Készítette: Kiss Ádám 12.C Czuczor Gergely Bencés Gimnázium 9022 Győr, Széchenyi tér 8.-9.
Baktériumok világa Avagy megfelelő probiotikus készítmény-e a Normaflore?
Kelt: 2011. március 27. 1
Készítette: Kiss Ádám 12.C Czuczor Gergely Bencés Gimnázium 9022 Győr, Széchenyi tér 8.-9. 2011. február, március
Baktériumok világa Avagy megfelelő probiotikus készítmény-e a Normaflore? Bevezető: a tápcsatorna és a probiotikumok Az ember heterotróf táplálkozású mindenevő élőlény. Az emberi szervezetben a táplálék lebontását, emésztését az emésztőrendszer végzi. A felvett táplálék a testben végighalad a tápcsatornán, mely több részből áll. A különböző részeknek eltérő feladatuk, funkciójuk van az emésztés folyamatában aszerint, hogy a táplálék emésztése éppen milyen stádiumban van. A táplálék először a szájüregbe kerül, ahol a fogak megőrlik, és összekeveredik a nyállal. A nyál amiláz enzimet tartalmaz, mely a keményítő bontására szolgál. A nyál alapvetően közel semleges, 7,4-es pH értékű, ez azonban a táplálék kémhatásának függvényében változhat. A táplálék innen a garaton keresztül a nyelőcsőbe, majd a gyomorba kerül. Itt a gyomor keverő mozgásának köszönhetően összekeveredik a gyomornedvvel. A gyomornedv pepszin enzimet tartalmaz, mely a fehérjéket bontja. A gyomor pH értéke erősen savas, 1-2 értékek között változik. A táplálék innen a patkóbélbe kerül, ahol összekeveredik a máj váladékával az epével, és a hasnyálmirigy váladékával a hasnyállal. Az epe eloszlatja (emulgeálja) a zsíros részeket, a hasnyál pedig az amiláz, tripszin, lipáz és nukleáz enzimek segítségével a keményítőt, polipeptideket, lipideket és a nukleinsavakat bontja. Itt a pH érték átcsap enyhén lúgos, 8-as értékre, mely a tápcsatorna további részeiben állandó marad. A vékonybélben aztán folytatódik a tápanyagok bontása a bélnedv enzimjei segítségével (maltáz, laktáz, szacharáz, erepszinek, lipáz, nukleázok és nukleotidázok segítségével). A vékonybélből a táplálék az 1-1,5 m hosszú vastagbélbe kerül. A vastagbél felszíne redős, de bélbolyhok nem találhatók rajta. Mirigysejtjei mechanikus ingerlésre (nyomás, súrlódás) síkos, mucin tartalmú váladékot termelnek, amelynek szerepe elsősorban a béltartalom csúszóssá tétele, előrehaladásának biztosítása. Emésztőenzimet nem tartalmaz, a vékonybélből átkerült, még emésztetlen anyagokat az ember már nem képes hasznosítani. A vastagbélben mintegy 500 különböző baktériumfaj él, melyek a béltartalomban található szerves anyagokat – akár a cellulózt is – hasznosítják. Az emberi szervezet számára az együttélés (szimbiózis) előnye, hogy a baktériumok B- és K-vitamint termelnek, ami a bélfalon keresztül felszívódik. [1] A vastagbélben élő baktériumok pótolhatatlanok az emberi szervezet kiegyensúlyozott működése szempontjából, viszont ez a rendszer 2
időnként sérülhet. A bakteriális fertőzések okozta betegségek kezelésére általában néhány napig tartó antibiotikus kezelés a gyógymód. Az antibiotikumok azonban nem csak a kórokozó baktériumokat pusztítják, hanem a bélflórát is jelentősen károsítják. (Már csak azért is, mert az antibiotikumokat szájon át vesszük be, így végighaladnak a tápcsatornán és közvetlen kapcsolatba kerülnek a bélben élő baktériumokkal.) A bélflóra károsodása számos kellemetlen következményt vonhat maga után. A legsúlyosabb tünet az antibiotikummal kezelt betegeknél, hogy közel 20-30%-uk a kezelés alatt vagy után hasmenéstől szenved, ami egyértelműen jelzi az egészséges bélflóra károsodását. Ezért is fontos antibiotikum kezelés során a probiotikumok használata, melyek helyreállítják a bélflóra működését. A probiotikumok jótékony hatású baktériumok. Javítják a bélflóra működését, elősegítik a problémamentes emésztést, erősítik az immunrendszert és segítik a vitaminhiány megszűnését. A probiotikumok a szervezetbe probiotikus élelmiszerek vagy speciális probiotikus készítmények révén juthatnak. [2] Egy 2008-as tanulmány arra világított rá, hogy a joghurtok kevésbé képesek a bennük lévő probiotikus törzsek gyomorban történő túlélését elősegíteni, mint például a sovány Cheddar sajt. A joghurtban lévő Lactobacillus casei száma rövid időn belül drasztikusan csökken a gyomor savas közegében: 30 perc elteltével 2-es pH mellett számuk a tízmillió baktérium/gramm joghurt mennyiségről 10 baktérium/gramm joghurtra csökken, azaz a gyomor savas közegét csak minden egy milliomodik L. casei élte túl. Míg a Cheddar sajt esetén ugyanaz a kiindulási mennyiség 120 perc elteltével tízezer/g sajtra csökkent – a gyomorsav támadását minden ezredik L. casei élte túl. A másik gyakori, az élelmiszerekben lévő probiotikus baktérium a bifidobaktérium. Ezek gyomorsav túlélő képessége azonban nagyban függ attól, hogy melyik törzs található meg az adott készítményben. Bizonyos törzsek esetében a bejutó bifidobaktériumok egy milliomod része, mások esetében egy százaléka képes 2-es pH mellett élve túljutni a gyomron. A legjobban teljesítő baktérium esetén a túlélőképesség nagyban függ a gyomor pH-jától: igen savas esetben (pH=1) csak minden egymilliomodik, savas esetben (pH=2) minden századik, míg enyhén savas (pH=3) esetben 80%-uk képes volt túlélni. A gyomor jellemzően azonban 1-2-es pH-jú. [2] Léteznek azonban nem élelmiszer probiotikus készítmények is. Ezek magas koncentrációban tartalmaznak probiotikus baktériumokat. Ezek között vannak olyanok, amelyek olyan speciális probiotikus baktériumot tartalmaznak, amelyek képesek túlélni a gyomor savas közegét. A Lacto Seven például 7 féle probiotikus baktériumot tartalmaz, tabletta formájában. Vizsgálataimhoz a Normaflore nevű probiotikus készítményt használtam.
A Normaflore A Normaflore patikákban vény nélkül kapható probiotikus készítmény. Gyakorlatilag műanyag ampullákban lévő folyadék (szuszpenzió), mely tisztított vizet és Bacillus clausii spórákat tartalmaz. A Bacillus clausii a természetben bárhol előforduló és a bél normál flórájában is gyakran megtalálható probiotikum. A készítményben található speciálisan kitenyésztett baktérium ellenáll a gyomorsavnak (a gyomor savas közegét (pH=2) 100%-ban túléli) és az emésztőenzimeknek, így élve képes eljutni a bélrendszer alsóbb részeibe is. Ez a Bacillus clausii a hőhatásoknak is ellenáll, ezért a gyártás, a tárolás, vagy az alkalmazás során bekövetkezett hőhatástól sem sérül, mindvégig megőrzi aktivitását. Többszörösen antibiotikum rezisztens, ezért a leggyakrabban alkalmazott antibiotikumok nem pusztítják el, így alkalmazása már az antibiotikum kúra során is elkezdhető. Gátolja a kórokozó mikroorganizmusok növekedését, és támogatja a hasznos baktériumok 3
szaporodását. Kedvezően befolyásolja az immunrendszert és méregtelenítő (antitoxikus) hatású. A Bacillus clausii különböző, különösen a B-vitamin-csoportba tartozó vitaminok termelésére képes. Az íztelen folyadék bármilyen itallal keverhető, könnyen bevehető. Felnőttek mellett csecsemők és gyermekek is szedhetik. [2] Az előző információk a készítményben található Bacillus clausii tulajdonságait illetően a [2] helyről származnak. Vizsgálataim során bizonyos állítások igazságtartalmát ellenőriztem, azaz, hogy megfelelő probiotikus készítmény-e a Normaflore? Konkrétan azt vizsgáltam, hogy kibírja-e a gyomor szélsőségesen savas pH értékét addig, amíg a táplálékkal együtt a gyomorban tartózkodik, és, hogy optimális-e számára a bél pH értéke a növekedéshez, szaporodáshoz. Vizsgálataimat a Czuczor Gergely Bencés Gimnázium biológia szertárában végeztem.
Eszközök Mikroszkóp és kamera A fénymikroszkópok nagyítástartománya általában 40x-1000x közötti, de egyes készülékek akár 1500x, 2000x nagyításra is képesek. Ez a baktériumok mérettartományába esik, így a fénymikroszkóp alkalmas baktériumok vizsgálatára. A nagyítást megkapjuk, ha az okulár és objektív nagyítását összeszorozzuk. Vizsgálataimhoz BTC márkájú BIM-12T típusú biológiai, sztereo objektíves fénymikroszkópot használtam, 10x okulárral és 40x ill. 100x objektívekkel (400 ill. 1000-szeres nagyításokkal). Fényképezéshez egy Tucsen (3,0 MP) márkájú mikroszkópra szerelhető kamerát használtam. Ezt közvetlenül lehet USB kábellel számítógéphez csatlakoztatni, és így kiváló képeket lehet vele készíteni. A képeken ezután számítógépen további módosítások (pl. kontraszt megváltoztatása) végezhetők annak érdekében, hogy a megfigyelni kívánt dolog minél jobban láthatóvá váljon. A kamerát denzitás mérésnél is használtam.
Tenyésztő A vizsgálatok elvégzésekor szimuláltam az emberi tápcsatornában uralkodó körülményeket a hőmérséklet beállításával. A tenyésztéseket Petri csészékben végeztem a szertárban található szárítószekrényben. Ebben a hőmérsékletet állandó 37,5 oC-ra állítottam. [1] Ezekkel a kísérletekkel kapcsolatban találóbb szó az eszközre a tenyésztő, így a továbbiakban ezt használom.
pH mérő, a pH fogalma A pH érték a folyadék savasságáról, ill. lúgosságáról ad információt. A vízben oxónium ill. hidroxid ionok találhatók, amelyek a vízből származnak. Ha több az oxónium ion, akkor savas, ha a hidroxid ion több, akkor lúgos a víz. A pH érték az oxónium ion koncentrációjának negatív tízes alapú logaritmusaként számolható. Semleges vízben egyaránt 10-7 a koncentrációja az oxónium és a hidroxid
4
ionnak is, ezért a semleges víz pH értéke 7. Ha a pH érték ennél kisebb, akkor a közeg savas, ha nagyobb, akkor lúgos. (pH értéket megfelelő intervallumban van értelme számolni). Mivel a pH érték egy logaritmikus skálán mozog, ezért pl. az 5-ös pH értékű vízben tízszer annyi oxónium ion van, mint a 6-os pH értékű vízben, a 4-esben pedig százszor annyi, mint a 6-osban. Így az 5-ös tízszer, a 4-es százszor erősebben savas, mint a 6-os. A pH értéket általában sav-bázis titrálással határozzuk meg, ez azonban jelen esetben túl időigényes lett volna és nem elég pontos. Ezért vizsgálataimban a pH érték meghatározásához egy Voltcraft márkájú kézi pH mérőt használtam (a képen). Ez a készülék 0-tól 14-es pH értékig képes mérni század pontossággal, plusz-mínusz 0,01 hiba mellett. Ezenkívül automata hőmérsékletkompenzációra képes, ami fontos, hiszen meleg oldatok pH értékét szeretném lemérni. A pH érték meghatározásához kb. 1 cm-re kell a vízbe mártani, és néhány másodpercet várni, majd leolvasni az értéket.
A táptalaj A baktériumok tenyésztéséhez szükségünk van táptalajra, mely tartalmazza a baktériumok számára szükséges megfelelő tápanyagokat. A táptalaj összetételét tekintve lehet természetes eredetű (pl. húsleves, vér), vagy különböző sók keverékéből összeállított szintetikus táptalaj. Laborokban gyakran használnak gél állapotú táptalajokat. A táptalaj Petri csészébe történő kiöntése után megszilárdul, kocsonyás, géles lesz. Erre aztán ún. szélesztéssel viszik fel a baktériumokat. Vizsgálataimban megfelelőbbnek találtam a folyékony táptalajt. A tenyésztéshez ún. bouillon táptalajt használtam. Ezt úgy készítettem, hogy egy darab húst vízben főztem néhány óráig. A főzetet ezután szűrőpapírral leszűrtem így alkalmanként kb. fél liter enyhén sárgás-zöldes táptalajt kaptam. Az így kapott bouillon táptalaj a baktériumok többségének tenyésztésére alkalmas, tartalmazza a megfelelő tápanyagokat. Egy belekben élő baktérium számára kiváló táptalaj.
A sterilitás
Bacillus clausii Egyéb baktérium
0
1
2
3
4
5
6
5
7
8
A kísérletek során törekedtem a rendelkezésemre álló eszközök engedte lehető legnagyobb sterilitás megőrzésére. Ennek érdekében a táptalaj közvetlenül felhasználás előtt lett felforralva. Mikroszkópos vizsgálatnak alávetve nem láttam benne baktériumot, sem egyéb élőlényt. Az eszközeimet etilalkoholban fertőtlenítettem. Ennek ellenére elkerülhetetlen a nem kívánatos mikroorganizmusok okozta fertőződés. A baktériumtenyészet megfelelő körülmények között a 2x függvény szerinti szaporodási ütemet mutatja. Ezt a diagramon a kék vonal jelzi. (A függőleges tengely a tenyészet sűrűségét, a vízszintes az időt jelzi.) A tenyésztés kezdetekor nagyon kis mennyiségben található baktérium. Tegyük a vizsgálataim kezdetét a vízszintes tengely 4-es pontjára, végét a tengely 7-es pontjára (az eltelt időintervallum néhány óra). A vizsgálat kezdetén a táptalajba viszonylag nagy mennyiségű Bacillus clausii baktériumot juttattam. Ekkor a nem teljes sterilitás miatt elméletileg nyomokban jelen lehetett egyéb baktérium is. A diagramról látható, hogy a mérés végére a Bacillus clausii előnye miatt sokkal nagyobb mennyiségben lesz jelen, mint az egyéb baktériumok, így a vizsgálatokkal kapott eredmények a Bacillus clausii-re vonatkoznak. Ezt az elméletet az előzetes vizsgálatokkal igazoltam. (ld. később)
A baktériumspórák A baktériumok kedvezőtlen körülmények között (legtöbbször a tápanyag kimerülése, benne különböző bomlási termények felszaporodása esetén) reprodukciós szerveket, ún. spórákat képeznek. Ezek vagy a baktériumok testében képződnek, és az anyasejt elpusztulása után kiszabadulnak, vagy a sejtsor egyes sejtjei a sejthártyának spóra hártyává alakulása által egészben átalakulnak spórákká. Ezek a spórák igen erős sejtburokkal (spórahártya) rendelkeznek, és a szerves világ eddig ismert legellenállóbb képződései. Fejlődőképességük megőrzése mellett éveken át jól tűrik a szárazságot és a meleget. Mihelyt a spóra kedvező élet- és szaporodási feltételek közé jut, kicsirázik és ismét vegetatív alakká pl. pálcikává nő. [3] 5 ml (egy műanyag ampulla) Normaflore szuszpenzió 2 milliárd baktérium spórát tartalmaz. A képen ennek mikroszkópos képe látható.
Előzetes vizsgálatok A tényleges méréseim előtt végeztem próbatenyésztéseket. Két Petri csészébe mérőhengerrel kimértem 30 cm3 táptalajt. Egyikbe 5 csepp Normaflore szuszpenziót cseppentettem, a másikat üresen hagytam. Ezután mindkettőt letakartam, és betettem a tenyésztőbe, beállítottam a hőfokot. 6 óra múlva megnéztem, ekkor a baktériumot tartalmazó tenyészet (minta) zavaros, opálos volt, a kontroll változatlan. Mikroszkóppal a mintában „nyüzsgő”, a spóránál nagyobb pálcika alakú baktérium tenyészetet figyeltem meg. (A képen.) A kontroll mikroszkóppal vizsgálva is „üres” volt. 8 órával később a helyzet változatlan volt. Másnap megnézve a tenyészeteket, mindkettő zavaros volt,
6
mikroszkóppal a kontrollban idegen, nagy, sötét, gömb alakú baktériumokat figyeltem meg. Ezek alapján a táptalaj szavatossági idejét a tenyésztőben 37,5 oC-on tárolva maximum 8 órának ítéltem meg. Ez azonban elégséges a vizsgálataim elvégzéséhez.
1. Vizsgálat: Változik-e a pH a tenyésztés közben a baktériumok anyagcsere folyamatainak köszönhetően? A vizsgálat menete: Két Petri csészébe egyenként 30 cm3 táptalajt töltöttem. Egyikbe 5 csepp Normaflore szuszpenziót cseppentettem, majd a pH mérővel lemértem mindkettő folyadék pH értékét (először a mintájáét, nehogy beszennyezzem a kontrollt). Minta: pH 6,52 kontroll: pH 6,50. Betettem őket a tenyésztőbe, beállítottam a hőmérsékletet. Kb. 7 óra elteltével, mikor a baktériumot tartalmazó tenyészet már kellőképpen zavaros volt, ismételt pH mérést végeztem. Minta: pH 6,41 kontroll: 6,40. (Mikroszkópos vizsgálattal megállapítható, hogy a mintában valóban Bacillus clausii baktériumok vannak, a kontroll pedig „üres”.) Következtetés: Mindkét esetben savasabb irányba tolódott el a pH. Ennek magyarázata a táptalajba a levegőből beoldódó CO2 gáz, mely savanhidrid, így vízzel reagálva szénsavvá alakul. Mindkét folyadék ugyanolyan mértékben változott (a 0,01 századnyi különbség mérési hibán belül van), így megállapítható, hogy a Bacillus clausii anyagcseréjével környezetének pH értékét nem változtatja. (Legalábbis ilyen körülmények között, ilyen mérések mellett.) Ez a további vizsgálataim elvégzéséhez fontos információ.
Az optikai denzitás fogalma, mérése Az optikai denzitás egy közeg, általában folyadék fényáteresztő képességéről ad információt. A Lambert–Beertörvény egy optikai tapasztalati összefüggés, amely a fény abszorpciója és azon közeg tulajdonságai között teremt kapcsolatot, melyben a fény terjed. A törvény szerint logaritmikus összefüggés van a T transzmittancia (az anyagon áteső fény hányada) illetve az anyag α abszorpciós együtthatójának és a fény által az anyagban megtett ℓ távolságnak (a fényút hosszának) a szorzata között. Az abszorpciós együttható felírható az elnyelő közeg ε moláris abszorpciós együtthatójának és az abszorbeáló részecskék c koncentrációjának szorzataként, vagy mint az abszorbens σ abszorpciós keresztmetszetének és N (részecske) sűrűségének szorzata. Folyadékokra ezeket az összefüggéseket többnyire az alábbi alakban alkalmazzák:
7
ahol I és I0 rendre a beeső, illetve az anyagon áthaladt fény intenzitása vagy energiája. Az abszorbancia és a transzmittancia közötti kapcsolat:
az abszorbancia pedig megegyezik a közeg optikai denzitásának értékével (D). A fenti egyenletekből:
D = –lg(I/I0) = ε ℓ c Tehát az optikai denzitás a „kijövő” fény intenzitásának és a „bemenő” fény intenzitásának hányadosának negatív tízes alapú logaritmusaként számolható. Az optikai denzitás ezenkívül egyenesen arányos a közeg vastagságával és a közegben lévő abszorbeáló részecskék (jelen esetben baktériumok) koncentrációjával. [4] (Szemléletesen, minél sűrűbb a tenyészet, annál kevesebb fényt enged át.) Az optikai denzitás mérésére készítettem egy ún. denziométert vagy denzmérőt. Lényegében egy PVC cső (d=32 mm), aminek az egyik felére üveglapot helyeztem, átdugtam egy lyukas fakorongon, és az egészet sziloplaszttal megragasztottam. A fa keret pedig egy felfelé világító lámpára passzol. A cső a farésszel együtt leszerelhető, így könnyen elmosható. A csőre pedig passzol a mikroszkóphoz tartozó kamerám. A képek készítésekor kikapcsoltam az automata fókuszt, és a fényerő korrekciót, így közel homogén, különböző fényerősségű képeket készíthettem. Ezeknek a képeknek aztán az Adobe Photoshop (Verzió: 8.0) szoftver segítségével meghatároztam a pixelek fényerejének átlagértékét, azaz az átlagos szürkeségi értéket vagy fényességi értéket. Az átlagos szürkeségi érték pedig megfelelő tartományon egyenesen arányos a fény intenzitásával. A kapott értékeket aztán Ms Excel táblázatba felvittem, és a megfelelő logaritmikus egyenletbe behelyettesítve optikai denzitást számoltam. Tehát a folyamat lényegében: betöltöm a folyadékot, ráteszem a kamerát, bekapcsolom a lámpát, fényképezek, majd a digitális képeket számítógépen kielemzem. Végeztem próbamérést: higított tejet adagoltam a denzmérőbe ugyanolyan mennyiségben, és minden újabb adag után képet készítettem. Az adatokat táblázatba írva, és átszámítva, a denzitási értékeket diagramon ábrázoltam. Nagyon szép lineáris egyenest kaptam. Ezzel igazoltam, hogy működik a denzmérőm, és igaz rá a Lambert-Beer törvény, hiszen a törvény szerint közeg vastagsága egyenesen arányos a denzitással. (Ezt a fényképezős eljárást használta a szerző is a [6] forrásban.)
8
2. Vizsgálat: Bacillus clausii tenyészet sűrűségének vizsgálata az idő függvényében. A denziométer kalibrálása: Bemértem 30 cm3 táptalajt a műszerbe. A képek fényességi értéke 0 és 256 között változik. Nyilvánvaló, hogy két különböző, de nagy intenzitású fény mérésével ugyanúgy a 256 értéket kapjuk. Annak érdekében, hogy a kis eltérést is ki tudjam mutatni, szükséges volt a denzmérő kalibrálása. Ez azt jelentette, hogy addig ragasztottam áttetsző ragasztószalagot a denzmérőben található üveglap aljára, amíg a készített képhez tartozó fényességi érték éppen 256 alá ment egy kicsivel. Ezt az értéket vettem I0-nak. A denzmérővel természetesen nem abszolút denzitást mérek, mert nem mértem ki arányossági tényezőt, azonban a vizsgálataim elvégzéséhez elégséges a denzitás relatív mérése. (Épp ezért nem is írtam értéket az y tengelyre.) A vizsgálat menete: Két Petri csészébe egyenként 30 cm3 táptalajt mértem ki. Egyikbe 4 csepp, másikba 6 csepp Normaflore szuszpenziót cseppentettem, és lemértem a denzitásukat. Ezután a tenyésztőbe helyeztem őket. A továbbiakban kb. 50 percenként mértem a denzitást. Azt adatok táblázatba írását és átszámítását követően diagramon ábrázoltam a tenyészetek sűrűségét az eltelt idő függvényében (kék: 4 cseppes, piros: 6 cseppes). A vízszintes képen a készített képek láthatók összefűzve.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
Következtetés: A tenyészet sűrűsége a várt exponenciális növekedést mutatja. Kb. 200 percig az ún. inkubációs szakaszban vannak, tehát alig változik a tenyészet sűrűsége. Ezután a hirtelen növekedési szakaszba lépnek. Kb. a 400. perc után az exponenciális trendvonal megtörik, a tenyészet sűrűségének növekedése lassul, majd megszűnik, beáll a stacioner szakasz. A növekedési ütem megtörésének pontos okait nem ismerem, de a méréseim szempontjából tulajdonképpen nem is kell. Feltételezésem szerint olyan sűrűvé válik a tenyészet, hogy az alsóbb rétegek
9
nem jutnak elég oxigénhez. (Esetleg ok lehet a tápanyag elfogyása is.) Ennek a mérésnek az elvégzésére azért volt szükség, hogy tudjam, hány percnek kell eltelnie a különböző stádiumokig. (Megj.: Az 50. percnél lévő kis kiemelkedés valószínűleg mérési hiba eredménye.)
A puffer oldat fogalma, elkészítésének nehézségei A 3. vizsgálat elvégzéséhez olyan eljárást kellett találnom, ami kielégíti a következő igényeket: 6-tól 10-ig egész pH értékű tápoldatok beállítása, úgy, hogy azok az értékek a mérés ideje alatt közel állandóak maradjanak, 38 oC-on is. Az oldatok legyenek víztiszták, és ne tartalmazzanak a baktériumok számára káros anyagokat, ill. mindegyik oldat ugyanolyan mértékben legyen előnyös a baktériumok szaporodása szempontjából, ha a pH értéktől eltekintünk. Az eljárás és a megfelelő anyagok megtalálásához a következő út vezetett: A puffer oldatok olyan gyenge (vízben egyensúlyi reakcióra vezető) sav és/vagy bázis oldatai, amikben a pH érték elmozdulása esetén olyan kémiai reakciók játszódnak le, melyek igyekeznek visszaállítani az eredeti pH értéket. [5] Különböző puffer recepteket találhatunk az interneten és egyes könyvekben, de ezek nem biológiai kísérletekhez készültek (nem tudom, milyen hatással vannak a baktériumokra), és ált. 18 oC-ra vannak megadva. A megfelelő receptért felkerestem a helyi ANTSZ labort, itt azonban hosszas tanácskozás után sajnos nem tudtak lényegesen segíteni. Ennek oka, hogy az ANTSZ-ben elsősorban a baktérium kimutatása a cél, ehhez pedig a legoptimálisabb táptalajt használják, így nincs receptjük az optimálistól eltérő táptalajhoz. Én viszont épp azt szeretném vizsgálni, hogy melyik az optimális? Ezek után úgy döntöttem tapasztalati úton (empirikusan) határozom meg a receptet. A következő vizsgálatokat végeztem el: Csapvízzel dolgoztam. A különböző pH értékeket úgy állítottam be, hogy csináltam egy savas komponenst, meg egy lúgos komponenst. A savashoz folyamatosan adagolva a lúgosat folyamatos pH mérés mellett 6-ostól kezdve minden egész pH értéknél 30 cm3-t kivettem, Petri csészébe tettem, és betettem a tenyésztőbe, majd néhány óra elteltével mértem a pH-t. A lúgos komponenshez kipróbáltam a kémia laborban található több gyenge sav sóját (pl. Na-acetát, Natartarát, Na-ftalát, stb.), ezekkel azonban magas koncentráció mellett is alig értem el a 8-as pH-t. A szertárban található NaOH granulátum elég erős, azonban csapvízben feloldva zavarossá vált. Ez azért van, mert a NaOH valószínűleg karbonátosodott, és a karbonát ion a vízben található Ca2+ ionnal CaCO3 (mészkő) csapadékot ad lúgos közegben. Ennek elkerülésére friss, víztiszta NaOH mérőoldatot kellett szereznem, hiszen a Ca2+ iont nem vonhatom ki a rendszerből, mert fontos tápanyag. Savas komponenshez először a gyomorban található HCl-t (sósavat) használtam (2-es pH értékről indultam, ehhez kezdtem hozzáadagolni a lúgos komponenst.). A mérés elvégzése utána azonban a pH 0,5-1 értékkel is elmozdult. Savasból lúgos irányba: valószínűleg a HCl mivel illékony elpárolgott 38 oC-on, lúgosból savas irányba: valószínűleg a beoldódott CO2 gáz miatt. Utána foszforsavval próbálkoztam. Az előző eljárást végrehajtása (2-es pH értékről indultam) után ennél már alig volt elmozdulás a pHban, viszont lúgos közegben CaHPO4 csapadék vált ki. Ezután citromsavval próbálkoztam (a savas komponens gyengébb, 4-es pH értékről indultam), ekkor azonban nem volt puffer hatás, a pH értékek megint csúszkáltak. A mérést hígabb foszforsavval (4-es pH értékről indultam) elvégezve szintén nem volt puffer hatás, töményebb citromsavval elvégezve viszont megjelent. Nyílván töményebb oldatnak nagyobb a puffer kapacitása, tehát kevésbé mozdulnak el az oldatok pH értékei. Eddig a tömény citromsav-NaOH oldat lenne megfelelő. Azonban számolni kell az ozmózis jelenségével. Ha túl 10
tömény, tehát túl sok ion van az oldatban, akkor az oldat a baktériumok szempontjából hipertóniás lehet, így a baktériumok ozmotikus sokkban pusztulnak el. Ennek elkerülésére maradtam a foszforsavNaOH oldatnál.
3. Vizsgálat: Optimális-e a vastagbél pH értéke a Bacillus clausii szaporodásához? A vizsgálat menete: 200 cm3 táptalajhoz ccH3PO4-et (foszforsavat) cseppentve 2-es értékig levittem a pH-t (savas komponens). 100 cm3 táptalajhoz ccNaOH oldatot cseppentve tömény lúgos komponenst hoztam létre. A savashoz a lúgos komponenst adagolva pH mérés mellett a 6-os értéknél megálltam, kimértem 30 cm3-t, hozzáadtam 5 csepp Normaflore szuszpenziót, lemértem a denzitását, majd Petri csészébe töltöttem. Ezt megismételtem minden egész pH értéknél egészen a 10-esig. CaHPO4 csapadék 6-os és 7-es értéknél gyakorlatilag nem, 8-asnál enyhén, 9 és 10-es értékeknél (220, ill. 215-ös mért szürkeségi értékek) már jelentősebben kivált. Ezután mindegyiket betettem a tenyésztőbe. 350 perc múlva ismét lemértem a tenyészetek denzitását, és pH értékét. A pH értékek változása 0,1 alatt volt. Majd lemértem a denzitást 400 percnél is. Azért ezekben az időpontokban, mert a 2. vizsgálat alapján ekkor vártam a legnagyobb eltérést. A csapadék problémáját úgy oldottam meg, hogy ezekből az értékekből kivontam a kezdeti denzitási értéket. A különbséget diagramon ábrázoltam. (kék: 300, piros: 400 perc)
5
6
7
8
9
10
11
Következtetés: A növekedési ütem a 8-as pH esetében volt a leggyorsabb. Érdekes megfigyelni, hogy a Bacillus clausii a többi pH értéken is szaporodott, valamint, hogy a 6os és 7-es pH értékeket jobban kedvelte, mint a 9 és 10-es pH-jú környezetet.
A táplálék a gyomorban A gyomor savasságát a sósav (HCl) adja. A táplálék a minőségétől és mennyiségétől függően különböző ideig tartózkodik a gyomorban. A szokásos napi ételeink 3-5 óráig emésztődnek a gyomorban. A zsíros ételeknek 5-6 órára van szükségük, a kenyér, tojás, hús, krumpli 2-3 óráig, a víz, tej, tea 1-2 óráig van a gyomorban. [1]
4. Vizsgálat: Kibírja-e a Bacillus clausii a gyomor savas környezetét, amíg a gyomorban tartózkodik? A vizsgálat menete: Foszforsavval 1-es pH értékre állítottam be a táptalaj pH-ját. Ezután két Petri csészébe egyenként 30 cm3 savas táptalajt mértem ki. Egyikbe 10 csepp Normaflore szuszpenziót cseppentettem, majd betettem őket a tenyésztőbe. 4 óra elteltével mikroszkópos vizsgálattal 11
megállapítottam, hogy a kontroll „üres”, a minta tartalmaz Bacillus clausii-t, bár kis mennyiségben. (Az első kép ekkor készült, a jobb oldali a minta.) A folyadékokat ezután NaOH oldattal 7,1-es pH-ra állítottam, és visszatettem őket a tenyésztőbe. 8 óra után látható volt, hogy a minta megzavarosodott, a kontroll üres maradt, mikroszkóppal a mintában nyüzsgő Bacillus clausii tenyészet volt látható. (A második képen.) Következtetés: A Bacillus clausii képes kibírni a gyomor extrém savas környezetét is, amíg a táplálékkal együtt a gyomorban található. (Bevételét elsősorban teával, gyümölcslével, vagy tejjel ajánlják, hiszen így gyorsabban átjut a gyomron.) A gyomornak az emésztésen kívül a bevitt táplálék bakteriális fertőzéstől való mentesítése is a feladata. (A gombák egyébként épp a savas környezetet kedvelik, ők a bél lúgos környezetében pusztulnak el.)
Az eredmény A Bacillus clausii bevétel után képes eljutni a belekig, és ott elszaporodni (ha csak a pH értékeket vesszük figyelembe).
További vizsgálatok További vizsgálatokat lehetne végezni arra vonatkozóan, hogy a Bacillus clausii ellenáll-e az egyes emésztőenzimeknek (pl. pepszin)? Azonban nem szabad elfelejteni, hogy az emésztőenzimek aktiválásához megfelelő pH értékre és hőmérsékletre van szükség. Vagy ellenőrizhető, hogy ellenáll-e a különböző antibiotikumoknak? Vizsgálni lehet, hogy milyen magas hőmérsékletet bír ki, továbbá, hogy tényleg termel-e B vitaminokat. Ezt akár egy olyan baktérium segítségével lehetne elvégezni, ami a táptalajban lévő B vitamin hiányában képtelen a szaporodásra.
Források: [1] Ábrahám-Bende-Megyeri: Anatómia-élettan; ötödik kiadás, Tankönyvkiadó, Budapest, 1987 [2] www.normaflore.hu [3] Tuboly Sándor: Állatorvosi járványtan I.; Mezőgazda Kiadó Kft., Budapest, 1997 [4] Biokémia gyakorlati jegyzet, összeállította: Tanszéki munkaközösség, ELTE Biokémia Tanszék, 2010 (jegyzet) [5] Kísérletes biológiai gyakorlatok, szerkesztette: Kerepesi Ildikó, Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar, 2005 (jegyzet) [6] Mészár Zoltán: Az extracelluláris makromolekulák szerepe a központi idegrendszer fejlődésében, Debrecen, 2008 (egyetemi doktori értekezés)
12
