BEFELÉ REKTIFIKÁLÓ KLORID ÁRAM VIZSGÁLATA ASZTROCITÁN ÉS GLOMERULÓZA SEJTEN

BEFELÉ REKTIFIKÁLÓ KLORID ÁRAM VIZSGÁLATA ASZTROCITÁN ÉS GLOMERULÓZA SEJTEN Dr. Makara Judit doktori (Ph.D.) értekezése Témavezeto: Dr. Spät András Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Élettani Intézet Budapest 2002.

Molekuláris orvostudományok tudományági Doktori Iskola Celluláris és molekuláris élettan program Semmelweis Egyetem

TARTALOMJEGYZÉK

BEVEZETÉS ÉS IRODALM I HÁTTÉR

5

Az asztrocita kation csatornái

7

Az asztrocita Cl- háztartása

8

Az asztrocita anion csatornái

9

A) Ligandfüggo anion csatornák

9

B) Nem ligandfüggo anion csatornák

10

1) Sejtduzzadás hatására aktivált anion áram

11

2) Depolarizáció-aktivált anion áramok

11

3) Hiperpolarizáció-aktivált anion áram

12

Anion csatornák lehetséges élettani szerepe asztrocitában

13

A) A membránpotenciál szabályozása

13

B) KCl transzport

13

C) pH szabályozás

14

D) Klorid ionok intracelluláris szabályozó szerepe

15

E) Proliferáció és migráció szabályozása

15

F) A sejttérfogat szabályozása

16

Sejttérfogat változás hatásai a mellékvesekérgi glomerulóza sejt áramaira

17

CÉLKITUZÉSEK

19

MÓDSZEREK

20

Kísérleti preparátumok

20

A) Hosszútávú asztrocita sejttenyészet

20

B) Akut agyszelet

21

C) Glomerulóza tenyészet

21

D) Mechanikus agykérgi sérülés (szúrt seb) mutéti technikája

22

2

Elektrofiziológiai mérések

22

A [Ca2+] c fluorimetriás mérése

25

Patch-clamp oldatok

26

A) Asztrocita tenyészet

26

B) Agyszelet

27

C) Glomerulóza tenyészet

27

D) Gátlószerek

27

Fluorimetriához használt oldatok

28

Statisztikai kiértékelés

28

EREDMÉNYEK

29

Befelé rektifikáló áram jellemzése hosszútávú patkány agykérgi asztrocita tenyészeten29 A befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenysége

31

A befelé rektifikáló áram töltéshordozója

33

Az intracelluláris ATP szerepe

33

A befelé rektifikáló áram pHe-érzékenysége

35

A pHe-érzékeny áramkomponens Cl--szelektivitásának vizsgálata

37

Kétféle asztrocita típus kimutatása in situ körülmények között

39

Befelé rektifikáló áram jellemzése komplex asztrocitán in situ

41

A Cl- áram nem detektálható ClC-2 "knock -out" egérben

44

A Cl- áram expressziója csökken reaktív asztrocitában

45

Cl- és Ca2+ csatornák vizsgálata patkány glomerulóza sejten

48

Ozmolaritás hatása a K+ által kiváltott [Ca2+] c jelre glomerulóza sejten

54

3

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

58

Befelé rektifikáló anion áram kimutatása tenyésztett és in situ vizsgált asztrocitán

58

A befelé rektifikáló Cl- áramot létrehozó csatorna azonosítása

60

A ClC-2 áram asztrocitában játszott lehetséges szerepe

62

A) A ClC-2 áram expressziója asztrocitában változik fejlodés és reaktív transzformáció során

62

B) A ClC-2 áram szerepe a membránpotenciál alakításában

63

C) A ClC-2 áram pHe érzékenysége

64

D) A ClC-2 csatornát befolyásoló egyéb tényezok esetleges szerepe

65

A glomerulóza sejt nyugalmi anion permeabilitása

67

Sejttérfogat változások hatása a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca2+ csatornáira

68

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

72

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

73

IRODALOMJEGYZÉK

74

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

87

ÖSSZEFOGLALÁS

88

SUMMARY

89

4

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR

A glia sejtek fo típusai a központi idegrendszerben (KIR) az asztrocita, az oligodendrocita és a mikroglia. A mikroglia elsosorban az agy védekezo funkciójában játszik szerepet, az oligodendrocita pedig a KIR-ben a fo mielinképzo elemet képviseli. Az asztrocita jellemzoen csillag alakú sejt, morfológiája azonban változó lehet. Az ún. fibrózus asztrocita elsosorban a fehérállományban fordul elo, hosszú, vékony, minden irányba kiterjedo nyúlványokkal rendelkezik. A protoplazmás asztrocita elsosorban a szürkeállományban

található

meg,

és

rövidebb,

elágazó

nyúlványai

vannak.

Morfológiája mellett az asztrocitára jellenzo bizonyos intermedier filamentumok, pl. a gliális fibrilláris savas protein (GFAP) és az S100 fehérje expressziója. A sejt nyúlványai gyakran végtalpakban végzodnek, amelyek részben neuronok (elsosorban szinapszisok illetve axonok), részben pedig kapillárisok vagy az agykamrák falának közelében helyezkednek el. Az asztrociták réskapcsolatok (gap junction) segítségével kiterjedt szincíciumot alkotnak. A hálózat dinamikusan változó lehet azáltal, hogy a réskapcsolatok nyitási állapota is szabályozott. Az asztrocita nem csak egyszeru térkitölto elem, funkciói igen sokrétuek. Egyik fo feladata, hogy biztosítja az idegsejtek környezetének, az agyi interstíciumnak a homeosztázisát. Rendkívül fontos ezen belül is az idegi aktivitás kapcsán az extracelluláris térbe kerülo K+ pufferelése, mivel a [K +]e alapvetoen befolyásolja a neuronok ingerlékenységét, a K+-on kívül azonban más ionok, így pl. a Ca2+ és H+ koncentrációjának szabályozása is lényeges. Az asztrocita szinaptikus rés körül elhelyezkedo

nyúlványai

neurotranszmitterek

izolálják

eltávolításában,

a

szinapszist,

meghatározva

és a

részt

vesznek

szinaptikus

egyes

résben

a

neurotranszmitter koncentráció alakulását és ezáltal a jelátvitel erosségét és idotartamát. A kapilláris felé nézo végtalpak a vér-agy gát alkotásában és funkcióiban vesznek részt. Az asztrocita ezenkívül szerepet játszik az idegsejtek tápanyagellátásában. A fejlodo agyban az asztroglia segíti az idegsejtek vándorlását és szinaptikus kapcsolatok kialakítását, kifejlett agyszövetben ugyanakkor az idegi sérülések kapcsán aktiválódva gliaheget hoz létre, amely betölti a keletkezett szövethiányt, megakadályozza azonban az idegnyulványok regenerálódását.

5

Az eddig említett klasszikus funkciókon kívül, az utóbbi évek izgalmas új eredményei szerint lehetséges, hogy az asztrociták a neuronokkal együttmuködve maguk is aktívan részt vehetnek magasabb idegi muködésekben (2). Az asztrocita számos neurotranszmitter-receptorral rendelkezik, melyek révén reagálni képes a szinapszisban lejátszódó eseményekre. A szinapszis aktiválódása során a környezo asztrocitákban a citoplazma [Ca2+]c megemelkedik, és a Ca2+ jel hullámszeruen tovaterjedhet a sejthálózatban. Mivel a [Ca2+]c jel hatására az asztrocita maga is képes neurotranszmitterek kibocsátására, szoros kommunikáció alakulhat ki az asztrocita és az idegsejt között (2). Ennek a kapcsolatnak a jelentosége ma élénk kutatások tárgya. A glia sejtek elektrofiziológiai tulajdonságairól az elso ismeretek az 1960-as és 70-es évekbol származnak. Kuffler és munkatársai gerinctelen fajok központi idegrendszerében (82, 83), valamint Ransom és mtsai macska agykéregben (113) mikroelektródával végzett kísérletei azt mutatták, hogy a glia sejtek in vivo kizárólag K+-szelektív,

lineáris

konduktanciával

rendelkeznek,

és

nem

expresszálnak

feszültségfüggo áramokat. Ez beleillett a glia sejtekrol mint passzív, nem ingerelheto, támasztó sejtekrol kialakított képbe. Az 1980-as, 90-es években a sejtspecifikus glia tenyészetek és a patch-clamp technika kidolgozása és elterjedése azonban ezt a koncepciót robbanásszeruen megváltoztatta. A nagy érzékenységu patch-clamp módszer segítségével nyilvánvalóvá vált, hogy a tenyésztett glia sejtek (különösen az asztrocita) a neuronokhoz hasonló változatosságú ioncsatorna- és receptor készlettel rendelkeznek. Ezzel megindult a glia sejtek "újrafelfedezése", szerepük feltérképezése és átértelmezése pedig az idegkutatás egyik izgalmas új területévé vált. Ma már ismert, hogy az asztrocita számos neurotranszmitter-receptorral és ioncsatornával rendelkezik, amelyek révén reagálhat a szinapszisokban, tágabb értelemben az idegsejtekben lezajló eseményekre (130, 149, 150). Az asztrocita feszültség- és ligandfüggo (receptor) ioncsatornáiról szerzett ismereteink nagy része fejlodo (embrionális vagy újszülött) agyból nyert, hosszú távon (legalább 2 hétig) tenyésztett sejtekbol származik. A sejttenyészetnek a szelettel szemben elonyei, de hátrányai is vannak. Elonye, hogy homogén sejtpopuláción dolgozhatunk, a sejtek közti kapcsolatok nem befolyásolják az egyedi sejteken végzett méréseket,

az

extracelluláris

folyadéktér

gyakorlatilag

végtelen,

gyorsan

és

tetszolegesen változtatha tó és a sejtek a mérés számára könnyen hozzáférhetoek.

6

Ugyanakkor hátránya, hogy a sejtek enzimatikus vagy mechanikus izolálása és a tenyésztés körülményeinek hatására a sejtek csatornakészlete és génexpressziója jelentosen megváltozhat. A bonyolultabb geometriájú sejtek nyúlványai az izolálás során szintén sérülhetnek. Ezen kívül a kétdimenziós tenyészetben a letapadt sejtek egymással való kapcsolatai illetve alakváltozási lehetoségei is lényegesen eltérnek a háromdimenziós in vivo vagy in situ körülményektol. Hosszabb tenyésztés során szintén megszunik a sejtekre in vivo esetleg jellemzo polarizált vagy inhomogén fehérje eloszlás. Tehát, különösen az olyan hosszú távú sejttenyészetek esetén, mint az asztrocita tenyészet is, a sejttenyészetben kapott eredmények inkább irányadónak tekinthetoek, de mindenképpen in situ megerosítést igényelnek valódi élettani relevanciájuk megítéléséhez. Ezért az asztrociták vizsgálatában az utóbbi években elotérbe kerültek az akut agyszelet preparátumok, amelyekben a sejtek hosszú tenyésztés nélkül, in situ vizsgálhatók. Az in situ végzett kísérletek sok (de nem minden) esetben megerosítették a tenyészetben nyert eredményeket, igazolva, hogy azok nem mutermék eredményei voltak. Mivel ezekben a preparátumokban a sejtek eredeti kapcsolatrendszere többé-kevésbé megtartott marad, lehetové teszik annak megismerését, hogy a neuronokkal, más glia sejtekkel vagy kapillárisokkal együttmuködve milyen integrált szerepet játszik az asztrocita az idegszövet muködésében.

Az asztrocita kation csatornái Az asztrocita csatornarepertoárjának feltérképezése és az egyes csatornák meghatározott funkcióhoz rendelése eddig a kation csatornák területén volt sikeresebb (150). Különösen a K+ csatornák kutatása volt intenzív, részben, mivel az in vivo is kimutatott nagy K+ konduktancia felelos az asztrocitára klasszikusan jellemzonek tartott erosen negatív membránpotenciáljának kialakításában, részben, pedig, mert e csatornák fontos szerepet játszhatnak a K+ ionok csatorna-mediált felvételében és leadásában. A feszültségfüggo Na+ és Ca2+ áramok kimutatása különbözo asztrocita preparátumokon szintén nagy érdeklodést váltott ki, mivel ezek a csatornák fontos szerepet játszanak az ingerlékeny sejtek akciós potenciál-képzésében és a sejtek Na+- és Ca2+ háztartásában.

7

Úgy tunik, hogy ezen csatornák expressziója erosen függ a környezet hatásaitól, elsosorban a neuronális muködéstol (150). Bár több hipotézis létezik funkcióikra vonatkozóan, végso helyüket az asztrocita élettani és patológiás muködésében még nem sikerült megfeleloen tisztázni.

Az asztrocita Cl- háztartása A klorid csatornák szerepének megértéséhez elengedhetetlen annak ismerete, hogy milyen a Cl- megoszlás a sejt és a külso tér között, hiszen ez meghatározza az ion egyensúlyi potenciálját és ezáltal az elektrokémiai hajtóero nagyságát és irányát egy adott membránpotenciálon. A Cl- ionok megoszlása lehet passzív, vagy pedig a sejtek aktívan halmozzák vagy eltávolítják azokat. Az asztrocita intracelluláris Clkoncentrációjáról meglehetosen kevés konkrét adat áll rendelkezésre, ezek azonban többnyire azt mutatják, hogy az asztrocita citoplazma [Cl-]i-ja magasabb, mint a passzív megoszlásból számított érték (71, 155, 159). Ez arra utal, hogy ebben a sejtben nyugalomban is muködnek aktív Cl- halmozó mechanizmusok. Ilyen mechanizmus lehet a Na+/K +/2Cl- szimporter és a Cl-/HCO3 - antiporter (71, 74, 76). Asztrocita sejttenyészeten körülbelül 30 és 50 mM közötti citoplazma [Cl-]i értéket állapítottak meg radioaktív

36

Cl meghatározással, Cl- szelektív mikroelektródával, Cl- érzékeny

fluoreszcens festékkel, valamint patch-clamp módszerrel (8, 13, 70, 72, 74, 155). In situ agykéregben

36

Cl-dal az asztroglia [Cl-]i-t 36-46 mM-nak becsülték (128). Ezekkel

ellentétben, tengerimalac szaglókéregben mikroelektródás módszerrel ennél jóval alacsonyabb (a passzív megoszlásnak megfelelo, 6 mM-os) glia [Cl-]i-t mértek (5), azonban ebben a vizsgálatban a glia sejteket nem azonosították, így nem kizárt, hogy esetleg oligodendrocitából származtak az adatok. A magas [Cl-]i következményeként a Cl- egyensúlyi potenciálja elméletileg az asztrocita membránpotenciáljánál pozitívabb érték lehet, ami azt jelenti, hogy a nyugalmi potenciálon egy Cl- csatorna nyitása Cl- kiáramlást okozna. Ezzel összhangban állnak azok a neuronmentessé tett patkány agyszeletben, GFAP-pozitív asztrocitán végzett in situ patch-clamp mérések, amelyekben a GABAA receptor-aktivált Cl- áram depolarizáló hatású volt (89), illetve ahol Cl- csatorna gátlószer adására

8

hiperpolarizáció következett be (156). Frissen izolált (47) és hosszútávú asztrocita tenyészeten (69) szintén kimutatható volt a GABAA receptorok aktivációjának depolarizáló hatása.

Az asztrocita anion csatornái

A) Ligandfüggo anion csatornák A neuronon leírt GABAA és glicin csatornákhoz hasonló tulajdonságokkal rendelkezo neurotranszmitter által aktivált anion áramok számos preparátumon kimutathatóak voltak asztrocitán, jelenlétük széles körben elfogadott (összefoglalva lásd 150). Mint az elozo fejezetben leírtam, a GABAA adásakor asztrocitán depolarizáció következik be. A depolarizáció hatására feszültségfüggo Ca2+ csatornákon keresztül történo Ca2+ beáramlást és [Ca2+]c emelkedést figyeltek meg felnott patkányagyból akutan izolált hippocampális asztrocitán (47) és fiatal egéragyból nyert corpus callosum szeletekben vizsgált asztrocitán (11). A GABAA csatorna aktiválása ezenkívül több preparátumon K+ csatornák gátlását váltotta ki (150). A neurotranszmitter-aktivált anion csatornák funkcionális jelentosége még nem kelloen tisztázott, feltételezések szerint szerepük lehet az extracelluláris [Cl-]e, a pHi, esetleg az asztrocita proliferációjának és differenciálódásának szabályozásában. Szintén a ligandfüggo anion csatorna áramok körébe sorolhatók a glutamát transzporterekhez kapcsolt anion áramok is. A glutamát szinaptikus résbol történo eltávolításáért felelos transzporterek összetett muködésuek: transzporterek és anion csatornák egyben (127, 140). A fehérje mint transzporter jól meghatározható sztöchiometriával muködik, ugyanakkor glutamát adásakor egy, a transzport ciklushoz nem kapcsolható Cl- áram is aktiválódik, melynek tulajdonságai egyértelmuen csatorna muködésre utalnak. A glia sejtekre jellemzo glutamát transzporterek (EAAT1 és 2) esetében az anion áram kisebb, mint a többi transzporternél (127, 140). A ligand függo anion csatornákkal értekezésemben bovebben nem foglalkozom.

9

B) Nem ligandfüggo anion csatornák A korai, ionszelektív mikroelektródával vagy

36

Cl izotóppal végzett vizsgálatok

eredménye ellentmondásos volt a nyugvó asztrocita Cl- permeabilitása tekintetében. Az asztrocita élettani muködésének vizsgálatában úttöro szerepet játszó Kuffler és munkatársai által piócán és kétéltueken in vivo végzett vizsgálatok szerint az asztrocita membránpotenciálja igen pontosan, a Nernst egyenlet által megjósolt módon követi az extracelluláris [K +] változásait, nem függ azonban a [Cl-]e változásaitól (82). Ezt az eredményt más szerzok is megerosítették egéragyból származó tenyésztett asztrocitán (153). Ez arra utalt, hogy e sejt nyugalmi Cl- permeabilitása elhanyagolható a K+-éhoz képest. Ez a viselkedés nem volt azonban érvényes minden preparátumra és minden asztrocitára. Kimelberg és mtsai (73) szerint tenyésztett patkány agykérgi asztrociták mintegy 10 %-án a külso Cl- helyettesítése nem-permeábilis anionra kb. 10 mV-os depolarizációt okozott, miközben a sejtek nagy részének membránpotencálja nem változott. Hasonló, néhány sejten megfigyelt depolarizáló hatást észlelt a külso Clelvonásakor tenyésztett pióca asztrocitán Walz és Schlue (152) is. Mindez arra utal, hogy az asztrociták a Cl- csatorna suruség szempontjából heterogének, és bizonyos sejtekben a Cl- permeabilitás nem elhanyagolható. Ezen túlmenoen ugyanakkor mindazok a mérések, amelyek a passzív megoszlásból adódónál jóval magasabb citoplazma [Cl-]i-t mutattak ki asztrocitában, közvetve arra utaltak, hogy a nyugalmi Clkonduktancia (bár nem elhanyagolható) valószínuleg nem lehet túlságosan nagy, hiszen ha az lenne, akkor rajta keresztül a felhalmozott Cl- gyorsan el tudná hagyni a sejtet. Az asztrocitában potenciálisan expresszált Cl- áramok megismerése azonban csak a patch-clamp korszak beköszöntével indult meg (159). A patch-clamp módszerrel eddig jellemzett feszültségfüggo anion csatornákat patkányból vagy egérbol származó hosszútávú asztrocita tenyészeten írták le, így mostanáig nem voltak megbízható ismereteink az in vivo expresszált anion áramokról. Szintén nem vizsgálták még e csatornákat regionális heterogenitás vagy az agy fejlodésével bekövetkezo változások szempontjából.

10

1) Sejtduzzadás hatására aktivált anion áram Ismert, hogy hipozmózissal eloidézett sejtduzzadás hatására az asztrocitából ozmolitként szolgáló nagyméretu anionok passzív kiáramlása következik be, ami feltehetoleg a sejttérfogat normalizálását szolgálja (106, 107). Az anion leadás (legalábbis részben) feltehetoleg egy számos emlos sejtféleségen leírt, térfogat-érzékeny kifelé rektifikáló anion csatornán keresztül jön létre (VSOAC; volume sensitive organic osmolyte and anion channel), melynek permeabilitása anionokra széles köru (96, 119, 138). (Rektifikációról a csatornamuködés szempontjából akkor beszélhetünk, ha azonos töltéshordozó-koncentrációjú extra- és intracelluláris oldatokban mérve egy csatorna feszültség-áram összefüggése a lineáristól eltér, tehát a csatorna egyik irányba jobban vezet, egyenirányít.) Ezt alátámasztották azok a kísérletek, melyekben különbözo, sejtalak-változással járó manipulációk mint pl. a sejtek lekerekítése tripszinnel vagy szérummentes Ringer oldattal, továbbá hipozmózissal eloidézett duzzasztás enyhén kifelé rektifikáló Cl- áram aktivációját okozta, amely áram gátolható volt Cl- csatorna gátlószerekkel (31, 86). Az aktin polimerizációjára ható anyagok (citokalazinok, falloidin, intracelluláris ATP emelése) befolyásolták a Cl- áramot, ami szintén a citoszkeleton szabályozó szerepét bizonyította (86). A kifelé rektifikáló csatornát egycsatornás felállásban mérve kimutatták az intracelluláris oldalon adott aktin közvetlen szabályozó hatását is (87). Egy másik munkacsoport kísérleteiben a csatorna aktivitását tirozin- és MAP kinázok szabályozták (31). Ezek a jelátviteli utak aktiválódhatnak duzzadás hatására (100).

2) Depolarizáció-aktivált anion áramok Teljes-sejt patch-clamp módszer segítségével az elso, feszültségfüggo anion csatornát a 80-as évek közepén figyelték meg asztrocitán (12, 53). A csatorna –40 mVnál pozitívabb membránpotenciáloknál aktiválódott, és erosen kifelé rektifikáló áramot hozott létre, mely nagyobb anionokra, mint glutamát vagy aszkorbinsav, nem volt átjárható. Az áram a teljes-sejt felállás létrehozása után néhány perc alatt, lassan fejlodött ki, amit arra utalt, hogy vagy valamilyen intracelluláris faktor lassú kimosódása, vagy a citoszkeleton átrendezodése, sejtalakváltozás felelos a csatorna szabályozásáért. Késobbi vizsgálatok szintén felhívták a figyelmet arra, hogy a

11

citoszkeleton szabályozhatja az asztrocita anion csatornáit. Letapadt, lapos asztrocitán anion konduktanciát általában nem mutattak ki (6, 63), ugyanakkor kiszakított membrándarabban megfigyelheto volt kis (5 pS) és nagy vezetoképességu (több száz pS) feszültségfüggo Cl- csatornák aktivitása (63, 103, 129). Utóbbi, nagy vezetoképességu csatornák élettani jelentosége vitatott. Ezen csatornák nyitási valószínusége 0 mV körül a legnagyobb. Gyengén szelektálnak különbözo anionok között, de kis mértékben Na+-ra is átjárhatóak, valójában tehát nem-szelektív pórusoknak tekinthetok. Tulajdonságai alapján feltételezik, hogy a mitokondrium külso membránjában megtalálható feszültségfüggo anion csatorna plazmamembránban elhelyezkedo rokonai (36, 159). Az egycsatornás méréssel kimutatott többi csatorna közül csak néhányat sikerült a teljes-sejt módszerrel vizsgált áramokkal azonosítani, így pl. egy negatív feszültségeken aktív, kis vezetoképességu csatorna feltehetoleg a hiperpolarizáció-aktivált anion áramnak felel meg (lásd B/3. pontban és a Megbeszélés fejezetben).

3) Hiperpolarizáció-aktivált anion áram A fenti anion csatornákon kívül leírtak asztrocitán egy hiperpolarizáció-aktivált, befelé rektifikáló (befelé egyenirányító) Cl- áramot is, amely azonban csak akkor vált jelentos amplitúdójúvá, ha a sejteket több héten keresztül kezelték egy membránpermeábilis

cAMP

analóggal,

a

dibutiril-cAMP-vel

(dBcAMP).

Az

áram

elektrofiziológiai tulajdonságait tekintve a ClC -2 elnevezésu 1992-ben klónozott, hiperpolarizáció-aktivált

Cl-

csatornán

keresztül

folyó

áramhoz

hasonló

tulajdonságokkal rendelkezett (142). A Xenopus oocitában expresszált ClC -2 áramról ismert, hogy hipozmózissal eloidézett sejtduzzadás, valamint acidózis aktiválja (54, 67). Kísérleteink kezdetén az asztrocita hiperpolarizáció-aktivált áramát szabályozó tényezok még nem voltak ismertek.

12

Anion csatornák lehetséges élettani szerepe asztrocitában

A) A membránpotenciál szabályozása A klasszikus szemlélet, amelyet Kuffler korai in vivo mikroelektródás kísérleteinek eredményei alapoztak meg, az asztrocita egyik fo jellegzetességének tekintette

az

erosen

negatív

(? 70

mV

vagy

annál

negatívabb)

nyugalmi

membránpotenciált. E felfogás olyannyira uralkodóvá vált, hogy az asztrocita azonosításának egyik általános kritériumának tekintették az ehhez közeli nyugalmi potenciál értéket, és a pozitívabb membránpotenciállal rendelkezo sejteket (a sejt sérülését vagy tökéletlen mérési körülményeket feltételezve) kizárták az értékelésbol. A patch-clamp módszer és a sejtek immunológiai azonosítása azonban ennél összetettebb kép feltárásához vezetett. Kimutatták, hogy mind a tenyésztett, mind az agyszeletben vizsgált asztrociták membránpotenciálja heterogén: a sejtek egy csoportja valóban –60 mV-nál negatívabb membránpotenciált mutat, azonban jelentos számban találhatók ennél pozitívabb (átlagosan körülbelül ? 45 mV-os) értékkel rendelkezo sejtek is (95, 164). Egyelore ellentmondóak az irodalmi adatok arra nézve, hogy ez két elkülönítheto asztrocita populációnak felel-e meg. A pozitívabb membránpotenciál kialakításában résztvevo tényezok között Na+ és esetleg Ca2+ áramok mellett szerepe lehet a Cláramoknak is. Mivel a korábban írtak értelmében az asztrocitában a Cl- egyensúlyi potenciálja a membránpotenciálnál pozitívabb érték, egy Cl- csatorna esetleges aktivációja a sejt depolarizációjának irányába hatna. A Cl- csatornák szerepe a nyugalmi potenciál kialakításában még nem tisztázott.

B) KCl transzport Az asztrocita fo feladatainak egyike a K+ felvétele a neuronaktivitás helyén, majd ezen ionok leadása a nyugalomban lévo területek vagy kapillárisok felé (98, 157). A K+ felvétel mechanizmusai között transzporterrel történo, valamint csatorna- mediált felvétel egyaránt szerepet játszik. A transzporterek közül a legtöbb bizonyíték a Na+/K +ATPáz és a Na+/K +2Cl- szimporter részvételére van (27, 157). A csatorna- mediált

13

felvétel elofeltétele, hogy az asztrociták réskapcsolatok segítségével kiterjedt szincíciumot alkotnak (111). A neuronaktivitás helyé n a magas extracelluláris [K +] miatt a K+ egyensúlyi potenciálja (EK ) pozitív irányba tolódik, ami az ott elhelyezkedo asztrocitákat depolarizálja. A szincícium azonban lehetové teszi, hogy az aktivitás helyétol távolabb eso, nyugalomban lévo sejtek saját membránpotenciáljukat mintegy "rákényszerítsék" az aktivitás helyén lévo sejtekre. Ezáltal az utóbbi sejtek membránpotenciálja a EK-nál negatívabb értéket vesz fel, így a K+ csatornákon keresztül K+ beáramlás következhet be. A K+ a távolabbi, nyugalomban lévo agyterületeken szintén elektrokémiai grádiensének megfeleloen távozik a szincíciumból. A csatorna- mediált K+ mozgásban kulcsszerepet játszanak a befelé rektifikáló K+ csatornák (K ir; 33, 98, 157). Az irodalomban feltételezik, hogy a K+ transzportjával egyidejuleg Cl- csatornákon keresztül történo Cl- felvétel- és leadás is történhet (45, 157). A Cl- áramot létrehozó csatorná(ka)t még nem azonosították, de valószínuleg olyan csatornáról lehet szó, amely a nyugalmi potenciál környékén, illetve enyhe depolarizáció esetén vezetoképes. Mivel kismértéku [K +]e emelkedés feltehetoleg még nem vált ki jelentos duzzadást vagy depolarizációt az asztrocitában, kis ingerek esetén a térfogat- vagy depolarizáció-aktivált Cl- csatornák valószínuleg nem vesznek részt a folyamatban.

C) pH szabályozás Az idegi aktivitás fokozódása több más ion mellett az agyi interstícium H+ koncentrációját is befolyásolja. Az extracelluláris pH (pHe) nyugalmi értékét különbözo agyterületeken mikroelektródás meghatározással 7,2-7,4 közöttinek találták (19, 112). Az idegi stimuláció hatására bekövetkezo pHe változások azonban meglepo módon az egyes agyterületeken eltéro jellegueknek bizonyultak (20, 34). Bizonyos agyi régiókban tisztán savas vagy lúgos irányú eltolódást kaptak, ugyanakkor pl. patkány hippocampusban (154) vagy rája kisagyban (115) komplex pHe jeleket figyeltek meg, melyek 0,1-0,3 pH egység nagyságú savas és lúgos irányú komponensekbol tevodtek össze. Kóros állapotokban, mint pl. az ún. terjedo gátlás ("spreading depression") vagy hipoxia, akár 1 pH egységnyi savanyodás is kialakulhat (19). Gyors pHe jelek létrehozásában elsosorban az ionotróp és metabotróp neurotranszmitter receptorok

14

aktiválódása játszhat szerepet, de a neuronok és glia sejtek megváltozott metabolikus aktivitása szintén befolyásolhatja (ha lassabban is) a pHe-t (19, 20, 34). A sav-bázis háztartás változásának hatására mindkét sejttípusban beindulnak pH szabályozási mechanizmusok is, amelyek hozzájárulhatnak a pHe szignálok alakulásához. Számos megfigyelés bizonyítja, hogy az asztrocita szerepet játszik a pHe szabályozásában (64, 80, 85, 118). Az asztrocita rendelkezik szénsav-anhidráz enzimmel, valamint különbözo, pH szabályozással összefüggo transzporterekkel, mint a Na+/HCO3 - szimporter, a Na+/H+ antiporter vagy a Cl- /HCO3 - antiporter (18, 34). A transzporterek aktivitása függ a transzportált ionok koncentrációjától, ezért az anion csatornák, melyek a Cl- (és esetleg HCO3 -) intracelluláris homeosztázisát közvetlenül befolyásolják, kihatással lehetnek a sejt pH szabályozására is. Kísérleteink kezdetén nagyon kevés információval rendelkeztünk arról, hogy a neuronaktivitással járó fiziológiás pHe-változások hogyan befolyásolják az asztrocita anion csatornáinak muködését.

D) Klorid ionok intracelluláris szabályozó szerepe

A Cl- intracelluláris koncentrációja és annak változása a sejt pH háztartásán és a Cl--ot szállító kerrierek aktivitásán kívül befolyásolhat egyéb sejtfunkciókat is (7). Közelmúltban végzett vizsgálatok arra utalnak, hogy például az asztrocitán leírt, gyorsan aktiválódó és inaktiválódó K+ áram kinetikája nagyban függ az intracelluláris Cl- koncentrációtól (8). A szerzok szerint ezzel a mechanizmussal magyarázható az a korábbi, többek által megerosített megfigyelés, miszerint asztrocitán a GABAA receptor aktiválása a sejt K+ áramainak gátlásához vezet (lásd 150). Nem kizárt, hogy a [Cl-]i változásai hasonló mechanizmussal más transzportfolyamatokat is szabályozhatnak.

E) Proliferáció és migráció szabályozása

Mint azt a korábbiakban említettem, a nyugvó asztrocita Cl- permeábilitása viszonylag kicsi a K+ permeábilitáshoz képest. Ezzel szemben irodalmi adatok szerint a tumoros átalakuláson átment (emberi gliómákból és asztrocitómákból izo lált) asztrocita

15

Cl- permeábilitása igen jelentos: megközelíti vagy akár meghaladja a K+ permeábilitást. A tumoros sejt egy chlorotoxin-érzékeny, kifelé rektifikáló Cl- áramot expresszál, (114, 143, 145), melynek farmakológiai gátlásával a proliferáció, illetve migráció mérsékelheto volt (114, 143). A klorid áram aktivitása a sejtciklus fázisaival összefüggésben változott, a szerzok feltételezése szerint a citoszkeleton átrendezodése következtében (144). Az áram aktivációja megfigyelheto volt a sejtek spontán alakváltozása során is (114). Tulajdonságai alapján ez az áram hasonló a tenyésztett asztrocitán megfigyelt, sejtduzzadás által aktivált kifelé rektifikáló Cl- áramhoz. Ennek megfeleloen a tumoros sejtben történo aktivációját magyarázhatja a sejtosztódás során megnövekedo sejttérfogat. Egy hipotézis szerint a csatornán keresztül létrejövo anion kiáramlás a sejttérfogat csökkenését segíti elo, a kisebb sejtméret pedig elonyös lehet az invazív migráció szempontjából (114). A duzzadás-aktivált anion csatorna szerepét a proliferáció szabályozásában több más sejttípuson is kimutatták (100).

F) A sejttérfogat szabályozása

A neuronok aktivitásának fokozódásakor már élettani körülmények között is bekövetkezhet az asztrocita duzzadása a KCl akkumuláció és a neurotranszmitter felvétel következtében, ezen kívül e sejtek térfogat-növekedése kimutatható agyi trauma vagy hipoxia kapcsán is (78). A zárt koponyaurben a sejttérfogat szabályozása kritikus fontosságú lehet. In vitro körülmények között kimutatták, hogy hipozmotikus duzzadást követoen az asztrocita ozmotikusan aktív molekulákat (és következésképp vizet) ad le, és ezen regulatórikus térfogatcsökkenés ("regulatory volume decrease", RVD) során térfogatát a normál érték közelébe tudja visszaállítani (41, 75, 106). A folyamatban fontos szerepet játszhatnak a fentebb leírt, duzzadásra aktiválódó, Cl- mellett esetleg nagyobb aminosavak és származékaik (taurin, glutamát, aszpartát) sejtbol történo kiáramlását is lehetové tevo anion csatornák (151). A RVD Cl- csatorna gátlószerekkel lassítható volt tenyésztett asztrocitában (120). Az anion csatornán keresztül bekövetkezo aminosav-kiáramlás nem csak az asztrocita térfogatszabályozása szempontjából lehet fontos, hanem aminosav neurotranszmitterek kibocsátási útjaként is szolgálhat (77). Ez utóbbi mechanizmus sejtduzzadással járó patológiás helyzetekben hozzájárulhat a glutamát excitotoxicitáshoz (77), de pl. a hipotalamusz ozmoszenzitív magjaiban

16

esetleges élettani szabályozó szerepére is komoly bizonyítékok vannak, ahol az asztrocita által a hipozmotikus duzzadást követo RVD során leadott taurin módosítja a vazopresszin-termelo idegsejtek muködését (62).

Sejttérfogat változás hatásai a mellékvesekérgi glomerulóza sejt áramaira

Az elobbiekben említett regulatórikus térfogatcsökkento mechanizmust, illetve az abban feltehetoleg részt vevo, térfogatváltozás által aktivált Cl- áramokat asztrocitán kívül számos más sejtféleségen kimutatták (60, 138). Speciális azonban azoknak a sejteknek az esete, melyek ozmoszenzitív funkcióval rendelkeznek. Ilyen sejtek esetében a RVD nem lenne feltétlenül elonyös, hiszen a szabályozás által csökkenne a muködésüket szabályozó inger erossége. Valóban van adat arra, hogy pl. a hipotalamusz vazopresszin-termelo ozmoszenzitív neuronjai nem szabályozzák aktívan térfogatukat (52). Ugyanakkor nagyon keveset tudunk arról is, hogy ozmoszenzitív sejtekben a sejttérfogat változásai milyen módon hoznak létre választ a sejt muködésében. A mellékvesekéreg glomerulóza sejtje által termelt aldoszteron szintén a só-víz háztartás egyik meghatározó hormonja, mégis, eddig csak egy munkacsoport vizsgálta a sejttérfogat változásainak hatását az izolá lt glomerulóza sejt muködésére. Schneider és mtsai szerint a hipozmózissal történo duzzasztás glomerulóza sejten nem vált ki RVD-t (57), ugyanakkor növeli a citoplazma Ca2+ koncentrációját ([Ca2+]c) és fokozza az aldoszteron termelését (160). Azt is kimutatták, hogy a glomerulóza sejt fiziológiás ingere, a [K +]e emelkedése szintén sejtduzzadást vált ki, amelyet nem követ regulatórikus térfogatcsökkenés (57). Schneider és mtsai kísérleteiben mind az ozmotikus duzzasztás, mind a K+ emelés által kiváltott aldoszteron termelés függött az extracelluláris Cl- koncentrációtól: kisebb hatást kaptak Cl--mentes külso oldatban (58, 161), ami arra utalt, hogy a glomerulóza sejt Cl- háztartása szerepet játszhat a jelközvetítésben. Más szteroid termelo sejteken - mint pl patkány Leydig-sejt és szarvasmarha mellékvesekérgi faszcikuláta-retikulárisz (kortizol- termelo) sejtek esetében - szintén feltételezik, hogy Cl- csatornák szerepet játszanak az inger okozta hormonválasz kialakításában (30, 38). A glomerulóza sejt Cl- csatornáiról nagyon keveset tudunk. Quinn és mtsai (109)

17

mérései szerint a külso Cl- koncentráció nem befolyásolta a sejtek nyugalmi potenciálját, ami arra utalt, hogy a glomerulóza sejt Cl- permeábilitása nem jelentos. Mások patch-clamp módszerrel kimutattak egy ACTH által aktivált, kifelé rektifikáló anion csatornát (25), azonban a nyugvó sejt Cl- csatornáit patch-clamp módszerrel tudomásunk szerint még senki nem vizsgálta. Kísérleteink kezdetén nem állt rendelkezésre irodalmi adat arról sem, hogy az ozmolaritás-változások milyen hatást fejtenek ki a sejt jelátviteli mechanizmusaiban részt vevo ioncsatornákra, így pl. a K+ hatását közvetíto feszültségfüggo Ca2+ csatornákra. A patkány glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca2+ áramainak két típusát mutatták ki: az alacsony küszöbu, gyorsan aktiválódó és inaktiválódó T típusú áramot (39, 91, 148) és a magas küszöbu, lassan aktiválódó és inaktiválódó L típusú áramot (39, 88, 148). A két áramtípus küszöbét munkacsoportunk ? ? 70 mV-os (T áram), illetve ? ? 57 mV-os (L áram) értékunek mérte (Várnai et al., 1998). Az L típusú áram küszöbe tehát jelentosen alacsonyabb a glomerulóza sejten, mint a más sejteken általánosan meghatározott küszöbérték (-20 mV; 59). Az irodalomban elfogadott nézet szerint a fiziológiás ingert jelento, néhány mM-os [K +]e emelkedés hatását elsosorban a T csatornán keresztül létrejövo Ca2+ beáramlás közvetíti (28, 88), bár ez az elmélet nem magyarázza meg kielégítoen azt, hogy a [K +]e szubmillimoláris emelése hogyan hoz létre [Ca2+]c jelet (Várnai et al,. 1998). A feszültségfüggo Ca2+ csatornák emellett az angiotenzin II hatásmechanizmusában is szerepet játszhatnak (61, 88). Minden olyan tényezo tehát, amely a T- és L típusú csatornák muködését módosítja, jelentosen befolyásolhatja a fiziológiás agonisták glomerulóza sejtre kifejtett hatását. (A glomerulóza sejt Ca2+ áramok korábbi összefoglalását lásd 132)

18

CÉLKITUZÉSEK

1. Vizsgálni kívántuk, hogy idegsejttel együtt tenyésztett asztrocitán jelen van-e valamely nem ligandfüggo, nyugalmi állapotban feltehetoleg aktív anion konduktancia.

2. Amennyiben ilyen áram kimutatható, jellemezni kívántuk elektrofiziológiai tulajdonságait és gátlószer-érzékenységét, továbbá reakcióját a sejt külso (pHe) vagy belso

környezetének

(ATP)

olyan

változásaira,

melyek

anion

csatornák

részvételével az asztrocita élettani muködését befolyásolhatják.

3. Vizsgálni kívántuk, hogy az in vivo körülményeket jól közelíto agyszelet preparátumon kimutatható-e a sejtkultúrán leírt anion áramok valamelyike nyugvó asztrocitán. Tanulmányozni kívántuk, hogy hogyan változik az anion áramok muködése az asztrocita in vivo reaktív transzformációja során. Tisztázni kívántuk továbbá az asztrocitán in situ kimutatható anion áramo(ka)t létrehozó csatornák molekuláris hátterét.

4. Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy az asztrocitán megfigyelheto anion áramokhoz hasonló konduktancia kimutatható-e nyugalomban a tole jelentosen eltéro tulajdonságokkal rendelkezo mellékvesekérgi glomerulóza sejten.

5. Vizsgálni kívántuk, hogy a sejttérfogat változásai hogyan befolyásolják a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca2+ csatornáinak muködését, és ezen keresztül a glomerulóza sejt fiziológiás ingerekre adott [Ca2+]c válaszát.

19

MÓDSZEREK

Kísérleti preparátumok

A) Hosszútávú asztrocita sejttenyészet A vegyes asztrocita-neuron tenyészet készítéséhez újszülött (1-3 napos) Wistar patkányokat használtunk. Dekapitálás után az agyat a koponyából eltávolítottuk, és elülso pólusát (a prefrontális kéregrészt) szikével apró darabokra vágtuk. A szövetet 5 percig emésztettük Ca2+- és Mg2+-mentes, 7,5 mg/ml tripszint (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) és 1 mg/ml DNázt (Sigma, www.sigmaaldrich.com) tartalmazó módosított Hank's oldatban (pH 7,4), majd 1,25 mg/ml DNáz tartalmú, 0,3 % szarvasmarha szérum albuminnal (BSA; Serva, Heidelberg, Németország) kiegészített módosított Hank's oldatban (Sigma) történo pipettázással tovább zúztuk. Az izolálás alatt minden oldat 200 ? M kinurénsavat (Sigma) tartalmazott a neuronok túlélésének elosegítésére. A sejteket centrifugálás (157 g, 2 ? 15 perc) után 25 cm2 alapterületu sejttenyészto edényekbe tapasztottuk le kb. 2 ? 104 /cm2 suruségben, és 10 % fötális borjú savóval (Protein, Biokémiai Gmk, Gödöllo), 100 NE penicillinnel és 100 ? g/ml streptomycinnel kiegészített Dulbecco- féle (DMEM) tenyészto oldatban (GibcoBRL, www.gibcobrl.com),

termosztátban

inkubáltuk

(5%

CO2 , 37

o

C, 100 %-os

páratartalom). A tenyészto oldatot 3 naponta cseréltük. A 2-8 hetes tenyésztés után az addigra összefüggo asztrocita rétegen ülo egyéb sejteket 14-16 órás horizontális rázás útján

eltávolítottuk.

A

megmaradt

asztrocitákat

tripszinnel

felvettük,

majd

üveglemezekre újra letapasztottuk és további 2-4 napig inkubáltuk. A második tenyészetet immuncitokémiai módszerrel ellenorizve a sejtek 85-95 %-a pozitívnak bizonyult az asztrocita-specifikus markerre, a gliális fibrilláris savas fehérjére (GFAP). Mérés elott néhány perccel a tenyészto oldatot egy standard külso oldatra cseréltük, mely (mM-ban) 137 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2 , 0,5 MgCl2 , 10 HEPES, 11 glukóz összetételu volt (pH 7,4). Méréseinkhez különálló, lapos, sokszögu, néha vastag elágazó nyúlványokkal rendelkezo sejteket választottunk. Az eredmények a további morfológiai részletektol függetlenek voltak.

20

B) Akut agyszelet A "knock-out" egereken végzett kísérleteken kívül minden agyszeletben történt mérésünket olyan transzgenikus egértörzsön végeztük, melyben a GFAP gén promotere által szabályozottan a sejtek felerosített zöld fluoreszcens fehérjét (EGFP) termelnek (Tg(GFAP/EGFP); 101). Mivel az asztrociták azonosításához elegendo mennyiségu EGFP-t a heterozigóta állatok is termelnek, mind homo-, mind heterozigóta állatokat felhasználtunk. A ClC -2 "knock-out" egerek Dr. Thomas Jentsch laboratóriumából származtak (17). Valamennyi "knock-out" állat homozigóta (-/-) volt. Az agyszeleteket felnott (4 hetesnél idosebb) egerekbol nyertük. Dekapitálás után az agyat 5 % CO2 -dal buborékoltatott jeges bikarbonát-pufferelt oldatba (BPO) helyeztük, melynek összetétele (mM-ban) 134 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2 , 1,3 MgCl2 , 1,25 K2 HPO4 , 23 NaHCO3 és 9 glukóz (pH 7,4) volt. Az agy lehutése után 130-150 ? m vastag koronális vagy transzverzális sze leteket készítettünk vibratom (Vibracut; FTB Feinwerktechnik, Bensheim, Németország) segítségével. A szeleteket a mérés kezdetéig (1-7 óráig) szobahomérsékletu, 5 % CO2 -dal buborékoltatott BPO-ban tároltuk.

C) Glomerulóza tenyészet A mellékvesekérgi glomerulóza sejteket standard félszintetikus tápon tartott, 200-300 g-os Wistar patkányokból nyertük. Az állatokat dekapitáltuk, majd a mellékveséket eltávolítottuk. Az ún. kapszuláris szövetet (rostos tok + zona glomerulosa) leválasztottuk és kisebb darabokra vágtuk. A szövetet 25 percig emésztettük 1,2 mg/ml kollagenázt tartalmazó, 2 mg/ml BSA- val kiegészített KrebsRinger-HEPES-glukóz (KRHG) oldatban (fo ionok: 146 Na+, 3,6 K+, 1,22 Mg2+, 1,8 Ca2+, pH 7,4) majd 0,2 mg/ml szójabab tripszin inhibitort (Sigma ) és 0,2 mg/ml DNázt tartalmazó KRHG oldatban történo pipettázással tovább diszpergáltuk. Az izolált sejteket tartalmazó felülúszót eltettük, majd a megmaradt szövetet újra emésztettük és pipettáztuk. A két frakcióból nyert sejteket centrifugálás (100 g, 10 perc) után polilizinnel fedett üveglemezre tapasztottuk le, majd módosított Krebs-Ringerbikarbonát és M199 oldat (GibcoBRL) 38-62 térfogat%-os keverékében (40C oldat; végso koncentrációk (mM): 146 Na+, 3,6 K+, 0,5 Mg2+, 1,2 Ca2+, pH 7,4) termosztátban

21

(5% CO2 , 37 ?C) tartottuk, és az izolálást követo elso ([Ca2+]c mérés) vagy második (patch-clamp mérés) napon használtuk fel. Mérés elott néhány perccel a tenyészto oldatot egy standard külso oldatra cseréltük, mely (mM-ban) 137 NaCl, 3,6 KCl, 2 CaCl2 , 0,5 MgCl2 , 10 HEPES, 11 glukóz összetételu volt (pH 7,4).

D) Mechanikus agykérgi sérülés (szúrt seb) mutéti technikája A Tg(GFAP/EGFP) egereket érzéstelenítettük (ketamin- hidroklorid : xylazinhidroklorid = 4:1; 30 ? l) adásával, majd sztereotaktikus készülékre (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) helyeztük. A koponyatetot fúróval megnyitottuk, majd 27-es standard méretu steril tut szúrtunk 3 mm mélyre a jobb félteke A1,5, L1,5, V2,5 koordinátáiban. A bormetszést varrattal zártuk.

A kísérleti preparátumok készítése során minden, az állatvédelemre vonatkozó intézményi és törvényi eloírást betartottunk. A kísérleti protokollokat jóváhagyta a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Állatvédelmi és Etikai Bizottsága (124/1994; 17/1998), illetve a német Landesamt für Arbeitsschutz (Berlin; G0086/98).

Elektrofiziológiai mérések Kísérleteinkben a patch-clamp technika "teljes-sejt" típusát alkalmaztuk (1. ábra), annak klasszikus vagy ún. perforált változatában. A teljes-sejt patch-clamp módszer során a plazmamembrán és egy üveg mikropipetta vége között rendkívül nagy (GOhm-os) ellenállású kapcsolatot alakítunk ki. A klasszikus változat esetén (1A ábra) a kapcsolat létrejötte után a pipettahegy alatti membránrészt enyhe szívással átszakítjuk, ezáltal a citoplazma összetételét a pipettában található oldat határozza meg. A pipettában, illetve a külso (extracelluláris) oldatban elhelyezett elektródák segítségével a teljes

plazmamembránon

keresztül

folyó

feszültségértékek mellett mérhetjük.

22

áramot

tetszolegesen

beállított

Az ún. perforált-patch eljárás esetében (1B ábra) a szoros kapcsolat létrejötte után a membránfoltot nem szakítjuk át. Ehelyett a sejttel az elektromos kapcsolatot az teremti meg, hogy a pipetta oldatban lévo pórusképzo anyag, a nisztatin beépül a pipetta alatti membránrészletbe, és azt egyértéku ionokra (elsosorban kationokra, de kisebb mértékben anionokra is) átjárhatóvá teszi. A nisztatint (Sigma) a mérést megelozo két órán belül frissen oldottuk fel dimetil-szulfoxidban (DMSO), és 240 ? g/ml végkoncentrációban adtuk a pipetta oldathoz.

Elektród

Im

Pipetta

+100 mV Pipetta oldat Sejt

-100 mV

Külso oldat

Nisztatin

Im +100 mV

-100 mV

1. ábra. A patch-clamp teljes-sejt mérési mód (fent) és annak nisztatinnal perforált változata (lent)

23

Kísérleteinkben két fo protokolltípust használtunk: a feszültséglépést (voltage step) és az ún. ramp (”rámpa, felhajtó”) protokollt. A feszültséglépés során a sejt membránpotenciálját igen rövid ido alatt, egy lépésben változtatjuk meg, míg a ramp protokoll esetében a feszültségváltozás egy kezdo és végérték között folyamatosan, lineárisan történik. Ezen protokoll elemeket, vagy ezek kombinációját tetszoleges számban ismételhetjük. Az egyes ismétlések között a membránpotenciált ún. tartófeszültségen, stabilan tartjuk. Az izolált sejteken végzett mérésekhez a sejteket tartalmazó fedolemezt Diaphot 300 inverz mikroszkóp (Nikon, Tokió, Japán) tárgylemeztartójára helyeztük. Az agyszeleteket Axiovert FS fluoreszcens mikroszkóp (Zeiss, Oberkochen, Németország) tárgylemeztartójára helyezett üveglemezen rögzítettük egy platinakeretre tekert nylon szálakból álló rács segítségével. A pipettákat boroszilikát üvegkapillárisból húztuk Sutter P-87-es pipettahúzó segítségével (Sutter, Novato, CA, USA). A pipetta oldattal töltött pipetták ellenállása 38 MO volt. A külso oldatot Ag-AgCl elektródon keresztül földeltük. Azoknál a kísérleteknél, ahol a Cl- koncentrációt változtattuk, Dri-Ref-2SH (World Precision Instruments, Aston, UK) 3 M-os KCl-ot tartalmazó referencia elektródot használtunk az Ag-AgCl elektród helyett, így az oldatcserék során az elektródpotenciál változásai ± 3 mV-nál minden esetben kisebbek voltak. Az agyszeleten végzett kísérleteknél az elektródot 3 M KCl- dal töltött agar híd kötötte össze a külso oldattal. Az elektromos jelek erosítéséhez izolált sejteknél Axopatch-1D (Axon Instruments, Foster City, CA, USA), agyszeletnél pedig EPC-9 (HEKA electronics, Lambrecht/Pfalz, Németország) patch-clamp erosítot használtunk. Az áramjeleket izolált sejteknél 1 kHz-en, agyszeletnél 3 kHz-en szurtük (a 3 dB-es csillapítás frekvenciája). A digitalizáláshoz a mintavételezés izolált sejten 4 kHz-en, míg agyszeletnél 3 vagy 10 kHz-en történt. A nem specifikus háttér konduktanciákból származó áramokra nem korrigáltunk. A mérésekhez, adattároláshoz és kiértékeléshez izolált sejtnél PClamp (Axon), agyszeletnél WinTida 4.02 (HEKA) programot használtunk. A különbözo külso oldatokat gravitáció által hajtott, több befolyócsöves mikroperfúziós rendszerrel juttattuk el a sejtekhez. Izolált sejten végzett méréseinknél ennek közös kifolyócsöve kb. 50 ? m távolságra helyezkedett el a vizsgált sejttol, így az oldat a sejt közvetlen környezetébe jutott. A Cl- koncentráció változtatásával járó

24

méréseket kis térfogatú (? 100 ? l) külso oldatban végeztük, és oldatváltoztatásnál a teljes mennyiséget cseréltük. Agyszeleten végzett kísérleteinknél a teljes szeletet perfundáltuk. Az izolált sejten végzett kísérletek többségét 30 ?C-on végeztük, kivéve (technikai okok miatt) a Cl- koncentráció változtatásával járó méréseket (5. és 7. ábra). Utóbbiak, valamint az agyszeleten végzett mérések szobahomérsékleten (25 ?C) történtek. Az áramdenzitás meghatározásakor az áram amplitúdót a sejtméretre normalizáltuk, amely a sejtmembrán kapacitásával arányos. A tenyésztett asztrociták kapacitása 50,9 ± 22,5 pF (n=157); a glomerulóza sejteké 7,6 ± 2,0 pF (n=52) volt, míg a hippocampus szeletekben a komplex asztrociták kapacitását 25,7 ± 10,2 pF-nak (n=7) mértük.

A [Ca2+]c fluorimetriás mérése Az üveglemezre letapasztott glomerulóza sejteket Indo-1 Ca2+-érzékeny fluoreszcens festék acetoxi- metilészter formájával (2 ? M; TefLabs, Austin, TX, USA) 45-60 percig inkubáltuk 40C oldatban, CO2 termosztátban 37 ?C-on. Töltés után a fedolemezt fluoreszcens méréshez kialakított inverz mikroszkóp (Diaphot 300, Nikon, Tokió, J) futheto tárgyasztalára tettük. A méréseket 30 ?C-on végeztük. A méréshez egyedül álló glomerulóza sejteket választottunk, melyeket monokromátor segítségével (PTI, South Brunswick, NJ, USA) 355 nm-es hullámhosszú fénnyel világítottunk meg. A fluoreszcens jeleket 400 és 500 nm-es hullámhosszokon mértük egy-egy fotoelektron sokszorozóval (Model 712, PTI), a 400 és 500 nm-en mért jelek arányát ("ratio") a PClamp program segítségével számítottuk. A ratio értékek kalibrációja során a Ca2+ koncentrációt a [Ca2+]c = KD ? ? ? [(R-Rmin )/(Rmax-R)] képlet segítségével számítottuk ki (55), ahol R a ratio (400/500 nm), ? az 500 nm-es fluoreszcens jelek 0 és telíto Ca2+ koncentráció mellett mért aránya, KD pedig a festék in vitro disszociációs konstansa Ca2+-ra (230 nM). Az Rmin -t, Rmax-ot és ? -t Indo-1-gyel töltött sejteken végzett kalibráció segítségével határoztuk meg (n=5). Az Rmin -t 10 ? M ionomycin jelenlétében Ca2+ mentes extracelluláris oldatban mértük (összetétel (mM): 137 NaCl, 3,6 KCl, 0,5

25

MgCl2 , 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 11 mM glukóz, pH 7,4) , míg az Rmax-ot 10 mM Ca2+ hozzáadásával értük el. Egyedi

glomerulóza

sejtek

[Ca2+]c-ját

Indo-1

fluoreszcens

festékkel

meghatározva 204 ? 28 nM-os nyugalmi értéket kaptunk (n=54). Ugyanezen tenyészeteken Fura-2-vel mérve a nyugalmi [Ca2+]c 132 ? 25 nM-nak bizonyult (n=9).

Patch-clamp oldatok

A) Asztrocita tenyészet A külso oldatok összetételét az 1. táblázat ismerteti. A pipettaoldat összetétele (mM-ban): 125 CsCl, 0,25 CaCl2 , 0,5 MgCl2 , 7,65 EGTA, 10 HEPES, 5 Na2 ATP (pH 7,2) volt. Amikor az ATP-t elhagytuk az oldatból, az ozmolaritás fenntartása érdekében az ATP-t szacharózzal helyettesítettük. Az oldatok ozmolaritását ozmométerrel ellenoriztük (MicroOsmometer 3MO, Advanced Instruments, Norwood, MA, USA).

Oldat Na+ K+ NMDG+

Cl-

szacharóz HEPES

PIPES

pH

S1 75 3 124 55 10 7,4 (NaOH) S2 100 3 149 5 5 6,4-7,9 (NaOH) S3a 100 143* 5 5 6,9 (HCl) S3b 100 143 5 5 7,9 (HCl) S4a 46 170 5 5 6,9 (TEA-OH) S4b 46 170 5 5 7,9 (TEA-OH) 2+ + 2+ S1-S4 10 Ba , 25 TEA , 2 4-AP, 0,5 Mg , 11 glukóz, 280-295 mOsm 1. táblázat. Külso patch-clamp oldatok összetétele asztrocita tenyészethez A koncentrációkra vonatkozó adatok mM-ban értendoek. * mielott a pH-t 7,9 to 6,9-re csökkentettük TEA: tetraetil-ammónium 4-AP: 4-aminopiridin NMDG+ : N- metil- D-glukamin

26

B) Agyszelet Standard fiziológiás külso oldatként bikarbonát-pufferelt sóoldatot (BPO) használtunk, melynek összetételét az agyszelet preparálásnál írtam le. A Cl- áramok méréséhez használt oldat (ún. NMDG-bikarbonát oldat) összetétele a következo volt (mM-ban): 117 NMDG-Cl, 23 NMDG-HCO3 , 5 CsCl, 2 CaCl2 , 1,3 MgCl2 , és 9 glukóz (pH 7,4). A külso oldatokat folyamatosan buborékoltattuk 5 % CO2 -dal. A pipettaoldat (mM-ban) 140 CsCl, 1,1 MgCl2 , 0,5 CaCl2 , 5 EGTA és 10 HEPES (pH 7,3) összetételu volt.

C) Glomerulóza tenyészet A Cl- és Ca2+ áramok méréséhez használt, különbözo ozmolaritású külso oldatokat egy hipozmotikus alapoldatból készítettük, melynek tartalma (mM-ban) 90 NMDG-Cl, 10 TEA-Cl, 0,5 MgCl2 , 10 BaCl2, 3,6 KCl, 2 NaCl, 11 glukóz és 10 HEPES (pH 7,4, 240 mOsm) volt. A külso oldat ozmolaritását szacharóz hozzáadásával emeltük 250, 290 és 330 mOsm-ra (Ba250-Ba330 oldatok). A pHe változások hatásának vizsgálatához az asztrocita tenyészetnél megadott S2 oldatot használtuk. A pipettaoldat a klasszikus teljes-sejt módszer esetén (mM-ban) 137 CsCl, 0,25 CaCl2 , 0,5 MgCl2 , 7,65 EGTA, 10 HEPES, 5 Na2 ATP (pH 7,2) összetételu volt. A nisztatin-perforált teljes-sejt mérésnél (mM-ban) 140 Cs-glukonát, 5 MgCl2 , 1 EGTA, 10 HEPES (pH 7,3) tartalmú oldatot használtunk.

D) Gátlószerek Minden gátlószert, melynek gyártóját külön nem jelöltem, a Sigma cégtol vásároltunk (www.sigmaaldrich.com). Az antracén-9-karboxisavat (9-AC), 5- nitro-2-(3fenilpropilamino)benzoátot (NPPB; Tocris, www.tocris.com) és nifluminsavat naponta frissen oldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO), és 1:1000 hígításban tettük S1 külso oldatba. A tetraetil- ammóniumot (TEA) és 4-aminopiridint (4-AP) porban mértük be a külso oldatba.

27

Fluorimetriához használt oldatok A [Ca2+]c méréséhez használt különbözo ozmotikus koncentrációjú oldatokat egy hipozmotikus alapoldatból készítettük, melynek tartalma (mM-ban) 112 NaCl, 3,6 KCl, 2 CaCl2 , 0,5 MgCl2 , 10 HEPES, 11 glukóz (pH 7,4, 245 mOsm) volt. A külso oldat ozmolaritását szacharóz hozzáadásával emeltük 250, 290 és 330 mOsm-ra. A K+ koncentráció emelésével járó kísérletekben az oldatok azonos ozmolaritását a kontroll oldathoz adott NMDG-Cl-dal biztosítottuk.

Statisztikai kiértékelés Az adatokat minden esetben átlag ± a középérték szórása (S.E.M.) értékben adtam meg. A kiértékelés során egy- és kétmintás t-próbát, valamint önkontrollos variancia analízist alkalmaztunk, a Statistica program (Tulsa, OK, USA) segítségével. Post hoc összehasonlításhoz a Tukey-féle szignifikancia különbség tesztet használtuk. Szignifikáns különbségnek minden esetben a p<0,05 szintu eltérést tekintettük.

28

EREDMÉNYEK

Befelé rektifikáló áram jellemzése hosszútávú patkány agykérgi asztrocita tenyészeten Az asztrocita anion áramainak vizsgálatához a külso oldat és a pipetta oldat összetételét úgy választottuk meg, hogy a sejt fo konduktanciáját jelento K+ áramokat kiküszöböljük.

Ennek

érdekében +

minden

hosszútávú

sejttenyészeten

végzett

+

kísérletünkben a pipetta oldat K helyett Cs -ot tartalmazott, a külso oldatban pedig 10 mM Ba2+-mal, valamint TEA és 4-AP segítségével gátoltuk a K+ csatornákat. Mint azt az 1. táblázat jelzi, ezen gátlószerek kivételével a külso oldat összetételét az egyes kísérletekre optimalizálva változtattuk. A teljes-sejt állapot elérését követoen S1 külso oldat jelenlétében a ? 100 mV-os tartófeszültségrol 15 másodpercenként ismételt, 1 másodperc hosszú, +40 mV- ig tartó folyamatos depolarizáció (ramp protokoll) segítségével széles feszültségtartományban térképeztük fel a sejtmembrán konduktanciáját. Mint az a 2. ábrán látható, az idoben egymást követo gö rbéken a negatív feszültségtartományban növekvo amplitúdójú, befelé irányuló áram volt megfigyelheto. A jelenség szinte minden vizsgált sejten kimutatható volt. Az áram növekedése 5-10 percig tartott, vizsgálatát a tartós állapot kialakulása után kezdtük el. Elso lépésként meghatároztuk az áram aktivációs kinetikáját és feszültség-áram összefüggését (3. ábra). Ehhez 0 mV-os tartófeszültségrol 1 másodperc hosszú feszültséglépésekbol álló sorozatot alkalmaztunk a –120 és +40 mV közötti tartományban. A 3A ábrán egy ilyen mérés során nyert görbéket mutatok be, ahol látható, hogy míg +40 és –20 mV között gyakorlatilag nem mérheto áramváltozás a feszültséglépés hatására, negatívabb potenciálokon egy lassan aktiválódó, befelé irányuló áram jelent meg, amely nem inaktiválódott még akkor sem, ha a membránt 15 másodpercig –100 mV-on tartottuk. Az aktiváció kinetikája két exponenciális komponensbol álló egyenlettel jól leírható volt, melyek idoállandói (?1 és ?2 ) –120 mVon 331,3 ± 41,1 ms-nak, illetve 38,8 ± 9,9 ms-nak adódtak. Az ugyanezen a feszültségen meghatározott, sejtméretre normalizált steady-state áramamplitúdó –21,7 ± 10,5 pA/pF volt (n=20). A feszültség-áram összefüggés meghatározásához az egyes

29

E (mV)

+ 40 -1 0 0

0 2. ábra. Befelé irányuló áram lassú idobeli kialakulása a ne gatív feszültségtartományban agykérgi asztrocita sejttenyészeten K+ csatorna gátlószereket tartalmazó külso oldatban (S1) a sejtmembránt –100 mV-os tartófeszültségrol folyamatosan depolarizáltuk +40 mV- ig, majd szimmetrikusan visszatértünk a tartófeszültségre. A görbék ugyanazon sejten 15 másodpercenként felvett áramprofilt mutatnak.

A

B E (mV)

+40

0

-120 -80

-40

0

+40

-120

500

E (mV) -0.2

I (pA)

0 -0.6 -500 -1.0

-1000 -1500

I/I-120

200 ms

3. ábra. A befelé irányuló áram aktivációs kinetikája és feszültség-áram összefüggése tenyésztett asztrocitán (A) Az áram végleges kialakulását követoen S1 külso oldatban 0 mV-os tartófeszültségrol 15 másodpercenként 1 másodperc hosszú feszültséglépést alkalmaztunk –120 és +40 mV között, 20 mV-os különbségekkel (egy reprezentatív sejt görbéi). (B) Az egyes lépések végén mért áramértékek a feszültségérték függvényében, a –120 mV-on mért (maximális) áramértékre (-1) normalizálva (n=7).

30

feszültséglépések végén mért átlagáramokat ábrázoltuk a maximális (–120 mV-os) áramértékekre normalizálva (3B ábra, n=7). Az áram –40 mV-nál negatívabb membránpotenciálnál kezdett aktiválódni, és amplitúdója az ennél negatívabb feszültségeken meredeken nott, tehát az áram befelé rektifikált. Az áram megfordulási potenciálja 0 mV körüli érték (–4,5 ± 3,6 mV) volt, amely az adott kísérleti körülmények között arra utalt, hogy vagy vegyes egyértéku kation áramról, vagy pedig klorid ionok által létrehozott áramról van szó, mivel ezen ionok koncentrációja a membrán két oldalán közel azonos volt.

A befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenysége A vizsgált áram kinetikája felvetette két csatornaféleség: a hiperpolarizációaktivált anion csatorna, illetve a hiperpolarizáció-aktivált nem specifikus kation csatorna (Ih ) lehetséges szerepét. Mindkét csatorna áramtípusát leírták már több más sejtféleség mellett asztrocitán is (45, 56). Mivel farmakológiai tulajdonságaik jelentosen különböznek, megvizsgáltuk a befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenységét (4. ábra). Az áramot 0 mV-ról –120 mV-ra történo, 15 másodpercenként alkalmazott feszültséglépésekkel aktiváltuk. A hiperpolarizáció-aktivált Cl- csatornák ismert gátlószerei közül a Cd2+ és a Zn2+ jelentos mértéku, reverzibilis gátlást fejtett ki; 100 ? M-os koncentrációban a Cd2+ 52,2 ± 11,6 %-kal (4A ábra; n=5), a Zn2+ pedig 36,0 ± 4,5 %-kal (n=4) csökkentette az áram amplitúdóját. Az anion csatornák szerves gátlószerei közül az extracellulárisan alkalmazott 1 mM 9-AC 33,8 ± 7,7 %-kal (4B ábra; n=6), 200 ? M NPPB 26,7 ± 6,4 %-kal (n=3) gátolt, míg 300 ? M nifluminsav 14,8 ± 3,5 %-os gyenge gátlást okozott (n=3, 4C ábra). Ezzel szemben a hiperpolarizációaktivált nem specifikus kation csatorna szervetlen gátlószere, az extracellulárisan adott Cs+ 3 mM-os koncentrációban nem fejtett ki gátló hatást (n=3). A gátlószer-érzékenység vizsgálata tehát valószínusítette, hogy a befelé rektifikáló áram egy klorid csatornán keresztül jön létre.

31

0

-120

E (mV)

A

B 2+

Cd

250 pA

500 pA

9-AC kontroll 200 ms

kimosás

kontroll kimosás

C

?

?

5

4

6

3

3

3

Zn2+

9-AC

NPPB

niflu.

Cs +

?

Cd2+

0.0

?

?

0.5

kontroll

I/Ikontroll

1.0

4. ábra. A befelé rektifikáló áram gátlószer-érzékenysége tenyésztett asztrocitán Az áramot 15 másodpercenként ismételve 0 mV-ról –120 mV-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel aktiváltuk, S1 külso oldatban. Minden gátlószert extracellulárisan alkalmaztunk. A kétértéku kation 100 ? M Cd2+ (A) és a szerves gátlószer 1 mM 9-AC (B) reverzibilisen gátolta a hiperpolarizációra aktiválódó áramot (reprezentatív görbék). (C) A –120 mV-os lépés végén mért áramamplitúdó változása a kontroll értékre normalizálva 100 ? M Cd2+, 100 ? M Zn2+, 1 mM 9-AC, 200 ? M NPPB, 300 ? M nifluminsav, valamint 3 mM Cs+ hatására. Az oszlopokban az elemszámokat tüntettük fel. A szignifikáns gátlást csillag jelöli.

32

A befelé rektifikáló áram töltéshordozója Amikor a Na+ és K+ ionokat a nagyméretu, nem permeábilis kationnal, NMDG+vel helyettesítettük, az áram amplitúdója és karakterisztikája nem változott, ami megerosítette, hogy az áram létrejöttéért nem kationcsatorna felelos (ábrát nem mutatok). A klorid ionok töltéshordozó szerepét az ún. farok-áram (tail current) megfordulási potenciáljának vizsgálatával igazoltuk (5. ábra). Az áramot egy hiperpolarizáló feszültséglépéssel aktiváltuk, majd pozitív lépést alkalmaztunk a –40 és +60 mV közé eso tartományban (5. ábra, fent). Pozitív feszültségen az addig aktív csatorna bezárul, ami az áram exponenciális lecsengéséhez vezet, ez az ún. farok-áram. A farok-áram megfordulási potenciálja ott található, ahol az áram meredeksége nulla. A kísérlet optimalizálása érdekében a külso oldatban a Na+ és K+ ionokat NMDG+-re cseréltük. A Cl- egyensúlyi potenciálját úgy változtattuk, hogy a külso oldatban az NMDG-Cl-ot szacharózzal helyettesítettük, így a Cl- koncentrációt 143 mM-ról 46 mMra csökkentettük. Az alacsonyabb klorid koncentrációnál a Nernst-egyenlet alapján számolt Cl- egyensúlyi potenciál 29,1 mV-tal a pozitív irányba tolódik. Az 5A és 5B ábra egy reprezentatív sejt eredeti regisztrátumait mutatja be a kétféle klorid koncentráció esetén, míg az 5C ábrán a farok-áramok meredeksége látható a feszültség függvényében. Ha a külso Cl- koncentrációt 143 mM-ról 46 mM-ra csökkentettük, a megfordulási potenciál +1,7 ± 1,6 mV-ról +26,4 ± 2,0 mV-ra tolódott (n=5). A mintegy 25 mV-os mért eltolódás jól közelíti a Cl- egyensúlyi potenciáljának számított változását, ami azt mutatja, hogy az áram töltéshordozója döntoen a Cl-.

Az intracelluláris ATP szerepe Több Cl- áramról ismert, hogy megjelenésük, kinetikájuk függ a citoplazma ATP koncentrációjától (48, 138). Munkacsoportunk patkány glomus caroticum kemoreceptor sejten is igazolta, hogy a befelé rektifikáló Cl- áram amplitúdója jelentosen nagyobb, ha a pipetta nem tartalmaz ATP-t (Petheo et al., 2001). Ezért megvizsgáltuk, hogyan befolyásolja az asztrocita befelé rektifikáló Cl- áramának viselkedését, ha a pipetta oldatból elhagyjuk az ATP-t. Azonos preparátumokon meghatározva ATP jelenlétében

33

E (mV)

+60

0

-120 -40

A I (nA)

0 -1 -2 250 ms

B I (nA)

0 -1 -2

C E (mV)

0

+20

+40

0.0

-0.3 -

dekség (pA/ms)

0.3

5. ábra. A befelé rektifikáló áram Cl- szelektivitásának vizsgálata tenyésztett asztrocitán Az áramot hiperpolarizációval aktiváltuk, majd különbözo feszültségértékekre léptünk –40 és +60 mV között, 15 másodpercenként. (A-B) Egy reprezentatív sejten felvett görbék 143 mM (S3a oldat; A) és 46 mM (S4a oldat; B) külso [Cl-]e mellett (pHe 6,9). (C) A farok-áramok meredeksége a feszültség függvényében 0 és +40 mV között a kétféle [Cl-]e esetén. A meredekséget az A és B ábrán bemutatott, szaggatott vonalakkal határolt szakaszon egyenes illesztésével határoztuk meg (n=5).

34

a maximális áramamplitúdó –120 mV-on –26,9 ± 18,3 pA/pF volt (n=7). Az ATP izozmotikus helyettesítése szacharózzal nem befolyásolta a kialakuló áram maximális amplitúdóját (–28,2 ± 17,0 pA/pF, n=6), tehát (a kemoreceptor sejttol eltéroen) tenyésztett asztrocitán a befelé rektifikáló Cl- áram amplitúdója független az intracelluláris ATP jelenlététol.

A befelé rektifikáló áram pHe-érzékenysége A befelé rektifikáló Cl- áram érzékenységét a külso pH változásai iránt az élettani, illetve kórélettani szempontból releváns 6,4-7,9 pH tartományban vizsgáltuk (6. ábra). Amikor a külso oldat pH-ját 7,4-rol 7,9-re emeltük, a –120 mV-on mért steadystate áram amplitúdója 18,0 ± 2,9 %-kal csökkent. Ezzel szemben, hasonló mértéku extracelluláris acidózis (pHe 6,9) hatására az amplitúdó 17,8 ± 5,8 %-os növekedése volt megfigyelheto (6A és 6B ábra, n=7). A pHe további csökkentése 6,4-re már nem okozott további amplitúdóváltozást. A pHe változtatása az aktiváció kinetikáját is befolyásolta (6C ábra): a vizsgált pHe-tartományban az aktiváció mindkét idoállandója pHe 6,9-nél volt a legkisebb, azaz az aktiváció ezen a pHe-n volt a leggyorsabb, míg pHe 6,4-nél az aktiváció jelentos lassulása következett be, amit az idoállandók (elsosorban a ?2 ) növekedése jelzett. A pHe változtatás hatása minden esetben gyors és kimosható volt.

35

A E (mV)

0

-120

I (pA)

0 -500 7.9 7.4

-1000 6.4

6.9 1 sec

B

C

1.2

?/?7.4

I/I7.4

1.5

1.0

?? 1.0

?1

0.8 0.5 6.4

6.9 7.4 pHe

7.9

6.4

6.9 7.4 pH e

7.9

6. ábra. A külso pH változtatásának hatása a befelé rektifikáló áramra tenyésztett asztrocitán (A) Különbözo pHe értékek mellett mért áramgörbék egy reprezentatív sejten. A befelé rektifikáló áramot 15 másodpercenként ismételt, 0-ról –120 mV-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel aktiváltuk. Az S2 külso oldat (mely a megfelelo intracelluláris H+-pufferelés érdekében HEPES mellett PIPES-t is tartalmazott) pH-ját 6,4, 6,9, 7,4 és 7,9 értékekre állítottuk be. (B) A pHe hatása a steady-state áram amplitúdójára (n=7). Az áramértékeket a pHe 7,4 mellett mért amplitúdóhoz viszonyítva adtuk meg. (C) A pHe hatása az aktiváció kettos exponenciális kinetikáját leíró ?1 és ?2 idoállandókra (n=7). Az idoállandók relatív változását a pHe 7,4 mellett mért értékekhez viszonyítva tüntettük fel.

36

A pHe-érzékeny áramkomponens Cl--szelektivitásának vizsgálata Annak kizárására, hogy a pHe változtatása nem az általunk vizsgált anion áramra, hanem valamely egyéb, a befelé rektifikáló Cl- áram mellett párhuzamosan muködo áramkomponensre fejtette ki hatását, bizonyítani szerettük volna, hogy a pHeérzékeny komponens valóban anionszelektív. Ehhez a befelé rektifikáló Cl- áramot hiperpolarizáló ramp protokollal aktiváltuk, majd 1 másodperc hosszú ramp depolarizációt alkalmaztunk –100-tól +50 mV-ig (7. ábra, bekeretezve). A depolarizációs ramp szakasz alatt a csatorna még nem zárul be teljesen, ezért amennyiben a hiperpolarizációval aktivált áramunkat valami (pl. a pHe) gátolja vagy aktiválja, a befolyásolt áramkomponens megfordulási potenciálját ezen a szakaszon megmérhetjük. A töltéshordozó egyensúlyi potenciáljánál (ahol a nettó fluxus nulla) az áramerosséget a pHe nem befolyásolja, tehát a két görbe itt keresztezodik. Ha a pHeérzékeny áramkomponens töltéshordozója a Cl-, akkor a [Cl-]e változtatásakor az áramkomponens

megfordulási

potenciáljának

követnie

kell

a

Cl-

egyensúlyi

potenciáljának elméleti eltolódását. A kísérlethez használt külso oldatokban a Na+-ot és K+-ot NMDG+ helyettesítette (S3 és S4 oldatok). Kontroll [Cl-]e (143 mM; S3) mellett a pHe emelése 6,9-rol (S3a) 7,9-re (S3b) gátolta a membrán konduktanciáját (7B ábra, n=5). A gátolt áramkomponens megfordulási potenciálja +2,5 ± 1,8 mV volt. Ezután a [Cl-]e-t 46 mMra csökkentettük, az NMDG-Cl szacharózzal való helyettesítésével (S4). Alacsony [Cl-]e jelenlétében megismételve a pHe változtatását a pHe-érzékeny komponens megfordulási potenciálja +28,4 ± 2,1 mV-ra tolódott (7A ábra), ami jól közelíti a Cl- egyensúlyi potenciáljának számolt változását (+29,1 mV eltolódás). Ez bizonyítja, hogy a pHeérzékeny komponens valóban anion áramnak felel meg.

37

A [Cl- ]e=46 mM

200 pA

pHe 7.9 pHe 6.9 100 ms

E (mV) -50

0

+50

B 7. ábra. A pHe-érzékeny áramkomponens anion-szelektivitásának vizsgálata tenyésztett asztrocitán A befelé rektifikáló áramot –100 mV-ra történo folyamatos hiperpolarizáló "ramp"-pel aktiváltuk, amelyet depolarizáló "ramp" követett +50 mV- ig (bekeretezett ábra, a protokoll értelmezését lásd a szövegben). A depolarizáló szakasz szaggatott vonalakkal kiemelt részén mért áramgörbék (A) 46 mM (S4 külso oldat) és (B) 143 mM (S3 külso oldat) [Cl-]e esetén, kétféle pHe mellett (egy reprezentatív sejten végzett mérés). Az acidózis által aktivált áramkomponens megfordulási potenciálját a szaggatott vonalak jelzik (n=5).

38

Kétféle asztrocita típus kimutatása in situ körülmények között Eddig bemutatott asztrocita méréseinket hosszútávú (>2 hét) tenyészeten végeztük. A tenyésztés során a sejt csatorna-expressziója azonban jelentosen megváltozhat. Ezenkívül az asztrocita tenyészetet a bevett módszernek megfeleloen 3 napnál fiatalabb újszülött állatokból készítettük, a rágcsálók agya azonban csak a születés után több héttel éri el a felnottre jellemzo fejlettséget. Ezért megvizsgáltuk, hogy felnott egéragyból készített akut agyszeleten is kimutatható-e a tenyésztett asztrocitán megfigyelt anion áram. Kísérleteinkhez egy genetikailag módosított egértörzset használtunk, amelynek asztrocitái EGFP-t expresszálnak a GFAP-t termelo gén promotere által szabályozottan (101). Az asztrocitákat mérés elott fluoreszcens mikroszkóp segítségével az EGFP jelenléte

alapján

azonosítottuk.

A

patch-clamp

módszer

teljes-sejt

felállását

alkalmaztuk, a pipettaoldat minden esetben Cs+-ot tartalmazott K+ helyett. Elso kísérleteinket a hippocampus CA3 régiójában található sejteken végeztük. Morfológiai és elektrofiziológiai tulajdonságaik alapján az asztrociták két típusát tudtuk elkülöníteni, melyek megfeleltek az irodalomban korábban in situ leírt "komplex" és "passzív" asztrocita típusoknak (32, 101, 136). A komplex sejteket halványabb EGFP fluoreszcencia, kerek vagy ovális sejttest és csak néha látható vékony, hosszú nyúlványok jellemezték (8A ábra). A –70 mV-os tartófeszültségrol rövid de- és hiperpolarizáló lépések sorozatát alkalmazva fiziológiás összetételu külso oldatban ezen a sejttípuson komplex feszültségfüggo áramprofil volt megfigyelheto (8C ábra, n=12). Ezzel

szemben

a

passzív

sejtek

erosebben

fluoreszkáltak

és

kiterjedt

nyúlványrendszerük jól látható volt (8B ábra), a fenti protokollal pedig jelentos nagyságú, feszültségtol független passzív konduktanciát mutattak (8D ábra, n=6). A Cl- áramok vizsgálhatósága érdekében a fiziológiás külso oldatot olyan oldatra cseréltük, melyben a Na+ és K+ ionokat NMDG+-vel és Cs+-mal helyettesítettük (NMDG-bikarbonát oldat), mivel ezáltal nemcsak a K+ áramokat, hanem az esetleg jelenlévo Ih áramot is gátolhatjuk. A sejtek konduktancia-változását 0 mV-ról –100 mVra történo ismétlodo feszültséglépésekkel követtük. Na+ és K+ ionok hiányában a

39

KOMPLEX

PASSZÍV

B

A

C

-70 2

2

1

1

0 -1

0.5 0.0

0

-2

F

+50 -100

4

NMDG I (nA)

E

-0.5 -1.0

0 -1

5 ms

-2

I (nA)

3

-160 I (nA)

I (nA)

3

D

+60

kontroll 500 ms

2 0 -2

NMDG kontroll

8. ábra. Két asztrocita típus kimutatása egér akut hippocampus szeletben in situ Komplex (A) és passzív (B) asztrocitát ábrázoló nagy nagyítású fluoreszcens felvétel. (C-D) A –70 mV-os tartófeszültségrol 15 ms hosszú feszültséglépéseket alkalmaztunk –160 és +60 mV között egy reprezentatív komplex (C) és passzív (D) sejten, BPO-ban. (E-F) A sejteket 0 mV-ról 1,5 másodpercig –100 mV-ra hiperpolarizáltuk egy lépésben, majd folyamatosan depolarizáltuk +50 mV- ig. A kontroll külso BPO-t NMDGbikarbonát oldatra cseréltük. Reprezentatív komplex (E) és passzív (F) sejt.

40

komplex sejten a konduktancia drasztikusan csökkent (8E ábra, n=11), míg a passzív sejten csak kismértéku gátlás következett be (8F ábra, n=6).

Befelé rektifikáló áram jellemzése komplex asztrocitán in situ Komplex asztrocitán az NMDG-bikarbonát oldat adása után a konduktancia további alakulását olyan protokollal követtük, amelyben 0 mV-ról lassú (2,5 másodperces) folyamatos hiperpolarizációt alkalmaztunk –120 mV-ig, melyet egy gyors depolarizáló ramp követett +50 mV- ig (9A ábra, fent). Hasonlóan a patkány agykérgi asztrocita sejttenyészeten tapasztaltakhoz (2. ábra), a hiperpolarizáló ramp negatív potenciáltartományában egy növekvo amplitúdójú, befelé irányuló áram volt megfigyelheto (9A ábra), amely kb. 3-5 perc alatt érte el a stabil állapotot. Az áram kialakulásának végén és kezdetén felvett görbéket egymásból kivonva megkapjuk a lassan kialakuló áramkomponenst (9B ábra). Az áramkomponens –40,5 ± 7,5 mV-os küszöbbel aktiválódott (n=9), megfordulási potenciálja pedig (a depolarizáló szakaszon leolvasva) +4,8 ± 11,1 mV- nak adódott. Ez a Cl- számolt egyensúlyi potenciáljához (+2,8 mV) közeli érték, ami valószínusíti, hogy az áram Cl- csatornán keresztül folyt. Ezen áram kialakulása 11 komplex sejtbol 10-en megfigyelheto volt. A stabil állapot kialakulása után meghatároztuk az áram aktivációs kinetikáját és feszültségfüggését (10A ábra). A befelé irányuló áram a sejttenyészeten vizsgált áramhoz igen hasonló kinetikát mutatott: kb. –40 mV-nál negatívabb feszültségeken lassan aktiválódott, és nem mutatott inaktivációt 1,5 másodperc alatt. Meghatároztuk a teljes (a feszültséglépések végén mért) steady-state áram feszültség-áram összefüggését (10B ábra, n=10), valamint külön a lassan aktiválódó áramkomponens feszültség-áram összefüggését (10C ábra, n=10). Ez utóbbi komponens (melyet a feszültséglépés végén mért áramértékbol a lépés elején mért áramérték kivonásával határoztunk meg) eros befelé rektifikációt mutatott. Az áramkomponens aktiválódása negatív potenciálokon a teljes steady-state konduktanciában is enyhe befelé rektifikáció megjelenéséhez vezetett (10B ábra). A steady-state áram amplitúdója –100 mV-on –89,7 ± 24,0 pA volt, amely sejtméretre normalizálva –4,6 ± 2,1 pA/pF értéket jelentett. A steady-state áram amplitúdóját 300 ? M Cd2+ 53,4 ± 3,9 %-kal csökkentette (10D ábra, n=5).

41

A

E (mV) 0

-120

+50

100

I (pA)

50 0 a

-50

b c

500 ms -100

B

20

I (pA)

0 -20

-40

9. ábra. Befelé irányuló áram lassú megjelenése hippocampális komplex asztrocitán in situ (A) NMDG-bikarbonát külso oldatban a 0 mV-os tartófeszültségrol 10 másodpercenként 2,5 másodperc hosszú folyamatos ramp hiperpolarizációt alkalmaztunk –120 mV- ig, majd 500 ms hosszan folyamatosan depolarizáltunk +50 mV- ig. Az a, b és c görbék egy reprezentatív sejten 40 másodperces idoközökkel nyert áramot mutatnak. (B) Az A ábrán látható mérésben a c (120 másodperc) és az a (0 másodperc) görbe kivonásával izoláltan megkaptuk a lassan aktiválódó áramkomponenst.

42

B

+40

E (mV) 0 100

100

-100

50 -100

0

-60

-20

20 I (pA)

-50 100 150

500 ms

-100

D E (mV) 0 100

25 -20

20

-50

I (pA)

-60

I (pA)

-100

0

+50 -100

+ Cd2+

-100 -200

kontroll 500 ms

10. ábra. Befelé rektifikáló áram jellemzése komplex asztrocitán in situ (A) A 0 mV-os tartófeszültségrol 1,5 másodperc hosszú feszültséglépéseket alkalmaztunk a –100 - +40 mV-os tartományban 10 másodpercenként, NMDGbikarbonát oldatban (reprezentatív sejt). (B) A feszültséglépések végén mért áramértékek a feszültség függvényében (n=10). (C) A lassan aktiválódó áramkomponens amplitúdója a feszültség függvényében. A komponens amplitúdóját úgy határoztuk meg, hogy a lépés végén mért áramértékekbol levontuk a lépés kezdetén a kapacitatív áram lecsengése után mért értéket (n=10). (D) 300 ? M Cd2+ hatása a befelé rektifikáló áramra (reprezentatív mérés, n=5). Az áramot 10 másodpercenként aktiváltuk –100 mV-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel.

43

Az áram jelenlétét megvizsgáltuk ugyanezen kísérleti körülmények között az agykéregben is. A cortexben a hippocampusban találtakkal megegyezoen kimutatható volt a kétféle asztrocita sejttípus, és 7-bol 6 komplex asztrocitán a befelé rektifikáló áram jelenléte. Az agykérgi sejten mért áram kinetikája, amplitúdója és Cd2+érzékenysége megegyezett a hippocampusban kimutatott árammal (ábrát nem mutatok). Passzív asztrocitán nem tudtunk olyan körülményeket teremteni, melyek mellett egy kis amplitúdójú Cl- áram megbízhatóan kimutatható lett volna (lásd 8F ábra), mivel a Na+ és K+ helyettesítése NMDG+-vel és Cs+-mal nem gátolta kelloképpen a passzív konduktanciát. Ezen a sejten a befelé rektifikáló áram fokozatos kialakulása az adott körülmények között nem volt észlelheto (n=6), bár néhány sejt esetében a hiperpolarizáló lépések során megfigyelheto volt egy lassan aktiválódó, befelé irányuló áramkomponens jelenléte. Ezt a komponenst azonban a domináló passzív konduktancia ingadozása miatt nem tudtuk azonosítani.

A Cl- áram nem detektálható ClC-2 "knock -out" egérben Mivel a hiperpolarizáció-aktivált Cl- áram tulajdonságai hasonlóak a Xenopus oocytában expresszált ClC -2 Cl- csatorna által létrehozott áram jellemzoihez (142), megvizsgáltuk, hogy valóban ez a csatorna felelos-e az általunk vizsgált áram kialakításáért. Ehhez egy olyan transzgenikus egértörzset használtunk, melyben a ClC -2 gént inaktiválták (17). Mivel ezek az álla tok nem expresszálnak EGFP-t, a komplex asztrocitát elektrofiziológiai jellemzoik (komplex feszültségfüggo áramprofil, nagy amplitúdójú feszültségfüggo Na+ áram hiánya, NMDG-bikarbonát oldatra adott reakció) alapján azonosítottuk (11A és 11B ábra). A kontroll (EGFP-t expresszáló) állatoknál alkalmazottal megegyezo kísérleti körülmények között a ClC -2 "knock-out" egerek hippocampusának CA3 régiójában a vizsgált 9 komplex asztrocita egyikén sem volt kimutatható a befelé rektifikáló áram jelenléte. Az áram teljes kialakulásához kontroll állatokban szükséges ido kivárása után az aktivációs protokoll alkalmazásakor a hiperpolarizáló lépéseknél nem jelent meg a lassan aktiválódó komponens (11C ábra), továbbá 300 ? M Cd2+ alkalmazása a –100 mV-on mért áram amplitúdójában nem okozott szignifikáns változást (n=4, ábrát nem mutatok). A feszültséglépések végén

44

mért áram feszültségfüggésén látható, hogy a ClC -2 "knock-out" állatok steady-state árama (a kontroll, EGFP-expresszáló állatokéval ellentétben, lásd 10B ábra) nem mutat befelé irányuló rektifikációt (11D ábra, n=7).

A Cl- áram expressziója csökken reaktív asztrocitában Az agyszövet különbözo eredetu, pl. mechanikus sérülése vagy ischemiás károsodása esetén a sérülés környezetében asztrociták aktiválódnak, ún. reaktív asztrogliózis alakul ki. A reaktív asztrocita mind morfológiailag, mind elektrofiziológiai tulajdonságai tekintetében különbözik a nyugvó sejttol, így pl. mérete nagyobb, fokozottan expresszál GFAP-t, csatornakészletében pedig jellemzo a befelé rektifikáló K+ áram csökkenése (122), míg más, pl. feszültségfüggo Ca2+ áramok kifejezodése fokozódik (163). A hiperpolarizáció-aktivált Cl- áram változását reaktív asztrocitán az EGFP-t termelo felnott egerek jobb oldali parietális kérgében, tu beszúrásával okozott mechanikus sértéssel (ún., "stab wound", szúrt seb) vizsgáltuk, míg a bal oldali kéreg kontrollként szolgált. A mutéti beavatkozás után 2-4 nappal a sérülés helye fluoreszcens mikroszkóppal jól azonosítható volt a környezo, erosen fluoreszkáló (azaz fokozottan GFAP-termelo) reaktív asztrociták jelenléte alapján (12A és 12B ábra). A komplex áramprofillal rendelkezo reaktív sejtek közül csak azokat a sejteket elemeztük, ahol a passzív konduktancia –100 mV-on az NMDG-bikarbonát oldat adásakor –300 pA- nál kisebb értékre csökkent (a sejtek 80 %-a). Az áram kimutatásához a korábban is alkalmazott aktivációs protokollt használtuk. A kontroll oldalon a vizsgált 6 sejt mindegyikén jelentos amplitúdójú befelé rektifikáló Cl- áram aktiválódott (12F ábra). Ezzel szemben, a sértés oldalán a vizsgált 8 reaktív sejtbol 5- nél a befelé rektifikáló áram nem volt detektálható (12C ábra), míg a maradék 3 sejten kis amplitúdójú hiperpolarizáció-aktivált komponens kimutatható volt (12D ábra).

45

B 1.0

I (nA)

0.5 NMDG

0.0 -0.5 -1.0 -1.5

ctr 500 ms

D

150

E (mV) -60

-20

20 I (pA)

-100

11. ábra. A befelé rektifikáló áram nem mutatható ki ClC -2 "knock-out" egérbol származó komplex asztrocitán in situ (A) Reprezentatív komplex asztrocita jellegzetes feszültségfüggo áramprofilja ClC -2 "knock-out" egér hippocampusában in situ. Az oldatok és a feszültségprotokoll azonos a 9C ábrán leírtakkal. (B) A külso BPO cseréje NMDG-bikarbonát oldatra a konduktancia jelentos csökkenéséhez vezetett (oldatok és a feszültségprotokoll leírása a 9E ábrán). (C) Aktivációs protokoll által kiváltott áram egy reprezentatív sejten (oldatok és protokoll azonos a 10A ábránál leírtakkal). (D) A feszültséglépések végén mért áramértékek a feszültség függvényében (n=7).

46

Sértett oldal

A

B

C E (mV) 0

200

D

+40 -100

200 100 I (pA)

I (pA)

100 0

-100

-100 -200

0

500 ms

-200

Kontroll oldal

E

F 200

I (pA)

100 0

-100 -200

12. ábra. A befelé rektifikáló Cl- áram vizsgálata reaktív asztrocitán in situ (A) Kis nagyítású fluoreszcens kép a sértés helyén. A szúrcsatorna körüli reaktív sejtek erosen fluoreszkálnak (nyilak). (B) Nagy nagyítású fluoreszcens kép egy reaktív asztrocitáról. (C-D) Aktivációs protokoll során mért áramok két reprezentatív reaktív sejten (protokoll és oldatok leírását lásd a 10A ábránál). (E) Kis nagyítású fluoreszcens kép a kontroll oldalról. A nyugvó sejtek fluoreszcenciája gyengébb (nyilak). (F) Aktivációs protokoll során mért áram egy reprezentatív kontroll sejten.

47

Cl- és Ca2+ csatornák vizsgálata patkány glomerulóza sejten Mivel laboratóriumunkban két neuroektodermális eredetu sejten - glomus caroticum kemoreceptor sejten (Petheo et al., 2001) és asztrocitán - igazoltuk a pHérzékeny, befelé rektifikáló Cl- áram jelenlétét, megvizsgáltuk, hogy hasonló konduktancia kimutatha tó-e az ezektol jelentosen eltéro, mezodermális eredetu endokrin sejttípuson, a glomerulóza sejten is. Az áram esetleges megjelenését kezdetben teljessejt módszerrel, az asztrocitához hasonló körülmények között (2. ábra) vizsgáltuk. A sejteket –100 mV-os tartófeszültségen tartottuk, és 15 másodpercenként depolarizáló feszültséglépéseket alkalmaztunk 0 mV-ra. A K+ csatornák gátlása érdekében a pipetta oldat Cs+-ot tartalmazott, a külso oldatban pedig 10 mM TEA és 10 mM Ba 2+ volt jelen (ECl-= +2,3 mV). Míg –100 mV-on a befelé rektifikáló Cl- áram esetleges megjelenését vizsgáltuk, a 0 mV-os feszültséglépésen a feszültségfüggo Ca2+ csatornák áramainak alakulását is követni tudtuk (13A ábra, nyilak). A depolarizáló feszültséglépés két befelé irányuló áramot aktivált, melyek az adott kísérleti körülmények között munkacsoportunk korábbi vizsgálatai alapján a T- és L típusú feszültségfüggo Ca2+ csatornákon keresztül folyó Ba 2+-áramnak feleltek meg (148). A feszültséglépés elején gyorsan aktiválódó és inaktiválódó befelé irányuló áram a T áramot, míg a lassan aktiválódó és 1 másodperc alatt jelentos inaktivációt nem mutató áram az L típusú áramot reprezentálja. A teljes-sejt felállásban mindkét áram idoben jelentos lecsengést (run-down) mutatott (13A ábra, n=9). Az asztrocitától eltéroen, a glomerulóza sejten a negatív membránpotenciál tartományban 5 perc alatt nem alakult ki jelentosebb befelé irányuló áramkomponens (13A ábra, n=9). A ClC -2 jellegu áram hiperpolarizáló lépésekkel történo célzott vizsgálata azonban kimutatta, hogy egy kis amplitúdójú áramkomponens mégis jelen van glomerulóza sejten. Ehhez az asztrocitán is alkalmazott aktivációs protokollt használtuk, 1 ? M nifedipin jelenlétében (lásd a 3A ábrát). A 0 mV-ról alkalmazott, erosen hiperpolarizáló feszültséglépések során a sejtek egy részén egy igen lassan aktiválódó, néhány pA nagyságú áramkomponens volt megfigyelheto (13B ábra), a feszültséglépések végén mért áram feszültség-áram összefüggése pedig azt mutatta, hogy –80 mV-nál negatívabb potenciálokon a membrán konduktanciája nagyobb, mint a pozitívabb potenciálokon mérheto érték (13C ábra, n=5).

48

E (mV) -100 100

B

0

10 0 I (pA)

-100 Cl- áram

-300 200 ms

T áram

-30

D -120 E (mV)

-80

-40

-10 -20

ido

0

E (mV) 0 5

-0.2 -0.6

200 ms

-100

0 I (pA)

-400

-120

L áram

0

-200

20

E (mV)

-5

7.4

-10

-1.0

-15

I/I-120

-20

250 ms

6.9

13. ábra. Acidózis-érzékeny befelé rektifikáló áram kimutatása patkány glomerulóza sejten (A) A sejteket –100 mV-os tartófeszültségrol (egy gyors –120 mV-os lépés közbeiktatásával) 1 másodperc hosszan 0 mV-ra depolarizáltuk izozmotikus külso oldatban, 10 mM Ba 2+ jelenlétében (Ba290 oldat). Egy reprezentatív sejten felvett áramgörbék 1, 3 és 5 perccel a mérés kezdete után (n=9). A T- és L típusú áramot, valamint a befelé rektifikáló Cl- áram mérésére alkalmas tartományt nyíllal jelöltük. (B) A 0 mV-os tartófeszültségrol 1 másodperc hosszú feszültséglépéseket alkalmaztunk a –120 - +20 mV-os tartományban 10 másodpercenként (reprezentatív sejt). A külso oldat azonos volt az asztrocita tenyészetnél is használt 7,4-es pHe-jú S2 oldattal. (C) A feszültséglépések végén mért áramértékek a feszültség függvényében, a maximális (–120-on mért) áramra normalizálva (n=5). (D) A befelé rektifikáló áramot 15 másodpercenként 0-ról –100 mV-ra történo hiperpolarizáló feszültséglépésekkel aktiváltuk. Az S2 külso oldat pH-ját 7,4-rol 6,9-re csökkentve a hiperpolarizáció során lassan aktiválódó áram amplitúdója növekedett (reprezentatív sejt).

49

Mivel a kis amplitúdójú áramkomponens jelenléte nem minden sejten volt megbízhatóan megítélheto, megvizsgáltuk, hogy – az asztrocitán mért Cl- áramhoz hasonlóan – növelheto-e a lassan aktiválódó áram acidózis alkalmazásával. Valóban, a pHe-t a kontroll 7,4-rol 6,9-re változtatva a –100 mV-on lassan aktiválódó komponensamplitúdójának reverzibilis növekedését tapasztaltuk 9-bol 7 glomerulóza sejten. A –100 mV-os feszültséglépés végén mért teljes áram amplitúdója szignifikánsan nott –18,4 ± 8,4 pA-rol (pHe 7,4) –23,6 ± 10,5 pA-re (pHe 6,9; n=9). Sejtméretre normalizálva ez –2,7 ± 1,1 pA/pF (pHe 7,4), illetve –3,4 ± 1,4 pA/pF (pHe 6,9) értéknek felel meg. Acidózissal több olyan sejten is kimutathatóvá vált –100 mVon a lassan aktiválódó áram, amelyeken pHe 7,4-en még nem volt nyilvánvaló a komponens jelenléte (13D ábra). Irodalmi adatok szerint mind a befelé rektifikáló Cl- áramok, mind a feszültségfüggo Ca2+ áramok érzékenyek lehetnek a sejttérfogat változásaira. Ezért megvizsgáltuk az ozmotikus változások hatását a glomerulóza sejt Cl- és Ca2+ csatornáira. Ezekhez a mérésekhez a teljes-sejt módszer egyik speciális változatát, az ún. nisztatin-perforált módszert alkalmaztuk (lásd a Módszerek fejezetet). Ennél a technikánál a citoplazma alkotórészeinek kimosódásával kevésbé kell számolni, így az intracelluláris környezet és a sejt metabolikus muködése közelebb áll a fiziológiáshoz, mint a klasszikus teljes-sejt technika esetében. A sejteket –100 mV-ról 15 másodpercenként 1 másodperc hosszan –20 mV-ra depolarizáltuk. A külso- és a pipetta oldatot továbbra is a K+ csatornák gátlására optimalizáltuk, az extracelluláris oldat ozmolaritását pedig szacharóz elvonásával vagy hozzáadásával változtattuk (Ba250-330 oldatok). Amikor a külso oldat ozmolaritását 1 percig a kontroll 290 mOsm-ról 250 mOsm-ra (n=5) vagy 330 mOsm-ra (n=9) változtattuk, a –100 mV-on mért áram nem mutatott szignifikáns változást (14A és 15A ábrák), ami arra utalt, hogy a sejttérfogat változása nem hoz létre gyors aktiváló hatást a befelé rektifikáló Cl- áramra. Hosszabb ozmotikus térfogatváltoztatás hatását rutinszeruen nem tudtuk vizsgálni a pipettamembrán kapcsolat stabilitásának romlása miatt. Megvizsgáltuk a feszültségfüggo Ba 2+ áramok amplitúdójának alakulását is 1 perces hipozmózis hatására. A T típusú áram amplitúdóját a tranziens áram csúcsértékénél határoztuk meg, míg az L típusú áramot a fenntartott áram maximumánál

50

vett 100-150 ms hosszúságú szakasz átlagértékével jellemeztük. Valamennyi vizsgált sejten kimutatható volt a T áram jelenléte, míg az L típusú áram a sejtek 81 %-ában volt megfigyelheto. Az ozmolaritás változtatása után 30 és 60 másodperccel hasonlítottuk össze az áram amplitúdóját a számolt kontroll értékkel. A T típusú áram amplitúdója az ismételt depolarizáló lépések során már izozmotikus (290 mOsm) körülmények között csökkenést mutatott. Az amplitúdó csökkenése az elso depolarizáló lépéshe z képest (IX/I1 ) jól leírható volt az y = 1,008 - 0,361? log10(X) egyenlettel, ahol X a depolarizáló lépés sorszáma. Az egyenletet statisztikai szoftver segítségével (Statistica), 4 független tenyészetbol származó 8 sejten végzett kontroll mérés eredménye alapján illesztettük (r=0,84). A T áram kontroll értékét a késobbi kísérletek során ezen egyenlet alapján extrapolálással számítottuk ki. Mivel az L áram amplitúdója izozmotikus körülmények között nem mutatott konzekvens változást, ennél az áramkomponensné l a kontroll értéknek

az

ozmolaritás

változtatása

elotti

3

depolarizáló

epizód

átlagos

áramamplitúdóját tekintettük. Az ozmolaritás csökkentése 290-rol 250 mOsm-ra mindkét áram amplitúdóját reverzibilisen növelte (14. ábra). A T típusú áram amplitúdója a 60. másodpercben 37,7 ? 17 %-al növekedett (n=5). Az L típusú áram amplitúdója 30 másodperccel a hipozmotikus oldat adása után szintén nott, a sejtek egy részében azonban csak átmeneti jelleggel; 60 másodperccel a stimulus kezdete után már nem volt kimutatható szignifikáns eltérés (n=5). Azonos kísérleti körülmények között a hiperozmózis (330 mOsm) hatására a T típusú áram amplitúdója nem változott szignifikánsan (n=9), bár az oldatcserét követo elso depolarizációs lépés során az áramamplitúdó kis mértéku emelkedését figyeltük meg. Mivel a jelenség közvetlenül az oldatcsere után jelentkezett és átmenetinek bizonyult, ezt az oldatcserével összefüggo muterméknek tekintettük. Ugyanezen sejteken mérve az L áram amplitúdója hiperozmózis hatására szignifikáns, 29 ? 8 %-os csökkenést mutatott egy perccel az ozmolaritás megváltoztatását követoen (n=7; 2 sejten L típusú áram nem volt kimutatható). A hiperozmózis hatása az L áramra általában csak részben volt reverzibilis.

51

C 290

250

290 mOsm

14. ábra. Hipozmózis hatása a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ba 2+ áramaira A sejteket a –100 mV-os tartófeszültségrol 1 másodpercig depolarizáltuk –20 mV-ra 15 másodpercenként, Ba290 külso oldatban. (A) Egy reprezentatív sejt T típusú áramának görbéi kontroll 290 mOsm (a), 250 mOsm hipozmózis (b) és kimosás (c) esetén. A feszültséglépés elso 100 ms-os szakaszát kinagyítva ábrázoltuk. (B) A tranziens áram csúcsértéke az ido függvényében (n=5). Az A ábra görbéinek megfelelo idopontokat bejelöltük. (C) Egy másik reprezentatív sejt L típusú áramá nak görbéi kontroll 290 mOsm (a), 250 mOsm hipozmózis (b) és kimosás (c) esetén. (D) A maximális áram 100 ms alatt mért átlagértéke az ido függvényében (n=5).

52

C 25 ms

-0.6

290

330

290mOsm

15. ábra. Hiperozmózis hatása a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ba 2+ áramaira A protokoll és az oldatok azonosak a 14. ábránál leírtakkal. (A) Egy reprezentatív sejt T árama kontroll 290 mOsm (a), 330 mOsm hiperozmózis (b) és kimosás (c) esetén. A feszültséglépés elso 100 ms-os szakaszát kinagyítva ábrázoltuk. (B) A tranziens áram csúcsértéke az ido függvényében (n=9). Az A ábra görbéinek megfelelo idopontokat bejelöltük. (C) Egy másik reprezentatív sejt L áramának görbéi kontroll 290 mOsm (a), 330 mOsm (b) és kimosás (c) esetén. (D) A maximális áram átlagértéke az ido függvényében (n=7).

53

Ozmolaritás hatása a K+ által kiváltott [Ca 2+]c jelre glomerulóza sejten A feszültségfüggo Ca2+ csatornák alapveto szerepet játszanak a glomerulóza sejt jelátvitelében. Ezért Indo-1 fluoreszcens festék segítségével megvizsgáltuk, hogy az ozmotikus változások feszültségfüggo Ca2+ csatornákra kifejtett hatása okoz-e változást a glomerulóza sejt nyugalmi Ca2+ háztartásában, illetve a fiziológiás mértéku [K +]e emelés által kiváltott [Ca2+]c változásokban. A fiziológiáshoz hasonló összetételu, HEPES-pufferelt extracelluláris oldat ozmolaritásának csökkentése a kontroll 290 mOsm-ról 250 mOsm-ra a vizsgált 25 sejtbol 22-ben nem befolyásolta a sejt [Ca2+]c-ját a hipozmotikus inger elso percében, míg 3 sejten kismértéku [Ca2+]c emelkedést figyeltünk meg. Még hosszantartó, 5 perces ozmotikus stimulus sem hatott a sejtek nyugalmi [Ca2+]c-jára sem hipozmózis (250 mOsm; n=4), sem hiperozmózis (330 mOsm; n=3) alkalmazása esetén (16A és B ábra), noha a sejtek válaszkészsége 8,6 mM K+-ra megtartott volt. Az ozmolaritás hatását a K+ által kiváltott [Ca2+]c jelre azokon a glomerulóza sejteken vizsgáltuk, amelyek a [K +]e 3,6 mM-ról 5 mM-ra történo, 20 másodpercig tartó emelésére jól mérheto [Ca2+]c növekedéssel válaszoltak. Kontroll körülmények között (290 mOsm) ezen sejtekben 5 mM K+ hatására a [Ca2+]c reverzibilisen, 22 ? 6 nM- lal növekedett a nyugalmi 229 ? 38 nM-os értékrol (n=15). A válaszkészség ellenorzése után az ozmolaritást 250 vagy 330 mOsm-ra változtattuk, majd 1 perc inkubáció után a [K +]e-t ismét 5 mM-ra emeltük. Végül a stimulust az izozmotikus kürülmények helyreállítását követoen megismételtük (17A és C ábra). A hipozmotikus oldatban történt [K +]e emelés esetén a kiváltott [Ca2+]c válasz 67 ? 22 nM volt, majd az izozmotikus körülmények helyreállítását követoen 31 ? 9 nM-re tért vissza (17A ábra, n=8). A hipozmózisban kapott [Ca2+]c válasz szignifikánsan nagyobbnak bizonyult mind az elotte, mind az utána izozmotikus körülmények között kapott [Ca2+]c jelnél. Amikor az ozmolaritást azután csökkentettük, hogy 5 mM K+-ra már fenntartott [Ca2+]c emelkedés alakult ki, hipozmózis hatására a [Ca2+]c néhány másodpercen belül további emelkedésnek indult, amely az ozmolaritás helyreállításával reverzibilis volt (17B ábra, n=4). A hipozmózissal ellentétben az ozmolaritás emelése

54

290

250

290

mOsm 8,6 mM K+

1 perc

290

330

290

mOsm 8,6 mM K+

16. ábra. Ozmolaritás hatása a [Ca2+]c-ra egyedi glomerulóza sejten Az ozmotikus koncentrációt az ábrák felso részén tüntettem fel. A [K +]e 3,6 mM-ról 8,6 mM-ra történo emelését piros vonal jelzi. Az extracelluláris oldat ozmolaritását a kontroll 290 mOsm-ról (A) 250 mOsm-ra (n=4), (B) 330 mOsm-ra (n=3) változtattuk. Az 5 perces inkubáció végén a sejtek válaszkészségét 8,6 mM K+ alkalmazásával ellenoriztük.

55

290 250

mOsm + 5 mM K

250

290

mOsm + 5 mM K

17. ábra. Ozmolaritás hatása az 5 mM K+ által kiváltott [Ca2+]c válaszra egyedi glomerulóza sejten Az ozmotikus koncentrációt az ábrák felso részén tüntettem fel. A [K +]e 3,6 mM-ról 5 mM-ra történo emelését piros vonalak jelzik. (A) Hipozmotikus oldattal (250 mOsm) történo elokezelés hatása a K+ által kiváltott [Ca2+]c válaszra (n=8). (B) Hipozmózis (250 mOsm) hatása a K+-os ingerlés közben (n=4). (C) Hiperozmotikus oldattal (330 mOsm) történo elokezelés hatása (n=7).

56

330 mOsm-ra nem befolyásolta szignifikánsan a K+ által kiváltott [Ca2+]c válasz amplitúdóját (17C ábra, n=7).

57

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Az értekezésben bemutatott eredmények alapvetoen két csoportba oszthatóak. Az elso részben szereplo kísérleteimben kimutattam és jellemeztem a befelé rektifikáló, negatív membránpotenciálon muködo anion áramot patkány agykéregbol tenyésztett, valamint egéragyból preparált szeletekben vizsgált asztrocitán, továbbá vizsgáltam az áram szabályozását az asztrocita-környezet változásainak hatására. Kísérleteim második csoportjában tanulmányoztam a patkány mellékvesekérgi glomerulóza sejt nyugalmi anion konduktanciáját, valamint a sejttérfogat változásainak hatását a sejt jelátvitelében szerepet játszó feszültségfüggo Ca2+ csatornákra.

Befelé rektifikáló anion áram kimutatása tenyésztett és in situ vizsgált asztrocitán Az általunk vizsgált befelé rektifikáló anion áram fo elektrofiziológiai és farmakológiai tulajdonságai a következok voltak: az áram –40 mV- nál negatívabb membránpotenciálokra lépve lassan aktiválódott és inaktivációt nem mutatott, ami arra utal, hogy az áram a sejt muködése szempontjából fontos membránpotenciál tartományban tartósan aktív lehet. Gátlószer-érzékenysége megfelelt a hasonló elektrofiziológiai jellegzetességu, irodalomban leírt Cl- csatornákénak. Sajnos, specifikusan erre az áramtípusra ható gátlószert még nem ismerünk, az ismert szerek pedig nemcsak hogy a Cl- csatornák típusai között nem tesznek lényeges különb séget, de más csatornákat és transzportereket is gátolhatnak. Az áram leginkább szelektív gátlószerének jelenleg a 9-AC és az NPPB tekintheto. Asztrocitán hiperpolarizáció-aktivált anion csatornák (és általában nem ligandfüggo anion csatornák) jelenlétérol irodalmi adatok eddig csak tenyésztett sejtbol származtak. Egér agykéregbol tenyésztett sejten egycsatornás méréssel kimutattak egy kis vezetoképességu anion áramot, amely negatív membránpotenciálokon aktiválódott (103). Ferroni és mtsai teljes-sejt és egycsatornás patch-clamp módszerrel szintén megfigyeltek egy kis vezetoképességu, befelé rektifikáló anion áramot olyan, patkány agykéregbol nyert asztrocitákon, melyeket több héten keresztül kezeltek dBcAMP- vel

58

(43, 44, 45). Ez az áram szinte minden tulajdonságában megfelelt az általunk leírt anion áramnak, volt azonban egy lényeges különbség: a mi tenyészeteinkben a sejtek dBcAMP kezelés nélkül is expresszálták az áramot, méghozzá a Ferroni és mtsai által a kezelt sejteken leírthoz hasonló suruséggel (–26 ± 5 pF, illetve –22 ± 11 pA/pF, –120 mV-on). Bár a különbség oka egyelore még nem tisztázott, feltételezzük, hogy a primer kultúránkban jelenlévo neuronok (melyek a másik munkacsoport tenyészetében feltehetoleg nem találhatóak meg) indukálhatták a Cl- csatorna expresszióját sejtjeinken; ezt a hatást Ferroni et al. kísérleteiben a dBcAMP kezelés helyettesíthette. A tenyésztett asztrocitán nyert eredmények azonban csak megkötésekkel vonatkoztathatók in vivo élettani muködésükre, mivel ezek a sejtek általában újszülött, és nem felnott agyból származnak, továbbá a tenyésztés során elveszítik in situ mutatott morfológiai és funkcionális változatosságukat és kapcsolatukat az idegsejtekkel. A befelé rektifikáló Cl- áram azonban vizsgálataink szerint kimutatható felnott egerek agyából származó szeletben vizsgált asztrociták egy csoportjában is, ami igazolja, hogy a csatorna expressziója sejttenyészetben nem mutermék. Az in situ preparátumban az áram denzitása azonban jóval kisebbnek bizonyult, mint a tenyésztett patkány asztrocitán akár általunk (Makara et al., 2001), akár mások (45) által mért érték. Bár ez az eltérés adódhat a fajok különbözoségébol, elképzelheto az is, hogy a tenyésztés során egy eddig ismeretlen hatás eredményeképpen a csatorna aktivitása vagy exp ressziója jelentosen fokozódik a nyugalmi in situ állapothoz képest. Az általunk in situ talált kétféle asztrocita típust már agyszeleten (32, 101, 136) és akutan izolált sejteken (137, 164) végzett vizsgálatok korábban kimutatták. A "passzív" sejt jellemzoen nagy, lineáris K+ konduktanciával rendelkezik, míg a "komplex" sejt különbözo feszültségfüggo csatornákat expresszál. Bár felvetodött, hogy a passzív sejten mért lineáris konduktancia csak az elektrofiziológiai mérések során alkalmazott körülmények, va gy a sejtek egymással való kapcsolódása miatt jelentkezo mutermék jelenség (16, 158), több adat utal arra, hogy valóban két, különbözo tulajdonságokkal rendelkezo típusról van szó. A két sejttípust kimutatták frissen izolált sejten is, ahol a réskapcsolatok nem befolyásolhatták a mérést. Továbbá, frissen izolált és in situ vizsgált asztrocitán egyaránt leírták, hogy glutamát adásakor a komplex sejten kizárólag AMPA receptor mediált áram alakul ki, míg a passzív sejtre glutamát transzporter mediált áram jellemzo, az AMPA receptor mediált áram pedig jóval kisebb,

59

vagy hiányzik (10, 92, 124, 165). Saját megfigyeléseink szintén alátámasztották, hogy a kétféle sejttípus nem mutermék, hiszen a komplex és passzív sejteket morfológiájuk alapján az esetek 80-90 %-ában sikerrel azonosítottuk már a mérés kezdete elott. Noha bizonyos glia progenitor (ún. O-2A) sejtek szintén mutathatnak "komplex" elektrofiziológiai profilt (9), mi kísérleteinkben kizárólag olyan sejteken mértünk, melyek EGFP-t expresszáltak (tehát a GFAP promoter aktív volt), így tehát a vizsgált sejtek asztrocitáknak tekinthetok. A Cl- áram jelenlétét igazoltuk komplex asztrocitán az agy különbözo területein (hippocampusban és kéregben). Passzív asztrocitán nem sikerült olyan kísérleti körülményeket

találni,

amellyel

a

passzív

konduktanciát

kello

mértékben

csökkenthettük volna, így egy kis amplitúdójú Cl- áram komponens rejtve maradhatott. Bár az eddigi, Tg(GFAP/EGFP) egereken végzett kísérletek arra utalnak, hogy az EGFP expressziója nem okoz változást a sejt muködésében, nem szabad figyelmen kívül hagyni. hogy vizsgálatainkban a sejtválasztás az EGFP expresszió alapján történt, ami elvben esetleg vezethetett egy addig nem expresszált csatorna megjelenéséhez. Ennek a valószínusége azonban kicsi, mivel az EGFP expresszáltatása általában más gének kifejezodésének csökkenéséhez, és nem növekedéséhez vezet. Szintén ez ellen szólhat a reaktív asztrocitákon kapott eredmény, ahol a fokozott EGFP expresszió ellenére a hiperpolarizáció-aktivált áram alig volt detektálható, valamint az, hogy az áramot másokkal együtt EGFP-t nem termelo tenyésztett patkány asztrocitákon is kimutattuk.

A befelé rektifikáló Cl- áramot létrehozó csatorna azonosítása Hiperpolarizációra aktiválódó anion áramokat már számos sejtféleségen (köztük emlos sejteken) kimutattak, és ezen áramok kinetikai és farmakológiai tulajdonságait jellemezték (3, 23, 24, 26, 48, 68, 134). A szerzok jelentos része feltételezte, hogy az anion áram létrehozásáért a feszültségfüggo ClC anion csatorna család ClC -2 tagja felelos, amelyet 1992-ben klónoztak (142), és mRNS-ét számos szövetféleségben kimutatták. A feszültségfüggo Cl- csatornák szerkezetének és muködésének vizsgálata az utóbbi években igen érdekes eredményekkel szolgált. Kiderült, hogy ezek a

60

csatornák két fehérjébol álló homodimerek, melyekben az egyes alegységek különálló, saját pórusokat hoznak létre. A pórusok egymástól függetlenül, illetve közös szabályozással is nyílhatnak, vezetoképességük kicsi, néhány pS nagyságrendu (40, 42, 66). A Xenopus oocitában expresszált ClC -2 csatorna tulajdonságai valóban sokban hasonlítanak a szövetbol nyert sejtekéihez, vannak azonban különbségek is. Így pl. natív sejteken az áram aktivációjának küszöbe pozitívabbnak, kinetikája pedig gyorsabbnak bizonyult, mint a klónozott ClC -2 csatorna áramának esetében. Ezeknek a különbségeknek az oka lehet az expressziós rendszer speciális környezete, esetleges további, még ismeretlen alegységek szerepe, a ClC -2 csatorna esetleges hasítási változatai, vagy a ClC -tol független egyéb befelé rektifikáló Cl- csatornák is (65). A kérdés eldöntésére leginkább alkalmas módszer az áram jelenlétének vizsgálata a ClC -2 gén kiütése után. ClC -2 "knock-out " egereket az utóbbi években két munkacsoport is létrehozott (17, 97). Ezen állatok vizsgálata révén néhány sejttípuson, így Leydig és Sertoli sejten, valamint nyálmirigy acinus sejten már bizonyítottá vált, hogy a befelé rektifikáló áram a ClC -2 csatornán keresztül jött létre, mivel a "knock-out" állatból származó sejteken az áram nem volt kimutatható (17, 97). Ugyanakkor plexus choroideus epitél sejten a befelé rektifikáló Cl- áram jelen volt a ClC -2 "knock-out" állatokban is, ami valószínusíti, hogy ebben a sejtféleségben egy, a ClC -2 vel feltehetoleg rokon, de nem azonos szerkezetu csatorna felelos az áram létrehozásáért (133). Kísérleteink során bizonyítottuk, hogy az általunk kimutatott hiperpolarizációaktivált Cl- áram kialakulásáért a ClC -2 anion csatorna felelos, hiszen a ClC -2 gén inaktiválása az áram teljes hiányához vezetett. A ClC -2 fehérje jelenlétét asztrocitában Sík és mtsai (126) immunfestéssel már korábban kimutatták. Nem szabad ugyanakkor figyelmen kívül hagynunk azt a szempontot, hogy a ClC-2 "knock-out" egértörzs genetika háttere különbözo volt, mint a Tg(GFAP/EGFP) törzsé. Így elképzelheto, hogy a ClC -2 áram ugyan jelen van a "knock-out" egértörzs vad típusú egyedeiben, azonban az EGFP-expresszáló egértörzsben kimutatott áram ezzel nem azonos. Ennek igazolása azonban csak EGFP-jelölt ClC -2 knock-outokon lenne kimutatható, amely sajnos nem áll rendelkezésre.

61

Mivel befelé rektifikáló Cl- áram számos sejtféleségen kimutatható és szerepét illetoen sok hipotézis merült fel (lásd késobb), meglepetésként hatott, hogy a ClC -2 csatorna kiütése nem volt letális. Sot, egyelore egyértelmu kóros elváltozásokat a "knock-out" állatokban csak a herében és a retinában mutattak ki: a csatorna hiánya a spermiumképzés zavarához, valamint a fotoreceptor sejtek degenerációjához vezetett (17, 97). Ez alapján úgy tunik, hogy a ClC -2 csatorna elsosorban valamilyen módon a vér-szövet barrierek képzésében részt vevo sejtek muködéséhez szükséges. Bár az említett két közlemény nem számol be drasztikus agyi funkciózavarról a "knock-out" állatoknál, a vér-agy gát képzésében fontos szerepet játszó asztrocita esetében szintén feltételezheto, hogy a csatorna szükséges e sejt élettani muködéséhez. Rendkívül figyelemre méltóak ilyen szempontból Sík és munkatársai immuncitokémiai módszerrel kapott eredményei, melyek szerint a ClC -2 csatorna fehérje nagy denzitással mutatható ki asztrociták végtalpain, különösen azokon, melyek a kapillárisokhoz kapcsolódnak (126). Mindamellett természetesen nem zárható ki, hogy éppen a Cl- áram kritikus fontossága miatt redundáns mechanizmusok alakultak ki a ClC -2 csatorna feladatainak ellátására, amelyek a "knock-out" állatban kompenzálni képesek a csatorna kiesett muködését.

A ClC-2 áram asztrocitában játszott lehetséges szerepe

A) A ClC-2 áram expressziója asztrocitában változik fejlodés és reaktív transzformáció során Az agyszövet mechanikus sértésével modellezheto különbözo agyi sérülések hatása az asztrocita muködésére. A sértés hatására annak környezetében az asztrociták ún. reaktív átalakulása következik be. A reaktív asztrocita GFAP termelése fokozott, mérete nagyobb a nyugvó sejténél, ugyanakkor több tulajdonsága a dedifferenciálódott vagy még nem differenciálódott sejtének felel meg (116). Kísérleteinkben a befelé rektifikáló Cl- áram kifejezodése csökkent reaktív asztrocitán, ami arra utal, hogy az áram jelenléte a nyugvó, differenciált sejt funkcióihoz szükséges. Ezt alátámasztotta az

62

a megfigyelés is, hogy akutan izolált komplex asztrocitán a befelé rektifikáló Cl- áram kifejezodése fokozódik az egyedfejlodés során: 7-8 hetes egerek hippocampusából izolált sejteken az áramkomponens normalizált értéke több mint háromszorosa volt a 18-20 napos állatokból izolált sejtekén mért értéknek (Makara et al., közlésre benyújtott kézirat). Figyelemreméltó,

hogy

az

asztrocita

csatorna- mediált K+ pufferoló

muködésében alapveto fontosságúnak tartott befelé rektifikáló K+ csatornák nagyon hasonló expressziós változást mutatnak a fejlodés és reaktív átalakulás során. A Kir áram denzitása szintén no a születés utáni elso 4 hét során (6, 15, 81), különbözo típusú agyi léziókkal eloidézett reaktív asztrogliózisban pedig a csatorna expressziójának csökkenését találták (33, 122). A Kir áram kifejezodésének változását összefüggésbe hozták azzal, hogy az extracelluláris K+ pufferelésének képessége csak a késoi posztnatális korra fejlodik ki teljesen (64, 81), illetve, hogy ez a funkció romlik az agyi károsodások területén (33). A Kir és a befelé rektifikáló Cl- áram kifejezodésének párhuzamos változása a fejlodés és a sérülésre adott válasz során alátámasztja azt a feltételezést, hogy ez a ClC -2 típusú Cl- csatorna együttmuködik a Kir csatornákkal a K+ és Cl- felvétel- leadás mechanizmusában. Ezt a feltételezést megerosíti az a korábban említett közlemény, mely szerint a ClC -2 csatorna fehérje jelenléte elsosorban az asztrocita kapillárisokhoz kapcsolódó végtalpain mutatható ki (126).

B) A ClC-2 áram szerepe a membránpotenciál alakításában Mint azt a bevezetésben említettem, az asztrocita nyugalmi membránpotenciálja újabb mérések szerint nem normál eloszlást mutat, hanem egy erosen negatív (< ? 60 mV) és egy pozitívabb (~ ? 40 - ? 50 mV) membránpotenciállal rendelkezo sejtcsoport figyelheto meg (95, 164). Míg az egyik vizsgálat szerint a membránpotenciál értéke nem volt kapcsolatba hozható a sejtek alakjával vagy membránjuk nyugalmi ellenállásával (95), addig a másik munkacsoport szerint a pozitívabb nyugalmi potenciál a komplex jelleggel rendelkezo sejtekre jellemzo, míg a passzív sejtek a negatívabb membránpotenciállal rendelkezo sejtcsoportnak felelnek meg (164). Ez utóbbi eredmény jól illeszkedne abba a képbe, mely szerint a passzív sejt lényegesen nagyobb nyugalmi K+ konduktanciával rendelkezik, mint a komplex sejt. Komplex sejten a viszonylag kisebb K+ permeabilitás mellett a depolarizáló jellegu áramok jóval

63

hatékonyabban képesek befolyásolni a nyugalmi membránpotenciál értékét. A komplex sejten a negatív membránpotenciálért felelos K+ áram elsosorban különbözo befelé rektifikáló K+ csatornákon (K ir) keresztül jön létre (32, 123). A befelé rektifikáló Cláram, mivel negatív membránpotenciálon aktív, és kifelé irányuló Cl- áramot hoz létre, megfelelo jelölt lehetne a Kir csatornák ellenében a depolarizáció létrehozására. Passzív asztrocitán nem tudtunk olyan kísérleti körülményeket teremteni, ahol a befelé rektifikáló Cl- áram kimutatható lett volna. Bár nem tudjuk kizárni, hogy ez a sejt is rendelkezik az áramkomponenssel, az mindenesetre valószínusítheto, hogy a K+ permeábilitáshoz képest a Cl- permeábilitás a passzív sejten kisebb, mint a komplex sejten, ami (más mechanizmusokkal együtt) magyarázhatja az eltéro membránpotenciál értékeket a két sejtcsoportban.

C) A ClC-2 áram pHe érzékenysége Irodalmi adatok szerint a pHe változásai befolyásolják a befelé rektifikáló Cláramokat, a különbözo sejteken kapott eredmények azonban nem egybehangzóak. A kísérletek értékelését nehezíti az is, hogy a vizsgálatok többségében a pH változások kívül estek az élettani szempontból releváns tartományon. Míg az extracelluláris acidózis aktiválta az oocitában expresszált ClC -2 áramot (67, 141), a rokon szerkezetu ClC-2G csatornát (139) valamint a meztelen csiga idegsejtjén (23) kimutatott befelé rektifikáló Cl- áramot, ellentétes hatást váltott ki azonban a patkány plexus choroideus sejten mérheto befelé rektifikáló Cl- áramra (68). Ugyanakkor ez utóbbi áramról nemrég bebizonyosodott, hogy nem a ClC -2 csatornán keresztül jött létre (133). Saját kísérleteinkben a patofiziológiás tartományon belül (pH 6,4-7,9) vizsgáltuk meg az extracelluláris pH hatását az asztrocita Cl- áramára. Eredményeink szerint a pH 7,4-rol 6,9-re való változtatása az áram amplitúdójának jelentos növekedését okozza, míg ugyanilyen mértéku, ellentétes irányú pH változtatás az amplitúdó csökkenéséhez vezet. A befelé rektifikáló anion csatorna hasonló, kifejezett pH érzékenységét mutatta ki a fiziológiás pH tartományban munkacsoportunk patkány kemoreceptor sejten (Petheo et al., 2001), ezenkívül Clark és mtsai patkány szimpatikus preganglionáris idegsejten (26). Ezzel foglalkozó kéziratom készítése közben jelent meg egy közlemény, mely

64

dBcAMP-vel kezelt patkány asztrocita tenyészeten a Cl- áram hasonló pH érzékenységét mutatta ki (46). A nyugalmi potenciál közelében aktív, pH érzékeny Cl- áram több szempontból is fontos lehet az asztrocita élettani muködésében. Egyik szerepe lehet az extracelluláris térben bekövetkezo veszélyes mértéku pHe változások elleni védekezés. A bevezetésben leírtak értelmében asztrocitában a Cl- egyensúlyi potenciálja a membránpotenciálnál pozitívabb érték. Az intersticiális pH savanyú irányba tolódása a befelé rektifikáló anion csatornát aktiválva Cl- kiáramláshoz vezethet, ez pedig a Cl-/HCO3 - antiporteren keresztül bikarbonát ionok leadását segítené elo. Amennyiben a csatorna maga is permeábilis HCO3 - -ra, az anion leadása közvetlenül is bekövetkezhet. A szabályozott HCO3 - leadás segíthet kivédeni a pHe változásait. A Cl- áram másik szerepe a neuronaktivitás során az asztrocita citoplazma pHjának (pHi ) szabályozása lehet. Kérgi ingerlés során a pHi lúgosodását mutatták ki asztrocitán (21, 22), a jelenséget pedig a [K +]e emelkedés depolarizáló hatásának tulajdonították (22, 35, 104). A pHi emelkedésének szerepet tulajdonítanak a neuronaktivitás hatására mutatott asztrocita reakciókban: fokozott glukóz metabolizmus, a Kir csatornák aktivitásának növekedése, a réskapcsolatok szabályozása révén a citoplazma lúgosodása ezen reakciók szempontjából kedvezo irányba hathat (18, 34). Pióca óriás glia sejten (35), patkány hippocampus asztrocitán (104) valamint patkány retina glia sejten (99) végzett vizsgálatok alapján a depolarizáció okozta citoplazma lúgosodás elsosorban az elektrogén Na+/HCO3 - szimporter fokozott aktivitásának következményeként alakul ki. Ezen mechanizmusok mellett a befelé rektifikáló Cláram is részt vehet a depolarizáció okozta lúgos pHi kialakításában, mivel pozitívabb membránpotenciálon a Cl- csatorna aktivitása kisebb. Ennek következtében az anion kiáramlás K+ (depolarizáció) hatására csökkenne, ami közvetlenül (HCO3 - leadás) vagy közvetve (Cl- leadás és Cl-/HCO3 - antiporter) nettó pHi emelkedést okozhatna.

D) A ClC-2 csatornát befolyásoló egyéb tényezok esetleges szerepe Az oocytában kifejezett ClC -2 csatorna vizsgálata kezdetben azt mutatta, hogy az áramot aktiváló tényezok közé tartozhat a hipozmózissal eloidézett sejtduzzadás is (54). A sejttérfogat változásainak hatása az áramra nagy érdeklodést váltott ki, és

65

feltételezték, hogy a "tipikus", kifelé rektifikáló térfogat-érzékeny anion áram (VSOAC) mellett a ClC -2 áram is szerepet játszhat a sejttérfogat szabályozásban (138). A kép azonban a natív sejteken nem egyértelmu. A hipozmózis stimuláló hatását a ClC -2 jellegu befelé rektifikáló Cl- áramra néhány sejttípuson és sejtvonalon megerosítették (26, 43, 49, 50), más sejtek esetében azonban éppen ellenkezo hatást mutattak ki: hipozmózis gátolta, hiperozmózis pedig aktiválta az áramot (24, 79). Hasonlóképpen megoszlanak a vélemények arról, hogy részt vesz-e ez az áramkomponens a sejttérfogat szabályozásában. Míg a ClC -2 csatorna hozzájárul a térfogatszabályozáshoz az oocyta expressziós rendszerben vagy pl. hepatoma sejten (50, 117), addig más sejtek esetében eros bizonyítékok szólnak ennek ellenkezoje mellett (14, 97). A hipozmózis serkento hatását a befelé rektifikáló Cl- áramra Ferroni és mtsai kimutatták patkány agykéregbol tenyésztett, dBcAMP-vel kezelt asztrocitán is (43), így az asztrocita esetében is felvetodött, hogy az áramnak szerepe lehet a hipozmotikus duzzadást

követo

regulatórikus

térfogatcsökkenésben.

Ennek

a

hipotézisnek

ellentmondani látszik azonban az, hogy tenyésztett asztrocitán a RVD nem gátolható 9AC-vel, a befelé rektifikáló Cl- csatorna viszonylag szelektív gátlószerével (120). Az eddig említetteken kívül a ClC -2 jellegu áramot aktiválhatja a [Cl-]i emelkedése is (37, 43, 108). Ennek a hatásnak szerepe lehet a Cl- transzportban, illetve a sejtek intracelluláris Cl- koncentrációjának stabilizálásában. Utóbbi funkciót tenyésztett hátsó köteg ganglion neuronon igen meggyozoen bizonyították: a ClC -2 gén expressziójának mértéke meghatározta, hogy a GABAA receptor ingerlése serkento vagy gátló hatású volt (135). A [Cl-]i szabályozó hatását a ClC -2-re asztrocitán is megerosítették (45). Mivel az asztrocita K+ felvétele során megemelkedik a [Cl-]i is (5, 29), a ClC-2 áram erre bekövetkezo növekedése jól beleillik abba a korábban kifejtett elképzelésbe, mely szerint a befelé rektifikáló Cl- áram a nyugalomban lévo területek és kapillárisok felé történo K+ és Cl- szállításban játszhatna fontos szerepet. A befelé rektifikáló Cl- áramok lassú kialakulása, "up-regulációja" a teljes-sejt módszer alkalmazása során felveti, hogy a csatorna valamilyen eddig ismeretlen intracelluláris szabályozás alatt áll. Saját vizsgálatainkban a kialakuló áram amplitúdója nagyobb, aktivációja pedig gyorsabb volt patkány kemoreceptor sejten ATP hiányában (Petheo et al., 2001), ezzel szemben az ATP jelenléte nem befolyásolta ezeket a paramétereket az asztrocita esetében. A különbözo protein kinázok és aktivátoraik

66

csatornára kifejtett hatásait többen vizsgálták (51, 102, 141), az eredmények alapján azonban eddig még nem alakult ki egységes kép a foszforilációs mechanizmusok szerepét illetoen. Amennyiben a vizsgált sejttípusok mindegyikében valóban a ClC -2 csatorna hozza létre az áramot, elképzelheto, hogy a foszforilációs hatások közvetítésében sejtspecifikus járulékos alegységek muködnek közre. Szintén felvetodött az aktin citoszkeleton szerepe a csatorna szabályozásában: a Xenopus oocytában expresszált ClC -2 áram az aktin citoszkeleton szétszakítása következtében növekedett (1).

A glomerulóza sejt nyugalmi anion permeabilitása Ezirányú irodalmi adatok hiányában megvizsgáltuk, hogy a glomerulóza sejt rendelkezik-e ClC-2 típusú, nyugalomban aktív anion áramokkal. Kísérleteinkben sikerült

kimutatni

glomerulóza

hiperpolarizáció-aktivált,

sejten

acidózis-érzékeny

is

az

asztrocitán

áramkomponenst.

találthoz

hasonló,

Bár

általunk

az

kimutatott pH-érzékeny áram amplitúdója kicsi, a sejtméretre normalizálva a –100 mVon pH 7,4 mellett mért teljes áram denzitása (–2,7 ± 1,1 pA/pF, pHe 7,4-en) összevetheto az asztrocitán in situ mért áram denzitásával. Glomerulóza sejten Clkonduktanciát tudomásunk szerint eddig egy munkacsoport írt le: Chorvatova és mtsai szerint ACTH hatására patkány glomerulóza sejten Ras közvetítésével aktiválódik egy kifelé rektifikáló Cl- áram (25). A hipozmózissal és [K +]e emeléssel kiváltott aldoszteron termelés Schneider és mtsai által kimutatott [Cl-]e- függése arra utal, hogy a glomerulóza sejt Cl- háztartása a jelközvetítésben nem hagyható figyelmen kívül (58, 161). A befelé rektifikáló Cl- áram szerepének tisztázása ebben a folyamatban még további vizsgálatokat igényel. A Cl- szabályozó szerepe a hormontermelésre az utóbbi években több szteroid termelo sejten felmerült (30, 38). Leydig sejten például kimutatták egy cAMP által szabályozott, hiperpolarizáció-aktivált Cl- áram jelenlétét (102), amelynek szerepet tulajdonítanak a különbözo ingerek (mint az LH, hCG) hatására létrejövo tesztoszteron termelésben. Mivel az extracelluláris Cl- megvonás csökkenti a szteroid termelés egyik kulcsszereplojének, a StAR fehérjének ("steroidogenic acut regulatory protein") a

67

szintézisét (110), felmerül, hogy a [Cl-]i csökkenése (amely a csatorna aktivációja következtében bekövetkezhet) ezen a mechanizmuson keresztül befolyásolhatja a szteroid termelést.

Sejttérfogat változások hatása a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca2+ csatornáira Eredményeink szerint az extracelluláris ozmolaritás változtatása jelentosen befolyásolja a glomerulóza sejt élettani muködésében alapveto szerepet játszó T- és L típusú feszültségfüggo Ca2+ csatornák amplitúdóját: hipozmózis esetén mindkét áram amplitúdója nott, míg a hiperozmózis az L áramot gátolta. Hasonló hatás az L áramra ismert szív- és simaizomsejten is: extracelluláris hipozmózissal vagy intracelluláris nyomásnöveléssel létrehozott sejttérfogat növekedés az L áram amplitúdójának növekedéséhez vezetett, míg a hiperozmotikus zsugorítás ellentétes hatást okozott (84, 90, 146). Az általunk alkalmazott, emberben kóros állapotokban eloforduló ozmolaritás tartományban (250-330 mOsm) nincs tudomásunk más, feszültségfüggo Ca2+ csatornán végzett hasonló vizsgálatról. A duzzadás valószínuleg mint mechanikus feszülés, a citoszkeleton közvetítésével befolyásolja a Ca2+ csatornák muködését (147), de nem zárható ki az intracelluláris ionkoncentráció- és ionerosség változás szerepe sem. Vizsgálataink szerint a glomerulóza sejt esetében a T és L áramok amplitúdójának növekedése hipozmotikus sejtduzzadás során jól magyarázza a hipozmózis és a [K +]e interakciójának mechanizmusát is. A [Ca2+]c mérése során azt tapasztaltuk ugyanis, hogy míg az ozmolaritás csökkentése önmagában nem váltott ki [Ca2+]c emelkedést, a kismértéku [K +]e emeléssel kiváltott [Ca2+]c választ a hipozmózis (250 mOsm) potencírozta. Hasonló interakciót mutattunk ki az aldoszteron termelés szintjén is (Makara et al., 2000). Mivel a feszültségfüggo Ca2+ csatornák csak depolarizáció esetén aktiválódnak, amennyiben a hipozmózis elsosorban ezen csatornák muködését befolyásolja, de depolarizációt önmagában nem okoz, az ozmolaritás csökkenésének csak a [K +]e emelése során lesz hatása. Nem szabad ugyanakkor figyelmen kívül hagyni, hogy a [Ca2+]c mérése során az extracelluláris pH-t - az irodalomban általánosan alkalmazott módon - HEPES-sel pufferoltuk. Mivel a glomerulóza sejtek rendelkeznek szénsav-anhidráz enzimmel, valamint Na+ /H+ és Cl-

68

/HCO3 - antiporterrel (105, 125), a bikarbonát elhagyása módosíthatja a sejtek H+- és Clháztartását, ez pedig kihatással lehet a duzzadás kapcsán létrejövo sejtfunkcióváltozások (pl. csatorna-aktiválódás) következményeire. Eredményeink csak részben egyeznek az irodalomban korábban publikált mérések adataival. Bár Wang és mtsai szuszpenzióban tartott szarvasmarha glomerulóza sejten hozzánk hasonlóan azt tapasztalták, hogy a [K +]e emelés hatása a [Ca2+]c-ra és az aldoszteron termelésre függ az extracelluláris folyadék ozmolaritásától, az o kísérleteikben az ozmolaritás csökkentése már önmagában is [Ca2+]c jelet és hormon választ hozott létre (160). Ennek az ellentmondásnak az oka lehet a fajok vagy a preparátum különbözosége. A hipozmózis-kiváltotta [Ca2+]c jel az említett közlemény szerint jelentosen kisebb volt, ha a külso térbol elvonták a Ca2+-ot, ami arra enged következtetni, hogy hipozmózis hatására Ca2+ influx következett be (160). Ezzel a mechanizmussal tehát a glomerulóza sejt érzékeny lehet az extracelluláris folyadék ozmolaritásának változásaira. Valóban vannak klinikai megfigyelések és in vivo nyert kísérleti adatok arra nézve, hogy az aldoszteron termelés nem független a plazma ozmolaritásától. Nefrektomizált emberben (93), valamint intakt és nefrektomizált kutyában (94) hemodialízissel kiváltott hiponatrémia során a plazma aldoszteron koncentrációjának emelkedését mérték. Szintén nott az aldoszterontermelés peritoneális dialízissel eloidézett hiponatrémia következtében olyan patkányban, melyben az ACTH szekréciót és a renin-angiotenzin rendszer muködését gyógyszeresen gátolták (131). Amennyiben a renin-angiotenzin rendszer muködését nem gátolták, azt tapasztalták, hogy a plazma aldoszteron koncentráció (PAC) és a plazma renin aktivitás (PRA) hányadosa (PAC/PRA) meredeken emelkedett a plazma [Na+] csökkenésével arányosan a 132-122 mM-os [Na+] tartományban (4), ami arra utalt, hogy hiponatrémia esetén vagy megnott a glomerulóza sejt érzékenysége angiotenzin II-re, vagy pedig valamilyen egyéb tényezo serkentette az aldoszteron termelést. Végül, vízmegvonással eloidézett dehidráció hatására kutyán megfigyelték, hogy noha a PRA növekedett, a PAC azonban nem változott (166). Noha ebben a vizsgálatban a K+ vesztés is eloidézhette a PAC várt növekedésének elmaradását, a szerzok arra a következtetésre jutottak, hogy valószínuleg a dehidrációval járó hipernatrémia vagy hiperozmózis csökkentette a mellékvesekéreg érzékenységét angiotenzin II-re.

69

A duzzadás serkento hatása a feszültségfüggo Ca2+ csatornák amplitúdójára azonban nem csak a plazma ozmolaritás változásainak érzékelése szempontjából lehet érdekes, hanem a K+ aldoszteron termelésre kifejtett hatása szempontjából is. A glomerulóza sejt térfogata Schneider és mtsai kísérletei szerint szuprafiziológiás [K +]e emelés (7 illetve 10 mM) hatására növekedett (57). A [K +]e sejttérfogatnövelo hatását kimutattak már többek között tenyésztett asztrocitán (78), vese tubulus sejten (121) vagy vesztibuláris epitél sejten (162) is, igaz, jóval magasabb koncentrációkat alkalmazva. Amennyiben a K+, illetve a hipozmózis által létrehozott sejttérfogat növekedés egyaránt növeli a feszültségfüggo Ca2+ áramok amplitúdóját, a K+ által kiváltott duzzadás is növelheti a K+-ra kapott Ca2+ válasz nagyságát, s ezáltal a sejttérfogatváltozás

hozzájárulhat

a

glomerulóza

sejtek

nagyfokú

[K +]e-

érzékenységének kialakulásához.

Eredményeinket összefoglalva a következok állapíthatók meg:

1. Neuronnal együtt tenyésztett patkány agykérgi asztrocitán kimutatható egy befelé rektifikáló, negatív membránpotenciál tartományban aktív, anion szelektív áram, amely ismert Cl- csatorna blokkolókkal gátolható. 2. Az anion áram aktiválható extracelluláris acidózissal és gátolható alkalózissal az in vivo körülmények között eloforduló pHe tartományban (pH 6,9-7,9). 3. Az áram aktivitása nem függ az intracelluláris ATP-tol. 4. Hasonló

tulajdonságokkal

rendelkezo

áram

kimutatható

egér

agyszelet

hippocampusban és kéregben in situ vizsgált asztrociták egyik altípusán, a komplex asztrocitán. 5. In situ vizsgált komplex asztrocitán az áram denzitása lényegesen kisebb, mint a neuronnal együtt hosszan tenyésztett asztrocitán. 6. A komplex asztrocitán mérheto áram a ClC -2 klorid csatornán keresztül jön létre. 7. A Cl- áram expressziója csökken in situ reaktív transzformáción átment komplex asztrocitán. 8. Az asztrocitán kimutatotthoz hasonló, pH-érzékeny befelé rektifikáló áram jelen van patkány zóna glomerulóza sejten is.

70

9. Hipozmózissal eloidézett sejtduzzadás hatására a glomerulóza sejt feszültségfüggo Ca2+ csatornáin keresztül folyó áram amplitúdója no. 10. Glomerulóza sejten az 5 mM K+ által kiváltott [Ca2+]c jel amplitúdója hipozmotikus oldatban (250 mOsm) nagyobb, mint izozmotikus (290 mOsm) oldatban.

71

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

4-AP 9-AC ATP BPO BSA [Ca2+]c cAMP [Cl-]e [Cl-]i ClC dBcAMP DIDS DMEM DMSO EGFP Em Erev GFAP HEPES Ih [K +]e KIR Kir KRHG NE NMDG pHe pHi PAC PIPES PRA RVD SITS TEA VSOAC

4-aminopiridin antracén-9-karboxisav adenozin- trifoszfát bikarbonát-pufferelt oldat "bovine serum albumin"; szarvasmarha szérum albumin citoplazma Ca2+ koncentráció ciklikus adenozin- monofoszfát extracelluláris Cl- koncentráció intracelluláris Cl- koncentráció "chloride channel"; klorid csatorna dibutiril-ciklikus-AMP 4, 4-diisotiocianostilbén-2,2'-diszulfonsav Dulbeccos’s modified Eagle’s medium dimetil-szulfoxid "enhanced green fluorescent protein"; felerosített zöld fluoreszcens fehérje membránpotenciál megfordulási potenciál "glial fibrillary acidic protein"; gliális fibrilláris savas fehérje N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etánszulfonsav) hiperpolarizáció-aktivált egyértéku kation áram extracelluláris K+ koncentráció központi idegrendszer befelé rektifikáló (inwardly rectifying) K+ csatona/áram Krebs-Ringer-HEPES- glukóz nemzetközi egység N-metil- D-glukamin extracelluláris pH citoplazma/intracelluláris pH plazma aldoszteron koncentráció 1,4-piperazindietánszulfonsav plazma renin aktivitás "regulatory volume decrease", regulatórikus térfogatcsökkenés 4-acetamido-4(')- isotiociano-2,2(')-diszulfonsav stilbén tetraetilammónium "volume sensitive organic osmolyte and anion channel"; térfogat-érzékeny szerves ozmolit és anion csatorna

72

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Mindenekelott

szeretném

megköszönni

témavezetomnek,

Spät

András

professzor úrnak, hogy diákkörösként bekapcsolódhattam a laboratóriumában folyó tudományos munkába, majd kezdo kutatóként munkacsoportjába vett. Köszönöm neki, hogy a tudomány iránti érdeklodésemet megerosítette, lehetoséget adott ötleteim önálló megvalósításához, miközben tanácsaival, kritikai meglátásaival és mindig igényességre törekvo hozzáállásával végig segítette és irányította munkámat. Köszönöm közvetlen munkatársamnak, Dr. Petheo Gábornak, hogy ötleteivel, tanácsaival, gyakorlati tapasztalatával folyamatosan segítette kutatásaimat, és hogy az együtt töltött évek során olyan baráti hangulat alakult ki a laborban, amelyben mindig kellemes volt dolgozni. Szintén köszönettel tartozom kutatótársaimnak, Dr. Molnár Zoltánnak, Dr. Deák Ferencnek, Dr. Pitter Jánosnak és Dr. Szabadkai Györgynek, akikhez mindig fordulhattam problémáimmal, és sok ötlettel járultak hozzá kísérleteim sikeréhez. Köszönöm laborunk asszisztensnoinek, Rajki Anikónak és Horváth Erzsébetnek, hogy igényes és áldozatos munkájukkal kutatásaimhoz folyamatosan hátteret biztosítottak. Köszönöm továbbá Dr. Tóth Attilának, hogy lelkes diákkörös hallgatóként hozzájárult a kísérletek elvégzéséhez. Hálával tartozom Dr. Várnai Péternek, aki tudományos diákköri témavezetoként felügyelte tevékenységemet és útmutatással szolgált számomra. Köszönöm továbbá Dr. Enyedi Péternek és Kovács Erikának, valamint Dr. Madarász Emíliának néhány konkrét kísérletben való közremuködését. Szintén köszönöm az Élettani Intézet valamennyi munkatársának, hogy a mindennapi életben és a szakmai munkában segítséget nyújtottak. Köszönettel tartozom a berlini Max Delbrück Centre for Molecular Medicine munkatársainak, Dr. Helmut Kettenmannak, Angelika Rappertnek és Dr. Christiane Nolténak, hogy az in situ asztrocita méréseket lehetové tették és teljes köruen támogatták. Végül, de nem utolsósorban, szeretettel köszönöm szüleimnek, hogy mindig mellettem álltak, és odaadó támogatásukkal lehetové tették, hogy nyugodt körülmények között foglalkozhassam munkámmal.

73

IRODALOMJEGYZÉK

1.

Ahmed N, Ramjeesingh M, Wong S, Varga A, Garami E, Bear CE. (2000) Chloride channel activity of ClC -2 is modified by the actin cytoskeleton. Biochem J 352:789-794.

2.

Araque A, Carmignoto G, Haydon PG. (2001) Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol 63:795-813.

3.

Arreola J, Park K, Melvin JE, Begenisich T. (1996) Three distinct chloride channels control anion movements in rat parotid acina r cells. J Physiol Lond 490:351-362.

4.

Balla T, Nagy K, Tarján E, Renczes G, Spät A. (1981) Effect of reduced extracellular sodium concentration on the function of adrenal zona glomerulosa: studies in conscious rats. J Endocrinol 89:411-416.

5.

Ballanyi K, Grafe P, ten Bruggencate G. (1987) Ion activities and potassium uptake mechanisms of glial cells in guinea-pig olfactory cortex slices. J Physiol Lond 382:159-174.

6.

Barres BA, Koroshetz WJ, Chun LL, Corey DP. (1990) Ion channel expression by white matter glia: the type-1 astrocyte. Neuron 5:527-544.

7.

Bekar LK, Walz W. (1999) Evidence for chloride ions as intracellular messenger substances in astrocytes. J Neurophysiol 82:248-254.

8.

Bekar LK, Walz W. (2002) Intracellular chloride modulates A-type potassium currents in astrocytes. Glia 39:207-216.

9.

Berger T, Schnitzer J, Kettenmann H. (1991) Developmental changes in the membrane current pattern, K+ buffer capacity and morphology of glial cells in the corpus callosum slice. J Neurosci 11: 3008-3024.

10.

Bergles DE, Jahr CE. (1997) Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron 19:1297-1308.

11.

Bernstein M, Lyons SA, Moller T, Kettenmann H. (1996) Receptor- mediated calcium signalling in glial cells from mouse corpus callosum slices. J Neurosci Res 46:152-163.

12.

Bevan S, Chiu SY, Gray PT, Ritchie JM. (1985) The presence of voltage-gated sodium, potassium and chloride channels in rat cultured astrocytes. Proc R Soc Lond B Biol Sci 225:299-313.

74

13.

Bevensee MO, Apkon M, Boron WF. (1997) Intracellular pH regulation in cultured astrocytes from rat hippocampus. II. Electrogenic Na/HCO3 cotransport. J Gen Physiol 110:467-483.

14.

Bond TD, Ambikapathy S, Mohammad S, Valverde MA. (1998) Osmosensitive C1- currents and their relevance to regulatory volume decrease in human intestinal T84 cells: outwardly vs. inwardly rectifying currents. J Physiol Lond 511:45-54.

15.

Bordey A, Sontheimer H. (1997) Postnatal development of ionic currents in rat hippocampal astrocytes in situ. J Neurophysiol 78:461-477.

16.

Bordey A, Sontheimer H. (1998) Passive glial cells, fact or artifact? J Membrane Biol 166:213-222.

17.

Bosl MR, Stein V, Hubner C, Zdebik AA, Jordt SE, Mukhopadhyay AK, Davidoff MS, Holstein AF, Jentsch TJ. (2001) Male germ cells and photoreceptors, both dependent on close cell-cell interactions, degenerate upon ClC-2 Cl- channel disruption. EMBO J 20:1289-1299.

18.

Brookes N. (1997) Intracellular pH as a regulatory signal in astrocyte metabolism. Glia 21:64-73.

19.

Chesler M. (1990) The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol 34:401-427.

20.

Chesler M, Kaila K. (1992) Modulation of pH by neuronal activity. Trends Neurosci 15:396-402.

21.

Chesler M, Kraig RP. (1987) Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation. Am J Physio l 253:R666-R670.

22.

Chesler M, Kraig RP. (1989) Intracellular pH transients of mammalian astrocytes. J Neurosci 9:2011-2019.

23.

Chesnoy-Marchais D. (1983) Characterization of a chloride conductance activated by hyperpolarization in Aplysia neurones. J Physiol Lond 342:277308.

24.

Chesnoy-Marchais D, Fritsch J. (1994) Activation of hyperpolarization and atypical osmosensitivity of a Cl- current in rat osteoblastic cells. J Membr Biol 140:173-188.

25.

Chorvatova A, Gendron L, Bilodeau L, Gallo-Payet N, Payet MD. (2000) A Ras-dependent chloride current activated by adrenocorticotropin in rat adrenal zona glomerulosa cells. Endocrinology 141:684-692.

75

26.

Clark S, Jordt SE, Jentsch TJ, Mathie A. (1998) Characterization of the hyperpolarization-activated chloride current in dissociated rat sympathetic neurons. J Physiol Lond 506:665-678.

27.

Clausen T. (1992) Potassium and sodium transport and pH regulation. Can J Physiol Pharmacol 70, Suppl. S219-S222.

28.

Cohen CJ, McCarthy RT, Barrett PQ, Rasmussen H. (1988) Ca channels in adrena l glomerulosa cells: K+ and angiotensin II increase T-type Ca channel current. Proc Natl Acad Sci U S A 85:2412-2416.

29.

Coles JA, Orkand RK, Yamate CL. (1989) Chloride enters glial cells and photoreceptors in response to light stimulation in the retina of the honey bee drone. Glia 2:287-297.

30.

Cooke BA, Ashford L, Abayasekara DR, Choi M. (1999) The role of chloride ions in the regulation of steroidogenesis in rat Leydig cells and adrenal cells. J Steroid Biochem Mol Biol 69:359-365.

31.

Crepel V, Panenka W, Kelly ME, MacVicar BA. (1998) Mitogen-activated protein and tyrosine kinases in the activation of astrocyte volume-activated chloride current. J Neurosci 18:1196-1206.

32.

D'Ambrosio R, Wenzel J, Schwartzkroin PA, McKhann GM, Janigro D. (1998) Functional specialization and topographic segregation of hippocampal astrocytes. J Neurosci 18:4425-4438.

33.

D'Ambrosio R, Maris DO, Grady MS, Winn HR, Janigro D. (1999) Impaired K+ homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J Neurosci 19:8152-8162.

34.

Deitmer JW, Rose CR. (1996) pH regulation and proton signalling by glial cells. Prog Neurobiol 48:73-103.

35.

Deitmer JW, Szatkowski M. (1990) Membrane potential dependence of intracellular pH regulation by identified glial cells in the leech central nervous system. J Physiol Lond 421:617-631.

36.

Dermietzel R, Hwang TK, Buettner R, Hofer A, Dotzler E, Kremer M, Deutzmann R, Thinnes FP, Fishman GI, Spray DC, Siemen D. (1994) Cloning and in situ localization of a brain-derived porin that constitutes a largeconductance anion channel in astrocytic plasma membranes. Proc Natl Acad Sci U S A 91:499-503.

37.

Dinudom A, Young JA, Cook DI. (1993) Na+ and Cl- conductances are controlled by cytosolic Cl- concentration in the intralobular duct cells of mouse mandibular glands. J Membr Biol 135:289-295.

76

38.

Dupre-Aucouturier S, Penhoat A, Rougier O, Bilbaut A. (2002) ACTH- induced Cl- current in bovine adrenocortical cells: correlation with cortisol secretion. Am J Physiol 282:E355-E365.

39.

Durroux T, Gallo-Payet N, Payet MD. (1988) Three components of the calcium current in cultured glomerulosa cells from rat adrenal gland. J Physiol Lond 404:713-729.

40.

Dutzler R, Campbell EB, Cadene M, Chait BT, MacKinnon R. (2002) X-ray structure of a ClC chloride channel at 3.0 A reveals the molecular basis of anion selectivity. Nature 415:287-294.

41.

Eriksson PS, Nilsson M, Wagberg M, Ronnback L, Hansson E. (1992) Volume regulation of single astroglial cells in primary culture. Neurosci Lett 143:195199.

42.

Estevez R, Jentsch T. (2002) CLC chloride channels: correlating structure with function. Curr Opin Struct Biol 12:531-539.

43.

Fava M, Ferroni S, Nobile M. (2001) Osmosensitivity of an inwardly rectifying chloride current revealed by whole-cell and perforated-patch recordings in cultured rat cortical astrocytes. FEBS Lett 492:78-83.

44.

Ferroni S, Marchini C, Schubert P, Rapisarda C. (1995) Two distinct inwardly rectifying conductances are expressed in long term dibutyryl-cyclic-AMP treated rat cultured cortical astrocytes. FEBS Lett 367:319-325.

45.

Ferroni S, Marchini C, Nobile M, Rapisarda C. (1997) Characterization of an inwardly rectifying chloride conductance expressed by cultured rat cortical astrocytes. Glia 21:217-227.

46.

Ferroni S, Nobile M, Caprini M, Rapisarda C. (2000) pH modulation of an inward rectifier chloride current in cultured rat cortical astrocytes. Neuroscience 100:431-438.

47.

Fraser DD, Duffy S, Angelides KJ, Perez-Velazquez JL, Kettenmann H, MacVicar BA. (1995) GABAA/benzodiazepine receptors in acutely isolated hippocampal astrocytes. J Neurosci 15:2720-2732.

48.

Fritsch J, Edelman A. (1996) Modulation of the hyperpolarization-activated Clcurrent in human intestinal T84 epithelial cells by phosphorylation. J Physiol Lond 490:115-128.

49.

Fritsch J, Edelman A. (1997) Osmosens itivity of the hyperpolarization-activated chloride current in human intestinal T84 cells. Am J Physiol 272:C778-C786.

77

50.

Furukawa T, Ogura T, Katayama Y, Hiraoka M. (1998) Characteristics of rabbit ClC-2 current expressed in Xenopus oocytes and its contribution to volume regulation. Am J Physiol 274:C500-C512.

51.

Furukawa T, Ogura T, Zheng YJ, Tsuchiya H, Nakaya H, Katayama Y, Inagaki N. (2002) Phosphorylation and functional regulation of ClC -2 chloride channels expressed in Xenopus oocytes by M cyclin-dependent protein kinase. J Physiol Lond 540:883-893.

52.

Gentles SJ, Oliet SHR, Drapeau P, Bourque CW. (1995) Lack of acute volume regulation in supraoptic nucleus (SON) neurons isolated from the adult rat. Soc Neurosci (abstract) 21:876.

53.

Gray PT, Ritchie JM. (1986) A voltage-gated chloride conductance in rat cultured astrocytes. Proc R Soc Lond B Biol Sci 228:267-288.

54.

Gründer S, Thiemann A, Pusch M, Jentsch TJ. (1992) Regions involved in the opening of CIC-2 chloride channel by voltage and cell volume. Nature 360:759762.

55.

Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260:3440-3450.

56.

Guatteo E, Stanness KA, Janigro D. (1996) Hyperpolarization-activated ion currents in cultured rat cortical and spinal cord astrocytes. Glia 16:196-209.

57.

Hayama N, Wang W, Robinson TV, Kramer RE, Schneider EG. (1993) Osmolality and potassium cause alterations in the volume of glomerulosa cells. Endocrinology 132:1230-1234.

58.

Hayama N, Wang W, Schneider EG. (1995) Osmolality- induced changes in aldosterone secretion involve a chloride-dependent process. Am J Physiol 268:R8-R13.

59.

Hille B. (1992) Ionic channels of excitable membranes. (Sinauer Associates Inc., Sunderland, MA, USA)

60.

Hoffmann EK, Dunham PB. (1995) Membrane mechanisms and intracellular signalling in cell volume regulation. Int Rev Cytol 161:173-262.

61.

Hunyady L, Rohács T, Bagó A, Deák F, Spät A. (1994) Dihydropyridinesensitive initial component of the ANG II- induced Ca2+ response in rat adrenal glomerulosa cells. Am J Physiol 266:C67-C72.

62.

Hussy N, Deleuze C, Bres V, Moos FC. (2000) New role of taurine as an osmomediator between glial cells and neurons in the rat supraoptic nucleus. Adv Exp Med Biol 483:227-237.

78

63.

Jalonen T. (1993) Single-channel characteristics of the large-conductance anion channel in rat cortical astrocytes in primary culture. Glia 9:227-237.

64.

Jendelova P, Sykova E. (1991) Role of glia in K+ and pH homeostasis in the neonatal rat spinal cord. Glia 4:56-63.

65.

Jentsch TJ, Stein V, Weinreich F, Zdebik AA. (2002a) Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev 82:503-568.

66.

Jentsch TJ. (2002b) Chloride channels are different. Nature 415:276-277.

67.

Jordt SE, Jentsch TJ. (1997) Molecular dissection of gating in the ClC -2 chloride channel. EMBO J 16:1582-1592.

68.

Kajita H, Brown PD. (1997) Inhibition of the inward-rectifying Cl- channel in rat choroid plexus by a decrease in extracellular pH. J Physiol Lond 498:703-707.

69.

Kettenmann H, Backus KH, Schachner M. (1984) Aspartate, glutamate and gamma-aminobutyric acid depolarize cultured astrocytes. Neurosci Lett 52:2529.

70.

Kettenmann H. (1987) K+ and Cl- uptake by cultured oligodendrocytes. Can J Physiol Pharmacol 65:1033-1037.

71.

Kettenmann H. (1990) Chloride channels and carriers in cultured glial cells. Chloride Channels and Carriers in Nerve, Muscle and Glial Cells (szerk. Alvarez-Leefmans FJ és Russel JM) pp. 193-208.

72.

Kimelberg HK. (1981) Active accumulation and exchange transport of chloride in astroglial cells in culture. Biochim Biophys Acta 646:179-184.

73.

Kimelberg HK, Hirata H, Bowman CL, Mazurkiewicz J. (1982) Effects of K+, Na+ and Cl- on membrane potentials and I-V curves of primary astrocyte cultures. Soc Neurosci (abstract) 8:238.

74.

Kimelberg HK, Bowman CL, Hirata H. (1986) Anion transport in astrocytes. Ann N Y Acad Sci 481:334-353.

75.

Kimelberg HK. (1987) Anisotonic media and glutamate- induced ion transport and volume responses in primary astrocyte cultures. J Physiol Paris 82:294-303.

76.

Kimelberg HK. (1990) Chloride transport across glial membranes. Chloride Channels and Carriers in Nerve, Muscle and Glial Cells (szerk. AlvarezLeefmans FJ és Russel JM) pp. 159-192.

77.

Kimelberg HK, Goderie SK, Higman S, Pang S, Waniewski RA. (1990) Swelling- induced release of glutamate, aspartate, and taurine from astrocyte cultures. J Neurosci 10:1583-1591.

79

78.

Kimelberg HK. (1995) Brain edema. Neuroglia (szerk. Kettenmann H és Ransom BR, Oxford University Press, UK) pp. 919-935.

79.

Komwatana P, Dinudom A, Young JA, Cook DI. (1995) Osmotic sensitivity of the hyperpolarization-activated Cl- current in mouse mandibular duct cells. Cell Physiol Biochem 5:243-251.

80.

Kraig RP, Pulsinelli WA, Plum F. (1985) Hydrogen ion buffering during complete brain ischemia. Brain Res 342:281-290.

81.

Kressin K, Kuprijanova E, Jabs R, Seifert G, Steinhäuser C. (1995) Developmental regulation of Na+ and K+ conductances in glial cells of mouse hippocampal brain slices. Glia 15:173-187.

82.

Kuffler SW, Nicholls JG, Orkand RK. (1966) Physiological properties of glial cells in the central nervous system of amphibia. J Neurophysiol 29:768-787.

83.

Kuffler SW. (1967) Neuroglial cells: physiological properties and a potassium mediated effect of neuronal activity on the glial membrane potential. Proc R Soc Lond B Biol Sci 168:1-21.

84.

Langton PD. (1993) Calcium channel currents recorded from isolated myocytes of rat basilar artery are stretch sensitive. J Physiol Lond 471:1-11.

85.

Largo C, Cuevas P, Somjen GG, Martin del Rio R, Herreras O. (1996) The effect of depressing glial function in rat brain in situ on ion homeostasis, synaptic transmission, and neuron survival. J Neurosci 16:1219-1229.

86.

Lascola CD, Kraig RP. (1996) Whole-cell chloride currents in rat astrocytes accompany changes in cell morphology. J Neurosci 16:2532-2545.

87.

Lascola CD, Nelson DJ, Kraig RP. (1998) Cytoskeletal actin gates a Cl- channel in neocortical astrocytes. J Neurosci 18:1679-1692.

88.

Lotshaw DP. (2001) Role of membrane depolarization and T-type Ca2+ channels in angiotensin II and K+ stimulated aldosterone secretion. Mol Cell Endocrinol 175:157-171.

89.

MacVicar BA, Tse FW, Crichton SA, Kettenmann H. (1989) GABA-activated Cl- channels in astrocytes of hippocampal slices. J Neurosci 9:3577-3583.

90.

Matsuda N, Hagiwara N, Shoda M, Kasanuki H, Hosoda S. (1996) Enhancement of the L-type Ca2+ current by mechanical stimulation in single rabbit cardiac myocytes. Circ Res 78:650-659. Matsunaga H, Maruyama Y, Kojima I, Hoshi T. (1987) Transient Ca2+-channel current characterized by a low-threshold voltage in zo na glomerulosa cells of rat adrenal cortex. Pflügers Arch 408:351-355.

91.

80

92.

Matthias K, Kirchhoff F, Seifert G, Hüttmann K, Matyash M, Kettenmann H, Steinhäuser C. Segregated expression of functional glutamate receptors and transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. (közlésre benyújtva, J Neurosci)

93.

McCaa RE, Bower JD, McCaa CS. (1973) Relative influence of acute sodium and volume depletion on aldosterone secretion in nephrectomized man. Circ Res 33:555-562.

94.

McCaa RE, Young DB, Guyton AC, McCaa CS. (1974) Evidence for a role of an unidentified pituitary factor in regulating aldosterone secretion during altered sodium balance. Circ Res 34-35:I15-25.

95.

McKhann GM II, D'Ambrosio R, Janigro D. (1997) Heterogeneity of astrocyte resting membrane potentials and intercellular coupling revealed by whole-cell and gramicidin-perforated patch recordings from cultured neocortical and hippocampal slice astrocytes. J Neurosci 17:6850-6863.

96.

Mongin AA, Reddi JM, Charniga C, Kimelberg HK. (1999) [3 H]taurine and D[3 H]aspartate release from astrocyte cultures are differently regulated by tyrosine kinases. Am J Physiol 276:C1226-C1230.

97.

Nehrke K, Arreola J, Nguyen HV, Pilato J, Richardson L, Okunade G, Baggs R, Shull GE, Melvin JE. (2002) Loss of hyperpolarization-activated Cl- current in salivary acinar cells from Clcn2 knockout mice. J Biol Chem 277:23604-23611.

98.

Newman E, Reichenbach A. (1996) The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci 19:307-312.

99.

Newman EA. (1999) Sodium-bicarbonate cotransport in retinal astrocytes and Müller cells of the rat. Glia 26:302-308.

100.

Nilius B, Eggermont J, Voets T, Droogmans G. (1996) Volume-activated Clchannels. Gen Pharmacol 27:1131-1140.

101.

Nolte C, Matyash M, Pivneva T, Schipke CG, Ohlemeyer C, Hanisch UK, Kirchhoff F, Kettenmann H. (2001) GFAP promoter-controlled EGFPexpressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia 33:72-86.

102.

Noulin JF, Joffre M. (1993) Characterization and cyclic AMP-dependence of a hyperpolarization-activated chloride conductance in Leydig cells from mature rat testis. J Membr Biol 133:1-15. Nowak L, Ascher P, Berwald NY. (1987) Ionic channels in mouse astrocytes in culture. J Neurosci 7:101-109.

103.

81

104.

Pappas CA, Ransom BR. (1994) Depolarization- induced alkalinization (DIA) in rat hippocampal astrocytes. J Neurophysiol 72:2816-2826.

105.

Parkkila AK, Parkkila S, Juvonen T, Rajaniemi H. (1993) Carbonic anhydrase isoenzymes II and I are present in the zona glomerulosa cells of the human adrenal gland. Histochemistry 99:37-41.

106.

Pasantes-Morales H, Murray RA, Lilja L, Moran J. (1994) Regulatory volume decrease in cultured astrocytes. I. Potassium- and chloride-activated permeability. Am J Physiol 266:C165-C171.

107.

Pasantes-Morales H, Franco R, Torres-Marquez ME, Hernandez-Fonseca K, Ortega A. (2000) Amino acid osmolytes in regulatory volume decrease and isovolumetric regulation in brain cells: contribution and mechanisms. Cell Physiol Biochem 10:361-370.

108.

Pusch M, Jordt SE, Stein V, Jentsch TJ. (1999) Chloride dependence of hyperpolarization-activated chloride channel gates. J Physiol Lond 515:341-353.

109.

Quinn SJ, Cornwall MC, Williams GH. (1987) Electrical properties of isolated rat adrenal glomerulosa and fasciculata cells. Endocrinology 120:903-914.

110.

Ramnath HI, Peterson S, Michael AE, Stocco DM, Cooke BA. (1997) Modulation of steroidogenesis by chloride ions in MA-10 mouse tumor Leydig cells: roles of calcium, protein synthesis, and the steroidogenic acute regulatory protein. Endocrinology 138:2308-2314.

111.

Ransom BR. (1995) Gap junctions. Neuroglia (szerk. Kettenmann H és Ransom BR, Oxford University Press, UK) pp. 299-318.

112.

Ransom BR, Carlini WG, Connors BW. (1986) Brain extracellular space: developmental studies in rat optic nerve. Ann N Y Acad Sci 481:87-105.

113.

Ransom BR, Goldring S. (1973) Ionic determinants of membrane potential of cells presumed to be glia in cerebral cortex of cat. J Neurophysiol 36:855-868.

114.

Ransom CB, O'Neal JT, Sontheimer H. (2001) Volume-activated chloride currents contribute to the resting conductance and invasive migration of human glioma cells. J Neurosci 21:7674-7683.

115.

Rice ME, Nicholson C. (1988) Behavior of extracellular K+ and pH in skate (Raja erinacea) cerebellum. Brain Res 461:328-334.

116.

Ridet JL, Malhotra SK, Privat A, Gage FH. (1997) Reactive astrocytes: cellular and molecular cues to biological function. Trends Neurosci 20:570-577. Roman RM, Smith RL, Feranchak AP, Clayton GH, Doctor RB, Fitz JG. (2001) ClC-2 chloride channels contribute to HTC cell volume homeostasis. Am J Physiol 280:G344-G353.

117.

82

118.

Rose CR, Deitmer JW. (1994) Evidence that glial cells modulate extracellular pH transients induced by neuronal activity in the leech central nervous system. J Physiol Lond 481:1-5.

119.

Rutledge EM, Aschner M, Kimelberg HK. (1998) Pharmacological characterization of swelling- induced D-[3 H]aspartate release from primary astrocyte cultures. Am J Physiol 274:C1511-C1520.

120.

Sanchez-Olea R, Pena C, Moran J, Pasantes-Morales H. (1993) Inhibition of volume regulation and efflux of osmoregulatory amino acids by blockers of Cltransport in cultured astrocytes. Neurosci Lett 156:141-144.

121.

Schild L, Aronson PS, Giebisch G. (1991) Basolateral transport pathways for K+ and Cl- in rabbit proximal tubule: effects on cell volume. Am J Physiol 260:F101-F109.

122.

Schröder W, Hager G, Kouprijanova E, Weber M, Schmitt AB, Seifert G, Steinhäuser C. (1999) Lesion- induced changes of electrophysiological properties in astrocytes of the rat dentate gyrus. Glia 28:166-174.

123.

Schröder W, Seifert G, Hüttmann K, Hinterkeuser S, Steinhäuser C. (2002) AMPA receptor- mediated modulation of inward rectifier K+ channels in astrocytes of mouse hippocampus. Mol Cell Neurosci 19:447-458.

124.

Seifert G, Zhou M, Steinhäuser C. (1997) Analysis of AMPA receptor properties during postnatal development of mouse hippocampal astrocytes. J Neurophysiol 78:2916-2923.

125.

Shepherd RM, Williams GH, Quinn SJ. (1992) Regulation of intracellular pH in single rat zona glomerulosa cells. Am J Physiol 262:C182-C190.

126.

Sík A, Smith RL, Freund TF. (2000) Distribution of chloride channel-2immunoreactive neuronal and astrocytic processes in the hippocampus. Neuroscience 101:51-65.

127.

Slotboom DJ, Konings WN, Lolkema JS. (2001) Glutamate transporters combine transporter- and channel- like features. Trends Biochem Sci 26:534-539.

128.

Smith QR, Johanson CE, Woodbury DM. (1981) Uptake of 36 Cl and 22 Na by the brain-cerebrospinal fluid system: comparison of the permeability of the bloodbrain and blood-cerebrospinal fluid barriers. J Neurochem 37:117-124.

129.

Sonnhof U. (1987) Single voltage-dependent K+ and Cl- channels in cultured rat astrocytes. Can J Physiol Pharmacol 65:1043-1050. Sontheimer H. (1992) Astrocytes, as well as neurons, express a diversity of ion channels. Can J Physiol Pharmacol 70 Suppl:S223-S238.

130.

83

131.

Spät A, Nagy K, Tarján E. (1979) Hyperaldosteronism in the sodium-depleted rat: mechanism of aldosterone stimulation by peritoneal dialysis with glucose solution. J Endocrinol 82:17-25.

132.

Spät A, Enyedi P, Hajnóczky G, Hunyady L. (1991) Generation and role of calcium signal in adrenal glomerulosa cells. Exp Physiol 76:859-885.

133.

Speake T, Kajita H, Smith CP, Brown PD. (2002) Inward-rectifying anion channels are expressed in the epithelial cells of choroid plexus isolated from ClC-2 'knock-out' mice. J Physiol Lond 539:385-390.

134.

Staley K. (1994) The role of an inwardly rectifying chloride conductance in postsynaptic inhibition. J Neurophysiol 72:273-284.

135.

Staley K, Smith R, Schaack J, Wilcox C, Jentsch TJ. (1996) Alteration of GABAA receptor function following gene transfer of the CLC-2 chloride channel. Neuron 17:543-551.

136.

Steinhäuser C, Berger T, Frotscher M, Kettenmann H. (1992) Heterogeneity in the membrane current pattern of identified glial cells in the hippocampal slice. Eur J Neurosci 4:472-484.

137.

Steinhäuser C, Kressin K, Kuprijanova E, Weber M, Seifert G. (1994) Properties of voltage-activated Na+ and K+ currents in mouse hippocampal glial cells in situ and after acute isolation from tissue slices. Pflügers Arch 428:610-620.

138.

Strange K, Emma F, Jackson PS. (1996) Cellular and molecular physiology of volume-sensitive anion channels. Am J Physiol 270:C711-C730.

139.

Stroffekova K, Kupert EY, Malinowska DH, Cuppoletti J. (1998) Identification of the pH sensor and activation by chemical modification of the ClC -2G Clchannel. Am J Physiol 275:C1113-C1123.

140.

Takahashi M, Billups B, Rossi D, Sarantis M, Hamann M, Attwell D. (1997) The role of glutamate transporters in glutamate homeostasis in the brain. J Exp Biol 200:401-409.

141.

Tewari KP, Malinowska DH, Sherry AM, Cuppoletti J. (2000) PKA and arachidonic acid activation of human recombinant ClC -2 chloride channels. Am J Physiol 279:C40-C50.

142.

Thiemann A, Gründer S, Pusch M, Jentsch TJ. (1992) A chloride channel widely expressed in epithelial and non-epithelial cells. Nature 356:57-60.

143.

Ullrich N, Sontheimer H. (1996) Biophysical and pharmacological characterization of chloride currents in human astrocytoma cells. Am J Physiol 270:C1511-C1521.

84

144.

Ullrich N, Sontheimer H. (1997) Cell cycle-dependent expression of a gliomaspecific chloride current: proposed link to cytoskeletal changes. Am J Physiol 273:C1290-C1297.

145.

Ullrich N, Bordey A, Gillespie GY, Sontheimer H. (1998) Expression of voltage-activated chloride currents in acute slices of human gliomas. Neuroscience 83:1161-1173.

146.

Xu WX, Kim SJ, Kim SJ, So I, Kang TM, Rhee JC, Kim KW. (1996) Effect of stretch on calcium channel currents recorded from the antral circular myocytes of guinea-pig stomach. Pflügers Arch 432:159-164.

147.

Xu WX, Kim SJ, So I, Kim KW. (1997) Role of actin microfilament in osmotic stretch-induced increase of voltage-operated calcium channel current in guineapig gastric myocytes. Pflügers Arch 434:502-504.

148.

Várnai P, Osipenko ON, Vizi ES, Spät A. (1995) Activation of calcium current in voltage-clamped rat glomerulosa cells by potassium ions. J Physiol Lond 483:67-78.

149.

Verkhratsky A, Orkand RK, Kettenmann H. (1998) Glial calcium: homeostasis and signaling function. Physiol Rev 78:99-141.

150.

Verkhratsky A, Steinhäuser C. (2000) Ion channels in glial cells. Brain Res Rev 32:380-412.

151.

Vitarella D, DiRisio DJ, Kimelberg HK, Aschner M. (1994) Potassium and taurine release are highly correlated with regulatory volume decrease in neonatal primary rat astrocyte cultures. J Neurochem 63:1143-1149.

152.

Walz W, Schlue WR. (1982) External ions and membrane potential of leech neuropile glial cells. Brain Res 239:119-138.

153.

Walz W, Wuttke W, Hertz L. (1984) Astrocytes in primary cultures: membrane potential characteristics reveal exclusive potassium conductance and potassium accumulator properties. Brain Res 292:367-374.

154.

Walz W. (1989) pH shifts evoked by neuronal stimulation in slices of rat hippocampus. Can J Physiol Pharmacol 67:577-581.

155.

Walz W. (1995) Distribution and transport of chloride and bicarbonate ions across membranes. Neuroglia (Szerk.: Kettenmann H és Ransom BR, Oxford Univerity Press, UK) pp. 221-229.

156.

Walz W, Wuttke WA.(1999) Independent mechanisms of potassium clearance by astrocytes in gliotic tissue. J Neurosci Res 56:595-603.

85

157.

Walz W. (2000a) Role of astrocytes in the clearance of excess extracellular potassium. Neurochem Int 36:291-300.

158.

Walz W. (2000b) Controversy surrounding the existence of discrete functional classes of astrocytes in adult gray matter. Glia 31:95-103.

159.

Walz W. (2002) Chloride/anion channels in glial cell membranes. Glia 40:1-10.

160.

Wang W, Hayama N, Robinson TV, Kramer RE, Schneider EG. (1992) Effect of osmolality on cytosolic free calcium and aldosterone secretion. Am J Physiol 262:E68-E75.

161.

Wang W, Schneider EG. (1997) Potassium- induced aldosterone secretion involves a Cl--dependent mechanism. Am J Physiol 272:R183-R187.

162.

Wangemann P, Marcus DC. (1990) K+-induced swelling of vestibular dark cells is dependent on Na+ and Cl- and inhibited by piretanide. Pflügers Arch 416:262269.

163.

Westenbroek RE, Bausch SB, Lin RC, Franck JE, Noebels JL, Catterall WA. (1998) Upregulation of L-type Ca2+ channels in reactive astrocytes after brain injury, hypomyelination, and ischemia. J Neurosci 18:2321-2334.

164.

Zhou M, Kimelberg HK. (2000) Freshly isolated astrocytes from rat hippocampus show two distinct current patterns and different [K +]o uptake capabilities. J Neurophysiol 84:2746-2757.

165.

Zhou M, Kimelberg HK. (2001) Freshly isolated hippocampal CA1 astrocytes comprise two populations differing in glutamate transporter and AMPA receptor expression. J Neurosci 21:7901-7908.

166.

Zucker A, Gleason SD, Schneider EG. (1982) Renal and endocrine response to water deprivation in dog. Am J Physiol 242:R296-R302.

86

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

Az értekezés alapjául szolgáló közlemények

Makara JK, Petheo GL, Tóth A, Spät A. (2000) Effect of osmolarity on aldosterone production by rat adrenal glomerulosa cells. Endocrinology 141:1705-1710. (IF: 4,79)

Makara JK, Petheo GL, Tóth A, Spät A. (2001) pH-sensitive inwardly rectifying chloride current in cultured rat cortical astrocytes. Glia 34:52-58. (IF: 4,193)

Makara JK, Rappert A, Matthias K, Steinhäuser C, Spät A, Kettenmann H. Astrocytes from mouse brain slices express ClC -2 mediated Cl- currents regulated during development and after injury. (közlésre benyújtva: Molecular and Cellular Neuroscience)

Az értekezéshez lazán kapcsolódó közlemények

Várnai P, Petheo GL, Makara JK, Spät A. (1998) Electrophysiological study on the high K+ sensitivity of rat glomerulosa cells. Pflügers Arch 435:429-431. (IF: 2,529)

Petheo GL, Molnár Z, Róka A, Makara JK, Spät A. (2001) A pH-sensitive chloride current in the chemoreceptor cell of rat carotid body. J Physiol Lond 535:95-106. (IF: 4,476)

Saját közleményeimre az értekezésben nem számozás, hanem elso szerzo és évszám szerint hivatkozom.

87

ÖSSZEFOGLALÁS Az anion csatornák fontos szerepet játszanak a Cl- transzportban, valamint a membránpotenciál, a sejttérfogat, az intra- és extracelluláris pH és a proliferáció szabályozásában. Kísérleteinkben a teljes-sejt patch-clamp módszer alkalmazásával vizsgáltuk az agykérgi és hippocampális asztrocita valamint a mellékvesekérgi glomerulóza sejt nyugalomban aktív Cl- áramait. Neuronnal együtt tenyésztett agykérgi asztrocitán a K+ áramok gátlása mellett kimutattuk egy befelé rektifikáló anion áram jelenlétét. Az áram a –40 mV- nál negatív membránpotenciál tartományban lassan aktiválódott, inaktivációt nem mutatott, és jól gátolható volt Cl- csatorna gátlószerekkel. Az anion áramot extracelluláris acidózis aktiválta, míg alkalózis gátolta a fiziológiás pHe tartományban (pH 6,9-7,9). Hasonló tulajdonságokkal rendelkezo, bár lényegesen kisebb denzitású áram detektálható volt egér agyszelet hippocampusban és kéregben in situ vizsgált, EGFP-t expresszáló asztrocita egyik altípusán, a komplex asztrocitán is. ClC-2 "knock-out" egér hippocampusában a komplex asztrocitán az áram nem volt detektálható, ami igazolta, hogy az áram a ClC -2 klorid csatornán keresztül jön létre. A Cl- áram nem, vagy csak kis amplitúdóval volt kimutatható in situ reaktív transzformáción átment EGFP-expresszáló komplex asztrocitán. Az asztrocitán kimutatotthoz hasonló, befelé rektifikáló áramot tenyésztett patkány zóna glomerulóza sejten is kimutattunk. Az áram glomerulóza sejten szintén aktiválható volt acidózissal (pH 6,9). A befelé rektifikáló Cl- áram szerepét asztrocitában elsosorban a K+ pufferolással együtt járó Cl- transzportban feltételezzük. Glomerulóza sejten az általunk kimutatott Cl- áram az elso anion konduktancia, amelyet nem stimulált sejten megfigyeltek. Az áram szerepet játszhat a szteroid szintézis szabályozásában. Hipozmózissal

eloidézett

feszültségfüggo T és L típusú Ca

2+

sejtduzzadás

hatására

a

glomerulóza

sejt

csatornáin keresztül folyó áram amplitúdója nott.

Mikrofluorimetriás vizsgálatokkal igazoltuk, hogy ez a hatás befolyásolja a glomerulóza sejt fiziológiás K+ ingerre adott [Ca2+]c válaszát: hipozmotikus oldatban (250 mOsm) az 5 mM K+ által kiváltott [Ca2+]c jel amplitúdója nagyobb volt, mint izozmotikus (290 mOsm) oldatban. A sejtduzzadás következtében kialakuló nagyobb válaszkészség feltételezésünk szerint szerepet játszhat a fiziológiás mértéku [K +]e emelkedés által kiváltott aldoszteron termelés fokozódásban.

88

SUMMARY Anion channels play an important role in Cl- transport and in the regulation of membrane potential, cell volume, intra- and extracellular pH and proliferation. We used the whole-cell patch-clamp method to investigate the resting anion conductance of cortical and hippocampal astrocytes as well as adrenocortical glomerulosa cells. After pharmacological elimination of the K+ conductance, an inwardly rectifying Cl- current was observed in rat cortical astrocytes co-cultured with neurons. The current activated slowly at potentials negative to –40 mV, did not show inactivation, and could be inhibited by known Cl- channel blockers. The current was sensitive to physiological changes in extracellular pH (pH 6,9-7,9): acidosis activated, whereas alkalosis inhibited the conductance. Patch-clamp experiments conducted in situ in cortex and hippocampus of mouse acute brain slices revealed the expression (albeit with markedly lower density) of a very similar inward current in a subtype of EGFP-expressing astrocytes, namely the complex astrocytes. The current was abolished in a "knock-out" mouse line where the ClC-2 Cl- channel gene was inactivated, indicating that the ClC -2 channel was responsible for generating the conductance. In situ EGFP-expressing reactive astrocytes exhibited small or not detectable Cl- current component. An inwardly rectifying current with similar characteristics to that observed in astrocytes was detected in cultured rat glomerulosa cells as well. The current in glomerulosa cells could be also activated with acidosis (pH 6,9). In astrocytes we propose a role for this anion current in Cl- transport accompanying K+ buffering. In glomerulosa cells, to our knowledge this is the first observation of an anion conductance in resting cells. The current may play a role in regulation of steroid synthesis in glomerulosa cells. Cell swelling induced by extracellular hyposmosis increased current amplitude through T and L type voltage-gated Ca2+ channels in glomerulosa cells. Using microfluorimetric technique we showed that this effect can influence the [Ca2+]c signal evoked by physiological elevation of extracellular [K +]: the [Ca2+]c signal induced by 5 mM K+ increased significantly in hyposmotic environment (250 mOsm) compared to that of under isosmotic cnditions (290 mOsm). Augmented responsiveness by cell swelling may be an important element of the extreme sensitivity of glomerulosa cells to physiological elevation of [K +]e.

89