21
BAB III METODE PENELITIAN
A. Desain Penelitian Penelitian yang digunakan adalah deskriptif. Penelitian ini dilaksanakan untuk mencari jawaban secara mendasar tentang sebab-akibat dengan menganalisis faktor penyebab terjadinya fenomena tertentu (Nazir, 1983). Sesuai dengan pernyataan tersebut, penelitian ini dilaksanakan untuk mengetahui faktor penyebab menurunya kadar detergen di kolam fakultatif IPAL Bojongsoang Bandung. B. Sampel Penelitian Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah limbah domestik pada kolam fakultatif di Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL) Bojongsoang Bandung. C. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Maret – Mei 2011 bertempat di laboratorium Perusahaan Daerah Air Minum (PDAM) Antapani Bandung, sedangkan pengambilan sampel dilakukan di kolam fakultatif Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL) Bojongsoang Bandung. D. Alat dan Bahan Penelitian Penelitian ini memerlukan banyak alat dan bahan. Adapun alat (Tabel 3. 1) dan bahan (Tabel 3. 2) yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
22
Tabel 3.1. Alat-alat Penelitian No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Alat-alat Laboratorium Autoklaf Botol sampel 250 ml Cawan Petri Gelas Kimia Gelas Ukur 1000 ml Jarum Inokulasi Labu Erlenmeyer 500 ml Lampu Spirtus Mikropipet 1 ml dan 5 ml Mikropipet 10 ml Mikroskop Neraca Timbangan Analitik Oven dan Lemari Pendingin Resiprocating water bath Tabung Durham Tabung Reaksi Tips 1 ml, 5 ml san 10 ml Vortek Mikrometer
Merek HL36AE
Spesifikasi EYELAmodel
Jumlah 1 unit 3 buah 48 buah
Merek Pyrex 2 buah 3 buah Merek Pyrex Merek Eppendorf Merek Eppendorf 22.103 BI.J070 Merek AND Merek National Merek EYELA Merek Pyrex Merek EYELA
3 buah 1 unit 1 buah 1 unit 1 unit 1 unit 1 unit 48 buah 300 buah 20 buah 1 unit 1 unit
Tabel 3.2. Bahan-bahan Penelitian No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Bahan-bahan Kimia Akuades Alkohol Alumunium foil H2O2 3% Indikator Methyl Red Kapas Larutan crystal violte Larutan logol Larutan safranin Medium Agar Lipid Medium Agar Pati Medium DMS Medium Kaldu Dekstrosa
Spesifikasi 70% Merek Bagus -
-
Jumlah 10 liter 500 ml 2 roll 100 ml 50 ml 2 Bungkus 100 ml 100 ml 100 ml 500 ml 500 ml 1 liter 500 ml
23
No. 14 15 16 17 18 19
Bahan-bahan kimia Medium Kaldu Laktosa Medium Kaldu Sukrosa Medium Kasein Medium MS Medium NA Medium Nutrient Agar (NA)
20 21
Medium Susu Litmus Medium Uji Kebutuhan Oksigen Medium Uji Reduksi Nitrat MR-VP Broth Reagen Barrit Reagen Kovac’s Reagen Uji Reduksi Nitrat Reagent reduksi nitrat SIM Agar Simmon Citrate Agar Tryptone Agar Urea Broth
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Spesifikasi
Merek Merck Analytic)
(Pure
Jumlah 500 ml 500 ml 500 ml 1 Liter 1 Liter 3 liter 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 50 ml 50 ml 50 ml 100 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml
E. Pembuatan Medium, Reagen dan Sterilisasi Pembuatan media dan larutan yang diperlukan berdasarkan buku acuan, yaitu Cappucino dan Sherman (2001). Adapuan medium yang akan dibuat terdiri dari MSM+Detergen (DMS/Detergen Minimal Salt), MS (Minimal Salt) sebagai kontrol, Nutrient Agar (NA), kaldu laktosa, kaldu sukrosa, kaldu dekstrosa, agar pati, agar lipid, gelatin, kasein, uji katalase, uji reduksi nitrat, uji kebutuhan oksigen, susu litmus, SIM agar, urea broth, tryptone agar, MR-VP broth dan Simmon Citrate agar. Sedangkan reagen yang dibunakan terdiri dari reagen pewarnaan gram bakteri, pembuatan H2O2 3%, reagen uji reduksi nitrat, larutan lugol, reagen Kovac’s, indikator methyl red dan reagen Barrit.
24
Berikut cara pembuatan medium dan reagen yang diperlukan dalam penelitian ini beserta fungsinya: 1. Medium MSM+Detergen (DMS/Detergen Minimal Salt) Medium ini digunakan sebagai medium selektif untuk pertumbuhan bakteri yang dapat mendegradasi detergen. Komposisi medium MSM+Detergen (DMS) terdiri dari NaCl 5 gram, KCl 0,6 gram, MgSO4 7 gram, NH4NO3 1 gram, detergen 10 mg, agar 20 gram dan akuades 1000 ml (Fagade, 2009). 2. Medium MS (Minimal Salt/Kontrol) Medium ini digunakan sebagai kontrol untuk membandingkan pertumbuhan bakteri pada medium DMS. Komposisi medium MS terdiri dari NaCl 5 gram, KCl 0,6 gram, MgSO4 7 gram, NH4NO3 1 gram, agar 20 gram dan akuades 1000 ml. 3. Medium Nutrient Agar (NA) Medium ini digunakan untuk kultur bakteri selama penelitian berlangsung. Komposisi medium ini terdiri dari tepung agar 15 gram, pepton 10 gram, NaCl 5 gram dan beef extract 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga volume mencapai 1000 ml. Kemudian pH medium diatur pada kisaran 6,8-7,2 kemudian dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 4. Medium Kaldu Laktosa Medium ini digunakan untuk uji fermentasi karbohidrat, yaitu Laktosa. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, NaCl 5 gram, beef extract 3 gram, laktosa 5 gram dan brom cresol purple (bcp) 0,01 gram. Semua bahan dicampurkan
25
ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 5. Medium Kaldu Sukrosa Medium ini juga digunakan untuk fermentasi karbohidrat, yaitu Sukrosa. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, NaCl 5 gram, beef extract 3 gram, sukrosa 5 gram dan brom cresol purple (bcp) 0,01 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 6. Medium Kaldu Dekstrosa Medium ini juga digunakan untuk fermentasi karbohidrat, yaitu Dekstrosa. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, NaCl 5 gram, beef extract 3 gram, dekstrosa 5 gram dan brom cresol purple (bcp) 0,01 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 7. Medium Agar Pati Medium ini digunakan untuk uji hidrolisis pati. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, beef extract 3 gram, amilum 2 gram dan agar 15 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml,
26
kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 8. Medium Agar Lipid Medium ini digunakan untuk uji Hidrolisis Lipid. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, beef extract 3 gram, lipid 10 gram, neutral red 0,02 gram dan agar 15 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 9. Medium Gelatin Medium ini digunakan untuk uji Hidrolisis Gelatin. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram, beef extract 3 gram, dan gelatin 120 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2 dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 10. Medium Kasein Medium ini digunakan untuk uji Hidrolisis Kasein. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 5 gram dan agar powder 15 gram. Semua bahan dicampurkan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1000 ml, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan homogen. Tuangkan campuran tadi ke dalam gelas kimia yang
27
berisi 100 gram susu skim sedikit demi sedikit agar tidak terjadi penggumpalan lalu diaduk hingga homogen. Kemudian pH medium diatur antara kisaran 7-7,2. Selanjutnya disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 11. Medium Uji Katalase Medium ini digunakan untuk kultur bakteri selama penelitian berlangsung. Komposisi medium ini terdiri dari tepung agar 15 gram, pepton 10 gram, NaCl 5 gram dan beef extract 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga volume mencapai 1000 ml. pH medium diatur pada kisaran 6,8-7,2 kemudian dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5-7 ml untuk agar miring dan disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 12. Medium Uji Reduksi Nitrat Medium ini digunakan untuk uji Reduksi Nitrat. Komposisi medium ini terdiri dari Disodium Fosfat 2 gram, tripton 20 gram, dekstrosa 1 gram, agar 1 gram, Potasium Nitrat 1 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga volume mencapay 1000 ml. selanjutnya pH diatur pada kisaran 7,2 dlalu dibiarkan hingga mendidih dan homogen. Setelah itu medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 8-10 ml dan disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
28
13. Medium Uji Kebutuhan Oksigen Medium ini digunakan untuk kultur bakteri selama penelitian berlangsung. Komposisi medium ini terdiri dari tepung agar 15 gram, pepton 10 gram, NaCl 5 gram dan beef extract 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga volume mencapai 1000 ml. pH medium diatur pada kisaran 6,8-7,2 kemudian dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml untuk agar diri dan disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 14. Medium Susu Litmus Medium ini digunakan untuk uji Reaksi Susu Litmus. Komposisi medium ini terdiri dari susu skim powder 100 gram, litmus 0,75 gram, dan akuades 1000 ml. litmus dilarutkan dengan akuades, jangan dipanaskan. Kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi susu skim bubuk dan diaduk hingga homogen. Setelah itu medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml dan disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 15. Medium SIM Agar Medium ini digunakan untuk uji produksi H2S. komposisi medium ini terdiri dari pepton 30 gram, beef extract 3 gram, ferrous ammonioum sulfate 0,2 gram, sodium thiosulfate 0,025 gram dan agar 3 gram. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga volume mencapai 1000 ml. pH medium diatur pada kisaran 7,3 kemudian dididihkan sambil dihomogenkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam
29
tabung reaksi sebanyak 8 ml untuk agar diri dan disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 16. Urea Broth Medium ini digunakan untuk uji Urease. Komposisi medium ini terdiri dari urea broth concentrate 10 ml dan akuades steril 90 ml (untuk 100 ml medium), kedua bahan dicampurkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil yang telah steril menggunakan tips steril masing-masing sebanyak 3 ml. 17. Tryptone Agar Medium ini digunakan untuk uji Indol. Komposisi medium ini terdiri dari tripton 10 gram, calcium chloride (reagent) 0,01-0,03 M, sodium chloride 5 gram dan agar 11 gram. Semua bahan dicampur dan dilarutkan dalam 1000 ml akuades, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil masingmasing sebanyak 3 ml lalu disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 18. MR-VP Broth Medium ini digunakan untuk uji Methyl Red dan Voges Proskauer. Komposisi medium ini terdiri dari pepton 7 gram, dekstrosa 5 gram dan potassium phosphate 5 gram. Semua bahan dicampur dan dilarutkan dalam 1000 ml akuades, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil masingmasing sebanyak 3 ml lalu disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
30
19. Simmon Citrate Agar Medium ini digunakan untuk uji Citrat. Komposisi medium ini terdiri dari ammonioum dihydrogen phosphate 1 gram, dipotassium phosphate 1 gram, sodium chloride 5 gram, sodium citrate 2 gram, magnesium sulfate 0,2 gram, agar 15 gram dan brom thymol blue 0,08 gram. Semua bahan dicampur dan dilarutkan dalam 1000 ml akuades, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil masing-masing sebanyak 3 ml lalu disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit 20. Pembuatan Reagen Pewarnaan Gram Bakteri Komposisi reagen pewarnaan Gram terdiri dari Kristal violet 2 gram dilarutkan dalam 20 ml athanol 95% dan ditambahkan ammonioum oxalate 0,8 gram yang dilarutkan dengan akuades 80 ml. Dalam membuat lugol, Kristal iodium 0,06 gram ditambahkan dengan 0,12 gram Kristal KI dan 20 ml akuades. Selain itu, alkohol 96% dan pembuatan Safranin O denga melarukan 125 mg dalam larutan 5 ml ethanol 95% dan akuades 50 ml. beberapa larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan. 21. Pembuatan H2O2 3% Sebanyak 3 ml H2O2 diencerkan dengan aquades menjadi 10 ml, kemudian dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan. 22. Pembuatan Reagen Uji Reduksi Nitrat Komposisi reagen untuk uji Reduksi Nitrat ini terdiri dari Asam Sulfanilat 8 gram dilarutkan dalam 1000 ml asam asetat, larutan ini sebagai larutan A. kemudian
31
alpha-naphhthylamine 5 gram dilarutkan dalam 1000 ml Asam Asetat 5 N, larutan ini sebagai larutan B. Selain kedua larutan tersebut, zinc powder sebanyak 10 gram juga disiapkan. 23. Pembuatan Larutan Lugol Larutan ini digunakan sebagai reagen untuk uji hidrolisis Pati. Komposisi reagen ini terdiri dari kristal iodium 0,06 gram ditambahkan kristal KI 0,12 gram dan 20 ml akuades. Selanjutnya larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan. 24. Pembuatan Reagen Kovac’s Reagen ini digunakan untuk uji Indol. Komposisi reagen ini terdiri dari pdimethylaminobenzaldehyde 5 gram, amyl alcohol 75 ml dan hydrochloric acid (concentrated) 25 ml. Kemudian p-dimethylaminobenzaldehyde dilarutkan dalam amyl alcohol kemudian ditambahkan hydrochloric acid (concentrated). Setelah itu reagen dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan. 25. Pembuatan Indikator Methyl Red Larutan indikator ini digunakan dalam uji Methyl Red. Komposisi larutan ini terdiri dari methyl red 0,1 gram, ethyl alcohol (95%) 3000 ml dan akuades 2000 ml. methyl red dilarutkan dalam ethyl alcohol 95% kemudian ditambahakan akuades hingga volume mencapai 500 ml. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan.
32
26. Pembuatan Reagen Barrit Reagen ini digunakan untuk uji Voges-Proskauer, terdiri dari larutan A dan larutan B. Untuk larutan A, Alpha-naphthol 5 gram dilarutkan dalam ethanol absolute 95 ml menggunakan stirrer. Untuk larutan B teridiri dari potassium hydroxide 40 gram, creatine 0,3 gram dan akuades 100 ml. potassium hydroxide dilarutkan dalam akuades (larutan akan menjadi panas), biarkan hingga menjadi dingin (temperatur ruang) kemudian dimasukkan
creatin dan dilarutkan
menggunakan stirrer. Setelah itu kedua larutan dimasukkan ke dalam botol gelap dan diberi label sesuai ketentuan. F. Rancangan Penelitian Penelitian yang digunakan adalah penelitian deskripsi eksploratif untuk mengidentifikasi bakteri pendegradasi detergen yang diisolasi dari limbah domestik yang ada di kolam fakultatif Instalasi Pengolahan Air Limbah (IPAL) Bojongsoang Bandung. G. Prosedur Penelitian Prosedur penelitian yang dilakukan terdiri dari 1. Tahap Persiapan, 2. Uji Pendahuluan, 3. Pengambilan Sampel Bakteri dari Limbah Cair Kolam Fakultatif dan Inokulasi pada Medium Selektif, 4. Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri, 5. Analisis Data. Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri yang terdiri dari a. Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri, b. Pembuatan Preparat dengan Metode Pewarnaan Gram, c. Uji Motilitas, d. Uji Aktivitas Biokimia Bakteri Limbah Detergen pada Kolam
33
Maturasi. Uji aktivitas biokimia bakteri limbah detergen pada kolam maturasi terdiri dari 1). Uji Motilitas, 2). Uji Kebutuhan Oksigen (aerob atau anaerob), 3). Uji Enzimatis Katalase, 4). Uji Fermentasi Karbohidrat, 5). Uji Hidrolisis yaitu Pati, Lipid, Gelatin dan Kasein, 6). Uji Reduksi Nitrat, 7). Reaksi Susu Litmus, 8). Produksi H2S, 9). Tes Urease, 10). Tes IMVIC. 1. Tahap Persiapan Dalam tahap ini dilakukan pengecekan alat dan bahan yang akan digunakan selama penelitian. Setelah lengkap maka dilakukan sterilisasi botol sampel, gelas kimia, cawan petri, gelas ukur, dan tabung reaksi serta peralatan lainnya yang harus disterilisasi sehingga tidak terkontaminasi. Setelah sterilisasi, kemudian membuat medium selektif karena bakteri yang akan ditumbuhkan mempunyai sifat spesifik yang tidak sama dengan bakteri lain, maka pembiakannya membutuhkan media yang berbeda pula. Dalam penelitian ini digunakan media selektif, yaitu MSM+Detergen (DMS/Detergen Minimal Salt media). Selanjutnya dilakukan pembuatan medium untuk pengujian biokimia. Setelah itu, dilakukan pengenceran sampel agar bakteri yang tumbuh pada medium tidak terlalu banyak dan semua medium disterilkan. 2. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan koloni bakteri yang baik. Pada uji pendahuluan ini digunakan medium DMS dengan konsentrasi detergen yang berbeda yaitu 10 ppm dan 1 ppm, serta medium MS sebagai kontrol. Konsentrasi 10 ppm dipilih berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
34
Fagade (2009). Sedangkan konsentrasi detergen 1 ppm digunakan karena penyesuaian dengan kadar detergen dalam kolam fakultatif. Sedangkan medium MS digunakan sebagai kontrol, yaitu tidak mengandung detergen sehingga dapat diketahui jenis bakteri yang dapat mendegradasi detergen atau tidak. Selain menggunakan medium dengan konsentrasi detergen berbeda, digunakan pula pengenceran sampel yang berbeda, yaitu 10-1 – 10-7. Sampel yang diisolasi adalah pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7, namun pada pengenceran ini tidak ada bakteri yang tumbuh pada ketiga medium. Selanjutnya pengenceran dikurangi menjadi 10-1 – 10-5, kemudian yang diisolasi adalah sampel dengan pengenceran 102
, 10-3, 10-4 dan 10-5 karena pada pengenceran ini jumlah koloni bakteri yang hidup
tidak terlalu padat di medium sehingga dalam indentifikasi tidak mengalami kesulitan. Namun, pertumbuhan koloni bakteri pada pengenceran 10-2 lebih baik dari pada sampel dengan pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5 dan pertumbuhan tersebut terjadi pada medium DMS 10 ppm. Pertumbuhan koloni bakteri tersebut memiliki ukuran yang lebih besar (lebih mudah diamati) dan jarak antar koloni jelas. Berdasarkan uji pendahuluan inilah maka digunakan medium DMS 10 ppm dan sampel dengan pengenceran 10-2. Untuk lebih jelas, berikut ini (Tabel 3. 3) pertumbuhan koloni bakteri saat uji pendahuluan.
35
Tabel 3. 3. 3 Pertumbuhan Koloni Bakteri pada Uji Pendahuluan Replikasi I II III
10-2 11 2
Medium DMS D 1 ppm 10-3 10-4 10-5 7 1 -
10-2 137 39 9
Medium DMS 10 ppm 10-33 10-4 3 1 5 2 -
10-5 1 -
3. Pengambilan Sampel Bakteri dari Limbah Cair Kolam Fakultatif dan Inokulasi pada Medium Selektif Pengambilan sampel akan dilakukan ditiga titik pada kolam Fakultatif IPAL Bojongsoang. Sebelum melakukan sampling air akan diamati terlebih dahulu faktor aquatik, yaitu suhu, pH, turbiditas dan DO. Sampel air limbah yang akan diambil sebanyak 100 ml menggunakan botol gelap 250 ml yang sudah steril dengan tiga replikasi.
Titik 2
Titik 1
Titik 3
Gambar 3.1 3.1.. Titik pengambilan sampel di kolam fakultatif IPAL Bojongsoang Bandung Kemudian, sampel dibawa ke laboratorium untuk diinokulasikan pada medium selektif untuk melihat jenis koloni bakteri yang ada pada limbah tersebut. Sebelum dilakukan inokulasi bakteri ke medium selektif, sampel dari titik 1, 2 dan 3
36
dihomogenkan kemudian diencerkan melalui metode pengenceran mulai dari pengenceran 10-1 hingga 10-2, dengan cara mengambil 1 ml air limbah dari botol sampel sumber air limbah kolam fakultatif dengan menggunakan tips 1 ml melalui mikropipet 1 ml kemudian di masukkan ke dalam tabung reaksi 10-1 yang berisi akuades steril sebanyak 9 ml dan dilakukan kemudian pada pengenceran 10-2. Hasil pengenceran yang dapat kita gunakan untuk kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi medium selektif yaitu pada pengenceran 10-2. Larutan dari tabung 10-2 diambil sebanyak 0,5 ml dengan menggunakan tips yang telah steril lalu memasukkannya ke dalam cawan petri steril medium DMS 10 ppm (Detergen Minimal Salt media) dan MS (Minimal Salt media) sebagai kontrol masing-masing sebanyak 9 ml (Fagade et al.. 2009). Kemudian cawan petri hasil inokulasi diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam (Suharjono et al., 2009) dan diamati koloni yang terbentuk dalam setiap cawan petri dengan menggunakan colony counter (Budiawan et al., 2009). 4. Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri Ini meruakan tahap akhir dalam langkah penelitian ini, yaitu melakukan identifikasi dan karakterisasi. Identifikasi ini di lakukan dengan berbagai macam metode, yaitu membuat preparat dengan metode pewarnaan Gram dan melakukan uji aktivitas biokimia terhadap bakteri hasil isolasi limbah (Syulasmi et al., 2003). Setiap tahapan identifikasi dilakukan secara triplo. Tahap identifikasi atau karakterisasi dalam penelitian ini meliputi :
37
a. Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Pengamatan morfologi koloni bakteri meliputi warna, bentuk, kenaikan permukaan/elevasi, tepian serta penampakan (suram/mengkilat) koloni. b. Pengamatan Reaksi Pewarnaan Gram Pengamatan reaksi pewarnaan Gram terdiri dari bentuk dan rangkaian sel, ukuran sel serta reaksi pewarnaan Gram positif atau negatif. Namun sebelum diamati terlebih dahulu harus dibuat preparat. Berikut ini cara pembuatan preparat pewarnaan Gram, pengamatan bentuk dan rangkaian sel, ukuran sel dan pengamatan reaksi pewarnaan Gram positif atau negatif. 1) Pembuatan Preparat Pewarnaan Gram Pembuatan preparat dengan metode pewarnaan Gram dilakukan melalui 2 tahap yaitu dibuat olesan bakteri dan dilakukan pewarnaan Gram pada olesan bakteri. Untuk pembuatan olesan bakteri, dibutuhkan objek gelas dan 1 ose biakan murni bakteri yang telah ditumbuhkan di medium selektif DMS 10 ppm dan MS dari limbah detergen, satu ose biakan murni bakteri tersebut disuspensikan dengan satu tetes aquades di atas objek gelas tersebut dan difiksasi di atas api sebanyak 3 kali. Kemudian dilakukan pewarnaan Gram yang bertujuan untuk menentukan apakah bakteri yang kita dapat itu bakteri Gram positif atau Gram negatif, dalam proses pewarnaan Gram ini digunakan pewarna karbol kristal violet, larutan alkohol 96 % , larutan lugol, safranin O, akuades dan minyak imersi.
38
2) Bentuk dan Rangkaian Sel Bentuk dan rangkaian sel dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 10x100 kali. 3) Ukuran Sel Pengukuran sel bakteri menggunakan alat yang disebut mikrometer sehingga diperoleh kalibrasi untuk satu garis yang ditempati oleh satu sel bakteri pada skala yang setara dengan mikrometer (µm) (Caprette, 2000). Skala kalibrasi ditentukan dengan menggunakan perbesaran yang sama saat pengamatan pewaraan Gram bakteri, yaitu 10x100 kali. Skala kalibrasi diperoleh dengan adanya skala objektif dan skala okuler yang berhimpit. Berikut rumus untuk kalibrasi:
0,01
0,01 0,0011 1,1 μm
11 0,01 0,0011 1,1 μm 96 Sehingga diperoleh skala kalibrasi satu garis adalah 1,1 μm
Skala Berhimpit Gambar 3. 2. Skala pada Mikrometer
39
4) Reaksi Pewaraan Gram Reaksi pewarnaan Gram dilihat melalui warna yang dihasilkan setelah pewaraan Gram. jika berwarna merah maka bakteri tersebut adalah Gram negatif, sedangkan jika berwarna biru maka bakteri tersebut adalah Gram Positif. c. Uji Motilitas Bakteri dinokulasikan pada medium NA dengan cara stab kemudian dilihat pertumbuhannya, jika bakteri tersebut bersifat motil maka terdapat pertumbuhan disekitar strip bakteri yang diinokulasi, sedangkan apabila bakteri tidak bersifat motil maka tidak telihat pertumbuhan sama sekali di sekitar strib dari inokulasi bakteri tersebut (Cappucino dan Sherman, 2001). d. Uji Aktivitas Biokimia Bakteri Limbah Detergen pada Kolam Fakultatif Pengujian aktivitas biokimia dilakukan terhadap kultur murni bakteri yang terbagi menjadi 2 tahap yaitu tes primer dan tes sekunder. Tes primer meliputi reaksi gram, spora, motilitas, uji kebutuhan oksigen, katalase, oksidasi, fermentasi dan tes glukosa. Sedangkan tes sekunder meliputi tes karbohidrat, urease, indole, dan reduksi nitrat. Adapun tahap-tahap dari uji biokimia dalam penelitian ini yaitu : 1) Uji Kebutuhan Oksigen (Aerob atau Anaerob) Bakteri dinokulasikan pada tabung yang berisi medium kaldu nutrisi agar dan diberi label tabung berisi agar diri NA dengan nama mikroorganisme. Medium NA dicairkan, kemudian diturnkan suhunya hingga 47 0C dengan tehnik sterilisasi, lalu dilakukan inokulasi mikroorganisme. Kemudian kultur dikocok dengan hati-hati menggunakan telapak tangan, jangan sampai terbentuk gelembung udara. Kemudian
40
kultur didinginkan dengan cepat dalam waterbath dengan posisi tegak dan sumbat kapas ditekan sampai jarak 2 cm dari mulut tabung dan dituangkan sedikit paraffin cair di atas sumbat kapas. Lalu diinkubasi pada suhu 22-37 0C selama 1x 24 jam dan diamati distribusi pertumbuhan mikroorganisme dalam kultur apakah di dasar atau di atas permukaan kultur (Syulasmi et al., 2008). 2) Uji Enzimatis Katalase Bakteri dinokulasikan pada tabung reaksi yang berisi 7 ml medium NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C, kemudian ditetesi H2O2 3%, kemudian diamati perubahan yang terjadi yaitu ada atau tidaknya gelembung udara di atas permukaan kultur bakteri. Kemampuan menghasilkan katalase dapat dideteksi dengan ditambahkannya H2O2 di atas agar miring yang telah ditumbuhi mikroorganisme. Uji positif ditandai dengan oleh terbentuknya gelembunggelembung oksigen yang menunjukkan mikroorganisme tersebut menghasilakn enzim katalase, begitupun sebaliknya (Syulasmi et al., 2008). 3) Uji Fermentasi Karbohidrat Bakteri dinokulasikan pada satu tabung reaksi yang berisi medium brom cresol purple (bcp) laktosa dan tabung Durham, satu tabung reaksi yang berisi medium bcp sukrosa dan tabung Durham, dan satu tabung reaksi yang berisi medium bcp dekstrosa dan tabung Durham. Semuanya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0
C, kemudian dilihat perubahan yang terjadi, yaitu ada tidaknya gelembung udara
pada tabung durham (Syulasmi et al., 2008).
41
4) Uji Hidrolisis yaitu Pati, Lipid, Gelatin dan Kasein a) Hidrolisis Pati Pati dapat dihidrolisis oleh bakteri tertentu dengan hasil akhir dekstrin. Hidrolisis ini terjadi karena adanya amilase yang dihasilkan oleh bakteri tertentu yang dapat digunakan dalam penentuan jenis. Kemampuan bakteri untuk menghidrolisis pati dapat diuji dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni setelah ditetesi dengan larutan iodin (Cappucino dan Sherman, 2001). b) Hidrolisis Lipid Kemampuan bakteri untuk menghidrolisis lipid dengan bantuan enzim lipase dapat digunakan medium lipid agar. Bakteri yang mampu menghasilkan lipase akan memperlihatkan zona lipolisis, ditunjukan dengan adanya daerah terang disekitar pertumbuhan koloni. Pada medium lipid agar ditambahkan indicator neutral red, pertumbuhan koloni pemecah lipid pada medium lipid neutral red akan berwarna merah pada bagian bawahnya. Hal ini disebabkan terbentuknya asam lemak mengakibatkan pH medium menurun (Cappucino dan Sherman, 2001). c) Hidrolisis Gelatin Pada medium nutrient gelatin bakteri diisolasi kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C, kemudian disimpan pada inkubator dengan suhu 4 0C selama 30 menit. Beberapa bakteri mampu menghidrolisis gelatin karena dapat menghasilkan eksoenzim proteolitik yang disebut gelatinase. Gelatin yang telah dihirolisis akan tetap cair meskipun disimpan pada suhu 4 0C, begitupun sebaliknya (Cappucino dan Sherman, 2001).
42
d) Hidrolisis Kasein Pada medium agar kasein bakteri diinokulasi kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C. Kemampuan bakteri untuk menghidrolisis dapat dibuktikan dengan menginokulasi bakteri pada medium susu skim agar. Pertumbuhan koloni bakteri pemecah protein pada medium susu skim agar akan dikelilingi oleh areal bening (Cappucino dan Sherman, 2001). 5) Uji Reduksi Nitrat Bakteri dinokulasikan pada tabung yang telah diberi nama bakteri tersebut. Setelah itu diinkubasi pada suhu 22-370C selama 24 sampai 1 x 24 jam. Kemudian medium ditetesi 3-4 tetes larutan nitrat A dan larutan B di atas permukaan kultur, didiamkan beberapa menit kemudian lihat perubahan yang terjadi. Perubahan warna medium putih kekuningan menjadi merah cherry menunjukkan reaksi positif uji reduksi nitrat. Untuk medium yang tidak mengalami perubahan warna, selanjutnya ditambahkan zinc powder secukupnya dan diamati perubahan yang terjadi. Jika terjadi perubahan warna medium putih kekuningan menjadi merah cherry, maka reaksi menunjukkan negatif dan bila tidak menunnjukkan perubahan warna, maka reaksi menunjukkan positif dalam uji reduksi nitrat (Cappucino dan Sherman, 2001). 6) Reaksi Susu Litmus Bakteri dinokulasikan pada medium susu litmus yang telah diberi label pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1x24 jam dan diamati perubahan yang terjadi. Menurut Syulasmi et al. (2008) reaksi susu litmus meliputi :
43
a) Fermentasi Laktosa Hasil dari fermentasi laktosa ini akan membentuk asam laktat. Adanya asam laktat sangat mudah diamati, litmus yang berwarna ungu pada pH netral berubah menjadi merah muda ketika medium menjadi asam (mendekati pH 4). b) Produksi Gas Fermentasi laktosa selain menghasilkan asam laktat juga menghasilkan gas CO2 dan H2. Adanya gas terlihat dari terpisahnya dadih (curd) atau terpecah-pecah. c) Reduksi Litmus Fermentasi laktosa merupakan reaksi anaerob, jadi tidak ada oksigen sebagai akseptor electron. Artinya H2 tidak berikatan dengan O2. Dalam reaksi susu litmus, litmus sebagai akseptor electron. Dalam kondisi teroksidasi litmus berwarna ungu, ketika menerima hydrogen dari substrat akan tereduksi dan berubah warna menjadi putih susu. d) Pembentukan Curd (Dadih) Adanya aktifitas biokimia oleh mikroorganisme yang berbeda terhadap susu litmus dapat menghasilkan dadih yang berbeda. Dadih dapat berupa dadih asam dan dadih rennet (keju). Dadi asam akan tetap menempel (tidak lepas) bila tabung dibalikkan, sedangkan dadih rennet (keju) akan terlepas (tumpah) bila tabung dibalikkan.
44
e) Proteolisis Reaksi ini dapat dilihat dengan terkumpulnya litmus di permukaan berwarna ungu tua sedangkan medium akan terlihat sebagai cairan yang kecoklatan dan translusen karena merupakan larutan asam amino. f) Reaksi Alkalis Reaksi ini tidak menunjukkan adanya perubahan medium (medium tetap berwarna ungu seperti tidak terjadi perubahan apa-apa). 7) Produksi H2S Bakteri diinokulasikan ke dalam medium SIM agar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif (terbentuknya H2S) ditandai dengan perubahan warna medium menjadi hitam. 8) Tes Urease Bakteri diinokulasikan ke dalam medium Urea kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna medium dari kuning menjadi pink yang sangat pekat. 9) Tes Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer, Citrate (IMVIC) Merujuk pada buku Cappucino dan Sherman (2001), berikut ini tahap untuk uji IMVIC: a) Indole Bakteri diinokulasikan ke dalam medium Tryptone agar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya lapisan cincin berwarna ungu pada permukaan kultur setelah ditetsi dengan reagen Kovac’s.
45
b) Methyl Red Bakteri diinokulasikan ke dalam medium MR-VP broth kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna medium menjadi merah setelah ditetesi indikator Methyl red. c) Voges-Proskauer Bakteri diinokulasikan ke dalam medium MR-VP broth kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Kultur kemudian ditetesi dengan Barrit A dan Barrit B dengan perbandingan 1:1, setelah itu dibirkan selama 15-20 menit. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna medium menjadi merah mawar. d) Uji Citrate Bakteri diinokulasi ke medium Simmon Citrate dengan cara distreak. kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2x 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya perubahan warna medium dari hijau menjadi biru tua. 5. Analisis data Setelah sampling air limbah selesai dilakukan dan di hasilkan kultur bakteri biakan murni pada medium agar miring, maka kultur bakteri dari air limbah detergen akan diidentifikasi melalui reaksi pewarnaan gram dan uji biokimia agar diketahui karakteristik bakteri pendegradasi detergen pada kolam fakultatif sebagai tahap identifikasi yang diharapkan. Kemudian hasil identifikasi bakteri akan di cocokkan dengan Bergey’s Manual Determinative Bacteriology Ninth Edition.
46
Alur Penelitian
Prosedur Penelitian
Sterilisasi alat dan medium
Tahap Persiapan
Pembuatan medium dan reagent
Uji Pendahuluan
Sampling air limbah dan inokulasi ke medium selektif Dikultivasi pada suhu 30 OC selama 24 – 48 jam
Identifikasi atau Karakterisasi Bakteri
Pengramatan Morfologi Koloni
Perwarnaan Gram Bakteri dan Uji Aktifitas Biokimia Bakteri
Analisa data
Laporan penelitian (Skripsi)
Grambar 3. 3. Diagram Alir Penelitian
