a CO is ezzel a mechanizmussal hoz létre simaizom-elernyedést (Rattan és Chakder, 1993; Ny és mtsai, 1996; Kwon és mtsai, 2001; Naik és mtsai, 2003). Az ODQ nem okozott további gátló hatást L-NOARG jelenlétében sem humán szigmabélen, sem patkány ileum preparátumon. Ez arra utal, hogy az idegingerléssel kiváltott NANC relaxációban az NO-n kívül más szolubilis guanilát-ciklázon keresztül ható transzmitter nem vesz részt. Az irodalomban már ismert, hogy patkány ileumon az ODQ gátolja az EFSokozta elernyedést (Tanovic és mtsai, 2001), ami várható is, mivel a válasz jelentős része NO-mediált. Mindazonáltal Ekblad és Sundler (1997) ezzel ellentétes adatokat közölt; ők azt találták, hogy az ODQ nem befolyásolta az EFS-okozta elernyedést, míg egy NO donor hatását gátolta. Humán colonon az ODQ önmagában jelentős de részleges (5. táblázat), P2 purinoceptor antagonistákkal kombinálva pedig teljes gátlást hozott létre a NANC válaszon (n=3, nincs feltüntetve), ami megerősíti az NO-ATP együtthatást.
64
A kísérletes diabétesz hatása az elektromos téringerléssel vagy kapszaicinnel kiváltott kolinerg, “purinerg” és “peptiderg” motoros válaszokra izolált patkány húgyhólyagon Bevezetés Régóta ismert, hogy a “purinerg” neurotranszmisszió szerepet játszik emlősök húgyhólyag-működésében
(ld.
Hoyle,
1994;
Burnstock,
1997).
Más
NANC
neurotranszmitterek szerepére is találhatók irodalmi adatok (Lundberg és mtsai, 1984; Maggi és mtsai, 1985). A hólyag kapszaicin-érzékeny érzőidegeiben kimutatták a tachykinin P-anyag (substance P) jelenlétét (Holzer és mtsai, 1982; Sharkey és mtsai, 1983). A kapszaicin atropin-rezisztens kontrakciót vált ki patkány hólyagon, amely érzékeny előzetes kapszaicin kezelésre és tachykinin receptor antagonistákra, de TTXrezisztens (Maggi és mtsai, 1985; 1991b). Ez arra utal, hogy a kapszaicin izgatja az érző idegvégződéseket (TTX-rezisztens módon) és tachykinineket szabadít fel, amelyek kontrahálják a simaizomzatot. In vitro funkcionális kísérletekben Meini és Maggi (1994) kimutatták tachykinin-mediált, kapszaicin-érzékeny komponens jelenlétét elektromos téringerléssel kiváltott NANC kontrakcióban patkány hólyag detrusor izomzatán. A válasz kiváltásához kellően hosszú idejű téringerlés alkalmazása szükséges. Ugyanezek a szerzők funkcionális bizonyítékot szolgáltattak P-anyag és neurokinin A részvételére a kapszaicin-okozta kontrakcióban (Meini és Maggi, 1994). A diabéteszes neuropátia egyaránt érinti a vegetatív, szomatomotoros és érző idegeket. A neuropátia egyik megjelenési formája a hólyag diszfunkciója (Ellenberg, 1980). A kapszaicin-érzékeny idegek is érintve lehetnek a hólyagműködés károsodása során. Patkány hólyag detrusor izomzatán ellentmondásos eredmények találhatók arra nézve, hogy a kísérletesen létrehozott diabétesz hogyan befolyásolja a kapszaicinokozta kontrakciót. Egyes eredmények csökkenést mutattak a kapszaicin hatásában diabéteszes patkányok hólyagján (Kamata és mtsai, 1992; Pinna és mtsai, 1994), míg mások nem találtak eltérést a diabéteszes és kontroll csoport között (Santicioli és mtsai, 1987; Dahlstrand és mtsai, 1992). Santicioli és mtsai (1987) eredményei szerint az elektromos téringerlésre kapott kontrakciós válasz csökken diabéteszben. Főként alacsony frekvenciánál volt ez megfigyelhető (0,1-5 Hz; előkezelés nélkül, tehát kolinerg-„purinerg” kevert válasz). Dahlstrand és mtsai (1992) kimutatták, hogy az
65
exogén P-anyag-okozta kontrakció fokozódott diabéteszes patkányok hólyagján, ami denervációs szuperszenzitivitás kifejlődésére utalhat. A jelen munka célja az volt, hogy in vitro rendszerben megvizsgáljuk a kísérletes diabétesz hatását a patkány húgyhólyag kapszaicin-érzékeny, kolinerg és “purinerg” idegműködéseire. Farmakológiai eszközök segítségével minden eddiginél jobban elkülönítettük ezeket a komponenseket. A kapszaicin-érzékeny válaszokat kapszaicin vagy hosszú idejű téringerlés alkalmazásával vizsgáltuk, miközben atropinnal blokkoltuk a muszkarin-receptorokat ill. antagonistákkal gátoltuk a P2 purinoceptorokat is. Az elektromos ingerlés során a kolinerg komponens kiemelésére purinoceptor antagonisták jelenlétében ingereltünk, míg a “purinerg” válaszok vizsgálatakor atropin volt jelen a szervfürdőben. A kapszaicin-létrehozta választ farmakológiailag jellemeztük. Megvizsgáltuk továbbá, hogy a kapszaicin-érzékeny idegek képesek-e relaxáció kiváltására ill. képesek-e gátolni a kolinerg vagy “purinerg” neurotranszmissziót. Módszerek és anyagok Streptozotocin-kezelés A kísérletek előtt 8 héttel hím Wistar patkányokat streptozotocinnal (50 mg/kg) vagy oldószerével kezeltünk (a kezelést dr. Pórszász Róbert végezte). Az állatokat standard körülmények között tartottuk, szabadon fogyasztottak táplálékot és ivóvizet. Nyolc hét elteltével csak azokat az állatokat használtuk fel a kísérletekhez, amelyeknek vércukor koncentrációja legalább 13 mmol/l volt, az ez alattiakat kizártuk. In vitro kísérletek A streptozotocinnal kezelt, oldószerrel kezelt és kezeletlen hím patkányokat (370-500 g) tarkóütéssel leöltük és kivéreztettük. A húgyhólyagot eltávolítottuk és sagittalisan félbe vágtuk, majd két detrusor-preparátumot készítettünk belőle (kb. 20 mm hosszú és 2 mm széles). A preparátumokat 37°C-os Krebs-oldatot tartalmazó szervfürdőkben 5 mN-os feszítés mellett felfüggesztettük. A fürdőket 95 % O2 és 5 % CO2 keverékével átbuborékoltattuk. Izotóniás jelátalakító segítségével a mozgásokat kompenzográfon regisztráltuk. Az elektromos téringerlést a szervfürdőben alul és fent elhelyezett platina elektródpár segítségével végeztük (távolságuk 4 cm). Az ingerlés paraméterei a következők voltak: a négyszögimpulzus amplitúdója 120 V, szélessége 0,1 ms; az
66
ingerlés frekvenciája 0,1 Hz (“egyes impulzusok”), ill. 1 Hz (30 másodpercig) vagy 10 Hz (40 másodpercig). A viszonylag szelektív kolinerg válaszok kiváltásakor P2 purinoceptor antagonista PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) volt a fürdőben, a “purinerg” mechanizmusokat pedig atropin (1 µmol/l) jelenlétében vizsgáltuk. Atropin, PPADS és suramin együttes jelenlétében vizsgáltuk a hosszú idejű téringerléssel (10 Hz 40 s) kiváltott kapszaicin-érzékeny kontrakciót ill. a kapszaicin hatását (30 nmol/l vagy 1 µmol/l). Guanetidin (3 µmol/l) végig jelen volt a fürdőben a szimpatikus válaszok kiiktatására. A kísérlet menete a következő volt: 40 perces inkubációs idő után elektromos téringerlést alkalmaztunk (egyes impulzusok és 1 Hz) atropin vagy PPADS + suramin jelenlétében. Ezt követően hozzáadtuk az atropin-kezelt preparátumokhoz a PPADS-t és a suramint, a másik típushoz pedig az atropint újabb 40 percre, majd megismételtük a téringerléseket. Utána a hosszú idejű (10 Hz 40 s) ingerlést alkalmaztuk, majd 15 perces nyugalmi periódust követően a kapszaicin kontraháló hatását vizsgáltuk. 30 nmol/l kapszaicint adtunk 3 percre (a válasz kb. 1,5 perc után érte el a csúcsát), majd 1 µmol/lre emeltük a koncentrációt és ezzel tachyphylaxiát is kiváltottunk. A kontrakciós válasz 20-25 perc alatt lecsengett. Ezután, 40 perccel a kapszaicin adását követően a 10 Hz 40 másodperces ingerlést megismételtük. Mivel előzetesen kimutattuk, hogy a szervfürdő kimosása megnövelte az ingerlés variabilitását, ezért a kapszaicin tachyphylaxia kiváltásakor nem mostuk ki a fürdőket, viszont olyan kapszaicin koncentrációt alkalmaztunk, amely még nem rendelkezett nem-specifikus hatásokkal. Alkalmazott anyagok Kapszaicin, guanetidin-szulfát, suramin-Na, tetrodotoxin (Sigma), atropin-szulfát (Merck), piridoxál-foszfát-6-azofenil-2’,4’-diszulfonsav (PPADS; RBI), SR 140 333 és SR 48 968 jelű tachykinin receptor antagonista vegyületek (NK1 ill. NK2 receptor antagonista; Sanofi Recherche, Montpellier, France), ω-konotoxin GVIA (Bachem).
67
Az adatok értékelése A kontrakciós válaszok nagyságát a kísérlet végén KCl-dal (80 mmol/l) kiváltott maximális összehúzódás százalékában, átlag ± SEM formájában adtuk meg. A statisztikai összehasonlításokat Wilcoxon teszt (2 összefüggő minta esetén) vagy MannWhitney teszt (2 független minta esetén) segítségével végeztük. P<0,05 vagy kisebb valószínűséget tekintettünk szignifikáns különbségnek. Eredmények A KCl-dal (80 mmol/l) kiváltott kontrakció nagysága azonos volt a streptozotocinnal kezelt, oldószerrel kezelt és kezeletlen csoport esetén. Elektromos téringerlés purinoceptor antagonisták jelenlétében Kontroll állatokból készült preparátumokon PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l) jelenlétében az egyes impulzusok rövid “twitch”-szerű válaszokat hoztak létre, az 1 Hz 30 s-es ingerlés pedig tónusos kontrakciót okozott. Utóbbi kb. 20 s után érte el a csúcsát. Atropin (1 µmol/l) szignifikánsan csökkentette ezeket a válaszokat. Ugyanilyen körülmények között a diabéteszes állatok preparátumai hasonló válaszokat adtak, melyeket az atropin (1 µmol/l) szintén szignifikánsan csökkentett (6. táblázat). Külön kísérletsorozatban megvizsgáltuk a kapszaicin tachyphylaxia (1 µmol/l kapszaicin 40 percre, mosás nélkül) és a TTX hatását a PPADS plusz suramin-kezelt kontroll preparátumokon. A kapszaicin tachyphylaxia nem okozott eltérést sem az egyes impulzusok, sem az 1 Hz-es ingerlés amplitúdójában (n=5). Az 1 µmol/l TTX teljesen kivédte mindkét ingerléstípus hatását (n=4). Elektromos téringerlés atropin jelenlétében A kontroll állatokból atropin (1 µmol/l) jelenlétében kapott válaszok nagysága megközelítően azonos volt a purinoceptor blokkolók jelenlétében kapott válaszokéval (7. táblázat). A diabéteszes állatokból készített preparátumokon szignifikánsan nagyobb kontrakciókat kaptunk mindkét frekvenciánál az oldószer kontrollhoz képest. Ettől eltekintve a válaszok alakja hasonló volt. PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) megközelítően 50 %-os gátlást eredményezett mindkét vizsgált csoportban, mindkét alkalmazott frekvencián (7. táblázat).
68
Külön kísérletsorozatban vizsgáltuk kezeletlen kontroll csoporton az emelt dózisban alkalmazott purinoceptor antagonisták hatását. 100 µmol/l PPADS plusz 200 µmol/l suramin sem védte ki teljesen az idegingerlésre (egyes impulzusok, 1 Hz 30 s) kapott válaszokat (n=4). A TTX (1 µmol/l; n=6) a kontrakciókat teljesen kivédte, míg a kapszaicin tachyphylaxia (n=6) nem befolyásolta egyik frekvencián kapott választ sem. A hosszú időtartamú elektromos téringerlés Kontroll preparátumokon atropin (1 µmol/l), PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) jelenléte esetén a 10 Hz 40 s-os idegingerlés jellegzetes kontrakciós választ eredményezett: a kezdeti gyors kontrakciót tónusos, lassú válasz követte (15. ábra). Kezeletlen állatok hólyagján (kapszaicin előkezelés nélkül) az ismételt idegingerlés alkalmazásakor a gyors komponens kissé csökkent (50 perc után, mosás nélkül; 34,6 ± 6,4 %-ról 29,0 ± 5,3 %-ra). A tónusos komponens ismételhetőnek bizonyult (29,1 ± 5,0 %-ról 28,2 ± 4,0 %-ra változott; n=10). TTX (1 µmol/l) 91 %-kal csökkentette a gyors választ és teljesen kivédte a tónusos komponenst (n=9). Kapszaicin előkezelés (1 µmol/l 40 percre, mosás nélkül) a gyors választ kb. 20 %-kal csökkentette, viszont a tónusos komponensen jelentősebb (80 % körüli) gátlást eredményezett (oldószerrel kezelt csoport; n=12). Diabéteszes állatok hólyagján kapott eredmények kapszaicin kezelés előtt jelentősen eltértek a kontroll csoporttól: a tónusos komponens kb. 60 %-kal kisebb volt a kontrollénál, míg a kezdeti gyors válasz kis mértékben nagyobb. A kapszaicin tachyphylaxia azonos mértékben csökkentette a gyors komponenst, mint az oldószerkezelt csoporton. A tónusos válasz gyakorlatilag eltűnt kapszaicin kezelés után (n=12; 15. ábra és 8. táblázat). A kapszaicin-okozta kontrakció Atropin (1 µmol/l), PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l) jelenlétében vizsgáltuk a kapszaicin-okozta kontrakciót oldószerrel kezelt (n=12) és diabéteszes (n=16) állatok hólyagján. 30 nmol/l és 1 µmol/l kapszaicint alkalmaztunk kumulatívan 3-3 percre. A diabéteszes csoportban kb. 20 %-kal kisebb válaszokat kaptunk mindkét vizsgált koncentráció esetén. Statisztikailag szignifikáns különbséget csak 1 µmol/l kapszaicin esetén kaptunk (16. ábra). Az előzetes kapszaicin tachyphylaxia teljesen kivédte a 30 nmol/l és 1 µmol/l kapszaicin kontraháló hatását. Utóbbi egyaránt igaz kezeletlen, oldószerrel kezelt és diabéteszes állatokra (n=4-6).
69
Külön kezeletlen állatcsoporton megvizsgáltuk a kapszaicin-okozta kontrakció farmakológiáját. A szub-maximális (300 nmol/l) kapszaicin-okozta izgató választ sem a TTX (1 µmol/l), sem 1 µmol/l TTX plusz ω-konotoxin GVIA (500 nmol/l) nem befolyásolta. A tachykinin receptor antagonista SR 140 333 (200 nmol/l; NK1 receptor blokkoló) ill. SR 48 968 (200 nmol/l; NK2 receptor blokkoló) külön-külön adva nem okozott szignifikáns gátlást. A két antagonista együttes adása viszont erősen gátolta a kapszaicinnel kiváltott kontrakciót (kb. 80 %-os gátlás) (9. táblázat). A kapszaicin nem relaxálja a hólyagot Megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy a kapszaicin esetleg gátló hatásokat is kiválthat a “purinerg” ill. kolinerg neurotranszmisszióra, amit azonban az izgató hatás maszkíroz. 1 µmol/l kapszaicint adtunk 2 perccel az elektromos ingerlések előtt (egyes impulzusok és 1 Hz 30 s-os ingerlés; PPADS + suramin ill. atropin jelenlétében; n=4 ill. n=6). Ezeket a kísérleteket kezeletlen állatcsoporton végeztük és mindvégig jelen volt 200 nmol/l SR 140 333 és 200 nmol/l SR 48 968, hogy a kapszaicin kontraháló hatását kivédjük. A kapszaicin nem okozott eltérést az ingerlésre kapott válaszokban a megelőző kontroll válaszokhoz képest. Acetil-kolinnal (1 µmol/l) előkontrahált preparátumokon az 1 µmol/l kapszaicin nem váltott ki relaxációt (n=5). Utóbbi kísérletekben is jelen volt a két tachykinin antagonista. A P2 purinoceptor antagonisták hatása az ATP-okozta kontrakcióra hólyagon Megvizsgáltuk a PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l) hatását az ATP-vel kiváltott kontrakcióra. Különböző ATP-koncentrációkat alkalmaztunk, de minden preparátum esetén csak egy adott ATP-koncentrációt vizsgáltunk. Az antagonisták minden vizsgált koncentrációnál (1-100 µmol/l) erős gátlást fejtettek ki az ATP-okozta kontrakcióra. A gátlás nem növekedett, ha az antagonisták koncentrációját a kétszeresére emeltük (n=4, 100 µmol/l ATP adása esetén).
70
6. táblázat. Az atropin (1 µmol/l) hatása az idegingerléssel kiváltott kontrakcióra PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) jelenlétében oldószerrel kezelt és diabéteszes patkányok hólyag detrusor izomzatán. Átlag ± SEM. * p<0,05: szignifikáns eltérés az atropin hatására az azonos állatcsoporton belül (Wilcoxon teszt). # p<0,05: szignifikáns eltérés a kontroll és diabéteszes csoport közt (Mann-Whitney teszt). Elemszám: n=6-8.
Előkezelés
Egyes impulzusok
1 Hz 30 s
Oldószerrel kezelt csoport PPADS + suramin
17,2 ± 1,9
45,9 ± 5,7
PPADS + suramin +
5,8 ± 2,6*
10,3 ± 2,6*
20,7 ± 1,0
49,2 ± 3,0
atropin Diabéteszes csoport PPADS + suramin
PPADS + suramin + 10,3 ± 1,9* atropin
22,0 ± 3,2*#
71
7. táblázat. A PPADS (50 µmol/l) + suramin (100 µmol/l) hatása az idegingerléssel kiváltott kontrakcióra atropin (1 µmol/l) jelenlétében oldószerrel kezelt és diabéteszes patkányok hólyag detrusor izomzatán. Átlag ± SEM. * p<0,05: szignifikáns eltérés a PPADS (50 µmol/l) plusz suramin (100 µmol/l) hatására az azonos állatcsoporton belül (Wilcoxon teszt). # p<0,05: szignifikáns eltérés a kontroll és diabéteszes csoport közt (Mann-Whitney teszt). Elemszám: n=6-8.
Előkezelés
Egyes impulzusok
1 Hz 30 s
Oldószerrel kezelt csoport atropin
14,6 ± 1,0
39,5 ± 4,3
atropin + PPADS +
9,9 ± 2,3*
19,3 ± 3,5*
atropin
25,7 ± 2,8#
53,3 ± 4,7#
atropin + PPADS +
13,0 ± 2,7*
23,3 ± 3,6*
suramin Diabéteszes csoport
suramin
72
15. ábra. Eredeti regisztrátum a 10 Hz 40 s-os idegingerlés kontraháló hatásáról oldószerrel kezelt és diabéteszes patkányok hólyag detrusor izomzatán. Függőleges kalibráció a maximális kontrakció 50 %-a. Vízszintes kalibráció: 40 s.
8. táblázat. A kapszaicin tachyphylaxia hatása a 10 Hz 40 s-os idegingerléssel kiváltott kontrakcióra patkány hólyag detrusor izomzatán. A válasz gyors és tónusos komponensét külön értékeltük. Átlag ± SEM. * − szignifikáns eltérés a kontroll válaszhoz képest (Wilcoxon teszt); # − szignifikáns eltérés az oldószerrel kezelt és diabéteszes csoport között (Mann-Whitney teszt). n: elemszám. Kontroll 10 Hz 40 s
Kapszaicin tachyphylaxia (1 µmol/l)
n
Oldószerrel kezelt csoport gyors
26,1 ± 4,0
19,7 ± 2,7*
12
tónusos
25,2 ± 4,5
4,7 ± 1,6*
12
Diabéteszes csoport gyors
40,3 ± 3,2#
31,4 ± 4,0*#
12
tónusos
10,4 ± 2,5#
1,3 ± 0,9*
12
73
9. táblázat. A kapszaicin által kiváltott kontrakció vizsgálata patkány hólyag detrusor izomzatán. A kapszaicint minden preparátumnak csak egyszer adtuk. Átlag ± SEM. * − szignifikáns eltérés a kontroll csoporthoz képest (Mann-Whitney teszt). n: elemszám. Előkezelés
Kapszaicin kontrakció (300 nmol/l)
n
⎯
41,6 ± 6,0
10
Tetrodotoxin (1 µmol/l)
38,4 ± 5,9
6
Tetrodotoxin + ω-konotoxin GVIA (500 nmol/l) SR 140 333 (200 nmol/l)
57,9 ± 6,6
6
34,9 ± 3,6
6
SR 48 968 (200 nmol/l)
39,7 ± 4,1
6
SR 140 333 + SR 48 968
8,6 ± 1,7*
6
Oldószer-kezelt Diabéteszes 70
*
Kontrakció (%)
60 50 40 30 20 10 0
30 nmol/l
30 nmol/l
1 µmol/l
1 µM
Kapszaicin
16. ábra. A kísérletes diabétesz hatása a kapszaicinnel kiváltott kontrakcióra patkány hólyag detrusor izomzatán. A 30 nmol/l és 1µmol/l kapszaicint kumulatívan adtuk. Átlag ± SEM. * − szignifikáns eltérés az oldószerrel kezelt csoporthoz képest (MannWhitney teszt). Kísérletek száma: n=12 (oldószerrel kezelt); n=16 (diabéteszes).
74
Megbeszélés A jelen kísérletsorozatban kísérletet tettünk arra, hogy farmakológiai eszközökkel elkülönítsük a patkány hólyag válaszainak kolinerg, “purinerg” és “peptiderg” összetevőit.
A “purinerg” válaszok gátlására két P2 purinoceptor antagonista
kombinációját alkalmaztuk: PPADS (Lambrecht és mtsai, 1992; ld. Barthó és mtsai, 1998) és suramin (Dunn és Blakeley, 1988). Hasonlóan az α,β-meATP-vel kiváltott tachyphylaxiához (Brading és Williams, 1990; Luheshi és Zar, 1990) mind a suramin (Boselli és mtsai, 1997; Tong és mtsai, 1997), mind a PPADS (Tong és mtsai, 1997) képes az elektromos ingerlésre létrejövő kontrakciót gátolni patkány húgyhólyagon. A kísérleteknél a két purinoceptor antagonista kombinációját alkalmaztuk, mivel előzetes vizsgálatokban úgy találtuk, hogy a két szer együtt nagyobb gátlást fejt ki, mint különkülön alkalmazva. 1 Hz-nél nagyobb frekvenciákat nem vizsgáltunk, hogy elkerüljük az interferenciát a kapszaicin-érzékeny válaszokkal. A kapszaicin tachyphylaxia az 1 Hz-es ill. kisebb frekvenciákon nem okozott változást a válaszok nagyságában. Így igen valószínű, hogy a vizsgált válaszokat kolinerg ill. nem-kolinerg efferensek közvetítik. PPADS és suramin jelenlétében kiváltott egyes impulzusokat és az 1 Hz-es idegingerlésre kapott válaszokat az atropin erősen (több mint 50 %-ig) gátolta, ez a válasz tehát jelentős mértékben kolinerg. A megmaradó válasz eredete eddig ismeretlen. Úgy tűnik, hogy a kolinerg (és az ismeretlen) neuronok relatíve érzéketlenek a kísérletes diabétesz károsító hatására, mivel a diabéteszes állatok hólyagján kapott válaszok nem tértek el az oldószerrel kezelt csoporttól. Az atropin jelenlétében kapott válaszok szignifikánsan gátolhatók PPADS és suramin kombinációjával, ami a válaszok részben “purinerg” természetét bizonyítja. Előzetes kísérletekben kimutattuk, hogy a PPADS az alkalmazott koncentrációban mentes a nem specifikus hatásoktól (Barthó és mtsai, 1997; 1998; 2000). A hólyag fenti válasza kb. 50 %-ban rezisztens volt a két purinoceptor antagonistára. Tong és mtsai (1997) és Boselli és mtsai (1997) hasonló ill. valamivel nagyobb gátló hatást mutattak ki NANC kontrakcióra purinoceptor antagonisták segítségével. Ezek a szerzők azt is kimutatták, hogy a P2 purinoceptor agonista α,β-meATP és ATP kontraháló hatásait is erősen gátolta a PPADS vagy suramin. Saját eredményeink szerint a PPADS plusz suramin erősen (valószínűleg nem kompetitív módon) gátolta az exogén ATP hatását. A P2 purinoceptor antagonisták gátló hatása az ATP-re nézve erősebb volt, mint az elektromos téringerlés esetén. Mindebből valószínűnek tűnik, hogy az atropin és a
75
purinoceptor antagonisták jelenlétében megmaradó válasz nem “purinerg” természetű, bár a PPADS- és suramin-érzéketlen purinoceptorok szerepe sem zárható ki teljesen. Sok bizonyíték található arra vonatkozóan, hogy patkány húgyhólyagon a kapszaicin kontraháló hatását tachykininek közvetítik. Maggi és mtsai (1991b) kimutatták, hogy a tachykinin receptor antagonista spantide (főként NK1 receptorokon ható, alapjában nem-szelektív antagonista) gátolja a P-anyag kontraháló hatását, míg az NK2 receptor antagonista L-659 877 vagy MEN 10 376 gátolja a neurokinin A kontraháló hatását ezen a szerven. Ezeknek az antagonistáknak az együttes alkalmazása majdnem teljesen kivédte a kapszaicin (1 µmol/l) hatását, viszont külön-külön a spantide ill. az L-659 877 vagy a MEN 10 376 csak mérsékelten volt hatásos. Ezt mi is alátámasztottuk receptor altípus-specifikus antagonisták, az SR 140 333 (NK1 receptor blokkoló) és SR 48 968 (NK2 receptor blokkoló) segítségével. A tachykinin NK1 és NK2
receptorok tehát szupra-additív (potencírozó) módon működnek közre a
kapszaicin által kiváltott válaszban. Mivel a kapszaicin-kiváltotta kontrakció rezisztens TTX-re, valószínűtlen, hogy a tachykininek neuronális izgató hatást váltanának ki, hacsak nem az idegek terminális, TTX-rezisztens részét aktiválják. Az utóbbi feltevést valószínűtlenné teszi, hogy a válasz érzéketlen volt ω-konotoxin GVIA adására, mely az N-típusú Ca2+ csatornák blokkolója. Az 1 µmol/l kapszaicinnel történő előkezelés teljesen kivédte a kapszaicin hatását (30 nmol/l−1 µmol/l), tehát ez a módszer alkalmas a kapszaicin-érzékeny válaszok eliminálására. Az 1 µmol/l-es kapszaicin előkezelés erőteljesen gátolta az 1 Hz 40 s-os elektromos téringerlés hatását, viszont a kolinerg ill. “purinerg” (egyes impulzusok és 1 Hz) válaszokra nem volt befolyása, ami arra utal, hogy a szer ebben a koncentrációban mentes a nem-specifikus simaizom-relaxáló hatásoktól. Nem találtunk bizonyítékot a kapszaicin rövid távú relaxáló hatására patkány hólyagon, még akkor sem, ha a kontraháló hatásokat kivédtük tachykinin antagonisták segítségével. Ez meglepő, mert számos simaizom-készítményen mind izgató, mind gátló kapszaicin-hatások kiválthatók (ld. Általános bevezetésben). Diabéteszes állatok hólyagján a kapszaicin-érzékeny hosszú idejű téringerlés (10 Hz 40 s) hatása jelentősen kisebb volt, mint a kontroll csoporton, míg a kapszaicinokozta válaszok csak kis mértékben csökkentek. Mindezek valószínűleg arra utalnak, hogy diabétesz hatására a kapszaicin-érzékeny idegek és nem a simaizom károsodik. Ezen idegekből történő transzmitter kiáramlás elektromos ingerlés hatására valószínűleg
76
sokkal összetettebb folyamat, mint kapszaicin hatására. Az előző folyamatban részt vesznek gyors Na+ csatornák (melyre a TTX érzékenység is utal), feszültség-függő Ca2+ csatornák és exocytosis. Az idegi ingerületvezetés károsodik kísérletes diabéteszben (Patel és Tomlinson, 1999), viszont a szenzoros transzmitterek mennyisége a jelek szerint nem csökken nagy mértékben. Utóbbit alátámasztja a kapszaicin hatásossága diabéteszes állatok hólyagján. A 10 Hz-es ingerlésre kapott válasz gyors kezdeti részének eredete nagyrészt ismeretlen. Feltételezzük, hogy hasonló transzmitter(ek) vesz(nek) benne részt, mint az alacsonyabb frekvenciákon megmaradó atropin- és P2 purinoceptor antagonista-rezisztens válaszokban. Összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy patkány húgyhólyag detrusor izomzatán farmakológiailag elkülönítettük a kolinerg, “purinerg” és kapszaicin-érzékeny kontrakciós válaszokat. Továbbá kimutattuk, hogy a kísérletes diabétesz erősen gátolja az elektromos téringerléssel kiváltott kapszaicin-érzékeny válaszokat, viszont a kémiai stimulációval kiváltott válaszokat alig befolyásolja.
77
Összefoglalás Munkacsoportunk fő kutatási profilja a belső szervek (elsősorban a gyomor-bélhuzam) funkcionális beidegzésének, mozgásválaszainak, ingerület-átvivő anyagainak tisztázása, farmakológiai eszközök segítségével. Ezeknek a kutatásoknak alapfilozófiája kettős: (a) Minél jobban megismerjük a belső szervek funkcionális beidegzését (ép és kóros körülmények közt), annál valószínűbb, hogy funkciózavar esetén a szervek működését gyógyszeresen befolyásolni tudjuk, ill. hogy reális betegség-modelleket tudunk kidolgozni állatkísérletekben. (b) Azok a neurotranszmitterek, amelyek a belső szervek idegeiből felszabadulnak, általában előfordulnak a központi idegrendszerben is, ugyanakkor a zsigerek kevésbé komplikált viszonyai közt is sokat megtudhatunk róluk, receptoraikról, szintézisükről, felszabadulásukról, pre- és posztszinaptikus modulációjukról. Tekintve, hogy a hasonlóságok mellett jelentős species-különbségek is mutatkoznak a zsigeri szervek válaszaiban és azok transzmitter-hátterében, a jelen munka nagy súlyt helyez a humán (operációs anyagból származó) preparátumok tanulmányozására is. Kutatásaink az ember és laboratóriumi állatok zsigeri szerveinek mozgásait szabályozó mechanizmusok felderítésére és befolyásolására irányultak. Eredményeink rávilágítanak arra a tényre, hogy a kapszaicin hatásában bélen nagy specieskülönbségek vannak: míg tengerimalacban főleg tachykinin-mediált izgató hatást találunk, addig humán bélen gátló hatás dominál, amelyet nem az ismert szenzoros transzmitter, a cAMP-n keresztül ható kalcitonin gén-rokon peptid (ld. Maggi, 1995), hanem − legalábbis részben − a nitrogén-monoxid közvetít. Kimutattuk, hogy a szenzoros izgató kapszaicin NO közvetítésével okoz elernyedést humán szigmabél, felszálló vastagbél és appendix körkörös izomzatán. A vékonybéllel kapcsolatban is hasonló eredményekre jutottunk. Eszerint az, hogy a szenzoros izgató kapszaicin NO-mediált gátló választ vált ki, meglehetősen általános jelenség az emberi bélhuzamban. A válasz nem érzékeny az idegi vezetést gátló tetrodotoxinra, tehát nem valószínű, hogy az NO enterális neuronokból származna, amelyeket szenzoros idegvégződések aktiválnak; fölvetődik annak lehetősége, hogy az NO magukból a kapszaicin-érzékeny érző idegvégződésekből szabadul fel. Ennek lehető tisztázására tervezzük, hogy neuronális NOS-gátlók hatását is vizsgáljuk a későbbiekben (a jelen
78
kísérletekhez NG-nitro-L-arginint használtunk, amely nem differenciál a NOS izoenzimek között). Rágcsáló béltraktusán végzett kísérleteink is alátámasztják az NO szenzoros neurotranszmitter
szerepét.
Egér
vastagbélből
készült
körkörös
„cikkcakk”
készítményen a kapszaicin elernyedést okoz, amely részlegesen érzékeny mind az NO szintézis, mind az idegvezetés bénítására. Az NO a tengerimalac colonon viszont nem játszik szerepet a kapszaicin-okozta válaszban. A vegetatív idegrendszerben meglehetősen általános a ko-transzmisszió jelensége. A „klasszikus” vegetatív neurotranszmitterek (acetil-kolin, noradrenalin) mellett sok NANC ingerület-átvivő vagy feltehető ingerület-átvivő anyag közvetíti a válaszokat, ú.m. kis-molsúlyú anyagok (szerotonin, NO, ATP és rokonvegyületei, aminosavak, valamint neuropeptidek (egyebek közt: tachykininek mint P-anyag, továbbá VIP-család, kolecisztokinin-család, CGRP, opioid peptidek). A kotranszmisszió jelenségét jelen kísérletekben is kimutattuk. Elektromos téringerléssel kiváltott NANC elernyedés mechanizmusát vizsgáltuk humán szigmabél körkörös izomzatán. Kimutattuk, hogy a válaszban nemcsak a már ismert NO, hanem P2 purinoceptor agonista (valószínűleg ATP) is részt vesz, de szerepe csak akkor válik nyilvánvalóvá, ha NOS-gátló is jelen van a rendszerben. A P2 purinoceptorok gátlására használt antagonista-keverék (PPADS plusz suramin) jól és specifikusan gátolta az exogén purinoceptor-izgató α,β-meATP elernyesztő hatását. Patkány izolált szervi készítményeken kimutattuk, hogy a vékonybél elektromos idegingerléssel kiváltott válaszait NO és ATP-szerű anyag együtt közvetíti, szupra-additív módon. Ezen a preparátumon bebizonyítottuk, hogy nincs olyan összetevője a válasznak, amely harmadik NANC mediátor (pl. CO vagy neuropeptid) felszabadulásával volna magyarázható. A P2 purinoceptorok bénítását itt is specifikus antagonista (PPADS) segítségével végeztük. Mindkét fent említett preparátumon megvizsgáltuk a guanilát-cikláz gátló ODQ jelű vegyület hatását olyan körülmények közt, hogy a NOS-t előzőleg bénítottuk. Az ODQ nem okozott további gátló hatást L-NOARG jelenlétében sem humán szigmabélen, sem patkány ileum preparátumon. Ez arra utal, hogy az idegingerléssel kiváltott NANC relaxációban az NO-n kívül más szolubilis guanilát-ciklázon keresztül ható transzmitter (pl. CO) nem vesz részt. Patkány hólyagon kimutattuk, hogy a kapszaicin izgató hatását tachykinin NK1 és NK2 receptor antagonisták kombinációjával lehet gátolni, továbbá hogy a kísérletes
79
diabétesz kizárólag a kapszaicin-érzékeny válaszokat gátolta. A kapszaicinre nem érzékeny zsigeri idegekkel kapcsolatban megállapítottuk, hogy kolinerg-, ill. purinoceptor-antagonisták hólyagizomzatra farmakológiailag
ható
és
kapszaicin-deszenzibilizáció
vegetatív
jelentősen
kolinerg,
elkülöníthetők
ill.
„purinerg” és
segítségével hatások
befolyásolásuk
a
egymástól külön-külön
tanulmányozható. A várakozással ellentétben eddig nem találtunk bizonyítékot arra, hogy az endokannabinoid anandamid humán bél-preparátumokon kapszaicin-szerű hatásokat fejtene ki. Jövőben tervezzük annak vizsgálatát, hogy a kannabinoid receptorok miképpen modulálják az emberi bélhuzam autonóm és szenzoros eredetű válaszait (v.ö. Szolcsányi, 2000). Az is lehetséges, hogy a kannabinoidok ismert hányáscsillapító hatásának van perifériás összetevője, és ez a humán bél-preparátumok segítségével tettenérhető. A kutatási téma további lehetséges irányai, az eredmények felhasználásának, hasznosításának lehetőségei: A kísérletek és várható eredményeik alapkutatási jellegűek: közelebb visznek a belső szervek ép és kóros működésének megértéséhez, ami hosszabb távon potenciálisan hasznos lehet a diagnosztika és terápia számára. A kolinerg és NANC transzmitter-rendszerek jobb megismerése más területeken (pl. központi idegrendszer) hasznosítható ismereteket is eredményezhet. Az egyik lehetséges irány tehát további transzmitterek kutatása, különös tekintettel a humán szövetekre. Másik lehetőség annak tisztázása, hogy a kapszaicinérzékeny
idegek
és
receptorok
(TRPV1)
milyen
belső
szervi
élettani
és
kórfolyamatokban játszanak szerepet. Ugyanakkor az érző neuronok központi idegrendszeri végződéseiből, a gerincvelő hátsó szarvában föltehetően ugyanazok a transzmitterek szabadulnak fel, mint a periférián, így a zsigeri szervekben nyert adatok relevanciával bírnak a nociceptio/fájdalomcsillapítás tekintetében is. A ″klasszikus ″ neurotranszmitter-rendszerekre (adrenerg, kolinerg) ható gyógyszerek ma fontos szereplői terápiás eszköztárunknak. Hasonló felemelkedés előtt állnak a nem-adrenerg, nem-kolinerg transzmitterekre ható szerek is (sőt közülük a szerotonerg rendszer már ma is fontos gyógyszerek célpontja). A NANC rendszerek funkciójának tisztázása (egyebek között farmakológiai eszközökkel) nagyban elősegíti a rájuk ható szerek kifejlesztését és indikációs területük megtalálását.
80
Irodalomjegyzék Abbracchio MP, Burnstock G, 1994. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? Pharmacol. Ther. 64: 445-475. Adenosine receptors. In: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition (Eds. Alexander, S.P.H., A. Mathie & J.A. Peters), Br. J. Pharmacol. 2006. 147: S9. Aimi Y, Fujimura M, Vincent SR, Kimura H, 1991. Localization of NADPH-diaphorase-containing neurons in sensory ganglia of the rat. J. Comp. Neurol. 306: 382-392. Allescher H-D, Sattler D, Piller C, Schusdziarra V, Classen M, 1992. Ascending neural pathways in the rat ileum in in vitro – effect of capsaicin and involvement of nitric oxide. Eur. J. Pharmacol. 217: 153-162. Anavi-Goffer S, Coutts AA, 2003. Cellular distribution of vanilloid VR1 receptor immunoreactivity in the guinea-pig myenteric plexus. Eur. J. Pharmacol. 458: 61-71. Barthó L, Szolcsányi J, 1978. The site of action of capsaicin on the guinea-pig isolated ileum. NaunynSchmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 305: 75-81. Barthó L, Vizi ES, 1985. Neurochemical evidence for the release of acetylcholine from the guinea-pig ileum myenteric plexus by capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 110: 125-127. Barthó L, Lefebvre R, 1994a. Nitric oxide causes contraction in the rat isolated small intestine. Eur. J. Pharmacol. 259: 101-104. Barthó L, Lefebvre R, 1994b. Nitric oxide induces acetylcholine-mediated contractions in the guinea-pig small intestine. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 350: 582-584. Barthó L, Holzer P, 1995. The inhibitory modulation of guinea-pig intestinal peristalsis caused by capsaicin
involves
calcitonin
gene-related
peptide
and
nitric
oxide.
Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 353: 102-109. Barthó L, Pethő G, Antal A, Holzer P, Szolcsányi J, 1987. Two types of relaxation due to capsaicin in the guinea-pig ileum. Neurosci. Lett. 81:146-150. Barthó L, Kóczán G, Holzer P, Maggi CA, Szolcsányi J, 1991. Antagonism of the effects of calcitonin gene-related peptide and of capsaicin on the guinea-pig isolated ileum by human alpha-calcitonin gene-related peptide(8-37). Neurosci. Lett. 129: 156-159. Barthó L, Kóczán G, Holzer P, Maggi CA, Szolcsányi J, 1992a. Antagonism of the motor effects of CGRP and of capsaicin on the guinea-pig ileum by human CGRP(8-37). In: Taché, Y., Holzer, P., Rosenfeld, M.G. (Eds.), Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 657, Calcitonin Gene-Related Peptide. The New York Academy of Sciences, New York, NY, pp. 538-540. Barthó L, Kóczán G, Pethő G, Maggi CA, 1992b. Blockade of nitric oxide synthase inhibits nervemediated contraction in the rat small intestine. Neurosci. Lett. 145: 43-46. Barthó L, Lefebvre RA, Halmai V, Kóczán G, 1994a. Evidence for a nitric oxide-mediated contraction in the rat intestinal smooth muscle. In: Moncada S, Feelisch M, Busse R, Higgs EA, (Eds.). The Biology of Nitric Oxide, Vol. 3.: Physiological and Clinical Aspects, pp. 396-399. Portland Press, London (1994).
81 Barthó L, Maggi CA, Wilhelm M, Patacchini R, 1994b. Tachykinin NK1 and NK2 receptors mediate atropine-resistant ileal circular muscle contractions evoked by capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 259: 187-193. Barthó L, Lénárd LJr, Maggi CA, 1997. Evidence for the involvement of P2 purinoceptors in the cholinergic contraction of the guinea-pig ileum. Br. J. Pharmacol. 121: 1507-1508. Barthó L, Lénárd LJr, Szigeti R, 1998. Nitric oxide and ATP co-mediate the NANC relaxant response in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 358: 496-499. Barthó L, Horváth G, Lénárd LJr, 1999a. Lack of anticholinergic effect of L-NAME in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 370: 279-282. Barthó L, Lénárd LJr, Lázár Zs, Maggi CA, 1999b. Connections between P2 purinoceptors and capsaicinsensitive afferents in the intestine and other tissues. Eur. J. Pharmacol. 375: 203-210. Barthó L, Lénárd LJr, Patacchini R, Halmai V, Wilhelm M, Holzer P, Maggi CA, 1999c. Tachykinin receptors are involved in the "local efferent" motor response to capsaicin in the guinea-pig small intestine and oesophagus. Neuroscience 90: 221-228. Barthó L, Lázár Zs, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, 2000. Evidence for the involvement of ATP, but not of VIP/PACAP or nitric oxide, in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 392: 183-188. Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethő G, Holzer-Petsche U, Holzer P, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, 2004. Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur. J. Pharmacol. 500: 143-157. Bayguinov O, Hagen B, Bonev AD, Nelson MT, Sanders KM, 2000. Intracellular calcium events activated by ATP in murine colonic myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279: C126-135. Bayliss WM, Starling EH, 1899. The movements and innervation of the small intestine. J. Physiol. 24: 99-143. Bayliss M, Wu C, Newgreen D, Mundy AR, Fry CH, 1999. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J. Urol. 162: 1833-1839. Belai A, Burnstock G, 1994. Evidence for coexistence of ATP and nitric oxide in non-adrenergic, noncholinergic (NANC) inhibitory neurones in the rat ileum, colon and anococcygeus muscle. Cell Tissue Res. 278: 197-200. Bennett MR, 1997. Non-adrenergic non-cholinergic (NANC) transmission to smooth muscle: 35 years on. Prog. Neurobiol. 52: 159-195. Berthoud HR, Blackshaw LA, Brookes SJ, Grundy D, 2004. Neuroanatomy of extrinsic afferents supplying the gastrointestinal tract. Neurogastroenterol. Motil. 16: 28-33. Birder LA, Apodaca G, De Groat WC, Kanai AJ, 1998. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. Am. J. Physiol. 275: F226-229. Bo X, Burnstock G, 1992. Species differences in characteristics and distribution of [3H] alpha,betamethylene ATP binding sites in urinary bladder and urethra of rat, guinea-pig and rabbit. Eur. J. Pharmacol. 216: 59-66. Bodin P, Burnstock G, 2001. Purinergic signalling: ATP release. Neurochem. Res. 26: 959-969.
82 Bodin P, Bailey D, Burnstock G, 1991. Increased flow-induced ATP release from isolated vascular endothelial cells but not smooth muscle cells. Br. J. Pharmacol. 103: 1203-1205. Boeckxstaens GE, Pelckmans PA, Herman AG, Van Maercke YM, 1993. Involvement of nitric oxide in the inhibitory innervation of the human isolated colon. Gastroenterology 104: 690-697. Borjesson L, Nordgren S, Delbro DS, 1997. DMPP causes relaxation of rat distal colon by a purinergic and a nitrergic mechanism. Eur. J. Pharmacol. 334: 223-231. Boselli C, Bianchi L, Grana E, 1997. Effect of cromakalim on the purinergic and cholinergic transmission in the rat detrusor muscle. Eur. J. Pharmacol. 335: 23-30. Brading AF, Williams JH, 1990. Contractile responses of smooth muscle strips from rat and guinea-pig urinary bladder to transmural stimulation: effects of atropine and α,β-methylene ATP. Br. J. Pharmacol. 99: 493-498. Brehmer A, Schrodl F, Neuhuber W, 1999. Morphological classifications of enteric neurons − 100 years after Dogiel. Anat. Embryol. (Berl.). 200: 125-135. Bult H, Boeckxstaens GE, Pelckmans PA, Jordaens FH, Van Maercke YM, Herman AG, 1990. Nitric oxide as an inhibitory non adrenergic non cholinergic neurotransmitter. Nature 345: 346-347. Burleigh DE, 1992. NG-nitro-L-arginine reduces nonadrenergic, noncholinergic relaxations of human gut. Gastroenterology 102: 679-683. Burnstock G, 1972. Purinergic nerves. Pharmacol Rev. 24: 509-560. Burnstock G, 1990. Overview: purinergic mechanisms. Ann. New York Acad. Sci. 603: 1-18. Burnstock G, 1996. A unifying purinergic hypothesis for the initiation of pain. Lancet 347: 1604-1605. Burnstock G, 1997. The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. Neuropharmacol. 36: 1127-1139. Burnstock G, 2000. P2X receptors in sensory neurones. Br. J. Anaesth. 84: 476-488. Burnstock G, 2006. Historical review: ATP as a neurotransmitter. Trends Pharmacol. Sci. 27: 166-176. Burnstock G, Warland JJ, 1987. A pharmacological study of the rabbit saphenous artery in vitro: a vessel with a large purinergic contractile response to sympathetic nerve stimulation. Br. J. Pharmacol. 90: 111-120. Burnstock G, Campbell G, Bennett M, Holman ME, 1964. Innervation of the guinea-pig taenia coli: are there intrinsic inhibitory nerves which are distinct from sympathetic nerves? Int. J. Neuropharmacol. 3: 163-166. Burnstock G, Cocks T, Crowe R, Kasakov L, 1978a. Purinergic innervation of the guinea-pig urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 63: 125-138. Burnstock G, Cocks T, Kasakov L, Wong HK, 1978b. Direct evidence for ATP release from nonadrenergic, non-cholinergic ("purinergic") nerves in the guinea-pig taenia coli and bladder. Eur. J. Pharmacol. 49: 145-149. Bültmann R, Trendelenburg M, Tuluc F, Wittenburg H, Starke K, 1999. Concomitant blockade of P2Xreceptors and ecto-nucleotidases by P2-receptor antagonists: functional consequences in rat vas deferens. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 359: 339-344. Caterina MJ, Julius D, 2001. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway. Ann. Rev. Neurosci. 24: 487-517.
83 Chan CLH, Facer P, Davis JB, Smith GD, Egerton J, Bountra C, Williams NS, Anand P, 2003. Sensory fibres expressing capsaicin receptor TRPV1 in patients with rectal hypersensitivity and faecal urgency. Lancet 361: 385-391. Chancellor MB, Kaplan SA, Blaivas JG, 1992. The cholinergic and purinergic components of detrusor contractility in a whole rabbit bladder model. J. Urol. 148: 906-909. Christinck F, Jury J, Cayabyab F, Daniel EE, 1991. Nitric oxide may be the final mediator of nonadrenergic, noncholinergic inhibitory junction potentials in the gut. Can. J. Physiol. Pharmacol. 69: 1448-1458. Clapham DE, Montell C, Schultz G, Julius D, 2003. International Union of Pharmacology. XLIII. Compendium of voltage-gated ion channels: transient receptor potential channels. Pharmacol. Rev. 55: 591-596. Costa M, Brookes SJ, 1994. The enteric nervous system. Am. J. Gastroenterol. 89 (Suppl): S129- S137. Creed KE, Ishikawa S, Ito Y, 1983. Electrical and mechanical activity recorded from rabbit urinary bladder in response to nerve stimulation. J. Physiol. 338: 149-164. Croci T, Emonds-Alt X, LeFur G, Manara L, 1995. In vitro characterization of the non-peptide tachykinin NK1 and NK2-receptor antagonists, SR140333 and SR48968 in different rat and guinea-pig intestinal segments. Life Sci. 56: 267-275. Dahlstrand C, Dahlström A, Ahlman H, Jonsson O, Lundstam S, Norlén L, Pettersson S, 1992. Effect of substance P on detrusor muscle in rats with diabetic cystopathy. Br. J. Urol. 70: 390-394. Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latcham J, Clapham C, Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers DC, Bingham S, Randall A, Sheardown SA, 2000. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 405: 183-187. De Petrocellis L, Bisogno T, Maccarrone M, Davis JB, Finazzi-Agro A, DiMarzo V, 2001. The activity of anandamide at vanilloid VR1 receptors requires facilitated transport across the cell membrane and is limited by intracellular metabolism. J. Biol. Chem. 276: 12856-12863. Drury AN, Szent-Györgyi A, 1929. The physiological activity of adenine compounds with special reference to their action upon the mammalian heart. J. Physiol. 68: 213-237. Dunn PM, Blakeley AG, 1988. Suramin: a reversible P2 purinoceptor antagonist in the mouse vas deferens. Br. J. Pharmacol. 93: 243-245. Edwards FA, Gibb AJ, Colquhoun D, 1992. ATP receptor-mediated synaptic currents in the central nervous system. Nature 359: 144-147. Ekblad E, Sundler F, 1997. Motor responses in rat ileum evoked by nitric oxide donors vs. field stimulation: modulation by pituitary adenylate cyclase-activating peptide, forskolin and guanylate cyclase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283: 23-28. Ellenberg M, 1980. Development of urinary bladder dysfunction in diabetes mellitus. Ann. Intern. Med. 92: 321-323. Evans RJ, Surprenant A, 1992. Vasoconstriction of guinea-pig submucosal arterioles following sympathetic nerve stimulation is mediated by the release of ATP. Br. J. Pharmacol. 106: 242249.
84 Evans RJ, Derkach V, Surprenant A, 1992. ATP mediates fast synaptic transmission in mammalian neurons. Nature 357: 503-505. Fahrenkrug J, Hannibal J, 1998. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide immunoreactivity in capsaicin-sensitive nerve fibres supplying the rat urinary tract. Neuroscience 83: 1261-1272. Farkas-Szállási T, Lundberg JM, Wiesenfeld-Hallin Zs, Hökfelt T, Szállási Á, 1995. Increased levels of GMAP, VIP and nitric oxide synthase, and their mRNAs, in lumbar dorsal root ganglia of the rat following systemic resiniferatoxin treatment. Neuroreport 6: 2230-2234. Fedan JS, Hogaboom GK, O'Donnell JP, Colby J, Westfall DP, 1981. Contribution by purines to the neurogenic response of the vas deferens of the guinea-pig. Eur. J. Pharmacol. 69: 41-53. Ferrero JD, Cocks T, Burnstock G, 1980. A comparison between ATP and bradykinin as possible mediators of the responses of smooth muscle to non-adrenergic non-cholinergic nerves. Eur. J. Pharmacol. 63: 295-302. Fredholm BB, Ijzerman AP, Jacobson KA, Klotz KN, Linden J, 2001. International Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine receptors. Pharmacol. Rev. 53: 527-552. Furchgott RF, Zawadzki JV, 1980. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288: 373-376. Furness JB, 2000. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81: 87-96. Furness JB, Costa M, 1980. Types of nerves in the enteric nervous system. Neuroscience 5: 1-20. Furness JB, Kunze WA, Bertrand PP, Clerc N, Bornstein JC, 1998. Intrinsic primary afferent neurons of the intestine. Prog. Neurobiol. 54: 1-18. Furness JB, Jones C, Nurgali K, Clerc N, 2004. Intrinsic primary afferent neurons and nerve circuits within the intestine. Prog. Neurobiol. 72: 143-164. Gabella G, 1994. Structure of muscles and nerves in the gastrointestinal tract. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 751-794. Galligan JJ, 2002. Pharmacology of synaptic transmission in the enteric nervous system. Curr. Opin. Pharmacol. 2: 623-629. Gershon MD, Kirchgessner AL, Wade PR, 1994. Functional anatomy of the enteric nervous system. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 381-422. Giuliani S, Santicioli P, Lippi A, Lecci A, Tramontana M, Maggi CA, 2001. The role of sensory neuropeptides in motor innervation of the hamster isolated urinary bladder. NaunynSchmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 364: 242-248. Gonzalez R, Dunkel R, Koletzko B, Schusdziarra V, Allescher HD, 1998. Effect of capsaicin-containing red pepper sauce suspension on upper gastrointestinal motility in healthy volunteers. Dig. Dis. Sci. 43: 1165-1171. Goyal RK, Hirano I, 1996. The enteric nervous system. New England J. Med. 334: 1106-1115. Grider JR, 1994. CGRP as a transmitter in the sensory pathway mediating peristaltic reflex. Am. J. Physiol. 266: G1139-1145.
85 Hansen MB, 2003. The enteric nervous system II: gastrointestinal functions. Pharmacol. Toxicol. 92: 249-257. Hebeiss K, Kilbinger H, 1996. Differential effects of nitric oxide donors on basal and electrically evoked release of acetylcholine from guinea-pig myenteric neurones. Br. J. Pharmacol. 118: 2073-2078. Holton P, 1959. The liberation of adenosine triphosphate on antidromic stimulation of sensory nerves. J. Physiol. (London) 145: 494-504. Holzer P, 1991. Capsaicin: Cellular targets mechanisms of action and selectivity for thin sensory neurons. Pharmacol. Rev. 43: 143-201. Holzer P, Barthó L, 1996. Sensory neurons in the intestine. In: Geppetti P, Holzer P (eds) Neurogenic Inflammation. CRC Press, Boca Raton, pp. 153-167. Holzer P, Bucsics A, Lembeck F, 1982. Distribution of capsaicin-sensitive nerve fibres containing immunoreactive substance P in cutaneous and visceral tissues of the rat. Neurosci. Lett. 31: 253257. Holzer P, Lippe IT, Tabrizi AL, Lénárd LJr, Barthó L, 1997. Dual excitatory and inhibitory effect of nitric oxide on peristalsis in the guinea pig intestine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 280: 154-161. Holzer-Petsche U, Seitz H, Lembeck F, 1989. Effect of capsaicin on gastric corpus smooth muscle of the rat in vitro. Eur. J. Pharmacol. 162: 29-36. Horowitz M, Wishart J, Maddox A, Russo A, 1992. The effect of chilli on gastrointestinal transit. J. Gastroenterol. Hepatol. 7: 52-56. Hoyle CH, 1992. Transmission: purines. In: Autonomic Neuroeffector Mechanisms, ed. Burnstock G, Hoyle CH; Harwood Academic Publishers, Chur, 1992, pp. 367-407. Hoyle CH, 1994. Non-adrenergic, non-cholinergic control of the urinary bladder. World J. Urol. 12: 233244. Hoyle CH, Burnstock G, 1985. Atropine-resistant excitatory junction potentials in rabbit bladder are blocked by alpha,beta-methylene ATP. Eur. J. Pharmacol. 114: 239-240. Hoyle CH, Chapple C, Burnstock G, 1989. Isolated human bladder: evidence for an adenine dinucleotide acting on P2X-purinoceptors and for purinergic transmission. Eur. J. Pharmacol. 174: 115-118. Hoyle CH, Knight GE, Burnstock G, 1990. Suramin antagonizes responses to P2-purinoceptor agonists and purinergic nerve stimulation in the guinea-pig urinary bladder and taenia coli. Br. J. Pharmacol. 99: 617-621. Huidobro-Toro JP, Yoshimura K, 1983. Pharmacological characterization of the inhibitory effects of neurotensin on the rabbit ileum myenteric plexus preparation. Br. J. Pharmacol. 80: 645-653. Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G, 1987. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 92659269. Ishiguchi T, Takahashi T, Itoh H, Owyang C, 2000. Nitrergic and purinergic regulation of the rat pylorus. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279: G740-747. Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J, 1967. Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. Br. J. Pharmacol. Chemother. 31: 138-151.
86 Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J, 1968. The role of sensory nerve endings in neurogenic inflammation induced in human skin and in the eye and paw of the rat. Br. J. Pharmacol. Chemother. 33: 32-41. Kamata K, Inoue K, Kasuya Y, 1992. Changes in contractile responses of the urinary bladder to substance P in streptozotocin-induced diabetic rats. Gen. Pharmacol. 24: 547-553. Kasakov L, Burnstock G, 1982. The use of the slowly degradable analog, alpha, beta-methylene ATP, to produce desensitisation of the P2-purinoceptor: effect on non-adrenergic, non-cholinergic responses of the guinea-pig urinary bladder. Eur. J. Pharmacol. 86: 291-294. Keef KD, Shuttleworth CW, Xue C, Bayguinov O, Publicover NG, Sanders KM, 1994. Relationship between
nitric
oxide
and
vasoactive
intestinal
polypeptide
in
enteric
inhibitory
neurotransmission. Neuropharmacology 33: 1303-1314. Kennedy C, Burnstock G, 1985. ATP produces vasodilation via P1 purinoceptors and vasoconstriction via P2 purinoceptors in the isolated rabbit central ear artery. Blood-Vessels 22: 145-155. Kerr KP, Mitchelson F, Coupar IM, 1995. Vagal nerve stimulation of the guinea-pig oesophagus. Acta Physiol. Scand. 154: 213-220. Király Á, Sütő G, Czimmer J, Horváth ÖP, Mózsik G, 2001. Failure of capsaicin-containing red pepper sauce suspension to induce esophageal motility response in patients with Barrett's esophagus. J. Physiol. Paris 95: 197-200. Kishi M, Takeuchi T, Suthamnatpong N, Ishii T, Nishio H, Hata F, Takewaki T, 1996. VIP- and PACAPmediated nonadrenergic, noncholinergic inhibition in longitudinal muscle of rat distal colon: involvement of activation of charybdotoxin- and apamin-sensitive K+ channels. Br. J. Pharmacol. 119: 623-630. Klukovits A, Gáspár R, Sántha P, Jancsó G, Falkay G, 2004. Role of capsaicin-sensitive nerve fibers in uterine contractility in the rat. Biol.Reprod. 70: 184-190. Koh SD, Dick GM, Sanders KM, 1997. Small-conductance Ca(2+)-dependent K+ channels activated by ATP in murine colonic smooth muscle. Am. J. Physiol. 273: C2010-2021. Krell RD, Mccoy JL, Ridley PT, 1981. Pharmacological characterization of the excitatory innervation to the guinea-pig urinary bladder in vitro: evidence for both cholinergic and non-adrenergic-noncholinergic neurotransmission. Br. J. Pharmacol. 74: 15-22. Kunze WA, Furness JB, 1999. The enteric nervous system and regulation of intestinal motility. Ann. Rev. Physiol. 61: 117-142. Kwon S, Chung S, Ahn D, Yeon D, Nam T, 2001. Mechanism of carbon monoxide-induced relaxation in the guinea pig ileal smooth muscle. J. Vet. Med. Sci. 63: 389-393. Lambrecht G, Friebe T, Grimm U, Windscheif U, Bungardt E, Hildebrandt C, Bäumert HG, SpatzKümbel G, Mutschler E, 1992. PPADS, a novel functionally selective antagonist of P2purinoceptor mediated responses. Eur. J. Pharmacol. 217: 217-219. Lecci A, Maggi CA, 2001. Tachykinins as modulators of the micturition reflex in the central and peripheral nervous system. Reg. Pept. 101: 1-18. Lecci A, Santicioli P, Maggi CA, 2002. Pharmacology of transmission to gastrointestinal muscle. Curr. Op. Pharmacol. 2: 630-641.
87 Lefebvre RA, 1995. Nitric oxide in the peripheral nervous system. Ann. of Medicine 27: 379-388. Lefebvre RA, Barthó L, 1997. Mechanism of the nitric oxide-induced contraction in the rat isolated small intestine. Br. J. Pharmacol. 120: 975-981. Lénárd LJr, Halmai V, Barthó L, 1999. Morphine contracts the guinea pig ileal circular muscle by interfering with a nitric oxide mediated tonic inhibition. Digestion. 60: 562-566. Lénárd LJr, Lázár Z, Benkó R, Szigeti R, Báthori Z, Tóth GK, Penke B, Barthó L, 2000. Inhibitory effect of PACAP(6-38) on relaxations induced by PACAP, VIP and non-adrenergic, non-cholinergic nerve stimulation in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 361: 492-497. Levin RM, Ruggieri MR, Wein AJ, 1968. Functional effects of the purinergic innervation of the rabbit urinary bladder. J. Pharmacol. Exp. Ther. 236: 452-457. Li CG, Rand MJ, 1990. Nitric oxide and vasoactive intestinal polypeptide mediate non-adrenergic, noncholinergic inhibitory transmission to smooth muscle of the rat gastric fundus. Eur. J. Pharmacol. 191: 303-309. Luheshi G, Zar A, 1990. Purinoceptor desensitization impairs but does not abolish the non-cholinergic motor transmission in rat isolated urinary bladder. Eur. J. Pharmacol. 185: 203-208. Lundberg JM, Brodin E, Hua X, Saria A, 1984. Vascular permeability changes and smooth muscle contraction in relation to capsaicin-sensitive substance P afferents in the guinea-pig. Acta Physiol. Scand. 120: 217-227. Maggi CA, 1990. The dual function of capsaicin-sensitive sensory nerves in the bladder and urethra. Ciba Foundation Symposium 96, 479-484; 151: 77-90. Maggi CA, 1995. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog. Neurobiol. 45: 1-98. Maggi CA, Giuliani S, 1991. The neurotransmitter role of CGRP in the rat and guinea-pig ureter: effect of a CGRP antagonist and species-related differences in the action of omega conotoxin on CGRP release from primary afferents. Neuroscience 43: 261-268. Maggi CA, Santicioli P, Meli A, 1985. Evidence for the involvement of endogenous substance P in the motor effects of capsaicin on the rat urinary bladder. J. Pharm. Pharmacol. 37: 203-204. Maggi CA, Manzini S, Giuliani S, Santicioli P, Meli A, 1986. Extrinsic origin of the capsaicin-sensitive innervation of rat duodenum: possible involvement of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the capsaicin-induced activation of intramural non-adrenergic non-cholinergic neurons. NaunynSchmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 334: 172-180. Maggi CA, Giuliani S, Santicioli P, Abelli L, Meli A, 1987a. Visceromotor responses to CGRP in the rat lower urinary tract: evidence for a transmitter role in the capsaicin-sensitive nerves of the ureter, Eur. J. Pharmacol. 143: 78-82. Maggi CA, Meli A, Santicioli P, 1987b. Four motor effects of capsaicin on guinea-pig distal colon. Br. J. Pharmacol. 90: 651-660. Maggi CA, Meli A, Santicioli P, 1987c. Neuroeffector mechanisms in the voiding cycle of the guinea-pig urinary bladder. J. Auton. Pharmacol. 7: 295-308.
88 Maggi CA, Santicioli P, Theodorsson-Norheim E, Meli A, 1987d. Immunoblockade of response to capsaicin in the rat vas deferens: evidence for the involvement of endogenous calcitonin generelated peptide. Neurosci. Lett. 78: 63-68. Maggi CA, Patacchini R, Santicioli P, Giuliani S, Turini D, Barbanti G, Beneforti P, Misuri D, Meli A, 1988. Specific motor effects of capsaicin on human jejunum. Eur. J. Pharmacol. 149: 393395. Maggi CA, Conte B, Furio M, Santicioli P, Giuliani S, Meli A, 1989a. Further studies on mechanisms regulating the voiding cycle of the rat urinary bladder. Gen. Pharmacol. 20: 833-838. Maggi CA, Patacchini R, Santicioli P, Turini D, Barbanti G, Beneforti P, Rovero P, Meli A, 1989b. Further studies on the motor response of the human isolated urinary bladder to tachykinins, capsaicin and electrical field stimulation. Gen. Pharmacol. 20: 663-669. Maggi CA, Santicioli P, Del Bianco E, Geppetti P, Barbanti G, Turini D, Meli A, 1989c. Release of VIPbut not CGRP-like immunoreactivity by capsaicin from the human isolated small intestine. Neurosci. Lett. 98: 317-320. Maggi CA, Santicioli P, Manzini S, Conti S, Giuliani S, Patacchini R, Meli A, 1989d. Functional studies on the cholinergic and sympathetic innervation of the rat proximal urethra: effect of pelvic ganglionectomy or experimental diabetes. J. Auton. Pharmacol. 9: 231-241. Maggi CA, Santicioli P, Renzi D, Patacchini R, Surrenti C, Meli A, 1989e. Release of substance P- and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactivity and motor response of the isolated guineapig gallbladder to capsaicin. Gastroenterology 96: 1093-1101. Maggi CA, Giuliani S, Santicioli P, Patacchini R, Said SI, Theodorsson E, Turini D, Barbanti G, Giachetti A, Meli A, 1990a. Direct evidence for the involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the motor response of the human isolated ileum to capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 185: 169-178. Maggi CA, Theodorsson E, Santicioli P, Patacchini R, Barbanti G, Turini D, Renzi D, Giachetti A, 1990b. Motor response of the human isolated colon to capsaicin and its relationship to release of vasoactive intestinal polypeptide. Neuroscience 39: 833-841. Maggi CA, Chiba T, Giuliani S, 1991a. Human αCGRP(8-37) as an antagonist of exogenous and endogenous calcitonin gene-related peptide. Eur. J. Pharmacol. 192: 85-88. Maggi CA, Patacchini R, Santicioli P, Giuliani S, 1991b. Tachykinin antagonists and capsaicin-induced contraction of the rat isolated urinary bladder: evidence for tachykinin-mediated cotransmission. Br. J. Pharmacol. 103: 1535-1541. Maggi CA, Theodorsson E, Santicioli P, Giuliani S, 1992. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide as co-transmitters in local motor responses produced by sensory nerve activation in the guinea-pig isolated renal pelvis. Neuroscience 46: 549-559. Maggi CA, Giuliani S, Zagorodnyuk V, 1996. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the circular muscle of guinea-pig colon: role as inhibitory transmitter and mechanisms of relaxation. Regulatory Peptides 61: 27-36. Martins SL, De Oliveira RB, Ballejo G, 1995. Rat duodenum nitrergic-induced relaxations are cGMPindependent and apamin-sensitive. Eur. J. Pharmacol. 284: 265-270.
89 Mashimo H, Goyal RK, 1999. Lessons from genetically engineered animal models. IV. Nitric oxide synthase gene knockout mice. Am. J. Physiol. 277: G745-750. Mayer EA, Koelbel CB, Snape WJJr, Eysselein V, Ennes H, Kodner A, 1990. Substance P and CGRP mediate motor response of rabbit colon to capsaicin. Am. J. Physiol. 259: G889-897. McConalogue K, Furness JB, Vremec MA, Holst JJ, Tornoe K, Marley PD, 1995. Histochemical, pharmacological, biochemical and chromatographic evidence that pituitary adenylyl cyclase activating peptide is involved in inhibitory neurotransmission in the taenia of the guinea-pig caecum. J. Auton. Nerv. Syst. 50: 311-322. McKirdy HC, Marshall RW, Taylor BA, 1993. Control of the human ileocaecal junction: an in vitro analysis of adrenergic and non-adrenergic non-cholinergic mechanisms. Digestion 54: 200-206. McLaren GJ, Kennedy C, Sneddon P, 1995. The effects of suramin on purinergic and noradrenergic neurotransmission in the rat isolated tail artery. Eur. J. Pharmacol. 277: 57-61. Meini S, Maggi CA, 1994. Evidence for a capsaicin-sensitive, tachykinin-mediated, component in the NANC contraction of the rat urinary bladder to nerve stimulation. Br. J. Pharmacol. 112: 11231131. Murad F, Mittal CK, Arnold WP, Katsuki S, Kimura H, 1978. Guanylate cyclase: activation by azide, nitro compounds, nitric oxide, and hydroxyl radical and inhibition by hemoglobin and myoglobin. Adv. Cyclic Nucleotide Res. 9: 145-158. Murthy KS, Grider JR, Jin JG, Makhlouf GM, 1995. Interplay of VIP and nitric oxide in the regulation of neuromuscular activity in the gut. Arch. Int. Pharm. Ther. 329: 27-38. Murthy KS, Makhlouf GM, 1998. Coexpression of ligand-gated P2X and G protein-coupled P2Y receptors in smooth muscle. Preferential activation of P2Y receptors coupled to phospholipase C (PLC)beta1 via Galphaq/11 and to PLC-beta3 via Gbetagammai3. J. Biol. Chem. 273: 4695-4704. Naik JS, O'Donaughy TL, Walker BR, 2003. Endogenous carbon monoxide is an endothelial-derived vasodilator factor in the mesenteric circulation. Am. J. Physiol. 284: H838-845. Nichols K, Staines W, Krantis A, 1994. Neural sites of the human colon colocalize nitric oxide synthaserelated NADPH diaphorase activity and neuropeptide Y. Gastroenterology 107: 968-975. Niioka S, Takeuchi T, Kishi M, Ishii T, Nishio H, Takewaki T, Hata F, 1997. Nonadrenergic, noncholinergic relaxation in longitudinal muscle of rat jejunum. Jpn. J. Pharmacol. 73: 155-161. Nishizawa S, Igawa Y, Okada N, Ohhashi T, 1997. Capsaicin-induced nitric-oxide-dependent relaxation in isolated dog urethra. Eur. J. Pharmacol. 335: 211-219. Nocerino E, Izzo AA, Borrelli F, Capasso F, Capasso R, Pinto A, Sautebin L, Mascolo N, 2002. Relaxant effect of capsazepine in the isolated rat ileum. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 365: 187-192. North RA, Barnard EA, 1997. Nucleotide receptors. Curr. Op. Neurobiol. 7: 346-357. Ny L, Alm P, Ekstrom P, Larsson B, Grundemar L, Andersson KE, 1996. Localization and activity of haem oxygenase and functional effects of carbon monoxide in the feline lower oesophageal sphincter. Br. J. Pharmacol. 118: 392-399.
90 Ny L, Pfeifer A, Aszodi A, Ahmad M, Alm P, Hedlund P, Fassler R, Andersson KE, 2000. Impaired relaxation of stomach smooth muscle in mice lacking cyclic GMP-dependent protein kinase I. Br. J. Pharmacol. 129: 395-401. O'Kelly T, Brading A, Mortensen N, 1993. Nerve mediated relaxation of the human internal anal sphincter: the role of nitric oxide. Gut 34: 689-693. O'Reilly BA, Kosaka AH, Chang TK, Ford AP, Popert R, Rymer JM, McMahon SB, 2001. A quantitative analysis of purinoceptor expression in human fetal and adult bladders. J. Urol. 165: 1730-1734. P2X receptors. In: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition (Eds. Alexander, S.P.H., A. Mathie & J.A. Peters), Br. J. Pharmacol. 2006. 147: S95. P2Y receptors. In: Guide to Receptors and Channels, 2nd edition (Eds. Alexander, S.P.H., A. Mathie & J.A. Peters), Br. J. Pharmacol. 2006. 147: S65. Palea S, Artibani W, Ostardo E, Trist DG, Pietra C, 1993. Evidence for purinergic neurotransmission in human urinary bladder affected by interstitial cystitis. J. Urol. 150: 2007-2012. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S, 1987. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 327: 524-526. Parlani M, Conte B, Goso C, Szállási Á, Manzini S, 1993. Capsaicin-induced relaxation in the rat isolated external urethral sphincter: characterization of the vanilloid receptor and mediation by CGRP. Br. J. Pharmacol. 110: 989-994. Patacchini R, Maggi CA, Rovero P, Regoli D, Drapeau G, Meli A, 1989. Effect of thiorphan on tachykinin-induced potentiation of nerve-mediated contractions of the rat isolated vas deferens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 250: 678-681. Patacchini R, De Giorgio R, Barthó L, Barbara G, Corinaldesi R, Maggi CA, 1998. Evidence that tachykinins are the main NANC excitatory neurotransmitters in the guinea-pig common bile duct. Br. J. Pharmacol. 124: 1703-1711. Patacchini R, Barthó L, De Giorgio R, Lénárd LJr, Stanghellini V, Barbara G, Lecci A, Maggi CA, 1999. Involvement of endogenous tachykinins and CGRP in the motor responses produced by capsaicin in the guinea-pig common bile duct. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 360: 344-353. Patak EN, Pennefather JN, Story ME, 2000. Effects of tachykinins on uterine smooth muscle. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27: 922-927. Patel J, Tomlinson DR, 1999. Nerve conduction impairment in experimental diabetes − proximodistal gradient of severity. Muscle Nerve 22: 1403-1411. Paton WDM, Vizi ES, 1969. The inhibitory action of noradrenaline and adrenaline on acetylcholine output by guinea-pig ileum longitudinal muscle strip. Br. J. Pharmacol. 35: 10-20. Patterson LM, Zheng H, Ward SM, Berthoud HR, 2003. Vanilloid receptor (VR1) expression in vagal afferent neurons innervating the gastrointestinal tract. Cell Tissue Res. 311: 277-287. Persson K, Johansson K, Alm P, Larsson B, Andersson KE, 1997. Morphological and functional evidence against a sensory and sympathetic origin of nitric oxide synthase-containing nerves in the rat lower urinary tract. Neuroscience. 77: 271-281.
91 Pinna C, Bolego C, Puglisi L, 1994. Effect of substance P and capsaicin on urinary bladder of diabetic rats and the role of the epithelium. Eur. J. Pharmacol. 271: 151-158. Pinna C, Bolego C, Puglisi L, 1995. Effect of substance P and capsaicin on stomach fundus and ileum of streptozotocin-diabetic rats. Eur. J. Pharmacol. 276: 61-69. Pluja L, Fernandez E, Jimanez M, 1999. Neural modulation of the cyclic electrical and mechanical activity in the rat colonic circular muscle: putative role of ATP and NO. Br. J. Pharmacol. 126: 883-892. Poonyachoti S, Kulkarni-Narla A, Brown DR, 2002. Chemical coding of neurons expressing delta- and kappa-opioid receptor and type I vanilloid receptor immunoreactivities in the porcine ileum. Cell Tissue Res. 307: 23-33. Ramme D, Regenold JT, Starke K, Busse R, Illes P, 1987. Identification of the neuroeffector transmitter in jejunal branches of the rabbit mesenteric artery. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 336: 267-273. Rand MJ, Li CG, 1995. Nitric oxide as a neurotransmitter in peripheral nerves: nature of transmitter and mechanism of transmission. Ann. Rev. Physiol. 57: 659-682. Rattan S, Chakder S, 1993. Inhibitory effect of CO on internal anal sphincter: heme oxygenase inhibitor inhibits NANC relaxation. Am. J. Physiol. 265: G799-804. Ren K, Ruda MA, 1995. Nitric oxide synthase-containing neurons in sensory ganglia of the rat are susceptible to capsaicin-induced cytotoxicity. Neuroscience 65: 505-511. Rózsai B, Lázár Zs, Benkó R, Barthó L, 2001. Inhibition of the NANC relaxation of the guinea-pig proximal colon longitudinal muscle by the purinoceptor antagonist PPADS, inhibition of nitric oxide synthase, but not by a PACAP/VIP antagonist. Pharmacol. Res. 43: 83-87. Saha JK, Hirano I, Goyal RK, 1993. Biphasic effect of SNP on opossum esophageal muscle:involvement of cGMP and eicosanoids. Am. J. Physiol. 265: G403-407. Samuelson UE, Dalsgaard CJ, Lundberg JM, Hökfelt T, 1985. CGRP inhibits spontaneous contractions in human uterus and fallopian tube. Neurosci. Lett. 62: 225-230. Sandler AD, Schlegel JF, DeSautel MG, Maher JW, 1993. Neuroregulation of a chemosensitive afferent system in the canine distal esophagus. J. Surg. Res. 55: 364-371. Santicioli P, Gamse R, Maggi CA, Meli A, 1987. Cystometric changes in the early phase of streptozotocin-induced diabetes in rats: evidence for sensory changes not correlated to diabetic neuropathy. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 335: 580-587. Saur D, Neuhuber WL, Gengenbach B, Huber A, Schusdziarra V, Allescher HD, 2002. Site-specific gene expression of nNOS variants in distinct functional regions of rat gastrointestinal tract. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282: G349-358. Schmidt HHHW, Lohmann SM, Walter U, 1993. The nitric oxide and cGMP signal transduction systemregulation and mechanism of action. Biochem. Biophys. Acta 1178: 153-175. Schwörer H, Katsoulis S, Creutzfeldt W, Schmidt WE, 1992. Pituitary adenylate cyclase activating peptide, a novel VIP-like gut-brain peptide, relaxes the guinea-pig taenia caeci via apaminsensitive potassium channels. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 346: 511-514.
92 Shan LH, Nishiyama M, Shibasaki T, Moroi K, Goto K, Masaki T, Kimura S, 1996. Endothelin ETA and ETB receptors mediate endothelin-1-induced apamin-sensitive relaxation in the guinea pig ileum. Jpn. J. Pharmacol. 70: 259-267. Sharkey KA, Williams RG, Schultzberg M, Dockray GJ, 1983. Sensory substance P- innervation of the urinary bladder: possible site of action of capsaicin in causing urine retention in rats. Neuroscience 10: 861-868. Sim JH, Kim YC, Kim SJ, Lee SJ, Suh SH, Jun JY, So I, Kim KW, 2001. Capsaicin inhibits the voltageoperated calcium channels intracellularly in the antral circular myocytes of guinea-pig stomach. Life Sci. 68: 2347-2360. Smart D, Gunthorpe MJ, Jerman JC, Nasir S, Gray J, Muir AI, Chambers JK, Randall AD, Davis JB, 2000. The endogenous lipid anandamide is a full agonist at the human vanilloid receptor (hVR1). Br. J. Pharmacol. 129: 227-230. Smid SD, Blackshaw LA, 2000. Neuromuscular function of the human lower oesophageal sphincter in reflux disease and Barrett's oesophagus. Gut 46: 756-761. Smid SD, Lynn PA, Templeman R, Blackshaw LA, 1998. Activation of non-adrenergic non-cholinergic inhibitory pathways by endogenous and exogenous tachykinins in the ferret lower oesophageal sphincter. Neurogastroenterol. Motil. 10: 149-156. Smits GJM, Lefebvre RA, 1996. ATP and nitric oxide: inhibitory NANC neurotransmitters in the longitudinal muscle-myenteric plexus preparation of the rat ileum, Br. J. Pharmacol. 118: 695703. Sneddon P, Burnstock G, 1984. ATP as a co-transmitter in rat tail artery. Eur. J. Pharmacol. 106: 149152. Stark ME, Szurszewski JH, 1992. Role of nitric oxide in gastrointestinal and hepatic function and disease. Gastroenterology 103: 1928-1949. Suzuki H, Ward SM, Bayguinov YR, Edwards FR, Hirst GD, 2003. Involvement of intramuscular interstitial cells in nitrergic inhibition in the mouse gastric antrum. J. Physiol. 546: 751-763. Szolcsányi J, 1984. Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-efferent function. In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation, ed. Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F; Akadémiai Kiadó, Budapest, 1984, pp. 27-56. Szolcsányi J, 1996. Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog. Brain Res. 113: 343-359. Szolcsányi J, 2000. Anandamide and the question of its functional role for activation of capsaicin receptors. Trends Pharmacol. Sci. 21: 203-204. Szolcsányi J, Barthó L, 1978. New type of nerve-mediated cholinergic contractions of the guinea-pig small intestine and its selective blockade by capsaicin. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 305: 83-90. Szolcsányi J, Barthó L, 1982. Capsaicin-sensitive, non-cholinergic excitatory innervation of the guineapig tracheobronchial smooth muscle. Neurosci. Lett. 34: 247-251.
93 Szolcsányi J, Barthó L, 2001. Capsaicin-sensitive afferents and their role in gastroprotection: an update. J. Physiol. Paris. 95: 181-188. Tagliani M, Candura SM, Di Nucci A, Franceschetti GP, D'Agostino G, Ricotti P, Fiori E, Tonini M, 1997. A re-appraisal of the nature of the atropine-resistant contraction to electrical field stimulation in the human isolated detrusor muscle. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 356: 750-755. Tam FS, Hillier K, 1992. The role of nitric oxide in mediating non-adrenergic non-cholinergic relaxation in longitudinal muscle of human taenia coli. Life Sci. 51: 1277-1284. Tanovic A, Jimenez M, Fernandez E, 2001. Actions of NO donors and endogenous nitrergic transmitter on the longitudinal muscle of rat ileum in vitro: mechanisms involved. Life Sci. 69: 1143-1154. Teixeira CE, Bento AC, Lopes-Martins RA, Teixeira SA, von Eickestedt V, Muscara MN, Arantes EC, Giglio JR, Antunes E, de Nucci G, 1998. Effect of Tityus serrulatus scorpion venom on the rabbit isolated corpus cavernosum and the involvement of NANC nitrergic nerve fibres. Br. J. Pharmacol. 123: 35-442. Terenghi G, Riveros-Moreno V, Hudson LD, Ibrahim NB, Polak JM, 1993. Immunohistochemistry of nitric oxide synthase demonstrates immunoreactive neurons in spinal cord and dorsal root ganglia of man and rat. J. Neurol. Sci. 118: 34-37. Thippeswamy T, Morris R, 2002. The roles of nitric oxide in dorsal root ganglion neurons. Ann. New York Acad. Sci. 962: 103-110. Toda N, Herman AG, 2005. Gastrointestinal function regulation by nitrergic efferent nerves. Pharmacol. Rev. 57: 315-338. Toda N, Baba H, Okamura T, 1990. Role of nitric oxide in non-adrenergic, non-cholinergic nervemediated relaxation in dog duodenal longitudinal muscle strips. Jpn. J. Pharmacol. 53: 281-284. Tong YC, Hung YC, Shinozuka K, Kunitomo M, Cheng JT, 1997. Evidence of adenosine 5’-triphosphate release from nerve and P2X purinoceptor mediated contraction during electrical stimulation of rat urinary bladder smooth muscle. J. Urol. 158: 1973-1977. Tøttrup A, Ny L, Alm P, Larsson B, Forman A, Andersson KE, 1993. The role of the L-arginine/nitric oxide pathway for relaxation of the human lower oesophageal sphincter. Acta Physiol. Scand. 149: 451-459. Uno H, Arakawa T, Fukuda T, Higuchi K, Kobayashi K, 1997. Involvement of capsaicin-sensitive sensory nerves in gastric adaptive relaxation in isolated guinea-pig stomachs. Digestion 58: 232239. Wali FA, 1985. Possible involvement of substance P in the contraction produced by periarterial nerve stimulation in the rat ileum. J. Aut. Pharmac. 5: 143-148. Ward SM, Sanders KM, 2001. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 281: G602-611. Ward SM, Bayguinov J, Won KJ, Grundy D, Berthoud HR, 2003. Distribution of the vanilloid receptor (VR1) in the gastrointestinal tract. J. Comp. Neurol. 465: 121-135.
94 Waterman SA, Costa M, 1994. The role of enteric inhibitory motoneurons in peristalsis in the isolated guinea-pig small intestine. J. Physiol. 477: 459-468. Whittle BJ, 1994. Nitric oxide in gastrointestinal physiology and pathology. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 267-294. Wood JD, 1994. Physiology of the enteric nervous system. In: Johnson, L.R. (Ed.) Physiology of the Gastrointestinal Tract, 3rd ed. Raven Press, New York, pp. 423-475. Xue L, Farrugia G, Sarr MG, Szurszewski JH, 1999. ATP is a mediator of the fast inhibitory junction potential in human jejunal circular smooth muscle. Am. J. Physiol. 276: G1373-1379. Yamaji M, Ohta M, Yamazaki Y, Fujinami K, Fujita A, Takeuchi T, Hata F, Takewaki T, 2002. A possible role of neurotensin in NANC relaxation of longitudinal muscle of the jejunum and ileum of Wistar rats. Br. J. Pharmacol. 137: 629-636. Yoshida M, Homma Y, Inadome A, Yono M, Seshita H, Miyamoto Y, Murakami S, Kawabe K, Ueda S, 2001. Age-related changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in human isolated bladder smooth muscles. Exp. Gerontol. 36: 99-109. Yoshida M, Miyamae K, Iwashita H, Otani M, Inadome A, 2004. Management of detrusor dysfunction in the elderly: changes in acetylcholine and adenosine triphosphate release during aging. Urology 63: 17-23. Zagorodnyuk V, Maggi CA, 1994. Electrophysiological evidence for different release mechanism of ATP and NO as inhibitory NANC transmitters in guinea-pig colon. Br. J. Pharmacol. 112: 1077-1082. Zagorodnyuk V, Maggi CA, 1998. Pharmacological evidence for the existence of multiple P2 receptors in the circular muscle of guinea-pig colon. Br. J. Pharmacol. 123: 122-128. Zagorodnyuk V, Santicioli P, Maggi CA, Giachetti A, 1995. Evidence that tachykinin NK1 and NK2 receptors mediate non-adrenergic non-cholinergic excitation and contraction in the circular muscle of guinea-pig duodenum. Br. J. Pharmacol. 115: 237-246. Zagorodnyuk V, Santicioli P, Maggi CA, Giachetti A, 1996. The possible role of ATP and PACAP as mediators of apamin-sensitive NANC inhibitory junction potentials in circular muscle of guineapig colon. Br. J. Pharmacol. 119: 779-786. Ziganshin AU, Hoyle CH, Bo X, Lambrecht G, Mutschler E, Baumert HG, Burnstock G, 1993. PPADS selectively antagonizes P2X-purinoceptor-mediated responses in the rabbit urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 110: 1491-1495. Zimmermann H, 2001. Ectonucleotidases: Some recent developments and a note on nomenclature. Drug Dev. Res. 52: 44-56.
95
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, 2002, Nitric oxide is involved in the relaxant effect of capsaicin in the human sigmoid colon circular muscle. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 366: 496-500. Benkó R Lázár Z, Pórszász R, Somogyi G, Barthó L, 2003, Effect of experimental diabetes on cholinergic, purinergic and peptidergic motor responses of the isolated rat bladder to electrical field stimulation or capsaicin. Eur. J. Pharmacol. 478: 73-80. Benkó R, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, Rumbus Z, Wolf M, Maggi CA, Barthó L, 2004, Inhibition of nitric oxide synthesis blocks the inhibitory response to capsaicin in intestinal circular muscle preparations from different species. Life Sci. 76: 2773-2782. Barthó L, Benkó R, Patacchini R, Pethő G, Holzer-Petsche U, Holzer P, Lázár Z, Undi S, Illényi L, Antal A, Horváth ÖP, 2004, Effects of capsaicin on visceral smooth muscle: a valuable tool for sensory neurotransmitter identification. Eur. J. Pharmacol. 500: 143-157. Benkó R, Undi S, Wolf M, Magyar K, Tóvölgyi Z, Rumbus Z, Barthó L, 2006, P2 purinoceptors account for the non-nitrergic NANC relaxation in the rat ileum. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 4: 319-324. Közlésre való előkészítés alatt: Benkó R, Undi S, Wolf M, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Horváth ÖP, Antal A, Magyar K, Tóvölgyi Z, Barthó L, 2006. P2 purinoceptor antagonists inhibit the NANC relaxation of the human colon in vitro. Neuroscience.
96
A jelölt egyéb közleményei Lénárd L Jr, Lázár Z, Benkó R, Szigeti R, Báthori Z, Tóth GK, Penke B, Barthó L, 2000, Inhibitory effect of PACAP(6-38) on relaxations induced by PACAP, VIP and non-adrenergic, non-cholinergic nerve stimulation in the guinea-pig taenia caeci. Naunyn-Schmiedebergs’ Arch. Pharmacol. 361: 492-497. Barthó L, Lázár Z, Lénárd L Jr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, 2000, Evidence for the involvement of ATP, but not of VIP/PACAP or nitric oxide, in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. Eur. J. Pharmacol. 392: 183-188. Rózsai B, Lázár Z, Benkó R, Barthó L, 2001, Inhibition of the NANC relaxation of the guinea-pig proximal colon longitudinal muscle by the purinoceptor antagonist PPADS, inhibition of nitric oxide synthase, but not by a PACAP/VIP antagonist. Pharmacol. Res. 43: 83-87. Lázár Z, Shahbazian A, Benkó R, Tóth G, Penke B, Barthó L, Holzer P, 2001, PACAP(6-38) inhibits the effects of vasoactive intestinal polypeptide, but not PACAP, on the small intestinal circular muscle. Eur. J. Pharmacol. 431: 259264. Lázár Z, Benkó R, Bölcskei K, Rumbus Z, Wolf M, Holzer P, Maggi CA, Barthó L, 2003, Actions of endothelin and corticotropin releasing factor in the guinea-pig ileum: no evidence for an interaction with capsaicin-sensitive neurons. Neuropeptides 37: 220-232. Benkó R, Undi S, Wolf M, Barthó L, 2005, Effects of acute administration of and tachyphylaxis to α,β-methylene ATP in the guinea-pig small intestine. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 97: 369-373. Barthó L, Undi S, Benkó R, Wolf M, 2005, Ideg-simaizom transzmitterek a gyomorbélhuzamban: A motilitászavarok lehetséges háttere. Praxis 14 (12): 14-19. Barthó L, Undi S, Benkó R, Wolf M, Lázár Z, Lénárd L Jr, Maggi CA, 2006, Multiple motor effects of ATP and their inhibition by PPADS in the small intestine of the guinea-pig. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 98: 488-495. Undi S, Benkó R, Wolf M, Illényi L, Horváth ÖP, Antal A, Csontos Z, Vereczkei A, Barthó L, 2006, Purinergic nerves mediate the non-nitrergic relaxation of the human ileum in response to electrical field stimulation. Brain Res. Bulletin (in press).
97
Kongresszusi szereplések Lénárd LJr, Barthó L, Benkó R, Báthori Z, Tóth G, Penke B, PACAP-antagonista gátolja a nem-adrenerg, nem-kolinerg elernyedést a coecumban. MITT vándorgyűlés, Harkány, 1999. jan. 27-30. [Abstract: Neurobiology 7: 349-350, 1999] Barthó L, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, PACAP antagonist inhibits nonadrenergic, non-cholinergic (NANC) relaxation in the guinea-pig taenia caeci. Neuropeptides - Ferrara 1999 (9th Annual Meeting of the European Neurpeptide Club, Ferrara, Italy, 12-15 May, 1999. [Abstract: Regul. Pept. 80:146, 1999] Barthó L, Lénárd L Jr, Szigeti R, Benkó R, Báthori Z, Tóth G, Penke B, Nitric oxide, ATP and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) mediate the relaxant response of the guinea-pig taenia caeci. Second European Congress of Pharmacology, July 3-7, 1999, Budapest, Hungary. [Abstract: Fundam. Clin. Pharmacol. 13/Suppl. 1, 1999, 77s] Lázár Z, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, Barthó L, Evidence for the participation of P2 purinoceptors in the excitatory effect of capsaicin in the small intestine. The 6th European Congress of Pharmaceutical Sciences, September 16-19, 2000, Budapest, Hungary. [Abstract: Eur. J. Pharmaceutical Sci. 11/Suppl. 1, 2000, S113] Barthó L, Lázár Z, Lénárd LJr, Benkó R, Tóth G, Penke B, Szolcsányi J, Maggi CA, P2 purinoceptors, but not vasoactive intestinal polypeptide/pituitary adenylate cyclase activating polypeptide or nitric oxide, play a role in the excitatory effect of capsaicin on myenteric neurons. Hung. Physiol. Soc./Br. Physiol. Soc. Meeting, Budapest, 27-29 May, 2000. [Abstract: J. Physiol. Lond. 526 P, 167 P.] Lázár Z, Benkó R, Barthó L, Nem nitrerg, nem VIP-erg gátló válasz légcsőben. Magyar Idegtudományi Társaság (MITT) VIII. Konferenciája, Szeged, 2001. január 2427. Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, A kapszaicin mozgató hatása humán vastagbélen. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Szeged, 2001. június 6-8.
98
Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, Motor effects of capsaicin in the human colon. 7th Meeting of the Austrian Neuroscience Association, Seggau/Leibnitz, Styria, Austria, 2-5 September, 2001. Lázár Z, Shahbazian A, Benkó R, Tóth G, Penke B, Barthó L, Holzer P, PACAP(6-38) inhibits the effects of VIP, but not PACAP, on the small intestinal circular muscle. 7th Meeting of the Austrian Neuroscience Association, Seggau/Leibnitz, Styria, Austria, 2-5 September, 2001. Benkó R, Lázár Z, Pórszász R, Barthó L, Csökkent zsigeri kapszaicin-érzékeny válaszok streptozotocin-diabéteszes patkányban. A Magyar Diabetes Társaság XVI. Kongresszusa, Debrecen, 2002. május 30-június 2.
[Abstract:
Diabetologia Hungarica 10, Suppl. 1, 10. old., 2002] Barthó L, Benkó R, Lázár Z, Illényi L, Horváth ÖP, Kapszaicin-érzékeny idegek lokális efferens hatásai humán colonon. A Magyar Gasztroenterológiai Társaság 44. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2002 június 4-8. (Motilitási Szekció, június 6.) Benkó R, Lázár Z, Undi S, Rumbus Z, Wolf M, Barthó L, A nitrogén-monoxid szerepe a kapszaicin hatásában különböző fajok bél körkörös izomzatán. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Debrecen, 2004. június 7-9. Benkó R, Undi S, Wolf M, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Barthó L, Nitrerg-purinerg interakciók tengerimalac-, patkány- és humán izolált bélen. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) kongresszusa, Budapest, 2005. június 2-4. [Extended abstract: Nitrergic-purinergic interactions in the guinea-pig, rat, and human intestine. Acta Physiol. Hung. 92 (3-4): 244-245.] Barthó L, Benkó R, Undi S, Pethő G, Sensory neurotransmitters and modulators: the basis of analgesic research. 1st BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, Hungary, September 26-28, 2005. Undi S, Benkó R, Wolf M, Magyar K, Barthó L: A guanilát-cikláz gátló ODQ hatása az elektromos téringerléssel kiváltott simaizom-válaszokra és a perisztaltikus reflexre. A Magyar Experimentális Farmakológia Tavaszi Szimpóziuma, Budapest, 2005. június 6-7. [Abstract: Inflammopharmacology 13: (5-6) 572573.] Wolf M., Undi S, Benkó R, Magyar K, Tóvölgyi Z, Barthó L, Egy guanilát-cikláz gátló vegyület hatása az elektromos téringerléssel kiváltott simaizom-válaszokra és a perisztaltikus
reflexre.
A
Magyar
Vándorgyűlése, Szeged, 2006. június 7-9.
Élettani
Társaság
(MÉT)
LXX.
99
Undi S, Wolf M, Benkó R, Illényi L, Cseke L, Kassai M, Vereczkei A, Horváth ÖP, Antal A, Barthó L, Purinerg gátló válasz humán ileumon. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXX. Vándorgyűlése, Szeged, 2006. június 7-9. Undi S, Wolf M, Benkó R, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Antal A, Horváth ÖP, Barthó L, P2 purinoceptor antagonisták gátló hatása human colon NANC relaxációjára in vitro. A Magyar Experimentális Farmakológia Szimpóziuma, Pécs, 2006.június 3. Benkó R, Undi S, Wolf M, Magyar K, Illényi L, Kassai M, Cseke L, Horváth ÖP, Antal A, Barthó L, NO and ATP co-mediate the non-adrenergic, non-cholinergic (NANC) relaxation in the human colon and rat ileum. 15th World Congress of Pharmacology,
IUPHAR,
Peking,
2006.
július
2-7.
[Abstract:
Acta
Pharmacologica Sinica, 2006, Suppl. 1: P 110.] Undi S, Benkó R, Wolf M, Lázár Z, Lénárd L Jr., Maggi CA, Barthó L, Effects of ATP and alpha, beta-methylene ATP (ABMA) and their inhibition by PPADS in the non-stimulated and field-stimulated guinea-pig ileum. 15th World Congress of Pharmacology,
IUPHAR,
Peking,
2006.
Pharmacologica Sinica, 2006, Suppl. 1: P 111.]
július
2-7.
[Abstract:
Acta
100
Köszönetnyilvánítás Őszinte köszönetemet fejezem ki dr. Barthó Loránd egyetemi tanár úrnak, témavezetőmnek, aki bevezetett a tudományos kutatómunka világába és mindvégig magas szintű szakmai tanácsaival irányította PhD munkámat. Köszönettel tartozom munkatársaimnak, dr. Lázár Zsófiának, dr. Undi Saroltának és dr. Wolf Mátyásnak a kísérletes munkában nyújtott baráti segítségükért, ill. volt kollégámnak ifj. dr. Lénárd Lászlónak, aki a kísérletes módszerek elsajátításában segítségemre volt. Köszönettel tartozom előbírálóimnak, dr. Mózsik Gyula egyetemi tanár úrnak és dr. Király Ágnes egyetemi docensnek, hogy hasznos tanácsaikkal segítették az értekezésem végleges formájának kialakítását. Végül, de nem utolsó sorban, köszönöm szüleimnek, hogy mindvégig támogattak tanulmányaim és munkám során.
