Bc. Markéta Pikorová

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra experimentální biologie rostlin

Kombinované mikrobiální ošetření v hydroponickém pěstování rajčete a okurky: vliv na výnosové parametry a obsah antioxidantů v plodech

Bc. Markéta Pikorová DIPLOMOVÁ PRÁCE

Školitel: prof. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D.

Praha, 2014

Školitel diplomové práce: prof. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D. Katedra experimentální biologie rostlin, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze Botanický ústav AV ČR, v.v.i.

Konzultanti diplomové práce: Mgr. Blanka Vlasáková, Ph.D. Botanický ústav AV ČR, v.v.i. RNDr. Miroslav Vosátka, CSc. Botanický ústav AV ČR, v.v.i.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci zpracovala samostatně za použití uvedených informačních zdrojů a literatury pod vedením prof. Jany Albrechtové. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze dne 5. 5. 2014 Markéta Pikorová 2

Poděkování Ráda bych poděkovala své školitelce prof. RNDr. Janě Albrechtové, Ph.D. za trpělivost, ochotu a množství odborných rad při zpracovávání mé diplomové práce. Děkuji RNDr. Miroslavu Vosátkovi, CSc. za pomoc s návrhy pokusů pro tuto práci. Velký dík patří Mgr. Blance Vlasákové, Ph.D. za vstřícné vedení během experimentální části práce. Děkuji také zaměstnancům Oddělení mykorhizních symbióz z BÚ AV ČR v Průhonicích za odbornou pomoc a cenné rady. Mgr. Zuzaně Lhotákové Ph.D. děkuji za odborné rady při analýze fotosyntetických pigmentů. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Michalu Bartošovi, Ing. Zoře Nývltové, Ph.D. a jejich týmu z VÚOS a.s. nejen za analýzy vzorků a RNDr. Aleši Látrovi, Ph.D. z firmy Symbiom za dodání mikrobiálního ošetření do pokusů a za cenné připomínky k mé diplomové práci. Za cenné připomínky děkuji také prof. RNDr. Ondřeji Prášilovi, Ph.D. V neposlední řadě děkuji svým blízkým za trpělivost a podporu.

Práce byla podpořena projekty: TAČR TA02020544: Biologická aditiva zálivkové vody pro zvýšení kvality potravinových plodin

Algatech, CZ.1.05/2.1.00/03.0110. 3

Obsah ABSTRAKT ..................................................................................................................... 9 ABSTRACT ................................................................................................................... 10 1 ÚVOD ......................................................................................................................... 11 1.1HYPOTÉZY A CÍLE PRÁCE.................................................................................................. 12 2. PŘEHLED LITERATURY .......................................................................................... 13 2.1 ANTIOXIDANTY: VLIV NA ZDRAVÍ ČLOVĚKA .................................................................... 13 2.2 MIKROBIÁLNÍ MUTUALISTICKÁ SYMBIÓZA ...................................................................... 14 2.2.1 Mykorhizní symbióza ................................................................................................ 14 2.2.1.1 Arbuskulární mykorhizní symbióza a její vlivy na rostliny............................................... 15 2.2.1.1.1 Vliv AM na růstové parametry rostlin ...................................................................... 16 2.2.1.1.2 Vliv AM na výnosové parametry rostlin................................................................... 17 2.2.1.1.3 Vliv AM na fyziologické parametry rostlin .............................................................. 17 2.2.1.1.4 Vliv AM na aktivitu enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách ............................ 18 2.2.1.1.5 Vliv AM na obsah primárních metabolitů v rostlinách .............................................. 19 2.2.1.1.6 Vliv AM na obsah sekundárních metabolitů v rostlinách .......................................... 19 2.2.1.1.7 Vliv AM na zvýšení odolnosti rostlin ....................................................................... 20

2.2.2 Bakterie podporující růst rostlin (PGPB) a jejich vlivy na rostliny............................ 21 2.2.2.1 Vliv PGPB na rostliny .................................................................................................... 23 2.2.2.1.1 Vliv PGPB na růstové parametry rostlin................................................................... 23 2.2.2.1.2 Vliv PGPB na výnosové parametry rostlin ............................................................... 23 2.2.2.1.3 Vliv PGPB na fyziologické parametry rostlin ........................................................... 24 2.2.2.1.4 Vliv PGPB na aktivitu enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách ......................... 24 2.2.2.1.5 Vliv PGPB na obsah primárních metabolitů v rostlinách .......................................... 25 2.2.1.1.6 Vliv PGPB na obsah sekundárních metabolitů v rostlinách ....................................... 25

2.2.3 Trichoderma (Th) a její vlivy na rostliny................................................................... 25 2.2.3.1 Vliv Th na rostliny.......................................................................................................... 26 2.2.3.1.1 Vliv Th na růstové parametry rostlin ........................................................................ 26 2.2.3.1.2 Vliv Th na fotosyntetické parametry, antioxidační aktivitu a obsah metabolitů v rostlinách............................................................................................................................... 26

2.2.4 Kombinované mikrobiální ošetření a jeho vliv na rostliny ......................................... 27 2.3 RAJČE A OKURKA ............................................................................................................ 28 2.3.1 Zemědělské využití a význam pro člověka ................................................................. 28 2.3.2 Vlivy symbiotických mikroorganismů na rostliny rajčete a okurky ............................ 29 2.3.2.1 Vlivy na růstové parametry rostlin rajčete a okurky ......................................................... 29 2.3.2.2 Vlivy na výnosové parametry rostlin rajčete a okurky ...................................................... 30

4

2.3.2.3 Vlivy na fyziologické parametry rostlin rajčete a okurky ................................................. 30 2.3.2.4 Vlivy na obsah antioxidantů a dalších látek v rostlinách rajčete a okurky ......................... 31

2.4 MECHANISMY ZMĚN OBSAHU ANTIOXIDANTŮ V ROSTLINÁCH VLIVEM MUTUALISTICKY SYMBIOTICKÝCH MIKROORGANISMŮ .....................................................................................

32

2.4.1 Základní struktura rostlinného metabolismu ............................................................. 32 2.4.2 Fenolické látky a jejich biosyntéza ........................................................................... 33 2.4.3 S prolinem vázaný oxidační pentózafosfátový cyklus a jeho propojení s biosyntézou fenolických látek ............................................................................................................... 34 2.4.4 Mechanismy změn obsahu fenolických látek v rostlinách vlivem symbiózy s mutualistickými mikroorganismy .................................................................................... 35 2.4.5 Mechanismy změn obsahu dalších látek s antioxidačními vlastnostmi v rostlinách vlivem symbiózy s mutualistickými mikroorganismy .......................................................... 37 2.4.6 Mechanismy změn obsahu některých enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách vlivem symbiózy s mutualistickými mikroorganismy .......................................................... 39 3 MATERIÁL A METODY ............................................................................................. 40 3.1 POUŢITÉ MIKROORGANISMY ............................................................................................ 40 3.2 HRNKOVÉ SKLENÍKOVÉ POKUSY ...................................................................................... 42 3.2.1 Pokus 1: Okurky....................................................................................................... 43 3.2.2 Pokus 2: Rajčata I .................................................................................................... 45 3.2.3 Pokus 3: Rajčata II .................................................................................................. 47 3.3 POLOPROVOZNÍ SKLENÍKOVÉ POKUSY ............................................................................. 49 3.3.1 Pokus 4: Okurky I .................................................................................................... 50 3.3.2 Pokus 5: Okurky II ................................................................................................... 51 3.3.3 Pokus 6: Rajčata ...................................................................................................... 52 3.4 METODIKA SBĚRU DAT .................................................................................................... 52 3.4.1 Růstové parametry ................................................................................................... 52 3.4.1.1 Stanovení hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin........................................................... 52 3.4.1.2 Měření výšky rostlin ....................................................................................................... 53

3.4.2 Výnosové parametry ................................................................................................. 53 3.4.2.1 Stanovení hmotnosti plodů .............................................................................................. 53

3.4.3 Fyziologické parametry ............................................................................................ 53 3.4.3.1 Stanovení obsahu fotosyntetických pigmentů v listech ..................................................... 53 3.4.3.1.1 Odběr a příprava vzorků pro analýzu ....................................................................... 54 3.4.3.1.2 Extrakce fotosyntetických pigmentů a spektrofotometrické měření ........................... 54 3.4.3.1.3 Výpočet koncentrace fotosyntetických pigmentů ...................................................... 55

3.4.4 Obsahy vybraných látek v plodech ............................................................................ 55 3.4.4.2 Stanovení celkového obsahu fenolických látek v plodech ................................................ 55

5

3.4.4.3 Stanovení cukernatosti plodů .......................................................................................... 56 3.4.4.1 Stanovení obsahu vitaminu C v plodech .......................................................................... 56

3.4.5 Stanovení míry mikrobiální kolonizace kořenů.......................................................... 56 3.4.5.1 Příprava vzorků pro vyhodnocení mykorhizní kolonizace ................................................ 57 3.4.5.2 Vyhodnocení míry mykorhizní kolonizace kořenů ........................................................... 57 3.4.5.3 Příprava vzorků a vyhodnocení kolonizace Th ................................................................. 58

3.4.6 Statistické zpracování dat ......................................................................................... 59 4 VÝSLEDKY ................................................................................................................ 60 4.1 VYHODNOCENÍ HRNKOVÝCH SKLENÍKOVÝCH POKUSŮ..................................................... 60 4.1.1 Výsledky pokusu 1: Okurky....................................................................................... 60 4.1.1.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace .............................................................................. 60 4.1.1.2 Růst rostlin okurek.......................................................................................................... 60 4.1.1.3 Výnosy plodů okurek ...................................................................................................... 61 4.1.1.4 Grafické znázornění výsledků pokusu 1 .......................................................................... 61

4.1.2 Výsledky pokusu 2: Rajčata I .................................................................................... 65 4.1.2.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace .............................................................................. 65 4.1.2.2 Růst rostlin rajčat ............................................................................................................ 65 4.1.2.3 Grafické znázornění výsledků pokusu 2 .......................................................................... 65

4.1.3 Výsledky pokusu 3: Rajčata II .................................................................................. 66 4.1.3.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace .............................................................................. 66 4.1.3.2 Růst rostlin rajčat ............................................................................................................ 66 4.1.3.3 Výnosy plodů rajčat ........................................................................................................ 67 4.1.3.4 Obsah fotosyntetických pigmentů.................................................................................... 67 4.1.3.5 Obsahy sledovaných látek v plodech ............................................................................... 67 4.1.3.6 Grafické znázornění výsledků pokusu 3 .......................................................................... 68

4.2 VYHODNOCENÍ POLOPROVOZNÍCH SKLENÍKOVÝCH POKUSŮ ............................................ 71 4.2.1 Výsledky pokusu 4: Okurky I .................................................................................... 71 4.2.1.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace .............................................................................. 71 4.2.1.2 Výnosy plodů okurek ...................................................................................................... 71

4.2.2 Výsledky pokusu 5: Okurky II ................................................................................... 72 4.2.2.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace .............................................................................. 72 4.2.2.2 Výnosy plodů okurek ...................................................................................................... 72

4.2.3 Výsledky pokusu 6: Rajčata ...................................................................................... 73 4.2.3.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace .............................................................................. 73 4.2.3.2 Výnosy plodů rajčat ........................................................................................................ 73

4.3 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ ........................................................................................................ 75 5 DISKUZE .................................................................................................................... 76 5.1 HYDROPONICKÉ PĚSTOVÁNÍ ROSTLIN A MIKROBIÁLNÍ OŠETŘENÍ...................................... 76 6

5.2 POUŢITÉ METODY ............................................................................................................ 77 5.3 VÝSLEDKY POKUSŮ ......................................................................................................... 78 5.4 MIKROBIÁLNÍ OŠETŘENÍ V POKUSECH ............................................................................. 80 5.5 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ PRŮBĚH PROVEDENÝCH POKUSŮ.................................................. 82 5.6 HYDROPONICKÉ PĚSTOVÁNÍ V BUDOUCÍM VÝZKUMU ...................................................... 84 6 SOUHRN .................................................................................................................... 86 7 SEZNAM LITERATURY ............................................................................................. 87

7

Seznam použitých zkratek 4CL APX

4-kumarát:koenzym A ligáza askorbát peroxidáza

C4H CAT CFU DHAR DMF

cinamát-4-hydroxyláza kataláza počet kolonii tvořících jednotek dehydroaskorbát reduktáza dimethylamid kyseliny mravenčí

G6PDH G-POD GPX GR GST

glukóza-6-fosfát dehydrogenáza guaiacol peroxidáza glutation peroxidáza glutation reduktáza glutation-S-transferáza

HPLC CHS JA MDHAR NADPH

vysokoúčinná kapalinová chromatografie chalkon syntáza kyselina jasmonová mono-dehydroaskorbát reduktáza nikotinamid adenin dinukleotidfosfát

PAL PEP POX PPO PPO

fenylalanin amonium lyáza fosfoenolpyruvát peroxidáza polyfenol oxidáza polyfenol oxidáza

SA SKDH SOD

kyselina salicylová šikimát dehydrogenáza superoxid dismutáza

AM

arbuskulární mykorhizní houby

PGPB Th

bakterie podporující růst rostlin Trichoderma harzianum

A. B.

Azospirillum Bacillus

G. P. R. T.

Glomus Pseudomonas Rhizophagus Trichoderma

8

Abstrakt O některých mikroorganismech je známo, ţe tvoří mutualistickou symbiózu s kořeny rostlin a svým působením mohou zlepšovat některé rostlinné parametry. Mezi symbiotické mikroorganismy, které jsou schopny různé parametry rostlin vylepšovat, patří zejména mykorhizní houby, rostlinám prospěšné půdní bakterie a některé saprotrofní mykoparazitické houby. Mechanismy změn těchto parametrů vlivem symbiotických mikroorganismů jsou známy jen z části a v současné době jsou aktivně zkoumány. Cíli této práce bylo zjistit, zda vybraná mikrobiální ošetření ovlivňují vybrané růstové, fyziologické a výnosové parametry rostlin a obsahy vybraných látek v plodech. V rámci této práce proběhly tři hrnkové skleníkové pokusy (pokus 1, 2 a 3) a tři poloprovozní skleníkové pokusy (pokus 4, 5 a 6), prováděné na rostlinách rajčete (Solanum lycopersicum) a okurky (Cucumis sativus). Rostliny byly pěstovány v hydroponii, za pouţití nosiče z čedičové vaty a byly zalévány ţivným roztokem. Jako mikrobiální ošetření rostlin byla v pokusech pouţita směs arbuskulárních mykorhizních hub (AM), směs bakterií podporujících růst rostlin (PGPB), saprotrofní mykoparazitická houba Trichoderma harzianum (Th) a různé vzájemné kombinace těchto ošetření. U rostlin rajčat a okurek v poloprovozních skleníkových pokusech byl sledován vliv mikrobiálního ošetření na výnosy plodů. V případě hrnkových skleníkových pokusů byl u rostlin rajčat a okurek sledován vliv mikrobiálního ošetření na hmotnost sušiny nadzemní části rostlin, výšku rostlin a výnos plodů; u rostlin rajčat v pokusu 3 byl dále sledován obsah fotosyntetických pigmentů v listech a byly stanovovány obsahy vybraných látek v plodech (cukernatost, celkový obsah fenolických látek a obsah vitaminu C). K rozvinutí mykorhizní symbiózy došlo pouze v pokusu 1 na okurkách. V ţádném z pokusů se mezi jednotlivými variantami nelišily hodnoty růstových, fyziologických ani výnosových parametrů rostlin. Cukernatost plodů ani celkový obsah fenolických látek v plodech rajčat se mezi jednotlivými variantami ošetření nelišily. Obsah vitaminu C v plodech rajčat byl sníţen v průměru o 10 % u rostlin ošetřených AM a u rostlin ošetřených Th. Klíčová slova: mikrobiální ošetření, arbuskulární mykorhizní symbióza, bakterie podporující růst rostlin PGPB, Trichoderma harzianum, rajče Solanum lycopersicum, okurka Cucumis sativus hydroponie, čedičová vata, antioxidanty, výnosové parametry

9

Abstract Some microorganisms are known to form mutualistic symbiosis with plant roots and by their impact they can improve some plant parameters. These symbiotic microorganisms, which are able to improve some plant parameters, include especially mycorrhizal

fungi,

plant

growth

promoting

bacteria

and

some

saprotrophic

mycoparasitical fungi. Mechanisms of changes of these parameters, as influenced by symbiotic microorganisms, are known only in part and nowadays are being actively researched. Aims of this work were to find out if selected microbial treatments influence selected growth, physiological and yield parameters of plants and contents of selected substances in fruits. Within this work were made three pot greenhouse experiments (experiments 1, 2 and 3) and three pilot greenhouse experiments (experiments 4, 5 and 6), performed on tomato (Solanum lycopersicum) and cucumber (Cucumis sativus) plants. Plants were grown in hydroponics using a carrier of rockwool and they were watered by nutrient solution. As microbial treatments for plants in experiments have been used a mixture of arbuscular mycorrhizal fungi (AM), mixture of plant growth promoting bacteria (PGPB), saprotrophic mycoparasitical fungus Trichoderma harzianum (Th) and various mutual combinations of these treatments. There have been observed effect of microbial treatments on fruit yields of tomatoes and cucumbers in pilot greenhouse experiments. In the case of pot greenhouse experiments on tomato and cucumber, there have been observed influence of microbial treatments on dry biomass of shoot, plant height and fruit yield; for tomato plants in the experiment 3, there have been further observed content of photosynthetic pigments in leaves and also have been determined contents of selected substances in fruits (sugar content, total phenolic content and vitamin C content). The development of mycorrhiza was present only in the experiment 1 at cucumbers. There were any differences between used variants of treatments, neither in growth, physiological nor yield parameters of plants in performed experiments. The sugar content or the total phenolic content in tomato fruits did not differ. The vitamin C content in tomato fruits was reduced by 10 % in average at plants treated by AM and at plants treated by Th. Key words: microbial treatment, arbuscular mycorrhizal symbiosis, plant growth promoting bacteria PGPB, Trichoderma harzianum, tomato Solanum lycopersicum, cucumber Cucumis sativus, hydroponics, rockwool, antioxidants, yield parameters 10

1 Úvod Trendem dnešní doby, zejména posledního desetiletí, je stále se zvyšující poptávka po kvalitních potravinách, produkovaných ekologickou cestou. Především ve vyspělých zemích se lidé více zaměřují na zdravý ţivotní styl, s čímţ souvisí i konzumace kvalitních potravin. Zároveň se prohlubují znalosti medicíny o vlivu rostlinných obsahových látek, jako jsou antioxidanty a další bioaktivní látky, na zdraví člověka a stoupá zájem spotřebitelů o plodiny s vysokým obsahem těchto látek. Ve světě je navyšováno mnoţství konzumované zeleniny a čím dál více spotřebitelů upřednostňuje plodiny, produkované alternativním zemědělstvím, bez nadměrného pouţívání chemických látek. Kromě negativního dopadu pouţívání agrochemikálií na zdraví člověka si společnost začíná více uvědomovat i dopady těchto látek na ţivotní prostředí. V konvenčním zemědělství je pro maximalizaci výnosů pouţíváno mnoţství agrochemikálií, jako jsou hnojiva a pesticidy, které mohou mít negativní vlivy na prostředí. Z těchto důvodů jsou hledány alternativy, které by omezily pouţívání agrochemikálií při produkci plodin, zvýšily kvalitu plodin a přitom nesníţily výnosy. Jedním z moţných řešení můţe být pouţití mikrobiálního ošetření rostlin. Některé mutualistické symbiotické mikroorganismy mohou zlepšovat růst rostlin, zvyšovat výnosy plodů a navyšovat obsahy antioxidantů a dalších látek, zvyšujících nutriční hodnotu, v konzumních částech rostlin. Jedním ze způsobů, jak navýšit výnosy a zároveň optimalizovat pouţívání chemických látek, je pouţití hydroponie. Při hydroponickém pěstování mají rostliny optimální podmínky pro svůj růst, rostliny nejsou stresovány a je tak zajištěn vysoký výnos. Protoţe ale k tvorbě antioxidantů v rostlinách často významně přispívá právě stres, nemusejí být konzumní části plodin, pěstovaných v hydroponii, na antioxidanty příliš bohaté. Pokud by byla nalezena vhodná kombinace mutualisticky symbiotických mikroorganismů pro ošetření rostlin, pěstovaných v příslušně optimalizovaném hydroponickém roztoku, která by navyšovala obsahy antioxidantů a dalších prospěšných látek v plodinách, významně by to přispělo ke zvýšenému objemu ekologicky produkovaných kvalitních plodin, v souladu s trvale udrţitelným rozvojem. Při pouţití vhodných mikroorganismů by mohlo téţ dojít k dalšímu navýšení výnosů hydroponicky pěstovaných plodin. Tato diplomová práce byla vypracována jako součást projektu TA ČR TA02020544 s názvem: Biologická aditiva zálivkové vody pro zvýšení kvality potravinových plodin.

11

V rámci tohoto projektu byla testována různá, nejen mikrobiální, aditiva u různých druhů zeleniny v hydroponickém i půdním prostředí. Na tomto projektu spolupracovalo konsorcium řešitelů, skládající se, kromě PřF UK, z dalších společností a institucí. Výzkumný ústav organických syntéz, a.s. dodával některá ošetření do pokusů a zajišťoval analýzy obsahových látek, společnost Symbiom, s.r.o. dodávala některá mikrobiální ošetření (symbiotické houby a PGPB bakterie) do pokusů, společnost RAWAT consulting s.r.o. dodávala některá další ošetření a prováděla pokusy a Zahradnická fakulta Mendelovy Univerzity v Brně zajišťovala některé z dalších pokusů v tomto projektu mimo rámec této diplomové práce. V rámci této diplomové práce probíhaly pokusy na hydroponicky pěstovaných rostlinách rajčete a okurky, za pouţití mikrobiálního ošetření. Jako mikrobiální ošetření byla pouţita směs arbuskulárních mykorhizních hub, směs bakterií podporujících růst rostlin, saprotrofní a mykoparazitická houba Trichoderma harzianum a vzájemné kombinace těchto ošetření. V prostorách Botanického ústavu AV ČR v.v.i. v Průhonicích proběhly hrnkové skleníkové pokusy a v prostorách společnosti Jiţní Morava a.s. proběhly poloprovozní skleníkové pokusy. U pokusných rostlin byl sledován vliv mikrobiálního ošetření na vybrané růstové, fyziologické a výnosové parametry. Z výnosových parametrů byly sledovány kvantitativní výnosové parametry, jako je hmotnost plodů a kvalitativní výnosové parametry, jako je obsah vybraných látek v plodech.

1.1Hypotézy a cíle práce Hypotéza 1: mikrobiální ošetření hydroponicky pěstovaných rostlin rajčete a okurky zvyšuje vybrané růstové, fyziologické a výnosové parametry rostlin. Hypotéza 2: mikrobiální ošetření hydroponicky pěstovaných rostlin rajčete a okurky zvyšuje obsahy vybraných látek v plodech (antioxidanty, rozpustné sacharidy) Cíl 1: zjistit, zda vybraná mikrobiální ošetření ovlivňují vybrané růstové, fyziologické a výnosové parametry hydroponicky pěstovaných rostlin rajčete a okurky Cíl 2: zjistit, zda vybraná mikrobiální ošetření ovlivňují obsahy vybraných látek v plodech, zvyšujících nutriční kvalitu plodů (antioxidanty, rozpustné sacharidy) u hydroponicky pěstovaných rostlin rajčete a okurky

12

2. Přehled literatury 2.1 Antioxidanty: vliv na zdraví člověka Antioxidanty můţeme definovat jako látky, které jsou schopné svým působením eliminovat tzv. prooxidanty, látky způsobující oxidaci. Mezi prooxidanty, které vznikají v buňkách aerobních organismů, vlivem metabolických procesů, patří zejména volné radikály kyslíku. Těmito kyslíkovými radikály jsou, mimo jiné, superoxid (.O 2-) a hydroxyl (.OH). Kromě těchto molekul jsou vytvářeny i další reaktivní formy kyslíku, ze kterých volné radikály mohou vznikat. Mezi tyto látky patří například peroxid vodíku (H2O2). Volné radikály svým působením poškozují struktury buněk, coţ můţe mít negativní vliv i na funkce celého organismu. Například hydroxylový radikál, který je povaţován za obzvláště agresivní oxidační činidlo, v buňce okamţitě napadá naprostou většinu makromolekul a způsobuje tak rozsáhlá poškození buněčných kompartmentů, rozklad DNA, mutace a často jeho působení vede aţ ke smrti buňky (rev. Scandalios, 1993). Z těchto důvodů se organismy proti nadměrnému působení volných radikálů chrání produkcí antioxidantů. Volné radikály v organismu mají ale i prospěšné funkce, například pomáhají v boji s patogeny či plní funkci signálních molekul (Ji et al., 1998; Chuang et al., 2002). Je-li však narušena rovnováha a v organismu je přítomno větší mnoţství volných radikálů, v poměru k niţšímu mnoţství antioxidantů, nazýváme tuto nerovnováhu oxidativním stresem (rev. Giustarini et al., 2009). Tento stav můţe nastat v návaznosti na vnější stresové podmínky, kdy působení různých abiotických i biotických stresů vyvolává nadprodukci reaktivních forem kyslíku (rev. Scandalios, 1993). Oxidativní stres a poškození jím způsobená jsou spojovány, ať uţ přímo či nepřímo, se vznikem mnoha závaţných onemocnění u člověka, mezi něţ se řadí kupříkladu různé kardiovaskulární choroby, neurodegenerativní onemocnění či rakovina (rev. Giustarini et al., 2009) a svůj podíl má i na stárnutí organismu. V mnoha studiích bylo pozorováno, ţe konzumace potravy, která je bohatá na antioxidanty, můţe předcházet vzniku těchto váţných onemocnění či pomáhat v jejich léčbě (rev. Balsano & Alisi, 2009). Z tohoto důvodu je pro člověka prospěšné konzumovat různé druhy zeleniny a ovoce, které jsou bohaté na antioxidanty (rev. Rao & Balachandran, 2002). Antioxidanty, vyskytující se přirozeně v různých organismech, můţeme rozdělit na antioxidanty enzymatické a neenzymatické. Mezi enzymatické antioxidanty patří různé enzymy s antioxidační aktivitou, jako jsou například superoxid dismutáza (SOD), 13

kataláza (CAT), glutation peroxidáza (GPX), askorbát peroxidáza (APX), polyfenol oxidáza (PPO) či glutation reduktáza (GR), (rev. Ji et al., 2006; Latef & Chaoxing, 2011). V rostlinách jsou dále sekundárním metabolismem syntetizovány neenzymatické antioxidanty, mezi něţ patří především vitaminy C a E, karotenoidy (rev. Romieu et al., 2008) a antokyany. Nejobsáhlejší skupinu antioxidantů pak tvoří fenolické látky (You et al., 2011). Některé z těchto látek sekundárního metabolismu rostlin mohou mít i další prospěšné funkce, například účinky antibakteriální, fungicidní, antivirové či jinak terapeutické (rev. Perron & Brumaghim, 2009). Současné výzkumy ukazují, ţe obsah antioxidantů v rostlinách můţe být navýšen vlivem mutualistické symbiózy rostlin s některými mikroorganismy.

2.2 Mikrobiální mutualistická symbióza Mikrobiální mutualistická symbióza je běţným, v přírodě široce rozšířeným vztahem mezi rostlinami a půdními mikroorganismy. Jedná se o vzájemně prospěšný vztah, kde rostlina prostřednictvím mikroorganismů, přítomných v její rhizosféře, získává zejména minerální látky pro svoji výţivu. Mikroorganismy pak z kořenů rostlin čerpají pro svoji potřebu rostlinné asimiláty, nebo mohou vyuţívat kořenové exudáty rostlin (rev. Haas & Defago, 2005). Jde o blízký, velmi komplexní vztah, kde se oba symbiotičtí partneři navzájem ovlivňují. Pro potřeby člověka je významný především vliv ze strany mikroorganismů, jelikoţ ty jsou schopny svým působením vylepšovat různé vlastnosti a parametry rostlin. Mezi mutualisticky symbiotické mikroorganismy rostlin patří především mykorhizní houby, rostlinám prospěšné půdní bakterie a mohou mezi ně téţ patřit i některé saprotrofní, mykoparazitické houby.

2.2.1 Mykorhizní symbióza Mykorhizní symbióza je mutualistický, v přírodě běţně se vyskytující vztah mezi houbami a rostlinami, lokalizovaný do prostoru rostlinných kořenů. Při mykorhizní symbióze houba proniká svým myceliem dovnitř pletiv kořene hostitelské rostliny skrze kořenovou pokoţku a prorůstá primární kořenovou kůrou. Jsou rozlišovány různé typy mykorhizní symbiózy, z nichţ dva základní jsou ektomykorhizní a endomykorhizní symbióza. V případě ektomykorhizní symbiózy houbové hyfy pronikají pouze do mezibuněčných prostor v primární kůře kořene; u endomykorhizní symbiózy se hyfy hub dostávají do vnitřního, intracelulárního prostoru buněk kořenových pletiv. V rámci

14

endomykorhizní symbiózy jsou dále rozlišovány tři základní typy: mykorhizní symbióza arbuskulární, orchideoidní a erikoidní (Gryndler et al., 2004).

2.2.1.1 Arbuskulární mykorhizní symbióza a její vlivy na rostliny Arbuskulární mykorhizní symbióza je pravděpodobně nejrozšířenějším typem mykorhizní symbiózy na Zemi a je také nejméně specifická, co se týče osidlování různých druhů hostitelských rostlin. Název arbuskulární mykorhizní symbiózy je odvozen od arbuskul (obr. 1), stromečkovitě větvených útvarů, tvořených houbovým myceliem uvnitř hostitelských buněk kořenové kůry (Gryndler et al., 2004). Houby, vytvářející s rostlinami arbuskulární mykorhizní symbiózu, tvoří v říši hub vlastní kmen Glomeromycota, který je členěn do čtyř řádů, obsahujících mnoho různých houbových druhů. Všechny tyto druhy ţijí výhradně symbiotickým způsobem ţivota (rev. Redecker et al., 2013). Obr. 1: Znázornění arbuskuly SH – buněčná stěna houby MH – cytoplazmatická membrána buňky houby CH – cytoplazma buňky houby SR – buněčná stěna rostlinné buňky MR – cytoplazmatická membrána rostlinné buňky CR – cytoplazma rostlinné buňky PM – periarbuskulární membrána (vchlípená cytoplazmatická membrána rostlinné buňky) MP – mezilehlý prostor AA – lokalizace ATPázové aktivity Převzato z Gryndler et al. (2004)

Symbióza s mykorhizními houbami přináší rostlinám řadu výhod. Mycelium mykorhizních hub je nepřehrádkované, jeho cytoplazmou je tedy moţno účinně přenášet různé látky poměrně vysokou rychlostí, a to obousměrně. Látky proudí jak od rostliny směrem do mycelia houby, tak z mycelia do kořenů rostliny, odkud mohou být dále distribuovány do různých rostlinných orgánů. Mycelium je bohatě větvené a svými drobnými hyfami je schopno pronikat i do velmi malých prostor v půdě, kam se rostlinné kořeny nejsou schopny dostat. Díky těmto svým vlastnostem mycelium houby mnohonásobně zvyšuje objem půdy, odkud rostlina můţe získávat minerální látky (Gryndler et al., 2004). Prostřednictvím houbového mycelia rostliny získávají především v půdě méně pohyblivé prvky, zejména fosfor, dusík, draslík, síru, vápník 15

a zinek (rev. Vosátka & Albrechtová, 2008). V případě fosforu mykorhizní houby zlepšují jeho příjem rostlinami také pozitivním působením na aktivitu rostlinných fosfatáz. Fosfatázy rostliny vylučují svými kořeny pro uvolnění fosforu z organických sloučenin (Awasthi et al., 2011). Kromě zmíněných nutričních vlivů, mají arbuskulární mykorhizní houby (AM) na své hostitelské rostliny i vlivy nenutriční. Nenutriční vlivy se týkají různých fyziologických procesů v rostlině, s čímţ jsou spojeny i změny rostlinných obsahových látek. Tyto změny mohou být kvantitativní i kvalitativní. Dochází k ovlivnění jak primárního, tak i sekundárního metabolismu rostlin.

2.2.1.1.1 Vliv AM na růstové parametry rostlin Působením nutričních, ale i nenutričních vlivů dochází u hostitelských rostlin ke změnám v některých růstových parametrech. Vlivem AM můţe u rostlin docházet ke zvýšenému růstu nadzemní části rostlin i kořenů, coţ lze pozorovat jako navýšení čerstvé i suché hmotnosti rostlin či jako zvětšení výšky rostlin a zvětšení délky kořenů. Mezi nejčastěji sledované růstové parametry rostlin, které jsou vlivem AM navyšovány, patří hmotnost nadzemní části rostlin a hmotnost kořenů. Zvýšená hmotnost sušiny nadzemní části a sušiny kořenů byla pozorována například u rostlin papriky roční (Capsicum annuum) vlivem mykorhizní houby Glomus mosseae (Latef, 2013). U rostlin papriky byla pozorována i zvýšená čerstvá hmotnost nadzemní části vlivem mykorhizní houby Rhizophagus irregularis (Zheng et al., 2004). Z dalších rostlin, patřících mezi zeleninu, můţeme zmínit například meloun cukrový (Cucumis melo), u kterého bylo pozorováno zvýšení hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin při inokulaci houbou G. mosseae nebo G. versiforme (Huang et al., 2011). Zvýšení hmotnosti celé rostliny v čerstvém i suchém stavu bylo pozorováno například také u česneku kuchyňského (Allium sativum) vlivem G. fasciculatum (Borde et al., 2009). Navýšení hmotnosti cibule u rostlin cibule kuchyňské (Allium cepa) v čerstvém stavu bylo pozorováno ve studii autorů Albrechtová et al. (2012) vlivem ošetření rostlin směsí šesti mykorhizních hub, převáţně z rodu Glomus. Ke zvětšení výšky rostlin a délky kořenů došlo u rostlin melounu cukrového vlivem ošetření G. mosseae, G. versiforme či R. irregularis (Huang et al., 2011). Můţe také docházet ke zvýšení počtu některých rostlinných orgánů, jako jsou listy či kořeny nebo ke změně jejich velikosti. Kupříkladu ve studii autorů Borde et al. (2009) došlo u česneku kuchyňského vlivem mykorhizní houby G. fasciculatum,

16

kromě zvětšení výšky rostlin, také k nárůstu počtu listů na rostlinu a ke zvětšení jejich plochy. V některých případech však můţe být růst rostlin vlivem AM naopak sníţen či neovlivněn, jako například ve studii autorů Zhu et al. (2012), kde ošetření rostlin kukuřice seté (Zea mays) houbou G. etunicatum nemělo vliv na hmotnost sušiny nadzemní části rostlin, hmotnost sušiny kořenů ani na výšku rostlin.

2.2.1.1.2 Vliv AM na výnosové parametry rostlin Působením AM dochází také ke změnám ve výnosových parametrech rostlin. Můţe dojít ke zvýšení výnosu plodů či semen, ke zvýšení průměrné hmotnosti plodu nebo semene, či ke zvýšení počtu plodů či semen. Vyšší výnos plodů byl pozorován například u lubenice obecné (meloun vodní, Citrullus lanatus) při pouţití mykorhizní houby G. mosseae (Ban et al., 2011). Vyšší výnos semen byl sledován u slunečnice roční (Helianthus annuus) při symbióze s houbou G. mosseae (Gholamhoseini et al., 2013) či u rýţe seté (Oryza sativa) v symbióze s R. irregularis (Li et al., 2011). Větší počet plodů na rostlinu byl sledován kupříkladu u štírovníku japonského (Lotus japonicus) při ošetření G. mosseae (Fester et al., 2011); větší počet semen na rostlinu pak například u pšenice seté (Triticum aestivum) při pouţití směsi mykorhizních hub Glomus spp. (Talaat & Shawky, 2014).

2.2.1.1.3 Vliv AM na fyziologické parametry rostlin Působením AM dochází u rostlin také k fyziologickým změnám, týkajícím se fotosyntézy, transpirace, respirace či vodního reţimu rostlin. U mykorhizních rostlin můţe docházet ke zvýšení obsahu chlorofylu a i b, i ke zvýšení jeho maximální fluorescence. Pozorováno je i navýšení obsahu dalších fotosyntetických pigmentů v rostlinách. U některých druhů zeleniny, například u papriky roční bylo pozorováno navýšení chlorofylu a a chlorofylu b v listech vlivem mykorhizní houby G. mosseae (Latef, 2011) či navýšení celkového obsahu chlorofylu v listech při ošetření rostlin houbou G. mosseae nebo R. irregularis (Cekic et al., 2012). Vyšší obsah celkového chlorofylu v listech byl pozorován také u hlávkového salátu (Lactuca sativa var. Capitata) při ošetření směsí hub G. mosseae a R. irregularis (Baslam et al., 2011). Vyšší obsah karotenoidů v listech byl zjištěn u papriky roční, ošetřené G. mosseae (Latef, 2011; Cekic et al., 2012) či R. irregularis (Cekic et al., 2012) nebo u hlávkového salátu, ošetřeného G. mosseae (Baslam et al., 2011). Vyšší maximální fluorescence 17

chlorofylu byla pozorována u kukuřice seté, ošetřené houbou G. etunicatum (Zhu et al., 2012). V některých případech můţe dojít naopak ke sníţení obsahu fotosyntetických pigmentů v listech, coţ bylo pozorováno kupříkladu u pistácie pravé (Pistacia vera) vlivem mykorhizní houby G. etunicatum (Abbaspour et al., 2011). Dále je u rostlin ve vztahu s AM pozorována zvýšená účinnost a rychlost fotosyntézy, zvýšená rychlost transpirace či vyšší vodivost průduchů. Mykorhizní rostliny mohou mít také vyšší relativní obsah vody ve svých pletivech a dokáţou efektivněji vodu vyuţívat. Vyšší rychlost fotosyntézy byla pozorována například u rostlin melounu cukrového v symbióze s G. mosseae či G. versiforme (Huang et al., 2011). Vyšší účinnost fotosyntézy pak byla sledována u rýţe seté při pouţití mykorhizní houby R. irregularis (Ruiz-Sanchez et al., 2011). Ke zvýšení rychlosti transpirace došlo u rostlin kukuřice seté, ošetřené mykorhizní houbou R. irregularis (Subramanian et al., 1995) či G. etunicatum (Zhu et al., 2012). Další z fyziologických parametrů, vodivost průduchů, byla zvýšená kupříkladu u rostlin melounu cukrového v symbióze s G. mosseae (Huang et al., 2011). Vyšší relativní obsah vody v listech měly například rostliny papriky roční po ošetření G. mosseae či R. irregularis (Cekic et al., 2012). Vyšší vyuţití vody rostlinou bylo pozorováno u kukuřice seté vlivem G. etunicatum (Zhu et al., 2012). V některých studiích byly pozorovány i další specifické vlivy mykorhizní symbiózy na fyziologické parametry rostlin, jako je například účinnější vyuţití fosforu a dusíku při fotosyntéze u rostlin sóji luštinaté (Gylcine max) vlivem houby G. mosseae (Brown & Bethlenfalvay, 1988), vyšší rychlost asimilace CO2 či vyšší aktivita elektronového transportu ve fotosystémech I a II u rostlin pšenice seté, ošetřené směsí mykorhizních hub Glomus spp. (Talaat & Shawky, 2014).

2.2.1.1.4 Vliv AM na aktivitu enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách Symbióza s AM mění v rostlinných orgánech aktivitu enzymů s antioxidační aktivitou. Antioxidační aktivita některých enzymů můţe být vlivem AM zvýšena, aktivita jiných enzymů naopak sníţena. Často je aktivita enzymů s antioxidační aktivitou ovlivněna rozdílným způsobem v závislosti na pouţitých mikroorganismech. Například u rostlin melounu cukrového bylo ve studii autorů Huang et al. (2011) pozorováno zvýšení aktivity enzymů SOD, CAT a guaiacol peroxidázy (G-POD) v nadzemních částech rostlin a SOD v kořenech, při ošetření rostlin mykorhizní houbou G. versiforme či G. mosseae; při pouţití houby R. irregularis byla aktivita enzymu SOD zvýšena 18

v nadzemních částech a v kořenech, aktivita G-POD byla zvýšena v nadzemních částech a aktivita CAT zůstala v nadzemních částech i v kořenech nezměněna. V listech rostlin papriky roční bylo sledováno zvýšení aktivity enzymu APX a sníţení aktivity GR vlivem G. mosseae; pouţití houby R. irregularis zvýšilo aktivitu APX a CAT a sníţilo aktivitu GR v listech (Cekic et al., 2012). V jiné studii bylo v listech papriky roční, vlivem G. mosseae pozorováno navýšení aktivity enzymů SOD, CAT, APX a GR (Latef, 2011). Ke zvýšení celkové antioxidační kapacity došlo v cibulích rostlin cibule kuchyňské při pouţití směsi šesti mykorhizních hub, převáţně z rodu Glomus (Albrechtová et al., 2012). Velké rozdíly v aktivitě enzymů s antioxidační aktivitou nastávají při různých stresových podmínkách. Jako příklad můţeme uvést studii autorů Porcel & Ruiz-Lozano (2004), kteří ve své studii sledovali aktivitu SOD u rostlin sóji luštinaté, která při mykorhizní symbióze s R. irregularis byla oproti kontrolním, nemykorhizním rostlinám sníţena, pokud byly rostliny pěstovány při dostatku vody. Pokud měly rostliny vody nedostatek, byla aktivita SOD u mykorhizních rostlin vyšší neţ u rostlin nemykorhizních. Naopak aktivita CAT byla v této studii zvýšena u mykorhizních rostlin při dostatku vody, při nedostatku vody nebyla její aktivita změněna.

2.2.1.1.5 Vliv AM na obsah primárních metabolitů v rostlinách Symbióza s arbuskulárními mykorhizními houbami má vliv na změny v obsahu látek primárního metabolismu rostlin. Dochází například k navýšení celkového obsahu sacharidů v rostlině či je zvyšován obsah rozpustných cukrů. Také dochází k navýšení obsahu vitaminu C v rostlinách. Zvýšený obsah rozpustných cukrů byl pozorován například v nadzemních částech a kořenech melounu cukrového vlivem G. mosseae či G. versiforme (Huang et al., 2011) nebo v listech rostlin papriky roční v symbióze s G. mosseae (Latef, 2011). K navýšení obsahu vitaminu C došlo například v kořenech chřestu lékařského (Asparagus officinalis), ošetřeného mykorhizní houbou Glomus sp. R-10 (Okada & Matsubara, 2012).

2.2.1.1.6 Vliv AM na obsah sekundárních metabolitů v rostlinách Vlivem AM dochází v rostlinách ke změnám obsahu různých látek sekundárního metabolismu. V mnoha studiích bylo pozorováno zvýšení celkového obsahu fenolických látek v mykorhizních rostlinách. Jako příklad můţeme uvést zvýšení celkového obsahu fenolických látek ve vnějších listech hlávkového salátu, vlivem směsi hub G. mossae a R. irregularis (Baslam et al., 2011). 19

Můţe docházet také ke zvýšení i ke sníţení obsahu jednotlivých sekundárních metabolitů v rostlinách, vlivem AM, nebo ke změně jejich obsahového poměru. Například ve studii autorů Devi & Reddy (2002) byl zjišťován vliv mykorhizní symbiózy s houbou G. mossae na obsah fenolických kyselin v rostlinách podzemnice olejné (Arachis hypogaea); v tomto případě došlo nejen k navýšení celkového obsahu fenolických kyselin v rostlině, ale i ke změně poměru obsahu jednotlivých kyselin, a dokonce i k produkci několika nových, bez mykorhizní symbiózy nepřítomných, látek. V mykorhizních rostlinách byla dále pozorována změna obsahu některých dalších fenolických látek. Například v plodech jahodníku (Fragaria x ananassa) došlo vlivem houby R. irregularis k navýšení obsahu kyseliny kumarové, kyanidinu, kvercetinu a kaempferolu a naopak ke sníţení obsahu kyseliny gallové, ferulové a ellagové (Castellanos-Morales et al., 2010). Vlivem AM je měněn například i obsah alkaloidů v rostlinách. V některých studiích byl sledován vliv mykorhizních hub na obsahy alkaloidů v rostlinách barvínku růţového (Catharanthus roseus) a bylo pozorováno navýšení obsahu vinkristinu, vinblastinu, katarantinu a vindolinu v listech, vlivem G. mossae (Ratti et al., 2010); navýšení obsahu vinblastinu v listech bylo sledováno i při pouţití směsi hub Glomus spp. (De la Rosa-Mera et al., 2011); při ošetření rostlin houbou G. etunicatum došlo k navýšení obsahu vinkristinu, vinblastinu, katarantinu a ajmalicinu v listech a ke sníţení obsahu katarantinu a ajmalicinu v kořenech (Andrade et al., 2013). Z dalších látek bylo pozorováno například navýšení obsahu hypericinu v nadzemních částech třezalky tečkované (Hypericum perforatum) vlivem R. irregularis (Zubek et al., 2012), navýšení obsahu saponinu glycirhizinu v rostlinách lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra) vlivem G. mossae nebo R. irregularis (Orujei et al., 2013) či zvýšení obsahu silice aliinu v rostlinách česneku kuchyňského vlivem G. fasciculatum (Borde et al., 2009).

2.2.1.1.7 Vliv AM na zvýšení odolnosti rostlin Vlivy AM, zmíněné v předchozích kapitolách, mohou rostlinám pomoci překonávat různé stresové podmínky. Pokud je mykorhizní rostlina vystavena stresu, AM je schopna negativní dopady tohoto stresu eliminovat. Jako příklad můţeme uvést studii autorů Abbaspour et al. (2011), kde byl sledován vliv mykorhizní houby G. etunicatum na hmotnost sušiny nadzemní části rostlin a na obsah chlorofylu v nadzemní části rostlin pistácie pravé při stresu z nedostatku vody: vlivem sucha došlo u rostlin v této studii ke sníţení hmotnosti nadzemní části rostlin a ke sníţení obsahu chlorofylu, symbióza s AM 20

ale byla schopna zlepšit oba sledované parametry rostlin do té míry, ţe jejich hodnota byla shodná s hodnotami u nemykorhizních rostlin v prostředí bez stresu a rostliny pak tedy tomuto stresu z nedostatku vody odolávaly lépe. Podobné výsledky byly získány i ve studii autorů Kaya et al. (2003), kdy vlivem mykorhizní houby G. clarum bylo u rostlin lubenice obecné dosaţeno stejného výnosu plodů při stresu z nedostatku vody, jako u rostlin nestresovaných a nemykorhizních, přičemţ rostliny nemykorhizní a stresované měly výnos plodů výrazně sníţen. Účinky stresu z nedostatku vody na sníţení obsahu chlorofylu v rostlinách byly eliminovány také u mykorhizních rostlin cizrny beraní (Cicer arietinum) vlivem mykorhizní houby G. etunicatum (Sohrabi et al., 2012). Relativní obsah vody v rostlinách a efektivita vyuţití vody byla vylepšena ve studii Zhu et al. (2012), kdy u rostlin kukuřice seté byly tyto parametry vlivem sucha sníţeny, mykorhizní houba G. etunicatum je však dokázala udrţet na stejné úrovni, jako u nemykorhizních rostlin bez stresu. Ve studii autorů Ni et al. (2013) měly mykorhizní houby G. mosseae i G. etunicatum pozitivní vliv na aktivitu enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách mandarinky obecné (Citrus tangerina), stresovaných nedostatkem vody; tyto houby, prostřednictvím enzymů s antioxidační aktivitou, sníţily obsah reaktivních forem kyslíku v rostlinách, čímţ byla tolerance rostlin ke stresu z nedostatku vody zvýšena. Mykorhizní rostliny mohou být vlivem AM odolnější i proti dalším stresům, například ve studii autorů Talaat & Shawky (2014) měly mykorhizní rostliny pšenice seté, stresované nadbytkem soli, vyšší relativní obsah vody v pletivech a vyšší vodivost průduchů, neţ rostliny nemykorhizní; hodnota těchto parametrů byla srovnatelná s hodnotami u rostlin nestresovaných, nemykorhizních. Bylo také pozorováno, ţe rostliny bramboříku (Cyclamen persicum), vystavené stresu z vysokých teplot, které tvořily symbiózu s mykorhizní houbou G. fasciculatum, vykazovaly niţší poškození listů usycháním, neţ rostliny nemykorhizní. (Maya & Matsubara, 2013) Vlivem AM v rostlinách také vzniká tzv. indukovaná rezistence, díky které jsou rostliny odolnější proti různým patogenům (Walters et al., 2013).

2.2.2 Bakterie podporující růst rostlin (PGPB) a jejich vlivy na rostliny Bakterie podporující růst rostlin (PGPB, z anglického „Plant Growth Promoting Bacteria“)* tvoří nesourodou skupinu bakterií, náleţících do mnoha různých taxonomických skupin. Bylo stanoveno, ţe pro zařazení mezi PGPB, musí tyto bakterie, kolonizující kořeny rostlin (obr. 2), splňovat alespoň dvě, ze tří následujících podmínek: *Poznámka: (Některými autory jsou označovány jako PGPR, „Plant Growth Promoting Rhizobacteria“) 21

1. agresivní kolonizace kořenů, 2. stimulace růstu rostlin a 3. biokontrola rostlinných patogenů (rev. Haas & Défago, 2005). Tyto bakterie mohou být podle typu kolonizace kořenů buď rhizosférické nebo endofytické. Rhizosférické bakterie se vyskytují v okolí kořenů rostlin, osidlují povrch kořenů, případně vnikají do mezibuněčných prostor povrchových vrstev kořene. Bakterie endofytické pak kolonizují prostory apoplastu kořene. Často je v tomto případě rostlinou vytvořena kořenová hlízka, kterou pak endofytické bakterie obývají. U jednotlivých rodů bakterií se jejich vlivy na rostliny liší. Bakterie, u kterých převaţují nutriční vlivy na zlepšení růstu rostlin, jsou nazývány jako tzv. biohnojiva. Tyto bakterie jsou pro růst rostlin prospěšné například fixací vzdušného dusíku, zvyšováním dostupnosti prvků pro rostlinu či indukcí nárůstu povrchu kořenů. Mezi tyto PGPB, které fixují vzdušný dusík, patří například bakterie z rodu Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, Azospirillum, Azoarcus, Azotobacter, Gluconacetobacter či Herbaspirillum. Mezi PGPB, zlepšující dostupnost půdních ţivin, patří kupříkladu někteří zástupci rodů Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Pseudomonas, Rhizobium nebo Bradyrhizobium, kteří mají schopnost rozpouštět pevně vázaný fosfor na pro rostliny lépe vstřebatelné formy. Bakterie rodu Azospirillum či Bacillus jsou schopny ovlivňovat růst a morfologii kořenů rostlin produkcí některých fytohormonů. Fytohormony produkují i další rody PGPB, jako příklad můţeme uvést Agrobacterium, Enterobacter, Pseudomonas, Rhizobium či Aeromonas, které prostřednictvím těchto fytohormonů mohou ovlivňovat růst rostlin. Tyto PGPB mohou mít na rostlinu i mnoho dalších vlivů (rev. Vessey, 2003). Další část PGPB je označována jako tzv. biopesticidy. Některé z uvedených bakterií mohou být vzhledem k jejich vlivům řazeny do obou zmíněných skupin a působit zároveň jako biohnojiva i jako biopesticidy. Bakterie jako biopesticidy chrání své hostitelské rostliny před napadením různými patogeny či při případném napadení rostlinám pomáhají s patogeny bojovat. Mezi tyto bakterie patří zejména rody Pseudomonas a Bacillus. Tyto bakterie mohou produkovat látky s antibiotickým či fungicidním účinkem nebo v rostlinách indukovat systémovou rezistenci (rev. Haas & Défago, 2005; Kavino et al., 2007).

22

Obr. 2: PGPB kolonizující kořenové vlásky banánovníku (Musa sp.). Mikrofotografie z elektronového skenovacího mikroskopu. Úsečka představuje 10 µm. Převzato z Mia et al. (2010)

2.2.2.1 Vliv PGPB na rostliny 2.2.2.1.1 Vliv PGPB na růstové parametry rostlin Vlivem PGPB dochází ke změnám v růstu rostlin. U rostlin, ošetřených PGPB, je pozorováno zvýšení čerstvé i suché hmotnosti nadzemní části rostlin i kořenů, navýšena je výška rostlin i délka kořenů. Dochází také ke změnám v růstu jednotlivých rostlinných orgánů. Vyšší hmotnost sušiny nadzemní části a kořenů byla pozorována například u rostlin pšenice seté, ošetřené bakterií Azospirillum brasilense (Bashan et al., 2006). U rostlin rýţe seté došlo k navýšení hmotnosti sušiny celé rostliny vlivem bakterií Bacillus pumilus nebo Pseudomonas pseudoalcaligenes (Jha & Subramanian, 2013). Zvýšení čerstvé hmotnosti celé rostliny bylo sledováno u cizrny beraní v symbióze s bakterií Serratia oderifera J118 (Shahzad et al., 2008). Vlivem PGPB došlo kupříkladu také k nárůstu výšky u rostlin papriky roční,

která byla ošetřena

bakterií

Bacillus vallismortis BS07 (Park et al., 2013). Ve studii autorů Sandhya et al. (2010) byly rostliny pšenice seté ošetřeny různými bakteriemi z rodu Pseudomonas a všechny z těchto bakterií působily pozitivně na zvětšení výšky nadzemní části rostlin a délky kořenů. Dále bylo sledováno například také zvětšení průměru stonku u rostlin papriky roční vlivem B. vallismortis BS07 (Park et al., 2013) či zvětšení počtu kořenů u pšenice seté, které bylo způsobeno symbiózou s různými PGPB z rodů Bacillus, Paenibacillus či Pseudomonas (Cakmakci et al., 2007).

2.2.2.1.2 Vliv PGPB na výnosové parametry rostlin PGPB mají vliv na zvýšení výnosu rostlin. Rostliny s mutualistickými symbiotickými bakteriemi mohou mít větší výnos plodů či semen nebo větší počet plodů či semen. Plody či semena rostlin s PGPB mohou mít také vyšší hmotnost nebo velikost. Vyšší výnos plodů a počet plodů byl pozorován například u papriky roční vlivem bakterie

23

B. vallismortis BS07 (Park et al., 2013). Větší výnos plodů a počet plodů byl sledován také u rostlin jahodníku, který byl ošetřen různými bakteriemi rodů Bacillus či Pseudomonas nebo jejich kombinacemi (Esitken et al., 2010; Erturk et al., 2012). Vyšší výnos semen měly rostliny cizrny beraní po ošetření bakteriemi Enterobacter gergoviae J107, Pantoea dispersa J112 či Serratia oderifera J118 (Shahzad et al., 2008). Větší průměr plodů byl pak pozorován u jabloně domácí (Malus domestica), ošetřené kombinacemi některých bakterií z rodů Bacillus a Microbacterium (Karlidag et al., 2007).

2.2.2.1.3 Vliv PGPB na fyziologické parametry rostlin PGPB ovlivňují i některé fyziologické parametry rostlin, spojené s fotosyntézou, transpirací a vodním reţimem rostlin. U rostlin s PGPB můţe docházet ke zvýšení obsahu chlorofylu i dalších fotosyntetických pigmentů v nadzemní části rostlin. Například v rostlinách papriky roční bylo sledováno navýšení chlorofylu v listech vlivem bakterie B. vallismortis BS07 (Park et al., 2013). Obsah chlorofylu byl navýšen i u rostlin pšenice seté, kde došlo ke zvýšení obsahu chlorofylu a a b v nadzemní části rostlin vlivem bakterie A. brasilense (Bashan et al., 2006) a v listech vlivem různých druhů a kmenů bakterií rodu Pseudomonas (Mishra et al., 2011). U pšenice seté došlo vlivem symbiózy s B. vallismortis BS07 také ke zvýšení obsahu některých karotenoidů v nadzemní části rostlin: byl navýšen obsah β-karotenu a xantofylů violaxantinu, anteroxantinu, zeaxantinu a luteinu (Bashan et al., 2006). Rostliny s PGPB mohou mít také vyšší relativní obsah vody ve svých pletivech, coţ bylo pozorováno například u pšenice seté, kdy měly rostliny zvýšený obsah vody v listech při ošetření různými druhy a kmeny bakterií z rodu Pseudomonas (Sandhya et al., 2010; Mishra et al., 2011).

2.2.2.1.4 Vliv PGPB na aktivitu enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách Symbióza

s PGPB

mění

v rostlinách

také

aktivitu

některých

enzymů

s antioxidační aktivitou. Aktivita enzymů můţe být vlivem různých PGPB zvýšena či sníţena v závislosti na vnějších podmínkách a pouţitých bakteriích. Jako příklad můţeme uvést

zvýšení

aktivity

a mono-dehydroaskorbát

APX, reduktázy

GR,

dehydroaskorbát

(MDHAR)

v listech

reduktázy pšenice

seté

(DHAR) vlivem

B. amyloliquefaciens 5113 či A. brasilense NO40 (Kasim et al., 2013). Ve studii autorů Jha & Subramanian (2013) bylo sledováno zvýšení aktivity peroxidázy (POX) v listech rýţe seté působením B. pumilus, P. pseudoalcaligenes či kombinací těchto dvou bakterií 24

a naopak sníţení aktivity SOD a CAT v listech vlivem těchto dvou bakterií nebo jejich směsi.

2.2.2.1.5 Vliv PGPB na obsah primárních metabolitů v rostlinách Působením PGPB můţe u rostlin docházet ke zvýšení obsahu některých sacharidů, zejména pak cukrů. Vyšší obsah rozpustných cukrů byl sledován kupříkladu v listech pšenice seté vlivem různých bakterií z rodu Pseudomonas (Sandhya et al., 2010). Z dalších plodin byl zvýšený obsah cukrů pozorován v plodech jahodníku vlivem ošetření PGPB B. megaterium RC01, Bacillus RC03, Paenibacillus polymyxa RC05 či B. simplex RC19 (Erturk et al., 2012) nebo v plodech jabloně domácí vlivem směsí PGPB Bacillus M3 s Microbacterium FS01 či Bacillus OSU-142 s Microbacterium FS01 (Karlidag et al., 2007). Měněn je i obsah vitaminu C. Ve studii autorů Erturk et al. (2012) bylo sledováno zvýšení obsahu vitaminu C v plodech jahodníku při ošetření rostlin bakteriemi B. megaterium RC01, Paenibacillus polymyxa RC05, B. simplex RC19 či Bacillus RC23. V jiných studiích naopak došlo ke sníţení obsahu vitaminu C v plodech jahodníku vlivem kombinace tří bakterií Pseudomonas BA-8, Bacillus OSU-142 a Bacillus M-3 (Pirlak & Kose, 2009; Esitken et al., 2010).

2.2.1.1.6 Vliv PGPB na obsah sekundárních metabolitů v rostlinách PGPB mohou měnit obsahy látek sekundárního metabolismu v rostlinách. V různých studiích byl sledován zvýšený celkový obsah fenolických látek v rostlinách vlivem PGPB. Došlo k navýšení celkového obsahu fenolických látek například u cizrny beraní vlivem různých druhů a kmenů bakterií Pseudomonas v celé rostlině (Sarma et al., 2002) či v kořenech (Singh et al., 2003).

2.2.3 Trichoderma (Th) a její vlivy na rostliny Trichoderma (teleomorfa Hypocrea) je rod vláknitých hub (obr. 3), náleţících do oddělení Ascomycota. Různé druhy Trichodermy se mohou vyskytovat v mnoha rozdílných prostředích a interagovat s různými organismy. Přestoţe se jedná především o houby saprotrofní a mykoparazitické, některé druhy Trichodermy mohou, kromě hub, příleţitostně parazitovat i na dalších organismech, včetně člověka. Mnoho druhů Trichodermy je však pro člověka prospěšných díky své schopnosti tvořit mutualistickou symbiózu s kořeny rostlin a vylepšovat tak různé rostlinné parametry. Při symbióze s rostlinou Trichoderma proniká do mezibuněčných prostor pokoţky a primární kůry 25

kořene. Svoji hostitelskou rostlinu pak houba chrání proti různým patogenům, primárně prostřednictvím produkce antibiotických látek a konzumací potenciálně patogenních hub v prostředí (rev. Hermosa et al., 2012; rev. Druzhinina et al., 2012). Trichoderma také produkuje některé fytohormony, čímţ můţe ovlivňovat růst rostlin (Zhang et al., 2013a).

Obr. 3: Saprotrofní a mykoparazitická vláknitá houba Trichoderma harzianum pod světelným mikroskopem. Převzato z Benítez et al. (2004).

2.2.3.1 Vliv Th na rostliny 2.2.3.1.1 Vliv Th na růstové parametry rostlin Trichoderma můţe ovlivňovat některé růstové parametry rostlin. U rostlin s Th je pozorována například vyšší čerstvá i suchá hmotnost rostlin, větší výška rostlin, nebo větší počet listů na rostlinu a větší plocha listů. Například u rostlin brukve řepáku (Brassica rapa) došlo ke zvýšení hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin a ke zvětšení výšky rostlin při ošetření Trichodermou harzianum M10 nebo T. atroviride P1 (Gallo et al., 2013). K navýšení počtu listů a plochy listů došlo u rauwolfie plazivé (Rauwolfia serpentina) vlivem ošetření T. viride

(Kaushish et al., 2012). Th můţe zlepšovat

i výnosové parametry rostlin.

2.2.3.1.2 Vliv Th na fotosyntetické parametry, antioxidační aktivitu a obsah metabolitů v rostlinách Th má také vliv na různé fyziologické parametry rostlin. Ovlivněny jsou některé parametry spojené s fotosyntézou, aktivita enzymů s antioxidační aktivitou a obsahy látek sekundárního i primárního metabolismu v rostlinách. Například v listech rostlin rauwolfie plazivé byl vlivem T. viride zvýšen obsah chlorofylu a a b a došlo také ke zvýšení vodivosti průduchů (Kaushish et al., 2012). V rostlinách brukve řepáku byla vlivem T. harzianum M10 navýšena celková antioxidační kapacita 26

(Gallo et al., 2013) a ve studii autorů Singh et al. (2014) bylo sledováno navýšení celkového obsahu fenolických látek, vyšší obsah flavonoidů a vyšší obsah vitaminu C v semenech cizrny beraní, vlivem T. harzianum THU 0816. Vyšší celkový obsah fenolických látek byl pozorován například také ve studii Rawat et al. (2011) v rostlinách pšenice seté při ošetření různými kmeny T. harzianum.

2.2.4 Kombinované mikrobiální ošetření a jeho vliv na rostliny V přirozeném půdním prostředí se mutualisticky symbiotické mikroorganismy rostlin nevyskytují samostatně, ale vţdy tvoří společenstva více různých druhů (Singh et al., 2013). V některých studiích byl sledován vliv pouţití kombinovaného mikrobiálního ošetření rostlin a bylo zjištěno, ţe symbiotické mikroorganismy mohou působit synergicky. Některé vlastnosti rostlin mohou být vylepšeny za pouţití kombinace několika různých symbiotických mikroorganismů více, neţ při pouţití pouze jednoho druhu. Například ve studii autorů Orhan et al. (2006) byl sledován vliv PGPB Bacillus OSU-142 a Bacillus M3 na některé vlastnosti rostlin maliníku obecného (Rubus idaeus) a bylo zjištěno, ţe pokud byly tyto PGPB pouţity společně, jejich vliv na zvýšení výnosu plodů byl větší, neţ kdyţ byly aplikovány samostatně. Autoři Jha & Subramanian (2013) ve své studii sledovali vliv PGPB B. pumilus a P. pseudoalcaligenes na aktivitu POX v rostlinách rýţe seté a aktivita tohoto enzymu byla výrazně zvýšena při pouţití kombinace těchto PGPB, oproti jejich samostatnému pouţití. Symbiotické

mikroorganismy

nemusí

být

kombinovány

pouze

v rámci

jednotlivých skupin (AM, PGPB, Th), ale často jsou pouţívány různé kombinace, kdy jsou vzájemně kombinovány organismy ze dvou nebo i ze všech tří skupin. Jednotlivé mikroorganismy se mohou navzájem různými způsoby ve svých účincích na rostliny podporovat. PGPB jsou v této souvislosti nazývány jako tzv. pomocné bakterie. Tyto pomocné bakterie mohou usnadňovat ostatním mikroorganismům kolonizaci kořenů hostitelských rostlin (Mamatha et al., 2002; rev. Vessey, 2003).

27

2.3 Rajče a okurka 2.3.1 Zemědělské využití a význam pro člověka Rajče jedlé (Solanum lycopersicum) je rostlina z čeledi Solanaeace, pocházející z oblasti Střední a Jiţní Ameriky. Od začátku novověku začalo být pěstování rajčete postupně rozšiřováno po celém světě, kde je dnes většinou pěstováno v odlišných klimatických podmínkách, neţ jaké panují v jeho domovině. Přestoţe rajče patří mezi vytrvalé rostliny, z důvodu jeho nesnášenlivosti mrazu je dnes pěstováno převáţně jako rostlina jednoletá. Rajče je povaţováno za jeden z nejvýznamnějších druhů zeleniny, pouţívaný ve velké míře po celém světě. Rajčata jsou součástí mnoha, dnes jiţ i tradičních, pokrmů a jsou konzumována jak v čerstvém stavu, tak i zpracovaná v dalších produktech. Plody rajčat jsou pro člověka významné i vzhledem k jejich vysokému obsahu antioxidantů. Plody jsou bohaté na karotenoidy, z nichţ je výrazným antioxidantem zejména lykopen, dále obsahují vitaminy C a E, flavonoidy a další fenolické látky. Konzumace plodů rajčat můţe díky těmto obsahovým látkám pomáhat v prevenci některých závaţných onemocnění, například sniţovat riziko vzniku některých typů rakoviny (Giovannetti et al., 2012). V roce 2012 celosvětová produkce plodů rajčat přesáhla 161 mil. tun a rajčata byla pěstována na celkové ploše více neţ 4,8 mil. ha. Mezi státy s nejvyšším podílem na produkci rajčat v roce 2012 patřila Čína, Indie, USA, Turecko a Egypt; z Evropských států pak Itálie, Španělsko, Ukrajina, Portugalsko a Řecko. V České republice byly rostliny rajčat pěstovány na ploše 381 ha a sklizeno bylo více neţ 13 000 tun plodů rajčat (FAOSTAT, 2012). Okurka setá (Cucumis sativus) je rostlina z čeledi Cucurbitaceae, původem z Indického poloostrova (Kuriachan & Beevy, 1992), odkud se její pěstování v průběhu středověku postupně rozšířilo do Evropy a později do celého světa (Paris et al., 2012). Plody okurky patří celosvětově mezi nejvíce konzumovanou zeleninu. Okurky jsou konzumovány buď v čerstvém stavu, nebo jsou zpracovávány do různých pokrmů a dalších produktů. Plody okurky obsahují různé, pro člověka prospěšné, látky, mezi něţ patří vitamin C, β-karoten, kyselina mléčná a fenolické látky. Konzumace plodů pomáhá předcházet různým onemocněním, či můţe podporovat léčbu akutních stavů, jako je

28

horečka, nespavost, bolest hlavy, či různé záněty. Plody okurky při vnějším uţití mají příznivé účinky na pleť (Sotiroudis et al., 2010; Nema et al., 2011). V roce 2012 bylo celosvětově vyprodukováno více neţ 65 mil. tun plodů okurek na celkové pěstební ploše více neţ 2 mil. ha. Na produkci okurek se v roce 2012 nejvíce podílely Čína, Turecko, Írán, Rusko a Ukrajina; z Evropských států pak Ukrajina, Španělsko, Polsko, Nizozemsko a Německo. V České republice byly okurky pěstovány na ploše 317 ha a sklizeno bylo více neţ 7000 tun plodů (FAOSTAT, 2012).

2.3.2 Vlivy symbiotických

mikroorganismů na

rostliny rajčete

a okurky V následujících

podkapitolách

budou

popsány

vlivy

mutualistických

symbiotických mikroorganismů na různé parametry u rostlin rajčete a okurky.

2.3.2.1 Vlivy na růstové parametry rostlin rajčete a okurky U rostlin rajčat a okurek dochází při symbióze s různými mutualistickými mikroorganismy ke zvýšenému růstu. Mnoha autory byla sledována zvýšená hmotnost nadzemních částí rostlin, a to jak v čerstvém, tak i v suchém stavu. Došlo také ke zvýšení hmotnosti čerstvých kořenů, i jejich sušiny. Vyšší čerstvá hmotnost nadzemní části rostlin rajčat byla pozorována například ve studii Huang et al. (2013) vlivem mykorhizní houby G. mosseae. V různých studiích bylo pozorováno navýšení hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin rajčat vlivem ošetření mykorhizními houbami R. irregularis (Hajiboland et al., 2010), G. mosseae (ZhongQun et al., 2007; Latef, 2011; Latef & Chaoxing 2011; Huang et al., 2013), G. fasciculatum či G. macrocarpum (Kapoor, 2008). Ke zvýšení hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin rajčat došlo dále při ošetření PGPB P. putida, P. fluorescens, Serratia marcescens, B. amyloliquefaciens, B. subtilis či B. cereus (Almaghrabi et al., 2013) nebo vlivem Th Trichoderma sp. či T. harzianum T969 (Azarmi et al., 2011). U rostlin okurek došlo k zvýšení hmotnosti sušiny nadzemní části vlivem ošetření AM G. mosseae (Chen et al., 2013). Rostliny rajčat a okurek se symbiotickými mikroorganismy dorůstají do větší výšky neţ rostliny bez symbiontů. K nárůstu výšky rostlin rajčat došlo vlivem různých PGPB z rodů Pseudomonas a Bacillus (Almaghrabi et al., 2013) a dále vlivem Trichodermy sp. či T. harzianum T969 (Azarmi et al., 2011) nebo kombinací T. harzianum DB 103 s G. mossae (Nzanza et al., 2011). U rostlin okurek byla výška

29

rostlin navýšena vlivem PGPB Serratia marcescens 90-166 či Flavomonas oryzihabitans INR-5 (Wei et al., 1996) nebo působením T. harzianum T-203 (Yedidia et al., 2003). Byl také sledován zvýšený růst některých rostlinných orgánů, došlo například ke zvýšení počtu listů na rostlině a ke zvýšení celkové plochy listů u rostlin rajčat vlivem T. harzianum T969 nebo Trichoderma sp. (Azarmi et al., 2011). U rostlin okurek byl pozorován zvýšený počet listů na rostlině vlivem PGPB P. putida 89B-61, Serratia marcescens 90-166 či Flavomonas oryzihabitans INR-5 (Wei et al., 1996) a větší plocha listů působením T. harzianum T-203 (Yedidia et al., 2003). V některých studiích byl efekt mikroorganismů na rostliny opačný. V některých případech došlo ke sníţení hmotnosti rostlin a ke zmenšení jejich výšky. Niţší hmotnost sušiny nadzemní části byla sledována při ošetření rostlin rajčat AM R. irregularis, G. mosseae nebo G. claroideum (Larsen et al., 2012) a menší výška rostlin při ošetření houbou G. mosseae (ZhongQun et al., 2007).

2.3.2.2 Vlivy na výnosové parametry rostlin rajčete a okurky Z výnosových parametrů rajčat došlo k navýšení výnosu plodů působením AM G. mosseae (Al-Karaki & Hammad, 2001; Latef, 2011; Huang et al., 2013), PGPB P. putida, P. fluorescens, Serratia marcescens, B. subtilis, B. cereus (Almaghrabi et al., 2013) Serratia sp. J2, Pseudomonas sp. J3 nebo Bacillus sp. BB11 (Guo et al., 2004), či vlivem Trichodermy harzianum (Bal & Altintas, 2006). U okurek byla vyšší hmotnost plodů pozorována při ošetření G.mosseae či G. versiforme (Wang et al., 2008) nebo působením PGPB P. putida 89B-61 či Serratia marcescens 90-166 (Wei et al., 1996).

2.3.2.3 Vlivy na fyziologické parametry rostlin rajčete a okurky Inokulace mutualistickými symbiotickými mikroorganismy má vliv na některé fyziologické parametry rostlin rajčat a okurek. Některé fyziologické parametry, jako je obsah chlorofylu v rostlině, jsou pouţívány jako indikátor zdraví rostlin. U rostlin rajčat bylo pozorováno zvýšení obsahu chlorofylu v listech vlivem G. mosseae (Latef & Chaoxing 2011) či R. irregularis (Hajiboland et al., 2010). V případě okurek bylo navýšení chlorofylu v listech sledováno u rostlin, ošetřených T. harzianum T-203 (Yedidia et al., 2003), T. harzianum SQR-T037 (Zhang et al., 2013a) nebo kombinací PGPB B. cereus AR156, B. subtilis SM21 a Serratia sp. XY21 (Wang et al., 2012). Naopak ve studii Azarmi et al. (2011) došlo při ošetření rostlin rajčat T. harzianum T447 ke sníţení obsahu chlorofylu v listech. 30

U rostlin rajčat byla také pozorována zvýšená transpirace vlivem R. irregularis (Hajiboland et al., 2010).

2.3.2.4 Vlivy na obsah antioxidantů a dalších látek v rostlinách rajčete a okurky Působením mutualistických symbiotických mikroorganismů dochází u rostlin rajčat a okurek ke změnám v obsahu antioxidantů a dalších látek primárního a sekundárního metabolismu. V různých studiích bylo vlivem mikrobiálního ošetření v rostlinách rajčat a okurek pozorováno navýšení některých enzymů s antioxidační aktivitou, zvýšení celkového obsahu fenolických látek a navýšení obsahu některých dalších látek. Zvýšení aktivity enzymu SOD bylo pozorováno v nadzemní části rostlin rajčat vlivem R. irregularis (Hajiboland et al., 2010), v listech vlivem G. mosseae (Latef, 2011; Latef a Chaoxing, 2011) a v kořenech vlivem R. irregularis (Hajiboland et al., 2010) či G. mosseae (ZhongQun et al., 2007). K navýšení aktivity CAT došlo v nadzemní části a kořenech působením R. irregularis (Hajiboland et al., 2010) a v listech vlivem G. mosseae (Latef, 2011). APX byla navýšena v listech rajčat při ošetření rostlin G. mosseae (Latef, 2011; Latef a Chaoxing, 2011) a v nadzemní části a kořenech vlivem T. harzianum T-22 (Mastouri et al., 2010). Dále došlo u rostlin rajčat, ošetřených G. mosseae k navýšení POD v kořenech (ZhongQun et al., 2007) a v listech (Latef & Chaoxing, 2011). GR byla navýšena v nadzemní části rostlin rajčat vlivem T. harzianum T-22 (Mastouri et al., 2010). V listech okurek došlo k navýšení PPO a G-POD působením G. mosseae (Chen et al., 2013). Celkový obsah fenolických látek byl zvýšen v nadzemní části rostlin rajčat při ošetření G. fasciculatum či G. macrocarpum (Kapoor, 2008) a v listech okurek vlivem G. mosseae (Chen et al., 2013). Pozorováno bylo kupříkladu také navýšení obsahu cukrů v listech rajčat vlivem G. mosseae (Latef & Chaoxing, 2011) či navýšení obsahu lykopenu v plodech rajčat působením R. irregularis (Giovannetti et al., 2012).

31

2.4 Mechanismy změn obsahu antioxidantů v rostlinách vlivem mutualisticky symbiotických mikroorganismů 2.4.1 Základní struktura rostlinného metabolismu Rostlinný metabolismus je rozdělen, stejně jako u ostatních organismů, na primární a sekundární metabolismus. Děje primárního metabolismu jsou nezbytné pro ţivot buněk a probíhají velmi podobným způsobem u všech ţivých organismů. Mezi produkty primárního metabolismu patří zejména lipidy, proteiny, sacharidy a nukleové kyseliny. Některé látky s původem v primárním metabolismu rostlin mohou působit jako antioxidanty. Mezi tyto antioxidační látky patří různé enzymy s antioxidační aktivitou a například také vitamin C (kyselina askorbová) a glutation (Schaaf et al., 1995). Děje sekundárního metabolismu jsou, na rozdíl od metabolismu primárního, specifické pro jednotlivé skupiny organismů a mohou se lišit i v rámci příbuzných druhů. Sekundární metabolity rostlin se dělí do několika skupin, z nichţ nejobsáhlejší tvoří fenolické látky. Mezi sekundárními metabolity rostlin najdeme mnoho antioxidantů, zejména pak velké mnoţství látek s antioxidačním účinkem se nachází mezi zmíněnými fenolickými látkami (rev. Giada et al., 2013). Na obrázku 4 jsou znázorněny vztahy mezi primárním a sekundárním metabolismem rostlin, základní skupiny rostlinných metabolitů a struktura drah, vedoucích k jejich vzniku.

Obr. 4: Vzájemné vztahy mezi primárním a sekundárním metabolismem rostlin; základní biosyntetické dráhy a skupiny rostlinných metabolitů. Převzato z rev. Giada (2013), upraveno.

32

2.4.2 Fenolické látky a jejich biosyntéza Rostlinné fenolické látky jsou velmi diverzifikovanou skupinou látek s velkými strukturními odlišnostmi. V rostlinách byly identifikovány desítky tisíc fenolických látek a jejich počet stále stoupá (Cheynier et al., 2013). Na základě struktury uhlíkového řetězce byly určeny základní skupiny fenolických látek (rev. Giada 2013). Tyto skupiny jsou znázorněny na obrázku 5.

Obr. 5: Základní skupiny fenolických látek podle uspořádání jejich uhlíkového řetězce. Převzato z rev. Giada (2013), upraveno.

33

Většina fenolických látek je v rostlinách syntetizována prostřednictvím dráhy kyseliny šikimové přes dráhu fenylpropanoidovou (rev. Giada, 2013). Šikimátová dráha je zahájena reakcí erytróza-4-fosfátu s fosfoenolpyruvátem (PEP), při níţ vzniká kyselina dehydrošikimová, ze které je dále syntetizována kyselina šikimová za katalýzy enzymem šikimát dehydrogenáza (SKDH), (Diaz & Merino, 1997). Z kyseliny šikimové poté vzniká aminokyselina fenylalanin. Dalším krokem biosyntézy fenolických látek je reakce, jeţ je prvním krokem fenylpropanoidové dráhy. Klíčovým enzymem, účastnícím se tohoto kroku, je fenylalanin amonium lyáza (PAL). PAL katalyzuje deaminaci fenylalaninu za vzniku kyseliny skořicové (rev. Vogt, 2010). Z kyseliny skořicové je dále syntetizována kyselina p-kumarová za katalýzy enzymem cinamát-4-hydroxylázou (C4H).

Poslední

reakce

fenylpropanoidové

dráhy

je

katalyzována

enzymem

4-kumarát:koenzym A ligázou (4CL) a v tomto kroku z kyseliny p-kumarové vzniká p-kumaroyl CoA (Ehlting et al., 2001). Z p-kumaroyl CoA dále vzniká nespočet různých druhů

fenolických

látek

a z tohoto

důvodu je

povaţován za

pravděpodobně

nejvýznamnější prekurzor biosyntézy fenolických látek v rostlinách (rev. Vogt, 2010). Dalším významným krokem je reakce, vedoucí z fenylpropanoidové dráhy k syntéze flavonoidů, při které reaguje p-kumaroyl CoA s malonyl CoA za vzniku prekurzoru flavonoidů, naringenin chalkonu. Tato reakce je katalyzována enzymem chalkon syntázou (CHS), (rev. Lillo et al., 2008). Popsané biosyntetické dráhy fenolických látek jsou znázorněny na obrázku 6.

2.4.3 S prolinem vázaný oxidační pentózafosfátový cyklus a jeho propojení s biosyntézou fenolických látek Dle některých studií je biosyntéza fenolických látek stimulována prostřednictvím oxidačního pentózafosfátového cyklu s přispěním biosyntézy iminokyseliny prolinu (rev. Shetty & Kalidas, 1996). V první fázi pentózafosfátového cyklu probíhají reakce, při kterých je glukóza-6-fosfát postupně přeměněn na ribulóza-5-fosfát. Nejdůleţitějším enzymem první reakce, a pravděpodobně i celého pentózafosfátového cyklu, je glukóza-6-fosfát dehydrogenáza (G6PDH). V tomto cyklu vznikají, mimo jiné, dvě molekuly NADPH (nikotinamid adenin dinukleotidfosfát), účastnící se dále různých reakcí primárního metabolismu. Čím více je buňkou produkováno a dále spotřebováváno NADPH, tím větší je následně koncentrace NADP+, přičemţ aktivita enzymu G6PDH je tímto NADP+ stimulována. Při biosyntéze prolinu je spotřebováváno NADPH, vzniká tedy NADP+. Čím větší mnoţství prolinu je syntetizováno, tím větší mnoţství NADP + 34

vzniká, a tím vyšší je aktivita enzymu G6PDH. V pentózafosfátovém cyklu dále z ribulóza-5-fosfátu vzniká erytróza-4-fosfát, která se účastní prvního kroku dráhy kyseliny šikimové a podílí se tedy na vzniku fenolických látek. Čím vyšší je tedy biosyntéza prolinu, tím více je podporován vznik fenolických látek (Shetty et al., 2003).

Obr. 6: Znázornění hlavních drah biosyntézy fenolických látek. PAL: fenylalanin amonium lyáza; 4CL: 4-kumaroyl:CoA-ligáza; CHS: chalkon syntáza; C4H: cinamát-4-hydroxyláza; SKDH: šikimát dehydrogenáza (katalyzuje přeměnu kyseliny dehydrošikimové na kyselinu šikimovou, reakce není zobrazena); HCT: hydroxycinamoyl transferáza; C3H: p-kumarát-3-hydroxyláza; CHI: chalkon iomeráza; ANS: antokyanidin syntáza; DFR: dihydroflavonol reduktáza; FS: flavon syntáza; F3H: flavanon 3-hydroxyláza; IFS: izoflavon syntáza; ANR: antokyanidin reduktáza; LAR: leukoantokyanidin reduktáza. Červeně jsou vyznačeny klíčové enzymy biosyntézy. Převzato z rev. Cheynier (2013) upraveno.

2.4.4 Mechanismy změn obsahu fenolických látek v rostlinách vlivem symbiózy s mutualistickými mikroorganismy Je známo, ţe symbiotické mikroorganismy rostlin jsou schopny svým působením měnit obsahy fenolických látek v rostlinách; mechanismy těchto změn však nejsou zatím dokonale známy. Obsah fenolických látek v rostlinách můţe být

ovlivňován

35

prostřednictvím primárního, i sekundárního metabolismu rostlin, a to působením na různé kroky biosyntetických drah. Bylo zjištěno, ţe při mikrobiální symbióze dochází v rostlinách k navýšení obsahu iminokyseliny prolinu. Prolin sám o sobě působí jako antioxidant (Shetty et al., 2003). Navýšení prolinu bylo pozorováno u rostlin, ošetřených AM (Krishna et al., 2005), PGPB (Mishra et al., 2011) i Th (Rawat et al., 2011), a to se současným navýšením celkového obsahu fenolických látek. Ve studii autorů Chen et al. (2013) byla pozorována zvýšená aktivita enzymu G6PDH a zároveň navýšení obsahu fenolických látek v rostlinách vlivem AM. Je tedy pravděpodobné, ţe jedním z mechanismů navýšení obsahu fenolických látek v rostlinách, je zvýšení tvorby prekurzorů pro sekundární metabolismus rostlin, vlivem zvýšené aktivity enzymu G6PDH v pentózafosfátovém cyklu, jeţ je navýšena zvýšenou biosyntézou prolinu, která je indukována symbiotickými mikroorganismy (rev. Shetty, 1996). Dále byly zjištěny různé vlivy symbiotických mikroorganismů na aktivitu některých enzymů, zapojených do biosyntézy fenolických látek. Autoři Chen et al. (2013) ve své studii pozorovali vliv AM na zvýšení aktivity enzymu SKDH, čímţ byla podporována syntéza kyseliny šikimové. Asi

nejznámějším

mechanismem

vlivu

mutualistických

symbiotických

mikroorganismů na obsah fenolických látek v rostlinách je změna aktivity enzymu PAL. U rostlin v symbióze s AM byla zjištěna zvýšená exprese genů pro PAL (Zhang et al., 2013b). Zvýšení obsahu PAL v rostlinách bylo pozorováno u rostlin ošetřených AM (Blee & Anderson, 1996; Chen et al., 2013), PGPB (Dutta et al., 2008; Sarma 2002) Th (Brotman et al., 2013), i u kombinovaného mikrobiálního ošetření (Lamba et al., 2008; Singh et al., 2013). Dalším enzymem, jehoţ aktivita můţe být ovlivněna symbiotickými mikroorganismy je 4CL; v případě tohoto enzymu byla pozorována jeho zvýšená aktivita u rostlin ošetřených Th (Brotman et al., 2013). Zvýšená aktivita byla zjištěna i u enzymu CHS u mykorhizních rostlin (Blee & Anderson 1996; Zhang et al., 2013b). Zvýšená aktivita těchto enzymů můţe vést k navýšení obsahu fenolických látek v rostlinách. Jaké jsou konkrétní příčiny zvýšení aktivit těchto enzymů, není zcela objasněno. Autory Harrison & Dixon (1994) bylo sledováno zvýšení aktivity enzymů PAL a CHS u mykorhizních rostlin pouze v buňkách, obsahujících arbuskuly.

Autoři Blee

& Anderson (1996) v buňkách s arbuskulami pozorovali akumulaci mRNA, kódující enzymy PAL a CHS, přičemţ sousední buňky, ani buňky s houbovými hyfami bez arbuskul tyto mRNA neobsahovaly; vyšší akumulace těchto transkriptů byla přítomna 36

v buňkách s mladými, řídce větvenými arbuskulami, v porovnání s buňkami, obsahujícími arbuskuly starší a bohatě větvené. Vyšší aktivita PAL je často pozorována pouze v určitém období po vzniku symbiózy, postupem času klesá na úroveň, která můţe být i niţší, neţ u kontrolních rostlin bez mikrobiálního ošetření; tento jev byl pozorován u rostlin ošetřených PGPB, Th, i jejich kombinacemi (Lamba et al., 2008; Singh et al., 2013). Ve studii autorů Singh et al. (2013) bylo sledováno, ţe v době, kdy byla aktivita PAL zvýšena, hodnoty její aktivity u rostlin, ošetřených Th nebo PGPB, převyšovaly nejen aktivitu u kontrolních rostlin bez ošetření, ale i aktivitu PAL u rostlin, ošetřených patogenní houbou. Podle jedné ze studií, je aktivita enzymů PAL a CHS ovlivňována signalizační kaskádou, v níţ je zapojen H2O2, kyselina salicylová (SA) a oxid dusnatý (NO). Po kolonizaci kořenů mikroorganismy, v tomto případě AM, dochází v rostlinných buňkách k navýšení reaktivních forem kyslíku, mimo jiné i H2O2. Vlivem H2O2 dochází k navýšení obsahu SA v rostlinách a vlivem SA je navyšován obsah NO. Tyto molekuly, z nichţ nejúčinnější je pravděpodobně NO, pak aktivují enzymy PAL a CHS, čímţ přispívají k navýšení produkce fenolických látek v rostlině (Zhang et al., 2013b). Ve studii autorů Zhang et al. (2013b) bylo také pozorováno, ţe nejvyšší syntéza a akumulace H2O2 se objevila po kolonizaci kořenů AM a postupem času klesala. Tento jev by mohl mít spojitost s postupným sniţováním aktivity PAL, popsaným výše. Bylo také zjištěno, ţe aktivita PAL je pravděpodobně zvyšována i působením kyseliny jasmonové (JA), jejíţ obsah je zvyšován při symbióze rostlin s AM (Kapoor, 2008). U rostlin ošetřených PGPB nebo Th bylo ve studii autorů Singh et al. (2013) a u AM ve studii autorů Chen et al. (2013) pozorováno zvýšení enzymu polyfenol oxidázy (PPO). Enzym PPO katalyzuje oxidaci fenolů na toxické chinony (Mayer, 2006), čímţ také můţe ovlivňovat mnoţství fenolických látek v rostlině (Chen et al., 2013).

2.4.5 Mechanismy změn obsahu dalších látek s antioxidačními vlastnostmi v rostlinách vlivem symbiózy s mutualistickými mikroorganismy Kromě fenolických látek jsou vlivem symbiózy s mikroorganismy měněny obsahy i dalších látek sekundárního, ale i primárního metabolismu rostlin. Ve studii autorů Brotman et al. (2013) bylo v rostlinách, ošetřených Th, pozorováno navýšení obsahu indolových glukosinolátů, coţ je jedna ze skupin látek, 37

patřící mezi rostlinné sekundární metabolity. Indolové glukosinoláty nemají antioxidační aktivitu, ale jejich degradací vznikají látky (Agerbirk et al., 2009), které antioxidační vlastnosti mají (Najafi et al., 2012). Ve studii autorů Brotman et al. (2013) bylo zároveň sledováno zvýšení exprese genu pro transkripční faktor HIG1/MYB51. Transkripční faktor HIG1/MYB51 aktivuje promotory genů pro biosyntézu indolových glukosinolátů, coţ vede ke zvýšení jejich tvorby v rostlinách (Gigolashvili et al., 2007). Th tedy patrně působí na stimulaci exprese genu pro HIG1/MYB51 a tím obsah indolových glukosinolátů v rostlinách zvyšuje. Jak jiţ bylo zmíněno v kapitole 2.4.4, vlivem AM dochází v rostlinných buňkách ke zvýšení obsahu SA (Zhang et al., 2013b). Navýšení obsahu SA bylo pozorováno i u rostlin ošetřených PGPB (Singh et al., 2003). Sama SA má antioxidační vlastnosti (Kang et al., 2013). Autory Kang et al. (2013) byl sledován vliv externě aplikované SA na expresi genů pro enzymy askorbát-glutationového cyklu a na biosyntézu kyseliny askorbové a glutationu a bylo pozorováno, ţe SA zvyšuje expresi genů pro enzymy s antioxidační aktivitou, glutation-S-transferázu (GST), GR a GPX a vlivem těchto enzymů je zvýšena biosyntéza kyseliny askorbové a glutationu. Je tedy moţné, ţe zvýšený obsah SA v rostlinách, vlivem symbiotických mikroorganismů, reguluje biosyntézu

kyseliny

askorbové

a

glutationu

prostřednictvím

enzymů

askorbát-glutationového cyklu. Například ve studii autorů Cakmakci et al. (2007) byla u rostlin, ošetřených PGPB, sledována vyšší aktivita enzymů GST a GR. Autoři Alguacil et al. (2003), Latef (2011) či Wu et al. (2006) ve svých studiích sledovali navýšení aktivity GR v rostlinách s AM. Porcel & Ruiz-Lozano (2004) sledovali u mykorhizních rostlin navýšení aktivity APX a GR. Dále bylo pozorováno u mykorhizních rostlin navýšení obsahu steviol-glykosidů. Steviol-glykosidy nejsou antioxidanty, ale jsou to látky pro člověka významné, vyuţívané jako sladidla. Tyto látky jsou biosyntetizovány přes dráhu 2-C-metyl-d-erytritol-4-fosfátu. Aktivita této dráhy je podporována vlivem JA. Obsah JA byl vlivem AM v rostlinách navýšen, coţ nejspíše vedlo i ke zvýšení obsahu steviol-glykosidů (Mandal et al., 2013). V další studii bylo sledováno navýšení obsahu alkaloidů v rostlinách, ošetřených PGPB a zároveň navýšení prolinu. Autoři této studie předpokládají, ţe prolin můţe být prekurzorem pro biosyntézu alkaloidů a z tohoto důvodu došlo k jejich navýšení v rostlinách (Ghorbanpour et al., 2013).

38

2.4.6 Mechanismy změn obsahu některých enzymů s antioxidační aktivitou v rostlinách vlivem symbiózy s mutualistickými mikroorganismy Vlivem mutualistických symbiotických mikroorganismů je v rostlinách často měněna aktivita enzymů s antioxidační aktivitou. Některé mechanismy změn obsahu u některých enzymů s antioxidační aktivitou byly jiţ zmíněny v předchozích kapitolách. Tato kapitola je zaměřena na enzymy, účastnící se boje s reaktivními formami kyslíku v buňkách. Po

kolonizaci

kořenů

mikroorganismy

dochází

v rostlinných

buňkách

k nadprodukci kyslíkového radikálu O2 -. Odpovědí rostliny ne tento stav je zvýšení aktivity enzymu SOD, která katalyzuje dismutaci tohoto O 2- na H2O2 a vodu. Vlivem působení SOD vzniká v buňkách nadměrné mnoţství H2O2 a z tohoto důvodu dochází k navýšení aktivity enzymu CAT, která katalyzuje dismutaci H 2O2 na kyslík a vodu. Navýšena můţe být i aktivita enzymu APX, jeţ redukuje H2O2 na vodu za pouţití kyseliny askorbové a elektronového donoru (Nautiyal et al., 2008). Ve studii autorů Brotman et al. (2013) byla v rostlinách po ošetření Th sledována zvýšená exprese genů pro SOD a CAT.

39

3 Materiál a metody V rámci experimentální části, uskutečněné v roce 2012, proběhlo celkem šest skleníkových pokusů (obr. 7). Pokusy byly rozděleny na hrnkové skleníkové pokusy a poloprovozní skleníkové pokusy. Pokusnými plodinami byly rostliny rajčete (Solanum lycopersicum) a okurky (Cucumis sativus).

Obr. 7: Znázornění jednotlivých pokusů (1 – 6) v čase. Rozdělení, označení a načasování pokusů a pouţité plodiny

Pokusné rostliny byly pěstovány hydroponicky. Jako nosič byly pouţity pěstební kostky a rohoţe z čedičové vaty od společnosti Bomat, s.r.o. Ţiviny byly rostlinám dodávány prostřednictvím ţivného roztoku, který byl ve většině pokusů přiváděn systémem kapkové závlahy ke kořenům rostlin.

3.1 Použité mikroorganismy Při pokusech byl sledován vliv symbiotických mikroorganismů na různé parametry rostlin rajčete a okurky. K ošetření rostlin byla pouţita směs arbuskulárních mykorhizních hub (AM), směs bakterií podporujících růst rostlin (PGPB) a Trichoderma (Th). Tato tři ošetření byla pouţita buď samostatně, nebo v různých vzájemných kombinacích. Tyto varianty ošetření se lišily u jednotlivých pokusů (viz tabulka 1).

40

Sloţení pouţitých ošetření byla následující: AM:

Rhizophagus irregularis (dříve Glomus intraradices) BEG140 Rhizophagus irregularis S7 Glomus claroideum BEG210 Glomus microaggregatum BEG56 Glomus versiforme Výrobce: Symbiom, s.r.o.

PGPB:

Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403 Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402 Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372 Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370 Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371 Výrobce: BioFil Kft., Maďarsko

Th:

Trichoderma harzianum Th78 Výrobce: Microgaia Biotech, Murcia, Španělsko

Tab. 1: Přehled variant mikrobiálního ošetření pouţitého v jednotlivých pokusech. Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), Th – Trichoderma harzianum Th78. Symbol „+“ ve sloupci „Varianta“ mezi jednotlivými ošetřeními značí, ţe byla tato ošetření pouţita jako směs. Symboly ve sloupcích „Mikrobiální ošetření“ značí, zda konkrétní mikrobiální ošetření bylo přítomno (+) nebo nebylo přítomno (-).

41

3.2 Hrnkové skleníkové pokusy Hrnkové skleníkové pokusy probíhaly v prostorách Botanického ústavu AV ČR v.v.i. v Průhonicích. Proběhly celkem tři hrnkové pokusy: pokus č. 1: Okurky, pokus č. 2: Rajčata I a pokus č. 3: Rajčata II. U všech těchto hrnkových pokusů byly pouţity stejné varianty mikrobiálního ošetření (tab. 1 v kapitole 3.1). Symbiotické mikroorganismy byly aplikovány ve formě prášku, který byl vsypán do otvoru vyhloubeného v pěstební kostce, těsně před zasazením rostlin. Do tohoto otvoru s práškem byly následně rostliny vsazeny svým kořenovým systémem, aby mohlo dojít ke kolonizaci kořenů. V případě varianty AM byl aplikován 1 g AM v prášku na jednu rostlinu, u varianty PGPB bylo aplikováno 0,1 g práškových PGPB na rostlinu, u varianty AM+PGPB byl aplikován 1 g prášku AM a 0,1 g prášku PGPB a u varianty Th byl aplikován 1 g práškové Trichodermy na rostlinu. Kontrolní varianta byla bez mikrobiálního ošetření. Práce probíhala za pouţití sterilních nástrojů i ostatního vybavení, aby nedošlo k neţádoucí mikrobiální kontaminaci pokusných rostlin. Rostlinám v pokusech byly dodávány ţiviny prostřednictvím ţivného roztoku. Sloţení jednotlivých ţivných roztoků je uvedeno v tabulce 2. Ošetřené rostliny byly v pokusech rozmístěny do řádků způsobem, znázorněným v tabulce 3. Jednotlivé pokusy se lišily počtem řádků. Pokus 1 měl sedmnáct řádků, pokus 2 měl dvanáct řádků a pokus 3 měl deset řádků. Tab. 2: Sloţení ţivných roztoků, pouţívaných v hrnkových skleníkových pokusech. Výsledný Whiteův roztok: zásobní roztok A ředěn 10 ml na 1 l destilované vody, zásobní roztoky B a C ředěny 1 ml na 1 l destilované vody; následně byly naředěné roztoky smíchány v poměru 1:1:1. Výsledný Hoaglandův roztok: 1 ml z kaţdého zásobního roztoku byl smísen s destilovanou vodou do konečného objemu 1l. Whiteův živný roztok zásobní rozrok A KCl KNO3 Ca(NO3)2 . 4H2O MnCl2 .4H2O KI H3BO3 ZnSO4 . 7H2O zásobní roztok B CuSO4 . 5H2O Na2MoO4 . 2H2O zásobní roztok C KH2PO4

mg/l 1,35 24 29,52 0,075 0,075 0,15 0,075 g/l 0,001 0,00017

Hoaglandův živný roztok zásobní roztoky: č. roztoku sloučenina 1 Ca(NO)3 * 4H2O 2 KNO3 3 KH2PO4 4 MgSO4 * 7H2O 5 Fe EDTA 6 mikroprvky: H3BO3 MnCl2 * 4H2O ZnSO4 * 7H2O (NH4)6Mo7O24 * 4H2O CuSO4 * 5H2O

¼ roztok

½ roztok

g/l 295,01 126,50 34,00 61,50 24,50

g/l 590,02 253,00 68,00 123,00 49,00

14,30 14,00 1,50 0,74 0,40

28,60 28,00 3,00 1,48 0,80

g/l 12,2

42

Tab. 3: Rozmístění jednotlivých rostlin v pokusech. Osy znázorňují počet řádků u jednotlivých pokusů (pokus č. 1: Okurky, pokus č. 2:Rajčata I, pokus č. 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78.

3.2.1 Pokus 1: Okurky Pokus probíhal v termínu 2. 5. – 10. 7. 2012. Dva týdny před zaloţením pokusu byla vyseta semena okurek do sterilního písku a zalévána destilovanou vodou. V pokusu byly pouţity rostliny okurky seté salátové (Cucumis sativus Media, Německo). Po vyklíčení byly týden staré semenáčky přesazeny jednotlivě do sadbovačů, aby bylo zabráněno proplétání kořenů mezi jednotlivými rostlinami. V den zaloţení pokusu byly připraveny pěstební kostky z čedičové vaty, o rozměrech 100 x 75 x 70 mm, do plastových misek a zality destilovanou vodou tak, aby byly plně nasáklé a připravené pro výsadbu rostlin. Poté bylo do pěstebních kostek aplikováno mikrobiální ošetření dle postupu, popsaného v kapitole 3.2. Rostliny byly rozděleny do pěti variant (tab. 1 v kapitole 3.1): AM, PGPB, AM+PGPB, Th a Kontrola. Kaţdá varianta obsahovala 17 opakování (rostlin). Rostliny byly po vsazení do pěstebních kostek upevněny zasypáním

43

umělým sterilním substrátem. V tomto pokusu nebyly pouţity pěstební rohoţe, rostliny byly pěstovány pouze v pěstebních kostkách (obr. 8).

Obr. 8: Znázornění způsobu pěstování rostlin okurek v pokusu 1.

První dva týdny trvání pokusu byly rostliny zalévány Whiteovým ţivným roztokem, poté po zbytek času trvání pokusu ¼ Hoaglandovým ţivným roztokem (sloţení roztoků viz tabulka 2 v kapitole 3.2). Zalévání probíhalo dle potřeby za pouţití konve. Sklizeň plodů proběhla dne 4. 7.; nadzemní část rostlin a kořeny byly sklizeny 10. 7. Byla zjišťována hmotnost plodů na rostlinu, hmotnost jednotlivých plodů a hmotnost sušiny nadzemní části rostlin a závislost těchto parametrů na pouţitých mikrobiálních ošetřeních. Dále byla stanovována kolonizace kořenů mykorhizními houbami. Na obrázku 9 jsou zachyceny rostliny v den zaloţení pokusu, na obrázku 10 pak těsně před sklizní plodů. V průběhu pokusu byly rostliny napadeny třásněnkami, proto byl prováděn postřik pesticidním přípravkem (pesticid Karate od výrobce Agro Bio Opava, s.r.o., dávkování dle návodu, aplikace 18. 5., 24. 5., 2. 6., 8. 6.).

44

Obr. 9: Pokus 1: Okurky A: rostliny okurek po zaloţení pokusu B: detail rostlin Fotografováno 2. 5. 2012

Obr. 10: Pokus 1: Okurky A: rostliny okurek před sklizní B: detail rostlin Fotografováno 4. 7. 2012

3.2.2 Pokus 2: Rajčata I Pokus probíhal v termínu 13. 6. – 17. 7. 2012. Tři týdny před zaloţením pokusu byla vyseta semena rajčat do sterilního písku a zalévána destilovanou vodou. V pokusu byly pouţity rostliny rajčete jedlého tyčkového (Solanum lycopersicum Tornádo F1, výrobce: Semo, a.s.). Po vyklíčení byly dvoutýdenní semenáčky přesazeny jednotlivě do sadbovačů, aby nedocházelo k proplétání mezi kořeny jednotlivých rostlin. Do plastových misek byly připraveny pěstební kostky z čedičové vaty, o rozměrech 100 x 75 x 70 mm, a zality ½ Hoaglandovým ţivným roztokem (sloţení roztoku viz tabulka 2 v kapitole 3.2) aţ do úplného nasáknutí. V den zaloţení pokusu bylo do pěstebních kostek aplikováno mikrobiální ošetření (postup viz kapitola 3.2) a následně zasazeny rostliny a upevněny sterilním umělým substrátem. Bylo vytvořeno pět variant (tab. 1 v kapitole 3.1): AM, PGPB, AM+PGPB, Th a Kontrola. Kaţdá varianta obsahovala 12 opakování (rostlin). 45

Rostliny byly zalévány ½ Hoaglandovým ţivným roztokem za pouţití konve aţ do 28. 6., kdy byly rostliny v pěstebních kostkách přemístěny na pěstební rohoţe, o rozměrech 150 x 100 x 250 mm, a umístěny do plastových misek (obr. 11). Rohoţe byly na tuto délku nařezány, ze dvou bočních stran tedy nebyly obaleny plastovým obalem. Rostliny byly od této chvíle zalévány pomocí systému kapkové závlahy. Zalévání probíhalo dle potřeby. Z důvodů konstrukce tohoto závlahového systému muselo být přeorganizováno rozmístění rostlin takovým způsobem, ţe v řadách bylo šest rostlin místo pěti. Rozmístění všech pěti rostlin v kaţdé z prvních deseti řad bylo zachováno tak, jak je uvedeno v tabulce 2 v kapitole 3.2 a všechny rostliny z řady č. 12 a dvě rostliny z řady č. 11 byly náhodně rozmístěny do ostatních řad tak, ţe vţdy tvořily šestou rostlinu v řadě (obr. 12).

Obr. 11: Znázornění způsobu pěstování rostlin rajčat v pokusu 2 a 3.

V systému závlahy bylo pouţito dávkovací čerpadlo od firmy Dosatron, prostřednictvím

kterého

byl

mísen

koncentrát

Hoaglandova

ţivného

roztoku

s destilovanou vodou na ½ Hoaglandův roztok. Tento roztok byl následně přes závlahové potrubí přiváděn do hadiček kapkové závlahy, vedoucích k jednotlivým rostlinám. Popsaný závlahový systém byl stejným způsobem pouţíván i v případě pokusu 3. Dne 9. 7. proběhlo první měření výšky rostlin rajčat. Z důvodu intoxikace pokusu cizorodou látkou musel být pokus předčasně ukončen. Dne 17. 7. proběhlo druhé měření výšky rostlin a pět rostlin od kaţdé varianty (rostliny č. 6, 7, 8, 9, 10) bylo sklizeno a byla 46

u nich zjišťována hmotnost sušiny nadzemní části a kolonizace kořenů mykorhizními houbami. Rostliny byly v průběhu pokusu napadeny třásněnkami a z tohoto důvodu ošetřovány pesticidním přípravkem (pesticid Karate od výrobce Agro Bio Opava, s.r.o., dávkování dle návodu, aplikace: 19. 6., 25. 6.). Z důvodu předčasného ukončení tohoto pokusu byl zaloţen pokus 3 se stejným rozvrţením.

Obr. 12: Pokus 2: Rajčata I Rozmístění rostlin napojených na systém kapkové závlahy. Fotografováno 4. 7. 2012

3.2.3 Pokus 3: Rajčata II Pokus probíhal v termínu 10. 9. – 17. 12. 2012. V pokusu byly pouţity rostliny rajčete jedlého tyčkového (Solanum lycopersicum Tornádo F1, výrobce: Semo, a.s.). Příprava rostlin před zaloţením pokusu a jeho samotné zaloţení probíhalo stejným způsobem jako v případě pokusu 2 (viz kapitola 3.2.2). Bylo vytvořeno pět variant (tab. 1 v kapitole 3.1): AM, PGPB, AM+PGPB, Th a Kontrola. Kaţdá varianta obsahovala 10 opakování (rostlin), avšak některé rostliny v průběhu pokusu odumřely nebo je nebylo moţné z různých důvodů hodnotit. Konečný počet hodnotitelných rostlin byl u jednotlivých variant následující: AM: 9 rostlin, PGPB: 8 rostlin, AM+PGPB: 9 rostlin, Th: 10 rostlin, Kontrola: 7 rostlin. Rostliny byly přemístěny na pěstební rohoţe a zapojeny do systému kapkové závlahy jiţ v první den trvání pokusu. Misky, ve kterých byly umístěny pěstební rohoţe, byly zakryty alobalem, aby byl omezen průnik světla do misek a tím bylo 47

zamezeno růstu řas v ţivném roztoku v miskách. V alobalu byl ponechán pouze otvor pro kontrolu mnoţství ţivného roztoku v miskách (obr. 13). Rostliny byly zalévány ½ Hoaglandovým ţivným roztokem za pouţití kapkové závlahy. Zalévání probíhalo dle potřeby. Od 4. 10. byly rostliny vyvázány pomocí provázků tak, aby zůstaly ve vzpřímené poloze. V průběhu pokusu byly odstraňovány postranní výhony rostlin zaštípnutím tak, aby zůstaly pouze dva hlavní výhony. Rostlinám bylo od podzimu uměle přisvětlováno (12 h denně, intenzita 8000 lx) z důvodu nedostatku světla v době trvání pokusu (obr. 14). Dne 24. 10. byla měřena výška rostlin; 24. 10. a 25. 10. pak byly odebrány vzorky listů pro analýzu fotosyntetických pigmentů. V období mezi 19. 11. a 17. 12. probíhala sklizeň plodů a byla zjišťována jejich hmotnost. U části z těchto sklizených plodů následně probíhala analýza obsahových látek. Sběr plodů pro analýzu probíhal od 26. 11. do 16. 12. Mezi 15. 12. a 17. 12 pak probíhala sklizeň nadzemních částí rostlin a kořenů. Byla zjišťována hmotnost sušiny nadzemní části a kolonizace kořenů mykorhizními houbami. V průběhu pokusu byly rostliny napadeny třásněnkami a houbovým onemocněním, proto byl prováděn postřik pesticidním přípravkem (pesticid Vertimec od výrobce Syngenta Czech s.r.o., dávkování dle návodu, aplikace: 19. 10., 26. 10, 5. 11.) a fungicidním přípravkem (fungicid Kumulus WG od výrobce Basf s.r.o., dávkování dle návodu, aplikace: 19. 10., 29. 10, 5. 11., 12. 11., 19. 11., 3. 12.).

Obr. 13: Pokus 3: Rajčata 2 Rostliny zapojeny v závlahovém systému, misky obaleny alobalem proti průniku světla a následnému růstu řas v roztoku. Fotografováno 24. 10. 2012

Obr. 14: Pokus 3: Rajčata II Umělé přisvětlování rostlinám. Fotografováno 8. 11. 2012

48

3.3 Poloprovozní skleníkové pokusy Poloprovozní skleníkové pokusy probíhaly v prostorách společnosti Jiţní Morava, a.s. v Tvrdonicích. Proběhly tři poloprovozní pokusy: pokus č. 4: Okurky I, pokus č. 5: Okurky II a pokus č. 6: Rajčata. U pokusů 4 a 6 byly pouţity stejné varianty mikrobiálního ošetření, rozdílné pak u pokusu 5 (tab. 1 v kapitole 3.1). Symbiotické mikroorganismy byly aplikovány ve formě prášku, který byl nasypán na pěstební rohoţ v místě, kam byla následně umístěna pěstební kostka s rostlinou. V případě varianty AM byl aplikován 1 g AM v prášku na jednu rostlinu, u varianty AM+Th byly aplikovány 2 g směsi AM a Th na rostlinu a u varianty AM+PGPB+Th bylo aplikováno 2,5 g směsi AM a Th a 0,1 g PGPB na rostlinu. Kontrolní varianta byla bez mikrobiálního ošetření. Rostliny byly pěstovány v pěstebních kostkách z čedičové vaty, umístěných v řadách na společných pěstebních rohoţích z čedičové vaty, v různých rozestupech. V jednom řádku byly pěstovány rostliny vţdy jen jedné varianty mikrobiálního ošetření. Rozmístění těchto řádků v jednotlivých pokusech je uvedeno v tabulce 4. V těchto pokusech byly pěstební rohoţe obaleny plastovým obalem ze všech stran, kromě otvoru pro umístění pěstební kostky a malého otvoru na spodní straně pro odtok přebytečného ţivného roztoku. Rohoţe nebyly umístěny v miskách, ale byly rozloţeny volně na zemi. Ţivný roztok tedy nebyl zadrţován. Po zaloţení pokusů se nadále o rostliny starali zaměstnanci společnosti Jiţní Morava a.s., kteří zajišťovali i následnou sklizeň plodů. Rostliny byly zalévány ţivným roztokem (úplné sloţení pouţívaného roztoku neznáme – vlastní ţivný roztok společnosti Jiţní Morava a.s.) za pouţití kapkové závlahy. Pro upevnění byly rostliny vyvázány provázky tak, aby drţely ve vzpřímené poloze. Během pokusu byly pouţity přípravky proti škůdcům.

49

Tab. 4: Rozmístění variant v řádcích u jednotlivých poloprovozních pokusů. Je uvedeno číslo řádku, počet rostlin v tomto řádku a ošetření pouţité v tomto řádku (varianta). Řádky, u kterých je pouţit znak „ - “ byly ošetřeny buď jiným, nebo ţádným ošetřením. Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), AM+Th – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a Trichodermy harzianum, AM+Th+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub, Trichodermy harzianum a směsi bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371).

3.3.1 Pokus 4: Okurky I Pokus probíhal v termínu 10. 4. – 9. 7. 2012. Byly pouţity rostliny okurky seté salátové (Cucumis sativus Media, Německo). Při zaloţení pokusu byly rostliny staré 25 - 28 dnů a jiţ měly kořenový systém prorostlý v pěstební kostce. Pokus byl zaloţen dle popisu v kapitole 3.3. Rostliny byly rozděleny do čtyř variant (tab. 1 v kapitole 3.1): AM, AM+Th, AM+PGPB+Th a Kontrola. Kaţdá varianta měla tři opakování (řádky). Dva z těchto řádků obsahovaly 132 rostlin, třetí 88 rostlin (viz tab. 4 v kapitole 3.3). Rostliny okurek v tomto pokusu jsou zachyceny na obrázku 15. V období mezi 7. 5. a 9. 7. probíhala sklizeň plodů (obr. 16). Byla zjišťována hmotnost plodů na řádek a u vybraných rostlin kolonizace kořenů mykorhizními houbami. V průběhu pokusu byly rostliny ošetřeny postřikem proti třásněnkám a sviluškám (pesticid Vertimec 1,8EC 0,1%, 50

aplikace: 27. 4.) a postřikem proti padlí (přípravek Ortiva 0,1%, aplikace: 8. 6., 15. 6., 20. 6.).

Obr. 15: Pokus 4: Okurky I Rostliny okurek v průběhu pokusu. Fotografováno 21. 5. 2012 Obr. 16: Pokus 4: Okurky I Plody okurek před sklizní. Fotografováno 21. 5. 2012

3.3.2 Pokus 5: Okurky II Pokus probíhal v termínu 30. 7. – 25. 10. 2012. Byly pouţity rostliny okurky seté salátové (Cucumis sativus Media, Německo). Při zaloţení pokusu byly rostliny staré 25 - 28 dnů a jejich kořenový systém byl jiţ prorostlý v pěstební kostce. Pokus byl zaloţen dle popisu v kapitole 3.3. Varianty ošetření do tohoto pokusu byly vybírány na základě výsledků z pokusu 4. Byly vytvořeny dvě varianty (tab. 1 v kapitole 3.1): AM+PGPB+Th a Kontrola. Kaţdá z variant měla šest opakování (řádků). Z toho čtyři řádky obsahující 132 rostlin a dva řádky obsahující 88 rostlin (tab. 4 v kapitole 3.3). V době mezi 17. 8. a 25. 10. byly sklízeny plody a zjišťována hmotnost plodů na řádek a u vybraných rostlin kolonizace kořenů mykorhizními houbami. Před zaloţením pokusu byly sazenice okurek ošetřeny přípravkem proti padlí (přípravek Ortiva 0,1%, aplikace: 27. 7.) V průběhu pokusu byly rostliny ošetřeny postřikem dalšími přípravky proti škůdcům (peroxid 0,5%, aplikace: 8. 8., 1. 9., 5. 9.; přípravek Topas 100EC 0,5 l/ha, aplikace: 14. 9., 27. 9.; přípravek Previcur 607 SL 0,15%, aplikace: 21. 9.; přípravek Ortiva 0,1%, aplikace: 1. 10., 12. 10.).

51

3.3.3 Pokus 6: Rajčata Pokus probíhal v termínu 10. 4. – 12. 11. 2012. Byly pouţity rostliny rajčete jedlého (Solanum lycopersicum Climberley, Německo). Při zaloţení pokusu byly rostliny staré 50 dnů a kořenový systém měly prorostlý v pěstební kostce. Pokus byl zaloţen dle popisu v kapitole 3.3. Byly vytvořeny čtyři varianty (tab. 1 v kapitole 3.1): AM, AM+Th, AM+PGPB+Th a Kontrola. Kaţdá varianta měla tři opakování (řádky). Dva z těchto řádků obsahovaly 88 rostlin, třetí 44 rostlin (tab. 4 v kapitole 3.3). Sklizeň plodů probíhala v období mezi 14. 6. a 12. 11. Zjišťována byla hmotnost plodů na řádek a u vybraných rostlin kolonizace kořenů mykorhizními houbami. Rostliny byly v průběhu pokusu ošetřeny přípravky proti škůdcům (přípravek Previcur 607 SL 0,15%, aplikace zálivkou: 20. 4.; přípravek Ortiva 0,1%, aplikace postřikem: 19. 5., aplikace zálivkou: 6. 9.; přípravek Vertimec 1,8 EC 0,1%, aplikace postřikem: 4. 6; přípravek Talent 375 ml/ha, aplikace postřikem: 21. 7.; přípravek Kumulus WG 0,3%, aplikace postřikem: 18. 8.; přípravek Topas 100EC 0,5 l/ha, aplikace postřikem: 24. 9., 10. 10.; přípravek Mospilan 20SP 0,04%, aplikace postřikem: 8. 10.).

3.4 Metodika sběru dat V pokusech byl zjišťován vliv aplikovaných mikrobiálních ošetření na různé parametry rostlin. Byly sledovány některé růstové, výnosové a fyziologické parametry a obsahy některých látek v plodech. Dále byla stanovována míra kolonizace kořenů mykorhizními houbami.

3.4.1 Růstové parametry V pokusech byly sledovány následující růstové parametry: hmotnost sušiny nadzemní části rostlin a výška rostlin.

3.4.1.1 Stanovení hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin Hmotnost sušiny nadzemní části rostlin byla stanovována v těchto pokusech: 1: Okurky, 2: Rajčata I a 3: Rajčata II. Nadzemní část rostlin (bez plodů) byla sklizena a sušena při teplotě 90 °C. Po úplném vysušení byla zjišťována hmotnost materiálu váţením na laboratorních vahách.

52

3.4.1.2 Měření výšky rostlin Výška rostlin byla měřena v těchto pokusech: 2: Rajčata I a 3: Rajčata II. V případě pokusu 2 proběhla dvě měření, u pokusu 3 proběhlo jedno měření. Výška rostliny byla stanovena jako vzdálenost od místa, kde rostlina vyrůstala z pěstební kostky aţ po nejvyšší bod rostliny a byla měřena přiloţením měřítka k rostlině.

3.4.2 Výnosové parametry Sledovaným výnosovým parametrem byla hmotnost plodů.

3.4.2.1 Stanovení hmotnosti plodů Hmotnost plodů byla zjišťována v následujících pokusech: 1: Okurky, 3: Rajčata II., 4: Okurky I, 5: Okurky II a 6: Rajčata. V případě hrnkových skleníkových pokusů (pokus 1 a 3) byly plody váţeny jednotlivě na laboratorních vahách (obr. 17) a následně byly hmotnosti plodů pro kaţdou rostlinu sečteny, čímţ byla stanovena hmotnost plodů na rostlinu. V případě poloprovozních skleníkových pokusů byla zjišťována hmotnost plodů na řádek. Následně byla tato hmotnost vydělena počtem rostlin v řádku a tím byla stanovena průměrná hmotnost plodů na rostlinu.

Obr. 17: Stanovování hmotnosti plodů okurek (pokus 1: Okurky) Fotografováno 4. 7. 2012

3.4.3 Fyziologické parametry Sledovaným fyziologickým parametrem byl obsah fotosyntetických pigmentů v listech.

3.4.3.1 Stanovení obsahu fotosyntetických pigmentů v listech Obsah fotosyntetických pigmentů v listech byl stanovován v pokusu 3: Rajčata II. 53

3.4.3.1.1 Odběr a příprava vzorků pro analýzu Z čepele druhého a třetího nejmladšího plně vyvinutého listu byly odstřihnutím odebrány vzorky listového materiálu o přibliţné velikosti 1 – 2 cm2 a vloţeny do předem zváţených zkumavek. Z kaţdé rostliny byly odebrány čtyři vzorky pro extrakci fotosyntetických pigmentů (a – první lístek vpravo z druhého nejmladšího listu, b – první lístek vlevo z druhého nejmladšího listu, c – první lístek vpravo z třetího nejmladšího listu, d – první lístek vlevo z třetího nejmladšího listu). Zároveň byly odebrány paralelní vzorky pro určení poměru čerstvé a suché hmotnosti materiálu, z důvodu následného vztaţení obsahu fotosyntetických pigmentů na suchou hmotnost listu. Tyto vzorky byly odebrány ze stejných míst jako vzorky pro extrakci pigmentů. Z kaţdé rostliny bylo tedy odebráno celkem osm vzorků listu. Všechny vzorky byly uzavřeny do zkumavek tak, aby nedocházelo k odparu a úniku vody a ztráty hmotnosti vzorku. Vzorky ve zkumavkách byly zváţeny na laboratorních vahách a jejich čerstvá hmotnost byla vypočítána dle vzorce:

m(zkumavka +

vzorek) –

m(zkumavka) = m(vzorek).

(m = hmotnost) Vzorky pro extrakci pigmentů byly následně zmraţeny v tekutém dusíku a uchovávány v mrazicím boxu při teplotě -60 °C aţ do provedení extrakce. Paralelní vzorky byly sušeny při teplotě 90 °C a po vysušení opět zváţeny. Jejich suchá hmotnost byla vypočítána podle stejného vzorce jako jejich čerstvá hmotnost.

3.4.3.1.2 Extrakce fotosyntetických pigmentů a spektrofotometrické měření Pro extrakci fotosyntetických pigmentů bylo pouţito organické rozpouštědlo dimethylamid kyseliny mravenčí (DMF), (Porra et al., 1989). Vzorky listů byly zality 10 nebo 15 ml DMF (dle velikosti) a ve skleněných lahvičkách byly skladovány v temnotě v lednici při 4 °C aţ do úplného vybělení (4 – 6 dnů). Poté bylo 0,5 ml extraktu ze vzorků přemístěno do kyvety a naředěno s čistým DMF v poměru 1 : 4. Následně byla na spektrofotometru změřena absorbance extraktu při vlnové délce v rozmezí 400 – 800 nm.

Referenčním vzorkem byl čistý DMF.

Stanovení probíhalo

za pouţití

spektrofotometru Unicam Helios alfa (vyrobeno ve Velké Británii). Naměřená data ze spektrofotometru

byla

zpracována

počítačovým

programem

Vision

V3.31.

54

Prostřednictvím tohoto programu byly z absorpční křivky odečteny hodnoty absorbance při vlnových délkách 480, 647, 664 a 750 nm.

3.4.3.1.3 Výpočet koncentrace fotosyntetických pigmentů Byla zjišťována koncentrace chlorofylu a, chlorofylu b a karotenoidů. Koncentrace těchto fotosyntetických pigmentů (µg/ml extraktu) byla vypočtena dle následujících rovnic (Lichtenthaler, 1987): Cha = chlorofyl a, Chb = chlorofyl b, c = celková koncentrace karotenoidů, A (vd) = hodnota absorbance při dané vlnové délce, zkorigovaná o absorbanci v 750 nm Cha = 11,65 * A664 – 2,69 * A647 Chb = 20,81 * A647 – 4,53 * A664 c = (1000 * A480 – 0,89 Cha – 52,02 * Chb) / 245 Koncentrace fotosyntetických pigmentů byla následně vztaţena na sušinu listu (µg/ g sušiny).

3.4.4 Obsahy vybraných látek v plodech Obsahy vybraných látek v plodech byly zjišťovány v pokusu 3: Rajčata II. V plodech rajčat byl stanovován celkový obsah fenolických látek, cukernatost (obsah rozpustných cukrů) a obsah vitaminu C (kyselina askorbová). Analýzy obsahových látek jsem neprováděla sama, byly zajišťovány Výzkumným ústavem organických syntéz, a.s. Z kaţdé rostliny bylo odebráno šest (v případě nedostatku plodů u některých rostlin pět) plodů pro tyto analýzy. Celkový počet analyzovaných vzorků byl u jednotlivých variant následující: AM – 53, Th – 59, PGPB – 47, AM+PGPB – 53, Kontrola – 42.

3.4.4.2 Stanovení celkového obsahu fenolických látek v plodech Ke stanovení celkového obsahu fenolických látek v plodech byla pouţita standardní

spektrofotometrická

metoda

s Folin-Ciocalteauovým

činidlem

(Folin

& Ciocalteu, 1927). Toto činidlo bylo tvořeno směsí následujících látek: wolframan sodný, kyselina orthofosforečná, kyselina chlorovodíková, molybdenan sodný, síran

55

lithný a brom. Jako standard byla pouţita kyselina gallová, rozpuštěná v redestilované, deionizované vodě (Slinkard & Singleton, 1977). Ve skleněných zkumavkách byly smíseny 4 ml deionizované vody, 4 ml Folin-Ciacalteauova činidla a 50 µl šťávy z plodů. Po pěti minutách byly přidány 4 ml uhličitanu sodného. Po dalších patnácti minutách byla směs změřena na spektrofotometru při 750 nm proti kontrolnímu roztoku.

3.4.4.3 Stanovení cukernatosti plodů Cukernatost byla stanovována refraktometricky jako hmotnostní procenta zastoupení rozpustných sacharidů ve šťávě z plodů. K měření byl pouţit digitální refraktometr HP/WR/WR-HT/WR-MW, Anton Paar. Tento přístroj prováděl výpočet stupňů Brixe (°Bx). Tyto stupně představují číselnou hodnotu hmotnosti cukrů, rozpuštěných ve 100 g vody, cukernatost byla tedy následně vyjádřena jako hmotnostní procenta rozpuštěného cukru. Vzorek plodu byl rozetřen ve třecí misce a následně centrifugován po dobu osmi minut při 4000 otáčkách/min. Poté byl vzorek přefiltrován přes diskový filtr NY 0,4 µm a změřen refraktometrem.

3.4.4.1 Stanovení obsahu vitaminu C v plodech Obsah vitaminu C v plodech byl stanovován chromatograficky. Pouţita byla vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) s UV detekcí, kolona C18-NH2, přístroj Shimadzu Nexera HPLC/PDA (vyrobeno v Japonsku). Jako mobilní fáze byla pouţita směs 0,05M octanu sodného a acetonitrilu (ACN) v poměru 95:5. Průtok mobilní fáze byl 0,6 ml/min. při teplotě kolony 30 °C. Kalibrace: externí (standard); mez detekce (LOD) 0,5 mg/ml (standard); mez stanovitelnosti (LOQ) 1,5 mg/ml. Z kaţdého plodu byl odebrán vzorek ve tvaru výseče o přibliţné hmotnosti 3 g a rozetřen ve třecí misce. Vzniklá šťáva byla v poměru 1:1 smíchána s 2% kyselinou metafosforečnou a tato směs byla následně přefiltrována přes jednorázový filtr NY 0,22µm a nastříknut na kolonu. Data byla následně vyhodnocena přístrojem.

3.4.5 Stanovení míry mikrobiální kolonizace kořenů Míra kolonizace kořenů arbuskulárními mykorhizními houbami byla zjišťována v pokusech: 1: Okurky, 2: Rajčata I, 3: Rajčata II., 4: Okurky I, 5: Okurky II a 6: Rajčata. Kolonizace Th byla zjišťována v pokusech 4: Okurky I, 5: Okurky II a 6: Rajčata. 56

3.4.5.1 Příprava vzorků pro vyhodnocení mykorhizní kolonizace Vzorky kořenů rostlin (jeden vzorek cca 1 g) byly odebrány z pěstebních kostek a rohoţí a umístěny do skleněných lahviček (obr. 18).

Obr. 18: Odběr vzorků kořenů A: pěstební kostka a rohoţ po sklizni B: rozříznutá rohoţ, připravená pro odběr kořenů C: rohoţ rozmělněná v misce s vodou a odběr kořenů za pomoci pinzety D: vkládání vzorku kořenů do lahvičky (Pokus 3: Rajčata II) Fotografováno 16. 12. 2012

Vzorky v lahvičkách byly nejprve pro projasnění zality 10% KOH (hydroxid draselný) a po dobu 30 - 40 minut vystaveny teplotě 90 °C, aţ do jejich odbarvení. Poté byly kořeny z KOH vyjmuty a důkladně propláchnuty čistou vodou. Následně byly kořeny okyseleny zalitím 2% kyselinou mléčnou a ponechány 20 minut při pokojové teplotě. Poté byla kyselina vylita a kořeny barveny 0,05% roztokem trypanové modři v laktoglycerolu (laktoglycerol : 80% kyselina mléčná : destilovaná voda; 1 : 2 : 1). Kořeny zalité barvivem byly po dobu 30 minut zahřívány na teplotu 90 °C. Pak byla barva

vymyta

tekoucí

vodou

a

kořeny

zality

laktoglycerolem

(glycerol : kyselina mléčná : destilovaná voda; 2 : 1 : 1), ve kterém byly dále uchovávány aţ do vyhodnocení jejich kolonizace (Koske & Gemma, 1989).

3.4.5.2 Vyhodnocení míry mykorhizní kolonizace kořenů Pro stanovení míry kolonizace kořenů arbuskulárními mykorhizními houbami byla pouţita průsečíková metoda (Giovannetti & Mosse, 1980). Nabarvené vzorky kořenů byly náhodně rozmístěny na Petriho misku (obr. 19), na jejímţ dně byla vyznačena čtvercová síť (strana čtverce 1 cm). Kořeny byly pozorovány pod binokulární lupou Olympus SZX 12. Byly sledovány průsečíky kořenů se čtvercovou sítí a bylo zaznamenáváno, zda část kořene, jeţ síť protíná, je kolonizován arbuskulární mykorhizní 57

houbou (+) či nikoliv (-). Celkem bylo sledováno sto průsečíků u kaţdého vzorku. Míra mykorhizní kolonizace (%C) pak byla vypočtena podle vzorce: %C = 100 * (+)/ (

+ +

(−))

Obr. 19: Nabarvený vzorek kořenů, náhodně rozloţený na Petriho misce se čtvercovou sítí, připravený pro vyhodnocení mykorhizní kolonizace. Fotografováno: 11. 1. 2013

3.4.5.3 Příprava vzorků a vyhodnocení kolonizace Th Přítomnost Trichodermy v kořenech byla ověřována u rostlin rajčata a okurek v poloprovozních pokusech. Vzorky kořenů v pěstebních kostkách byly zasílány na analýzu firmě Microgaia Biotech ve Španělsku, která analýzy provedla. Byl stanovován počet ţivotaschopných buněk kmene Trichoderma harzianum Th78 roztěrovou metodou na neselektivních agarových plotnách. Vzorek 10 g kořenů v čedičové vatě byl smíchán se 100 ml čtvrtinového Ringerova roztoku (Oxoid, Anglie), směs byla po dobu 1 minuty důkladně protřepána následně naředěna v ředící řadě 10-1 aţ 10-5/10-6. Sloţení agarových ploten: 39 g/l PDA (bramboro-dextrózový agar), 50 mg/l bengálská červeň. Po sterilizaci média v autoklávu, při teplotě 120 °C po dobu 20 min, bylo do média, při ochlazení na teplotu 55 °C, přidáno 100 mg/l sterilního streptomycinu pro potlačení růstu bakterií (Williams et al., 2003). Naředěné roztoky byly naneseny v mnoţství 100 µl na agarovou plotnu, rozetřeny a inkubovány ve tmě při teplotě 25 - 28 °C po dobu 5 - 7 dní. Po nárůstu a sporulaci houby byl na základě charakteristických znaků určen poţadovaný kmen Th78. Podle počtu kolonií Th78 a ostatních houbových kultur na agarové plotně a daného ředění roztoku byl vypočítán počet kolonii tvořících jednotek na gram výchozího vzorku (CFU/g). U hrnkových skleníkových pokusů nebyla přítomnost Th zjišťována. Kolonizace PGPB nebyla zpětně ověřována u ţádného z pokusů. 58

3.4.6 Statistické zpracování dat Data byla analyzována za pouţití počítačového programu R 2.15.1 (balíček Rcmdr, verze 1.9-6). Data byla zpracována jednovýběrovou analýzou rozptylu (ANOVA). Normální rozdělení dat bylo testováno za pouţití Shapiro-Wilkova testu normality. Data, která neodpovídala normálnímu rozdělení, byla před analýzou odmocněna či zlogaritmována. Dále byl pro porovnání jednotlivých variant pouţit Tukey-Kramerův test a pro ověření závistosti mykorhizní kolonizace kořenů na růstových a výnosových parametrech Pearsonův korelační koeficient.

59

4 Výsledky 4.1 Vyhodnocení hrnkových skleníkových pokusů 4.1.1 Výsledky pokusu 1: Okurky

4.1.1.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace U variant ošetřených směsí arbuskulárních mykorhizních hub došlo k úspěšné kolonizaci kořenů. Míra mykorhizní kolonizace kořenů okurek dosahovala v průměru 23,47 % u varianty AM a 24, 53 % u varianty AM+PGPB. Tyto varianty se mezi sebou v míře kolonizace na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišily. U variant, které nebyly ošetřeny mykorhizními houbami, mykorhizní kolonizace nebyla přítomna (tab. 5).

Tab. 5: Průměrná míra kolonizace (%) kořenů arbuskulárními mykorhizními houbami u rostlin okurek (Cucumis sativus Media) v pokusu 1: Okurky. Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin, AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Mykorhizní kolonizace byla přítomná pouze u variant, ošetřených AM. SE - střední chyba průměru.

4.1.1.2 Růst rostlin okurek Míra růstu nadzemních částí rostlin okurek byla vyjádřena jako hmotnost sušiny nadzemní části rostlin. Mezi jednotlivými variantami nebyly na hladině spolehlivosti α = 0,05 pozorovány statisticky významné rozdíly v hmotnosti sušiny nadzemních částí rostlin okurek (graf 1). Růst nadzemních částí rostlin tedy nebyl v tomto pokusu mikrobiálním ošetřením významně ovlivněn.

60

4.1.1.3 Výnosy plodů okurek Rostliny okurek v tomto pokusu měly ve většině případů pouze jeden plod na rostlinu, kromě dvou rostlin (jedna kontrolní rostlina a jedna rostlina varianty AM), které měly plody dva. Celkem sedmnáct rostlin pak nemělo plody ţádné (Kontrola 2 rostliny, AM 3 rostliny, PGPB 5 rostlin, AM+PGPB 3 rostliny, Th 4 rostliny). Hmotnost plodů na rostlinu se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 2). Pouţitá mikrobiální ošetření tedy v tomto pokusu na výnos plodů neměla významný vliv. Hmotnost jednoho plodu se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 3). Dále byla zjišťována závislost hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin a hmotnosti plodů na míře mykorhizní kolonizace u jednotlivých rostlin. Závislost hmotnosti sušiny (graf 4), ani hmotnosti plodů (graf 5) na mykorhizní kolonizaci nebyla zjištěna.

4.1.1.4 Grafické znázornění výsledků pokusu 1 Hmotnost sušiny nadzemní části rostlin okurek 3

Hmotnost (g)

2,5 a

a

a

a

PGPB

AM+PGPB

a

2 1,5 1 0,5

0

Kontrola ± SE

AM

Th

Varianta

Graf 1: Průměrná hmotnost (g) sušiny nadzemní části rostlin okurek (Cucumis sativus Media) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 1: Okurky). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 17).

61

Hmotnost plodů okurek na rostlinu 40

Hmotnost (g)

35

a a

a

30 a

25

a

20 15 10 5 0

Kontrola

AM

PGPB

AM+PGPB

Th

Varianta

± SE

Graf 2: Průměrná hmotnost (g) plodů okurek na rostlinu (Cucumis sativus Media) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 1: Okurky). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 17).

Hmotnost jednotlivých plodů okurek Hmotnost plodů (g)

40

a

a

a

35

a

a

PGPB

AM+PGPB

30 25 20 15 10 5 0

Kontrola

AM

Th

Varianta +/- SE

G

Graf 3: Průměrná hmotnost (g) jednoho plodu okurek (Cucumis sativus Media) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 1: Okurky). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 12-16).

62

Závislost hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin na mykorhizní kolonizaci kořenů u varianty AM

Hmotnost sušiny (g)

A 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

0

20

40

60

80

100

Míra kolonizace mykorhizními houbami (%)

Závislost hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin na mykorhizní kolonizaci kořenů u varianty AM+PGPB

Hmotnost sušiny (g)

B 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

0

20

40

60

80

100

Míra kolonizace mykorhizními houbami (%)

g Graf 4: Závislost hmotnosti sušiny nadzemních částí rostlin okurek (Cucumis sativus Media) na míře kolonizace (%) arbuskulárními mykorhizními houbami (pokus 1: Okurky). V grafu A je znázorněna varianta AM, v grafu B varianta AM+PGPB. AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin. Značky v grafu znázorňují jednotlivé rostliny. Závislost hmotnosti sušiny na míře mykorhizní kolonizace nebyla prokázána (Pearsonův korelační koeficient, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 17).

63

Závislost hmotnosti plodů na mykorhizní kolonizaci kořenů u varianty AM

Hmotnost plodů (g)

A 60 50 40 30 20 10 0

0

20

40

60

80

100

Míra kolonizace mykorhizními houbami (%)

Závislost hmotnosti plodů na mykorhizní kolonizaci kořenů u varianty AM+PGPB

Hmotnost plodů (g)

B 60 50 40

30 20 10 0

0

20

40

60

80

100

Míra kolonizace mykorhizními houbami (%)

g Graf 5: Závislost hmotnosti plodů okurek (Cucumis sativus Media) na míře kolonizace (%) arbuskulárními mykorhizními houbami (pokus 1: Okurky). V grafu A je znázorněna varianta AM, v grafu B varianta AM+PGPB. AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin. Značky v grafu znázorňují jednotlivé rostliny. Závislost hmotnosti plodů na míře mykorhizní kolonizace nebyla prokázána (Pearsonův korelační koeficient, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 17).

64

4.1.2 Výsledky pokusu 2: Rajčata I

4.1.2.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace U ţádné z variant, ošetřených směsí arbuskulárních mykorhizních hub, nebyla zjištěna přítomnost mykorhizní kolonizace kořenů. Mykorhizní kolonizace kořenů nebyla zjištěna ani u variant bez ošetření AM.

4.1.2.2 Růst rostlin rajčat Míra růstu nadzemních částí rostlin rajčat byla hodnocena jako hmotnost sušiny nadzemní části rostlin a jako výška rostlin. Hodnoty hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin nebyly mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně odlišné (graf 6). Jednotlivé varianty se mezi sebou ve výšce nadzemní části rostlin na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišily ani v 27. den pokusu, ani v 35. den pokusu. (graf 7).

4.1.2.3 Grafické znázornění výsledků pokusu 2

Hmotnost (g)

Hmotnost sušiny nadzemní části rostlin rajčat

± SE

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

a a

a

a

Kontrola

AM

PGPB

Varianta

a

AM+PGPB

Th

g

Graf 6: Průměrná hmotnost (g) sušiny nadzemní části rostlin rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 2: Rajčata I). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 5).

65

Výška rostlin rajčat 100 Výška (cm)

b

b

80

b

b

b

60 a

40

a

a

a

a

20 0 Kontrola

AM

PGPB

AM+PGPB

Varianta

± SE

9.7.

Th 17.7.

g

Graf 7: Průměrná výška (cm) nadzemní části rostlin rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) v 27. den pokusu (9.7.) a v 35. den pokusu (17.7.) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 2: Rajčata I). Kontrola - kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné v rámci porovnávání hodnot, zjištěných v jednom datu pozorování (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 12).

4.1.3 Výsledky pokusu 3: Rajčata II

4.1.3.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace U ţádné z variant, ošetřených směsí arbuskulárních mykorhizních hub, nebyla zjištěna přítomnost mykorhizní kolonizace kořenů. Mykorhizní kolonizace kořenů nebyla zjištěna ani u variant bez ošetření AM.

4.1.3.2 Růst rostlin rajčat Míra růstu nadzemních částí rostlin rajčat byla hodnocena jako hmotnost sušiny nadzemní části rostlin a jako výška rostlin. Hmotnost sušiny nadzemní části rostlin se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 8). Výška rostlin se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 9).

66

4.1.3.3 Výnosy plodů rajčat Výnos plodů byl stanoven jako součet hmotností jednotlivých plodů, sklizených z rostliny. Hmotnost plodů na rostlinu se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 10).

4.1.3.4 Obsah fotosyntetických pigmentů Obsah chlorofylu a, obsah chlorofylu b a celkový obsah karotenoidů v listech nebyl na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně odlišný mezi jednotlivými variantami (graf 11).

4.1.3.5 Obsahy sledovaných látek v plodech V plodech rajčat byl sledován celkový obsah fenolických látek, obsah rozpuštěných cukrů a obsah vitaminu C. Celkový obsah fenolických látek v plodech rajčat se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišil (graf 12). Cukernatost plodů rajčat nebyla mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně odlišná (graf 13). V případě obsahu vitaminu C byl na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významný rozdíl mezi variantami Kontrola a AM a také mezi variantami Kontrola a Th (graf 14). Oproti kontrolní variantě byl u varianty AM sníţen obsah vitaminu C v plodech v průměru o 9,58 %. V případě varianty Th byl obsah vitaminu C oproti kontrole sníţen průměrně o 11,37 %.

67

4.1.3.6 Grafické znázornění výsledků pokusu 3 Hmotnost sušiny nadzemní části rostlin rajčat 35

a

a

a

a

Kontrola

AM

PGPB

a

Hmotnost (g)

30

25 20 15

10 5 0

AM+PGPB

Th

Varianta

± SE

Graf 8: Průměrná hmotnost (g) sušiny nadzemní části rostlin rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 7-10).

Výška rostlin rajčat 120

Výška (cm)

100

a

a

a

a

a

Kontrola

AM

PGPB

AM+PGPB

Th

80 60 40 20 0

± SE

Varianta

g Graf 9: Průměrná výška (cm) nadzemní části rostlin rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) v 45. den pokusu při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 7-10).

68

Hmotnost (g)

Hmotnost plodů rajčat na rostlinu 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

a

a

Kontrola

AM

± SE

a

a

PGPB

AM+PGPB

a

Th

Varianta

a

Graf 10: Průměrná hmotnost (g) plodů rajčat na rostlinu (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 7-10).

mg/g sušiny

Obsah fotosyntetických pigmentů v listech rajčat 16 14 12 10 8 6 4 2 0

a

a

b

b

Kontrola

c

PGPB

c

c

c

AM

b

b

b

c

a

a

a

AM+PGPB

Th

Varianta ±SE

chlorofyl a

chlorofyl b

karotenoidy a xantofyly

v Graf 11: Průměrný obsah (mg/g sušiny) fotosyntetických pigmentů (obsah chlorofylu a, obsah chlorofylu b a celkový obsah karotenoidů) v listech rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné v rámci porovnávání jednotlivých barviv (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 28-40).

69

mg / 100 g plodu

Celkový obsah fenolických látek v plodech rajčat 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

a

a

a

a

a

Kontrola

AM

PGPB

AM+PGPB

Th

± SE

Varianta

g

Graf 12: Celkový obsah fenolických látek (mg/100 g čerstvého plodu) v plodech rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 42-59).

Hmotnostní procenta (%)

Cukernatost plodů rajčat

± SE

4

a

a

a

a

Kontrola

AM

PGPB

AM+PGPB

a

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

Th

Varianta g

aGraf 13: Obsah rozpustných cukrů (hmotnostní %) v plodech rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 42-59).

70

mg / 100 g plodu

Obsah vitaminu C v plodech rajčat 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

a

ab

b

Kontrola

AM

PGPB

ab b

AM+PGPB

Th

Varianta

± SE

a

a

Graf 14: Obsah kyseliny askorbové (mg/100 g čerstvého plodu) v plodech rajčat (Solanum lycopersicum Tornádo F1) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 3: Rajčata II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), PGPB – směs bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371), AM+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a směsi bakterií podporujících růst rostlin, Th – Trichoderma harzianum Th78. Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené různými písmeny jsou statisticky významně odlišné; varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 42-59).

4.2 Vyhodnocení poloprovozních skleníkových pokusů 4.2.1 Výsledky pokusu 4: Okurky I

4.2.1.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace U ţádné z variant, ošetřených směsí arbuskulárních mykorhizních hub, nebyla zjištěna přítomnost mykorhizní kolonizace kořenů. Mykorhizní kolonizace kořenů nebyla zjištěna ani u variant bez ošetření AM. Přítomnost Th v kořenech byla zjištěna u varianty AM+Th, kde dosahovala v průměru hodnoty 2,08 * 103 CFU/g a u varianty AM+PGPB+Th , kde dosahovala v průměru 1,36 * 102 CFU/g. U kontrolní varianty Th zjištěna nebyla. Zjištěné hodnoty CFU/g jsou spíše nízké (Postma et al., 2000).

4.2.1.2 Výnosy plodů okurek Hmotnost plodů na rostlinu se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 15). 71

Hmotnost plodů okurek na rostlinu

Hmotnost (kg)

12 10

a

a

a

a

Kontrola

AM

AM+Th

AM+Th+PGPB

8 6 4 2 0

Varianta

± SE

Graf 15: Průměrná hmotnost (kg) plodů okurek na rostlinu (Cucumis sativus Media) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 4: Okurky I). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), AM+Th – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a Trichodermy harzianum, AM+Th+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub, Trichodermy harzianum a směsi bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371). Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 3).

4.2.2 Výsledky pokusu 5: Okurky II

4.2.2.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace U ţádné z variant, ošetřených směsí arbuskulárních mykorhizních hub, nebyla zjištěna přítomnost mykorhizní kolonizace kořenů. Mykorhizní kolonizace kořenů nebyla zjištěna ani u variant bez ošetření AM. Přítomnost Th v kořenech byla zjištěna u varianty AM+PGPB+Th, kde dosahovala v průměru 1,5 * 103 CFU/g a byla přítomna i u některých kontrolních rostlin; u těchto kontrolních rostlin dosahovala v průměru 2,47 * 103 CFU/g (v případě započítání kontrolních rostlin bez nálezu Th do průměru, byl průměr 4,98 * 102 CFU/g). Zjištěné hodnoty CFU/g jsou spíše nízké (Postma et al., 2000).

4.2.2.2 Výnosy plodů okurek Hmotnost plodů na rostlinu se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 16).

72

Hmotnost plodů okurek na rostlinu 7

Hmotnost (kg)

6

a

a

Kontrola

AM+Th+PGPB

5 4 3 2 1 0

Varianta

± SE

Graf 16: Průměrná hmotnost (kg) plodů okurek na rostlinu (Cucumis sativus Media) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 5: Okurky II). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM+Th+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), Trichodermy harzianum a směsi bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371). Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 6).

4.2.3 Výsledky pokusu 6: Rajčata

4.2.3.1 Vyhodnocení mikrobiální kolonizace U ţádné z variant, ošetřených směsí arbuskulárních mykorhizních hub, nebyla zjištěna přítomnost mykorhizní kolonizace kořenů. Mykorhizní kolonizace kořenů nebyla zjištěna ani u variant bez ošetření AM. Přítomnost Th v kořenech byla zjištěna u varianty AM+Th, kde dosahovala v průměru 4,15 * 102 CFU/g, u varianty AM+PGPB+Th, kde dosahovala v průměru 5,53 * 102 CFU/g a byla zjištěna i u některých kontrolních rostlin, kde dosahovala hodnoty 6,6 * 102 CFU/g (v případě započítání kontrolních rostlin bez nálezu Th do průměru, byl průměr 2,46 * 102 CFU/g). Zjištěné hodnoty CFU/g

jsou spíše nízké

(Postma et al., 2000).

4.2.3.2 Výnosy plodů rajčat Hmotnost plodů na rostlinu se mezi jednotlivými variantami na hladině spolehlivosti α = 0,05 statisticky významně nelišila (graf 17).

73

Hmotnost plodů rajčat na rostlinu

Hmotnost (kg)

30

a

a

a

a

Kontrola

AM

AM+Th

AM+Th+PGPB

25

20 15 10 5 0

± SE

Varianta

Graf 17: Průměrná hmotnost (kg) plodů rajčat na rostlinu (Solanum lycopersicum Climberley) při pouţití mikrobiálního ošetření (pokus 6: Rajčata). Kontrola – kontrolní varianta bez ošetření, AM – směs arbuskulárních mykorhizních hub (Rhizophagus irregularis BEG140, Rhizophagus irregularis S7, Glomus claroideum BEG210, Glomus microaggregatum BEG56, Glomus versiforme), AM+Th – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub a Trichodermy harzianum, AM+Th+PGPB – kombinace směsi arbuskulárních mykorhizních hub, Trichodermy harzianum a směsi bakterií podporujících růst rostlin (Azospirillum brasilense K2012 242/9 NCAIM (P) B.001403, Azospirillum largimobile K2012 B41 NCAIM (P) B.001402, Leuconostoc mesenteroides K2009 25/4 NCAIM (P) B.001372, Pseudomonas chlororaphis K2009 13/4 B NCAIM (P) B.001370, Pseudomonas lundensis K2009 9/4-B NCAIM (P) B.001371). Úsečkami je znázorněna střední chyba průměru (SE). Varianty označené stejnými písmeny nejsou staticky významně odlišné (jednovýběrová analýza rozptylu ANOVA, hladina spolehlivosti α = 0,05; n = 3).

74

4.3 Shrnutí výsledků V pokusu 1 nebyly mezi jednotlivými variantami shledány statisticky významné rozdíly v hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin, v hmotnosti plodů na rostlinu ani v hmotnosti jednoho plodu. U variant, ošetřených arbuskulárními mykorhizními houbami, byla přítomna mykorhizní kolonizace kořenů, i kdyţ dosahovala poměrně nízkých hodnot (varianta AM 23,47 %, varianta AM+PGPB 24, 53 %). Závislost mezi touto mykorhizní kolonizací a hmotností sušiny nadzemní části rostlin ani hmotností plodů na rostlinu prokázána nebyla. V pokusu 2 mykorhizní kolonizace kořenů zjištěna u ţádné z variant nebyla, z tohoto pokusu tedy nelze vyvodit závěry ohledně vlivu ošetření mykorhizními houbami. V pokusu nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl v hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin ani ve výšce nadzemní části rostlin. V pokusu 3 mykorhizní kolonizace kořenů zjištěna u ţádné z variant nebyla, z tohoto pokusu tedy nelze vyvodit závěry ohledně vlivu ošetření mykorhizními houbami. V pokusu nebyl mezi jednotlivými variantami zjištěn statisticky významný rozdíl v hmotnosti sušiny nadzemní části rostlin, ve výšce nadzemní části rostlin ani v hmotnosti plodů na rostlinu. Obsah fotosyntetických pigmentů v listech se téţ statisticky významně mezi jednotlivými variantami nelišil. Statisticky významně se mezi variantami nelišil ani celkový obsah fenolických látek v plodech ani cukernatost plodů. Oproti hypotéze, obsah vitaminu C v plodech byl statisticky významně sníţen u varianty AM o 9,58 % a u varianty AM+PGPB o 11,37 % oproti kontrolní variantě. V ţádném z poloprovozních skleníkových pokusů (pokusy 4, 5 a 6) mykorhizní kolonizace kořenů arbuskulárními mykorhizními houbami nebyla úspěšná; v ţádném z těchto pokusů u ţádné z variant nebyla zjištěna. Kolonizace kořenů Th byla zjištěna u všech pokusů u varianty Th. Nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly v hmotnosti plodů na rostlinu mezi jednotlivými variantami.

75

5 Diskuze 5.1 Hydroponické pěstování rostlin a mikrobiální ošetření Mikrobiální ošetření rostlin, ať uţ se jedná o mykorhizní houby, bakterie podporující růst rostlin nebo Trichodermu, je obvykle aplikováno do běţného půdního substrátu, nikoliv do substrátu či nosiče hydroponického. Většina studií, zabývajících se vlivem mikrobiálního ošetření na rostliny, se soustředí na pěstování rostlin v nejrůznějších půdách; jen malá část vědeckých experimentů probíhá v hydroponickém prostředí. Z tohoto důvodu je vliv mutualistických symbiotických mikroorganismů na rostliny, pěstované v hydroponii, probádán v mnohem menší míře, neţ je tomu u rostlin pěstovaných klasicky v půdě. Hydroponické pěstování rostlin je producenty zeleniny vyuţíváno hlavně z důvodů standardizace podmínek minerální výţivy rostlin a snadnější péče o zdraví kořenového systému. Při pěstování rostlin bez půdy dochází ke sníţení rizika infekce kořenů různými půdními patogeny. Pokud se infekce kořenů rostlin v hydroponickém systému vyskytne, lze ji účinně zlikvidovat průtokovou aplikací pesticidů prostřednictvím závlahového systému. Likvidace kořenových patogenů je v případě hydroponicky pěstovaných rostlin nejen účinnější, neţ při pěstování rostlin v půdě, ale také ekonomičtější, z důvodu potřeby niţšího mnoţství pesticidu a především také ekologičtější, jelikoţ nedochází k zamořování prostředí toxickými látkami z pesticidů. Co se týká minerální výţivy rostlin, při hydroponickém pěstování má producent dokonalou kontrolu nad sloţením ţivin, jeţ jsou rostlinám dodávány. Prostřednictvím ţivného roztoku lze optimalizovat podmínky pro výţivu rostlin a tím maximalizovat výnosy. Pouţitím hydroponie také odpadá problém se zaléváním rostlin. Hydroponické pěstování rostlin je uskutečňováno pouze v zakrytých prostorách ve sklenících, výnosy tedy nejsou tolik ovlivňovány výkyvy počasí. Při nepříznivých teplotních podmínkách je však nutno skleníky vytápět, coţ je energeticky náročné a z tohoto důvodu je hydroponické pěstování rostlin rozšířeno zejména v oblastech s teplejším klimatem. V mnoha zemích s příznivými podmínkami pro hydroponické pěstování se hydroponie stává stále důleţitější součástí produkce zeleniny. V České republice není pěstování rostlin v hydroponii příliš pouţíváno zejména z důvodu zmíněných klimatických podmínek. Jediným hydroponickým producentem zeleniny v ČR

76

je společnost Jiţní Morava a.s. v Tvrdonicích na Jiţní Moravě, coţ je jedna z nejteplejších oblastí ČR. A právě v této společnosti jsme prováděli poloprovozní pokusy.

5.2 Použité metody U rostlin rajčat a okurek v našich pokusech byly pouţity tradiční metody pro růstovou analýzu a měření výnosových parametrů rostlin. Růst nadzemní části rostlin rajčat a okurek byl stanovován jako hmotnost sušiny nadzemní části rostlin; stejná metodika byla pouţita u rostlin rajčat například ve studii autorů Larsen et al. (2012) či Almaghrabi et al. (2013) a u rostlin okurek ve studii autorů Chen et al. (2013). V některých studiích byla zjišťována čerstvá hmotnost nadzemní části rostlin rajčat (Mayak et al., 2004); (Azarmi et al., 2011) a okurek (Yedidia et al., 2003). V našich pokusech byly rostliny rajčat v pokusu 3 a rostliny okurek v pokusu 1 napadeny patogeny, proto měly ke konci pokusů značnou část listů uschlou a z tohoto důvodu nebylo moţné stanovovat čerstvou hmotnost nadzemní části těchto rostlin. V mnoha studiích je téţ u rostlin zjišťována hmotnost kořenů, ať uţ v čerstvém či suchém stavu. U rostlin rajčat byla hmotnost kořenů stanovována kupříkladu ve studii autorů Azarmi et al. (2011), kde byla zjišťována suchá i čerstvá hmotnost kořenů; u rostlin okurek pak byla čerstvá hmotnost kořenů zjišťována například ve studii autorů Yedidia et al. (2003) a suchá hmotnost kořenů ve studii Zhang et al. (2013a). V našich pokusech nebylo moţné hmotnost kořenů stanovit z toho důvodu, ţe kořeny byly prorostlé v pěstební kostce a pěstební rohoţi z čedičové vaty a bylo by velmi obtíţné, ne-li nemoţné veškerou biomasu kořenů od materiálu čedičové vaty oddělit. Ze stejného důvodu nebylo moţné zjišťovat ani délku kořenů, která byla u rostlin okurek stanovována například ve studii autorů Gamalero et al. (2010). Kromě toho byla převáţná většina získaných segmentů kořenů pouţita pro zjištění mykorhizní kolonizace. V pokusech 2 a 3 byla u rostlin rajčat měřena výška nadzemní části. Výška nadzemní části rostlin rajčat byla měřena v předchozích studiích například u autorů Dasgan et al. (2008) či Azarmi et al. (2011). V pokusu 3 byl měřen fyziologický parametr, obsah fotosyntetických pigmentů v listech rajčat, jako ukazatel zdraví rostlin. Tento parametr byl u rostlin rajčat měřen jako fyziologický indikátor například také ve studii autorů Hajiboland et al. (2010). Z výnosových parametrů byly sledovány výnosové parametry kvantitativní a vybrané kvalitativní. Sledovanými kvantitativními výnosovými parametry v našich pokusech byl výnos plodů (hmotnost plodů na rostlinu v případě hrnkových skleníkových 77

pokusů a hmotnost plodů na řádek u poloprovozních skleníkových pokusů). Výnos plodů byl v předchozích studiích sledován například u rostlin rajčat autory Guo et al. (2004). Výnos plodů je důleţitým parametrem při produkci zeleniny, jako jsou rajčata či okurky, neméně důleţitá je však i kvalita plodů. Sledovanými kvalitativními parametry byly výnosy některých obsahových látek v plodech rajčat. Zvýšením některých látek v plodech dochází k navýšení potravní hodnoty plodů. Jedním z měřených parametrů byla cukernatost plodů, která navyšuje nutriční hodnotu plodů. V dnešní době je pozornost ve velké míře zaměřována na obsahy látek s antioxidačním účinkem z důvodu jejich schopnosti zhášet volné radikály. V posledních dekádách se projevují snahy o dosaţení co nejvyšší biologické aktivity obsahových látek v zelenině. Z tohoto důvodu byl mezi sledované kvalitativní parametry vybrán celkový obsah fenolických látek a obsah vitaminu C v plodech. V plodech rajčat by bylo moţné sledovat mnoţství dalších biologicky aktivních látek, ale z důvodu omezených finančních prostředků byly provedeny jen tyto nejběţnější analýzy. Fenolické látky jsou velmi heterogenní skupinou sekundárních metabolitů rostlin, z nichţ mnohé mají antioxidační vlastnosti. Byla provedena primární screeningová analýza s pouţitím Folin-Ciocalteauova činidla, které reaguje nespecificky s mnoha fenolickými látkami. Z důvodu, ţe nebyly zjištěny ţádné statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými variantami ošetření v celkovém obsahu fenolických látek, nebyly prováděny ţádné další analýzy. V případě, ţe by u některé z variant došlo ke zvýšení celkového obsahu fenolických látek v plodech, následovalo by určení celkové antioxidační kapacity. Pokud by bylo v plodech některé varianty zjištěno navýšení celkové antioxidační kapacity, dalším krokem by bylo pouţití sofistikovanějších a finančně náročnějších metod, jako je zjišťování obsahu různých typů fenolických látek s pouţitím HPLC (Cvikrova et al., 1991).

5.3 Výsledky pokusů V ţádném z našich pokusů nedošlo u ţádné z variant ošetření ke změnám měřených růstových ani výnosových parametrů rostlin u hrnkových skleníkových pokusů ani u poloprovozních skleníkových pokusů. Podobné výsledky měli autoři Zehnder et al. (2000), kteří pouţili PGPB Bacillus pumilus SE34 či Bacillus subtilis IN937b k ošetření rostlin rajčat; u rostlin nedošlo ke změně ve výšce nadzemní části rostlin ani ke změně ve výnosu plodů. V jiné studii nedošlo u rostlin rajčat, ošetřených směsí AM, k významné změně v hmotnosti sušiny nadzemní části (Cwala et al., 2010), stejně jako v případě 78

našich pokusů. Sledovaný fyziologický parametr, obsah fotosyntetických pigmentů v listech, se v pokusu 3 u rostlin rajčat mezi jednotlivými variantami ošetření nelišil. Obsah chlorofylu v listech rajčat byl sledován ve studii autorů Latef & Chaoxing (2011), kde byly rostliny ošetřeny mykorhizní houbou G. mosseae; k významné změně obsahu chlorofylu v listech v této studii vlivem ošetření nedošlo. Je nutno podotknout ţe ve všech pokusech, kromě pokusu 1, nedošlo k rozvinutí mykorhizní kolonizace kořenů, nelze tedy hodnotit vliv tohoto ošetření na rostlinné parametry v pokusech 2, 3, 4, 5 a 6. Nebyly změněny ani kvalitativní vlastnosti plodů rajčat. V případě cukernatosti plodů nebyly zjištěny významné rozdíly mezi jednotlivými variantami. Cukernatost plodů rajčat v pokusu dosahovala v průměru 3,6 %. Dle literatury dosahují odrůdy s většími plody cukernatosti 3 – 5 %, odrůdy se středně velkými plody 5 – 7 % a odrůdy s nejmenšími plody 9 – 15 %. Na výši obsahu cukrů v plodech se podílí také vnější podmínky, jako je teplota a ozářenost. Při vyšších teplotách a vyšší ozářenosti mají plody rajčat vyšší obsah cukrů (rev. Beckles, 2012). Rajčata v našem pokusu spadala mezi odrůdy se střední velikostí plodů, dosahovala tedy spíše nízkých hodnot cukernatosti. Rajčata v pokusu byla pěstována od poloviny září do poloviny prosince, a přestoţe byl skleník vytápěn a rostlinám bylo přisvětlováno, teplota i ozářenost dosahovaly jistě niţších hodnot neţ jaké by mohly být v letním období; niţší teplota a méně světla jsou tedy moţnými důvody niţší cukernatosti plodů. Celkový obsah fenolických látek v plodech rajčat se mezi jednotlivými variantami nelišil; průměrná hodnota celkového obsahu fenolických látek dosahovala 38 mg/100 g čerstvé váhy plodu. Rozsah celkového obsahu fenolických látek v plodech různých kultivarů rajčat je uváděn následující: 32,66 – 120,35 mg/100 g (Kavitha et al., 2014). Celkový obsah fenolických látek v plodech rajčat byl tedy v našem pokusu spíše niţší. Stejně jako v případě cukernatosti, i mnoţství obsahu fenolických látek v plodech závisí na mnoţství světla, dopadajícího na rostliny. Čím delší je fotoperioda a intenzita a kvalita světla, tím vyšší je obsah fenolických látek v plodech rajčat (rev. Slimestad & Verheul, 2009). Obsah vitaminu C v plodech rajčat byl sníţen u variant AM a Th, přičemţ sníţení u obou variant se pohybovalo kolem 10 %. Toto sníţení nebylo výrazné a tyto výsledky nepovaţujeme za příliš významné; jejich interpretační hodnota je diskutabilní zejména z důvodu, ţe u varianty AM nebyla detekována ţádná mykorhizní kolonizace a také z důvodu dalších okolností pokusu, které budou popsány dále. Obsah vitaminu C se v našem pokusu pohyboval mezi 7,8 – 8,8 mg/100 g čerstvé hmotnosti plodu. 79

V literatuře je uváděn běţný rozsah obsahu vitaminu C v plodech rajčat 8,4 - 59 mg/100 g čerstvé hmotnosti (rev. Dumas et al., 2003). Obsahy se tedy v pokusu 3 pohybovaly na dolní hranici a plody nebyly na vitamin C příliš bohaté. Obsah vitaminu C v plodech se liší u rozdílných kultivarů rajčat a je závislý na mnoha okolnostech, například na intenzitě světla, stáří a velikosti plodů. Větší plody často obsahují méně vitaminu C, neţ plody menší velikosti. Bylo zjištěno, ţe rajčata pěstovaná ve skleníku mají niţší obsah vitaminu C v plodech, neţ rostliny pěstované venku, z důvodu niţší intenzity světla ve skleníku. Plody rostlin rajčat, pěstovaných v létě v polních podmínkách mohou obsahovat i o 20 % vitaminu C více, neţ rostliny pěstované ve skleníku v podzimním období (Massot et al., 2010). Rostliny v našem pokusu byly pěstovány v průběhu podzimu ve skleníku, coţ by mohlo vysvětlovat poměrně nízký obsah vitaminu C v plodech. Plody rajčat pro analýzu byly v pokusu sklízeny průběţně, proto je moţné, ţe variabilita v obsahu vitaminu C mezi jednotlivými variantami byla způsobena rozdílnými podmínkami, při kterých některé z plodů dozrávaly, právě z důvodu podzimního období a většího kolísání osvětlení. Plody se mezi sebou také lišily velikostí, coţ mohlo přispět k rozdílným výsledkům jednotlivých variant.

5.4 Mikrobiální ošetření v pokusech Schopnosti některých mutualistických symbiotických mikroorganismů zlepšovat různé rostlinné parametry u zeleniny jsou bohatě popsány v literatuře. Na základě výsledků z předchozích studií byl očekáván podobný vliv mikrobiálního ošetření i v našich

pokusech.

Ve

většině

předchozích

studií

však

byly

symbiotické

mikroorganismy aplikovány ke kořenům rostlin, pěstovaných v půdních substrátech, nikoliv v hydroponických systémech, případně byly sazenice rostlin předpěstovány v substrátu s mikrobiálním ošetřením a následně přesazeny do hydroponie, coţ zvyšuje pravděpodobnost uchycení a rozvoje mikrobiální symbiózy. Jak jiţ bylo popsáno v kapitole 5.1, výţiva rostlin v hydroponickém systému je plně optimalizovaná a rostliny mají dostatek všech potřebných ţivin. Je známo, ţe jsou-li rostliny pěstovány při vyšších koncentracích fosforu, nedochází u nich k rozvinutí mykorhizní symbiózy nebo je mykorhizní kolonizace kořenů nízká (Graham et al., 1981; Thomson et al., 1986; Elias & Safir, 1987). Vysoký obsah fosforu v ţivném roztoku tedy můţe mít negativní vliv na rozvoj mykorhizní symbiózy u hydroponicky pěstovaných rostlin. Tento jev můţe vysvětlovat, proč v našich pokusech nedošlo k mykorhizní kolonizaci kořenů rostlin. 80

V případě pokusu 1 na okurkách kořeny mykorhizními houbami kolonizovány byly nejspíše z toho důvodu, ţe v tomto pokusu byly rostliny zalévány roztokem s niţší koncentrací ţivin. V tomto pokusu mykorhizní kolonizace kořenů rostlin okurek dosahovala necelých 25 %, coţ je ve srovnání s okurkami, pěstovanými v běţném substrátu, hodnota poměrně nízká; například ve studii Chen et al. (2013) kolonizace kořenů rostlin okurek dosahovala 60 %. V případě hydroponicky pěstovaných rostlin byla niţší mykorhizní kolonizace pozorována například u rostlin rajčete, kde kolonizace dosahovala 14 % (Cwala et al., 2010). Co se týká koncentrace fosforu, například ve studii autorů Dasgan et al. (2008) byly rostliny rajčat, ošetřené mykorhizní houbou G. fasciculatum, pěstovány v hydroponii za pouţití ţivného roztoku s poměrně vysokou koncentrací fosforu, 40 – 50 ppm, a u rostlin rajčat v této studii došlo k mykorhizní kolonizaci kořenů a byly vlivem mykorhizy zlepšeny i některé parametry rostlin; došlo ke zvětšení výšky rostlin i ke zvýšení výnosu plodů; ve studii však autoři pouţili rostliny předpěstované v substrátu s mykorhizním inokulem a teprve později je přesadili do hydroponického systému; navíc pouţili velmi vysokou dávku inokula AM. V našich pokusech na rajčatech (pokus 2 a 3) byl pouţit ţivný roztok s koncentrací fosforu, odpovídající 15 ppm. Výnosy plodů u hydroponicky pěstovaných rajčat byly zvýšeny také ve studii autorů Gravel et al. (2007) vlivem T. atroviride či PGPB P. marginalis nebo P. putida. V další studii byla při hydroponickém pěstování okurek navýšena hmotnost sušiny nadzemní části, výška rostlin a obsah chlorofylu v listech vlivem T. harzianum SQR-T037 nebo T. harzianum T-E5 (Zhang et al., 2013a). V našich pokusech byla pozorována poměrně nízká koncentrace Trichodermy v rhizosféře rostlin rajčat i okurek (pokus 4: AM+PGPB+Th 1,36 * 102 CFU/g; AM+Th 2,08 * 103 CFU/g; pokus 5: AM+PGPB+Th 1,5 * 103 CFU/g; pokus 6: AM+Th 4,15 * 102 CFU/g; AM+PGPB+Th 5,53 * 102 CFU/g). Například ve studii autorů Postma et al. (2000) byla u hydroponicky pěstovaných okurek zjištěna hodnota přítomnosti Trichodermy přibliţně 1 * 105 CFU/g. V našich pokusech na okurkách a rajčatech (pokusy 5 a 6) byla navíc přítomnost Trichodermy detekována i u kontrolních rostlin bez ošetření Th. Tato skutečnost mohla mít částečně podíl na vyrovnání hodnot výnosu plodů mezi jednotlivými variantami. Pozitivní detekce Trichodermy v kořenech kontrolních rostlin byla pozorována například u rostlin lubenice obecné (meloun vodní); v případě rostlin ošetřených Trichodermou byla pozorována koncentrace 1 * 104 CFU/g, u kontrolních rostlin byla koncentrace 1 * 102 CFU/g.

81

Změny různých rostlinných parametrů, vlivem symbiotických mikroorganismů, jsou závislé i na dalších faktorech. Velmi záleţí na volbě sloţení mikrobiálního ošetření a jeho kompatibilitě s konkrétním druhem rostliny. Různé druhy mikroorganismů mohou růstové, výnosové, fyziologické i další parametry své hostitelské rostliny ovlivňovat odlišným způsobem. Jako příklad můţeme uvést studii autorů Almaghrabi et al. (2013), kde byly rostliny rajčat ošetřeny šesti různými PGPB z rodů Pseudomonas, Bacillus a Serratia a vlivem těchto bakterií došlo k navýšení některých růstových a výnosových parametrů rostlin; hmotnost sušiny nadzemní části rostlin byla navýšena vlivem všech šesti bakterií, přičemţ mezi některými ošetřeními byly významné rozdíly ve vlivu na hmotnost; výška rostlin byla navýšena pouze vlivem pěti pouţitých bakterií, jedno z ošetření nemělo na výšku rostlin vliv a mezi některými z variant ošetření byly opět rozdíly ve vlivu; působením pouţitých PGPB došlo i ke zvýšení výnosu plodů, pět z pouţitých bakterií zvýšilo výnos plodů, jedno z ošetření jej naopak sníţilo. Kromě kompatibility rostlinného a mikrobiálního partnera je působení symbiotických mikroorganismů na rostliny ovlivňováno i dalšími faktory, například způsobem aplikace mikroorganismů. Ve studii od autorů Azarmi et al. (2011) byl sledován vliv různých kmenů Trichodermy na růstové a fyziologické parametry semenáčků rajčat, přičemţ ošetření bylo aplikováno buď přímo na semena rajčat, nebo do substrátu a bylo zjištěno, ţe semenáčky rajčat dosahovaly největší výšky, měly nejvyšší hmotnost sušiny nadzemní části a obsahu chlorofylu vlivem T. harzianum T969, aplikované do substrátu; při aplikaci na semena nemělo toto ošetření na uvedené parametry významný vliv; pokud byly semenáčky ošetřeny T. harzianum T447, při aplikaci do půdy zůstaly zmíněné růstové parametry rostlin nezměněny a obsah chlorofylu byl oproti kontrole sníţen; při aplikaci na semena toto ošetření nemělo na rostlinné parametry výrazný vliv. Vlivy symbiotických mikroorganismů na rostliny jsou závislé také na koncentraci aplikovaného mikrobiálního ošetření (Segarra et al., 2007).

5.5 Faktory ovlivňující průběh provedených pokusů V případě poloprovozních skleníkových pokusů byl nejspíše nejvíce omezujícím, co se týká pokusů, fakt, ţe nebylo moţno manipulovat se sloţením ţivných roztoků. Z důvodů, ţe tyto pokusy byly prováděny ve velkém objemu (880 – 1408 rostlin na pokus) a probíhaly v rámci běţného provozu producenta, mohl by být zásahem do sloţení ţivných roztoků negativně ovlivněn výnos plodů ve velkém rozsahu a tím 82

i zisky producenta. Nebylo tedy moţno ověřit, jakým způsobem by pokusy probíhaly při niţší koncentraci ţivin, zejména fosforu, zda by došlo k rozvinutí mykorhizní symbiózy a zda by pouţitá ošetření měla na výnos rostlin vliv. K potlačení rozvinutí mikrobiálního ošetření v pokusech mohlo dojít také v důsledku opakované aplikace fungicidů. Kupříkladu pouţitý fungicid Ortiva obsahuje azoxystrobiny, coţ jsou látky, které, zejména při aplikaci zálivkou, mají velmi negativní dopad na rozvoj mykorhizy (Diedhiou et al., 2004). Vliv na nerozvinutí mykorhizní symbiózy dále můţe mít i fakt, ţe mikrobiální ošetření bylo aplikováno aţ ke starším rostlinám (stáří okurek 25 – 28 dnů, stáří rajčat 50 dnů) při jejich umístění do hydroponického systému. Pokud by rostliny byly předem předpěstovány jiţ s mikrobiálním ošetřením, mohlo by to pozitivně ovlivnit rozvoj mykorhizy, jako například ve studii Dasgan et al. (2008). U hrnkových skleníkových pokusů bylo moţno sloţení ţivných roztoků ovlivnit; pouţívali jsme různé koncentrace ţivin u různých pokusů. U všech tří hrnkových pokusů se však vyskytly technické problémy, zasahující do průběhu pokusů. Rostliny okurek v pokusu 1 byly napadeny patogeny (třásněnkami a houbovou chorobou) a přestoţe byl následně pravidelně prováděn postřik proti těmto patogenům, nepodařilo se nákazu zlikvidovat. Z důvodu špatného zdravotního stavu rostlin nadzemní část dosahovala pouze velmi malého vzrůstu a výnosy plodů byly taktéţ velmi nízké. Plody okurek v pokusu 1 dorůstaly do hmotnosti v průměru 30 g, přičemţ plody okurek stejné odrůdy ze zdravých, prosperujících rostlin v poloprovozních pokusech 4 a 5 byly sklízeny při průměrné hmotnosti 300 g. Pokus 2, prováděný na rajčatech, byl zahájen v polovině června, coţ je vcelku příznivá doba pro pěstování rajčat. V průběhu pokusu byl personálem skleníku, starající se o zalévání rostlin o víkendu, nechtěně nalit k rostlinám roztok, obsahující neţádoucí látky. Z tohoto důvodu musel být pokus po měsíci trvání neplánovaně a nuceně ukončen. U rostlin z tohoto pokusu byly alespoň vyhodnoceny růstové parametry; byla zjištěna výška rostlin a hmotnost sušiny nadzemní části rostlin. Mykorhizní kolonizace kořenů u rostlin zjištěna nebyla. K úspěšnému rozvinutí mykorhizní kolonizace dochází u rostlin povětšinou za 4 – 6 týdnů, pokus byl tedy pro ustanovení mykorhizní kolonizace příliš krátký, nemohly se zde tedy projevit vlivy tohoto ošetření. Po neúspěšném průběhu pokusu 2 byl naplánován další pokus na rajčatech s totoţným návrhem. Ihned po ukončení pokusu 2 byla vyseta semena rajčat pro pokus 3, po třech týdnech se však vyskytly problémy a vzešlé semenáčky odumřely. V prvním týdnu v srpnu byla vyseta semena nová, vzhledem k extrémně vysokým teplotám ve 83

skleníku však semenáčky rajčat opět nepřeţily. Opět tedy byla vyseta semena, která jiţ byla pěstována úspěšně, a byl zaloţen pokus 3. Ze zmíněných důvodů byl pokus 3 zahájen aţ v první polovině září a probíhal po celý podzim. Podmínky pokusu byly tedy značně suboptimální, coţ se negativně projevilo na zhoršeném růstu, vedoucímu aţ k odumření některých rostlin. Vlhké a chladné podzimní počasí podporovalo výskyt a šíření houbových chorob, kterými byly rostliny rajčat v průběhu pokusu nakaţeny. Pravidelně byl prováděn postřik fungicidním přípravkem, ale onemocnění rostlin se plně zlikvidovat nepodařilo. Při postřiku fungicidním přípravkem byl kořenový systém rostlin důkladně chráněn, aby nedošlo k vlivu přípravku na mikrobiální ošetření, nelze však vliv tohoto fungicidního přípravku na potlačení houbového mikrobiálního ošetření, tedy AM a Th, úplně vyloučit. Všechny tři hrnkové pokusy se potýkaly s různými problémy, narušujícími průběh pokusů a proto by bylo vhodné provést podobných pokusů více. V roce 2013 jsem se však účastnila studijního pobytu v zahraničí a z tohoto důvodu jsem pokusy v tomto roce neprováděla, máme tedy k dispozici pouze výsledky pokusů z jedné sezony (rok 2012). Přestoţe výsledky z našich pokusů nejsou příliš optimistické, neznamená to, ţe by mikrobiální ošetření při pouţití v hydroponickém systému nemohlo na některé rostlinné parametry působit pozitivně. Problémem hydroponických pokusů je zejména to, ţe by bylo třeba pracovat v systému, který umoţňuje manipulaci s obsahem ţivin, dodávaných rostlinám, coţ momentálně v ČR není v poloprovozních podmínkách moţné. Lze pouze provádět menší pokusy, které pokud by byly úspěšné, je nutno dále opakovat právě v poloprovozních podmínkách. V pokusech jsme se potýkali s různými experimentálními problémy; hypotéza, ţe hydroponická kultivace rostlin rajčete a okurky můţe zvyšovat výnosy plodů a obsahy látek s antioxidačním účinkem v plodech nemůţe být potvrzena ani vyvrácena. Byla by třeba další sezona či více pro získání dalších výsledků a vyvození komplexnějších závěrů.

5.6 Hydroponické pěstování v budoucím výzkumu Ve světě je hydroponické pěstování zeleniny široce rozšířeno. Pokud by se podařilo najít vhodné mikrobiální ošetření, zvyšující výnosy plodů a kvalitu obsahových látek v plodech v hydroponickém pěstování, vedlo by to ke zvýšené ekologické produkci zeleniny bez pouţití agrochemikálií či alespoň s jejich sníţeným pouţitím.

84

Jedním z aktuálních témat, která jsou řešena současným zemědělstvím a zelinářstvím, je zvyšování nutriční hodnoty zeleniny, coţ má v dnešní době význam zejména v zemích třetího světa, kde je důleţitý vysoký obsah ţivin, jako jsou cukry a bílkoviny v potravě. Ve vyspělých částech světa, kde není problém s nedostatkem potravin, stoupá zájem o kvalitní potraviny, které jsou schopny podporovat odolnost člověka proti civilizačním chorobám a nepříznivým vlivům prostředí. Z těchto důvodů je cílem současného vývoje navyšování obsahu antioxidantů a dalších prospěšných bioaktivních látek v konzumované potravě. Producenti zeleniny se snaţí přizpůsobovat aktuálním trendům a nabízet spotřebitelům kvalitní potraviny, bohaté na antioxidanty a další látky. Vlivem manipulace obsahových látek dochází i ke změně v chuti plodů. Například vyšší obsah cukrů v plodech navyšuje nejen nutriční kvalitu plodů, ale také zlepšuje chuťové vlastnosti plodů, čímţ stoupá atraktivita pro spotřebitele. Proto tato tématika patří v současné době k aktuálním ve výzkumu vlivu mikrobiálních inokulací v zemědělské produkci.

85

6 Souhrn K rozvinutí mykorhizní symbiózy v hrnkových skleníkových pokusech došlo pouze v pokusu 1 na okurkách. V ţádném z pokusů se mezi jednotlivými variantami nelišily hodnoty růstových, fyziologických ani výnosových parametrů rostlin. Cukernatost plodů ani celkový obsah fenolických látek v plodech rajčat se mezi jednotlivými variantami ošetření nelišily. Obsah vitaminu C v plodech rajčat byl sníţen v průměru o 10 % u rostlin ošetřených AM a u rostlin ošetřených Th. V ţádném z poloprovozních skleníkových pokusů (pokusy 4, 5 a 6) mykorhizní kolonizace kořenů arbuskulárními mykorhizními houbami nebyla úspěšná; v ţádném z těchto pokusů u ţádné z variant nebyla zjištěna. Kolonizace kořenů Th byla zjištěna u všech pokusů u varianty Th. Nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly v hmotnosti plodů na rostlinu mezi jednotlivými variantami. Aplikace mikrobiálního ošetření v hydroponických poloprovozních či provozních podmínkách má úskalí optimálního sloţení ţivných roztoků. Pokud je sloţení ţivných roztoků optimalizováno pro rostliny bez mikrobiálního ošetření, jak tomu bylo v poloprovozních pokusech, pak rostlina nepotřebuje vyuţít mutualistickou symbiózu a investovat energii ve formě asimilátů do rozvoje struktur, podporujících mikrobiální symbiózu. V případě poloprovozních skleníkových pokusů nebylo moţno manipulovat se sloţením ţivných roztoků. U hrnkových skleníkových pokusů bylo moţno sloţení ţivných roztoků ovlivnit; pouţívali jsme různé koncentrace ţivin u různých pokusů. Nicméně u všech tří hrnkových pokusů se vyskytly technické problémy, zasahující do průběhu pokusů a z časových důvodů se nepodařilo provést pokusy další. Na základě provedených pokusů a jejich výsledků lze uzavřít, ţe hypotézy, ţe hydroponická kultivace rostlin rajčete a okurky s mikrobiálním ošetřením zvyšuje růstové a fyziologické parametry rostlin, kvalitu výnosů plodů a obsahy látek s antioxidační aktivitou v plodech, nelze potvrdit ani vyvrátit. Pro ověření by bylo třeba experimenty zopakovat s dodrţením agrotechnických lhůt pro kultivaci obou druhů rostlin a s moţností manipulovat se sloţením ţivných roztoků.

86

7 Seznam literatury Abbaspour H, Saeidi-Sar S, Afshari H. 2011. Improving drought tolerance of Pistacia vera L. seedlings by arbuscular mycorrhiza under greenhouse conditions. Journal of Medicinal Plants Research 5, 7065-7072. Agerbirk N, De Vos M, Kim JH, Jander G. 2009. Indole glucosinolate breakdown and its biological effects. Phytochemistry Reviews 8, 101-120. Al-Karaki GN, Hammad R. 2001. Mycorrhizal influence on fruit yield and mineral content of tomato grown under salt stress. Journal of Plant Nutrition 24, 13111323. Albrechtova J, Latr A, Nedorost L, Pokluda R, Posta K, Vosatka M. 2012. Dual Inoculation with Mycorrhizal and Saprotrophic Fungi Applicable in Sustainable Cultivation Improves the Yield and Nutritive Value of Onion. Scientific World Journal, 8. Alguacil MM, Hernandez JA, Caravaca F, Portillo B, Roldan A. 2003. Antioxidant enzyme activities in shoots from three mycorrhizal shrub species afforested in a degraded semi-arid soil. Physiologia Plantarum 118, 562-570. Almaghrabi OA, Massoud SI, Abdelmoneim TS. 2013. Influence of inoculation with plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on tomato plant growth and nematode reproduction under greenhouse conditions. Saudi Journal of Biological Sciences 20, 57-61. Andrade SAL, Malik S, Sawaya A, Bottcher A, Mazzafera P. 2013. Association with arbuscular mycorrhizal fungi influences alkaloid synthesis and accumulation in Catharanthus roseus and Nicotiana tabacum plants. Acta Physiologiae Plantarum 35, 867-880. Awasthi A, Bharti N, Nair P, Singh R, Shukla AK, Gupta MM, Darokar MP, Kalra A. 2011. Synergistic effect of Glomus mosseae and nitrogen fixing Bacillus subtilis strain Daz26 on artemisinin content in Artemisia annua L. Applied Soil Ecology 49, 125-130. Azarmi R, Hajieghrari B, Giglou A. 2011. Effect of Trichoderma isolates on tomato seedling growth response and nutrient uptake. African Journal of Biotechnology 10, 5850-5855. Bal U, Altintas S. 2006. Effects of Trichoderma harzianum on the yield and fruit quality of tomato plants (Lycopersicon esculentum) grown in an unheated greenhouse. Australian Journal of Experimental Agriculture 46, 131-136. Balsano C, Alisi A. 2009. Antioxidant Effects of Natural Bioactive Compounds. Current Pharmaceutical Design 15, 3063-3073. Ban D, Ban SG, Oplanic M, Horvat J, Novak B, Zanic K, Znidarcic D. 2011. GROWTH AND YIELD RESPONSE OF WATERMELON TO IN-ROW 87

PLANT SPACINGS AND MYCORRHIZA. Chilean Journal of Agricultural Research 71, 497-502. Bashan Y, Bustillos JJ, Leyva LA, Hernandez JP, Bacilio M. 2006. Increase in auxiliary photoprotective photosynthetic pigments in wheat seedlings induced by Azospirillum brasilense. Biology and Fertility of Soils 42, 279-285. Baslam M, Garmendia I, Goicoechea N. 2011. Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) Improved Growth and Nutritional Quality of Greenhouse-Grown Lettuce. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59, 5504-5515. Beckles DM. 2012. Factors affecting the postharvest soluble solids and sugar content of tomato (Solanum lycopersicum L.) fruit. Postharvest Biology and Technology 63, 129-140. Benitez T, Rincon AM, Limon MC, Codon AC. 2004. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. International Microbiology 7, 249-260. Blee KA, Anderson AJ. 1996. Defense-related transcript accumulation in Phaseolus vulgaris L colonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices Schenck & Smith. Plant Physiology 110, 675-688. Borde M, Dudhane M, Jite PK. 2009. Role of Bioinoculant (AM Fungi) Increasing in Growth, Flavor Content and Yield in Allium sativum L. under Field Condition. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 37, 124-128. Brotman Y, Landau U, Cuadros-Inostroza A, Takayuki T, Fernie AR, Chet I, Viterbo A, Willmitzer L. 2013. Trichoderma-Plant Root Colonization: Escaping Early Plant Defense Responses and Activation of the Antioxidant Machinery for Saline Stress Tolerance. Plos Pathogens 9, 15. Brown MS, Bethlenfalvay GJ. 1988. THE GLYCINE-GLOMUS-RHIZOBIUM SYMBIOSIS .7. PHOTOSYNTHETIC NUTRIENT-USE EFFICIENCY IN NODULATED, MYCORRHIZAL SOYBEANS. Plant Physiology 86, 12921297. Cakmakci R, Erat M, Erdogan U, Donmez MF. 2007. The influence of plant growthpromoting rhizobacteria on growth and enzyme activities in wheat and spinach plants. Journal of Plant Nutrition and Soil Science-Zeitschrift Fur Pflanzenernahrung Und Bodenkunde 170, 288-295. Castellanos-Morales V, Villegas J, Wendelin S, Vierheilig H, Eder R, CardenasNavarro R. 2010. Root colonisation by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices alters the quality of strawberry fruits (Fragaria x ananassa Duch.) at different nitrogen levels. Journal of the Science of Food and Agriculture 90, 1774-1782. Cekic FO, Unyayar S, Ortas I. 2012. Effects of arbuscular mycorrhizal inoculation on biochemical parameters in Capsicum annuum grown under long term salt stress. Turkish Journal of Botany 36, 63-72. 88

Cvikrova M, Meravy L, Machackova I, Eder J. 1991. PHENYLALANINE AMMONIA-LYASE, PHENOLIC-ACIDS AND ETHYLENE IN ALFALFA (MEDICAGO-SATIVA L) CELL-CULTURES IN RELATION TO THEIR EMBRYOGENIC ABILITY. Plant Cell Reports 10, 251-255. Cwala Y, Laubscher CP, Ndakidemi PA, Meyer AH. 2010. Mycorrhizal root colonisation and the subsequent host plant response of soil less grown tomato plants in the presence and absence of the mycorrhizal stimulant, Mycotech. African Journal of Microbiology Research 4, 414-419. Dasgan HY, Kusvuran S, Ortas I. 2008. Responses of soilless grown tomato plants to arbuscular mycorrhizal fungal (Glomus fasciculatum) colonization in re-cycling and open systems. African Journal of Biotechnology 7, 3606-3613. De la Rosa-Mera CJ, Ferrera-Cerrato R, Alarcon A, Sanchez-Colin MD, MunozMuniz OD. 2011. Arbuscular mycorrhizal fungi and potassium bicarbonate enhance the foliar content of the vinblastine alkaloid in Catharanthus roseus. Plant and Soil 349, 367-376. Devi MC, Reddy MN. 2002. Phenolic acid metabolism of groundnut (Arachis hypogaea L.) plants inoculated with VAM fungus and Rhizobium. Plant Growth Regulation 37, 151-156. Diaz J, Merino F. 1997. Shikimate dehydrogenase from pepper (Capsicum annuum) seedlings. Purification and properties. Physiologia Plantarum 100, 147-152. Diedhiou PM, Oerke EC, Dehne HW. 2004. Effects of the strobilurin fungicides azoxystrobin and kresoxim-methyl on arbuscular mycorrhiza. Zeitschrift Fur Pflanzenkrankheiten Und Pflanzenschutz-Journal of Plant Diseases and Protection 111, 545-556. Druzhinina IS, Shelest E, Kubicek CP. 2012. Novel traits of Trichoderma predicted through the analysis of its secretome. Fems Microbiology Letters 337, 1-9. Dumas Y, Dadomo M, Di Lucca G, Grolier P. 2003. Effects of environmental factors and agricultural techniques on antioxidant content of tomatoes. Journal of the Science of Food and Agriculture 83, 369-382. Dutta S, Mishra AK, Kumar BSD. 2008. Induction of systemic resistance against fusarial wilt in pigeon pea through interaction of plant growth promoting rhizobacteria and rhizobia. Soil Biology & Biochemistry 40, 452-461. Ehlting J, Shin JJK, Douglas CJ. 2001. Identification of 4-coumarate : coenzyme A ligase (4CL) substrate recognition domains. Plant Journal 27, 455-465. Elias KS, Safir GR. 1987. HYPHAL ELONGATION OF GLOMUS-FASCICULATUS IN RESPONSE TO ROOT EXUDATES. Applied and Environmental Microbiology 53, 1928-1933.

89

Erturk Y, Ercisli S, Cakmakci R. 2012. YIELD AND GROWTH RESPONSE OF STRAWBERRY TO PLANT GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA INOCULATION. Journal of Plant Nutrition 35, 817-826. Esitken A, Yildiz HE, Ercisli S, Donmez MF, Turan M, Gunes A. 2010. Effects of plant growth promoting bacteria (PGPB) on yield, growth and nutrient contents of organically grown strawberry. Scientia Horticulturae 124, 62-66. FAOSTAT. 2012. FAOSTAT Agricultural Production Database (přístup duben 2014) Fester T, Fetzer I, Buchert S, Lucas R, Rillig MC, Hartig C. 2011. Towards a systemic metabolic signature of the arbuscular mycorrhizal interaction. Oecologia 167, 913-924. Folin O, Ciocalteu V. 1927. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. The Journal of Biological Chemistry 73, 627-650. Gallo M, Esposito G, Ferracane R, Vinale F, Naviglio D. 2013. Beneficial effects of Trichoderma genus microbes on qualitative parameters of Brassica rapa L. subsp sylvestris L. Janch. var. esculenta Hort. European Food Research and Technology 236, 1063-1071. Gamalero E, Berta G, Massa N, Glick BR, Lingua G. 2010. Interactions between Pseudomonas putida UW4 and Gigaspora rosea BEG9 and their consequences for the growth of cucumber under salt-stress conditions. Journal of Applied Microbiology 108, 236-245. Gholamhoseini M, Ghalavand A, Dolatabadian A, Jamshidi E, Khodaei-Joghan A. 2013. Effects of arbuscular mycorrhizal inoculation on growth, yield, nutrient uptake and irrigation water productivity of sunflowers grown under drought stress. Agricultural Water Management 117, 106-114. Ghorbanpour M, Hatami M, Khavazi K. 2013. Role of plant growth promoting rhizobacteria on antioxidant enzyme activities and tropane alkaloid production of Hyoscyamus niger under water deficit stress. Turkish Journal of Biology 37, 350360. Giada, Lourdes d, Reis, Maria. 2013. Food Phenolic Compounds: Main Classes, Sources and Their Antioxidant Power. In: Morales-Gonzáles, A, José, eds. Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases – A Role for Antioxidants: InTech. Gigolashvili T, Berger B, Mock HP, Muller C, Weisshaar B, Fluegge UI. 2007. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Plant Journal 50, 886-901. Giovannetti M, Avio L, Barale R, Ceccarelli N, Cristofani R, Iezzi A, Mignolli F, Picciarelli P, Pinto B, Reali D, Sbrana C, Scarpato R. 2012. Nutraceutical 90

value and safety of tomato fruits produced by mycorrhizal plants. British Journal of Nutrition 107, 242-251. Giovannetti M, Mosse B. 1980. EVALUATION OF TECHNIQUES FOR MEASURING VESICULAR ARBUSCULAR MYCORRHIZAL INFECTION IN ROOTS. New Phytologist 84, 489-500. Giustarini D, Dalle-Donne I, Tsikas D, Rossi R. 2009. Oxidative stress and human diseases: Origin, link, measurement, mechanisms, and biomarkers. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 46, 241-281. Graham JH, Leonard RT, Menge JA. 1981. MEMBRANE-MEDIATED DECREASE IN ROOT EXUDATION RESPONSIBLE FOR PHOSPHORUS INHIBITION OF VESICULAR-ARBUSCULAR MYCORRHIZA FORMATION. Plant Physiology 68, 548-552. Gravel V, Antoun H, Tweddell RJ. 2007. Growth stimulation and fruit yield improvement of greenhouse tomato plants by inoculation with Pseudomonas putida or Trichoderma atroviride: Possible role of indole acetic acid (IAA). Soil Biology & Biochemistry 39, 1968-1977. Gryndler M, Baláž M, Hršelová H, Jansa J, Vosátka M. 2004. Mykorhizní symbióza. O soužití hub s kořeny rostlin. Praha: Academia. Guo JH, Qi HY, Guo YH, Ge HL, Gong LY, Zhang LX, Sun PH. 2004. Biocontrol of tomato wilt by plant growth-promoting rhizobacteria. Biological Control 29, 6672. Haas D, Defago G. 2005. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. Nature Reviews Microbiology 3, 307-319. Hajiboland R, Aliasgharzadeh N, Laiegh SF, Poschenrieder C. 2010. Colonization with arbuscular mycorrhizal fungi improves salinity tolerance of tomato (Solanum lycopersicum L.) plants. Plant and Soil 331, 313-327. Harrison MJ, Dixon RA. 1994. SPATIAL PATTERNS OF EXPRESSION OF FLAVONOID/ISOFLAVONOID PATHWAY GENES DURING INTERACTIONS BETWEEN ROOTS OF MEDICAGO-TRUNCATULA AND THE MYCORRHIZAL FUNGUS GLOMUS VERSIFORME. Plant Journal 6, 920. Hermosa R, Viterbo A, Chet I, Monte E. 2012. Plant-beneficial effects of Trichoderma and of its genes. Microbiology-Sgm 158, 17-25. Huang JC, Lai WA, Singh S, Hameed A, Young CC. 2013. Response of mycorrhizal hybrid tomato cultivars under saline stress. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 13, 469-484. Huang Z, Zou ZR, He CX, He ZQ, Zhang ZB, Li JM. 2011. Physiological and photosynthetic responses of melon (Cucumis melo L.) seedlings to three Glomus species under water deficit. Plant and Soil 339, 391-399. 91

Chen SC, Jin WJ, Liu AR, Zhang SJ, Liu DL, Wang FH, Lin XM, He CX. 2013. Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) increase growth and secondary metabolism in cucumber subjected to low temperature stress. Scientia Horticulturae 160, 222229. Cheynier V, Comte G, Davies KM, Lattanzio V, Martens S. 2013. Plant phenolics: Recent advances on their biosynthesis, genetics, and ecophysiology. Plant Physiology and Biochemistry 72, 1-20. Chuang YYE, Chen YD, Chandramouli GVR, Cook JA, Coffin D, Tsai MH, DeGraff W, Yan HL, Zhao SP, Russo A, Liu ET, Mitchell JB. 2002. Gene expression after treatment with hydrogen peroxide, menadione, or t-butyl hydroperoxide in breast cancer cells. Cancer Research 62, 6246-6254. Jha Y, Subramanian RB. 2013. Paddy plants inoculated with PGPR show better growth physiology and nutrient content under saline conditions. Chilean Journal of Agricultural Research 73, 213-219. Ji LL, Leeuwenburgh C, Leichtweis S, Gore M, Fiebig R, Hollander J, Bejma J. 1998. Oxidative stress and aging - Role of exercise and its influences on antioxidant systems. Towards Prolongation of the Healthy Life Span: Practical Approaches to Intervention 854, 102-117. Ji P, Campbell HL, Kloepper JW, Jones JB, Suslow TV, Wilson M. 2006. Integrated biological control of bacterial speck and spot of tomato under field conditions using foliar biological control agents and plant growth-promoting rhizobacteria. Biological Control 36, 358-367. Kang GZ, Li GZ, Liu GQ, Xu W, Peng XQ, Wang CY, Zhu YJ, Guo TC. 2013. Exogenous salicylic acid enhances wheat drought tolerance by influence on the expression of genes related to ascorbate-glutathione cycle. Biologia Plantarum 57, 718-724. Kapoor R. 2008. Induced Resistance in Mycorrhizal Tomato is correlated to Concentration ofJasmonic Acid. Vol. 8: OnLine Journal of Biological Sciences, 49-56. Karlidag H, Esitken A, Turan M, Sahin F. 2007. Effects of root inoculation of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield, growth and nutrient element contents of leaves of apple. Scientia Horticulturae 114, 16-20. Kasim WA, Osman ME, Omar MN, Abd El-Daim IA, Bejai S, Meijer J. 2013. Control of Drought Stress in Wheat Using Plant-Growth-Promoting Bacteria. Journal of Plant Growth Regulation 32, 122-130. Kaushish S, Kumar A, Aggarwal A, Parkash V. 2012. Influence of Inoculation with the Endomycorrhizal Fungi and Trichoderma viride on Morphological and Physiological Growth Parameters of Rauwolfia serpentina Benth. Ex. Kurtz. Indian Journal of Microbiology 52, 295-299.

92

Kavino M, Harish S, Kumar N, Saravanakumar D, Damodaran T, Soorianathasundaram K, Samiyappan R. 2007. Rhizosphere and endophytic bacteria for induction of systemic resistance of banana plantlets against bunchy top virus. Soil Biology & Biochemistry 39, 1087-1098. Kavitha P, Shivashankara KS, Rao VK, Sadashiva AT, Ravishankar KV, Sathish GJ. 2014. Genotypic variability for antioxidant and quality parameters among tomato cultivars, hybrids, cherry tomatoes and wild species. Journal of the Science of Food and Agriculture 94, 993-999. Kaya C, Higgs D, Kirnak H, Tas I. 2003. Mycorrhizal colonisation improves fruit yield and water use efficiency in watermelon (Citrullus lanatus Thunb.) grown under well-watered and water-stressed conditions. Plant and Soil 253, 287-292. Koske RE, Gemma JN. 1989. A MODIFIED PROCEDURE FOR STAINING ROOTS TO DETECT VA-MYCORRHIZAS. Mycological Research 92, 486-505. Krishna H, Singh SK, Sharma RR, Khawale RN, Grover M, Patel VB. 2005. Biochemical changes in micropropagated grape (Vitis vinifera L.) plantlets due to arbuscular-mycorrhizal fungi (AMF) inoculation during ex vitro acclimatization. Scientia Horticulturae 106, 554-567. Kuriachan P, Beevy SS. 1992. OCCURRENCE AND CHROMOSOME-NUMBER OF CUCUMIS-SATIVUS VAR HARDWICKII (ROYLE) ALEF IN SOUTH-INDIA AND ITS BEARING ON THE ORIGIN OF CULTIVATED CUCUMBER. Euphytica 61, 131-133. Lamba P, Sharma S, Munshi GD, Munshi SK. 2008. Biochemical changes in sunflower plants due to seed treatment/spray application with biocontrol agents. Phytoparasitica 36, 388-399. Larsen J, Graham JH, Cubero J, Ravnskov S. 2012. Biocontrol traits of plant growth suppressive arbuscular mycorrhizal fungi against root rot in tomato caused by Pythium aphanidermatum. European Journal of Plant Pathology 133, 361-369. Latef A. 2011. Influence of arbuscular mycorrhizal fungi and copper on growth, accumulation of osmolyte, mineral nutrition and antioxidant enzyme activity of pepper (Capsicum annuum L.). Mycorrhiza 21, 495-503. Latef A, Chaoxing H. 2011. Effect of arbuscular mycorrhizal fungi on growth, mineral nutrition, antioxidant enzymes activity and fruit yield of tomato grown under salinity stress. Scientia Horticulturae 127, 228-233. Latef AAA. 2013. Growth and Some Physiological Activities of Pepper (Capsicum annuum L.) in Response to Cadmium Stress and Mycorrhizal Symbiosis. Journal of Agricultural Science and Technology 15, 1437-1448. Li H, Ye ZH, Chan WF, Chen XW, Wu FY, Wu SC, Wong MH. 2011. Can arbuscular mycorrhizal fungi improve grain yield, As uptake and tolerance of rice grown under aerobic conditions? Environmental Pollution 159, 2537-2545. 93

Lichtenthaler HK. 1987. CHLOROPHYLLS AND CAROTENOIDS - PIGMENTS OF PHOTOSYNTHETIC BIOMEMBRANES. Methods in Enzymology 148, 350-382. Lillo C, Lea US, Ruoff P. 2008. Nutrient depletion as a key factor for manipulating gene expression and product formation in different branches of the flavonoid pathway. Plant Cell and Environment 31, 587-601. Mamatha G, Bagyaraj DJ, Jaganath S. 2002. Inoculation of field-established mulberry and papaya with arbuscular mycorrhizal fungi and a mycorrhiza helper bacterium. Mycorrhiza 12, 313-316. Mandal S, Evelin H, Girl B, Singh VP, Kapoor R. 2013. Arbuscular mycorrhiza enhances the production of stevioside and rebaudioside-A in Stevia rebaudiana via nutritional and non-nutritional mechanisms. Applied Soil Ecology 72, 187-194. Massot C, Genard M, Stevens R, Gautier H. 2010. Fluctuations in sugar content are not determinant in explaining variations in vitamin C in tomato fruit. Plant Physiology and Biochemistry 48, 751-757. Mastouri F, Bjorkman T, Harman G. 2010. Trichoderma-Plant Association Enhances Plant Antioxidant Capacity and Tolerance to Abiotic Stresses. Hortscience 45, S65-S65. Maya MA, Matsubara Y. 2013. Influence of arbuscular mycorrhiza on the growth and antioxidative activity in cyclamen under heat stress. Mycorrhiza 23, 381-390. Mayak S, Tirosh T, Glick BR. 2004. Plant growth-promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomatoes and peppers. Plant Science 166, 525-530. Mayer AM. 2006. Polyphenol oxidases in plants and fungi: Going places? A review. Phytochemistry 67, 2318-2331. Mia MAB, Shamsuddin ZH, Wahab Z, Marziah M. 2010. Rhizobacteria as bioenhancer and biofertilizer for growth and yield of banana (Musa spp. cv. 'Berangan'). Scientia Horticulturae 126, 80-87. Mishra PK, Bisht SC, Ruwari P, Selvakumar G, Joshi GK, Bisht JK, Bhatt JC, Gupta HS. 2011. Alleviation of cold stress in inoculated wheat (Triticum aestivum L.) seedlings with psychrotolerant Pseudomonads from NW Himalayas. Archives of Microbiology 193, 497-513. Najafi M, Najafi H. 2012. DFT/B3LYP study of the substituent effects on the reaction enthalpies of the antioxidant mechanisms of Indole-3-Carbinol derivatives in the gas-phase and water. Computational and Theoretical Chemistry 999, 34-42. Nautiyal CS, Govindarajan R, Lavania M, Pushpangadan P. 2008. Novel mechanism of modulating natural antioxidants in functional foods: Involvement of plant growth promoting rhizobacteria NRRL B-30488. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56, 4474-4481.

94

Nema NK, Maity N, Sarkar B, Mukherjee PK. 2011. Cucumis sativus fruit-potential antioxidant, anti-hyaluronidase, and anti-elastase agent. Archives of Dermatological Research 303, 247-252. Ni QD, Zou YN, Wu QS, Huang YM. 2013. Increased Tolerance of Citrus (Citrus tangerina) Seedlings to Soil Water Deficit after Mycorrhizal Inoculation: Changes in Antioxidant Enzyme Defense System. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca 41, 524-529. Nzanza B, Marais D, Soundy P. 2011. Tomato (Solanum lycopersicum L.) seedling growth and development as influenced by Trichoderma harzianum and arbuscular mycorrhizal fungi. African Journal of Microbiology Research 5, 425-431. Okada T, Matsubara Y. 2012. Influence of Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Sodium Chloride on Fusarium Root Rot and Antioxidative Abilities in Asparagus Plants. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 81, 257-262. Orhan E, Esitken A, Ercisli S, Turan M, Sahin F. 2006. Effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield, growth and nutrient contents in organically growing raspberry. Scientia Horticulturae 111, 38-43. Orujei Y, Shabani L, Sharifi-Tehrani M. 2013. Induction of glycyrrhizin and total phenolic compound production in licorice by using arbuscular mycorrhizal fungi. Russian Journal of Plant Physiology 60, 855-860. Paris HS, Daunay MC, Janick J. 2012. Occidental diffusion of cucumber (Cucumis sativus) 500-1300 CE: two routes to Europe. Annals of Botany 109, 117-126. Park JW, Balaraju K, Kim JW, Lee SW, Park K. 2013. Systemic resistance and growth promotion of chili pepper induced by an antibiotic producing Bacillus vallismortis strain BS07. Biological Control 65, 246-257. Perron NR, Brumaghim JL. 2009. A Review of the Antioxidant Mechanisms of Polyphenol Compounds Related to Iron Binding. Cell Biochemistry and Biophysics 53, 75-100. Pirlak L, Kose M. 2009. Effects of Plant Growth Promoting Rhizobacteria on Yield and Some Fruit Properties of Strawberry. Journal of Plant Nutrition 32, 1173-1184. Porcel R, Ruiz-Lozano JM. 2004. Arbuscular mycorrhizal influence on leaf water potential, solute accumulation, and oxidative stress in soybean plants subjected to drought stress. Journal of Experimental Botany 55, 1743-1750. Porra RJ, Thompson WA, Kriedemann PE. 1989. DETERMINATION OF ACCURATE EXTINCTION COEFFICIENTS AND SIMULTANEOUSEQUATIONS FOR ASSAYING CHLOROPHYLL-A AND CHLOROPHYLL-B EXTRACTED WITH 4 DIFFERENT SOLVENTS - VERIFICATION OF THE CONCENTRATION OF CHLOROPHYLL STANDARDS BY ATOMICABSORPTION SPECTROSCOPY. Biochimica Et Biophysica Acta 975, 384-394.

95

Postma J, Willemsen-de Klein M, van Elsas JD. 2000. Effect of the indigenous microflora on the development of root and crown rot caused by Pythium aphanidermatum in cucumber grown on rockwool. Phytopathology 90, 125-133. Rao AV, Balachandran B. 2002. Role of oxidative stress and antioxidants in neurodegenerative diseases. Nutritional Neuroscience 5, 291-309. Ratti N, Verma HN, Gautam SP. 2010. Effect of Glomus species on physiology and biochemistry of Catharanthus roseus. Indian Journal of Microbiology 50, 355-360. Rawat L, Singh Y, Shukla N, Kumar J. 2011. Alleviation of the adverse effects of salinity stress in wheat (Triticum aestivum L.) by seed biopriming with salinity tolerant isolates of Trichoderma harzianum. Plant and Soil 347, 387-400. Redecker D, Schussler A, Stockinger H, Sturmer SL, Morton JB, Walker C. 2013. An evidence-based consensus for the classification of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota). Mycorrhiza 23, 515-531. Romieu I, Castro-Giner F, Kunzli N, Sunyer J. 2008. Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: a review. European Respiratory Journal 31, 179196. Ruiz-Sanchez M, Armada E, Munoz Y, de Salamone IEG, Aroca R, Ruiz-Lozano JM, Azcon R. 2011. Azospirillum and arbuscular mycorrhizal colonization enhance rice growth and physiological traits under well-watered and drought conditions. Journal of Plant Physiology 168, 1031-1037. Sandhya V, Ali SZ, Grover M, Reddy G, Venkateswarlu B. 2010. Effect of plant growth promoting Pseudomonas spp. on compatible solutes, antioxidant status and plant growth of maize under drought stress. Plant Growth Regulation 62, 21-30. Sarma BK, Singh DP, Mehta S, Singh HB, Singh UP. 2002. Plant growth-promoting rhizobacteria-elicited alterations in phenolic profile of chickpea (Cicer arietinum) infected by Sclerotium rolfsii. Journal of Phytopathology-Phytopathologische Zeitschrift 150, 277-282. Scandalios JG. 1993. OXYGEN STRESS AND SUPEROXIDE DISMUTASES. Plant Physiology 101, 7-12. Schaaf J, Walter MH, Hess D. 1995. PRIMARY METABOLISM IN PLANT DEFENSE - REGULATION OF A BEAN MALIC ENZYME GENE PROMOTER IN TRANSGENIC TOBACCO BY DEVELOPMENTAL AND ENVIRONMENTAL CUES. Plant Physiology 108, 949-960. Segarra G, Casanova E, Bellido D, Odena MA, Oliveira E, Trillas I. 2007. Proteome, salicylic acid, and jasmonic acid changes in cucumber plants inoculated with Trichoderma asperellum strain T34. Proteomics 7, 3943-3952. Shahzad SM, Khalid A, Arshad M, Khalid M, Mehboob I. 2008. INTEGRATED USE OF PLANT GROWTH PROMOTING BACTERIA AND P-ENRICHED

96

COMPOST FOR IMPROVING GROWTH, YIELD AND NODULATION OF CHICKPEA. Pakistan Journal of Botany 40, 1735-1741. Shetty, Kalidas. 1996. Biotechnology to harness the benefits of dietary phenolics; focus on Lamiaceae. Vol. 6: Asia Pacific J Clin Nutr, 162-171. Shetty P, Atallah MT, Shetty K. 2003. Stimulation of total phenolics, L-DOPA and antioxidant activity through proline-linked pentose phosphate pathway in response to proline and its analogue in germinating fava beans (Vicia faba). Process Biochemistry 38, 1707-1717. Singh A, Jain A, Sarma BK, Upadhyay RS, Singh HB. 2014. Beneficial compatible microbes enhance antioxidants in chickpea edible parts through synergistic interactions. Lwt-Food Science and Technology 56, 390-397. Singh A, Sarma BK, Upadhyay RS, Singh HB. 2013. Compatible rhizosphere microbes mediated alleviation of biotic stress in chickpea through enhanced antioxidant and phenylpropanoid activities. Microbiological Research 168, 33-40. Singh UP, Sarma BK, Singh DP. 2003. Effect of plant growth-promoting rhizobacteria and culture filtrate of Sclerotium rolfsii on phenolic and salicylic acid contents in chickpea (Cicer arietinum). Current Microbiology 46, 131-140. Slimestad R, Verheul M. 2009. Review of flavonoids and other phenolics from fruits of different tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) cultivars. Journal of the Science of Food and Agriculture 89, 1255-1270. Slinkard K, Singleton VL. 1977. TOTAL PHENOL ANALYSIS - AUTOMATION AND COMPARISON WITH MANUAL METHODS. American Journal of Enology and Viticulture 28, 49-55. Sohrabi Y, Heidari G, Weisany W, Ghasemi-Golezani K, Mohammadi K. 2012. Some physiological responses of chickpea cultivars to arbuscular mycorrhiza under drought stress. Russian Journal of Plant Physiology 59, 708-716. Sotiroudis G, Melliou E, Sotiroudis TG, Chinou I. 2010. CHEMICAL ANALYSIS, ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THREE GREEK CUCUMBER (CUCUMIS SATIVUS) CULTIVARS. Journal of Food Biochemistry 34, 61-78. Subramanian KS, Charest C, Dwyer LM, Hamilton RI. 1995. ARBUSCULAR MYCORRHIZAS AND WATER RELATIONS IN MAIZE UNDER DROUGHT STRESS AT TASSELLING. New Phytologist 129, 643-650. Talaat NB, Shawky BT. 2014. Protective effects of arbuscular mycorrhizal fungi on wheat (Triticum aestivum L.) plants exposed to salinity. Environmental and Experimental Botany 98, 20-31. Thomson BD, Robson AD, Abbott LK. 1986. EFFECTS OF PHOSPHORUS ON THE FORMATION OF MYCORRHIZAS BY GIGASPORA-CALOSPORA AND

97

GLOMUS-FASCICULATUM IN RELATION TO ROOT CARBOHYDRATES. New Phytologist 103, 751-765. Vessey JK. 2003. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil 255, 571-586. Vogt T. 2010. Phenylpropanoid Biosynthesis. Molecular Plant 3, 2-20. Vosátka M, Albrechtová J. 2008. Theoretical Aspects and Practical Uses of Mycorrhizal Texhnology in Floriculture and Horticulture. UK: Isleworth, 466-479. Walters DR, Ratsep J, Havis ND. 2013. Controlling crop diseases using induced resistance: challenges for the future. Journal of Experimental Botany 64, 12631280. Wang CJ, Yang W, Wang C, Gu C, Niu DD, Liu HX, Wang YP, Guo JH. 2012. Induction of Drought Tolerance in Cucumber Plants by a Consortium of Three Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Strains. Plos One 7, 10. Wang CX, Li XL, Zhou JC, Wang GQ, Dong YY. 2008. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on growth and yield of cucumber plants. Communications in Soil Science and Plant Analysis 39, 499-509. Wei G, Kloepper JW, Tuzun S. 1996. Induced systemic resistance to cucumber diseases and increased plant growth by plant growth-promoting rhizobacteria under field conditions. Phytopathology 86, 221-224. Williams J, Clarkson JM, Mills PR, Cooper RM. 2003. A selective medium for quantitative reisolation of Trichoderma harzianum from Agaricus bisporus compost. Applied and Environmental Microbiology 69, 4190-4191. Wu QS, Zou YN, Xia RX. 2006. Effects of water stress and arbuscular mycorrhizal fungi on reactive oxygen metabolism and antioxidant production by citrus (Citrus tangerine) roots. European Journal of Soil Biology 42, 166-172. Yedidia I, Shoresh M, Kerem Z, Benhamou N, Kapulnik Y, Chet I. 2003. Concomitant induction of systemic resistance to Pseudomonas spingae pv. lachrymans in cucumber by Trichoderma asperellum (T-203) and accumulation of phytoalexins. Applied and Environmental Microbiology 69, 7343-7353. You Q, Wang BW, Chen F, Huang ZL, Wang X, Luo PG. 2011. Comparison of anthocyanins and phenolics in organically and conventionally grown blueberries in selected cultivars. Food Chemistry 125, 201-208. Zehnder GW, Yao CB, Murphy JF, Sikora ER, Kloepper JW. 2000. Induction of resistance in tomato against cucumber mosaic cucumovirus by plant growthpromoting rhizobacteria. Biocontrol 45, 127-137. Zhang FG, Yuan J, Yang XM, Cui YQ, Chen LH, Ran W, Shen QR. 2013a. Putative Trichoderma harzianum mutant promotes cucumber growth by enhanced production of indole acetic acid and plant colonization. Plant and Soil 368, 433444. 98

Zhang RQ, Zhu HH, Zhao HQ, Yao Q. 2013b. Arbuscular mycorrhizal fungal inoculation increases phenolic synthesis in clover roots via hydrogen peroxide, salicylic acid and nitric oxide signaling pathways. Journal of Plant Physiology 170, 74-79. Zheng HZ, Kim YW, Lee HJ, Park RD, Jung WJ, Kim YC, Lee SH, Kim TH, Kim KY. 2004. Quantitative changes of PR proteins and antioxidative enzymes in response to Glomus intraradices and Phytophthora capsici in pepper (Capsicum annuum L.) plants. Journal of Microbiology and Biotechnology 14, 553-562. ZhongQun H, ChaoXing H, ZhiBin Z, ZhiRong Z, HuaiSong W. 2007. Changes of antioxidative enzymes and cell membrane osmosis in tomato colonized by arbuscular mycorrhizae under NaCl stress. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces 59, 128-133. Zhu XC, Song FB, Liu SQ, Liu TD, Zhou X. 2012. Arbuscular mycorrhizae improves photosynthesis and water status of Zea mays L. under drought stress. Plant Soil and Environment 58, 186-191. Zubek S, Mielcarek S, Turnau K. 2012. Hypericin and pseudohypericin concentrations of a valuable medicinal plant Hypericum perforatum L. are enhanced by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza 22, 149-156.

99