METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________
BATERIE PRIMÁRNÍCH ZKOUŠEK CYTOKOMPATIBILITY SLITIN PRO DENTÁLNÍ IMPLANTÁTY BATTERY OF PRIMARY ASSAYS TO TEST CYTOCOMPATIBILITY OF DENTAL IMPLANTS ALLOYS Vítězslav Březina Jiří Kudrman Jiří Vaněk Stomatologické výzkumné centrum, LF MU Komenského nám. 2, 662 62 Brno, UJP a.s., Pod Kamínkou 1345, 156 10 Praha Abstrakt: Studie je zaměřena na primární testy cytokompability materiálů užitých v medicíně a je použitelná jak pro materiály arteficiální, tak i přírodní. Velké množství materiálů, které dnes rychle vznikají, je zapotřebí roztřídit před preklinickými a klinickými testy. Baterii krátkých testů, které představujeme jako primární testy na úrovni tkáňových a buněčných kultur rozhodují o testování následném. Testová baterie se skládá s buněčného dilatačního testu, tří kontaktních testů a testů klastogenity na chromosomech buněčných linií, anebo chromosomech lidských. Pomocí těchto testů se v uplynulém výzkumném období podařilo úspěšně uvést nové biokompatibilní materiály do dentální implantologie. Study is focused on the primary assays to set cytocompatibility of materials used in medicine wheather on arificial or natural. Many and many materials arised now in short time, and it is necessary to grade it exactly, before preclinical and clinical assays. Battery of short tests is suggested as a primary tests on the level of tissue and cell culture to decide about next testing steps. Test battery consist of cell dilatation test (spreading), three contact tests, and klasogenity test on heteroploid cell line, or human chromosomes. By means of used battery was introduced new materials for implantology in last research time.
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Problematika zkoušek biokompatibility je stále rozvíjena - je to tím, že s rozvojem technologií vzniká stále více nových materiálů s vlastnostmi, které mohou být využity v medicíně, buď jako náhrady ztracených částí těla, nebo jako podpůrné prostředky, usnadňující či zpříjemňující život. Naše pozornost je upřena do sféry dentálních implantátů, jejichž potřeba se neustále zvyšuje, a je na ně požadována vysoká kvalita nejenom pokud jde o vlastnosti mechanické, ale, co je snad významnější i na vlastnosti biologické. Znamená to, že nelze vyrábět jakoukoli náhradu určenou pro medicínu, která by nesplnila jak mechanické, tak i biologické normativy. Ty jsou velmi přísné, a pokud jde o biologické normativy, jsou dány souborem norem ISO, kterých je dnes šestnáct. Pro implantační pomůcky, které jsou vpraveny do těla na dlouhou dobu, jsou zkoušky biokompatibility rozděleny do několika částí, z nichž je část zabývající se buněčnou snášenlivostí určující. Vznikne-li tedy nějaký nový materiál, třeba slitina, je prvním požadavkem na určení vhodnosti pro lékařské účely test cytokompatibility. Ten se odehrává na několika úrovních, Tou první je odpověď na otázku, zda není výluh testovaného materiálu toxický. Druhá úroveň odpovídá na otázku, zda je buněčná populace schopna se k materiálu navázat, bez větších ztrát na buněčných funkcích, a třetí úroveň odpovídá na otázku, zda materiál nepoškozuje genetickou výbavu buňky, což souvisí s obavami indukce nádoru. Navržená baterie primárních testů biokompatibility byla aplikována v případě studovaných slitin titanu a to z hlediska vlivu vybraných legujících přísad. Výsledky ukazují, že volba přísady může zásadním způsobem ovlivnit vlastnosti slitin a jejich vhodnost pro užití v humánní medicíně. Dosavadní a současně platný způsob standardizace zdravotnických prostředků je dán normami ČSN EN ISO 7405 a ČSN EN ISO řady 10993. Tyto standardy doporučují metodiky i hodnocení vhodnosti, resp. toxicity zkoušených materiálů. Norma ČSN EN ISO 7405 uvádí jako metodiku zkoušku difúze agarem a zkoušku difúze filtrem, případně dentinovou barierovou zkoušku cytotoxicity. Současné poznatky však ukazují, že tyto metodiky jsou méně citlivé a že použité materiály se nemusí projevovat zjevně toxicky, ale mohou pouze snižovat biotoleranci tak, že procesy interakce buňka-povrch implantátu se zpomalují, nebo se při kontaktu buněk s materiálem zvýšenou měrou vyskytují změny buněčné stavby, jako aberace mítóz, poškození buněčných membrán nebo vznik vícejaderných buněk. Tyto procesy mohou rovněž u některých pacientů vyvolávat zvýšenou citlivost na vložený materiál, a mohou ústit do řady nežádoucích reakcí. Při adjustaci testovací baterie bylo aplikováno 8 metodik sledování cytokompatibility. Tyto metodiky jsou vesměs citlivější k interakci materiál-živá buňka a umožňují detailní dělení materiálů podle těchto rekci. Cílem bylo ověřit tyto metody, připravit jejich certifikaci a zdůvodnit jejich použití pro vyšší stupeň náročnosti hodnocení biokompatibility materiálů v rámci certifikovaných laboratoří. Výše uvedený postup a volbu vlastní metodiky hodnocení cytokompatibility umožňují standardy ČSN EN ISO 10993-5 a ČSN EN ISO 10993-11. Podmínkou je uvedené postupy vysvětlit a zdůvodnit (ČSN EN ISO 10993-11, odst. 6.4). Z této skutečnosti vycházela i tato
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ práce a cílem bylo vytvořit reprodukovatelná kriteria umožňující standardizaci zvolených zkoušek cytokomptibility. Výsledky testů jednotlivých prvků, které by mohly být použity jako přísady, ukazuje tabulka 1. Prvé dva testy, test dilatace a adherence jsou prováděny na živočišných heteroploidních buněčných liniích a to na buňkách L pocházejících z myších embryonálních fibroblastů a na buňkách HeLa pocházející z epiteloidních buněk karcinomu člověka. Třetím testem je screenigový test. Ten je založený na nových poznatcích systémové biologie a užívá jako testovacího kriteria fluorescenci autotrofních mikroorganismů. Tabulka 1: Výsledek testů cytokompatibilitu některých přísad Prvek
Test dilatace Test adherence
Screeningový Souhrnné test hodnocení
Al
tolerantní
tolerantní
toxický
tolerantní
Cu
toxický
toxický
toxický
toxický
In
toxický
toxický
tolerantní
toxický
Mo
tolerantní
tolerantní
tolerantní
tolerantní
Nb
kompatibilní kompatibilní
kompatibilní
kompatibilní
Pb
toxický
toxický
toxický
Ta
kompatibilní kompatibilní
kompatibilní
kompatibilní
Ti
kompatibilní kompatibilní
kompatibilní
kompatibilní
V
tolerantní
toxický
tolerantní
tolerantní
Zn
toxický
toxický
toxický
toxický
Zr
kompatibilní kompatibilní
kompatibilní
kompatibilní
toxický
Výsledek testů dilatace je uveden na grafu (obr.1.) Je zde dobře patrný efekt rozdělující testované materiály do jednotlivých skupin.
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Obr. 1. Test dilatace 120,00
100,00
Procento dilatovaných buněk [%]
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00 0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
Doba expozice [min.]
50,00
60,00
70,00
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Další skupinou testů cytokompatibilitu jsou zkoušky přímé adherence buněk na testované materiály. Při ní jsou buňky očkovány na vzorek materiálu na kterém jsou exponovány 72 hodin. Doba exposice může být i menší, v případě, že hodláme zachytit přímou vazbu povrchových buněčných membrán k testovanému povrchu. Při této zkoušce hledáme zejména atypie v morfologii buněčného povrchu, ty se projevují zejména membránovými vychlípeninami buněčných membrán, popřípadě dalšími změnami buněčného povrchu. Změny jsou odečítány z obrazových záznamů rastrovací elektronové mikroskopie. Některé z nich jsou na obrázku 2. Obrázek 2: Atypie buněčné membrány podobající se velkým bublinám na povrchu
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Obrázek 3: Těchto atypií povrchu buněk přibývá se zvyšující se koncentrací přidané přísady
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Obrázek 4: Krupičková a drobně vláknitá stavba povrchové membrány v závislosti na přísadě.
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Obr.5: Struktura povrchu může podstatně ovlivnit buněčnou adherence.
Neméně významným primárním testem je zkouška klastogenity. Ta je založena na indukci chromozomálních aberací vyprovokovaných materiálem, anebo jeho následnou úpravou. Lomivost chromosomů je velmi silným ukazatelem možné kancerogenity materiálu užitého jako implantát. Ten je v těle umístěn po dlouhou dobu a působení provokující přísady je tedy stálé, trvalé v množstvích, které běžné testy toxicity neodhalí.
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Obr. 6: Chromosomální zlom jako základní aberace chromosomu.
Obr.7: Atypické dělení buněk zobrazené jako chromosomální rozptyl mimo dělící vřeteno.
Podstatou těchto zkoušek je kultivace lidských lymfocytů ve výluhu testovaného materiálu či jeho přísady, anebo přímá kultivace buněk v přítomnosti zkoušeného materiálu. Zkouška odhalí, zda je materiál klastogenní a zda je možno jej propustit k dalším zkouškám, které na primární testy na buněčné úrovni navazují. Ty se již provádějí na laboratorních zvířatech.
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Závěr: Navržená baterie testů cytokompatibility uvádí ucelený systém primárních testů, které vypovídají nejenom o cytotoxicitě, ale rozdělují odezvu buněk na skupinu biotolerance, která znamená, že zkoušený materiál sice není toxický, ale je nutno zabývat se jeho dalšími možnými účinky a skupinu netolerantní, která sice nepůsobí cytotoxicky, ale na buňkách objevuje výrazné změny s možnými neoplastickými následky. Použitá literatura: Březina, V. Cytokompatibilita kovových slitin. Závěrečná zpráva projektu. B.P. MEDICAL spol.s r.o. říjen 2007. Březina, V., Biotolerance dodaných slitin testem adherence buněk k povrchům. B.P. Medical s.r.o., Nové Hrady, 2006-11-27 Míková, R., Vaněk, J., Fousek, J. Hodnocení poškozovacích dějů na reoperovaných implantátech. Zpráva UJP č. 1197. UJP PRAHA a.s., 2006 Červinka, M., and Půža, V. In vitro toxicity testing of implantation materials used in medicine: effects on cell morphology, cell proliferation and DNA synthesis. Toxicology in Vitro, 1990, vol. 4, no. 4/5, p. 711-716. Červinka, M. Time-lapse Phase-contrast Microphotography of Cell Populations as a Basis for Improvement of In vitro Toxicity Assessment. ATLA, 1992, vol. 20, p. 302-306 Červinka, M.,. Půža, V., Hroch, M., and Červinková, Z. In vitro cytotoxicity testing of metal alloys used in medicine: Comparison of different approaches. Toxicology in Vitro, 1994, vol. 8, no. 4, p. 783-785. Hungerford, D.A., 1965: Leukocyte cultures from small inculla of whole blood and preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl. Stain.Technol. 40, 333-338 p. Kolářová, J., Hroch, M. a Červinka, M. Testování cytotoxicity stomatologických materiálů na buněčných kulturách. Acta Medica (Hradec Králové), Supplementum, 1999, roč. 42, s. 51-56. Kudrman, J., Podhorná, B., Míková, R. Vlastnosti a technologie titanových slitin. Zpráva UJP 1108, UJP PRAHA .a.s, 2004 Kudrman, J., Míková, R., Podhorná, B., Veselý, J., Sedláček, V. Optimalizace výběru kovových biomateriálů z hlediska složení, vlastností, životnosti a sekundárních zdravotních rizik. Program MPO POKROK. Zpráva UJP č 1151. Praha, 2005 Míková, R., Vaněk J., Fousek J. Hodnocení poškozovacích dějů na reoperovaných implantátech. Zpráva UJP č. 1157, Praha, 2005 Půža, V., Červinka, M. a Pomajbík, J. Biologické hodnocení slitin Kdynium - K1, K2 a K3 určených k implantacím. Praktcké zubní lékařství, 1993, č. 3, roč. 41, s. 78-85. Půža, V., Kolářová, J. a Červinka, M. Cytologický účinek Jicalu. Stomatologické zprávy, 1997, roč. 38, č. 1, s. 6-14.
METAL 2008 13. –15. 5. 2008, Hradec nad Moravicí ___________________________________________________________________________ Rössner P. et al., 2003: Standardní operační postupy pro biologické monitorování genotoxických účinků faktorů prostředí. Acta Hyg.Epidemiol.Microbiol. č.3, 191pp. Tucker J.D., Morgan W.F., Awa A.A., Bauchinger M., Blakey D., Cornforth M.N., Littlefield L.G., Natarajan A.T., Shasserre C., 1995: A proposed system for scoring structural aberrations detected by chromosome painting. Cytogenet.Cell Genet. 68, 211-221 p. Vaněk, J., Březina, V. Biokompatibilita kovových slitin. Závěrečná zpráva projektu. Stomatologická klinika FNUSA v Brně, říjen 2007.
