BAKTERI KITINOLITIK YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG LAMONGAN JAWA TIMUR CHITINOLYTIC BACTERIA ISOLATED FROM SHRIMP PONDS LAMONGAN EAST JAVA

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014

BAKTERI KITINOLITIK YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG LAMONGAN JAWA TIMUR CHITINOLYTIC BACTERIA ISOLATED FROM SHRIMP PONDS LAMONGAN EAST JAVA Nuniek Herdyastuti Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp. 031-8298761 Email :[email protected]

Abstrak. Eksplorasi kitinolitik dari tambak udang bertujuan untuk mencari keragaman bakteri penghasil kitinase dengan aktivitas yang tinggi dari lingkunga perairan. Aktivitas kitinase ditentukan dengan metode Monreal-Reese berdasarkan pelepasan N-Asetil glukosamin. Diperoleh isolat LA-21 adalah bakteri gram positif berbentuk batang dengan karakteristik koloni berwarna putih, bentuk bulat, elevasi cembung, margin bergerigi (serrate) dan diameter koloni 1-2 mm. Hasil uji 16S-rRNA menunjukkan bahwa isolat LA-21 mempunyai hubungan kekerabatan 97 % terhadap Bacillus sp AHBR 2. Kata kunci: Aktivitaskitinase, bakteri kitinolitik, tambak udang Abstract. Chitinolytic exploration of shrimp ponds aimed to diversity of bacteria producing chitinase with high activity of aquatic environments. Chitinase activity was determined by a Monreal-Reese method based on the release N-Acetyl glucosamine. Isolates LA-21 was a gram positive with characteristic rodshapes, white coloni, rounded shape, serrated margine, convex elevation and diameter coloni 1-2 mm. Test result 16S-rRNA indicate that the isolates-LA-21 97% gene similarity to Bacillus sp AHBR 2 Key words : Chitinase activity, chitinolytic bacteria, shrimp ponds PENDAHULUAN

perairan seperti laut, danau, tambak, limbah udang dan sebagainya [2,3,4

Kitinase (EC 3.2.11.14) adalah enzim yang

mempunyai

menghidrolisis

kemampuan

senyawa

kitin

Eksplorasi

untuk

habitat

telah

banyak

dilakukan untuk mencari biodiversitas bakteri

membentuk

oligosakarida dan monomernya. Kitinase dapat

kitinolitik

ditemukan dari berbagai macam organisma

keragaman bakteri yang mampu menghasilkan

seperti

aktivitas kitinase terbaik. Salah satu tempat yang

virus,

bakteri,

jamur,

serangga,

metabolismenya

peranan [1].

penting Bakteri

tujuan

mendapatkan

berpotensi menghasilkan bakteri kitinolitik yaitu

tumbuhan tingkat tinggi dan hewan yang mempunyai

dengan

tambak udang. Beberapa wilayah di Jawa Timur

dalam

seperti

kitinolitik

Lamongan

Tuban,

Situbondo

dan

Sidoarjo berada di daerah pesisir pantai sehingga

merupakan penghasil enzim kitinase dapat

sebagian besar mata pencaharian penduduk

diperoleh dari berbagai sumber rti lingkungan

B - 192


adalah sebagai petani tambak. Penelitian ini

Prism 9700, perangkat Applied Biosystems

bertujuan untuk mengetahui keanekaragaman

3730XL Genetic Analyzer

bakteri kitinolitik yang berasal dari lingkungan tambak udang khusunya di daerah Lamongan

Bahan

Jawa Timur.

Bahan-bahan yang di butuhkan adalah kitin, HCl (37%), aquades, yeast extract (Difco), NaCl, tripton (Difco), Bacto agar (Difco), KH2PO4, Na-K- tartrat tetrahidrat, asam 3,5dinitrosalisilat (SIGMA), N-asetil glukosamin (SIGMA). universal primer 5’GGTTACTTGTTACGACTT-3’ (Uni B1) dan 5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’ (Bact F1) , dNTP, Taq DNA polymerase, Etidium Bromida, Red Safe flourecent kit, loading buffer, agarose.

Udang mempunyai kandungan kitin yang cukup tinggi. Focher menyatakan bahwa, kulit udang mengandung protein (25 – 40 %), kalsium karbonat (45 – 50 %), dan kitin (15 – 20 %), tetapi besarnya kandungan komponen tersebut tergantung pada jenis udangnya. Kitin merupakan bentuk linier polisakarida yang dibentuk dari ikatan -1,4 residu N-asetilglukosamin [5]. Dengan demikian kitin secara kimiawi

adalah

suatu

polimer

golongan Prosedur Penelitian

polisakarida yang tersusun atas 2-asetamido-2deoksi-D-glukosa

Seleksi bakteri kitinolitik

membentuk ikatan -1,4.

Bakteri dari diisolasi dari tambak udang

Ikatan pada molekul tersebut membentuk fibra yang linier. Rantainya dapat membentuk kristal

dengan

karena adanya ikatan hidrogen intramolekul dan

minimal yang mengandung koloidal kitin,

membentuk

panjang

dengan komposisi : 0,4 % koloidal kitin ; 0,7 %

menghasilkan struktur yang rigid dan stabil [6].

K2HPO4 ;, 0,3 % KH2PO4 ; 0,5 % MgSO4.5H2O

Kitin terutama dalam bentuk koloidal kitin

; 0,01 % FeSO 4.7H2O ; 0,001 % MnCl2 dan 0,5

banyak digunakan sebagai sumber karbon dan

% pepton. Campuran diinkubasi pada suhu

induser untuk memproduksi enzim kitinase dari

ruang selama 45 jam dengan pengocokan

berbagai strain [7].

kecepatan 150 rpm. Supernatan yang diperoleh

mikrofibril

yang

cara

menumbuhkan

pada

media

selanjutnya ditentukan aktivitas kitinasenya. BAHAN DAN METODE Alat

Persiapan Koloidal kitin

Beberapa alat yang digunakan antara lain :

Kitin dibuat bentuk koloid dengan

peralatan gelas yang umum digunakan, pH

menggunakan cara menurut Hsu and Lockwood

meter, Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu,

[8]. Sebanyak 40 g kitin dilarutkan dalam 400

1800), sentrifuse dingin (5810 R), PCR ABI

mL HCl pekat, diaduk dengan pengaduk magnet selama 30 – 50 menit. Larutan kitin kemudian

B - 193


diendapkan sebagai suspensi koloid dengan

Penentuan dilakukan berdasarkan tahapan

menambahkan 2 liter air dingin (suhu 5 – 10 C)

: isolasi DNA, amplifikasi dengan gen 16S-

secara pelan-pelan. Suspensi ditampung dengan

rRNA dengan kondisi reaksi PCR : siklus

cara menyaring menggunakan kertas saring, dan

sebanyak 30 siklus, denaturasi : 95 ºC

residu yang diperoleh dicuci dengan aquades 5

selama 1 menit; annealing : 55 ºC selama 1

liter. Pencucian diulang sedikitnya 3 kali atau

menit ; dan elongasi: 72 ºC selama 1 menit.

sampai pH sekitar 3,5. Pada proses ini kira-kira

Hasil PCR yang telah dimurnikan dilakukan

akan diperoleh 85 % kitin.

sequencing dengan kondisi dengan kondisi initial denaturation 96 ºC selama 1 menit, dengan siklus 25 kali terdiri dari 96 ºC

Penentuan aktivitas enzim kitinase

selama 10 detik, 50 ºC selama 5 detik dan 60

Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan

ºC selama 4 menit.

jumlah gula reduksi yang dilepaskan dan diukur secara kolorimetri dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Monreal dan Reese [9].

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sebanyak 2 mL larutan kitin 1,25 % (b/v)

Isolasi bakteri kitinolitik dari Tambak udang Kitin

dilarutkan dalam 200 mM buffer kalium fosfat diaduk

dengan

pengaduk

magnet

(1975)

yang

sebagai

media

selektif

untuk

mendapatkan bakteri kitinolitik. Enzim kitinase

tempatkan tabung ke dalam air mendidih selama

ekstraseluler

5 menit dan didinginkan pada suhu kamar.

dari

Bacillus

sp

WY22

menunjukkan spesifitas substrat paling tinggi

Suspensi disentrifugasi selama 10 menit pada Sebanyak 1

kitin

yang telah dijelaskan oleh Hsu dan Lockwood

selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah 2 jam

rpm.

adalah

dilarutkan dalam asam klorida pekat seperti

dan

ditambahkan 0,5 mL larutan enzim. Inkubasi

kecepatan 4000

koloidal

dengan

mL

menggunakan

kitin

koloidal

bila

dibandingkan menggunakan substrat swollen

supernatan pada tabung sampel ditambahkan 2

kitin, glikol kitin atau serbuk kitin [10].

mL air deionisasi dan 1,5 mL reagen pewarna

Beberapa penelitian yang memanfaatkan kitin

yang mengandung 5,3 M larutan Natrium kalium

koloidal untuk mendapatkan bakteri kitinolitik

tartrat dan Asam 3,5 Dinitrosalisilat 96 mM.

seperti Enterobacter sp NRG4, Aeromonas sp,

Campuran dipanaskan dalam air mendidih

Aeromonas schubertii, Bacillus laterosporous

selama 5 menit setelah dingin diukur serapannya

MML2270 [11, 12, 13, 14].

dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

Hasil eksplorasi bakteri kitinolitik dari

gelombang 540 nm. Sebagai standar digunakan

tambak udang di Lamongan, telah diperoleh 54

N-asetil glukosamin.

isolat (LA 1 – LA54). Berdasarkan hasil uji

Penentuan gen 16S-rRNA

aktivitas pada ekstrak kasar menunjukkan bahwa

B - 194


37 dari 54 isolat mempunyai aktivitas kitinase seperti pada Gambar 1 [15]. Hasil analisis kuantitatif bakteri kitinolitik berdasarkan uji aktivitas pada ekstrak kasar memberikan hasil yang cukup tinggi. Nilai aktivitas tersebut cukup tinggi bila dibandingkan dengan isolat kitinolitik yang diperoleh dari tambak udang Tuban [16], Stenotrophomonas sp. B2-4 yang diisolasi dari 17] and Enterobacter sp. G-1 yang diisolasi dari

Gambar 2. Pewarnaan Gram isolat LA-21 dengan perbesaran 100 kali

kota Matsue, Jepang [18].

Tabel 1. Hasil uji Fisiologi isolat LA-21 No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

Gambar 1. Hasil uji aktivitas ekstrak kasar isolat dari Lamongan

Penentuan spesies Isolat LA-21 Berdasarkan hasil uji fisiologi dan morfologi isolat LA-21 merupakan bakteri gram positif berbentuk batang (Gambar 2) dengan karakteristik koloni berwarna putih, bentuk bulat,

elevasi

cembung,

margin

bergerigi

(serrate) dan diameter koloni 1-2 mm. Uji morfologi (Tabel 1) menduga bahwa isolat LA21 merupakan Bacillus cereus dengan percent probability 63.60%.

B - 195

Jenis uji Biokimia Oksidase Motilitas Nitrat Lisin Ornitin H2S Glukosa Xilosa ONPG Indol Urease VP Sitrat TDA Gelatin Malonat Inositol Sorbitol Ramnosa Sukrosa Laktosa Arabinosa Adonitol Rafinosa Salisin Arginin Amilolitik Proteolitik Lipolitik

Hasil + + + + + + + + + +


Gambar 3. Penentuan urutan DNA hasil amplifikasi isolat LA-21

Penentuan spesies secara genetik, telah diperoleh hasil amplifikasi isolat LA-21 dengan ukuran DNA 1500 bp. DNA isolatLA21 yang telah ditentukan urutannya (Gambar 3)

di

BLAST

melalui

situs

www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mendapatkan sequence alignment. Berdasarkan Sequence Gambar 4. Phylogenetic Tree yang menunjukkan kekerabatan isolat LA-21

alignment menunjukkan bahwa isolat LA-21 mempunyai hubungan kekerabatan yang lebih dekat dengan Bacillus sp AHBR 2 sebesar

97

phylogenetic

% tree

seperti seperti

tampak

Bakteri kitinolitik dari kelompok Bacillus

pada

tersebut

sudah banyak

tampak pada

peneliti

yang

Gambar 4 [19]

lain,

dihasilkan

oleh

seperti yang

telah

dilakukan oleh Penelitian lain tentang bakteri kitinolitik diperoleh beberapa bakteri yang tergolong

dalam

Bacillus,

Bacillus

sp

maupun Bacillus licheniformis [20,21,22,

B - 196


4. Moon S.J, Young ML, Yong LC, Cherol HK,Young CL., 2005. “Overexpression and characterization of a novel chitinase gene from marine bacterium Pseudomonas sp BK1”, Ind. J. Biochem. Biophy., 42 : 339-344 5. Nathalie,C., Fleury, A., Fukamiza,T., and Ryszard,B., 2006, ‘Two-exo--Dglukosaminidase from Actinomycetes define anew subfamily 2 of glikoside hydrolases”, Biochem.Journal , 394 : 675-686. 6. Gooday, G.W., 1990, “Physiology of Microbial Degradation of Chitin and Chitosan”, Biodegradation, 1 : 177-190 7. Mejia-Saulés,J.E.,Waliszewski, K.N.,Garcia, M.A., and Cruz-Camarillo, R., 2006 “The use crude shrimp shell powder for chitinase production by Serratia marcescens”. Food Techn.Biotechnology, 44(1) : 95-100

23]. Penghasil kitinolitik jenis yang lain juga telah ditentukan seperti Pseudomonas sp TKU008 diperoleh dari tanah di Taiwan [24] Pseudomonas sp TNH54 dari tanah sawah [25].

KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : 1. Bakteri kitinolitik LA-21 yang diisolasi dari tambak udang Lamongan mempunyai aktivitas kitinase yang cukup tinggi yaitu 0,731 U/mL 2. Isolat LA-21 merupakan bakteri gram positif berbentuk batang dan berdasarkan hasil analisis 16s-rRNA tergolong sebagai kelompok Bacillus sp

8. Hsu S.C., and Lockwood J.L., 1975, Powdered Chitin Agar As a Selective Medium for Enumeration of Actinomycetes in Water and Soil, Appl. Microbiol., 29, 3, 422-426.

UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terimakasih disampaikan kepada kelompok penelitian Kitinase khususnya kepada Fauziah dan Rio Widodo yang telah menyelesaikan penelitian ini.

9. Monreal J. and Reese, E.T., 1969, The Chitinase of Serratia marcescens, Canadian Journal of Microbiology, 15 : 689-696. 10. Woo C.D and Park H.D., 2003, An Extrasellular Bacillus sp Chitinase for the production of chitotriose as a major chitinolytic product, Biotechnol. Letters, 25 : 409-412. 11. Dahiya N., Tewari, and Hoondai, 2005, Chitinase from Enterobacter sp. NRG4 : Its Purification, Characterization and Reaction Pattern, Electronic J. Biotechnol., 8, 2. 12. Guo, S.H., Chen J.K. and Lee,W.C., 2004, Purification and Characterization of Extracellular Chitinase From Aeromonas schubertii, Enzyme and Microbial Technology, 35 : 550-556 13. Huang C.J., and Chen C.Y., 2004, “Gene Cloning and Biochemical Characterization of Chitinase CH from Bacillus cereus 28-9”, Annals. Microbiol., 54 (3) : 289-297

DAFTAR PUSTAKA 1. Kuddus, S.M., Ahmad, R.I.Z., 2013. “Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase”, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology., 11 : 39-46 2. Donderski W, Brzezinska MS., 2003. “The Utilization of N-Aceyloglu-cosamine and Chitin as Sources of Carbon and Nitrogen by Plantonic and Benthic Bacteria in Lake Jeziorak”. Polish Journal of Enviromental Studies., 12 : 685-692. 3. Chang SC, Wang JT, Vandamme P, Hwang JH, Chang PS, Chen WM., 2004. “Chitinimonas taiwanensis gen. nov., sp. nov., a Novel Chitinolytic Bacterium Isolated from a Freshwater Pond for Shrimp Culture” System Appl. Microbiol., 27 : 43–49

B - 197


14. Shanmugaiah V., Mathivanan N., Balasubramanian N., and Manoharan P.T., 2008, “Optimization of cultural conditions for production of chitinase by Bacillus laterosporous MML2270 isolated from rice rhizosphere soil”, Afric. J. Biotechnol., 7, 15, 2562-2568 15. Fauziah dan Herdyastuti, N. 2013. “Uji Aktivitas Bakteri Kitinolitik dari Tambak Udang Di Lamongan dan Sidoarjo”. UNESA Journal of Chemistry. 2(1) : 36-39 16. Prabowo,Y.Y., dan Herdyastuti, N., 2014, “Aktivitas bakteri kitinolitik yang diisolasi dari tambak udang di Tuban”, UNESA Journal of Chemistry. 3(3) : 17. Soeka, YS, and Sulistiani. 2011. “Seleksi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase yang Diisolasi dari Gunung Bromo Jawa Timur”. Jurnal Natur Indonesia. 13(2). 155-161 18. Mahata, M., Dharma A., Ryanto, I, and Rizal Y. 2008. Characterization of Extracellular Chitinase from Bacterial Isolate 99 and Enterobacter sp. G-1 from Matsue City, Japan. Microbiology Indonesia. Vol. 2, No. 1. 34-38 19. Widodo, R., dan Herdyastuti, N., 2013, “Penentuan gen penyandi 16SrRNA bakteri kitinolitik dari tambak udang Lamongan”, UNESA Journal of Chemistry. 3(3) : 20. Anuradha, V. dan Revathi, K. 2013. “Purification and characterization of chitinase fromtwo Bacillus spisolated from crustacean shells”. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (3):160-167. 21. Haliza, Winda dan Suhartono, Maggy Thenawidjaya. 2004. “Karakteristik Kitinase Dari Mikrobia”. Buletin Teknologi Pascananen Pertanian Vol 8 (1). 22. Suryanto, D., Munir, E., and Yurnaliza. 2005. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik: Keragaman Gen Kitinase pada Berbagai

Jenis Bakteri dan Pemanfaatannya. Medan: Universitas Sumatera Utara. 23. Anindyaputri, Amaryllis. dkk. 2010. “Chitinolytic Bacteria Isolated from Chili Rhizosphere: Chitinase Characterization and Its Application as Biocontrol for Whitefly (Bemisia tabaciGenn.)”. American Journal of Agricultural and Biological Sciences. 5 (4): 430-435. 24. Wang S.L., Bo-Shyun L., Liang T.W., Wang C.L., Pei-Chen W., and Je-Ruei L., 2010, “Purification and Characterization of Chitinase from a New Species Strain Pseudomonas sp. TKU008”, J. Microbiol. Biotechnol., 20, (6) : 1001–1005

25. Herdyastuti,N., Cahyaningrum S.E., Raharjo T.J., Mudasir, Matsjeh,S., 2012, “Potential antifungal of Chitinolytic Bacteria Pseudomonas sp TNH54 from Mud Field”, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, Vol.3 Issue 3:11171124

B - 198

BAKTERI KITINOLITIK YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG LAMONGAN JAWA TIMUR CHITINOLYTIC BACTERIA ISOLATED FROM SHRIMP PONDS LAMONGAN EAST JAVA

Recommend Documents